KR101139327B1

KR101139327B1 - 플라즈마 처리에 의한 친수성 웨스턴 블롯용 멤브레인 및 그 제조방법

Info

Publication number: KR101139327B1
Application number: KR1020100078667A
Authority: KR
Inventors: 김찬; 조기운; 박주영
Original assignee: 주식회사 아모그린텍; 주식회사 아모메디
Priority date: 2010-08-16
Filing date: 2010-08-16
Publication date: 2012-04-26
Also published as: KR20120021734A

Abstract

본 발명은 전기방사된 나노섬유를 열판 캘린더 공정을 거친 후 플라즈마 처리에 의해 친수화를 부여하여 웨스턴 블롯시 메탄올 전처리 과정을 거치지 않고도 감도가 우수하고 백그라운드가 없는 웨스턴 블롯용 멤브레인 및 그 제조방법에 관한 것이다.
본 발명은 소수성 고분자 물질을 용매에 용해하여 방사용액을 제조하는 단계; 상기 방사용액을 방사방법에 의하여 소수성 고분자 나노섬유 웹을 얻는 단계; 상기 얻어진 나노섬유 웹을 라미네이팅하는 단계; 및 상기 라미네이팅된 나노섬유 웹을 플라즈마 처리하여 웨스턴 블롯용 멤브레인을 얻는 단계를 포함한다.

Description

플라즈마 처리에 의한 친수성 웨스턴 블롯용 멤브레인 및 그 제조방법{ Nano-fibered Membrane of Hydrophile Property for Western Blot by Plasma Coating and Manufacturing Method of the Same}

본 발명은 나노섬유로 구성된 웨스턴 블롯(western blot)용 멤브레인(membrane) 및 그 제조방법에 관한 것으로, 구체적으로는 전기방사된 나노섬유를 열판 캘린더 공정을 거친 후 플라즈마 처리에 의해 친수화를 부여하여 웨스턴 블롯시 메탄올 전처리 과정을 거치지 않고도 감도가 우수하고 백그라운드가 없는 웨스턴 블롯용 멤브레인 및 그 제조방법에 관한 것이다.

현재 상용화 되어 있는 웨스턴 블롯용 멤브레인으로는 니트로셀룰로오스(NC, nitro cellulose), 나일론(Nylon), 폴리비닐리덴 플루오라이드(polyvinylidene fluoride, 이하 'PVdF") 계 고분자로 이루어진 다공성 멤브레인이 있다.

특히, PVdF계 멤브레인의 경우 니트로셀룰로오스나 나일론 계 등에 비해 단백질 바인딩 감도나 멤브레인 강도, 취급성 등이 우수하여 웨스턴 블롯용 멤브레인의 주종을 이루어 왔다.

웨스턴 블롯은 주어진 샘플의 조직 호모게네이트(homogenate)나 추출물의 특정 단백질을 분리, 검출하는데 사용되는 기법으로 여러 단백질 혼합물로부터 어떤 특정 단백질을 찾아내는 기법으로, 찾고자 하는 단백질에 대한 항체(antibody)를 사용하여 항원-항체반응(antigen-antibody reaction)을 일으킴으로서 단백질의 존재 여부를 밝혀내는 방법이다.

또한, 네이티브 겔(native gel) 또는 변성단백질을 폴리펩타이드(polypeptide) 또는 단백질의 3차원 구조의 크기에 의해 분리하는 데에도 이용된다.

웨스턴 블롯은 세포나 조직으로부터 추출된 단백질을 샘플버퍼(sample buffer)와 섞어 아크릴아미드(acrylamide)로 만든 분자체(molecular sieve)에 올려놓고 전기영동을 하면 샘플버퍼에 들어있던 SDS(sodium dodecylsulfate, SDS-page) 라는 물질이 단백질 전체에 (-) 전기를 띠게 해서 (+) 전기쪽으로 단백질이 끌려가게 된다. 이때 SDS 분자체가 단백질의 진행을 방해하여 작은 분자는 빨리, 큰분자는 느리게 이동하여 여러 크기의 밴드(band)를 형성하게 되는데, 이때 크기에 따라 분리된 겔(gel)위에 멤브레인을 올려놓고 전기를 흘려주면 단백질은 분리된 상태로 멤브레인에 옮겨진다(transfer). 여기서 검출하고자 하는 특정 단백질에 대한 항체(antibody)를 결합시키고 다시 그 항체에 특이적인 2차 항체를 결합시켜 발색 내지는 형광에 의해 나타나는 반응을 엑스레이(X-ray)로 이미지화하는 방법이다.

이때 사용되는 멤브레인은 단백질과 소수성 결합(hydrophobic interaction)을 할 수 있는 예를 들면, PVdF를 원료로 하여 평균 세공경이 0.2㎛와 0.45㎛로 구성되어 있는 다공성 멤브레인을 사용하고 있다. 이러한 멤브레인은 물과 같은 비용매 속에 용매와 고분자를 부어 제작하는 상전이법(phase separation)에 의한 건식(dry), 습식(wet), 건습식(dry-wet casting)과 같은 방법으로 제조되고 있으나 제조단가가 고가이며, 대량으로 생산하는데 한계가 있다.

또한, 상전이법에 의해 제조되므로 세공구조가 균일한 분포를 이루지 못하는 단점이 있으며, 예를 들면, PVdF 멤브레인의 경우 사용 전 100% 메탄올에 침지하여 멤브레인을 부분 친수화시켜 버퍼용액과의 상용성을 극대화시킬 필요가 있으며, 이러한 과정을 생략할 경우 단백질 흡착이 되지 않거나 불충분한 경우가 발생한다.

그러나, 메탄올 전처리에 의해 멤브레인의 강도가 크게 저하하여 크랙이 발생할 우려가 있고, 기포 등이 형성되어 백그라운드가 발생하여 원하는 단백질을 정확하게 검출하는데 한계가 있다.

따라서, 웨스턴 블롯을 행할 경우 메탄올 전처리과정이 없으면서 백그라운드가 발생하지 않는 초고감도 멤브레인에 대한 사용자의 요구가 강하게 요구되어왔다.

따라서, 본 발명의 발명자들은 상기 요구에 부응하기 위하여 보다 저렴하면서 간단하고 환경부하가 적은 플라즈마 처리를 통하여 나노섬유로 구성된 멤브레인의 표면을 친수화시켜 웨스턴 블롯을 행할 경우 메탄올 전처리 과정을 생략하여도 기존 멤브레인보다 백그라운드가 없으면서 감도가 우수한 웨스턴 블롯용 나노섬유로 구성된 초고감도 멤브레인을 제조할 수 있다는 사실을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 나노섬유 웹을 플라즈마 처리하여 친수성을 부여하면 별도의 메탄올 전처리과정이 생략가능하며 백그라운드가 없으면서 감도가 우수한 웨스턴 블롯용 멤브레인 및 그 제조방법을 제공함에 있다.

이와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 양태에 따르면, 웨스턴 블롯용 멤브레인의 제조방법에 있어서, 소수성 고분자 물질을 용매에 용해하여 방사용액을 제조하는 단계; 상기 방사용액을 방사방법에 의하여 소수성 고분자 나노섬유 웹을 얻는 단계; 상기 얻어진 나노섬유 웹을 라미네이팅하는 단계; 및 상기 라미네이팅된 나노섬유 웹에 친수성을 부여하기 위해 표면개질을 수행하여 웨스턴 블롯용 멤브레인을 얻는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 웨스턴 블롯용 멤브레인의 제조방법을 제공한다.

상기 소수성 고분자 물질은 PVdF(polyvinylidene fluoride), 나일론(nylon), 니트로셀룰로오스(nitrocellulose), PU(polyurethane), PC(polycarbonate), PS(polystyrene), PLA(polylatic acid), PAN(polyacrylonitrile), PLGA,(polylactic-co-glycolic acid) PEI(polyethyleneimine), PPI(polypropyleneimine), PMMA(Polymethylmethacrylate), PVC(polyvinylcholride), PVAc(polyvinylacetate), 및 폴리스티렌 디비닐벤젠 공중합체(Polystylene divinylbenzene copolymer)로 구성되는 군에서 선택되는 1종 또는 2종 이상을 복합화하여 구성되는 것을 특징으로 한다

상기 용매는 디메틸 포름아미드(di-methylformamide, DMF), 디메틸 아세트아미드(di-methylacetamide, DMAc), THF(tetrahydrofuran), 아세톤(Acetone), 알코올(Alcohol)류, 클로로포름(Chloroform), DMSO(dimethyl sulfoxide), 디클로로메탄(dichloromethane), 초산(acetic acid), 개미산(formic acid), NMP(N-Methylpyrrolidone), 불소계 알콜류, 및 물로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 한다.

상기 나노섬유 웹을 형성하는 나노섬유의 직경은 50～1000㎚인 것을 특징으로 한다.

상기 방사방법은 전기방사(electrospinning), 전기분사(electrospray), 전기분사방사(electroblown spinning), 원심전기방사(centrifugal electrospinning), 및 플래쉬 전기방사(flash-electrospinning)로 이루어진 군에서 선택되는 1종인 것을 특징으로 한다.

상기 라미네이팅은 압착, 가압, 캘린더링, 롤링, 열접합, 초음파 접합, 심 실링 테이프법 중에서 선택된 어느 하나의 방법으로 수행되는 것을 특징으로 한다.

상기 방사용액 전체에 대하여 상기 소수성 고분자 물질의 함량은 5～90중량%인 것을 특징으로 하는 웨스턴 블롯용 멤브레인의 제조방법.

상기 라미네이팅 공정은 60～200℃ 온도범위에서의 열처리를 수반하면서 수행되는 것을 특징으로 한다.

상기 표면 개질은 플라즈마 처리에 의해 수행하는 것을 특징으로 한다.

상기 플라즈마 처리시 사용하는 가스는 산소 또는 아르곤인 것을 특징으로 한다.

상기 플라즈마 처리시간은 30~300초인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 다른 양태에 따르면, 상기에서 제조되는 웨스턴 블롯용 멤브레인으로서, 평균 세공경이 0.1～1.0㎛, 멤브레인 두께가 30～200㎛인 것을 특징으로 하는 웨스턴 블롯용 멤브레인을 제공한다.

따라서, 본 발명에 있어서는 메탄올 전처리과정을 생략하여도 기존의 멤브레인에 비해 우수한 감도를 제공하는 효과가 있다.

도 1은 본 발명의 실시예 1에 의해 제조된 PVdF 멤브레인의 주사전자 현미경 사진; (a) 1k, (b) 10kㅧ 배율,
도 2는 본 발명의 실시예 2에 의해 제조된 플라즈마 처리된 PVdF 멤브레인의 주사전자 현미경 사진; (a)플라즈마처리 30초 (b)플라즈마처리 60초 (c)플라즈마처리 150초 (d)플라즈마처리 300초,
도 3 및 도 4는 본 발명의 실시예 2에 의해 제조된 플라즈마 처리된 PVdF 멤브레인의 접촉각 및 인장강도를 나타내는 그래프,
도 5는 본 발명의 실시예 1과 비교예에서 제조된 각 멤브레인의 평균세공경의 크기를 나타내는 그래프; (a) 비교예 (b) 실시예 1,
도 6은 본 발명의 실시예 1과 비교예에서 제조된 각 멤브레인 단면 주사전자 현미경 사진; (a) 비교예 (b) 실시예 1
도 7은 본 발명의 실시예 1과 비교예에 의해 제조된 각 멤브레인의 웨스턴블롯 평가 결과를 나타낸 그림,
도 8 및 도 9는 본 발명의 실시예 1과 2에 의해 제조된 각 멤브레인의 웨스턴블롯 평가 결과를 나타낸 그림,
도 10은 웨스턴 블롯 후의 멤브레인의 변색된 상태를 보여주는 사진.

본 발명에 따른 웨스턴 블롯용 나노섬유로 구성된 멤브레인은 소수성 고분자 예를 들면, PVdF 고분자를 방사 가능한 농도로 용매에 용해하여 방사용액을 제조하고, 방사구로 이송한 후 노즐에 고전압을 인가하여 전기방사하고 이를 라미네이팅하여 평균 세공경 0.1~1.0 ㎛, 평균 섬유경 50~1,000 ㎚, 멤브레인 두께 30~200 ㎛로 구성되어 있으며 플라즈마 처리에 의해 표면친수화가 진행되어 메탄올 전처리 과정이 생략되어도 감도가 우수한 단백질 분리, 검출용 멤브레인을 제조한다.

이하 각 단계별로 상세히 설명한다.

소수성 고분자 함유 방사용액 제조단계

소수성 고분자 예를 들면, PVdF를 적당한 용매를 사용하여 방사 가능한 농도로 용해하여 방사용액을 준비한다. 상기 방사용액 제조에 있어서 PVdF 고분자 물질의 함량은 약 5 ~ 90 중량%가 적당하며 5 중량% 미만의 경우 나노섬유를 형성하기 보다는 비드상(bead)으로 분사되어 멤브레인을 구성하기 어려우며, 90중량% 초과인 경우에는 점도가 높아 방사성이 불량하여 섬유를 형성하기 곤란한 경우가 있다. 따라서 방사용액의 제조는 특별한 제약은 없으나 섬유상 구조를 형성하기 쉬운 농도로 섬유의 모폴러지(morphlolgy)를 제어하는 것이 바람직하다.

본 발명에 있어서 사용가능한 소수성 고분자 물질로는 상기 PVdF(polyvinylidene fluoride) 이외에도 나일론, 니트로셀룰로오즈, PU(polyurethane), PC(polycarbonate), PS(polystyrene), PLA(polylatic acid), PLGA(polylactic-co-glycolic acid), PAN(polyacrylonitrile), PEI(polyethyleneimine), PPI(polypropyleneimine), PMMA(Polymethylmethacrylate), PVC(polyvinylcholride), PVAc(polyvinylacetate), 및 폴리스티렌 디비닐벤젠 공중합체(Polystylene divinylbenzene copolymer) 등을 단독 내지는 복합화 하여 사용할 수 있으며, 상용성 있는 용매를 사용하여 방사 가능한 농도의 방사용액을 제조하여 사용한다.

여기서 사용되는 용매는 디메틸 포름아미드(di-methylformamide, DMF), 디메틸 아세트아미드(di-methylacetamide, DMAc), THF(tetrahydrofuran), 아세톤(Acetone), 알코올(Alcohol)류, 클로로포름(Chloroform), DMSO(dimethyl sulfoxide), 디클로로메탄(dichloromethane), 초산(acetic acid), 개미산(formic acid), NMP(N-Methylpyrrolidone), 불소계 알콜류, 및 물로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 사용한다.

고분자 나노섬유 웹 형성단계

상기 제조된 방사용액을 정량펌프를 사용하여 방사팩(spin pack)으로 이송하고, 이때 고전압 조절장치를 사용하여 방사팩에 전압을 인가하여 전기방사를 실시한다. 이때 사용되는 전압은 0.5~100 kV까지 조절하는 것이 가능하며, 집전판은 접지를 하거나 (-)극으로 대전하여 사용할 수 있으며, 전기전도성 금속, 박리지 등으로 구성되는 것이 바람직하다. 집전판의 경우 방사시 섬유의 집속을 원활하게 하기위해 포집장치(suction collector)를 부착하여 사용하는 것이 바람직하다.

또한 방사팩과 집전판까지의 거리는 5~50 ㎝로 조절하여 사용하는 것이 바람직하다. 방사시 토출량은 정량펌프를 사용하여 홀당 0.01~5 cc/hole?min으로 토출하여 방사하고, 방사시 온도 및 습도를 조절할 수 있는 챔버내에서 상대 습도 30-80 %의 환경에서 방사하는 것이 바람직하다.

방사방법은 상기 전기방사(electrospinning)이외에도, 전기분사(electrospray), 전기분사방사(electroblown spinning), 원심전기방사(centrifugal electrospinning), 및 플래쉬 전기방사(flash-electrospinning)도 가능하다.

고분자 나노섬유 웹 라미네이팅 단계

제조된 고분자 예를 들면, PVdF로 구성된 나노섬유 웹은 압착, 롤링, 열접합, 초음파 접함, 심 실링 테이프(Sim sealing tape), 등의 다양한 방법으로 라미네이팅하여 멤브레인 두께 30~200 ㎛, 평균 세공경 0.1~1.0 ㎛가 되도록 한다.

멤브레인 두께가 30 ㎛ 미만의 경우 웨스턴 블롯시 강직도가 낮아 취급이 불량하며, 200 ㎛를 초과할 경우 제조공정 비용이 상승하므로 30~200 ㎛가 적당하다. 또한, 평균세공경은 0.1~1.0 ㎛가 적당하며, 0.1 ㎛ 미만의 경우 후처리 공정 비용이 상승하며 트렌스퍼 시간이 지연되는 특징이 있으며, 1.0 ㎛ 초과의 경우 트렌트퍼 농도가 낮아 정확한 단백질 분석이 이루어질 수 없는 단점이 있다.

특히, 나노섬유 부직포의 압착의 경우 열처리를 동반하면서 할 수 있는데 고분자가 용융되지 않는 범위인 60~200℃의 온도범위에서 실시하는 것이 바람직하다. 60℃미만의 경우 열처리 온도가 낮아 나노섬유간 융착이 불안정하여 나노섬유의 분리가 진행되어 적당한 웨스턴 블롯을 수행하기 어렵게 된다. 또한 열처리 온도가 200℃ 초과의 경우 나노섬유를 구성하는 고분자 예를 들면 PVdF의 용융에 의해 세공구조가 막혀 적절한 SDS-page로부터 단백질 전이(transfer)가 이루어지지 않아 정확한 분석이 이루어지지 않는 경향이 있다.

나노섬유 표면 개질단계

나노섬유의 표면구조 개질에는 용매를 사용하여 WBL(weak boundary layer)를 제거, 팽윤, 표면 에칭을 거치는 화학적 방법과, X-ray, Y-ray, 전자빔 등의 이온화 방사선(radiation) 조사로 표면반응을 유도하는 광화학적 개질방법과, 진공하에서 코로나 방전(corona discharge), 플라즈마(plasma), 전자빔, 이온빔 등의 고에너지 원자, 분자 이온을 이용하여 표면산화 반응을 유도하는 물리적 개질과, 화염 내지는 오존을 이용하는 방법 등 다양한 형태로 나노섬유의 표면을 개질할 수 있다.

본 발명에서는 이러한 상기의 방법 중에서 가장 간단하면서 환경부하가 적고 표면개질 효과가 우수한 플라즈마 처리를 통하여 나노섬유의 표면을 친수화시켜 메탄올 전처리과정이 생략된 초고감도 웨스턴 블롯용 멤브레인을 완성한다.

플라즈마 처리 공정변수로는 사용되는 가스의 종류나 유량, 처리압력, 처리시간, 전력 등을 들 수 있으며, 나노섬유의 표면개질에 맞는 조건을 찾는 것이 바람직하다.

즉, 플라즈마 공정시 사용되는 처리가스로는 산소(O₂)나 아르곤(Ar) 등을 사용할 수 있으나 본 발명에서는 에칭과 가교효과(crosslinking effect)를 갖는 아르곤 가스를 사용하는 것이 바람직하며, 처리시간으로는 30 ~ 300초 정도의 처리가 적당하며, 이때 전력은 400W로 하는 것이 적당하다. 30초 미만의 플라즈마 처리의 경우 멤브레인에 부분친수화가 진행되어 웨스턴 블롯을 행할 경우 웨스턴 버퍼용액과의 상용성이 떨어져 백그라운드가 발생하는 경우가 있으며, 300초를 초과할 경우 웨스턴 블롯시 감도는 상승하나 멤브레인의 물성이 저하하는 경우가 발생하고, 공정비용이 상승할 우려가 있다. 또한, 전력을 높여주면 플라즈마 처리시간을 줄일수 있으므로, 전력과 처리시간은 반비례의 관계를 가진다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

(실시예 1)

PVdF 고분자를 20중량%가 되도록 용매 DMAc에 용해하였다. 상기 제조된 용액을 정량펌프를 이용하여 방사노즐로 이송하고 인가전압 25kV, 방사구와 집전체와의 거리 20㎝, 토출량 분당 0.05cc/g?holl으로 상온, 상압에서 방사를 실시하여 PVdF 나노섬유 방사 웹을 얻었다.

이때 방사된 PVdF 나노섬유 방사 웹의 주사전자 현미경 사진을 도 1에 나타내었다. 도 1에서 보는 바와 같이, 방사된 나노섬유의 평균 직경은 약 300-400 ㎚를 나타내었다. 세공경이 비교적 균일하며 그 구조에 있어서도 3차원적으로 열린 세공구조(3-dimensional open pore channel)로 형성되어 있음을 알 수 있다.

이렇게 방사된 PVdF 나노섬유 방사 웹을 140℃로 가열된 열판 캘린더 롤을 통과시켜 라미네이팅을 실시하여 PVdF 나노섬유 멤브레인을 제작하였으며, 라미네이팅 후 멤브레인의 두께는 약 80㎛이었다.

(실시예 2)

상기 실시예 1의 방법에 의해 제조된 PVdF 나노섬유 멤브레인을 플라즈마 크리너 장비를 사용하여 표면개질을 실시하였다. 이때 사용된 가스로는 아르곤(Ar)을 100 sccm으로 공급하면서 400W에서 30, 60, 150, 300sec 간격으로 표면개질을 실시했다.

도 2에는 실시예2에 의해 제조된 플라즈마 처리된 PVdF 멤브레인의 플라즈마 처리시간별 PVdF 나노섬유 멤브레인의 표면 구조를 주사전자현미경의 사진을 보여준다. 도 2에서 보는 바와 같이, 플라즈마 처리시간이 증가할수록 PVdF 나노섬유 표면에 발생한 크랙의 크기가 증가하는 것을 볼 수 있다. 이것은 플라즈마 처리에 의해 나노섬유 표면에 에칭이 발생하여 나타난 것으로 판단된다.

도 3에는 실시예2에 의해 제조된 플라즈마 처리된 PVdF 멤브레인의 플라즈마 처리에 따른 물과의 접촉각 결과를 나타내었다. 도 3에 도시된 바와 같이, 플라즈마 처리에 따라 물의 접촉각이 낮아지는 친수화 경향을 나타내었으며, 플라즈마 처리 시간이 증가할수록 초기 친수화 경향은 증가하나 30초 처리한 경우 그 변화폭이 가장 크게 나타남을 알 수 있다.

도 4는 실시예2에 의해 제조된 플라즈마 처리된 PVdF 멤브레인의 플라즈마 처리에 따른 인장강도를 나타내었다. 도 4에 도시된 바와 같이, 플라즈마 처리시간이 증가할수록 인장강도는 감소하는 경향을 나타내었으며, 이는 플라즈마 처리에 따른 결과로 플라즈마 처리시간이 증가할수록 멤브레인의 물성이 취약해지는 것을 알 수 있다.

(비교예)

비교를 위하여 상분리법을 이용하여 제조된 상용화 멤브레인인 Pall사(PALL CO., LTD., BioTrace™ PVDF)의 PVdF 멤브레인을 사용하였다. 이때 사용된 Pall사의 PVdF 멤브레인은 두께 150㎛, 평균 세공경의 크기가 0.45㎛이었다.

도 5에는 PMI(capillary flow porometer)장비를 사용하여 실시예1과 비교예에서 제조된 멤브레인의 평균세공경의 크기를 나타내었다. 도 5에서 보는 바와 같이, (b)실시예를 보여주는 나노섬유로 구성된 멤브레인의 경우 평균세공경의 크기가 매우 균일하게 나타나나 (a)비교예를 보여주는 상용화 샘플의 경우 평균세공경의 크기가 매우 광범위하게 나타남을 알 수 있다.

도 6에는 (a) 비교예와 (b)실시예1의 멤브레인의 단면 주사전자 현미경 사진을 나타내었다.

도 6의 (a) 비교예의 경우에 나타난 바와 같이 상용화 샘플의 경우 상분리법을 이용하여 제조되므로 세공구조가 2차원 닫힌 세공(closed pore) 구조에 기인한 반면, 도 6의 (b) 실시예1의 경우에 나타난 바와 같이 나노섬유의 경우 제조와 동시에 3차원 열린 세공(open pore) 구조를 나타낸 결과로 생각된다.

(웨스턴 블롯 시험예1)

일반적으로 웨스턴 블롯을 행할 경우 멤브레인을 100% 메탄올(methanol)에 활성화시켜 멤브레인을 부분 친수화시킬 필요가 있다. 이것은 멤브레인과 웨스턴 버퍼용액과의 친화성을 증가시켜 멤브레인에 겔(gel)내 단백질과의 상호작용이 잘 일어나도록 하는 과정이다.

이하는 상기 멤브레인의 부분 친수화 과정을 생략한 상태에서 상기 실시예1과 비교예의 멤브레인을 이용하여 웨스턴 블롯을 실시하였다.

먼저 실시예1과 비교예에서 제조된 멤브레인을 가로× 세로 각각 6× 8㎝로 미리 잘라놓고 메탄올 활성화를 생략하고 웨스턴 블롯을 행하였다. 먼저 잘라진 멤브레인을 트랜스퍼 완충용액(1× transfer buffer)으로 옮겨준 후 10분간 방치하였다. 이때 트랜스퍼 완충용액의 구성은 3.03g/L trisma-base, 14.4g/L Glycine, 20% methanol (200ml/L)이었다. 트랜스퍼할 겔을 트랜스퍼 완충용액으로 살짝 적셔주고 멤브레인 위에 기포가 생기지 않도록 주의하여 올려놓는다. 겔과 멤브레인을 밀착시킨 후 양면에 트랜스퍼 완충용액으로 미리 적셔준 3M지(3M paper)를 대고 트랜스퍼 키트(Transfer kit)에 장착한다.

트랜스퍼는 미니-겔(Mini-gel) 트랜스퍼 키트를 사용하여 100V에서 1시간 실시하였으며, 이때 발생하는 열을 차단하기 위하여 트랜스퍼 용기를 얼음 속에 놓아 실시하였다. 트랜스퍼가 끝난 후 장치를 해체하고 멤브레인을 분리하여 1xTBST(Tris-buffered saline with 0.05% tween 20)로 살짝 찧어준다. 이때 TBST의 구성은 0.2M Tris pH 8 (24.2g Trisma base), 1.37M NaCl (80g NaCl), Adjust pH7.6 by conc HCl로 이루어진다.

이때 정제된 단백질 항원의 농도는 20, 10, 5, 2.5, 1㎍이었으며, 10% SDS-page 겔을 이용하였다. 전체 트랜스퍼 시간은 약 1시간 40분이었으며, 차단시간(blocking time)은 1시간 30분이었다.

1차 항체(First Antibody)로는 β-actin (Santa cruz, sc-47778)이었으며, 이를 1:5000으로 희석하여 트랜스퍼 멤브레인과 - 4℃에서 하루정도 반응시켰다. 이렇게 트랜스퍼된 것을 X-ray 필름을 이용하여 단백질 발현을 확인하였다.

도 7은 실시예1과 비교예에 의해 제조된 멤브레인을 사용하여 웨스턴 블롯을 시행한 결과를 나타낸 것이다. 도 7에서 보는 바와 같이, 상용화 멤브레인(Commercial mem.)의 경우 메탄올 활성화를 하지 않을 경우(MeOH Non activation) 단백질 발현을 관찰할 수 없었으나 PVdF 나노섬유 멤브레인(Plasma Non-treated)의 경우 플라즈마 처리를 행하지 않아도 단백질 발현이 우수하게 관찰되는 것을 확인할 수 있었다. 이것은 나노섬유의 경우 방사와 동시에 나노섬유가 3차원 구조로 적층된 형태로 세공(기공)이 표면에서 이면에 이르기까지 연결된 3차원 열린 세공구조를 가지고 있다.

또한, 실시예1의 멤브레인이 비교예에 비하여 세공경이 균일하며, 높은 기공도에 의해 보다 큰 비표면적을 가지므로 이에 따라 우수한 민감도를 보인 것으로 판단된다. 특히 상용화 멤브레인의 경우 상분리법을 이용하여 제조되므로 그 구조는 필연적으로 2차원 닫힌 세공(2-D closed pore) 구조를 가지고 있어 나노섬유에 비해 민감도가 떨어진 결과로 볼 수 있다.

(웨스턴 블롯 시험예2)

상기 실시예1과 실시예2에 의해 제조된 PVdF 멤브레인을 상기 시험예1의 방법과 동일한 방법으로 웨스턴 블롯을 실시하였다. 이때 웨스턴 블롯을 행하기 전 100% 메탄올 전처리를 각각 1분간 실시하여 플라즈마 처리한 샘플과 미처리 샘플을 비교하여 나타내었다.

도 8은 실시예1과 2에 의해 제조된 각 멤브레인의 웨스턴 블롯 평가 결과를 나타낸 그림이다. 도 8에서 보는 바와 같이, 플라즈마 처리를 하지 않은 PVdF 나노섬유 멤브레인의 경우 메탄올 전처리과정(MeOH treated)을 거친 멤브레인 샘플이 미처리 멤브레인 샘플에 비해 단백질 발현이 우수한 것으로 나타났으나 반대로 플라즈마 처리(Plasma treatment)를 30초 이상 처리한 멤브레인 샘플의 경우 메탄올 전처리과정을 거친 멤브레인 샘플 보다 미처리 멤브레인 샘플이 단백질 발현이 보다 우수한 것으로 나타났다. 이것은 플라즈마 처리에 의해 이미 표면 친수화가 진행된 샘플을 메탄올 전처리를 행함으로써 표면친수화가 과도하게 진행되어 멤브레인과 단백질간 소수성 상호작용을 방해하여 나타난 결과로 판단된다.

따라서, 메탄올 전처리를 하지 않고 플라즈마 처리를 30초간했을 경우에 가장 바람직한 멤브레인을 얻을 수 있었다.

(웨스턴 블롯 시험예3)

플라즈마 처리된 샘플의 경시변화를 관찰하기 위해 상기 실시예1과 실시예2에 의해 제조된 PVdF 나노섬유 멤브레인을 3개월간 상온에 방치한 후 시험예1과 시험예2의 방법과 동일하게 웨스턴 블롯을 행하였으며 그 결과를 도 9에 나타냈다.

도 9에서 보는 바와 같이, 플라즈마 처리후 3개월 경과 후에도 시험예2와 동일한 결과를 얻었다. 이것은 나노섬유의 경우 아르곤 플라즈마처리시 표면구조의 변화가 시간에 따라 크게 변하지 않음을 시사하고 있는 것으로 사료된다.

시험예2와 시험예3의 경우 플라즈마 처리시간이 30초의 경우가 매우 선명하게 단백질이 발현되는 것을 볼 수 있는데 이것은 도 10에서와 같이 플라즈마 처리시간이 60초를 초과하게 되면 멤브레인의 표면친수화가 과도하게 진행되어 웨스턴 블롯을 행할 경우 멤브레인이 황색으로 변색되는 것을 볼 수 있다.

이것은 웨스턴 버퍼용액내의 물질과 멤브레인과의 상호작용에 의한 것이나 웨스턴을 행하는데 있어 큰 문제는 되지 않는 것으로 사료된다.

또한, 도 8과 9의 결과에서 나타난 바와 같이 플라즈마 처리를 행한 샘플의 경우 메탄올 전처리 과정을 거친 샘플에 비해 단백질 발현이 보다 민감하게 작용하는 것은 메탄올 처리보다 플라즈마 처리가 나노섬유의 표면구조 개질을 보다 균일하고 효과적으로 개질하는 것으로 판단되었다.

특히, 기존 멤브레인에 비해 나노섬유로 구성된 멤브레인이 보다 효과적으로 단백질을 흡착하는 것은, 나노섬유의 경우 제조와 동시에 3차원 열린 세공 구조에 의한 모세관 현상과 거대 비표면적의 결과로 판단되며, 기존 상용화 멤브레인에 비해 도 6에서 나타난 결과와 같이 보다 균일한 세공구조에 기인한 것으로 판단된다.

따라서, 본 발명의 나노섬유 멤브레인을 플라즈마 처리하여 웨스턴 블롯용 멤브레인으로 사용하면 별도의 메탄올 전처리과정이 생략가능하며 친수화되어 백그라운드가 없으면서 감도가 우수하다.

이상에서는 본 발명을 특정의 바람직한 실시예를 예로 들어 도시하고 설명하였으나, 본 발명은 상기한 실시예에 한정되지 아니하며 본 발명의 정신을 벗어나지 않는 범위 내에서 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 다양한 변경과 수정이 가능할 것이다.

본 발명은 웨스턴 블롯용 멤브레인으로 사용가능하며, 단백질 분리, 분석, 검출, 진단 및 다양한 분야에 멤브레인으로 활용가능하다.

Claims

웨스턴 블롯용 멤브레인의 제조방법에 있어서,
소수성 고분자 물질을 용매에 용해하여 방사용액을 제조하는 단계;
상기 방사용액을 방사방법에 의하여 소수성 고분자 나노섬유 웹을 얻는 단계;
상기 얻어진 나노섬유 웹을 라미네이팅하는 단계; 및
상기 라미네이팅된 나노섬유 웹에 친수성을 부여하기 위해 표면개질을 수행하여 웨스턴 블롯용 멤브레인을 얻는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 웨스턴 블롯용 멤브레인의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 소수성 고분자 물질은 PVdF(polyvinylidene fluoride), 나일론(nylon), 니트로셀룰로오스(nitrocellulose), PU(polyurethane), PC(polycarbonate), PS(polystyrene), PLA(polylatic acid), PAN(polyacrylonitrile), PLGA,(polylactic-co-glycolic acid) PEI(polyethyleneimine), PPI(polypropyleneimine), PMMA(Polymethylmethacrylate), PVC(polyvinylcholride), PVAc(polyvinylacetate), 및 폴리스티렌 디비닐벤젠 공중합체(Polystylene divinylbenzene copolymer)로 구성되는 군에서 선택되는 1종 또는 2종 이상을 복합화하여 구성되는 것을 특징으로 한 웨스턴 블롯용 멤브레인의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 용매는 디메틸 포름아미드(di-methylformamide, DMF), 디메틸 아세트아미드(di-methylacetamide, DMAc), THF(tetrahydrofuran), 아세톤(Acetone), 알코올(Alcohol)류, 클로로포름(Chloroform), DMSO(dimethyl sulfoxide), 디클로로메탄(dichloromethane), 초산(acetic acid), 개미산(formic acid), NMP(N-Methylpyrrolidone), 불소계 알콜류, 및 물로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 한 웨스턴 블롯용 멤브레인의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 나노섬유 웹을 형성하는 나노섬유의 직경은 50～1000㎚인 것을 특징으로 하는 웨스턴 블롯용 멤브레인의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 방사방법은 전기방사(electrospinning), 전기분사(electrospray), 전기분사방사(electroblown spinning), 원심전기방사(centrifugal electrospinning), 및 플래쉬 전기방사(flash-electrospinning)로 이루어진 군에서 선택되는 1종인 것을 특징으로 하는 웨스턴 블롯용 멤브레인의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 라미네이팅은 압착, 가압, 캘린더링, 롤링, 열접합, 초음파 접합, 심 실링 테이프법 중에서 선택된 어느 하나의 방법으로 수행되는 것을 특징으로 하는 웨스턴 블롯용 멤브레인의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 방사용액 전체에 대하여 상기 소수성 고분자 물질의 함량은 5～90중량%인 것을 특징으로 하는 웨스턴 블롯용 멤브레인의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 라미네이팅 공정은 60～200℃ 온도범위에서의 열처리를 수반하면서 수행되는 것을 특징으로 하는 웨스턴 블롯용 멤브레인의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 표면 개질은 플라즈마 처리에 의해 수행하는 것을 특징으로 하는 웨스턴 블롯용 멤브레인의 제조방법.
제9항에 있어서,
상기 플라즈마 처리시 사용하는 가스는 산소 또는 아르곤인 것을 특징으로 하는 웨스턴 블롯용 멤브레인의 제조방법.
제9항에 있어서,
상기 플라즈마 처리시간은 30~300초인 것을 특징으로 하는 웨스턴 블롯용 멤브레인의 제조방법.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따라 제조되는 웨스턴 블롯용 멤브레인으로서, 평균 세공경이 0.1～1.0㎛, 멤브레인 두께가 30～200㎛인 것을 특징으로 하는 웨스턴 블롯용 멤브레인.