WO2011055796A1 - ピロロキノリンキノンのフリー体 - Google Patents

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WO2011055796A1
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salt
alkali metal
metal salt
pyrroloquinoline quinone
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池本　一人
純一 枝廣
Original Assignee
三菱瓦斯化学株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D471/00—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, at least one ring being a six-membered ring with one nitrogen atom, not provided for by groups C07D451/00 - C07D463/00
    • C07D471/02—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, at least one ring being a six-membered ring with one nitrogen atom, not provided for by groups C07D451/00 - C07D463/00 in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D471/04—Ortho-condensed systems

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a free form of pyrroloquinoline quinone and a high-purity crystal obtained by the production method.
  • PQQ Pyrroloquinoline quinone
  • This PQQ is obtained by subjecting PQQ obtained by an organic chemical synthesis method (JACS, Vol. 103, pages 5599-5600 (1981)) or a fermentation method (Japanese Patent Laid-Open No. 1-218597) to chromatography,
  • the PQQ section in the effluent can be concentrated, crystallized by crystallization (Japanese Patent No. 2072284), and dried.
  • the crystals thus obtained are usually alkali metal salts, depending on the pH and precipitation conditions used.
  • PQQ is required to be a free form for use as a raw material for derivative synthesis or as a product dissolved in an organic solvent that is insoluble in alkali metal salts.
  • PQQ crystals are obtained by adjusting the pH to 2.5.
  • PQQ is It was found to be a mono-alkali metal salt, not a free form.
  • the structure of a free form has been reported (nature, vol. 280, 30 August, 1979, P844), which contains an acetone adduct.
  • the present inventors have found that a free form of pyrroloquinoline quinone is precipitated when the pH of the solution in which the alkali metal salt of pyrroloquinoline quinone is dissolved is 1.5 or less (Examples 1 to 3). ). The present invention is based on this finding.
  • the object of the present invention is to provide a method for producing a free form of pyrroloquinoline quinone easily and without using an organic solvent or an ion exchange resin, and a high-purity crystal thereof.
  • a pyrroloquinoline quinone free form comprising: preparing a solution having a pH of 1.5 or less obtained by dissolving an alkali metal salt of the compound to obtain a precipitate;
  • a production method (hereinafter sometimes referred to as “production method according to the present invention”) is provided.
  • the formula (1) (Hereinafter, also referred to as “the compound according to the present invention”) is provided.
  • a free form of pyrroloquinoline quinone having a high purity can be easily produced without using an organic solvent or an ion exchange resin and having a low alkali metal content and good crystallinity. It is.
  • the PQQ-free body obtained in the present invention can be used as an active ingredient of a pharmaceutical or functional food, and is in the form of an external preparation for skin, injection, oral preparation, suppository, etc. It is advantageous in that it can be provided in the form of food, various hospital foods, and the like.
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of powder X-ray analysis of the PQQ-free body obtained in Example 1.
  • a free form of pyrroloquinoline quinone can be produced by preparing a solution having a pH of 1.5 or less obtained by dissolving an alkali metal salt of pyrroloquinoline quinone and obtaining a precipitate.
  • pyrroloquinoline quinone and “free form of pyrroloquinoline quinone” mean a compound represented by the following formula (1), and are used interchangeably to represent the compound.
  • an alkali metal salt of pyrroloquinoline quinone means an alkali metal salt of a compound represented by the formula (1).
  • pyrroloquinoline quinone free form crystal means a crystal of the compound represented by the formula (1), which is a state in which pyrroloquinoline quinone molecules are regularly aligned in a solid state. Specifically, it is a highly pure and highly stable state. Whether or not the compound of formula (1) (free form of pyrroloquinoline quinone) is in the form of crystals can be confirmed by detecting a peak by powder X-ray diffraction.
  • the production method according to the present invention can be carried out by preparing a solution having a pH of 1.5 or less obtained by dissolving an alkali metal salt of pyrroloquinoline quinone and obtaining a precipitate.
  • examples of the alkali metal salt of pyrroloquinoline quinone used as a raw material for producing a free form of pyrroloquinoline quinone include salts of sodium, potassium, lithium, cesium, rubidium and the like. These salts may be used alone or in combination. Preferably, it is a single salt of sodium or potassium, and a sodium salt is more preferable because it can be easily purchased.
  • the substitution number of the salt in the alkali metal salt of pyrroloquinoline quinone is 1 to 3, and any of a monoalkali metal salt, a dialkali metal salt, and a trialkali metal salt is preferable, but a dialkali metal salt is preferable.
  • the alkali metal salt of pyrroloquinoline quinone is particularly preferably a disodium salt.
  • alkali metal salt a free body can be produced by precipitation in an aqueous solution having a pH of 1.5 or lower.
  • alkaline earth metals, ammonium, organic ammonium salts, and transition metal salts can be similarly produced.
  • alkali metal salt of pyrroloquinoline quinone used as a raw material in the present invention, commercially available products can be obtained.
  • the alkali metal salt of pyrroloquinoline quinone used as a raw material in the present invention can be produced by a known method such as an organic chemical synthesis method or a fermentation method.
  • the alkali metal salt of pyrroloquinoline quinone used as a raw material in the present invention may be crystalline or amorphous. Further, impurities may be included.
  • an alkali metal salt of pyrroloquinoline quinone When used as a solution, it can be used by dissolving in a solvent such as water or alcohol, but it is preferably used as an aqueous solution of an alkali metal salt of pyrroloquinoline quinone.
  • the solution of the alkali metal salt of pyrroloquinoline quinone can be prepared to be, for example, 0.001 to 1 w / w%, preferably 0.005 to 0.5 w / w%, more preferably 0.01 to 0.25 w / w%.
  • the pH of the solution can be 3 or more and 13 or less, preferably 5 to 12, and more preferably 7 to 10.
  • an alkaline substance for example, sodium hydroxide
  • the temperature at this time can be 0 to 140 ° C., but preferably 20 to 90 ° C. does not require a special apparatus and is easy to use. In terms of solubility, a high temperature is easily dissolved, and therefore, it is preferably set to 50 ° C. or higher from the viewpoint of productivity.
  • a solution having a pH of 1.5 or less prepared by dissolving an alkali metal salt of pyrroloquinoline quinone is prepared in order to precipitate the target free form of pyrroloquinoline quinone.
  • Preparation of a solution having a pH of 1.5 or lower can be performed by using an acid.
  • the pH of the solution can be 1.5 or less, preferably 1 or less. If the pH is 2 or more, the alkali metal remains, that is, a salt of 1 sodium salt or more. In order to prevent this, the pH used is preferably 1.5 or less, more preferably 1 or less. If the pH is not lowered at the time of precipitation, the precipitated crystal becomes a solid having a peak derived from the structure of one alkali metal salt.
  • the pH of the solution can be 0.5 to 1.5, preferably 0.5 to 1, and more preferably 0.6 to 0.9.
  • an acid is added to the alkali metal salt solution of pyrroloquinoline quinone to lower the pH. It can also be carried out by adding an alkali metal salt solution of pyrroloquinoline quinone to the acid solution.
  • it can also be implemented by mixing the solid of the alkali metal salt of pyrroloquinoline quinone, and an acid. In this case, when an acid is added abruptly, the mixed state does not occur uniformly, so alkali metals are likely to remain, but the amount of water used is small and simple.
  • a solution having a pH of 1.5 or less comprising an alkali metal salt of pyrroloquinoline quinone is represented by the following process (hereinafter also referred to as “preparation process”): (I) a step of adding an acid or an acidic solution to a solution obtained by dissolving an alkali metal salt of pyrroloquinoline quinone to bring the pH of the solution to 1.5 or less; (Ii) adding a solution obtained by dissolving an alkali metal salt of pyrroloquinoline quinone or an alkali metal salt of pyrroloquinoline quinone to an acidic solution to bring the pH of the solution to 1.5 or lower; or (iii) an acid It can be prepared by adding a solution prepared by dissolving an alkali metal salt of pyrroloquinoline quinone to bring the pH of the solution to 1.5 or less.
  • it can be prepared by adding an acid or an acidic solution to a solution obtained by dissolving an alkali metal salt of pyrroloquinoline qui
  • an additive can be added to an addition target at a time, or can be gradually added.
  • the acid used in the preparation step is not particularly limited as long as the pH can be lowered.
  • Either inorganic acid or organic acid can be used.
  • examples of the inorganic acid include hydrochloric acid, hydrogen bromide, hydrogen iodide, perchloric acid, sulfuric acid, phosphoric acid, nitric acid, etc., preferably hydrochloric acid, hydrogen bromide, hydrogen iodide, perchlorine. Acid, phosphoric acid, nitric acid, more preferably hydrochloric acid.
  • organic acid examples include acetic acid, formic acid, oxalic acid, lactic acid, and citric acid, and acetic acid, formic acid, oxalic acid, lactic acid, and citric acid are preferable. Since there is a risk of acid remaining in pyrroloquinoline quinone due to the low pH used, monovalent acids that have vapor pressure and are not toxic, such as hydrochloric acid, are most preferred. Further, hydrochloric acid gives a solid with high crystallinity which is also defined in the scope of the present invention, and is excellent in terms of crystallinity. Multivalent acids often have low solubility of salts with alkali metal ions and tend to remain in solids. Sulfuric acid is easy to use because it does not emit smoke, but it is preferable to combine with other acids because it tends to remain in a solid and there is a risk of discoloration due to its dehydrating property.
  • the acid can be used alone or in combination of two or more, but at least hydrochloric acid is used, that is, hydrochloric acid alone or hydrochloric acid and one or more other acids (for example, hydrogen bromide, hydrogen iodide, Perchloric acid, sulfuric acid, phosphoric acid, nitric acid, etc.) are preferably used in combination.
  • hydrochloric acid alone or hydrochloric acid and one or more other acids (for example, hydrogen bromide, hydrogen iodide, Perchloric acid, sulfuric acid, phosphoric acid, nitric acid, etc.) are preferably used in combination.
  • Acid can be used as diluted acid (acidic solution).
  • the acid can be used after being dissolved in a solvent such as water.
  • the acidic solution can be prepared to be 0.1 to 20 g / L, for example, but preferably 0.5 to 10 g / L. *
  • the molar ratio of the alkali metal salt of pyrroloquinoline quinone and the acid can be 1: 1 to 1: 1000, preferably 1: 2 to 1: 100.
  • the temperature at which the preparation step is performed is not particularly limited, but can be set to ⁇ 20 ° C. to 140 ° C. from the standpoint of general handling. In order to increase the solubility of the alkali metal salt of pyrroloquinoline quinone, it can be heated.
  • the time for carrying out the preparation process is not particularly limited, but it can be carried out in 5 minutes to 1 week. If the scale is small, it takes a short time, but if it is large, it takes a long time.
  • a precipitate can be obtained from a solution having a pH of 1.5 or less obtained by dissolving an alkali metal salt of pyrroloquinoline quinone prepared by the above preparation step.
  • precipitate means a solid phase (solid) appearing from a liquid phase (solution).
  • a step of leaving a solution having a pH of 1.5 or less prepared by dissolving the alkali metal salt of pyrroloquinoline quinone prepared by the above preparation step (hereinafter referred to as “precipitation step”). May be implemented).
  • the solution may be stirred.
  • the temperature at which the precipitation step is performed is not particularly limited, but can be set to ⁇ 20 ° C. to 100 ° C. from the viewpoint of general handling. At the time of precipitation, the lower temperature is more likely to be precipitated, so that the temperature can be preferably ⁇ 10 to 70 ° C., more preferably 0 to 50 ° C.
  • the time for performing the precipitation step is not particularly limited, but is 1 minute to 1 week, preferably 30 minutes to 1 hour.
  • the precipitated solid can be separated from the liquid using a known method such as filtration or centrifugation. This may be washed with water or a hydrochloric acid solution, and further washed with an organic solvent such as isopropanol if necessary.
  • the obtained solid can be dehydrated by air drying and drying under reduced pressure.
  • the production method according to the present invention can be carried out as follows: An alkali metal salt of pyrroloquinoline quinone is dissolved in water.
  • the pH at this time is desirably 3 or more and 13 or less, and more preferably 5 to 12.
  • an alkaline solution may be added to adjust the pH.
  • the temperature at this time may be 0 to 140 ° C., but it is preferably 20 to 90 ° C., and no special equipment is required, and it is easy to use. In terms of solubility, high temperatures are easy to dissolve, so setting it to 50 ° C. or higher increases productivity.
  • a solid is precipitated by adding an acid to this solution and lowering it to the range of the present invention.
  • the solid that has been prepared and precipitated under these conditions is a free form of pyrroloquinoline quinone, and 12.4 °, 15.5 °, and 16.6 as 2 ⁇ peaks using Cu K ⁇ radiation in powder X-ray diffraction. It is a crystal of pyrroloquinoline quinone showing °, 18.2 °, 24.0 °, 24.9 °, 28.0 ° (all within the range of ⁇ 0.2 °).
  • these peaks can also be observed with a general powder X-ray diffractometer equipped with a monochromator. Since the crystal form defined in the present invention includes a measurement error, it is only necessary to have a reasonable identity regarding the angle of the peak.
  • a method for producing a compound represented by formula (1) (free form of pyrroloquinoline quinone), wherein an alkali metal salt of a compound represented by formula (1) is dissolved.
  • An acid or acidic solution is added to the resulting aqueous solution to prepare a solution having a pH of 1.5 or lower, and a precipitate is obtained.
  • the alkali metal salt is a sodium salt, potassium salt, lithium salt, cesium salt.
  • the acid is preferably selected from the group consisting of hydrochloric acid, hydrogen bromide, hydrogen iodide, perchloric acid, phosphoric acid, nitric acid, acetic acid, formic acid, oxalic acid, lactic acid and citric acid.
  • a production method is provided that is a combination of one or two or more selected acids, and preferably has a pH of 1 or less.
  • a process for producing a compound represented by formula (1) (free form of pyrroloquinoline quinone), wherein an alkaline solution of the compound represented by formula (1) is added to an acidic solution. Adding a metal salt or an aqueous solution in which the alkali metal salt is dissolved to prepare a solution having a pH of 1.5 or lower, and obtaining a precipitate.
  • the alkali metal salt is a sodium salt or a potassium salt.
  • the acid is hydrochloric acid, hydrogen bromide, hydrogen iodide, perchloric acid, phosphoric acid, nitric acid, acetic acid, formic acid, oxalic acid, lactic acid and
  • a production method is provided which is a combination of one or two or more acids selected from the group consisting of citric acid, and preferably has a pH of 1 or less.
  • a process for producing a compound represented by formula (1) (free form of pyrroloquinoline quinone), wherein an alkali metal salt of the compound represented by formula (1) is dissolved.
  • An acid or acidic solution is added to the resulting aqueous solution to prepare a solution having a pH of 1.5 or less, and a precipitate is obtained.
  • the alkali metal salt is a sodium salt, potassium salt, lithium salt, cesium Selected from the group consisting of a salt and a rubidium salt.
  • the acid is one or a combination of two or more acids including at least hydrochloric acid, and preferably has a pH of 1 or less. .
  • the free form obtained by the present invention has a low alkali metal content and high crystallinity, so that the purity is high.
  • This diffraction peak can be distinguished from disodium salt and monosodium salt, and is effective for quality control.
  • the free form of pyrroloquinoline quinone obtained by the production method according to the present invention can be used as an active ingredient of a pharmaceutical or functional food, and is in the form of an external preparation for skin, injection, oral preparation, suppository, etc. Can be provided in the form of food and drink, nutrition-enhanced food, various hospital foods, etc.
  • saccharides such as water, fructose and glucose, oils such as falling raw oil, soybean oil and olive oil, and glycols such as polyethylene glycol and polypropylene glycol are used as the liquid agent. it can.
  • solid preparations such as tablets, capsules, granules, etc.
  • sugars such as lactose, sucrose, mannitol, etc., kaolin, talc, magnesium stearate etc. as lubricants, starch, sodium alginate as disintegrants
  • binder examples include polyvinyl alcohol, cellulose, and gelatin
  • surfactant include fatty acid esters
  • plasticizer include glycerin and the like, but are not limited thereto. You may add a dissolution accelerator, a filler, etc. as needed.
  • pyrroloquinoline quinone can be used alone or in combination with other materials.
  • Materials that can be combined include vitamins such as vitamin B group, vitamin C ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ and vitamin E, amino acids, carotenoids such as astaxanthin, ⁇ -carotene and ⁇ -carotene, ⁇ 3 fatty acids such as docosahexaenoic acid and eicosapentaenoic acid Examples thereof include ⁇ 6 fatty acids such as arachidonic acid, but are not limited thereto.
  • the present invention further provides the following inventions.
  • the acid used for precipitating pyrroloquinoline quinone is selected from hydrochloric acid, hydrogen bromide, hydrogen iodide, perchloric acid, sulfuric acid, phosphoric acid, nitric acid, acetic acid, formic acid, oxalic acid, lactic acid and citric acid.
  • Example 1 As a raw material PQQ disodium salt, a reagent (trade name: Bio PQQ) manufactured by Mitsubishi Gas Chemical Co., Ltd. was used. The purity of the PQQ disodium salt by high-performance liquid chromatography UV absorption was 99.0%.
  • Example 2 The raw material of Example 1 (PQQ disodium salt) was dissolved in water, the pH was adjusted to pH 8 with sodium hydroxide, sodium chloride was added to precipitate PQQ trisodium salt, washed with ethanol and dried. This was used for the experiment.
  • PQQ trisodium salt 0.9 g was dissolved in water (60 g). About 2 g of concentrated hydrochloric acid was added to this while stirring. The pH of the obtained solution was 0.6. After stirring overnight, the mixture was filtered, washed with isopropanol, and dried under reduced pressure to obtain 0.35 g of a red solid. The results of powder X-ray diffraction and Na analysis of the obtained red solid were the same as those in Example 1, with no residual sodium and free crystals.
  • Example 3 The same PQQ disodium salt 1 g as in Example 1 was added to a mixture of 3.5 g of concentrated hydrochloric acid and 3.5 g of water, and the pH of the resulting solution was adjusted to 1. Stirring was carried out at room temperature for 1 hour, filtered and washed with water. Drying under reduced pressure gave 0.79 g of a red solid. The resulting red solid had a sodium / PQQ molar ratio of 0.06, with some sodium remaining.
  • Comparative Example 1 The same raw material (PQQ disodium salt) as in Example 1 was used and the operation was carried out in the same manner. However, hydrochloric acid was added to adjust the pH of the solution to 2.3, and 1.75 g of a red solid was precipitated.
  • the molar ratio of sodium / PQQ was 0.96 and it was a monosodium salt.
  • the powder X-ray diffraction data at this time shows 8.5, 11.9, 15.7, 16.9, 24.4, 27.3 as 2 ⁇ peaks using Cu K ⁇ radiation in powder X-ray diffraction. It was. The peak was different from the free body.
  • Comparative Example 2 The same operation as in Comparative Example 1 was performed. However, 4N sulfuric acid was used to adjust the pH, the pH of the solution was adjusted to 2.5, and 1.71 g of a red solid was obtained.
  • Comparative Example 3 The experiment was conducted using the same raw material (PQQ disodium salt) as in Example 1 as a solid. 2 g of PQQ disodium salt was added to 200 g of 4N sulfuric acid to adjust the pH to 0.6 to obtain 1.66 g of a brown solid.
  • the molar ratio of sodium / PQQ was 0.96, which was in the range of monosodium salt.
  • the powder X-ray diffraction data showed a spectrum without a clear peak and low crystallinity. It was a broad peak centered at 26.6 as a 2 ⁇ peak using Cu K ⁇ radiation by powder X-ray diffraction. In this case, sodium remained, discoloration occurred, and the crystallinity was low.

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Abstract

　本発明は、有機溶媒やイオン交換樹脂を使用することなく、簡便に、ピロロキノリンキノンのフリー体を製造する方法とその高純度な結晶の提供を目的とする。本発明によれば、ピロロキノリンキノンのアルカリ金属塩を溶解してなるｐＨ１．５以下の溶液を調製し、析出物を得ることを含んでなる、ピロロキノリンキノンのフリー体の製造方法およびその高純度な結晶が提供される。

Description

ピロロキノリンキノンのフリー体 関連出願の参照
　本特許出願は、２００９年１１月６日に提出された日本出願である特願２００９－２５５０５６の利益を享受する。この先の出願における全開示内容は、引用することにより本明細書の一部とされる。
　本発明は、ピロロキノリンキノンのフリー体の製造方法および該製造方法により得られる高純度な結晶に関する。
　ピロロキノリンキノン（以下、「ＰＱＱ」と表すことがある）は、新しいビタミンの可能性があることが提案されて（例えば、nature, vol.422, 24 April, 2003, p832）、健康補助食品、化粧品などに有用な物質として注目を集めている。ＰＱＱは、細菌に限らず、真核生物のカビ、酵母に存在し、補酵素として重要な働きを行っている。また、ＰＱＱについては、近年までに、細胞の増殖促進作用、抗白内障作用、肝臓疾患予防治療作用、創傷治癒作用、抗アレルギ－作用、逆転写酵素阻害作用、グリオキサラ－ゼＩ阻害作用－制癌作用など多くの生理活性が明らかにされている。このＰＱＱは、有機化学的合成法（JACS、第103巻、第5599～5600頁（1981））や発酵法（特開平１－２１８５９７号公報）などの方法により得たＰＱＱをクロマトグラフィーに供し、流出液中のＰＱＱ区分を濃縮して、晶析により結晶化し（特許第２０７２２８４号公報）、乾燥して得ることができる。しかし、こうして得られる結晶は、使用するｐＨや析出条件によってかわるが通常アルカリ金属塩である。
　ＰＱＱは、誘導体合成の原料や、アルカリ金属塩では溶けない有機溶媒に溶解した製品として利用するために、フリー体が求められている。しかし、ＪＡＣＳ、第１０３巻、第５５９９～５６００頁（１９８１）では、ｐＨを２．５にすることでＰＱＱの結晶を得ているが、本発明者が鋭意検討した結果、この領域ではＰＱＱはフリー体ではなく、１アルカリ金属塩であることが判明した。さらに単結晶Ｘ線回折の結果、フリー体の構造が報告されているが（nature, vol. 280, 30 August, 1979, P844）、これはアセトン付加体が含まれている。
　通常、アルカリ金属塩をフリー体にするにはイオン交換樹脂の使用や、酸性にして有機溶媒抽出する方法が一般的である。しかし、イオン交換樹脂の場合、ＰＱＱのフリー体の溶解度が低いために大量の抽出液が必要であり、また、その後の濃縮工程も必要になり効率的でない。また、有機溶媒を使用して抽出する場合、装置は有機溶媒対応にしたものとなり、高価である。また、火災や爆発の危険性も増えるため、最小限にとどめることが好ましい。
　本発明者らは、ピロロキノリンキノンのアルカリ金属塩が溶解された溶液のｐＨを１．５以下にすることにより、ピロロキノリンキノンのフリー体が析出されることを見出した（実施例１～３）。本発明は、この知見に基づくものである。
　本発明は、有機溶媒やイオン交換樹脂を使用することなく、簡便に、ピロロキノリンキノンのフリー体を製造する方法とその高純度な結晶の提供を目的とする。
　本発明によれば　式（１）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
 で表される化合物（ピロロキノリンキノンのフリー体）の製造方法であって、該化合物のアルカリ金属塩を溶解してなるｐＨ１．５以下の溶液を調製し、析出物を得ることを含んでなる製造方法（以下、「本発明による製造方法」ということがある）が提供される。
　本発明によれば、また、本発明による製造方法により製造される、式（１）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 で表される化合物（以下、「本発明による化合物」ということがある）が提供される。
　本発明によれば、さらに、式（１）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 で表される化合物の結晶（以下、「本発明による結晶」ということがある）が提供される。
　本発明によれば、有機溶媒やイオン交換樹脂を使用することなく、アルカリ金属の含有量が少なく、結晶性が良いため純度が高いピロロキノリンキノンのフリー体を簡便に製造可能である点で有利である。
　本発明で得られるＰＱＱフリー体は、医薬または機能性食品の有効成分とすることができ、皮膚外用剤、注射剤、経口剤、坐剤等の形態、あるいは、日常食する飲食物、栄養補強食、各種病院食等の形態で提供可能である点で有利である。
実施例１で得られたＰＱＱフリー体の粉末Ｘ線解析の結果を示した図である。
発明の具体的説明
　本発明によれば、ピロロキノリンキノンのアルカリ金属塩を溶解してなるｐＨ１．５以下の溶液を調製し、析出物を得ることにより、ピロロキノリンキノンのフリー体を製造することができる。
　本願明細書において「ピロロキノリンキノン」および「ピロロキノリンキノンのフリー体」とは、下記式（１）で表される化合物を意味し、該化合物を表すために互換的に用いられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
　本願明細書において「ピロロキノリンキノンのアルカリ金属塩」とは、式（１）で表される化合物のアルカリ金属塩を意味する。
　本願明細書において「ピロロキノリンキノンのフリー体の結晶」とは、式（１）で表される化合物の結晶を意味し、固体状態でピロロキノリンキノン分子が規則正しく整列している状態であり、一般的には、高純度で安定性の高い状態である。式（１）の化合物（ピロロキノリンキノンのフリー体）が結晶の形態であるか否かは、粉末Ｘ線回析でピークを検出することにより確認することができる。
　本発明による製造方法は、ピロロキノリンキノンのアルカリ金属塩を溶解してなるｐＨ１．５以下の溶液を調製し、析出物を得る工程を実施することにより行うことができる。
　本発明において、ピロロキノリンキノンのフリー体を製造するための原料として使用するピロロキノリンキノンのアルカリ金属塩としては、ナトリウム、カリウム、リチウム、セシウム、ルビジュウムなどの塩が挙げられる。これらの塩は単独でも、混合でもどちらでも良い。好ましくは、単独のナトリウム、カリウムの塩であり、容易に購入しやすい点で、ナトリウム塩がより好ましい。ピロロキノリンキノンのアルカリ金属塩における塩の置換数は、１～３であり、モノアルカリ金属塩、ジアルカリ金属塩、トリアルカリ金属塩のどれでも良いが、好ましくは、ジアルカリ金属塩である。ピロロキノリンキノンのアルカリ金属塩として、特に好ましくはジナトリウム塩である。
　このアルカリ金属塩を用いて、ｐＨ１．５以下の水溶液中で析出させることでフリー体を製造することができる。同様にしてアルカリ土類金属やアンモニウム、有機アンモニウム塩、遷移金属塩でも同様に製造できる。
　本発明において原料に用いるピロロキノリンキノンのアルカリ金属塩は、市販されているものを入手することができる。
　本発明において原料に用いるピロロキノリンキノンのアルカリ金属塩は、有機化学的合成法や発酵法などの公知の方法により製造することができる。
　本発明において原料に用いるピロロキノリンキノンのアルカリ金属塩は、結晶でもよいし、非晶質でもよい。また、不純物を含んでいてもよい。
　ピロロキノリンキノンのアルカリ金属塩を溶液として使用する場合は、水、アルコール等の溶媒に溶解して使用することができるが、ピロロキノリンキノンのアルカリ金属塩の水溶液として使用することが好ましい。
　ピロロキノリンキノンのアルカリ金属塩の溶液は、例えば、０．００１～１ｗ／ｗ％となるように調製することができるが、好ましくは、０．００５～０．５ｗ／ｗ％、より好ましくは、０．０１～０．２５ｗ／ｗ％である。
　ピロロキノリンキノンのアルカリ金属塩を溶液として使用する場合は、該溶液のｐＨは、３以上で１３以下とすることができ、好ましくは、５～１２であり、より好ましくは、７～１０である。ｐＨを調整するために、アルカリ性物質（例えば、水酸化ナトリウム等）を加えることができる。このときの温度は０～１４０℃とすることができるが、好ましくは、２０～９０℃が特別な装置も要らず、使用しやすい。溶解度の面では高い温度が溶解しやすいため、生産性の点から、５０℃以上にするのが好ましい。
　本発明による製造方法において、目的のピロロキノリンキノンのフリー体を析出させるために、ピロロキノリンキノンのアルカリ金属塩を溶解してなるｐＨ１．５以下の溶液を調製する。
　ｐＨ１．５以下の溶液の調製は、酸を使用することにより行うことができる。
　溶液のｐＨは１．５以下、好ましくは、１以下とすることができる。ｐＨが２以上であればアルカリ金属が残留、つまり、１ナトリウム塩以上の塩になってしまう。それを防ぐために使用するｐＨは１．５以下が良く、さらに好ましくは１以下で析出させることが好ましい。析出の際にｐＨを下げていないと、析出する結晶が１アルカリ金属塩の構造に由来するピークを有する固体になるために、結晶性を良くするには１以下であることが望ましい。
　本発明による製造方法において、溶液のｐＨは０．５～１．５、好ましくは、０．５～１、より好ましくは、０．６～０．９とすることができる。
　本発明による製造方法において、ピロロキノリンキノンのアルカリ金属塩を溶解してなるｐＨ１．５以下の溶液を調製する工程について、ピロロキノリンキノンのアルカリ金属塩溶液に対して酸を加えてｐＨを下げることもできるし、酸の溶液にピロロキノリンキノンのアルカリ金属塩溶液を添加して実施することもできる。また、再結晶等の操作を行う場合は、ピロロキノリンキノンのアルカリ金属塩の固体と酸と混合することにより実施することもできる。この場合、急激に酸を加えた場合、混合状態が均一に起こらないため、アルカリ金属が残留しやすいが、使用する水の量も少なく、簡便である。
　具体的には、ピロロキノリンキノンのアルカリ金属塩を含んでなるｐＨ１．５以下の溶液は、下記工程（以下「調製工程」ということがある）：
（ｉ）ピロロキノリンキノンのアルカリ金属塩を溶解してなる溶液に、酸または酸性溶液を添加し、該溶液のｐＨを１．５以下にする工程； 
（ｉｉ）酸性溶液に、ピロロキノリンキノンのアルカリ金属塩またはピロロキノリンキノンのアルカリ金属塩を溶解してなる溶液を添加し、該溶液のｐＨを１．５以下にする工程；または
（ｉｉｉ）酸に、ピロロキノリンキノンのアルカリ金属塩を溶解してなる溶液を添加し、該溶液のｐＨを１．５以下にする工程
を実施することにより調製することができる。好ましくは、ピロロキノリンキノンのアルカリ金属塩を溶解してなる溶液に、酸または酸性溶液を添加し、該溶液のｐＨを１．５以下に調整する工程を実施することにより調製することができる。
　本願明細書における「添加」については、添加物を添加対象に一時に添加することもできるし、徐々に添加することもできる。
　調製工程において使用される酸は、ｐＨを下げることができる限り、この種類は特に制限されない。無機酸、有機酸、どちらでも使用できる。具体的には、無機酸としては、塩酸、臭化水素、ヨウ化水素、過塩素酸、硫酸、燐酸、硝酸等が挙げられるが、好ましくは、塩酸、臭化水素、ヨウ化水素、過塩素酸、燐酸、硝酸、より好ましくは、塩酸である。有機酸としては、酢酸、蟻酸、シュウ酸、乳酸、クエン酸等が挙げられるが、好ましくは、酢酸、蟻酸、シュウ酸、乳酸、クエン酸である。使用するｐＨが低いために酸がピロロキノリンキノンに残留する危険性があることから、蒸気圧があり、毒性のない一価の酸、例えば塩酸が最も好ましい。また、塩酸は本発明の範囲にも規定する結晶性の高い固体を与え、結晶性の面からも優れている。多価の酸はアルカリ金属イオンとの塩の溶解度が低いことが多く、固体に残留しやすい。硫酸は発煙等がなく使用しやすいが、固体に残留しやすく、また、脱水性があるために変色を起こす危険性があるために他の酸と組み合わせることが好ましい。
　酸は、単独または２種以上混合して使用することができるが、少なくとも塩酸を使用すること、すなわち、塩酸単独または塩酸と他の1種以上の酸（例えば、臭化水素、ヨウ化水素、過塩素酸、硫酸、燐酸、硝酸等）とを組み合わせて使用することが好ましい。
　酸は、希釈酸（酸性溶液）として使用することができる。酸を酸性溶液として使用する場合は、酸を、水等の溶媒に溶解して使用することができる。
　酸性溶液は、例えば、０．１～２０ｇ／Ｌとなるように調製することができるが、好ましくは、０．５～１０ｇ／Ｌである。　
　ピロロキノリンキノンのアルカリ金属塩と酸とのモル比は、１：１～１：１０００、好ましくは、１：２～１：１００とすることができる。
　調製工程を実施する温度は特に制限はないが、一般的な取り扱いやすさの点から、－２０℃から１４０℃とすることができる。ピロロキノリンキノンのアルカリ金属塩の溶解度を上げたい場合は加温することができる。
　調製工程を実施する時間は特に制限がないが、５分から１週間ぐらいで行うことができる。スケールが小さい場合は短時間ですむが、大きな場合は長時間必要である。
　上記の調製工程により調製されたピロロキノリンキノンのアルカリ金属塩を溶解してなるｐＨ１．５以下の溶液から析出物を得ることができる。
　本願明細書において「析出物」とは、液相（溶液）から表れた固相（固体）を意味する。
　本願発明による製造方法において、析出物を得るために、上記調製工程により調製されたピロロキノリンキノンのアルカリ金属塩を溶解してなるｐＨ１．５以下の溶液を放置する工程（以下「析出工程」ということがある）を実施することができる。該工程において、該溶液は、攪拌されてもよい。
　攪拌は、磁気攪拌、機械攪拌、手動攪拌、振とう攪拌等に供することにより実施することができるが、好ましくは、磁気攪拌または機械攪拌である。
　析出工程を実施する温度は特に制限はないが、一般的な取り扱いやすさの点から、－２０℃から１００℃とすることができる。析出させる時には低い温度のほうが析出しやすいため、好ましくは、－１０～７０℃、より好ましくは０～５０℃とすることができる。
　析出工程を実施する時間は特に制限がないが、１分～１週間、好ましくは、３０分～１時間である。
　析出した固体（析出物）は、濾過、遠心分離等の公知の方法を用いて液と分けることができる。これを水、塩酸溶液で洗い、必要であればイソプロパノールのような有機溶媒でさらに洗えばよい。この得られた固体は風乾、減圧乾燥することで水分を除くことができる。
　本発明による製造方法は、より具体的には、下記のように実施することができる：
　ピロロキノリンキノンのアルカリ金属塩を水に溶解させる。このときのｐＨは３以上で１３以下であることが望ましく、より好ましくは５から１２である。この時にｐＨ調整のためにアルカリ性の溶液を加えて調整してもよい。このときの温度は０から１４０℃で使用すれは良いが、好ましくは２０から９０℃が特別な装置も要らず、使用しやすい。溶解度の面では高い温度が溶解しやすいため、５０℃以上にするのが生産性を高める。この溶液に酸を加え、本発明の範囲まで下げることで固体が析出する。または、アルカリ金属塩の溶液を酸性溶液の中に添加することで析出させることができる。固体のアルカリ金属塩を粉末として酸性溶液に添加することでも製造できる。ｐＨを返すために混合する時は攪拌しながらするとアルカリ金属の残留を抑制することができる。
　このような条件で調整し、析出してきた固体はピロロキノリンキノンのフリー体であり、粉末Ｘ線回折でＣｕ Ｋα放射線を用いた２θのピークとして１２．４°、１５．５°、１６．６°、１８．２°、２４．０°、２４．９°、２８．０°（いずれも±０．２°の範囲内）を示すピロロキノリンキノンの結晶である。
＜粉末Ｘ線回折による回折角２θの測定条件＞
装置：株式会社マックサイエンス製Ｍ１８ＸＣＥ
Ｘ線：Ｃｕ／管電圧４０ｋＶ／管電流１００ｍＡ
発散スリット：１°
散乱スリット：１°
受光スリット：０．３ｍｍスキャンスピード：４．０００°／ｍｉｎ
サンプリング幅：０．０２０°
　なお、これらのピークは、その他、モノクロメータが装着された一般的な粉末Ｘ線回折装置で観測することもできる。本発明で規定する結晶形は測定誤差も含まれることから、ピークの角度に関する合理的な同一性があればよい。
　本発明の好ましい態様によれば、式（１）で表される化合物（ピロロキノリンキノンのフリー体）の製造方法であって、式（１）で表される化合物のアルカリ金属塩を溶解してなる水溶液に酸または酸性溶液を添加してｐＨ１．５以下の溶液を調製し、析出物を得ることを含んでなり、好ましくは、アルカリ金属塩が、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、セシウム塩、およびルビジュウム塩からなる群から選択され、好ましくは、酸が、塩酸、臭化水素、ヨウ化水素、過塩素酸、燐酸、硝酸、酢酸、蟻酸、シュウ酸、乳酸およびクエン酸からなる群から選択される１種または２種以上の酸の組み合わせであり、好ましくは、ｐＨが１以下である製造方法が提供される。
　本発明の好ましい態様によれば、また、式（１）で表される化合物（ピロロキノリンキノンのフリー体）の製造方法であって、酸性溶液に、式（１）で表される化合物のアルカリ金属塩または該アルカリ金属塩を溶解してなる水溶液を添加してｐＨ１．５以下の溶液を調製し、析出物を得ることを含んでなり、好ましくは、アルカリ金属塩が、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、セシウム塩、およびルビジュウム塩からなる群から選択され、好ましくは、酸が、塩酸、臭化水素、ヨウ化水素、過塩素酸、燐酸、硝酸、酢酸、蟻酸、シュウ酸、乳酸およびクエン酸からなる群から選択される１種または２種以上の酸の組み合わせであり、好ましくは、ｐＨが１以下である製造方法が提供される。
　本発明のより好ましい態様によれば、式（１）で表される化合物（ピロロキノリンキノンのフリー体）の製造方法であって、式（１）で表される化合物のアルカリ金属塩を溶解してなる水溶液に酸または酸性溶液を添加してｐＨ１．５以下の溶液を調製し、析出物を得ることを含んでなり、好ましくは、アルカリ金属塩が、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、セシウム塩、およびルビジュウム塩からなる群から選択され、好ましくは、酸が、少なくとも塩酸を含む１種または２種以上の酸の組み合わせであり、好ましくは、ｐＨが１以下である製造方法が提供される。
　本発明で得られるフリー体はアルカリ金属の含有量も少なく、結晶性が良いため純度も高い。この回折ピークはジナトリウム塩、モノナトリウム塩と区別することができ、品質管理に有効である。
　本発明による製造方法で得られるピロロキノリンキノンのフリー体は、医薬または機能性食品の有効成分とすることができ、皮膚外用剤、注射剤、経口剤、坐剤等の形態、あるいは、日常食する飲食物、栄養補強食、各種病院食等の形態で提供可能である。調製の際に使用される添加剤としては、液剤としては水、果糖、ブドウ糖等の糖類、落下生油、大豆油、オリーブ油等の油類、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール等のグリコール類を用いることができる。
　錠剤、カプセル剤、顆粒剤などの固形剤の賦型剤としては乳糖、ショ糖、マンニット等の糖類、滑沢剤としてはカオリン、タルク、ステアリン酸マグネシウム等、崩壊剤としてデンプン、アルギン酸ナトリウム、結合剤としてポリビニルアルコール、セルロース、ゼラチン等、界面活性剤としては脂肪酸エステル等、可塑剤としてグリセリン等を例示することができるが、これらに限定されるものではない。必要に応じて溶解促進剤、充填剤等を加えてもよい。
　また、ピロロキノリンキノンのフリー体は、単独でも、他の素材と組み合わせても使用できる。組み合わせ可能な素材としては、ビタミンＢ 群、ビタミンＣ およびビタミンＥ 等のビタミン類、アミノ酸類、アスタキサンチン、α-カロテン、β-カロテン等のカロテノイド類、ドコサヘキサエン酸、エイコサペンタエン酸等のω　３脂肪酸類、アラキドン酸等のω６脂肪酸類などが例示されるが、これらに限定されるものではない。
　本発明によれば、さらに、以下の発明が提供される。
（１）ピロロキノリンキノンのアルカリ金属塩をｐＨ１．５以下の水溶液中で析出させることを特徴とするフリー体の製造方法。
（２）ピロロキノリンキノンのアルカリ金属塩がナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、セシウム塩及びルビジュウム塩から選択されることを特徴とする（１）記載のフリー体の製造方法。
（３）ピロロキノリンキノンのアルカリ金属塩がジナトリウム塩であることを特徴とする（１）記載のフリー体の製造方法。
（４）ピロロキノリンキノンを析出する際に使用する酸が塩酸、臭化水素、ヨウ化水素、過塩素酸、硫酸、燐酸、硝酸、酢酸、蟻酸、シュウ酸、乳酸及びクエン酸から選択されることを特徴とする（１）～（３）のいずれかに記載のフリー体の製造方法。
（５）粉末Ｘ線回折でＣｕ　Ｋα放射線を用いた２θのピークとして１２．４°、１５．５°、１６．６°、１８．２°、２４．０°、２４．９°、２８．０°を示すピロロキノリンキノンの結晶。
　実施例および比較例によって本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの例にのみ限定されるものではない。また、特に断りのない限り本文中の％は重量％を示す。
　本発明に関する分析は以下のようにして行った。
[ＰＱＱ分析]
装置： 島津製作所、高速液体クロマトグラフィー、LC-20A
カラム：YMC-Pack ODS-TMS(5μm)、150x4.6mm I.D.
測定温度：40℃
検出：２６０ｎｍにおける吸光度
溶離液：100mM CH3COOH/100mM CH3COONH4 (30/70, pH5.1)
溶出速度：1.5mL/min
[Ｎａ分析]
ポンプ： 島津製作所、LC-6A
カラムオーブン：島津製作所、HIC-6A
測定温度：40℃
検出器：東ソー株式会社、電気伝導度計CM-8000
カラム：昭和電工株式会社、Shodex、IC Y-521
溶離液：4mM HNO3
溶出速度：1.0mL/min
[粉末X線回折]
装置：株式会社マックサイエンス製Ｍ１８ＸＣＥ
Ｘ線：Cu／管電圧４０kV／管電流１００mA
発散スリット：1°
散乱スリット：1°
受光スリット：0.３mmスキャンスピード：4.000°／min
サンプリング幅：0.02
実施例１
　原料のＰＱＱジナトリウム塩は三菱ガス化学社製の試薬（商品名：バイオＰＱＱ）を使用した。ＰＱＱジナトリウム塩の、高速液体クロマトグラフィーのＵＶ吸収による純度は９９．０％であった。
　上記のジナトリウム塩２ｇを水１９８ｇに加えてジナトリウム塩水溶液を得た。得られた溶液はＮａＯＨでｐＨ９にあわせた。次に、この溶液に和光純薬製濃塩酸を水で５０％希釈した液７．７ｇを攪拌しながら添加してｐＨを０．９にした。３０分攪拌後、析出した固体をろ過し、水、イソプロパノールで洗った。これを減圧乾燥５０℃で一晩行った。回収した赤色結晶の重量は１．６ｇであった。Ｎａ分析によると、Ｎａ含有量０でナトリウムは含まれず、簡単な方法でＰＱＱフリー体が得られた。得られたＰＱＱフリー体の粉末Ｘ線解析の結果を図１に示す。粉末Ｘ線回折でＣｕ　Ｋα放射線を用いた２θのピークとして１２．４°、１５．５°、１６．６°、１８．２°、２４．０°、２４．９°、２８．０°を示していた。
実施例２
　実施例１の原料（ＰＱＱジナトリウム塩）を水に溶かし、ｐＨを水酸化ナトリウムでｐＨ８にして、食塩を加えてＰＱＱトリナトリウム塩を析出させ、エタノールで洗浄し乾燥した。これを実験に使用した。
　ＰＱＱトリナトリウム塩０．９ｇを水（６０ｇ）に溶かした。これに攪拌しながら濃塩酸を約２ｇ加えた。得られた溶液のｐＨは０．６を示した。一晩攪拌後、濾過し、イソプロパノールで洗い、減圧乾燥して、赤色固体０．３５ｇを得た。得られた赤色固体の粉末Ｘ線回折、Ｎａ分析の結果は実施例１と同様の結果となり、ナトリウムの残留はなく、フリー体の結晶であった。
実施例３
　実施例１と同じＰＱＱジナトリウム塩１ｇの固体を、濃塩酸３．５ｇと水３．５ｇの混合液に加え、得られた溶液のｐＨを１とした。攪拌を室温で１時間行い、ろ過し、水で洗った。減圧乾燥して、赤色固体０．７９ｇを得た。得られた赤色固体におけるナトリウム／ＰＱＱのモル比は０．０６で、わずかにナトリウムが残留した。
比較例１
　実施例１と同じ原料（ＰＱＱジナトリウム塩）を使用し、操作を同じように行った。ただし、塩酸を加えて、溶液のｐＨを２．３とし、赤色固体１．７５ｇを析出させた。
　この物質を分析した結果、ナトリウム／ＰＱＱのモル比は０．９６で１ナトリウム塩であった。このときの粉末Ｘ線回折のデータは粉末Ｘ線回折でＣｕ　Ｋα放射線を用いた２θのピークとして８．５，１１．９，１５．７，１６．９，２４．４，２７．３を示した。フリー体とは異なるピークであった。
比較例２
　比較例１と同様の操作を行った。ただし、ｐＨをあわせるのに４Ｎ　硫酸を使用し、溶液のｐＨを２．５にし、赤色の固体１．７１ｇを得た。
　この物質を分析した結果、ナトリウム／ＰＱＱのモル比は０．９４で１ナトリウム塩であった。このときの粉末Ｘ線回折のデータは比較例１と同様の位置にピークを示していた。
比較例３
　実施例１と同様の原料（ＰＱＱジナトリウム塩）を固体として使用して実験を行った。４Ｎ　硫酸２００ｇにＰＱＱジナトリウム塩２ｇを添加し、ｐＨ０．６にし、茶色固体１．６６ｇを得た。
　この物質を分析した結果、ナトリウム／ＰＱＱのモル比は０．９６で１ナトリウム塩の範囲であった。この粉末Ｘ線回折のデータは明確なピークのないスペクトルで結晶性が低かった。粉末Ｘ線回折でＣｕ　Ｋα放射線を用いた２θのピークとして２６．６を中心とするブロードなピークであった。この場合、ナトリウムが残留し、変色が起こり、結晶性も低かった。

Claims (10)

  1. 　式（１）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     で表される化合物の製造方法であって、該化合物のアルカリ金属塩を溶解してなるｐＨ１．５以下の溶液を調製し、析出物を得ることを含んでなる、製造方法。
  2. 　アルカリ金属塩が、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、セシウム塩およびルビジュウム塩から選択される、請求項１に記載の製造方法。
  3. 　アルカリ金属塩が、ジアルカリ金属塩である、請求項１に記載の製造方法。
  4. 　アルカリ金属塩が、ジナトリウム塩である、請求項１に記載の製造方法。
  5. 　ｐＨ１．５以下の溶液が、酸を使用することにより調製される、請求項１に記載の製造方法。
  6. 　酸が、塩酸、臭化水素、ヨウ化水素、過塩素酸、硫酸、燐酸、硝酸、酢酸、蟻酸、シュウ酸、乳酸およびクエン酸から選択される１種または２種以上の組み合わせである、請求項５に記載の製造方法。
  7. 　式（１）で表される化合物が、結晶の形態である、請求項１～６のいずれかに記載の製造方法。
  8. 　請求項１～７のいずれか一項に記載の製造方法により製造される、式（１）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     で表される化合物。
  9. 　式（１）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     で表される化合物の結晶。
  10. 　粉末Ｘ線回折でＣｕ Ｋα放射線を用いた２θのピークとして１２．４°、１５．５°、１６．６°、１８．２°、２４．０°、２４．９°、２８．０°（いずれも±０．２°）を示す、請求項９に記載の結晶。
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