WO2010067612A1 - 糖化ヘモグロビン含有試料の前処理法 - Google Patents

糖化ヘモグロビン含有試料の前処理法 Download PDF

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宮崎　修
俊祐 藏下
耕平 田久保
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Definitions

  • the present invention relates to a method for accurately measuring glycated hemoglobin, particularly glycated hemoglobin A1c, by immunological means.
  • Glycated hemoglobin in which sugar is bound to hemoglobin in blood, particularly hemoglobin A1c (hereinafter referred to as “HbA1c”) in which the N-terminal valine residue of hemoglobin ⁇ chain has been glycated has been clinically observed in the past 1 to 2 months. It is widely used as an index suitable for the diagnosis of diabetes and the follow-up of diabetes.
  • JP 61-172064 A Japanese Patent Laid-Open No. 01-155268 Japanese Patent Laid-Open No. 03-51759 Japanese Patent Laid-Open No. 06-11510 Japanese Patent Laid-Open No. 2001-33442 JP 2007-163182 A
  • the concentration of the nonionic surfactant used is preferably 0.1% to 5%, particularly preferably 0.2% to 1.5%, from the viewpoint of the effect of exposing the epitope and the reactivity of the antibody.
  • the nonionic surfactant and nitrite may be used alone or in combination, but it is more preferable to use them together in terms of shortening the processing time and improving the quantitativeness.
  • Bis (2-hydroxyethyl) iminotris (hydroxymethyl) methane hereinafter referred to as “Bis-Tris”
  • Bis-Tris Bis (2-hydroxyethyl) iminotris (hydroxymethyl) methane
  • PPES piperazine-N, N′-bis (2-ethanesulfonic acid
  • the pretreatment liquid may be added to the glycated hemoglobin-containing sample solution and stirred.
  • the temperature is preferably 15 ° C. to 50 ° C., more preferably 20 ° C. to 40 ° C.
  • the treatment time is preferably 30 seconds to 30 minutes, and more preferably 1 minute to 5 minutes.
  • the method for sensitizing the latex particles with the anti-HbA1c antibody is not particularly limited, and a known method can be used. Examples thereof include a method of physically adsorbing on the surface of latex particles, a method of covalently bonding to the surface of latex particles having a functional group, and a method of sensitizing by immunological bonding.
  • HbA0 hemoglobin A0
  • HbA1c hemoglobin A0
  • the anti-HbA1c antibody may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody.
  • those described in patent documents Japanese Patent Laid-Open Nos. 61-172064 and 6-66796) can be used.
  • Example 1 Comparison of epitope exposure effect
  • Materials and Methods (1) Preparation of Purified HbA0 and Purified HbA1c Using human erythrocyte hemolysate, described in non-patent literature (Melisenda J. McDonald et al, JBC, 253 (7), 2327-2332, 1978). HbA0 and HbA1c were purified by ion exchange chromatography using Bio-Rex70 (Bio-Rad) and used in the subsequent experiments.
  • OVA ovalbumin
  • Example 3 Materials and Methods (1) Preparation of anti-HbA1c antibody, anti-hemoglobin antibody, and anti-HbA0 antibody The anti-HbA1c antibody, anti-hemoglobin antibody, and anti-HbA0 antibody used for the measurement were the same as in (3) of Example 1. Prepared.

Abstract

　簡便な処理で、かつ保存安定性や環境面で問題がなく、かつ短時間で十分にエピトープ露出化できる、糖化ヘモグロビン含有試料の前処理手段及びこれを用いる糖化ヘモグロビンの免疫学的測定法を提供する。 　糖化ヘモグロビン含有試料を、（Ａ）グアニジン又はその塩と（Ｂ）非イオン性界面活性剤及び／又は亜硝酸塩とを含有する前処理液で処理することを特徴とする糖化ヘモグロビンの免疫学的測定用糖化ヘモグロビン含有試料の前処理法。

Description

糖化ヘモグロビン含有試料の前処理法
　本発明は、糖化ヘモグロビン、特に糖化ヘモグロビンＡ１ｃを免疫学的手段により正確に測定する方法に関する。
　血中のヘモグロビンに糖が結合した糖化ヘモグロビン（グリコヘモグロビン）、特にヘモグロビンβ鎖のＮ末端バリン残基が糖化されたヘモグロビンＡ１ｃ（以下、「ＨｂＡ１ｃ」という）は、臨床的に過去１～２ヶ月の平均血糖値を反映することから、糖尿病の診断や糖尿病の経過観察に適した指標として広く使用されている。
　糖化ヘモグロビンの測定法としては、ＨＰＬＣ法及び免疫学的測定法が知られているが、免疫学的測定法においては、ヘモグロビンの糖化されている部位に特異的な抗体を用いる必要がある。ヘモグロビンβ鎖Ｎ末端の糖化部位は、タンパク質の表面に存在するのではなく内部に埋もれており、抗体が結合し難い場所に存在することが判明している。従って、当該エピトープ部位を認識する抗体を効率良く反応させるために、当該エピトープ部位を表面に露出化させる技術が開発されている（特許文献１）。
　エピトープ露出化手段としては、糖化ヘモグロビン含有試料をグアニジン、チオシアン酸、あるいはチオシアン酸リチウム塩をそれぞれ単独で使用するものや、チオシアン酸とフェリシアニド等の酸化剤の組み合せ、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤等により処理する手段（特許文献１～６）が知られている。
特開昭６１－１７２０６４号公報 特開平０１－１５５２６８号公報 特開平０３－５１７５９号公報 特開平０６－１１５１０号公報 特開２００１－３３４４２号公報 特開２００７－１６３１８２号公報
　しかしながら、従来のエピトープ露出化手段に関しては、例えばグアニジン処理は加熱処理が必要である。チオシアン酸は環境上有害な物質である。フェリシアニド等の酸化剤は着色しやすい等の保存安定性に問題がある。非イオン性界面活性剤単独では効果が十分でない等の問題があった。
　従って、本発明の課題は、簡便な処理で、かつ保存安定性や環境面で問題がなく、かつ短時間で十分にエピトープを露出化できる、糖化ヘモグロビン含有試料の前処理手段及びこれを用いる糖化ヘモグロビンの免疫学的測定法を提供することにある。
　そこで本発明者は、糖化ヘモグロビンの効率的かつ簡便なエピトープ露出化手段について検討したところ、グアニジンと非イオン性界面活性剤及び／又は亜硝酸塩とを含有する溶液で、糖化ヘモグロビン含有試料を処理すれば、グアニジン、非イオン性界面活性剤及び亜硝酸塩をそれぞれ単独で用いた場合に比べて極めて優れたエピトープ露出化効果が得られ、加熱処理を施さなくても短時間で効率良く、糖化された部分が露出化され、糖化ヘモグロビンの正確な免疫学的測定が可能になることを見出し、本発明を完成した。
　すなわち、本発明は、糖化ヘモグロビン含有試料を、（Ａ）グアニジン又はその塩と（Ｂ）非イオン性界面活性剤及び／又は亜硝酸塩とを含有する前処理液で処理することを特徴とする糖化ヘモグロビンの免疫学的測定用糖化ヘモグロビン含有試料の前処理法を提供するものである。
　また、本発明は、（Ａ）グアニジン又はその塩と（Ｂ）非イオン性界面活性剤及び／又は亜硝酸塩とを含有することを特徴とする、糖化ヘモグロビンの免疫学的測定用糖化ヘモグロビン含有試料前処理液を提供するものである。
　さらに本発明は、糖化ヘモグロビン含有試料を、（Ａ）グアニジン又はその塩と（Ｂ）非イオン性界面活性剤及び／又は亜硝酸塩とを含有する前処理液で処理し、次いで抗糖化ヘモグロビン抗体を用いる免疫学的測定することを特徴とする糖化ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの免疫学的測定方法を提供するものである。
　本発明の前処理法によれば、短時間の簡便な処理により、試料中の糖化ヘモグロビン中の糖化部分が効率的に露出化される。従って、当該前処理された試料を用いて抗糖化ヘモグロビン抗体を用いた免疫学的測定すれば、正確に糖化ヘモグロビンが定量可能となる。
競合ＥＬＩＳＡ法にて各試薬のエピトープ露出化効果を比較した結果を示す。 競合ＥＬＩＳＡ法にて本発明試薬のエピトープ露出化効果におけるｐＨの影響を調べた結果を示す。 競合ＥＬＩＳＡ法にて本発明試薬の保存安定性を調べた結果を示す。 本発明試薬を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡによるＨｂＡ１ｃ濃度測定系、及びＨｂＡ０濃度測定系における検量線を示す。 イムノクロマト法によるＨｂＡ１ｃの測定法概略図を示す。
　本発明の糖化ヘモグロビン含有試料は、糖化ヘモグロビン測定用の被検試料であり、例えば血液、赤血球画分等が挙げられる。ここで、糖化ヘモグロビンとしては、ヘモグロビンβ鎖が糖化された糖化ヘモグロビンが好ましく、特にＨｂＡ１ｃが好ましい。
　また、本発明方法により露出化されるエピトープ部位は、ヘモグロビンの糖化された領域であり、例えばヘモグロビンβ鎖の糖化されたＮ末端領域であり、より好ましくはヘモグロビンβ鎖のＮ末端バリンが糖化されたペプチドを含む領域である。
　本発明の前処理に用いられる前処理液には、（Ａ）グアニジン又はその塩と（Ｂ）非イオン性界面活性剤及び／又は亜硝酸塩とが含まれる。本発明によれば、成分（Ａ）と成分（Ｂ）とを併用することにより、成分（Ａ）又は成分（Ｂ）をそれぞれ単独で用いた場合に比べて極めて優れたエピトープ露出化効果が得られる。
　成分（Ａ）のグアニジンとしては、グアニジン自体を用いることもできるが、グアニジン塩を用いるのが、エピトープ露出化効果の点で特に好ましい。グアニジンの塩としては、グアニジン塩酸塩が好ましい。グアニジンの使用濃度は、エピトープ露出化効果、及び抗体の反応性の点から、１ｍｏｌ／Ｌ～６ｍｏｌ／Ｌ、特に２．５ｍｏｌ／Ｌ～３．５ｍｏｌ／Ｌが好ましい。
　成分（Ｂ）の非イオン性界面活性剤としては、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンエーテル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、アルキルグリコシド、アルカノイル－Ｎ－メチルグルカミド、（アルキルカルバモイル）メチル－グルコピラノシド、アルキルグルコピラノシド、デオキシコール酸アミド類、サポニン等が挙げられる。より具体的には、ポリオキシエチレンＣ６－Ｃ２４アルキルエーテル、ポリオキシエチレンＣ６－Ｃ２４アルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンエーテル、ポリオキシエチレンＣ６－Ｃ２４脂肪酸エステル、ショ糖Ｃ６－Ｃ２４脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタンンＣ６－Ｃ２４脂肪酸エステル、Ｃ６－Ｃ２４アルキルグリコシド、Ｃ６－Ｃ２４アルカノイルメチルグルカミド、（Ｃ６－Ｃ２４アルキルカルバモイル）メチル－グルコピラノシド、Ｃ６－Ｃ２４アルキルグルコピラノシド、Ｎ，Ｎ－ビス（３－Ｄ－グルコンアミドプロピル）デオキシコールアミド、サポニンが挙げられる。
　非イオン性界面活性剤の使用濃度は、エピトープ露出化効果の点、及び抗体の反応性の点から、０．１％～５％、特に０．２％～１．５％が好ましい。
　成分（Ｂ）の亜硝酸塩としては、亜硝酸ナトリウム、亜硝酸カリウム等の亜硝酸アルカリ金属塩が挙げられる。
　亜硝酸塩の使用濃度は、エピトープ露出化効果の点、及び抗体の反応性の点から、１ｍｍｏｌ／Ｌ～５０ｍｍｏｌ／Ｌ、特に５ｍｍｏｌ／Ｌ～１５ｍｍｏｌ／Ｌが好ましい。
　非イオン性界面活性剤と亜硝酸塩は、それぞれ単独で使用してもよいし、併用してもよいが、併用するのが処理時間の短縮化、定量性の向上の点からさらに好ましい。
　また、本発明前処理液中の成分（Ａ）と成分（Ｂ）の含有比（質量比）は、エピトープ露出化効果、及び抗体の反応性の点から特に限定されることは無く、上述した各成分の濃度範囲、すなわち、（Ａ）が、１～６ｍｏｌ／Ｌ、（Ｂ）の非イオン性界面活性剤が、０．１～５％、また、（Ｂ）の亜硝酸塩が、１～５０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であればよい。
　本発明の前処理液は、前記成分（Ａ）及び（Ｂ）を含有する水溶液として使用するのが好ましい。またこの水溶液のｐＨは、４．０～９．０、さらに４．５～７．０が好ましい。これらのｐＨに調整するには、適宜緩衝剤を添加してもよい。緩衝剤としては、クエン酸、フタル酸、酢酸、コハク酸、カコジル酸、マレイン酸、イミダゾール、コリジン、リン酸、Ｊｏｈｎｓｏｎ－Ｌｉｎｄｓａｙ等のユニバーサル緩衝剤、２－モルホリノエタンスルホン酸（以下、「ＭＥＳ」という）、ビス（２－ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（以下、「Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ」という）、ピペラジン－Ｎ，Ｎ’－ビス（２－エタンスルホン酸）（以下、「ＰＩＰＥＳ」という）等のグッド緩衝剤が用いられる。
　本発明の前処理液を用いて、糖化ヘモグロビン含有試料を処理するには、糖化ヘモグロビン含有試料溶液に、前処理液を添加し、攪拌すればよい。温度は、１５℃～５０℃、さらに２０℃～４０℃が好ましい。処理時間は３０秒間～３０分間、さらに１分間から５分間が好ましい。
　糖化ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンは、前記処理により、糖化部位が効率良く、露出化される。従って、この処理試料について、抗糖化ヘモグロビン抗体を用いる免疫学的測定をすれば、糖化ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン含有量が正確に定量できる。
　本発明方法における、糖化ヘモグロビンの測定法は、通常の免疫測定法であればいずれも採用できる。ここで免疫測定法としては、サンドイッチＥＬＩＳＡ法、競合ＥＬＩＳＡ法、イムノクロマト法、ラテックス凝集法、競合ラテックス凝集法等が挙げられる。以下、ＨｂＡ１ｃの測定を例として説明する。
　例えば、サンドイッチＥＬＩＳＡ法で測定する場合には、精製したＨｂＡ１ｃを標準品として次のような方法でＨｂＡ１ｃを定量できる。すなわち、抗ＨｂＡ１ｃ抗体を固定化したＥＬＩＳＡプレートに、本発明の前処理液で処理した検体試料を添加し反応させた後、酵素標識した抗ヘモグロビン抗体（以下、「抗Ｈｂ抗体」という）を反応させ、発色後の吸光度の変化から、試料中に存在するＨｂＡ１ｃを特異的に定量できる。
　ラテックス凝集法で測定する場合には、精製したＨｂＡ１ｃを標準品として、次のような方法で定量することができる。すなわち、抗ＨｂＡ１ｃ抗体を不溶性担体であるラテックス粒子に感作し、本発明の前処理液で処理した検体試料、及び抗Ｈｂモノクローナル抗体に接触させることにより、試料中のＨｂＡ１ｃを介して抗体感作ラテックス粒子同士が架橋し凝集を生じるため、この凝集度の変化から当該ＨｂＡ１ｃを特異的に定量できる。
　競合ラテックス凝集法で測定する場合には、精製したＨｂＡ１ｃを標準品として、次のような方法で定量することができる。すなわち、ＨｂＡ１ｃのβ鎖Ｎ末端の糖化ペプチド、例えば糖化６残基ペプチド（ｆ－ＶＨＬＴＰＥ（配列番号１））を不溶性担体であるラテックス粒子に感作し、本発明の前処理液で処理した検体試料、及び抗ＨｂＡ１ｃ抗体を接触させることにより、ｆ－ＶＨＬＴＰＥ感作ラテックス粒子と抗ＨｂＡ１ｃ抗体による凝集反応に対して検体試料中のＨｂＡ１ｃが競合阻害を示すため、この競合阻害の変化から検体試料中のＨｂＡ１ｃを特異的に定量できる。
　ラテックス凝集法等における抗体感作ラテックス粒子のラテックス粒子としては、ラテックス凝集反応を利用した免疫学的凝集反応及び凝集阻止反応において、一般的に用いられている微粒子の担体であれば特に制限されないが、工業的に大量生産することができる有機系微粒子が好ましい。このような有機系微粒子としては、例えば、スチレン、塩化ビニル、アクリロニトリル、酢酸ビニル、アクリル酸エステル、メタクリル酸エステル等のビニル系モノマーの単独重合体又は共重合体；スチレン－ブタジエン共重合体、メチルメタクリレート－ブタジエン共重合体等のブタジエン系共重合体等が挙げられる。また、このような有機系微粒子に、カルボキシル基、第一級アミノ基、カルバモイル基、水酸基、アルデヒド基等の官能基が結合した反応性有機系微粒子も好ましく使用することができる。上記のラテックス粒子の中では、抗原又は抗体の吸着性に優れ、生物学的活性を長期間安定に保持できる点から、ポリスチレン、スチレン－ブタジエン共重合体等のポリスチレン系ラテックス粒子が好ましい。
　ラテックス粒子の形状は特に制限されないが、その平均粒子径は、ラテックス粒子表面の蛋白質と測定対象物質との凝集反応の結果生じる凝集体が肉眼又は光学的に検出できるに充分な大きさが望ましい。好ましい平均粒子径としては０．０２～１．６μｍであり、特に０．０３～０．５μｍが好ましい。
　ラテックス粒子に抗ＨｂＡ１ｃ抗体を感作する方法は、特に制限されず、公知の方法が使用できる。例えば、ラテックス粒子表面に物理的に吸着させる方法、官能基を有するラテックス粒子表面に共有結合させる方法、及び免疫学的結合によって感作する方法などが挙げられる。
　イムノクロマト法で測定する場合には、ヘモグロビンのβ鎖Ｎ末端が修飾されていないヘモグロビンＡ０（以下、「ＨｂＡ０」という）とＨｂＡ１ｃとが同時に測定できるので特に好適である。例えば図５に示す如く、抗ＨｂＡ０抗体及び抗ＨｂＡ１ｃ抗体とをそれぞれ別の部位（Ａライン及びＢライン）に固定化したイムノクロマト支持体を用いる。本発明の前処理液で処理したＨｂＡ１ｃ含有検体をサンプルパッドに滴下する。滴下された試料は、毛細管現象により展開され、Ａラインに到達すると試料中のＨｂＡ０のみが反応し、Ｂラインに到達すると試料中のＨｂＡ１ｃのみが反応する。その他のヘモグロビンは反応せずにエンドパッドまで移動する。Ａライン及びＢラインの色の濃さ、反射強度、又は吸光度等をイムノクロマトリーダーで測定すれば、試料中のＨｂＡ０及びＨｂＡ１ｃがそれぞれ定量できる。ここで、ＨｂＡ０の定量値をＡ、ＨｂＡ１ｃの定量値をＢとすると、ＨｂＡ１ｃ（％）＝（Ｂ／（Ａ＋Ｂ））×１００として、ＨｂＡ１ｃ（％）を求めることも出来る。
　ここで抗ＨｂＡ１ｃ抗体としては、モノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよく、例えば特許文献（特開昭６１－１７２０６４号公報、特開平６－６６７９６号公報）記載のもの等が使用可能である。
　次に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明する。
実施例１（エピトープ露出効果の比較）
（Ｉ）材料と方法
（１）精製ＨｂＡ０及び精製ＨｂＡ１ｃの調製
　ヒト赤血球溶血液を用いて、非特許文献（Ｍｅｌｉｓｅｎｄａ　Ｊ．　ＭｃＤｏｎａｌｄ　ｅｔ　ａｌ、ＪＢＣ、２５３（７）、２３２７－２３３２、１９７８）記載のＢｉｏ－Ｒｅｘ７０（バイオラッド社）を用いたイオン交換クロマトグラフィーにより、ＨｂＡ０及びＨｂＡ１ｃを精製し、以降の実験に用いた。
（２）各種ペプチド、及び糖化ペプチドの調製
　各配列のペプチドは、ペプチド自動合成装置を用いＦｍｏｃ法により合成、及び精製した。各ペプチドの純度は、ＨＰＬＣで９５％以上であることを確認した。また、分子量は、質量分析装置（ＭＡＬＴＩ－ＴＯＦ）にて理論値と同じであることを確認した。糖化ペプチドは、特許文献（特開昭６１－１７２０６４号公報）記載の方法にて合成及び精製した。すなわち、各配列のペプチドとグルコースを無水ピリジン中で反応させて糖化ペプチドを合成し、ＨＰＬＣで精製した。各糖化ペプチドの分子量は、質量分析装置（ＭＡＬＴＩ－ＴＯＦ）で理論値、すなわち各ペプチドの分子量に１６２を加算した分子量と同じであることを確認した。
（３）ペプチド結合タンパク、及び糖化ペプチド結合タンパクの調製
　上記（２）で調製したペプチド又は糖化ペプチドの内、Ｃ末端をシステイン（Ｃ）にして合成したものについて（例えば、ＶＨＬＴＣ（配列番号２）、ｆ－ＶＨＬＴＣ）、次のようにキャリアタンパクに結合させた。すなわち、０．１５ｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ含有２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液ｐＨ７．２（以下、「ＰＢＳ」という）に５ｍｇ／ｍＬの濃度に溶解したペプチド（ＶＨＬＴＣ）、又は糖化ペプチド（ｆ－ＶＨＬＴＣ）を５ｍｇ／ｍＬの濃度で精製水に溶解したマレイミド活性型オブアルブミン（ＯＶＡ）（ＰＩＥＲＣＥ社製）と１対１で混和後、室温で緩やかに回転させながら２時間インキュベートし、ＰＢＳで透析して使用した（ＶＨＬＴＣ－ＯＶＡ、ｆ－ＶＨＬＴＣ－ＯＶＡ）。
（４）抗ヘモグロビン抗体、抗ＨｂＡ１ｃ抗体、及び抗ＨｂＡ０抗体の調製
　抗ヘモグロビン抗体は、上記（１）の精製ＨｂＡ０を免疫原として定法にて作製したマウスモノクローナル抗体を使用した。抗ＨｂＡ１ｃ抗体は、特許文献（特開昭６１－１７２０６４号公報）記載の方法にて作製したマウスモノクローナル抗体を使用した。すなわち、上記（２）で合成した糖化ペプチド（ｆ－ＶＨＬＴＰＥＥＫＹＹＣ（配列番号３））をスカシ貝ヘモシアニン（以下、ＫＬＨという）に結合させ、これを免疫原とした。ハイブリドーマのスクリーニングでは、抗原固相化ＥＬＩＳＡで精製ＨｂＡ１ｃと反応し、且つ精製ＨｂＡ０と反応しない株を選択した。抗ＨｂＡ０抗体は、上記（３）で調製したペプチド結合タンパク（ＶＨＬＴＣ－ＯＶＡ）を免疫原として、定法にて作製したマウスモノクローナル抗体を使用した。この時、ハイブリドーマのスクリーニングでは、抗原固相化ＥＬＩＳＡで精製ＨｂＡ０と反応し、且つ精製ＨｂＡ１ｃと反応しない株を選択した。
　抗ＨｂＡ０抗体については、前記スクリーニングで選択された株についてクローニングを実施し、抗ＨｂＡ０モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを独立行政法人産業技術総合研究所（２００８年１１月２８日付け、日本国茨城県つくば市東一丁目１番地１中央第６）に寄託した。寄託番号は以下のとおりである。
　抗体番号：８５２０１
　受託番号：ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１１８７
（５）検体処理方法
　ヒト赤血球を１：５０の比率で各処理液と混和し、２５℃で１０分間処理した。その後、その混合液を１％ＢＳＡ－０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０－ＰＢＳ（以下、「１％ＢＳＡ－ＰＢＳＴ」という）で４倍（ＨｂＡ１ｃ濃度：６４μｇ／ｍＬ）、４０倍（ＨｂＡ１ｃ濃度：６．４μｇ／ｍＬ）、又は４００倍（ＨｂＡ１ｃ濃度：０．６４μｇ／ｍＬ）の各濃度に希釈し、後述する競合ＥＬＩＳＡに供した。
（６）競合ＥＬＩＳＡ
　ａ．上記（３）で調製したｆ－ＶＨＬＴＣ－ＯＶＡをＰＢＳで１μｇ／ｍＬの濃度に希釈後、５０μＬ／ｗｅｌｌずつ９６穴プレートに分注し、４℃で一晩静置した。
　ｂ．０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０－ＰＢＳ（以下、「ＰＢＳＴ」という）４００μＬ／ｗｅｌｌで３回洗浄後、ブロッキング液（１％ＢＳＡ－ＰＢＳＴ）を１００μＬ／ｗｅｌｌずつ分注し、室温で１時間静置した。
　ｃ．ＰＢＳＴで３回洗浄後、上記（５）で調製した検体液を２５μＬ／ｗｅｌｌずつ分注した。
　ｄ．続いて、１％ＢＳＡ－ＰＢＳＴで０．５μｇ／ｍＬに希釈した抗ＨｂＡ１ｃ抗体を２５μＬ／ｗｅｌｌずつ分注し、室温で１時間静置した。
　ｅ．ＰＢＳＴで３回洗浄後、ＨＲＰ－ＧｔＦ（ａｂ’）２－Ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ　Ｉｇ’ｓ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ社製）を１％ＢＳＡ－ＰＢＳＴで５０００倍希釈した溶液を５０μＬ／ｗｅｌｌずつ分注し、室温で１時間静置した。
　ｆ．ＰＢＳＴで３回洗浄後、オルトフェニレンジアミン塩酸塩を含む発色液（オルトフェニレンジアミン塩酸塩（東京化成社製）を２ｍｇ／ｍＬ、過酸化水素を０．０２％の濃度でｐＨ５．０のクエン酸緩衝液に溶解（以下、「ＯＰＤ発色液」という）を分注し（５０μＬ／ｗｅｌｌ）、室温で１０分間静置した。
　ｇ．０．７５ｍｏｌ／Ｌ硫酸を５０μＬ／ｗｅｌｌずつ分注して反応を停止した後、プレートリーダーで４９２ｎｍの吸光度を測定した。
（７）阻害率の算出
　上記（６）で得られた吸光度から、下記の式にて阻害率を算出し、各試薬のエピトープ露出化効果の指標とした。
　阻害率（％）＝［（Ａ－Ｂ）／Ａ］×１００
　　　　　　Ａ：検体ブランクの吸光度
　　　　　　Ｂ：検体添加時の吸光度
（ＩＩ）結果
（１）各試薬の露出効果の比較
　前処理液として、３ｍｏｌ／Ｌ－グアニジン塩酸塩、１％ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ２０）、１０ｍｍｏｌ／Ｌ－亜硝酸ナトリウムの各水溶液、６ｍｏｌ／Ｌ－グアニジン塩酸塩と２％ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートの１対１の混合液（グアニジン＋ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート）、６ｍｏｌ／Ｌ－グアニジン塩酸塩と２０ｍｍｏｌ／Ｌ－亜硝酸ナトリウムの１対１の混合液（グアニジン＋ＮａＮＯ２）、２％ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートと２０ｍｍｏｌ／Ｌ－亜硝酸ナトリウムの１対１の混合液（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート＋ＮａＮＯ２）、及び５ｍｍｏｌ／Ｌ－ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）を用い、上記（Ｉ）の（５）のように検体を処理後、競合ＥＬＩＳＡで露出化効果を比較した。その結果、図１に示すように、グアニジン＋ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、及びグアニジン＋ＮａＮＯ２はグアニジン単独よりも著しく露出化効果が高いことが判明した。一方、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、亜硝酸ナトリウム、及びＭＥＳ緩衝液単独、及びポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート＋ＮａＮＯ２は露出効果がほとんどなかった。このことから、グアニジン塩酸塩水溶液にポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート又は亜硝酸ナトリウムを添加することにより、エピトープ露出効果が著しく高くなることが示唆された。
（２）界面活性剤の種類
　前処理液として、３ｍｏｌ／Ｌ－グアニジン塩酸塩水溶液に終濃度１％、０．５％、又は０．２５％で各種非イオン性界面活性剤を添加した試薬を用い検体を処理後、競合ＥＬＩＳＡで各試薬のエピトープ露出化効果を比較した。その結果、表１に示すように、グアニジン塩酸塩単独の試薬に比べ、各界面活性剤を添加した試薬は著しくエピトープ露出化効果が高いことが判明した。このことから、グアニジン塩酸塩水溶液に非イオン性界面活性剤を添加することにより、エピトープ露出効果が高くなることが示唆された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
（３）ｐＨの影響
　前処理液として、終濃度で３ｍｏｌ／Ｌのグアニジン塩酸塩及び１％のポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ２０）を含む各ｐＨの緩衝液（ｐＨ４．５、ｐＨ５．５：クエン酸－ＮａＨＰＯ４、ｐＨ６．０、ｐＨ７．０：ＫＨ２ＰＯ４－Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．５、ｐＨ８．０、ｐＨ９．０：Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、それぞれ、２０ｍｍｏｌ／Ｌ）を用い検体を処理後、競合ＥＬＩＳＡで各試薬のエピトープ露出化効果を比較した。その結果、図２に示すように、ｐＨ４．５～ｐＨ７、特にｐＨ４．５～ｐＨ６の酸性領域でエピトープ露出化効果が高いことが判明した。
（４）処理時間１分間での比較
　検体処理時間を１０分間から１分間に変えて各試薬のエピトープ露出化効果を比較した。前処理液として、５ｍｍｏｌ／Ｌ－ＭＥＳ（ｐＨ６．０）、及び該緩衝液に次の各試薬、すなわち、３ｍｏｌ／Ｌ－グアニジン塩酸塩、１０ｍｍｏｌ／Ｌ－亜硝酸ナトリウム、１％ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ２０）、３ｍｏｌ／Ｌ－グアニジン塩酸塩－１％ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（グアニジン＋ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート）、３ｍｏｌ／Ｌ－グアニジン塩酸塩－１０ｍｍｏｌ／Ｌ－亜硝酸ナトリウム（グアニジン＋ＮａＮＯ２）、１０ｍｍｏｌ／Ｌ－亜硝酸ナトリウム－１％ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート＋ＮａＮＯ２）、又は、３ｍｏｌ／Ｌ－グアニジン塩酸塩－１０ｍｍｏｌ／Ｌ－亜硝酸ナトリウム－１％ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（グアニジン＋ＮａＮＯ２＋ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート）を添加した試薬を用いた。赤血球１容に対し各前処理液５０容の割合で混和後、２５℃で１分間処理し、その後上記（Ｉ）の（５）と同様に検体を１％ＢＳＡ－ＰＢＳＴで希釈し、競合ＥＬＩＳＡで露出化効果を比較した。その結果、表２に示すように、グアニジン＋ＮａＮＯ２＋ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートを添加した試薬が、最も露出効果の高いことが判明した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
実施例２（試薬の安定性）
（Ｉ）材料と方法
　本発明の前処理液の保存安定性を検討するため、前処理液（１％ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ２０）－１０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＮＯ2－３ｍｏｌ／Ｌ　グアニジン塩酸塩－５ｍｍｏｌ／Ｌ ＭＥＳ緩衝液、ｐＨ６．０を４℃、又は３７℃で８日間放置後、実施例１と同様にエピトープ露出効果を調べ、当日調製の同一処方試薬のエピトープ露出効果と比較した。
（ＩＩ）結果
　その結果、図３に示すように、エピトープ露出効果は、３７℃で８日間放置した試薬でも当日調製の試薬と同等であった。このことから、本発明のエピトープ露出試薬は、保存安定性が良好であることが確認された。
実施例３（実用性の確認）
（Ｉ）材料と方法
（１）抗ＨｂＡ１ｃ抗体、抗ヘモグロビン抗体、及び抗ＨｂＡ０抗体の調製
　測定に用いた抗ＨｂＡ１ｃ抗体、抗ヘモグロビン抗体、及び抗ＨｂＡ０抗体は、実施例１の（３）と同様に調製した。
（２）ビオチン標識抗ヘモグロビン抗体の調製
　上記（１）の抗ヘモグロビン抗体を市販のビオチン標識試薬（ＰＩＥＲＣＥ社、ＥＺ－Ｌｉｎｋ　Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ－ＬＣ－Ｂｉｏｔｉｎ）を用い、次のように標識した。１０ｍｇ／ｍＬの濃度でＰＢＳに溶解したビオチン標識試薬０．０５ｍＬを１ｍｇ／ｍＬの濃度の抗ヘモグロビン抗体液１ｍＬに添加し、室温で２時間反応させた。反応後、ＰＢＳで透析し測定に使用した。
（３）検体及び標準試料の調製
　社内ボランティアよりＥＤＴＡ－２Ｎａ入りの真空採血管（積水メディカル社製）に採血し、遠心分離により赤血球を分離した。この赤血球４μＬと本発明の前処理液（１％ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ２０）－１０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＮＯ２－３ｍｏｌ／Ｌ　グアニジン塩酸塩－５ｍｍｏｌ／Ｌ　ＭＥＳ緩衝液、ｐＨ６．０）２００μＬを混和した。２５℃で１０分間放置後、その混合液を３％スキムミルク－ＰＢＳＴで段階希釈し、下記サンドイッチＥＬＩＳＡの検体として使用した。尚、標準試料は、下記ＨＰＬＣ法により予めＨｂＡ１ｃ濃度及びＨｂＡ０濃度を求めておいた別人の検体を用いた。
（４）サンドイッチＥＬＩＳＡによるＨｂＡ０濃度の測定
　ａ．抗ＨｂＡ０抗体をＰＢＳで５μｇ／ｍＬの濃度に希釈した。これをＥＬＩＳＡプレートに５０μＬ／ｗｅｌｌずつ分注し、４℃で一晩静置した。
　ｂ．ＰＢＳＴ（３５０μＬ／ｗｅｌｌ）で３回洗浄後、１％ＢＳＡ－ＰＢＳＴを１００μＬ／ｗｅｌｌずつ分注し、室温で１時間静置した。
　ｃ．ＰＢＳＴで３回洗浄後、上記（３）で処理した標準試料又は検体を５０μＬ／ｗｅｌｌずつ分注し、室温で１時間静置した。
　ｄ．ＰＢＳＴで３回洗浄後、１％ＢＳＡ－ＰＢＳＴで１μｇ／ｍＬの濃度に希釈したビオチン標識抗ヘモグロビン抗体を５０μＬ／ｗｅｌｌずつ分注し、室温で１時間静置した。
　ｅ．ＰＢＳＴで３回洗浄後、１％ＢＳＡ－ＰＢＳＴで１μｇ／ｍＬの濃度に希釈したＨＲＰ－Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を５０μＬ／ｗｅｌｌずつ分注し、室温で３０分間静置した。
　ｆ．ＰＢＳＴで３回洗浄後、ＯＰＤ発色液を分注し（５０μＬ／ｗｅｌｌ）、室温で１０分間静置した。
　ｇ．０．７５ｍｏｌ／Ｌ硫酸を５０μＬ／ｗｅｌｌずつ分注して反応を停止した後、プレートリーダーで４９２ｎｍの吸光度を測定した。
　ｈ．各濃度の標準試料の吸光度をもとに検量線を作成し、それを用い検体の濃度を求めた。
（５）サンドイッチＥＬＩＳＡによるＨｂＡ１ｃ濃度の測定
　上記（４）と同様の方法で、抗ＨｂＡ０抗体の代わりに抗ＨｂＡ１ｃ抗体を用いＨｂＡ１ｃ濃度を測定した。
（６）ＨｂＡ１ｃ値の算出
　上記（４）及び（５）で求めたＨｂＡ０濃度及びＨｂＡ１ｃ濃度をもとに下記計算式よりＨｂＡ１ｃ値（ＨｂＡ１ｃの含有率）を求めた。
　＜計算式＞
　ＨｂＡ１ｃ含有率（％）＝ＨｂＡ１ｃ量（濃度）／（ＨｂＡ１ｃ量（濃度）＋ＨｂＡ０量（濃度））×１００
（７）ＨＰＬＣ法によるＨｂＡ１ｃ値の測定
　東ソー自動グリコヘモグロビン分析計ＨＬＣ－７２３Ｇ８を用い、全ヘモグロビン中のＨｂＡ１ｃの割合を測定した。
（ＩＩ）結果
（１）検量線
　標準試料を用い、ＨｂＡ０濃度測定系、及びＨｂＡ１ｃ濃度測定系の検量線を作成した。図４に示すように、両測定系ともに各抗原濃度依存的に吸光度の上昇が確認された。
（２）ＨＰＬＣ法による測定値との比較
　本発明の前処理液を用い上記サンドイッチＥＬＩＳＡで求めたＨｂＡ１ｃ値とＨＰＬＣ法で求めたＨｂＡ１ｃ値を比較した。健常者５名より採取した検体を両方法でそれぞれＨｂＡ１ｃ値を求めた。その結果、表３に示すように、両方法で求めたＨｂＡ１ｃ値は概ね同じような値を示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　以上の結果から、本発明の前処理液がＨｂＡ０濃度、ＨｂＡ１ｃ濃度、及びＨｂＡ１ｃ値（ＨｂＡ１ｃの割合）の定量測定に使用できることが確認された。

Claims (6)

  1. 　糖化ヘモグロビン含有試料を、（Ａ）グアニジン又はその塩と（Ｂ）非イオン性界面活性剤及び／又は亜硝酸塩とを含有する前処理液で処理することを特徴とする糖化ヘモグロビンの免疫学的測定用糖化ヘモグロビン含有試料の前処理法。
  2. 　グアニジン又はその塩の使用濃度が１～６ｍｏｌ／Ｌ、非イオン性界面活性剤の使用濃度が０．１～５％、亜硝酸塩の使用濃度が１～５０ｍｍｏｌ／Ｌである請求項１記載の前処理法。
  3. 　（Ａ）グアニジン又はその塩と（Ｂ）非イオン性界面活性剤及び／又は亜硝酸塩とを含有することを特徴とする、糖化ヘモグロビンの免疫学的測定用糖化ヘモグロビン含有試料前処理液。
  4. 　グアニジン又はその塩の使用濃度が１～６ｍｏｌ／Ｌ、非イオン性界面活性剤の使用濃度が０．１～５％、亜硝酸塩の使用濃度が１～５０ｍｍｏｌ／Ｌである請求項３記載の前処理液。
  5. 　糖化ヘモグロビン含有試料を、（Ａ）グアニジン又はその塩と（Ｂ）非イオン性界面活性剤及び／又は亜硝酸塩とを含有する前処理液で処理し、次いで抗糖化ヘモグロビン抗体を用いる免疫学的測定することを特徴とする糖化ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの免疫学的測定方法。
  6. 　グアニジン又はその塩の使用濃度が１～６ｍｏｌ／Ｌ、非イオン性界面活性剤の使用濃度が０．１～５％、亜硝酸塩の使用濃度が１～５０ｍｍｏｌ／Ｌである請求項５記載の測定方法。
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