JP5757449B2 - ウエスタンブロット用ナノ繊維メンブレン及びその製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、ナノ繊維で構成されたウエスタンブロット（ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）用メンブレン（ｍｅｍｂｒａｎｅ）及びその製造方法に係り、具体的には、電気紡糸によって平均繊維径５０〜１０００ｎｍであるナノ繊維を、熱板カレンダー工程を経て、平均細孔径０．１〜１．０μｍ、厚さ３０〜２００μｍからなった３次元の開いた細孔構造（３−Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｏｐｅｎ ｐｏｒｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）を有するウエスタンブロット用ナノ繊維メンブレン及びその製造方法に関する。

現在、商用化されているウエスタンブロット用メンブレンとしては、ニトロセルロース（ＮＣ、ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）、ナイロン（Ｎｙｌｏｎ）、ポリビニリデンフルオライド（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ ｆｌｕｏｒｉｄｅ、以下‘ＰＶｄＦ’）系高分子からなった多孔性メンブレンがある。

特に、ＰＶｄＦ系メンブレンの場合、ニトロセルロースやナイロン系などに比べて、タンパク質のバインディング感度とメンブレン強度及び取扱性などに優れて、ウエスタンブロット用メンブレンの主流となっている。

ウエスタンブロットは、与えられたサンプルの組織ホモジネート（ｈｏｍｏｇｅｎａｔｅ）や抽出物の特定のタンパク質を分離、検出するのに用いられる技法であって、複数のタンパク質混合物からいずれの特定のタンパク質を検出する技法である。検出しようするタンパク質に対する抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）を使用して、抗原−抗体反応（ａｎｔｉｇｅｎ−ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒｅａｃｔｉｏｎ）を起こすことで、タンパク質の存在有無を明らかにする方法である。

また、ウエスタンブロットは、ネイティブゲル（ｎａｔｉｖｅ ｇｅｌ）または変性タンパク質を、ポリペプチド（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）またはタンパク質の３次元構造の大きさによって分離するのにも用いられる。

ウエスタンブロットは、細胞や組織から抽出されたタンパク質をサンプルバッファー（ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ）と混ぜて、アクリルアミド（ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）で作った分子篩（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｉｅｖｅ）に載せて電気泳動をする。すると、サンプルバッファーに入っていたＳＤＳ（ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ、ＳＤＳ−ｐａｇｅ）という物質がタンパク質の全体に（−）電気を帯びるようにして、（＋）電気の側にタンパク質が引き付けられる。このとき、ＳＤＳ分子篩がタンパク質の進行を妨げて、小さい分子は速く、大きい分子は遅く移動して、様々な大きさのバンド（ｂａｎｄ）を形成することになる。このとき、大きさによって分離されたゲル（ｇｅｌ）の上にメンブレンを載せて電気を流すと、タンパク質が分離された状態でメンブレンに移される（ｔｒａｎｓｆｅｒ）。ここで、検出しようとする特定のタンパク質に対する抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）を結合させ、再び該抗体に特異的な２次抗体を結合させて、発色によって現れる反応をＸ線（Ｘ−ｒａｙ）でイメージ化する。

このような用途で使用されるメンブレンは、タンパク質と疏水性結合（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）ができる高分子、例えば、ＰＶｄＦを原料として平均細孔径が０．２μｍ〜０．４５μｍで構成されている多孔性メンブレンである。

このような多孔性メンブレンは、水のような非溶媒中に溶媒及び高分子を注いで作製する相分離法（ｐｈａｓｅ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ）による乾式（ｄｒｙ）、湿式（ｗｅｔ）、または乾湿式（ｄｒｙ−ｗｅｔ ｃａｓｔｉｎｇ）のような方法で製造されているが、製造単価が高価で、大量で生産するのに限界がある。

また、多孔性メンブレンは、相分離法により製造される場合、細孔構造が均一な分布をなすことができないという短所があり、例えば、ＰＶｄＦメンブレンの場合、使用前に必ずメンブレンをメタノールに浸漬して、部分親水化工程を経て、バッファー溶液との相溶性を極大化する必要があり、このような親水化過程を省略する場合、タンパク質の吸着が十分にできず、感度が低下する恐れがある。

このようなメタノール前処理工程は、メンブレンの強度を大きく低下させて、クラックが発生する恐れがあり、気泡などが形成されてバックグラウンドが発生するため、所望のタンパク質を正確に検出するのには限界がある。

したがって、本発明の発明者らは、電気紡糸技法を用いて、価格が低廉で、且つ製造方法が簡便で、細孔構造の人為的調節が可能で、表面積が極大化したナノ繊維で構成されたメンブレンを開発することによって、メタノール前処理過程を省略しても既存のメンブレンよりも感度に優れたメンブレンを製造することで、本発明を完成した。

したがって、本発明の目的は、電気紡糸技法を使用して、表面積が極大化したナノ繊維ウェブで構成され、メタノール前処理過程を省略することが可能なので、バックグラウンドがなく、且つ、感度に優れたウエスタンブロット用メンブレン及びその製造方法を提供することにある。

本発明の他の目的は、プラズマを通じて表面改質を行って、メンブレンを親水化させて、より感度に優れたウエスタンブロット用メンブレン及びその製造方法を提供することにある。

このような目的を達成するために、本発明の一態様によれば、ウエスタンブロット用メンブレンの製造方法において、疏水性高分子物質を溶媒に溶解して、紡糸溶液を製造する段階と、前記紡糸溶液を、電気紡糸法によって、疏水性高分子ナノ繊維ウェブを得る段階と、前記得られたナノ繊維ウェブをカレンダリング（ｃａｌｅｎｄｅｒｉｎｇ）して、ウエスタンブロット用メンブレンを得る段階と、を含むことを特徴とする、ウエスタンブロット用メンブレンの製造方法を提供する。

また本発明は、前記カレンダリングされたナノ繊維ウェブに、親水性を付与するために、表面改質を行う段階をさらに含むことができる。

本発明で使用可能な疏水性高分子物質は、例えば、ＰＶｄＦ（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ ｆｌｕｏｒｉｄｅ）、ナイロン（ｎｙｌｏｎ）、ニトロセルロース（ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）、ＰＵ（ｐｏｌｙｕｒｅｔｈａｎｅ）、ＰＣ（ｐｏｌｙｃａｒｂｏｎａｔｅ）、ＰＳ（ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ）、ＰＬＡ（ｐｏｌｙｌａｔｉｃ ａｃｉｄ）、ＰＡＮ（ｐｏｌｙａｃｒｙｌｏｎｉｔｒｉｌｅ）、ＰＬＧＡ（ｐｏｌｙｌａｃｔｉｃ−ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｃ ａｃｉｄ）ＰＥＩ（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ）、ＰＰＩ（ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ）、ＰＭＭＡ（Ｐｏｌｙｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ）、ＰＶＣ（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｃｈｏｌｒｉｄｅ）、ＰＶＡｃ（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌａｃｅｔａｔｅ）、及びポリスチレンジビニルベンゼン共重合体（Ｐｏｌｙｓｔｙｌｅｎｅ ｄｉｖｉｎｙｌｂｅｎｚｅｎｅ ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ）からなる群から選択された１種または２種以上の混合物で構成されることができる。

本発明で使用可能な溶媒は、ジメチルホルムアミド（ｄｉ−ｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ、ＤＭＦ）、ジメチルアセトアミド（ｄｉ−ｍｅｔｈｙｌａｃｅｔａｍｉｄｅ、ＤＭＡｃ）、ＴＨＦ（ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｕｒａｎ）、アセトン（Ａｃｅｔｏｎｅ）、アルコール（Ａｌｃｏｈｏｌ）類、クロロホルム（Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ）、ＤＭＳＯ（ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）、ジクロロメタン（ｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ）、酢酸（ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）、ギ酸（ｆｏｒｍｉｃ ａｃｉｄ）、ＮＭＰ（Ｎ−Ｍｅｔｈｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ）、フッ素系アルコール類、及び水からなる群から選択された１種以上のものを使用することができる。

前記ナノ繊維ウェブを形成するナノ繊維の直径は、５０〜１０００ｎｍであることを特徴とする。

前記紡糸方法は、電気紡糸（ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｉｎｎｉｎｇ）、電気スプレー（ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ）、電気噴射紡糸（ｅｌｅｃｔｒｏｂｌｏｗｎ ｓｐｉｎｎｉｎｇ）、遠心電気紡糸（ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｉｎｎｉｎｇ）、及びフラッシュ電気紡糸（ｆｌａｓｈ−ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｉｎｎｉｎｇ）、バブル電気紡糸（ｂｕｂｂｌｅ ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｉｎｎｉｎｇ）、溶融電気紡糸（ｍｅｌｔ ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｉｎｎｉｎｇ）、ニードルレス電気紡糸（ｎｅｅｄｌｅｌｅｓｓ ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｉｎｎｉｎｇ）から選択されたいずれか１つの方法を使用することができる。

前記カレンダリングは、圧着、加圧、熱板カレンダリング、ローリング、熱接合、超音波接合、シームシーリングテープ、ラミネーティング法から選択されたいずれか１つの方法で行われる。

前記紡糸溶液全体に対して前記疏水性高分子物質の含量は、５〜９０重量％であることが望ましい。

前記カレンダリング工程は、６０〜２００℃の温度範囲での熱処理を伴いながら行われる。

前記表面改質は、望ましくは、プラズマ処理によって行う。

前記プラズマ処理時に使用するガスは、酸素またはアルゴンを使用する。

前記プラズマ処理時間は、３０〜３００秒であることが望ましい。

前記メンブレンは、平均細孔径が０．１〜１．０μｍ、厚さが３０〜２００μｍ、気孔度が６０％以上であることが望ましい。

本発明の他の態様によれば、上記した方法によって製造されるウエスタンブロット用メンブレンを提供する。

したがって、本発明により製造されたウエスタンブロット用メンブレンは、製造工程が簡単なので、低廉なコストで大量生産が可能で、既存のメンブレンに比べて優れた感度を提供することによって、タンパク質分離及び分析の用途、または多様な検出に活用が可能である。

本発明の実施例１により製造されたＰＶｄＦメンブレンの走査電子顕微鏡写真；（ａ）１ｋ、（ｂ）１０ｋ×倍率。 本発明の実施例４により製造されたプラズマ処理されたＰＶｄＦメンブレンの走査電子顕微鏡写真；（ａ）プラズマ処理３０秒（ｂ）プラズマ処理６０秒（ｃ）プラズマ処理１５０秒（ｄ）プラズマ処理３００秒。 本発明の実施例４により製造されたプラズマ処理されたＰＶｄＦメンブレンの接触角を示すグラフである。 本発明の実施例４により製造されたプラズマ処理されたＰＶｄＦメンブレンの接触角度を示すグラフである。 本発明の実施例１と比較例で製造された各メンブレンの平均細孔径の大きさを示すグラフ；（ａ）比較例（ｂ）実施例１。 本発明の実施例１と比較例で製造された各メンブレンの断面走査電子顕微鏡写真；（ａ）比較例（ｂ）実施例。 本発明の実施例及び比較例により製造されたメンブレンの空気中でのＴＧＡ分析結果；（ａ）比較例、（ｂ）実施例１（ＰＶｄＦ ＨＳＶ９００）、（ｃ）実施例２（ＰＶｄＦ ７６１）、（ｄ）実施例３（ＰＶｄＦ ７６１／２８０１）。 本発明の実施例１と比較例により製造された各メンブレンのウエスタンブロット評価結果を示す図である。 本発明の実施例１及び４により製造された各メンブレンのウエスタンブロット評価結果を示す図である。 本発明の実施例１及び４により製造された各メンブレンのウエスタンブロット評価結果を示す図である。 ウエスタンブロット後のメンブレンの変色状態を示す写真である。

本発明に係るウエスタンブロット用ナノ繊維で構成されたメンブレンは、疏水性高分子、例えば、ＰＶｄＦ高分子を紡糸可能な濃度で溶媒に溶解して、紡糸溶液を製造し、紡糸口に移送した後、ノズルに高電圧を印加して電気紡糸する。電気紡糸により製造されたナノ繊維ウェブは、カレンダリング工程を経て、平均細孔径０．１〜１．０μｍ、平均繊維径５０〜１，０００ｎｍ、厚さ３０〜２００μｍからなったメンブレンとして製造される。

このようなナノ繊維メンブレンは、メタノール前処理過程が省略されても感度に優れて、タンパク質分離及び検出用として使用することができ、表面改質（例えば、プラズマ処理）を経て表面親水化して使用することもできる。

以下、各段階別に詳細に説明する。

疏水性高分子含有紡糸溶液の製造段階
疏水性高分子（例えば、ＰＶｄＦ）を、適当な溶媒を使用し、紡糸可能な濃度で溶解して、紡糸溶液を準備する。高分子物質（ＰＶｄＦ）の含量は、溶液全体を基準に約５〜９０重量％が適当である。５重量％未満の場合、電気紡糸をすると、ナノ繊維を形成するよりはビード状（ｂｅａｄ）で噴射されて、メンブレンを構成しにくく、９０重量％超過の場合には粘度が高くて、紡糸が不可能なので繊維を形成しにくい。したがって、紡糸溶液の製造は、特別な制約はないが、繊維状構造を形成しやすい濃度として繊維のモーフォロジー（ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ）を制御することが望ましい。

高分子ナノ繊維ウェブの形成段階
前記製造された紡糸溶液は、定量ポンプを使用して紡糸パック（ｓｐｉｎ ｐａｃｋ）へ移送した後、高電圧調節装置を用いて紡糸パックに電圧を印加して、電気紡糸を実施する。このとき使用される電圧は、０．５〜１００ｋＶの範囲内で調節可能であり、集電板は、電気伝導性金属、剥離紙などを使用することができ、接地をしたり、または（−）極に帯電して使用することができる。前記集電板は、紡糸時繊維の集束を円滑にするために捕集装置（ｓｕｃｔｉｏｎ ｃｏｌｌｅｃｔｏｒ）を付着して使用することが望ましい。

また、電気紡糸は、紡糸パックと集電板までの距離を５〜５０ｃｍに調節し、紡糸時吐出量を定量ポンプを使用して、ホール当り０．０００１〜５ｃｃ／ｈｏｌｅ・ｍｉｎで紡糸し、紡糸時温度及び湿度を調節できるチャンバー内で相対湿度３０〜８０％で紡糸することが望ましい。このようにして紡糸されたナノ繊維ウェブの平均繊維径は５０〜１，０００ｎｍになるようにする。

紡糸方法は、前記電気紡糸（ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｉｎｎｉｎｇ）の他にも、電気スプレー（ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ）、電気噴射紡糸（ｅｌｅｃｔｒｏｂｌｏｗｎ ｓｐｉｎｎｉｎｇ）、遠心電気紡糸（ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｉｎｎｉｎｇ）、及びフラッシュ電気紡糸（ｆｌａｓｈ−ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｉｎｎｉｎｇ）、バブル電気紡糸（ｂｕｂｂｌｅ ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｉｎｎｉｎｇ）、溶融電気紡糸（ｍｅｌｔ ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｉｎｎｉｎｇ）、ニードルレス電気紡糸（ｎｅｅｄｌｅｌｅｓｓ ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｉｎｎｉｎｇ）も可能である。

高分子ナノ繊維ウェブのカレンダリング段階
前記紡糸された高分子ナノ繊維ウェブは、加圧、圧着、ローリング、熱板カレンダリング、熱接合、超音波接合、シームシーリングテープ（Ｓｉｍ ｓｅａｌｉｎｇ ｔａｐｅ）、ラミネーティングなどの多様な方法でカレンダリングしてメンブレンを得る。該得られた高分子ナノ繊維ウェブは、３次元の開いた細孔構造を有するので、メタノール前処理過程を省略しても超高感度の特性を持つメンブレンを得ることができる。

このとき、メンブレン厚さは３０〜２００μｍであり、平均細孔径は０．１〜１．０μｍになるようにする。メンブレン厚さは、３０μｍ未満の場合、ウエスタンブロット時剛直度が低いため取り扱いが難しく、２００μｍを超過する場合、製造コストが上昇する。また、メンブレンの平均細孔径は０．１μｍ未満の場合、後処理工程コストが上昇し、トランスファー時間が遅延され、１．０μｍ超過の場合、トランスファー濃度が低くて、正確なタンパク質分析ができないことがある。

特に、カレンダリングを行う場合、熱処理を伴うことができ、カレンダリング熱処理温度は、高分子が溶融されない６０〜２００℃の範囲が望ましい。カレンダリングの熱処理温度は、６０℃未満の場合、熱処理温度が低くて、ナノ繊維間の融着が不安定であるため、ナノ繊維の分離が進行され、適当なウエスタンブロットを行いにくく、２００℃超過の場合、ナノ繊維を構成する高分子（例えば、ＰＶｄＦ）の溶融により細孔構造が詰まって、適切なＳＤＳ−ｐａｇｅからタンパク質転移（ｔｒａｎｓｆｅｒ）ができず、正確な分析を行うことができないこともある。

ナノ繊維の表面改質の段階
ナノ繊維の表面構造改質には、溶媒を使用してＷＢＬ（ｗｅａｋ ｂｏｕｎｄａｒｙ ｌａｙｅｒ）を除去、膨潤、表面エッチングを経る化学的方法と、Ｘ−ｒａｙ、Ｙ−ｒａｙ、電子ビームなどのイオン化放射線（ｒａｄｉａｔｉｏｎ）の照射で表面反応を誘導する光化学的改質方法と、真空下でコロナ放電（ｃｏｒｏｎａ ｄｉｓｃｈａｒｇｅ）、プラズマ（ｐｌａｓｍａ）、電子ビーム、イオンビームなどの高エネルギー原子、分子イオンを用いて、表面酸化反応を誘導する物理的改質と、火炎ないしはオゾンを用いる方法など多様な形態でナノ繊維の表面を改質できる。

本発明では、このような方法のうち最も簡単で、且つ環境負荷が少なく、表面改質の効果に優れたプラズマ処理を通じて、ナノ繊維の表面を親水化させて、超高感度ウエスタンブロット用メンブレンを完成する。

プラズマ処理工程の変数としては、使用されるガスの種類、流量、処理圧力、処理時間、電力などを挙げることができ、ナノ繊維の表面改質に合った条件を探すのが望ましい。

すなわち、プラズマ工程時に使用される処理ガスとしては、酸素（Ｏ_２）またはアルゴン（Ａｒ）を使用することができ、本発明では、エッチング及び架橋効果｛かきょう こうか｝（ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔ）を有するアルゴンガスを使用した。

プラズマ処理時間は、３０〜３００秒が適当であり、このとき、電力は４００Ｗとした。プラズマ処理時間が３０秒未満である場合、メンブレンにおける親水化度合いが不十分であるため、ウエスタンブロットを行なう場合、ウェスタンバッファー溶液との相溶性が低下し、バックグラウンドが発生する可能性が高く、３００秒を超過する場合、プラズマに長時間露出し、むしろメンブレンの物性が低下して、工程コストが上昇する。ここで、電力と処理時間とは反比例の関係を有するので、電力を高めるとプラズマ処理時間を減らすことができる。

以下、実施例によって本発明をより詳細に説明する。これら実施例は、単に本発明を例示するためのもので、本発明の範囲がこれら実施例によって制限されるものと解釈してはならない。

（実施例１）
紡糸溶液は、疏水性高分子であるホモ（ｈｏｍｏ）ポリマーで構成されたＰＶｄＦ（ＨＳＶ９００）を使用し、溶液全体に対して２０重量％になるように溶媒ＤＭＡｃに溶解して製造した。前記紡糸溶液は、定量ポンプを用いて紡糸ノズルに移送されて、印加電圧２５ｋＶ、紡糸口と集電体との距離２０ｃｍ、分当りの吐出量０．００５ｃｃ／ｇｈｏｌｌ、常温、常圧の条件で電気紡糸を実施して、ＰＶｄＦナノ繊維ウェブを得た。

このとき、紡糸されたＰＶｄＦナノ繊維ウェブは、図１で走査電子顕微鏡写真として示す。図１に示されたように、紡糸されたナノ繊維は、平均繊維径が約３００〜４００ｎｍを示した。また、ナノ繊維は、細孔径が比較的均一で、３次元的に開いた細孔構造を有する。

このように紡糸されたＰＶｄＦナノ繊維ウェブは、１４０℃で加熱した熱板ロールを通過させてカレンダリングして、ＰＶｄＦナノ繊維メンブレンを製作し、カレンダリング後のメンブレンの厚さは約８０μｍであった。

（実施例２及び３）
実施例２及び３は、疏水性高分子であるホモポリマーで構成されたＰＶｄＦ ７６１を単独（実施例２）で、及び共重合体であるＰＶｄＦ ２８０１をＰＶｄＦ ７６１と５０：５０重量％で混合（実施例３）して、実施例１と同様の方法で電気紡糸した後カレンダリングして、ナノ繊維メンブレンを得た。

製造された実施例２及び３のメンブレンは、比較例のメンブレンとの比較のために、ＴＧＡ、ＸＲＤ、ＳＥＭ、ＤＳＣ分析を実施した。熱分析の結果、比較例及び実施例により製造されたサンプルの場合、ほぼ同じ結果を示し、ＰＶｄＦ高分子の典型的な結果を示した。下記のメンブレン構造分析で、その結果を説明する。

（実施例４）
実施例４は、前記実施例１の方法によって製造されたＰＶｄＦナノ繊維メンブレンを、プラズマクリーナー装備を使用して表面改質を実施した。このときに使用されたガスは、アルゴン（Ａｒ）であり、アルゴンを１００ｓｃｃｍで供給しながら、４００Ｗで３０、６０、１５０、３００秒（ｓｅｃ）の間隔で表面改質を実施した。

図２は、実施例４により製造されたプラズマ処理されたＰＶｄＦメンブレンのプラズマ処理時間別表面構造を走査電子顕微鏡写真を通じて示す。図２に示されたように、プラズマ処理時間が増加するほどＰＶｄＦナノ繊維の表面に発生したクラックの大きさが増加するのが分かる。これは、プラズマ処理によりナノ繊維の表面にエッチングが発生して現れたものと判断される。

図３は、実施例４により製造されたプラズマ処理されたＰＶｄＦメンブレンのプラズマ処理による水との接触角を示した。図３に示されたように、プラズマ処理により水の接触角が低くなる親水化傾向を示し、プラズマ処理時間が増加するほど初期親水化傾向は増加するが、３０秒処理した場合にその変化の幅が最も大きく現れることが分かる。

図４は、実施例４により製造されたプラズマ処理されたＰＶｄＦメンブレンのプラズマ処理による引張強度を示した。図４に示されたように、プラズマ処理時間が増加するほど引張強度は減少する傾向を示し、プラズマ処理時間が増加するほどプラズマ処理によってメンブレンの物性が脆弱になることがわかる。

（比較例）
比較のために相分離法を用いて製造された商用化メンブレンであるＰａｌｌ社（ＰＡＬＬ ＣＯ．，ＬＴＤ．，ＢｉｏＴｒａｃｅ^ＴＭ ＰＶＤＦ）のＰＶｄＦメンブレンを使用した。このとき使用されたＰａｌｌ社のＰＶｄＦメンブレンは、厚さ１５０μｍ、平均細孔径の大きさが０．４５μｍであった。

図５には、ＰＭＩ（ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｆｌｏｗ ｐｏｒｏｍｅｔｅｒ）装備を使用して、実施例１及び比較例で製造されたメンブレンの平均細孔径の大きさを示した。図５に示されたように、（ｂ）実施例１を示すナノ繊維メンブレンの場合、平均細孔径の大きさが非常に均一に現れるが、（ａ）比較例を示す商用化メンブレンの場合、平均細孔径の大きさが非常に不均一に現れることが分かる。

図６には、（ａ）比較例、及び（ｂ）実施例１のメンブレンの断面走査電子顕微鏡写真を示した。

図６の（ａ）比較例の場合に示されたように、商用化メンブレンの場合、相分離法を用いて製造されるので、細孔構造が２次元の閉じた細孔（ｃｌｏｓｅｄ ｐｏｒｅ）構造に起因した反面、図６の（ｂ）実施例１の場合に示されたように、ナノ繊維メンブレンの場合、製造と同時に３次元の開いた細孔（ｏｐｅｎ ｐｏｒｅ）構造を示した結果と思われる。

（メンブレンの構造分析）
実施例１ないし３により製造されたＰＶｄＦメンブレン、及び比較例により製造された商用化メンブレンの構造分析をＤＳＣ、ＸＲＤ、ＴＧＡ、ＳＥＭを通じて行った。走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）分析結果、比較例の場合には、製造されたメンブレンを示す図６（ａ）で見るように、細孔径が均一ではなく、また細孔構造においても閉じた細孔構造であることが分かる。

熱重量分析（ＴＧＡ）結果を示した図７から、商用化メンブレンである比較例と本発明の実施例のいずれも約５００℃までは空気中で分解されないということを示しており、ただし、本発明の実施例１ないし３の場合が比較例に比べて熱的に多少、より安定していることを確認することができる。

一方、本発明の実施例１と比較例により製造された各メンブレンの気孔度（ｐｏｒｏｓｉｔｙ）は、それぞれ横×縦１ｃｍずつ切断して、次の式（１）により測定した。

上記式により得られた気孔度は、実施例１の場合が７３．３％、比較例の場合が約６７％であって、本発明の実施例１の方法により製造されたメンブレンの気孔度が約１０％、より大きいという事実を確認した。

（ウエスタンブロット試験例１）
一般的にウエスタンブロットを行なう場合、メンブレンを１００％メタノール（ｍｅｔｈａｎｏｌ）に活性化させて、メンブレンを部分親水化させる必要がある。これは、メンブレンとウェスタンバッファー溶液との親和性を増加させて、メンブレンにゲル（ｇｅｌ）内のタンパク質との相互作用がよく起きるようにする過程である。

以下は、前記メンブレンの部分親水化過程を省略した状態で、前記実施例１及び比較例のメンブレンを用いてウエスタンブロットを実施した。

まず、実施例１と比較例で製造されたメンブレンを、横×縦、それぞれ６×８ｃｍに予めカットして置き、メタノール活性化を省略し、ウエスタンブロットを行った。まず、カットされたメンブレンをトランスファー緩衝溶液（１×ｔｒａｎｓｆｅｒ ｂｕｆｆｅｒ）に移した後１０分間放置した。このとき、トランスファー緩衝溶液の構成は、３．０３ｇ／Ｌ ｔｒｉｓｍａ−ｂａｓｅ、１４．４ｇ／Ｌ グリシン（Ｇｌｙｃｉｎｅ）、２０％メタノール（ｍｅｔｈａｎｏｌ）（２００ｍｌ／Ｌ）であった。トランスファーするゲルはトランスファー緩衝溶液で軽く湿らせ、メンブレン上に気泡が生じないように注意して載せて置く。ゲルとメンブレンとを密着させた後、両面にトランスファー緩衝溶液で予め湿らせた３Ｍ紙（３Ｍ ｐａｐｅｒ）を当てて、トランスファーキット（Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｋｉｔ）に装着する。

トランスファーは、ミニ−ゲル（Ｍｉｎｉ−ｇｅｌ）トランスファーキットを使用して、１００Ｖで１時間実施し、この時発生する熱を遮断するために、トランスファー容器を氷中に置いて実施した。トランスファーが終わった後、装置を解体し、メンブレンを分離して、１ｘＴＢＳＴ（Ｔｒｉｓ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ ｗｉｔｈ ０．０５％ ｔｗｅｅｎ ２０）で湿らせる。このとき、ＴＢＳＴの構成は、０．２Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ８（２４．２ｇ Ｔｒｉｓｍａ ｂａｓｅ）、１．３７Ｍ ＮａＣｌ（８０ｇ ＮａＣｌ）、Ａｄｊｕｓｔ ｐＨ７．６ ｂｙ ｃｏｎｃ ＨＣｌからなる。

このとき、精製されたタンパク質抗原の濃度は、２０、１０、５、２．５、１μｇであって、１０％ＳＤＳ−ｐａｇｅゲルを用いた。全体トランスファー時間は約１時間４０分で、遮断時間（ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｔｉｍｅ）は１時間３０分であった。

１次抗体（ｆｉｒｓｔ Ａｎｔｉｂｏｄｙ）としてはβ−ａｃｔｉｎ（Ｓａｎｔａ ｃｒｕｚ、ｓｃ−４７７７８）を使用し、これを１：５０００に希釈して、−４℃で、トランスファーメンブレンと１日程度（２４ｈｒｓ）反応させた。このようにトランスファーされたものを、Ｘ線フィルムを用いて、タンパク質の発現を確認した。

図８は、実施例１と比較例により製造されたメンブレンを使用してウエスタンブロットを実施した結果を示したものである。図８に示されたように、商用化メンブレン（ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ ｍｅｍ．）の場合、メタノール活性化をしない場合（ＭｅＯＨ Ｎｏｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）、タンパク質の発現を観察することができなかった。しかし、実施例１のメンブレン（Ｐｌａｓｍａ Ｎｏｎ−ｔｒｅａｔｅｄ）の場合、メタノール活性化をしない場合にもタンパク質の発現が優秀に観察されるのを確認することができた。これは、実施例１のメンブレンが、電気紡糸によりナノ繊維が３次元構造で積層された形態で、細孔（気孔）が表面から裏面に至るまで連結された３次元の開いた細孔構造を有しており、毛細管現象（ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｅｆｆｅｃｔ）の発現に起因することである。

また、実施例１のメンブレンが比較例に比べて細孔径が均一であり、高い気孔度によって、より大きい比表面積を有するので、これによって、優れた敏感度を示したものと判断される。特に、比較例の商用化メンブレンの場合、相分離法を用いて製造されるので、その構造は必然的に２次元の閉じた細孔（２−Ｄ ｃｌｏｓｅｄ ｐｏｒｅ）構造を有しており、実施例１のナノ繊維メンブレンに比べて敏感度が低下した結果と見ることができる。

（ウエスタンブロット試験例２）
前記実施例１と実施例４により製造されたＰＶｄＦナノ繊維メンブレンを、前記試験例１と同様の方法で、ウエスタンブロットを実施した。このとき、ウエスタンブロットを行う前、１００％メタノール前処理（Ｔｒｅａｔｅｄ）をそれぞれ１分間実施して、プラズマ処理したメンブレン（３０秒、６０秒、１８０秒、３００秒）とプラズマ未処理メンブレン（０秒）とを比較して示した。

図９は、実施例１と４により製造された各メンブレンのウエスタンブロット評価結果を示した図である。図９に示されたように、プラズマ処理をしない（Ｐｌａｓｍａ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｔｉｍｅ ０秒）実施例１のメンブレンの場合、メタノール前処理過程（ＭｅＯＨ ｔｒｅａｔｅｄ）を経たメンブレンがメタノール未処理（ＭｅＯＨ Ｎｏｎ−ｔｒｅａｔｅｄ）メンブレンに比べて、タンパク質発現に優れたものと示された。しかし、逆に、プラズマ処理時間（Ｐｌａｓｍａ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｔｉｍｅ）をそれぞれ、３０秒、６０秒、１８０秒、３００秒処理した実施例４のメンブレンの場合、メタノール前処理過程を経たメンブレンよりもメタノール未処理（Ｎｏｎ−ｔｒｅａｔｅｄ）メンブレンが、よりタンパク質の発現に優れたものと示された。これは、プラズマ処理により既に表面親水化が進行したメンブレンを、メタノール前処理を行なうことによって、表面親水化が過度に進行して、メンブレンとタンパク質との間の疏水性相互作用を妨げて示された結果と判断される。

（ウエスタンブロット試験例３）
プラズマ処理されたメンブレンの経時変化を観察するために、前記実施例１と実施例４より製造されたＰＶｄＦナノ繊維メンブレンを３ヶ月間常温に放置した後、試験例１及び試験例２の方法と同様に、ウエスタンブロットを行って、その結果を図１０に示した。

図１０に示されたように、プラズマ処理後、３ヶ月経過後にも試験例２と同じ結果を得た。これは、ナノ繊維の場合、アルゴンプラズマ処理時表面構造の変化が時間によって大きく変わらないことを示唆する。

試験例２と試験例３の場合において、プラズマ処理時間が３０秒の場合、非常に鮮明にタンパク質が発現するのを見ることができる。これは、図１１でのように、プラズマ処理時間が６０秒を超過することになると、メンブレンの表面親水化が過度に進行して、ウエスタンブロットを行なう場合、メンブレンが黄色に変色することに起因する。

これは、ウェスタンバッファー溶液内の物質とメンブレンとの相互作用によるものであるが、ウエスタンブロットを行うのに大きな問題にはならない。

また、図９と図１０の結果で示されたように、プラズマ処理を行ったサンプルの場合、メタノール前処理過程を経たサンプルに比べてタンパク質の発現がより敏感に作用することは、メタノール処理よりプラズマ処理がナノ繊維の表面構造をより均一に改質するものであることが分かった。

特に、既存のメンブレンに比べてナノ繊維で構成されたメンブレンがより效果的にタンパク質を吸着するのは、ナノ繊維の場合、製造と同時に３次元の開いた細孔構造による毛細管現象、及び巨大比表面積の結果と判断され、既存の商用化メンブレンに比べて図６に示された結果のように、より均一な細孔構造に起因する。

したがって、本発明のナノ繊維メンブレンは、メタノール前処理による親水化過程を経なくてもタンパク質の発現がなされ、プラズマ処理により親水化過程を行って、ウエスタンブロット用メンブレンとして使用すると、バックグラウンドがないながら感度がさらに優れる。

以上では、本発明を特定の好適な実施例を挙げて説明したが、本発明は上記した実施例に限定されず、本発明の精神を逸脱しない範囲内で当該発明の属する技術分野における通常の知識を有する者によって多様な変更及び修正が可能であるだろう。

本発明は、ウエスタンブロット用メンブレンとして使用可能であり、タンパク質の分離、分析、検出、診断を含む多様な分野においてメンブレンとして活用可能である。

Claims (11)

1. ウエスタンブロット用メンブレンの製造方法において、
   紡糸溶液全体に対して５〜９０重量％の疎水性高分子物質を溶媒に溶解して、紡糸溶液を製造する段階と、
   前記紡糸溶液を、電気紡糸法によって、疎水性高分子ナノ繊維ウェブを得る段階と、
   前記得られたナノ繊維ウェブをカレンダリングして、ウエスタンブロット用メンブレンを得る段階と、
   前記カレンダリングされたナノ繊維ウェブに親水性を付与するために、表面にプラズマ処理を行う段階と、を含むことを特徴とする、ウエスタンブロット用メンブレンの製造方法。
2. 前記疎水性高分子物質は、例えば、ＰＶｄＦ（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ ｆｌｕｏｒｉｄｅ）、ナイロン（ｎｙｌｏｎ）、ニトロセルロース（ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）、ＰＵ（ｐｏｌｙｕｒｅｔｈａｎｅ）、ＰＣ（ｐｏｌｙｃａｒｂｏｎａｔｅ）、ＰＳ（ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ）、ＰＬＡ（ｐｏｌｙｌａｔｉｃ ａｃｉｄ）、ＰＡＮ（ｐｏｌｙａｃｒｙｌｏｎｉｔｒｉｌｅ）、ＰＬＧＡ（ｐｏｌｙｌａｃｔｉｃ−ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｃ ａｃｉｄ）ＰＥＩ（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ）、ＰＰＩ（ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ）、ＰＭＭＡ（Ｐｏｌｙｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ）、ＰＶＣ（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｃｈｏｌｒｉｄｅ）、ＰＶＡｃ（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌａｃｅｔａｔｅ）、及びポリスチレンジビニルベンゼン共重合体（Ｐｏｌｙｓｔｙｌｅｎｅ ｄｉｖｉｎｙｌｂｅｎｚｅｎｅ ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ）からなる群から選択された１種または２種以上の混合物で構成されることを特徴とする、請求項１に記載のウエスタンブロット用メンブレンの製造方法。
3. 前記溶媒は、ジメチルホルムアミド（ｄｉ−ｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ、ＤＭＦ）、ジメチルアセトアミド（ｄｉ−ｍｅｔｈｙｌａｃｅｔａｍｉｄｅ、ＤＭＡｃ）、ＴＨＦ（ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｕｒａｎ）、アセトン（Ａｃｅｔｏｎｅ）、アルコール（Ａｌｃｏｈｏｌ）類、クロロホルム（Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ）、ＤＭＳＯ（ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）、ジクロロメタン（ｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ）、酢酸（ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）、ギ酸（ｆｏｒｍｉｃ ａｃｉｄ）、ＮＭＰ（Ｎ−Ｍｅｔｈｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ）、フッ素系アルコール類、及び水からなる群から選択された１種以上であることを特徴とする、請求項１に記載のウエスタンブロット用メンブレンの製造方法。
4. 前記ナノ繊維ウェブを形成するナノ繊維の直径は、５０〜１０００ｎｍであることを特徴とする、請求項１に記載のウエスタンブロット用メンブレンの製造方法。
5. 前記紡糸方法は、電気紡糸（ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｉｎｎｉｎｇ）、電気スプレー（ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ）、電気噴射紡糸（ｅｌｅｃｔｒｏｂｌｏｗｎ ｓｐｉｎｎｉｎｇ）、遠心電気紡糸（ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｉｎｎｉｎｇ）、及びフラッシュ電気紡糸（ｆｌａｓｈ−ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｉｎｎｉｎｇ）、バブル電気紡糸（ｂｕｂｂｌｅ ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｉｎｎｉｎｇ）、溶融電気紡糸（ｍｅｌｔ ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｉｎｎｉｎｇ）、ニードルレス電気紡糸（ｎｅｅｄｌｅｌｅｓｓ ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｉｎｎｉｎｇ）から選択されたいずれか１つの方法であることを特徴とする、請求項１に記載のウエスタンブロット用メンブレンの製造方法。
6. 前記カレンダリングは、圧着、加圧、熱板カレンダリング、ローリング、熱接合、超音波接合、シームシーリングテープ法、ラミネーティングから選択されたいずれか１つの方法で行われることを特徴とする、請求項１に記載のウエスタンブロット用メンブレンの製造方法。
7. 前記カレンダリング工程は、６０〜２００℃の温度範囲での熱処理を伴いながら行われることを特徴とする、請求項１に記載のウエスタンブロット用メンブレンの製造方法。
8. 前記プラズマ処理時に使用するガスは、酸素またはアルゴンであることを特徴とする、請求項１に記載のウエスタンブロット用メンブレンの製造方法。
9. 前記プラズマ処理時間は、３０〜３００秒であることを特徴とする、請求項１に記載のウエスタンブロット用メンブレンの製造方法。
10. 前記メンブレンは、平均細孔径が０．１〜１．０μｍ、厚さが３０〜２００μｍ、気孔度が６０％以上であることを特徴とする、請求項１に記載のウエスタンブロット用メンブレンの製造方法。
11. 請求項１ないし１０のうちいずれか１項によって製造される、ウエスタンブロット用メンブレン。