WO2011040718A2 - 웨스턴 블롯용 나노섬유 멤브레인 및 그 제조방법 - Google Patents

웨스턴 블롯용 나노섬유 멤브레인 및 그 제조방법 Download PDF

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김철현
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    • Y10T442/2762—Coated or impregnated natural fiber fabric [e.g., cotton, wool, silk, linen, etc.]
    • Y10T442/277—Coated or impregnated cellulosic fiber fabric

Definitions

  • the present invention relates to a membrane for a western blot composed of nanofibers and a method for manufacturing the same, and specifically, the average diameter of nanofibers having an average fiber diameter of 50 to 1000 nm by electrospinning through a hot plate calendering process.
  • the present invention relates to a nanofiber membrane for western blot having a three-dimensional open pore structure having a pore size of 0.1 to 1.0 ⁇ m and a thickness of 30 to 200 ⁇ m, and a method of manufacturing the same.
  • the PVdF-based membrane is superior to nitrocellulose, nylon, and the like, and has excellent binding sensitivity, membrane strength, handleability, and the like.
  • Western blot is a technique used to isolate and detect a specific protein from a tissue homogenate or extract of a given sample. It is used to find a specific protein from several protein mixtures. It is a method of detecting the presence of a protein by causing an antigen-antibody reaction.
  • Western blots are also used to separate native gels or denatured proteins by the size of the polypeptide or the three-dimensional structure of the protein.
  • Western blots are electrophoresed by mixing proteins extracted from cells or tissues with a sample buffer and placing them in a molecular sieve made of acrylamide. Then, the material called SDS (sodium dodecylsulfate, SDS-page) in the sample buffer is charged to the positive (+) electricity to the whole of the protein. At this time, the SDS molecular sieve interferes with the progress of the protein, so that small molecules move quickly and large molecules move slowly to form bands of various sizes. At this time, the membrane is placed on the gel separated according to the size, and electricity is applied to transfer the membrane to the membrane in a separated state.
  • an antibody to a specific protein to be detected is bound, and then a secondary antibody specific for the antibody is bound to image the reaction caused by color development by X-ray.
  • the membrane used for this purpose is a porous membrane composed of a polymer capable of hydrophobic interaction with a protein such as PVdF and having an average pore diameter of 0.2 ⁇ m to 0.45 ⁇ m.
  • Such a porous membrane is prepared by a method such as dry, wet, or dry-wet casting by phase separation in which a solvent and a polymer are poured into a non-solvent such as water.
  • a solvent and a polymer are poured into a non-solvent such as water.
  • the manufacturing cost is expensive and there is a limit to mass production.
  • the porous membrane has a disadvantage in that the pore structure does not have a uniform distribution when manufactured by the phase transition method.
  • the membrane is immersed in methanol before use and partially hydrophilized to undergo a buffer solution. It is necessary to maximize the compatibility with, and if the hydrophilization process is omitted, the adsorption of the protein is not made sufficiently there is a fear that the sensitivity is lowered.
  • the methanol pretreatment process greatly reduces the strength of the membrane and may cause cracks, and since bubbles are formed and a background is generated, there is a limit in accurately detecting a desired protein.
  • the inventors of the present invention omit the methanol pretreatment process by developing a membrane composed of nanofibers with low surface area, simple manufacturing method, artificial control of pore structure, and maximized surface area by using an electrospinning technique.
  • the present invention was completed by manufacturing a membrane having a higher sensitivity than the existing membrane.
  • an object of the present invention is to provide a membrane for Western blot and excellent method for producing a blot having excellent sensitivity without the background because it is possible to omit the methanol pretreatment process is composed of a nanofiber web with a surface area maximized by using an electrospinning technique .
  • Another object of the present invention is to provide a membrane for a Western blot and a method of manufacturing the same by performing surface modification through plasma to hydrophilize the membrane.
  • a method for preparing a membrane for Western blot comprising the steps of: preparing a spinning solution by dissolving a hydrophobic polymer in a solvent; Obtaining a hydrophobic polymer nanofiber web from the spinning solution by an electrospinning method; And calendering the obtained nanofiber web to obtain a membrane for western blot.
  • the present invention may further comprise performing a surface modification to impart hydrophilicity to the calendered nanofiber web.
  • Hydrophobic polymer materials usable in the present invention are, for example, polyvinylidene fluoride (PVDF), nylon (nylon), nitrocellulose (nitrocellulose), PU (polyurethane), PC (polycarbonate), PS (polystyrene), PLA (polylatic acid), Polyacrylonitrile (PAN), polylactic-co-glycolic acid (PLGA), polyethyleneimine (PEI), polypropyleneimine (PPI), polymethylmethacrylate (PMMA), polyvinylcholride (PVC), polyvinylacetate (PVAc), and polystyrene divinylbenzene copolymer (Polystylene divinylbenzene) It may be composed of one or two or more kinds selected from the group consisting of copolymers).
  • PVDF polyvinylidene fluoride
  • nylon nylon
  • nitrocellulose nitrocellulose
  • PU polyurethane
  • PC polycarbonate
  • PS polystyrene
  • Solvents usable in the present invention are dimethyl formamide (di-methylformamide, DMF), dimethyl acetamide (di-methylacetamide, DMAc), THF (tetrahydrofuran), acetone, alcohol (Alcohol), chloroform, Chloroform, DMSO (dimethyl sulfoxide), dichloromethane (dichloromethane), acetic acid (acetic acid), formic acid (formic acid), NMP (N-Methylpyrrolidone), fluorine-based alcohols, and water may be used at least one selected from the group consisting of.
  • the diameter of the nanofibers forming the nanofiber web is characterized in that 50 to 1000nm.
  • the radiation method is electrospinning, electrospray, electroblown spinning, centrifugal electrospinning, flash-electrospinning, bubble electrospinning, Any one method selected from melt electrospinning and needleless electrospinning may be used.
  • the calendering is performed by any one method selected from pressing, pressing, hot plate calendering, rolling, thermal bonding, ultrasonic bonding, seam sealing tape, and laminating.
  • the content of the hydrophobic polymer material is 5 to 90% by weight based on the whole spinning solution.
  • the calendering process is carried out with a heat treatment in the temperature range of 60 ⁇ 200 °C.
  • the surface modification is preferably carried out by plasma treatment.
  • the gas used in the plasma treatment uses oxygen or argon.
  • the plasma treatment time is preferably 30 to 300 seconds.
  • the membrane preferably has an average pore diameter of 0.1 to 1.0 mu m, a membrane thickness of 30 to 200 mu m, and a porosity of 60% or more.
  • a membrane for western blot prepared according to the above method.
  • the membrane for the Western blot manufactured by the present invention can be mass-produced at a low cost since the manufacturing process is simple, and can be used for protein separation and analysis or various detections by providing excellent sensitivity compared to the existing membrane.
  • Example 1 is a scanning electron micrograph of a PVdF membrane prepared by Example 1 of the present invention; (a) 1k, (b) 10k ⁇ magnification,
  • Example 2 is a scanning electron micrograph of a plasma treated PVdF membrane prepared by Example 4 of the present invention; (a) plasma treatment 30 seconds (b) plasma treatment 60 seconds (c) plasma treatment 150 seconds (d) plasma treatment 300 seconds,
  • 3 and 4 are graphs showing the contact angle and the tensile strength of the plasma-treated PVdF membrane prepared by Example 4 of the present invention.
  • Example 5 is a graph showing the size of the average pore diameter of each membrane prepared in Example 1 and Comparative Example of the present invention. (a) Comparative Example (b) Example 1,
  • Example 6 is a cross-sectional scanning electron micrograph of each membrane prepared in Example 1 and Comparative Example of the present invention. (a) Comparative Example (b) Example 1
  • Example 7 shows the results of TGA analysis in air of membranes prepared by Examples and Comparative Examples of the present invention.
  • (a) Comparative Example (b) Example 1 (PVdF HSV 900), (c) Example 2 (PVdF 761), (d) Example 3 (PVdF 761/2801),
  • Example 8 is a diagram showing the results of Western blot evaluation of each membrane prepared by Example 1 and Comparative Example of the present invention.
  • Figure 9 and Figure 10 shows the results of Western blot evaluation of each membrane prepared by Examples 1 and 4 of the present invention
  • 11 is a photograph showing the discolored state of the membrane after Western blot.
  • the membrane composed of nanofibers for Western blot according to the present invention is prepared by dissolving a hydrophobic polymer, for example, PVdF polymer, in a solvent to a spinning concentration to produce a spinning solution, and transferring it to a spinneret and applying a high voltage to the nozzle to electrospin.
  • the nanofiber web prepared by electrospinning is made of a membrane consisting of an average pore diameter of 0.1 to 1.0 ⁇ m, an average fiber diameter of 50 to 1,000 nm, and a membrane thickness of 30 to 200 ⁇ m through a calendering process.
  • nanofiber membranes can be used for protein separation and detection because of their high sensitivity even if methanol pretreatment is omitted, or may be used after surface modification (eg, plasma treatment).
  • a spinning solution by dissolving a hydrophobic polymer (eg PVdF) to a spinnable concentration using a suitable solvent.
  • the content of the polymeric material (PVdF) is suitably about 5 to 90% by weight based on the total solution. If less than 5% by weight, the electrospinning is difficult to form the membrane by spraying the beads (bead) rather than forming the nanofiber, when the weight is greater than 90% by weight it is difficult to form the fiber because the spinning is impossible . Therefore, the preparation of the spinning solution is not particularly limited, but it is desirable to control the morphology of the fibers at a concentration that is easy to form a fibrous structure.
  • the prepared spinning solution is transferred to a spin pack using a metering pump, and then subjected to electrospinning by applying a voltage to the spinning pack using a high voltage regulator.
  • the voltage used can be adjusted in the range of 0.5 ⁇ 100 kV
  • the current collector plate may be used with an electrically conductive metal, release paper, etc., it can be grounded or charged to the (-) pole.
  • the current collector plate is preferably used by attaching a suction collector to facilitate the focusing of the fiber during spinning.
  • electrospinning adjusts the distance between the spin pack and the current collector plate to 5 ⁇ 50 cm, and the discharge amount during the spinning is discharged at 0.0001 ⁇ 5 cc / hole ⁇ min per hole using a metering pump, and the temperature and humidity during the spinning It is desirable to spin at a relative humidity of 30-80% in an adjustable chamber. In this way, the average fiber diameter of the spun nanofiber web is 50-1,000 nm.
  • the spinning method includes electrospray, electroblown spinning, centrifugal electrospinning, and flash-electrospinning, bubble electrospinning. Melt electrospinning, needleless electrospinning are also possible.
  • the spun polymer nanofiber web is calendered by various methods such as pressing, pressing, rolling, hot plate calendering, thermal bonding, ultrasonic bonding, sim sealing tape, laminating, and the like. Since the obtained polymer nanofiber web has a three-dimensional open pore structure, a membrane having ultra high sensitivity can be obtained even if the methanol pretreatment process is omitted.
  • the membrane thickness is 30 ⁇ 200 ⁇ m
  • the average pore diameter is to be 0.1 ⁇ 1.0 ⁇ m.
  • the membrane thickness is less than 30 ⁇ m, western blotting rigidity is difficult to handle, and when the thickness is more than 200 ⁇ m, the manufacturing cost increases.
  • the average pore size of the membrane is less than 0.1 ⁇ m post-treatment process cost increases and the transfer time is delayed, if the thickness is greater than 1.0 ⁇ m may not be able to perform accurate protein analysis.
  • the calendering heat treatment temperature is preferably in the range of 60 ⁇ 200 °C that the polymer is not melted.
  • the heat treatment temperature of calendering is less than 60 °C, the heat treatment temperature is low, so that the fusion between nanofibers is unstable, so that the separation of nanofibers is difficult to perform proper Western blot.
  • the pore structure is blocked and protein transfer is not performed from an appropriate SDS-page, so an accurate analysis may not be performed.
  • the surface structure of nanofibers can be modified by chemical methods of removing, swelling and surface etching WBL (weak boundary layer) using a solvent and surface reaction by ionizing radiation irradiation such as X-ray, Y-ray and electron beam.
  • the surface of the nanofibers is hydrophilized through a plasma treatment having the simplest environmental load and the excellent surface modification effect among these methods to complete the ultra-high sensitivity western blot membrane.
  • Plasma treatment process parameters include the type of gas used, flow rate, treatment pressure, treatment time, power, and the like, and it is desirable to find a condition suitable for surface modification of nanofibers.
  • the treatment gas used in the plasma process may use oxygen (O 2 ) or argon (Ar).
  • oxygen O 2
  • Ar argon
  • an argon gas having an etching and a cross-linking effect is used.
  • Plasma treatment time is suitable 30 ⁇ 300 seconds, at this time the power was 400W. If the plasma treatment time is less than 30 seconds, the degree of hydrophilization of the membrane is insufficient, so that the western blot is less compatible with the Western buffer solution and the background is more likely to occur. Due to the deterioration of the properties of the membrane, the process cost increases. Here, since power and processing time are inversely related, increasing the power can reduce the plasma processing time.
  • the spinning solution was prepared by using PVdF (HSV 900) composed of a hydrophobic polymer, homopolymer, and dissolving it in a solvent DMAc so that the total weight of the solution was 20% by weight.
  • the spinning solution is transferred to a spinning nozzle using a metering pump and subjected to electrospinning under conditions of an applied voltage of 25 kV, a distance of 20 cm between the spinneret and the current collector, and a discharge amount of 0.005 cc / gholl, room temperature, and atmospheric pressure.
  • the emitted PVdF nanofiber web is shown by scanning electron micrograph in FIG. As shown in FIG. 1, the spun nanofibers exhibited an average fiber diameter of about 300-400 nm. In addition, the nanofibers have a relatively uniform pore diameter and have a three-dimensional open pore structure.
  • Examples 2 and 3 were prepared by mixing PVdF (761) composed of a hydrophobic polymer homopolymer alone (Example 2) and copolymerized PVdF (2801) with PVdF (761) at 50: 50% by weight (Example 3). After electrospinning in the same manner as in Example 1, calendering to obtain a nanofiber membrane.
  • the prepared membranes of Examples 2 and 3 were subjected to TGA, XRD, SEM, DSC analysis for comparison with the membrane of Comparative Example.
  • the results of the thermal analysis showed almost the same results for the samples prepared by the comparative example and the example, and showed typical results of the PVdF polymer, and the results are described in the following membrane structure analysis.
  • Example 4 was subjected to surface modification of the PVdF nanofiber membrane prepared by the method of Example 1 using a plasma cleaner equipment.
  • the gas used was argon (Ar), and surface modification was performed at intervals of 30, 60, 150, 300 seconds (sec) at 400W while argon was supplied at 100 sccm.
  • FIG. 2 shows, by scanning electron micrograph, the surface time-dependent surface structure of the plasma treated PVdF membrane prepared in Example 4.
  • FIG. 2 shows, by scanning electron micrograph, the surface time-dependent surface structure of the plasma treated PVdF membrane prepared in Example 4.
  • FIG. 2 shows, by scanning electron micrograph, the surface time-dependent surface structure of the plasma treated PVdF membrane prepared in Example 4.
  • FIG. 2 shows, by scanning electron micrograph, the surface time-dependent surface structure of the plasma treated PVdF membrane prepared in Example 4.
  • Figure 3 shows the contact angle with water according to the plasma treatment of the plasma treated PVdF membrane prepared in Example 4. As shown in FIG. 3, the contact angle of water was lowered according to the plasma treatment, and the initial hydrophilization tendency increased as the plasma treatment time increased, but the change was greatest when the treatment was performed for 30 seconds. Able to know.
  • Figure 4 shows the tensile strength according to the plasma treatment of the plasma treated PVdF membrane prepared by Example 4. As shown in FIG. 4, as the plasma treatment time increases, the tensile strength tends to decrease, and as the plasma treatment time increases, the physical properties of the membrane become weak due to the plasma treatment.
  • PVdF membrane of Pall (PALL CO., LTD., BioTrace TM PVDF), a commercially available membrane prepared using a phase separation method, was used.
  • Pall's PVdF membrane used at this time was 150 ⁇ m thick, the average pore size was 0.45 ⁇ m.
  • Figure 5 shows the average pore size of the membrane prepared in Example 1 and Comparative Example using a capillary flow porometer (PMI) equipment.
  • PMI capillary flow porometer
  • Figure 6 shows a cross-sectional scanning electron micrograph of the membrane of (a) Comparative Example and (b) Example 1.
  • the pore structure is due to a two-dimensional closed pore structure, whereas the implementation of FIG. 6 (b) is performed.
  • the nanofiber membrane shows a three-dimensional open pore structure at the same time of manufacture.
  • thermogravimetric analysis (TGA) results show that both the comparative example and the embodiment of the present invention, which are commercially available membranes, do not decompose to air up to about 500 ° C. However, in Examples 1 to 3 of the present invention, It can be seen that is more thermally more stable than the comparative example.
  • the porosity obtained by the above formula is 73.3% for Example 1 and about 67% for Comparative Example, indicating that the porosity of the membrane prepared by the method of Example 1 of the present invention is about 10% larger. Confirmed.
  • the membranes prepared in Example 1 and Comparative Example were cut in advance by 6 ⁇ 8 cm in width ⁇ length, respectively, omitting methanol activation, and Western blot was performed.
  • the cut membrane was transferred to a transfer buffer (1 ⁇ transfer buffer) and left for 10 minutes.
  • the transfer buffer consisted of 3.03 g / L trisma-base, 14.4 g / L glycine (Glycine) and 20% methanol (200 ml / L).
  • the gel to be transferred is lightly moistened with transfer buffer and placed on the membrane carefully to avoid bubbles. After the gel and the membrane are in close contact with each other, the 3M paper previously wetted with transfer buffer solution is placed on a transfer kit.
  • Transfer was carried out for 1 hour at 100V using a Mini-gel transfer kit, the transfer vessel was placed in ice to block the heat generated at this time. After transfer, disassemble the device, remove the membrane, and soak in 1x TBST (Tris-buffered saline with 0.05% tween 20).
  • TBST Tris-buffered saline with 0.05% tween 20.
  • TBST consists of 0.2M Tris pH 8 (24.2g Trisma base), 1.37M NaCl (80g NaCl), and Adjust pH 7.6 by conc HCl.
  • the concentration of the purified protein antigen was 20, 10, 5, 2.5, 1 ⁇ g, 10% SDS-page gel was used.
  • the total transfer time was about 1 hour 40 minutes and the blocking time was 1 hour 30 minutes.
  • the first antibody was ⁇ -actin (Santa cruz, sc-47778), which was diluted 1: 5000 and reacted with the transfer membrane at -4 ° C. for about 1 day (24hrs). This transfer was confirmed the protein expression using an X-ray film.
  • FIG. 8 shows the results of Western blot using the membrane prepared by Example 1 and Comparative Example.
  • Example 1 membrane in the case of commercial mem., Protein expression was not observed when methanol activation was not performed.
  • Example 1 membrane Pulsma Non-treated
  • Example 1 membrane it was confirmed that the protein expression is excellent even when not activated methanol. This is because Example 1 membrane has a three-dimensional open pore structure in which pores (pores) are connected from the surface to the back side in a form in which nanofibers are stacked in a three-dimensional structure by electrospinning, thereby producing a capillary effect. It is due to.
  • the membrane of Example 1 since the membrane of Example 1 has a more uniform pore diameter and a larger specific surface area due to the higher porosity, the membrane of Example 1 is considered to exhibit excellent sensitivity accordingly.
  • the structure since the commercialized membrane is manufactured by using a phase separation method, the structure inevitably has a 2-D closed pore structure, which is inferior in sensitivity to the nanofiber membrane of Example 1. have.
  • the PVdF nanofiber membranes prepared in Examples 1 and 4 were subjected to Western blot in the same manner as in Test Example 1. At this time, 100% methanol pretreatment (Treated) was performed for 1 minute before Western blot, and the plasma treated membrane (30 seconds, 60 seconds, 180 seconds, 300 seconds) was compared with the plasma untreated membrane (0 seconds). .
  • Example 9 is a diagram showing the results of Western blot evaluation of each membrane prepared in Examples 1 and 4.
  • the plasma treatment time Pulsma treatment time 0 seconds
  • Example 1 Membrane treated with methanol pre-measured (MeOH treated) membrane is more protein expression than MeOH non-treated (MeOH Non-treated) membrane Found to be excellent.
  • Example 4 membranes treated with plasma treatment time of 30 seconds, 60 seconds, 180 seconds, and 300 seconds methanol-treated membranes were more effective than membranes subjected to methanol pretreatment. Protein expression was found to be better. This is judged to be a result of excessive surface hydrophilization by hindering the hydrophobic interaction between the membrane and the protein by performing methanol pretreatment on the membrane which has already undergone surface hydrophilization by plasma treatment.
  • the plasma treatment time is 30 seconds, it can be seen that the protein is expressed very clearly. This is because, as shown in Fig. 11, when the plasma treatment time exceeds 60 seconds, the surface hydrophilization of the membrane proceeds excessively and the membrane becomes yellow when western blot is performed.
  • the protein expression is more sensitive than the methanol pretreated sample. It turned out that it reforms more uniformly.
  • the adsorption of proteins by membranes composed of nanofibers more effectively compared to conventional membranes is considered to be a result of capillary phenomena and large specific surface area due to three-dimensional open pore structure at the time of nanofibers. This is due to the more uniform pore structure as shown in FIG.
  • the nanofibrous membrane of the present invention is protein expression without undergoing the hydrophilization process by methanol pretreatment, it is more excellent sensitivity without the background when used as a membrane for Western blot by performing the hydrophilization process by plasma treatment .
  • the present invention can be used as a membrane for Western blot, and can be used as a membrane in various fields including protein separation, analysis, detection, and diagnosis.

Abstract

본 발명은 예를 들면 전기방사에 의해 평균 섬유경 50~1000nm인 나노섬유를 열판 캘린더 공정을 거쳐 평균 세공경이 0.1~1.0㎛이고, 두께가 30~200㎛로 이루어진 3차원 열린 세공구조(3-Dimensional open pore channel)를 가지는 웨스턴 블롯용 나노섬유 멤브레인 및 그 제조방법에 관한 것이다. 본 발명은 소수성 고분자 물질을 용매에 용해하여 방사용액을 제조하는 단계; 상기 방사용액을 방사방법에 의하여 소수성 고분자 나노섬유 웹을 얻는 단계; 및 상기 얻어진 나노섬유 웹을 캘린더링하여 웨스턴 블롯용 멤브레인을 얻는 단계를 포함한다.

Description

웨스턴 블롯용 나노섬유 멤브레인 및 그 제조방법
본 발명은 나노섬유로 구성된 웨스턴 블롯(western blot)용 멤브레인(membrane) 및 그 제조방법에 관한 것으로, 구체적으로는 전기방사에 의해 평균섬유경 50~1000nm인 나노섬유를 열판 캘린더 공정을 거쳐 평균세공경 0.1~1.0㎛, 두께 30~200㎛로 이루어진 3차원의 열린 세공구조(3-Dimensional open pore structure)를 가지는 웨스턴 블롯용 나노섬유 멤브레인 및 그 제조방법에 관한 것이다.
현재 상용화되고 있는 웨스턴 블롯용 멤브레인은 니트로셀룰로오스(NC, nitro cellulose), 나일론(Nylon), 폴리비닐리덴 플루오라이드(polyvinylidene fluoride, 이하 'PVdF’) 계 고분자로 이루어진 다공성 멤브레인이 있다.
특히, PVdF계 멤브레인의 경우 니트로셀룰로오스나 나일론 계 등에 비해 단백질의 바인딩 감도와, 멤브레인 강도와, 취급성 등이 우수하여 웨스턴 블롯용 멤브레인의 주종을 이루고 있다.
웨스턴 블롯은 주어진 샘플의 조직 호모게네이트(homogenate)나 추출물의 특정 단백질을 분리, 검출하는데 사용되는 기법으로 여러 단백질 혼합물로부터 어떤 특정 단백질을 찾아내는 기법으로, 찾고자 하는 단백질에 대한 항체(antibody)를 사용하여 항원-항체반응(antigen-antibody reaction)을 일으킴으로서 단백질의 존재 여부를 밝혀내는 방법이다.
또한, 웨스턴 블롯은 네이티브 겔(native gel) 또는 변성 단백질을 폴리펩타이드(polypeptide) 또는 단백질의 3차원 구조의 크기에 의해 분리하는 데에도 이용된다.
웨스턴 블롯은 세포나 조직으로부터 추출된 단백질을 샘플버퍼(sample buffer)와 섞어 아크릴아미드(acrylamide)로 만든 분자체(molecular sieve)에 올려놓고 전기영동을 한다. 그러면, 샘플버퍼에 들어있던 SDS(sodium dodecylsulfate, SDS-page) 라는 물질이 단백질 전체에 (-) 전기를 띠게 해서 (+) 전기쪽으로 단백질이 끌려가게 된다. 이때 SDS 분자체가 단백질의 진행을 방해하여 작은 분자는 빨리, 큰분자는 느리게 이동하여 여러 크기의 밴드(band)를 형성하게 된다. 이때 크기에 따라 분리된 겔(gel)위에 멤브레인을 올려놓고 전기를 흘려주면 단백질이 분리된 상태로 멤브레인에 옮겨진다(transfer). 여기서 검출하고자 하는 특정 단백질에 대한 항체(antibody)를 결합시키고 다시 그 항체에 특이적인 2차 항체를 결합시켜 발색에 의해 나타나는 반응을 엑스레이(X-ray)로 이미지화한다.
이러한 용도로 사용되는 멤브레인은 단백질과 소수성 결합(hydrophobic interaction)을 할 수 있는 고분자 예를 들면, PVdF를 원료로 하여 평균 세공경이 0.2㎛~0.45㎛로 구성되어 있는 다공성 멤브레인이다.
이러한 다공성 멤브레인은 물과 같은 비용매 속에 용매와 고분자를 부어 제작하는 상전이법(phase separation)에 의한 건식(dry), 습식(wet), 또는 건습식(dry-wet casting)과 같은 방법으로 제조되고 있으나, 제조단가가 고가이며 대량으로 생산하는데 한계가 있다.
또한, 다공성 멤브레인은 상전이법에 의해 제조되는 경우 세공구조가 균일한 분포를 이루지 못하는 단점이 있으며, 예를 들면, PVdF 멤브레인의 경우 사용 전에 반드시 멤브레인을 메탄올에 침지하여 부분 친수화 공정을 거쳐 버퍼용액과의 상용성을 극대화할 필요가 있으며, 이러한 친수화 과정을 생략할 경우 단백질의 흡착이 충분히 이루어지지 않아 감도가 저하될 우려가 있다.
이러한 메탄올 전처리 공정은 멤브레인의 강도를 크게 저하시켜 크랙이 발생할 우려가 있고, 기포 등이 형성되어 백그라운드가 발생하므로 원하는 단백질을 정확하게 검출하는데는 한계가 있다.
따라서, 본 발명의 발명자들은 전기방사기법을 이용하여 가격이 저렴하면서 제조방법이 간편하고, 세공구조의 인위적 조절이 가능하며, 표면적이 극대화된 나노섬유로 구성된 멤브레인을 개발함으로써 메탄올 전처리 과정을 생략하여도 기존 멤브레인보다 감도가 우수한 멤브레인을 제조함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 전기방사기법을 사용하여 표면적이 극대화된 나노섬유 웹으로 구성되어 메탄올 전처리과정을 생략하는 것이 가능하므로 백그라운드가 없으면서 감도가 우수한 웨스턴 블롯용 멤브레인 및 그 제조방법을 제공함에 있다.
본 발명의 다른 목적은 플라즈마를 통해 표면 개질을 수행하여 멤브레인을 친수화시켜 보다 감도가 우수한 웨스턴 블롯용 멤브레인 및 그 제조방법을 제공함에 있다.
이와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명의 일 양태에 따르면, 웨스턴 블롯용 멤브레인의 제조방법에 있어서, 소수성 고분자 물질을 용매에 용해하여 방사용액을 제조하는 단계; 상기 방사용액을 전기방사방법에 의하여 소수성 고분자 나노섬유 웹을 얻는 단계; 및 상기 얻어진 나노섬유 웹을 캘린더링(calendering)하여 웨스턴 블롯용 멤브레인을 얻는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 웨스턴 블롯용 멤브레인의 제조방법을 제공한다.
또한 본 발명은, 상기 캘린더링된 나노섬유 웹에 친수성을 부여하기 위해 표면 개질을 수행하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용가능한 소수성 고분자 물질은 예를 들면 PVdF(polyvinylidene fluoride), 나일론(nylon), 니트로셀룰로오스(nitrocellulose), PU(polyurethane), PC(polycarbonate), PS(polystyrene), PLA(polylatic acid), PAN(polyacrylonitrile), PLGA,(polylactic-co-glycolic acid) PEI(polyethyleneimine), PPI(polypropyleneimine), PMMA(Polymethylmethacrylate), PVC(polyvinylcholride), PVAc(polyvinylacetate), 및 폴리스티렌 디비닐벤젠 공중합체(Polystylene divinylbenzene copolymer)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합물로 구성될 수 있다.
본 발명에서 사용가능한 용매는 디메틸 포름아미드(di-methylformamide, DMF), 디메틸 아세트아미드(di-methylacetamide, DMAc), THF(tetrahydrofuran), 아세톤(Acetone), 알코올(Alcohol)류, 클로로포름(Chloroform), DMSO(dimethyl sulfoxide), 디클로로메탄(dichloromethane), 초산(acetic acid), 개미산(formic acid), NMP(N-Methylpyrrolidone), 불소계 알콜류, 및 물로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 사용할 수 있다.
상기 나노섬유 웹을 형성하는 나노섬유의 직경은 50∼1000㎚인 것을 특징으로 한다.
상기 방사방법은 전기방사(electrospinning), 전기분사(electrospray), 전기분사방사(electroblown spinning), 원심전기방사(centrifugal electrospinning), 및 플래쉬 전기방사(flash-electrospinning), 버블전기방사(bubble electrospinning), 용융전기방사(melt electrospinning), 니들레스전기방사(needleless electrospinning) 중에서 선택된 어느 하나의 방법을 사용할 수 있다.
상기 캘린더링은 압착, 가압, 열판 캘린더링, 롤링, 열접합, 초음파 접합, 심 실링 테이프, 라미네이팅법 중에서 선택된 어느 하나의 방법으로 수행된다.
상기 방사용액 전체에 대하여 상기 소수성 고분자 물질의 함량은 5∼90중량%인 것이 바람직하다.
상기 캘린더링 공정은 60∼200℃ 온도범위에서의 열처리를 수반하면서 수행된다.
상기 표면 개질은 바람직하기로는 플라즈마 처리에 의해 수행한다.
상기 플라즈마 처리시 사용하는 가스는 산소 또는 아르곤을 사용한다.
상기 플라즈마 처리시간은 30~300초인 것이 바람직하다.
상기 멤브레인은 평균 세공경이 0.1∼1.0㎛, 멤브레인 두께가 30∼200㎛, 기공도가 60%이상인 것이 바람직하다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 상기한 방법에 따라 제조되는 웨스턴 블롯용 멤브레인을 제공한다.
따라서, 본 발명에 의해 제조된 웨스턴 블롯용 멤브레인은 제조공정이 간단하므로 저렴한 비용으로 대량생산이 가능하며, 기존 멤브레인에 비해 우수한 감도를 제공함으로써 단백질 분리 및 분석용도 또는 다양한 검출에 활용이 가능하다.
도 1은 본 발명의 실시예 1에 의해 제조된 PVdF 멤브레인의 주사전자 현미경 사진; (a) 1k, (b) 10k× 배율,
도 2는 본 발명의 실시예 4에 의해 제조된 플라즈마 처리된 PVdF 멤브레인의 주사전자 현미경 사진; (a)플라즈마처리 30초 (b)플라즈마처리 60초 (c)플라즈마처리 150초 (d)플라즈마처리 300초,
도 3 및 도 4는 본 발명의 실시예 4에 의해 제조된 플라즈마 처리된 PVdF 멤브레인의 접촉각 및 인장강도를 나타내는 그래프,
도 5는 본 발명의 실시예 1과 비교예에서 제조된 각 멤브레인의 평균세공경의 크기를 나타내는 그래프; (a) 비교예 (b) 실시예 1,
도 6은 본 발명의 실시예 1과 비교예에서 제조된 각 멤브레인 단면 주사전자 현미경 사진; (a) 비교예 (b) 실시예 1
도 7은 본 발명의 실시예 및 비교예에 의해 제조된 멤브레인의 공기중에서의 TGA분석 결과; (a) 비교예, (b)실시예 1(PVdF HSV 900), (c)실시예 2(PVdF 761), (d)실시예 3(PVdF 761/2801),
도 8은 본 발명의 실시예 1과 비교예에 의해 제조된 각 멤브레인의 웨스턴 블롯 평가 결과를 나타낸 그림,
도 9 및 도 10은 본 발명의 실시예 1과 4에 의해 제조된 각 멤브레인의 웨스턴 블롯 평가 결과를 나타낸 그림,
도 11은 웨스턴 블롯 후의 멤브레인의 변색된 상태를 보여주는 사진.
본 발명에 따른 웨스턴 블롯용 나노섬유로 구성된 멤브레인은 소수성 고분자 예를 들면, PVdF 고분자를 방사 가능한 농도로 용매에 용해하여 방사용액을 제조하고, 방사구로 이송한 후 노즐에 고전압을 인가하여 전기방사한다. 전기방사에 의해 제조된 나노섬유 웹은 캘린더링 공정을 거쳐 평균 세공경 0.1~1.0 ㎛, 평균 섬유경 50~1,000 ㎚, 멤브레인 두께 30~200 ㎛로 이루어진 멤브레인으로 제조된다.
이러한 나노섬유 멤브레인은 메탄올 전처리 과정이 생략되어도 감도가 우수하여 단백질 분리, 검출용으로 사용할 수 있으며, 표면개질(예를 들면, 플라즈마처리)을 거쳐 표면 친수화하여 사용할 수도 있다.
이하 각 단계별로 상세히 설명한다.
소수성 고분자 함유 방사용액의 제조단계
소수성 고분자(예를 들면, PVdF)를 적당한 용매를 사용하여 방사 가능한 농도로 용해하여 방사용액을 준비한다. 고분자 물질(PVdF)의 함량은 전체 용액을 기준으로 약 5 ~ 90 중량%가 적당하다. 5중량% 미만의 경우 전기방사를 하면 나노섬유를 형성하기 보다는 비드상(bead)으로 분사되어 멤브레인을 구성하기 어려우며, 90중량% 초과인 경우에는 점도가 높아 방사가 불가능하여 섬유를 형성하기 곤란하다. 따라서 방사용액의 제조는 특별한 제약은 없으나 섬유상 구조를 형성하기 쉬운 농도로 해서 섬유의 모폴러지(morphology)를 제어하는 것이 바람직하다.
고분자 나노섬유 웹의 형성단계
상기 제조된 방사용액은 정량펌프를 사용하여 방사팩(spin pack)으로 이송하한후, 고전압 조절장치를 사용하여 방사팩에 전압을 인가하여 전기방사를 실시한다. 이때 사용되는 전압은 0.5~100 kV의 범위에서 조절 가능하며, 집전판은 전기전도성 금속, 박리지 등을 사용할 수 있으며, 접지를 하거나 (-)극으로 대전하여 사용할 수 있다. 상기 집전판은 방사시 섬유의 집속을 원활하게 하기 위해 포집장치(suction collector)를 부착하여 사용하는 것이 바람직하다.
또한, 전기방사는 방사팩과 집전판까지의 거리를 5~50 ㎝로 조절하고, 방사시 토출량을 정량펌프를 사용하여 홀당 0.0001~5 cc/hole· min으로 방사하고, 방사시 온도 및 습도를 조절할 수 있는 챔버내에서 상대습도 30-80%에서 방사하는 것이 바람직하다. 이렇게 하여 방사된 나노섬유 웹의 평균 섬유경은 50~1,000 ㎚가 되도록 한다.
방사방법은 상기 전기방사(electrospinning)이외에도, 전기분사(electrospray), 전기분사방사(electroblown spinning), 원심전기방사(centrifugal electrospinning), 및 플래쉬 전기방사(flash-electrospinning), 버블전기방사(bubble electrospinning), 용융전기방사(melt electrospinning), 니들레스전기방사(needleless electrospinning)도 가능하다.
고분자 나노섬유 웹 캘린더링 단계
상기 방사된 고분자 나노섬유 웹은 가압, 압착, 롤링, 열판 캘린더링, 열접합, 초음파 접함, 심 실링 테이프(Sim sealing tape), 라미네이팅 등의 다양한 방법으로 캘린더링 멤브레인을 얻는다. 얻어진 고분자 나노섬유 웹은 3차원의 열린 세공구조를 가지므로 메탄올 전처리과정을 생략하여도 초고감도의 특성을 가지는 멤브레인을 얻을 수 있다.
이때, 멤브레인 두께는 30~200 ㎛이고, 평균 세공경은 0.1~1.0 ㎛가 되도록 한다. 멤브레인 두께는 30 ㎛ 미만의 경우 웨스턴 블롯시 강직도가 낮아 취급이 어려우며, 200 ㎛를 초과할 경우 제조비용이 상승한다. 또한, 멤브레인의 평균세공경은 0.1 ㎛ 미만의 경우 후처리 공정비용이 상승하며 트랜스퍼 시간이 지연되며, 1.0 ㎛ 초과의 경우 트랜스퍼 농도가 낮아 정확한 단백질 분석이 이루어질 수 없는 경우가 있다.
특히, 캘린더링을 수행할 경우 열처리를 동반할 수 있으며, 캘린더링 열처리 온도는 고분자가 용융되지 않는 60~200℃의 범위가 바람직하다. 캘린더링의 열처리 온도는 60℃미만의 경우 열처리 온도가 낮아 나노섬유간 융착이 불안정하여 나노섬유의 분리가 진행되어 적당한 웨스턴 블롯을 수행하기 어렵고, 200℃초과의 경우 나노섬유를 구성하는 고분자(예를 들면 PVdF)의 용융에 의해 세공구조가 막혀 적절한 SDS-page로부터 단백질 전이(transfer)가 이루어지지 않아 정확한 분석이 이루어지지 않을 수 있다.
나노섬유 표면 개질단계
나노섬유의 표면구조 개질에는 용매를 사용하여 WBL(weak boundary layer)를 제거, 팽윤, 표면 에칭을 거치는 화학적 방법과, X-ray, Y-ray, 전자빔 등의 이온화 방사선(radiation) 조사로 표면반응을 유도하는 광화학적 개질방법과, 진공하에서 코로나 방전(corona discharge), 플라즈마(plasma), 전자빔, 이온빔 등의 고에너지 원자, 분자 이온을 이용하여 표면산화 반응을 유도하는 물리적 개질과, 화염 내지는 오존을 이용하는 방법 등 다양한 형태로 나노섬유의 표면을 개질할 수 있다.
본 발명에서는 이러한 방법 중에서 가장 간단하면서 환경부하가 적고 표면개질 효과가 우수한 플라즈마 처리를 통하여 나노섬유의 표면을 친수화시켜 초고감도 웨스턴 블롯용 멤브레인을 완성한다.
플라즈마 처리공정 변수로는 사용되는 가스의 종류, 유량, 처리압력, 처리시간, 전력 등을 들 수 있으며, 나노섬유의 표면개질에 맞는 조건을 찾는 것이 바람직하다.
즉, 플라즈마 공정시 사용되는 처리가스는 산소(O2) 또는 아르곤(Ar)을 사용할 수 있으며, 본 발명에서는 에칭과 가교효과(cross-linking effect)를 갖는 아르곤 가스를 사용하였다.
플라즈마 처리시간은 30 ~ 300초가 적당하며, 이때 전력은 400W로 하였다. 플라즈마 처리시간이 30초 미만으로 되면 멤브레인에 친수화 정도가 불충분하여 웨스턴 블롯을 행할 경우 웨스턴 버퍼용액과의 상용성이 떨어지고 백그라운드가 발생할 가능성이 높고, 300초를 초과할 경우 플라즈마에 장시간 노출되어 오히려 멤브레인의 물성이 저하되어 공정비용이 상승한다. 여기서, 전력과 처리시간은 반비례의 관계를 가지므로, 전력을 높여주면 플라즈마 처리시간을 줄일 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되어서는 아니된다.
(실시예 1)
방사용액은 소수성 고분자인 호모(homo)폴리머로 구성된 PVdF(HSV 900)을 사용하고 용액 전체에 대해 20중량%가 되도록 용매 DMAc에 용해하여 제조하였다. 상기 방사용액은 정량펌프를 이용하여 방사노즐로 이송되어 인가전압 25kV, 방사구와 집전체와의 거리 20㎝, 토출량 분당 0.005cc/gholl, 상온, 상압의 조건에서 전기방사를 실시하여 PVdF 나노섬유 웹을 얻었다.
이때 방사된 PVdF 나노섬유 웹은 도 1에서 주사전자 현미경 사진으로 보여준다. 도 1에서 보는 바와 같이, 방사된 나노섬유는 평균 섬유경이 약 300-400 ㎚를 나타내었다. 또한, 나노섬유는 세공경이 비교적 균일하며 3차원적으로 열린 세공구조를 갖는다.
이렇게 방사된 PVdF 나노섬유 웹은 140℃로 가열된 열판 롤을 통과시켜 캘린더링하여 PVdF 나노섬유 멤브레인을 제작하였으며, 캘린더링 후 멤브레인의 두께는 약 80㎛이었다.
(실시예 2 및 3)
실시예 2 및 3은 소수성 고분자인 호모폴리머로 구성된 PVdF(761)를 단독(실시예 2) 및 공중합체인 PVdF(2801)을 PVdF(761)과 50:50중량%로 혼합(실시예 3)하여 실시예 1에서와 동일한 방법으로 전기방사한 후, 캘린더링하여 나노 섬유 멤브레인을 얻었다.
제조된 실시예 2 및 3의 멤브레인은 비교예의 멤브레인과 비교를 위하여 TGA, XRD, SEM, DSC 분석을 실시하였다. 열분석 결과 비교예와 실시예에 의해 제조된 샘플의 경우 거의 동일한 결과를 나타냈으며, PVdF 고분자의 전형적인 결과를 나타내었으며, 하기의 멤브레인 구조분석에서 그 결과를 설명한다.
(실시예 4)
실시예 4는 상기 실시예 1의 방법에 의해 제조된 PVdF 나노섬유 멤브레인을 플라즈마 크리너 장비를 사용하여 표면개질을 실시하였다. 이때 사용된 가스는 아르곤(Ar)이며, 아르곤을 100 sccm으로 공급하면서 400W에서 30, 60, 150, 300초(sec) 간격으로 표면개질을 실시하였다.
도 2는 실시예 4에 의해 제조된 플라즈마 처리된 PVdF 멤브레인의 플라즈마 처리시간별 표면 구조를 주사전자 현미경사진을 통해 보여준다. 도 2에서 보는 바와 같이, 플라즈마 처리시간이 증가할수록 PVdF 나노섬유 표면에 발생한 크랙의 크기가 증가하는 것을 알 수 있다. 이것은 플라즈마 처리에 의해 나노섬유 표면에 에칭이 발생하여 나타난 것으로 판단된다.
도 3은 실시예 4에 의해 제조된 플라즈마 처리된 PVdF 멤브레인의 플라즈마 처리에 따른 물과의 접촉각을 나타내었다. 도 3에 도시된 바와 같이, 플라즈마 처리에 따라 물의 접촉각이 낮아지는 친수화 경향을 나타내었으며, 플라즈마 처리 시간이 증가할수록 초기 친수화 경향은 증가하나 30초 처리한 경우에 그 변화폭이 가장 크게 나타남을 알 수 있다.
도 4는 실시예 4에 의해 제조된 플라즈마 처리된 PVdF 멤브레인의 플라즈마 처리에 따른 인장강도를 나타내었다. 도 4에 도시된 바와 같이, 플라즈마 처리시간이 증가할수록 인장강도는 감소하는 경향을 나타내었으며, 플라즈마 처리시간이 증가할수록 플라즈마 처리에 따라 멤브레인의 물성이 취약해지는 것을 알 수 있다.
(비교예)
비교를 위하여 상분리법을 이용하여 제조된 상용화 멤브레인인 Pall사(PALL CO., LTD., BioTrace™ PVDF)의 PVdF 멤브레인을 사용하였다. 이때 사용된 Pall사의 PVdF 멤브레인은 두께 150㎛, 평균 세공경의 크기가 0.45㎛이었다.
도 5에는 PMI(capillary flow porometer)장비를 사용하여 실시예 1과 비교예에서 제조된 멤브레인의 평균 세공경의 크기를 나타내었다. 도 5에서 보는 바와 같이, (b)실시예 1을 보여주는 나노섬유 멤브레인의 경우 평균 세공경의 크기가 매우 균일하게 나타나지만, (a)비교예를 보여주는 상용화 멤브레인의 경우 평균 세공경의 크기가 매우 불균일하게 나타남을 알 수 있다.
도 6에는 (a) 비교예와 (b)실시예 1의 멤브레인의 단면 주사전자 현미경 사진을 나타내었다.
도 6의 (a) 비교예의 경우에 나타난 바와 같이, 상용화 멤브레인의 경우 상분리법을 이용하여 제조되므로 세공구조가 2차원의 닫힌 세공(closed pore) 구조에 기인한 반면, 도 6의 (b) 실시예 1의 경우에 나타난 바와 같이 나노섬유 멤브레인의 경우 제조와 동시에 3차원 열린 세공(open pore) 구조를 나타낸 결과로 생각된다.
(멤브레인 구조분석)
실시예 1 내지 3에 의해 제조된 PVdF 멤브레인과 비교예에 의해 제조된 상용화 멤브레인의 구조분석을 DSC, XRD, TGA, SEM을 통하여 하였다. 주사전자 현미경(SEM) 분석결과, 비교예의 경우에는, 제조된 멤브레인을 나타내는 도 6a에서 보는 바와 같이, 세공경이 균일하지 못하고, 또한 세공구조에 있어서도 닫힌 세공구조임을 알 수 있다.
열중량 분석(TGA)결과를 나타낸 도 7로부터, 상용화 멤브레인인 비교예와 본 발명의 실시예 모두 약 500℃까지는 공기 중에서 분해되지 않는다는 것을 나타내고 있으며, 다만, 본 발명의 실시예 1 내지 3의 경우가 비교예에 비하여 열적으로 다소 더 안정하다는 것을 확인할 수 있다.
한편, 본 발명의 실시예 1과 비교예에 의해 제조된 각 멤브레인의 기공도(porosity)는 각각 가로× 세로 1㎝씩 절단하여 다음 식 (1)에 의해 측정하였다.
Figure PCTKR2010006358-appb-I000001
..........(1)
여기서,
Figure PCTKR2010006358-appb-I000002
는 PVdF의 밀도로 1.76g/㎤ 이며,
Figure PCTKR2010006358-appb-I000003
는 계산된 값이다.
상기 식에 의해 얻어진 기공도는 실시예 1의 경우가 73.3%, 비교예의 경우가 약 67%로 되어 본 발명의 실시예 1의 방법에 의해 제조된 멤브레인의 기공도가 약 10% 더 크다는 사실을 확인하였다.
(웨스턴 블롯 시험예 1)
일반적으로 웨스턴 블롯을 행할 경우 멤브레인을 100% 메탄올(methanol)에 활성화시켜 멤브레인을 부분 친수화시킬 필요가 있다. 이것은 멤브레인과 웨스턴 버퍼용액과의 친화성을 증가시켜 멤브레인에 겔(gel)내 단백질과의 상호작용이 잘 일어나도록 하는 과정이다.
이하는 상기 멤브레인의 부분 친수화 과정을 생략한 상태에서 상기 실시예 1과 비교예의 멤브레인을 이용하여 웨스턴 블롯을 실시하였다.
먼저 실시예 1과 비교예에서 제조된 멤브레인을 가로×세로 각각 6×8㎝로 미리 잘라놓고 메탄올 활성화를 생략하고 웨스턴 블롯을 행하였다. 먼저 잘라진 멤브레인을 트랜스퍼 완충용액(1× transfer buffer)으로 옮겨준 후 10분간 방치하였다. 이때 트랜스퍼 완충용액의 구성은 3.03g/L trisma-base, 14.4g/L 글리신(Glycine), 20% 메탄올(methanol)(200ml/L)이었다. 트랜스퍼할 겔은 트랜스퍼 완충용액으로 살짝 적셔주고 멤브레인 위에 기포가 생기지 않도록 주의하여 올려놓는다. 겔과 멤브레인을 밀착시킨 후 양면에 트랜스퍼 완충용액으로 미리 적셔준 3M지(3M paper)를 대고 트랜스퍼 키트(Transfer kit)에 장착한다.
트랜스퍼는 미니-겔(Mini-gel) 트랜스퍼 키트를 사용하여 100V에서 1시간 실시하였으며, 이때 발생하는 열을 차단하기 위하여 트랜스퍼 용기를 얼음 속에 놓아 실시하였다. 트랜스퍼가 끝난 후 장치를 해체하고 멤브레인을 분리하여 1xTBST(Tris-buffered saline with 0.05% tween 20)로 적셔준다. 이때 TBST의 구성은 0.2M Tris pH 8 (24.2g Trisma base), 1.37M NaCl (80g NaCl), Adjust pH 7.6 by conc HCl로 이루어진다.
이때 정제된 단백질 항원의 농도는 20, 10, 5, 2.5, 1㎍이었으며, 10% SDS-page 겔을 이용하였다. 전체 트랜스퍼 시간은 약 1시간 40분이었으며, 차단시간(blocking time)은 1시간 30분이었다.
1차 항체(first Antibody)로는 β-actin (Santa cruz, sc-47778)이었으며, 이를 1:5000으로 희석하여 트랜스퍼 멤브레인과 - 4℃에서 하루정도(24hrs) 반응시켰다. 이렇게 트랜스퍼된 것을 X-ray 필름을 이용하여 단백질 발현을 확인하였다.
도 8은 실시예 1과 비교예에 의해 제조된 멤브레인을 사용하여 웨스턴 블롯을 시행한 결과를 나타낸 것이다. 도 8에서 보는 바와 같이, 상용화 멤브레인(commercial mem.)의 경우 메탄올 활성화를 하지 않을 경우(MeOH Non activation) 단백질 발현을 관찰할 수 없었다. 그러나 실시예 1 멤브레인(Plasma Non-treated)의 경우 메탄올 활성화를 하지 않은 경우에도 단백질 발현이 우수하게 관찰되는 것을 확인할 수 있었다. 이것은 실시예 1 멤브레인이 전기방사에 의해 나노섬유가 3차원 구조로 적층된 형태로 세공(기공)이 표면에서 이면에 이르기까지 연결된 3차원의 열린 세공구조를 가지고 있어 모세관현상(capillary effect)의 발현에 기인하는 것이다.
또한, 실시예 1의 멤브레인이 비교예에 비하여 세공경이 균일하며, 높은 기공도에 의해 보다 큰 비표면적을 가지므로 이에 따라 우수한 민감도를 보인 것으로 판단된다. 특히 비교예 상용화 멤브레인의 경우 상분리법을 이용하여 제조되므로 그 구조는 필연적으로 2차원 닫힌 세공(2-D closed pore) 구조를 가지고 있어 실시예 1의 나노섬유 멤브레인에 비해 민감도가 떨어진 결과로 볼 수 있다.
(웨스턴 블롯 시험예 2)
상기 실시예 1과 실시예 4에 의해 제조된 PVdF 나노섬유 멤브레인을 상기 시험예 1의 방법과 동일한 방법으로 웨스턴 블롯을 실시하였다. 이때 웨스턴 블롯을 행하기 전 100% 메탄올 전처리(Treated)를 각각 1분간 실시하여 플라즈마 처리한 멤브레인(30초,60초,180초,300초)과 플라즈마 미처리 멤브레인(0초)을 비교하여 나타내었다.
도 9는 실시예 1과 4에 의해 제조된 각 멤브레인의 웨스턴 블롯 평가결과를 나타낸 그림이다. 도 9에서 보는 바와 같이, 플라즈마 처리를 하지 않은(Plasma treatment time 0초) 실시예 1 멤브레인의 경우 메탄올 전처리 과정(MeOH treated)을 거친 멤브레인이 메탄올 미처리(MeOH Non-treated) 멤브레인에 비해 단백질 발현이 우수한 것으로 나타났다. 그러나, 반대로 플라즈마 처리시간(Plasma treatment time)을 각각 30초, 60초 180초, 300초 처리한 실시예 4 멤브레인의 경우 메탄올 전처리(treated)과정을 거친 멤브레인 보다 메탄올 미처리(Non-treated) 멤브레인이 단백질 발현이 보다 우수한 것으로 나타났다. 이것은 플라즈마 처리에 의해 이미 표면 친수화가 진행된 멤브레인을 메탄올 전처리를 행함으로써 표면친수화가 과도하게 진행되어 멤브레인과 단백질간 소수성 상호작용을 방해하여 나타난 결과로 판단된다.
(웨스턴 블롯 시험예 3)
플라즈마 처리된 멤브레인의 경시변화를 관찰하기 위해 상기 실시예 1과 실시예 4에 의해 제조된 PVdF 나노섬유 멤브레인을 3 개월간 상온에 방치한 후 시험예 1과 시험예 2의 방법과 동일하게 웨스턴 블롯을 행하였으며 그 결과를 도 10에 나타내었다.
도 10에서 보는 바와 같이, 플라즈마 처리후 3 개월 경과 후에도 시험예 2와 동일한 결과를 얻었다. 이것은 나노섬유의 경우 아르곤 플라즈마 처리시 표면구조의 변화가 시간에 따라 크게 변하지 않음을 시사한다.
시험예 2와 시험예 3의 경우 플라즈마 처리시간이 30초의 경우가 매우 선명하게 단백질이 발현되는 것을 볼 수 있다. 이것은 도 11에서와 같이, 플라즈마 처리시간이 60초를 초과하게 되면 멤브레인의 표면 친수화가 과도하게 진행되어 웨스턴 블롯을 행할 경우 멤브레인이 황색으로 변색되는 것에 기인한다.
이것은 웨스턴 버퍼용액 내의 물질과 멤브레인의 상호작용에 의한 것이나 웨스턴 블롯을 행하는데 있어 큰 문제가 되지는 않는다.
또한, 도 9와 도 10의 결과에서 나타난 바와 같이, 플라즈마 처리를 행한 샘플의 경우 메탄올 전처리 과정을 거친 샘플에 비해 단백질 발현이 보다 민감하게 작용하는 것은 메탄올 처리보다 플라즈마 처리가 나노섬유의 표면구조를 보다 균일하게 개질하는 것임을 알 수 있었다.
특히, 기존 멤브레인에 비해 나노섬유로 구성된 멤브레인이 보다 효과적으로 단백질을 흡착하는 것은, 나노섬유의 경우 제조와 동시에 3차원 열린 세공구조에 의한 모세관 현상과 거대 비표면적의 결과로 판단되며, 기존 상용화 멤브레인에 비해 도 6에서 나타난 결과와 같이 보다 균일한 세공구조에 기인한다.
따라서, 본 발명의 나노섬유 멤브레인은 메탄올 전처리에 의한 친수화 과정을 거치지 않아도 단백질 발현이 이루어지며, 플라즈마 처리에 의해 친수화 과정을 수행하여 웨스턴 블롯용 멤브레인으로 사용하면 백그라운드가 없으면서 감도가 더욱 우수하다.
이상에서는 본 발명을 특정의 바람직한 실시예를 예로 들어 도시하고 설명하였으나, 본 발명은 상기한 실시예에 한정되지 아니하며 본 발명의 정신을 벗어나지 않는 범위 내에서 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 다양한 변경과 수정이 가능할 것이다.
본 발명은 웨스턴 블롯용 멤브레인으로 사용가능하며, 단백질 분리, 분석, 검출, 진단을 포함하는 다양한 분야에 멤브레인으로 활용가능하다.

Claims (14)

  1. 웨스턴 블롯용 멤브레인의 제조방법에 있어서,
    소수성 고분자 물질을 용매에 용해하여 방사용액을 제조하는 단계;
    상기 방사용액을 전기방사방법에 의하여 소수성 고분자 나노섬유 웹을 얻는 단계; 및
    상기 얻어진 나노섬유 웹을 캘린더링하여 웨스턴 블롯용 멤브레인을 얻는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 웨스턴 블롯용 멤브레인의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 캘린더링된 나노섬유 웹에 친수성을 부여하기 위해 표면개질을 수행하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 웨스턴 블롯용 멤브레인의 제조방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 소수성 고분자 물질은 PVdF(polyvinylidene fluoride), 나일론(nylon), 니트로셀룰로오스(nitrocellulose), PU(polyurethane), PC(polycarbonate), PS(polystyrene), PLA(polylatic acid), PAN(polyacrylonitrile), PLGA,(polylactic-co-glycolic acid) PEI(polyethyleneimine), PPI(polypropyleneimine), PMMA(Polymethylmethacrylate), PVC(polyvinylcholride), PVAc(polyvinylacetate), 및 폴리스티렌 디비닐벤젠 공중합체(Polystylene divinylbenzene copolymer)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합물로 구성되는 것을 특징으로 한 웨스턴 블롯용 멤브레인의 제조방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 용매는 디메틸 포름아미드(di-methylformamide, DMF), 디메틸 아세트아미드(di-methylacetamide, DMAc), THF(tetrahydrofuran), 아세톤(Acetone), 알코올(Alcohol)류, 클로로포름(Chloroform), DMSO(dimethyl sulfoxide), 디클로로메탄(dichloromethane), 초산(acetic acid), 개미산(formic acid), NMP(N-Methylpyrrolidone), 불소계 알콜류, 및 물로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 한 웨스턴 블롯용 멤브레인의 제조방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 나노섬유 웹을 형성하는 나노섬유의 직경은 50∼1000㎚인 것을 특징으로 하는 웨스턴 블롯용 멤브레인의 제조방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 방사방법은 전기방사(electrospinning), 전기분사(electrospray), 전기분사방사(electroblown spinning), 원심전기방사(centrifugal electrospinning), 및 플래쉬 전기방사(flash-electrospinning), 버블전기방사(bubble electrospinning), 용융전기방사(melt electrospinning), 니들레스전기방사(needleless electrospinning) 중에서 선택된 어느 하나의 방법인 것을 특징으로 하는 웨스턴 블롯용 멤브레인의 제조방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 캘린더링은 압착, 가압, 열판 캘린더링, 롤링, 열접합, 초음파 접합, 심 실링 테이프법, 라미네이팅 중에서 선택된 어느 하나의 방법으로 수행되는 것을 특징으로 하는 웨스턴 블롯용 멤브레인의 제조방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 방사용액 전체에 대하여 상기 소수성 고분자 물질의 함량은 5∼90중량%인 것을 특징으로 하는 웨스턴 블롯용 멤브레인의 제조방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 캘린더링 공정은 60∼200℃ 온도범위에서의 열처리를 수반하면서 수행되는 것을 특징으로 하는 웨스턴 블롯용 멤브레인의 제조방법.
  10. 제2항에 있어서,
    상기 표면 개질은 플라즈마 처리에 의해 수행하는 것을 특징으로 하는 웨스턴 블롯용 멤브레인의 제조방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 플라즈마 처리시 사용하는 가스는 산소 또는 아르곤인 것을 특징으로 하는 웨스턴 블롯용 멤브레인의 제조방법.
  12. 제10항에 있어서,
    상기 플라즈마 처리시간은 30~300초인 것을 특징으로 하는 웨스턴 블롯용 멤브레인의 제조방법.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 멤브레인은 평균 세공경이 0.1∼1.0㎛, 멤브레인 두께가 30∼200㎛, 기공도가 60%이상인 것을 특징으로 하는 웨스턴 블롯용 멤브레인 제조방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따라 제조되는 웨스턴 블롯용 멤브레인.
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