WO2009116659A1 - 抗グリピカン３抗体を用いる肝癌細胞の検出法 - Google Patents

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WO2009116659A1
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antibody
cells
glypican
score
complex
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片岡寛章
高居宏武
加藤淳彦
鈴木雅実
杉本正道
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国立大学法人宮崎大学
中外製薬株式会社
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57438—Specifically defined cancers of liver, pancreas or kidney
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/303—Liver or Pancreas
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies

Definitions

  • the present invention relates to an in vitro oral immunoassay method for detecting the presence of liver cancer cells in a subject.
  • glypican 3 is frequently expressed in liver cancer
  • analysis of the expression profile of glibican 3 in liver cancer is useful for identifying the function of glypican 3 in liver cancer, treating or diagnosing liver cancer, and predicting the prognosis of liver cancer. It is considered to be deaf.
  • immunohistochemistry especially the enzyme antibody method, is widely used for pathological diagnosis.
  • Immunohistochemistry is a highly sensitive and specific method for detecting the presence and distribution of substances (antigens) in living bodies using biological reagents such as antibodies and enzymes.
  • the characteristics of immunohistochemistry are as follows: 1. It is convenient in terms of technique, 2. It can be applied to morphological information, and it can be applied to a wide range of applications.
  • immunohistochemical staining has the advantage that it can be used for targeted pathological diagnosis and morphological observation using a wide range of specimens such as fresh frozen sections, cytological specimens, or paraffin sections of fixed tissues.
  • immunostaining by the enzyme antibody method can be applied to formalin-fixed paraffin-embedded tissues that are used for normal pathological diagnosis, and therefore has a very wide range of applications.
  • artifacts artificial artifacts
  • staining not only fails, but sometimes antigen changes due to formalin fixation and embedding, and antibody
  • false positives and false negatives occur. These false positives and false negatives can result in misinterpretation of staining results.
  • Formalin fixation which is used for normal histological searches, is useful for maintaining morphology, but is not an ideal fixative in terms of maintaining binding to antibodies. Therefore, in addition to formalin, alcohol or the like may be used as a fixing solution. However, an immobilization method that has excellent shape retention and can preserve the binding properties of all antigens to antibodies has not yet been established. Therefore, formalin immobilization is a practical immobilization method that is widely used, although there is a problem in maintaining the binding property with the antibody.
  • HIER method heat-induced antigen retrieval
  • the antigen when heated using a microwave or boiling clave, the antigen is hydrolyzed by high-temperature treatment, so that the epitope can bind to the antibody.
  • Glypican 3 liver cancer Until now, the expression in the can also be detected by the HIER method (Non-patent Documents 1 to 5 and Patent Document 1).
  • anti-glibican 3 antibody shows cross-reactivity with epithelial cells of blood vessels and hepatic sinusoids, a blocking reaction with a protein lysate from normal hepatocytes is preliminarily excluded to eliminate such cross-linking.
  • Non-patent document 4 Complicated treatment is required (Non-patent document 4), and it is observed that Daribican 3 originally expressed on the cell membrane is expressed in cytoplasm (Non-patent document 2).
  • the HIER method could not accurately detect the expression of glypican 3 in liver cancer tissue, and development of an accurate detection method for the expression instead of the conventional HIER method was required.
  • Non-Patent Document 1 CapurroM, Wanless IR, Sherman M, Deboer G, Shi W, Miyoshi E, Filmus J., (2003) Gastroenterology 125 (1), 89-97
  • Non-Patent Document 2 Yamauchi N, Watanabe A, Hishinuma M, Ohashi K, Midorikawa Y, Morishi ta Y, Niki T, Shibahara J, Mori M, Makuuchi M, Hippo Y, Kodaraa T, Iwanar i H, Aburatani H, Fukayama M., (2005) Mod Pathol 18 (12), 1591-8
  • Non-Patent Document 3 Libbrecht L, Severi T, Cassiman D, Vender Borght S, Pirenne J, Nevens F, Verslype C, van Pelt J, Roskams T., (2006) Am J Surg Pathol 30 (11), 1405- 11
  • Non-Patent Document 4 Grozdanov PN, Yovchev MI, Dabeva MD., (2006) Lab Invest 86 (12), 1272-84
  • Non-Patent Document 5 Llovet, J: M., Chen, Y., Wurmbach, E., Roayaie, S., Fiel, MI, Schwartz, M., Thung, SN, Khitrov, G., Zhang, W. , Villanueva, A., Battiston,, Mazzaferro, V., Bruix, J., Waxman, S., Friedman, SL, (2006) Gastroenterology 131 (6), 1758-1767
  • the present invention has been made in view of such circumstances, and an object of the present invention is to provide a method that makes it possible to accurately detect the mode of expression of darpican 3 in liver cancer tissue.
  • An in vitro immunoassay method for detecting the presence of liver cancer cells in a subject comprising:
  • the anti-glibican 3 antibody is administered to the preparation under conditions suitable for the formation of a complex of glypican 3 and anti-glibican 3 antibody present in the treated tissue preparation (c). Touched,
  • a method comprising the steps of:
  • the C-terminal polypeptide of Glybican 3 is a polypeptide consisting of the 359th amino acid to the 580th amino acid described in SEQ ID NO: 1 or a polypeptide consisting of the 375th amino acid to the 580th amino acid [6 ] The method described in;
  • step (e) The method according to any one of [1] to [5], wherein the anti-glibican 3 antibody is a 1G12 antibody; [10] The method according to any one of [1] to [9], wherein in step (e), the presence of the complex is detected by quantification;
  • IR Cp is the expression score of glypican 3
  • PR is a numerical value obtained by squaring the proportion of cells in which the complex is detected under a microscope.
  • SI-C p is a staining intensity at which the complex is detected in the cytoplasm of cells in the field under a microscope.
  • SP is the numerical value of the percentage of cells showing complete membrane staining in the cell membrane of cells in the field of view under the microscope]
  • IR Cm is the membrane localization score of glypican 3
  • PR is a numerical value obtained by scoring the proportion of cells in which the complex is detected under a microscope.
  • SI-I Cm is a numerical value obtained by scoring the staining intensity at which the complex is detected in the cell membrane of cells in the visual field under a microscope.
  • SP is a numerical value obtained by scoring the percentage of cells that show complete membrane staining in the cell membrane of the cells in the field of view under the microscope]
  • a method for determining the dose of an anticancer drug containing anti-glypican 3 antibody in treating liver cancer to a subject based on the score calculated by the method described in [11] and [12]. is there.
  • FIG. 1 is a diagram showing each grade of S I score.
  • FIG. 2 is a diagram showing each grade of SP score.
  • FIG. 3 is a diagram showing the staining results of specimens of HuH-7 and He p G 2 cell transplantation models.
  • FIG. 4 is a diagram showing the staining result of a preparation prepared from a clinical specimen of human liver cancer.
  • FIG. 5A is a graph showing the antitumor effect of hGC33 antibody in a mouse model transplanted with human liver cancer.
  • FIG. 5B is a graph showing the antitumor effect of hGC33 antibody in a mouse model transplanted with human liver cancer.
  • FIG. 5 C is a diagram showing the antitumor effect of hGC33 antibody in a mouse model transplanted with human liver cancer.
  • FIG. 5D is a graph showing the antitumor effect of hGC33 antibody in a mouse model transplanted with human liver cancer.
  • tissue preparation refers to any biological sign obtained from an individual, body fluid (eg, blood, serum, plasma, and cerebrospinal fluid), tissue culture or tissue section, etc. Refers to goods.
  • a subject sample is preferably used as a biological sample.
  • a preferred subject preparation is a tissue obtained from the subject, more preferably a liver tissue of the subject.
  • a biopsy which is a known method is preferably used. Liver biopsy is a method in which a thin, long needle is inserted into the liver directly from the surface of the skin and the liver tissue is collected. Usually, the area where the needle is punctured is the space between the right lower chest.
  • the puncture site is sterilized after the safety of the puncture site is confirmed using an ultrasonography device before surgery. Furthermore, from the skin to the surface of the liver is the target of anesthesia, and the puncture needle is punctured after the skin at the puncture site is made a small incision.
  • the tissue specimen is observed with the transmitted light under the microscope, the tissue specimen is sliced to such an extent that it sufficiently transmits the light used for the microscope.
  • the tissue preparation is fixed as a pre-stage of slicing. In other words, dehydration and denaturation of tissue and cell proteins causes the cells that make up the tissue to quickly die, and the structure is stabilized and insolubilized.
  • the tissue specimen to be fixed is cut with a knife such as a scalpel as a fragment of a size and shape suitable for making a paraffin-embedded section.
  • the fragment is then immersed in a fixative, which is a reagent used to perform fixation.
  • formalin more preferably neutral buffered formalin is preferably used.
  • the concentration of neutral shock formalin is appropriately selected according to the characteristics or physical properties of the tissue preparation.
  • the concentration may be appropriately changed between 1 to 50%, preferably 5 to 25%, more preferably 10 to 15%.
  • the fixative in which the tissue preparation is immersed is appropriately deaerated using a vacuum pump. Fixation is performed by leaving the tissue specimen in the fixative solution for several hours under normal pressure and room temperature.
  • the time required for fixation can be appropriately selected within the range of 1 hour to 7 days, preferably 2 hours to 3 days, preferably 3 hours to 24 hours, and more preferably 4 hours to 16 hours.
  • a section can be suitably prepared from the tissue preparation to which the fixation has been applied using the frozen section method or the paraffin section method.
  • a suitable example of the frozen section method is 0. T. co immediate ound (Miles.
  • tissue preparation is frozen in a slice using a cryostat (frozen section preparation device).
  • a uniform and appropriate hardness is imparted by immersing a tissue preparation to which fixation is applied in an embedding medium and hardening it.
  • Paraffin can be suitably used as the embedding agent.
  • Tissue preparations to which fixation has been applied are dehydrated using ethanol. Specifically, the tissue preparation is dehydrated by being sequentially immersed in 70% ethanol, 80% ethanol, and 100% ethanol. The time and number of times required for immersion can be appropriately selected within the range of 1 hour to several days and 1 to 3 times.
  • the tissue preparation is then embedded in paraffin after the liquid phase has been replaced with xylene.
  • the time required for substituting the liquid phase with xylene can be appropriately selected within the range of 1 hour to several hours. At that time, it can be substituted at room temperature, or it can be substituted at 4. However, when it is substituted at 4, it is preferable that the substitution time is long, such as overnight.
  • the time and number of times required for embedding in paraffin can be appropriately selected within the range of 1 to several hours and 1 to 4 times. At that time, it can be embedded at room temperature, or it can be embedded at 4.
  • the embedding time is longer, such as overnight.
  • the tissue preparation can be suitably embedded in paraffin.
  • a “block” is created by adhering a tissue preparation embedded in paraffin to a rootstock as described above, and this block is selected from a thickness of 1 to 20 xm by a micro Im.
  • Sliced to a thickness of The sliced tissue sections are fixed by being placed on a slide glass as a permeable support.
  • a slide glass prepared by applying 0.01% poly-1 ⁇ -lysine (Sigma) to a slide glass and drying it in order to prevent the tissue section from peeling off can also be suitably used.
  • the fixed tissue sections are air-dried for an appropriate time selected between a few minutes and an hour.
  • tissue preparations prepared as described above and mounted on a permeable support. It is desirable that this tissue preparation is two tissue preparations that can be regarded as organizationally. “Can be equated” means that the two tissue preparations to be compared are composed of approximately the same cells or tissues in the subject preparation from which the tissue preparation is derived. For example, two tissue preparations prepared as adjacent sections are two tissue preparations that can be viewed. In the present invention, unless otherwise specified, “two things that can be equated” ⁇ Tissue preparation '' refers to two tissue preparations prepared as adjacent sections, but in addition, the structure of the cells or tissues constituting the two tissue preparations is not prepared as adjacent sections.
  • the reactivity of an antigen whose reactivity with an antibody is attenuated by formalin fixation is activated.
  • the protease antigen activation method PIER method
  • HIER heat-induced antigen activation method
  • a heating method using a microphone mouth wave, a heating method using a heat clave, a heating method using a boiling treatment, or the like is appropriately used.
  • the time required for activation of the treatment is appropriately selected from 5 minutes to 60 minutes, for example, 10 minutes.
  • the antigen activation treatment can be performed in a commercially available Target Retrieval Solution (DakoCytomat ion) or the like in addition to 1 OmM sodium citrate buffer. In the following examples, Target Retrieval Solution is used.
  • the antigen-antibody complex described later can be detected.
  • Deviation buffers and aqueous solutions are also preferably used.
  • protease used in the protease antigen activation method is not particularly limited, and generally available proteases can be appropriately selected and used.
  • proteases 0. 01N hydrochloric acid in 0.05% concentration of Bae trypsin or,, pH 7.
  • Tr IS buffer 0.01% concentration of 6 C a C 1 2 0 further comprising containing Protease K at a concentration of 1 to 50 / g / ml in 1 OmM Tris HCl buffer at pH 7.8 containing 1% trypsin, 1 OmM EDTA and 0.5% SDS is suitable.
  • Protea Ichize 0. 01N hydrochloric acid in 0.05% concentration of Bae trypsin or,, pH 7.
  • Tr IS buffer 0.01% concentration of 6 C a C 1 2 0 further comprising containing Protease K at a concentration of 1 to 50 / g / ml in 1 OmM Tris HCl buffer at pH 7.8 containing 1% trypsin, 1 OmM EDTA and
  • the pH of the reaction solution is appropriately selected between 6.5 and 9.5, and SH reagent, trypsin inhibitor and chymotrypsin inhibitor can also be used as appropriate.
  • the histofine HER2 kit (M The protease attached to 0N0) (Nichirei Bioscience) is also a specific example of such a suitable protease.
  • Proteaase antigen activation is usually carried out at 37.
  • the reaction temperature can be appropriately changed within the range of 25 to 50.
  • the reaction time is appropriately selected, for example, between 1 minute and 5 hours, for example, 15 minutes, 30 minutes, 45 minutes, 1 hour, 2 hours, 3 Hours, 4 hours, etc.
  • the tissue preparation subjected to the process is washed with a washing buffer.
  • a washing buffer PBS (Phosphate buffer saline) is preferably used, and Tris hydrochloric acid buffer can also be suitably used.
  • the washing condition is a method in which washing is carried out 3 times for 5 minutes at room temperature, but the washing time and temperature can be appropriately changed.
  • anti-glibican 3 antibody used in the method of the present invention any antibody can be suitably used as long as it has an activity of binding to glibican 3.
  • particularly suitable antibodies are the GC 33 antibody (Patent Document 2) and the 1 G12 antibody (Patent Document 1) disclosed in the following Examples.
  • anti-glypican 3 antibodies suitably used in the present invention can be obtained by immunizing non-human animals using glypican 3 as an immunizing antigen.
  • Patent Documents 1 and 2 describe methods for producing such anti-glypican 3 antibodies, and those skilled in the art can appropriately obtain a desired anti-glybican 3 body based on the method.
  • EL I SA enzyme-linked immunosorbent assay
  • E I A enzyme immunoassay
  • R I A radioimmunoassay
  • fluorescent immunoassay can be used. These methods are described in the general teaching book “Antibodies A Laboratory Manual. Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988”.
  • EL ISA format the binding activity of antibodies to cells is quantitatively evaluated by comparing signal levels generated by enzymatic reactions.
  • a test antibody is added to an ELISA plate on which cells forcibly expressing an antigen are immobilized, and an antibody bound to the cell is detected using an enzyme-labeled antibody that recognizes the test antibody.
  • FACS fluorescence activated cell sorting
  • FACS format By using FACS format, it is possible to measure the binding between an antigen that is not bound to a carrier such as an ELISA plate and is expressed on the surface of a cell suspended in a buffer or the like and an antibody against the antigen.
  • flow cytometry used for such measurements include FACSCanto TM II, FACSAria TM, FACSArray TM, FACSVantage TM SE, FACSCalibur TM (hereafter BD Biosciences), EPICS ALTRA HyPerSort, Cytomics FC 500, EPICS XL-MCL ADC, EPICSXL ADC, Cell Lab Quanta I Cell Lab Quanta SC (above, Beckman Coulter).
  • An example of a suitable method for measuring the binding activity of the anti-glibican 3 antibody to the antigen is a method using a secondary antibody that recognizes a test antibody reacted with a cell expressing glycobican 3.
  • Cells expressing glypican 3 are reacted with the test antibody, stained with FITC-labeled secondary antibody, measured by FACSCalibur (BD), and the fluorescence intensity is analyzed using CELL QUEST Software (BD).
  • FACSCalibur FACSCalibur
  • CELL QUEST Software CELL QUEST Software
  • the binding activity of the antibody to the antigen can be determined by comparing with the control Geo-Mean value when using.
  • the calculation formula for obtaining the Geo-Mean value (Geometric Mean) is described in CELL QUEST Software User's Guide (BD biosciences).
  • Anti-glibican 3 antibody is reacted as a primary antibody to a tissue preparation that has been subjected to antigen activation treatment by the heat-induced antigen activation method and a tissue preparation that has been subjected to antigen activation treatment by the antigen activation method. .
  • the reaction is carried out under conditions suitable for the anti-glibican 3 antibody to recognize an epitope in the antigen to form an antigen-antibody complex.
  • the reaction is usually performed overnight at 4 or 1 hour at 37, but the reaction conditions are appropriate for the body to recognize the epitope in the antigen and form an antigen-antibody complex.
  • the range can be changed as appropriate.
  • the reaction temperature can vary from 4 to 50 and the reaction time can vary from 1 minute to 7 days.
  • the tissue preparation is washed with a washing buffer.
  • a washing buffer PBS (Phosphate buffer saline) is preferably used, and Tris buffer buffer can also be suitably used.
  • PBS Phosphate buffer saline
  • Tris buffer buffer can also be suitably used.
  • a method of performing washing for 5 minutes at room temperature three times is adopted as washing conditions, but the washing time and temperature can be changed as appropriate.
  • a secondary antibody that recognizes the primary antibody is reacted with the tissue preparation subjected to the primary antibody reaction.
  • a secondary antibody previously labeled with a labeling substance for visualizing the secondary antibody is used.
  • Labeling substances include FITC (fluorescein isothiocyanate), fluorescent dyes such as Cy2 (Amersham), A1 exa 488 (Molecular Probe), enzymes such as peroxidase or alkaline phosphatase, or colloidal gold Etc. are preferable.
  • the reaction with the secondary antibody is carried out under conditions suitable for the formation of an antigen-antibody complex between the anti-glibican 3 antibody and the secondary antibody recognizing the anti-glibican 3 antibody.
  • the reaction is carried out at room temperature or 37 ° C for 30 minutes to 1 hour, but can be appropriately changed within a suitable range for the anti-glibican 3 antibody and the secondary antibody to form an antigen-antibody complex.
  • the reaction temperature can vary from 4 to 50 and the reaction time can vary from 1 minute to 7 days. When the reaction at a low temperature is carried out, it is preferable to carry out the reaction for a long time.
  • the tissue preparation is washed with a washing buffer.
  • washing buffer PBS (Phosphate buffer saline) is suitably used, and Tris hydrochloric acid buffer can also be suitably used.
  • PBS Phosphate buffer saline
  • Tris hydrochloric acid buffer can also be suitably used.
  • a cleaning condition a method of performing washing for 5 minutes at room temperature three times is adopted, but the cleaning time and temperature may be appropriately changed.
  • a substance that visualizes the labeling substance is reacted with the tissue preparation subjected to the secondary antibody reaction.
  • DAB diamino
  • a tissue preparation is incubated in a reaction solution obtained by mixing an equal amount of benzidine solution immediately before incubation.
  • a chromogenic substrate such as DAB—Ni or A EC + (above, DAK0) can be selected as appropriate.
  • the visualization reaction is stopped by observing the degree of color development from time to time under a microscope and immersing the tissue preparation in P B S when the appropriate color development is confirmed.
  • BC IP (Promo 4—Black mouth 3—Indolyl phosphate)
  • ZNBT Nirobul monotetrazolium
  • Zymed substrate solution (1011 concentration) 1 ⁇ 80 1 2 and 28 mM NaC 1 in pH 9.8 5 OmM sodium carbonate buffer solution with 0.4 mM concentration of NBT and BC IP at 0.38 mM concentration)
  • NBT Nitrobul monotetrazolium
  • a fluorescent dye such as FI TC (fluorescein isothiocyanate), Cy 2 (Amersham) or A 1 exa 488 (Molecular Probe) is used as a label for secondary antibodies
  • the reaction process of the visualization substance Is not necessary, and the emitted light can be appropriately detected by irradiating light with the excitation wavelength of the fluorescent substance and using a fluorescence microscope.
  • Patent Document 3 It is known that glypican 3 is digested in liver cancer tissue and its N-terminal part is released into serum (Patent Document 3). Therefore, in the method of the present invention, when an antibody that binds to the N-terminal partial peptide of Daribican 3 that is released into serum by such digestion is used, the antibody still remains in the cell after digestion. It cannot bind to the C-terminal partial polypeptide anchored on the surface. On the other hand, when an antibody that binds to a C-terminal partial peptide is used in the method of the present invention, the antibody binds to a C-terminal partial polypeptide that is still anchored on the cell surface after digestion. Can do.
  • the anti-glypican 3 antibody used in the present invention it is possible to detect a partial polypeptide of Daribican 3 that is anchored on the cell surface regardless of whether or not digestion is performed. Until digestion, it is possible to detect a partial polypeptide of Glybican 3 that is anchored on the cell surface but is released into serum after digestion.
  • anti-glypican 3 antibodies are useful for the treatment and prevention of liver cancer (Patent Document 3).
  • the cytotoxic activity exhibited by such therapeutic anti-glybican 3 antibody is mainly due to the effect of effec- tive cells on the Fc portion of anti-glypican 3 antibody bound to the C-terminal partial polypeptide anchored on the cell surface. It is exerted by antibody-dependent cytotoxic activity (ADCC activity) and complement-dependent cytotoxic activity (CDC activity) initiated by binding of complement.
  • ADCC activity antibody-dependent cytotoxic activity
  • CDC activity complement-dependent cytotoxic activity
  • the method of the present invention binds to the C-terminal partial polypeptide.
  • the anti-glibican 3 antibody can be preferably used.
  • the site where Glypican 3 is digested in liver cancer tissue is the 3 5 8th and 3 5 9th amino acids of the 3 Daripican 3 molecule represented by SEQ ID NO: 1, or 3 7 4th and 3 7 5th amino acids It is suggested that it is a polypeptide bond (Patent Document 3). Therefore, the anti-glypican 3 antibody that binds to the C-terminal partial polypeptide preferably used in the present invention includes the amino acids from the 3 5 9th to the 5 80th amino acids of the glypican 3 molecule represented by SEQ ID NO: 1. Examples thereof include an antibody that binds to a polypeptide consisting of an acid, or a polypeptide consisting of the amino acids 3 5 5 to 5 80.
  • anti-glibican 3 antibody that binds to the N-terminal partial polypeptide is used.
  • the 3 anti-glypican 3 molecules recognized by the anti-glypican 3 antibody that binds to the N-terminal partial polypeptide are the more mature therapeutic target molecules, and the hepatoma cells that express such 3 anti-glypican molecules become more mature. Each can be characterized as an untreated therapeutic target cell.
  • anti-glibican 3 antibody that binds to the C-terminal partial polypeptide of the glypican 3 molecule detects the glypican 3 molecule regardless of maturation.
  • anti-glibican 3 antibody that binds to the N-terminal partial polypeptide of glypican 3 molecule detects 3 molecules of daribican before matured but does not detect 3 molecules of mature glypican. That is, it is detected by the method of the present invention by using two types of antibodies, an antibody that binds to the C-terminal partial polypeptide of the anti-glypican 3 molecule and an antibody that binds to the N-terminal partial polypeptide. It becomes possible to classify hepatoma cells expressing daribican 3 molecules and 3 glycan molecules according to the degree of maturation.
  • anti-glibican 3 antibody that binds to the C-terminal partial polypeptide of three anti-glypican molecules
  • anti-glibican 3 antibody that binds to the N-terminal partial polypeptide of glybican 3 molecule.
  • I mean.
  • tissue preparations were prepared from the same subject, and anti-glypican 3 antibody that binds to the N-terminal partial polypeptide of glypican 3 molecule was used as the primary antibody for the reaction, and to the other The anti-glibican 3 antibody that binds to the C-terminal partial polypeptide of darribican 3 molecule is subjected to the reaction as the primary antibody.
  • Glypican 3 molecule detected using anti-glypican 3 antibody binding to polypeptide should be evaluated as a less mature molecule in terms of its maturity level Hepatoma cells expressing such glypican 3 molecules can be evaluated as less mature cells.
  • anti-glypican 3 antibody binding to the N-terminal partial polypeptide of glypican 3 molecule is not detected, but darpican detected using anti-glypican 3 antibody binding to the C-terminal partial polypeptide of glypican 3 molecule.
  • Three Molecules can be evaluated as more mature molecules in terms of their degree of maturity, and hepatoma cells expressing such glypican 3 molecules are more mature It can be evaluated as a cell.
  • Anti-Gribican 3 antibody that binds to the N-terminal partial polypeptide of Glybican 3 molecule and Anti-Gribican 3 antibody that binds to the C-terminal partial polypeptide of Glypican 3 molecule belong to different antibody subclasses, or Measurements can be made using a single tissue preparation if it was produced in a different animal species.
  • a secondary antibody that recognizes the anti-glybican 3 antibody that binds to the N-terminal partial polypeptide and a secondary antibody that recognizes the anti-glypican 3 antibody that binds to the C-terminal partial polypeptide, By labeling with different types of enzymes or fluorescence, detection using two types of anti-glybican 3 antibodies on one tissue preparation becomes possible.
  • the present invention is based on the difference in the antigen activation reaction (that is, the heat-induced antigen activation method and the protease antigen activation method) under the microscope of the antigen-antibody complex formed from glypican 3 and anti-glibican 3 antibody.
  • a method for quantifying the difference in the degree and manner of detection is provided.
  • the quantification is represented by the following formula (1);
  • IR Cp is the expression score of glypican 3
  • PR is a numerical value obtained by scoring the proportion of cells in which the complex is detected under a microscope.
  • S I 1 C p is a numerical value obtained by scoring the staining intensity at which the complex is detected in the cytoplasm of cells in the visual field under a microscope.
  • SP is a numerical value obtained by scoring the percentage of cells that show complete membrane staining in the cell membrane of the cells in the field of view under the microscope]
  • the PR score is the PR score
  • the quantification is represented by the following formula (2);
  • IR Cm is the membrane localization score of glypican 3
  • PR is a numerical value obtained by scoring the proportion of cells in which the complex is detected under a microscope.
  • SI-I Cm is a numerical value obtained by scoring the staining intensity at which the complex is detected in the cell membrane of cells in the visual field under a microscope.
  • SP is a numerical value obtained by scoring the percentage of cells that show complete membrane staining in the cell membrane of the cells in the field of view under the microscope]
  • the PR score is the PR score
  • SI—Cm score is (b) In the cell membrane of the cells in the visual field under the microscope,
  • the above-described equations (1) and (2) are used for each of the tissue preparation subjected to the heat-induced antigen activation method and the tissue preparation subjected to the protease antigen activation method.
  • the calculated score is determined.
  • the score calculated based on equation (1) reflects the expression level of glypicon 3 and the score calculated based on equation (2) indicates the localization of glypican 3 expression in the cell membrane. The reflected score.
  • HuH-7 cells Human Science Research Resource Bank
  • HuH-7 is Dulbecco's Modifid Eagle Medium Medium (SIGMA) containing 10% FBS (BI0NET)
  • HepG2 is 10% FBS, 1 mmol / L MEM Sodium Pyruvate (In vitrorogen), 1 mmol / L It was maintained and passaged in Minimum Essential Medium Eagle Medium (SIGMA) containing MEM Non-Essential Amino Acid (Invitrogen).
  • the expression level of GPC3 in HuH-7 cells and HepG2 cells was measured by the QIFI- Kit (DakoCytomation) using mouse anti-human GPC3 monoclonal antibody (clone name: GC33, described in WO2006 / O06693). It was. The measurement method was the method described in the attached manual.
  • the GC33 antibody used was dissolved at room temperature and then adjusted to 1 mg / ml with PBS.
  • As a negative control lyophilized mIgG2a (one vial) dissolved in 500 1 “Japan Pharmacopoeia Water for Injection Otsuka Distilled Water” was used.
  • each of the suspensions to which GC33 and mIgG2a were added 2 1 and 5 ⁇ 1 were left at 4 for 30 minutes. Then, the cells were fractionated by subjecting each of the suspensions to which 1 ml of FACS-PBS had been added to a centrifugation operation at 5000 rpm for 1 minute at 4. Resuspend the cells in 98 1 FACS-PBS. It was cloudy.
  • the output is displayed so that the two peaks generated by the measurement of the labeled setup beads are within the measurement screen.
  • EPICS-XL The cell samples subjected to GC33 antibody reaction, the cell samples subjected to mIgG2a reaction, and the mean fluorescence intensity (MFI) value of each fluorescence emitted by the calibre beads were measured.
  • the expression level of glypican 3 in HuH-7 was 1.25 ⁇ 10 5 molecules per cell.
  • the expression level of glypican 3 in HepG2 was 9.67 ⁇ 10 5 molecules per cell.
  • Each cell of HuH-7 and HepG2 was prepared to 5 ⁇ 10 7 cells per ml in a solution containing the same volume of the maintenance passage medium described in (1) and MATRI GEL Matrix (BD Bioscience). It was. The day before transplantation of each cell into a mouse, anti-assialo GM 1 antibody (Wako Pure Chemical, 1 vial content was dissolved in 1 ml of distilled water and further diluted with 4 ml of physiological saline). This was administered intraperitoneally to a 5-week-old SC ID mouse (CLEA Japan).
  • the anti-asharo GM1 antibody (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was prepared by dissolving the contents of one vial in 1 ml of distilled water and further diluting with 4 ml of physiological saline. The next day, 100 1 of each cell suspension (ie, 5 ⁇ 10 6 cells per mouse) was transplanted subcutaneously into the abdomen of the mouse.
  • the uniform transplanted tissue sample collected from the HepG2 transplant model prepared in (3) is a surgical scalpel. Was divided into four equal parts. One fragment was fixed with 10% neutral buffered formalin for 24 hours. The fixed tissue pieces were then embedded in paraffin using an automatic embedding device ETP-150C (Sakura Finetech Japan) and stored in 4T (Method A).
  • paraffin-embedded specimens prepared by the A and B methods were sliced on a cryostat microtome immediately before application of immunohistochemical staining, air-dried, deparaffinized and subjected to staining.
  • Tissue-Tek OCT co immediate and frozen in a dry ice bath After the frozen block was sliced into multiple sections on a cryostat microtome, the sections were air-dried and fixed in the following different ways. One section was fixed at 4 in 4% paraformaldehyde for 30 minutes (Method D). Another section was fixed at 4 in acetone for 10 minutes (Method E). Another section was fixed in 10% neutral buffered formalin for 30 minutes at room temperature (Method F). Immobilized sections by the D, E, and F methods were washed 3 times for 5 minutes with Tris-buffered saline (TBS, 50 mM, pH 7.4), air-dried, and stored at 1-80.
  • TBS Tris-buffered saline
  • Tissue sections prepared as described above were used for immunohistochemical staining shown below.
  • primary antibodies GC33 antibody (IgG2a) or 1G12 antibody (BioMosaic, IgGl) were used at concentrations of 2.5 tg / ml and l.Ozg / ml, respectively.
  • the reagents included in L SAB-2 kit were used as the necessary reagents for staining.
  • the staining method is included in the kit The method described in the instructions was performed. Antigen activation was not performed because the immobilization time was short.
  • the antigen-antibody complex formed in the immunohistochemical staining process was visualized by a peroxidase-daminobenzidine (MB) reaction. Hematoxylin was used as a counterstain.
  • MB peroxidase-daminobenzidine
  • Hematoxylin was used as a counterstain.
  • mouse IgG2 was used for GC33 and IgG1 was used for 1G12. Three cases were evaluated for each method and the results are shown in Table 1.
  • the staining in immunostaining was graded according to the parameters shown below. Ie;
  • a sample having a ratio of cells in which the complex is detected is 50% or less
  • the PR grade is determined by using a specimen in which the percentage of cells in which the complex is detected is 90% or more as ⁇ HJ,
  • Standard stained images for each grade of S I score (+1, +2, +4 and +5) are shown in Figure 1.
  • A shows a standard with S I +1
  • B shows a standard with S I +2
  • S I shows a standard with +4,
  • D shows a standard with S I +5.
  • Fig. 2 shows stained images of each grade of SP score (+1, + I I and + I I I).
  • A shows a standard with SP of I
  • B shows a standard with S I of I I I.
  • the grades of SI and SP of preparations prepared by any of methods C to F were both low, indicating that sufficient stained images were not obtained. In addition, the morphological structure of the standard was not preserved. In comparison between Method A and Method B, the grades of SI and SP of the sample prepared by Method B are both high (SI is +3 to +5,? Is 1 I or III), and PR Cells with a grade of 903 ⁇ 4 or more were judged positive (H). On the other hand, in method A, S I was +3 to +5, SP was determined as I or I I, and PR grade was also determined as L or MH. In terms of the difference between the GC33 antibody and the 1G12 antibody, both GC33 antibodies gave a stronger stained image than the 1G12 antibody.
  • the immobilization time of the uniform transplanted tissue sample collected from the HepG2 transplant model prepared in (3) was examined as follows. A preparation was prepared with a fixation time of 24 hours and 7 days with 10% neutral buffer formalin in Method A described in (4). In addition, the preparations prepared at each fixing time were activated by any of the activation methods described below: autoclave, microwave, and protease. t ar g e t retrieva
  • a sample activated by autoclaving was prepared by subjecting the sample to autoclaving at 121 for 10 minutes in a solution diluted 10-fold with 1 solution, pH6 (DAKO). Microphone by heating the sample 4 times in the same solution at 780W for 5 minutes A preparation activated by mouth wave was prepared. A sample was also prepared separately, which was reacted at room temperature for 5 minutes with the AR reagent supplied with HistofineHer2kit (MONO) (Nichirei Bioscience).
  • Tissue sections prepared as described above were used for immunohistochemical staining shown below.
  • primary antibodies GC33 antibody (IgG2a) or 1G12 antibody (BioMosaic, IgGl) were used at concentrations of 2.5 g / ml and 1.0 g / ml, respectively.
  • the reagents included in the L SAB-2 kit were used for the staining.
  • the staining method was carried out as described in the instructions included with the kit. Since the immobilization time was short, antigen activation was not performed.
  • the antigen-antibody complex formed during the immunohistochemical staining process was visualized by the peroxidase-diaminobenzidine (DAB) reaction.
  • DAB peroxidase-diaminobenzidine
  • Hematoxylin was used as a counterstain.
  • mouse IgG2 was used for GC33 and IgGl was used for 1G12.
  • IgG2 was used for GC33 and IgGl was used for 1G12.
  • Table 2 Three cases were evaluated for each specimen to which each immobilization time and each activation reaction was applied, and the results are shown in Table 2.
  • the microwave method gave slightly better SI and SP grades than the autoclave method.
  • the specimens that had been antigen-activated by the protease method showed better staining than the other specimens that had been antigen-activated in the SP score as well as their PR grade and SI score. It was.
  • the transplanted tissue piece collected from the transplant model prepared in (2) was fixed by immersing in 10% neutral buffered formalin for 7 days, and then a paraffin-embedded block specimen of the tissue piece was prepared according to a conventional method. Tissue sections sliced from this block specimen were used for immunohistochemical staining as shown below.
  • GC33 antibody (IgG2a) was used as the primary antibody.
  • the reagents included in the Histofine HER2 kit (MONO) (Nichirei Bioscience) were used as reagents necessary for staining. Except for using the GC33 antibody as the primary antibody, the staining method was performed as described in the instructions attached to the kit.
  • Antigen activation treatment can be performed by protease treatment (treatment for 5 minutes at room temperature using the protease provided with the kit) or in Target Retrieval Solution (DakoCytomat ion) diluted 10-fold. Was autoclaved for 10 minutes at 121 "C.
  • the antigen-antibody complex formed in the immunohistochemical staining process was visualized by the peroxidase-daminobenzidine (DAB) reaction. Hematoxylin was used for counterstaining, and the primary antibody was used. Mouse IgG2 was used as a control antibody.
  • DAB peroxidase-daminobenzidine
  • Staining by immunostaining with mouse anti-human Glybican 3 antibody was evaluated by the following three parameters (positive cell rate: PR, staining intensity: S I, cell membrane staining pattern: SP).
  • the total score calculated using SI-Cm was expressed as IR Cp, and the total score calculated using IR CB SI-Cp.
  • Fig. 3 shows a stained image of a tissue preparation derived from an animal model transplanted with HuH-7 and HepG2 when autoclaved.
  • A shows a stained image of a sample prepared from a HuH-7 transplantation model and heat-induced antigen activation by autoclaving.
  • B shows a protease antigen activation on a section prepared from the HuH-7 transplantation model.
  • C is a stained image of a preparation prepared by heat treatment
  • C is a stained image of a preparation prepared by heat-induced antigen activation by autoclaving on a section prepared from a He pG 2 transplant model
  • D is a He pG 2 transplant
  • a stained image of a specimen prepared by protease antigen activation treatment on a section prepared from a model is shown.
  • Table 3 shows the scores for individual staining parameters.
  • the IR Cp value calculated from the tissue preparation derived from the animal model transplanted with HuH-7 and HepG2 was 7, and no difference was observed between HuH-7 and HepG2.
  • the IR Cll values were all 5 and there was no difference between the two. (Table 3 and Figure 3)
  • Table 3 also shows the scores of individual staining parameters when a tissue preparation derived from an animal model transplanted with HuH-7 and HepG2 was subjected to the treatment with a pure tear. Yes. A higher trend was observed in the SI-C m and SI-C p scores obtained from the tissue preparations treated with the protease compared to those obtained from the autoclaved preparations.
  • the IR Cp values obtained from the tissue preparations transplanted with HuH-7 and HepG2 were 4 and 8, respectively.
  • the IR Cll values obtained from the tissue preparations transplanted with HuH-7 and HepG2 were 4 and 9, respectively (Table 3 and Fig. 3).
  • the antigen activation by the protease treatment is a method in which the difference in the expression level of glypican 3 is reflected more accurately than the autoclave treatment.
  • the protease treatment was superior to the autoclave treatment from the viewpoint of the staining property of the cell membrane of the tissue preparation.
  • a human hepatocellular carcinoma sample was immersed and fixed in 1 ( ⁇ neutral buffered formalin for a certain period of time.
  • a paraffin-embedded block specimen was prepared according to a conventional method.
  • a tissue slice sliced from the block specimen was immunized. Used for histochemical staining, immunohistochemical staining was performed in the same manner as in Example 1.
  • Example 1 (6-2) Based on the description in Example 1 (6-2), the following three parameters are shown for staining by mouse anti-human GPC3 antibody immunostaining (positive cell rate: PR, staining intensity: SI, cell membrane staining pattern) : SP).
  • Fig. 4 shows a stained image of the specimen subjected to antigen activation treatment.
  • A shows a stained image of a specimen prepared from a specimen prepared from case A and heat-induced antigen activation treatment by autoclaving.
  • B shows a section prepared from case A specimen subjected to protease antigen activation.
  • a stained image of the sample, C is a stained image of a sample prepared by heat-induced antigen activation by autoclaving on a section prepared from the sample of Case B, and D is prepared from the sample of Case B.
  • E is a stained image of a specimen that has been subjected to protease antigen activation treatment
  • E is a staining image of a specimen that has been heat-induced antigen activation treatment by autoclaving on a section prepared from the specimen of Case C
  • F is Sections prepared from the specimens of case C represent stained images of specimens that have been treated with protease antigen activation.
  • the PR score is case A. 1 (less than 20% area positive), 2 in case B (positive in 20-50% area) and 3 in case C (positive in more than 50% area).
  • the antigen activation method by protease treatment compared to autoclave may be a method that more accurately reflects the difference in the expression level of GPC3 in GPC3 immunostaining using clinical hepatocellular carcinoma samples. Sex was suggested. It was also revealed that the protease treatment was excellent in terms of cell membrane staining. Furthermore, in the protease method, it was shown that the specific positive reaction by the anti-GPC3 antibody can be grasped more accurately because the nonspecific positive reaction is minimal.
  • HuH-7 cells and HepG2 cells were used as cells for transplantation.
  • HuH-7 cells are in Dulbecco's Modi fid Eagle's Medium medium (SIGMA) containing ⁇ BS (BI0NET), HepG2 cells are layer BS, 1 mmol / 1 MEM Sodium Pyruvate (Invitrogen), 1 ⁇ ol / l MEM Non- Each was maintained and passaged in Minimum Essent ial Medium Eagle Medium (SIGMA) containing Essent ial Amino Acid (Invitrogen).
  • SIGMA Dulbecco's Modi fid Eagle's Medium medium
  • Each cell was prepared to 5 ⁇ 10 7 cells per ml using a solution containing equal amounts of the above-mentioned passage medium and Matrigel Matrix (BD Bioscience).
  • SC ID mice Oss, 5 weeks old
  • lOO tl anti-asharo GM1 antibody Wako Pure Chemical, 1 vial dissolved in 5 ml PBS
  • 100 1 of the cell suspension was transplanted subcutaneously into the abdomen of Japan Marie. That is, 5 ⁇ 10 6 cells were administered per mouse.
  • Tumor volume is calculated by the following equation, the mean tumor volume was assumed that the model is established when it becomes 117 to 330 negation 3.
  • Tumor volume major axis X minor axis X minor axis / 2
  • Humanized anti-human GPC3 monoclonal antibody (clone name: hGC33, public) It is described in the open application WO2006 / 006693. ) Was prepared to 0.5 nig / ml, 0.1 mg / ml, or 0.05 mg / ml using PBS sterilized by filtration on the day of administration, and 5 mg / kg administration group, 1 mg / ml respectively. It was used as an administration sample for the kg administration group and 0.5 mg / kg administration group.
  • FIG. 5A is a graph showing changes in tumor volume over time in a HepG2-transplanted mouse model.
  • the diamond represents the time course of the tumor volume of the group administered with vehicle
  • the square represents the group administered with hGC33 antibody at 1 mg / kg
  • the circle represents the group administered with hGC33 antibody at 5 mg / kg.
  • the time point at which the hGC33 antibody was administered is indicated by an arrow.
  • * indicates that the significance level P by significance test is P ⁇ 0.05.
  • FIG. 5B is a diagram showing temporal changes in tumor volume in a mouse model transplanted with HuH-7.
  • the rhombus represents the time course of the tumor volume of the group administered with vehicle
  • the square represents the group administered with hGC33 antibody at I mg / kg
  • the circle represents the group administered with hGC33 antibody at 5 mg / kg.
  • the time point at which the hGC33 antibody was administered is indicated by an arrow.
  • * indicates that the significance level P by significance test is P ⁇ 0.05.
  • 5C is a graph showing the wet tumor weight one week after the last administration date in the HepG2 transplanted mouse model.
  • * indicates that the significance level P by significance test is P ⁇ 0.05.
  • ** indicates that the significance level P by the significance test is ⁇ ⁇ 0 ⁇ 0001.
  • FIG. 5D is a graph showing the wet tumor weight one week after the last administration date in the HuH-7 transplanted mouse model.
  • * indicates that the significance level P by significance test is P ⁇ 0.05.
  • ** indicates that the significance level P by significant difference test is P ⁇ 0.0001.
  • the SAS preclinical package (SAS Institute) was used for statistical analysis.
  • the tumor volume at the last measurement day was used and the significance test was evaluated by Dunne 11 type multiple comparison method.
  • FIGS. 5A and 5B it was confirmed that the tumor growth in the hGC33 antibody administration group was significantly suppressed as compared with that in the vehicle administration group.
  • the efficacy of the antibody is relatively strong in the HepG2 cell transplant model and relatively weak in the HuH-7 cell transplant model.
  • mice transplanted with HepG2 cells that are judged to exhibit high expression levels of the antigen and the expression of cell membrane localization based on the analysis results of immunohistochemical staining of tissue specimens prepared by the protease antigen activation method It became clear that the model showed a high antitumor effect.
  • the above analysis results revealed that the mouse model transplanted with HuH-7 cells diagnosed with low antigen expression showed a low anti-tumor effect.

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Abstract

本発明は、被験体における肝癌細胞の存在を検出するためのインビトロ免疫アッセイ方法に関する。本発明の方法では、肝癌組織におけるグリピカン３抗原の発現を検出する際に、熱誘導抗原賦活化法による抗原賦活化処理と、プロテアーゼ抗原賦活化法による抗原賦活化処理とを組み合わせることによって、グリピカン３抗原の発現量や発現態様の差異を免疫組織化学的染色法によって検出することができる。このことにより、従来のHIER法ではグリピカン３が高発現していると認定されていた検体を、グリピカン３の発現量に応じて段階的に類別することが可能である。

Description

明細書
抗グリビカン 3抗体を用いる肝癌細胞の検出法 技術分野
[ 0 0 0 1 ]
本発明は、被験体における肝癌細胞の存在を検出するためのィンビト口免疫アツセィ 方法に関する。
背景技術
[ 0 0 0 2 ]
グリピカン 3は肝癌で頻繁に高発現していることから、肝癌におけるグリビカン 3の 発現プロファイルの解析は、 グリピカン 3の肝癌における機能の同定、肝癌の治療また は診断および肝癌の予後予測に有用であろうと考えられている。一般にタンパク質の発 現解析に際しては、免疫組織化学、 とりわけ酵素抗体法が病理診断に広く用いられてい る。免疫組織化学は生体内の物質（抗原） の存在と分布を抗体や酵素等の生物学的試薬 を用いて高感度、 かつ特異的に検出する方法である。 免疫組織化学の特徴として、 1 . 手技的に簡便である、 2 . 得られた生化学的情報を形態情報に適用することができる等 の広範な応用が可能である、 3 . 生物学的、 病理学的に重要な情報を提供する、 4. 生 物学的試薬を用いるので通常の方法とは異なった注意がいる、 等の特徴があげられる。 また、 免疫組織化学染色は新鮮凍結切片、 細胞診検体、 または、 固定組織のパラフィン 切片等広範囲な検体を用いて目的とする病理診断や形態学的観察に使用できるという 長所も有している。
[ 0 0 0 3 ]
免疫組織化学の中でも、酵素抗体法による免疫染色は、通常の病理診断に用いられる ホルマリン固定パラフィン包埋組織が使えるために、その応用範囲は非常に広い。 しか し、 ホルマリン固定組織であるために起こりうるアーチファクト （人為的所産）等に十 分な注意を払わないと、染色に失敗するばかりか、 ときにはホルマリン固定および包埋 による抗原の変化や、抗体の浸透と反応性の変化をもたらす結果、偽陽性や偽陰性が生 じる。こうした偽陽性や偽陰性は、染色結果に対する解釈の誤りに帰結することがある。
[ 0 0 0 4]
通常の組織学的検索に用いられるホルマリン固定は、 形態の保持には有用であるが、 抗体との結合性の保持という点からは理想的な固定液とはいえない。そこでホルマリン 以外にもアルコールなどが固定液として用いられることもあるが、形態保持に優れ、す ベての抗原の抗体との結合性を保存できるような固定法はまだ確立されていない。した がって、 ホルマリン固定は、 抗体との結合性の保持に問題があるものの、広く用いられ ている現実的な固定法となっている。
[ 0 0 0 5 ]
そこで、抗体との結合性の保持に対するホルマリン固定の影響を減弱するためのいく つかの方法が考えられてきている。第一に、 ホルマリン固定の影響を受けないェピトー プを認識する抗体を選択して免疫染色に使用するという方策が考えられる。同一の抗原 を認識する抗体の中から、抗原中のホルマリン固定の影響を受けにくいェピトープを認 識する抗体を免疫染色に使用することにより、偽陰性を減らすことが可能となる。 しか しながら、グリビカン 3は細胞表面に発現した後にプロテア一ゼ等の翻訳後修飾を受け るため、抗体との結合が可能なェピトープが限定されることから、好適なェピト一プを 選択するためのェピトープの多様性がなレ ^。
[0006]
第二に、免疫染色の感度を高くして通常の方法では可視化できない抗原を検出する方 法が挙げられる。 最も簡便な方法は、 発色時に通常免疫染色で使用される DAB (3,3' diaminobenzidine tetrahydrochloride) に銅などの重金属を加える方法であるが、 顕 著な感度の上昇は期待できない。 ABC (avidin-biotylated peroxidase complex) 法や LSAB (labeled streptavidin biotynlated antibody) 法などの、 ピオチン化二次抗体 と ABC あるいは酵素標識アビジンを繰り返して切片と反応させることによって感度を あげるという方法も試みられたが、反応回数が増えるに従って背景の非特異染色も増強 する傾向が認められた。さらに酵素標識デキストランポリマーを用いる EPOS (enhanced polymer one-step staining) 法や、 ピオチン化夕イラマイドと ABC法を組み合わせた CSA (catalyzed signal amplification) 法が利用できるようになって、 染色の感度は 飛躍的に向上した。 しかしながら、 ABC法等の従来の方法を用いてホルマリン固定組織 における抗原を検出する際には、腫瘍組織は陽性と、正常または非腫瘍組織は陰性と判 断され、そうした判断に基づいて腫瘍組織と非腫瘍組織の識別をすることが可能であつ たが、高感度法を用いると非腫瘍組織内の微量の抗原も検出されるため、抗原によって はこのような識別ができない場合もある。 また、高感度法を用いる場合は高感度ゆえに 背景染色も増強するといつた問題も有していた。
[0007]
第三にホルマリン固定により抗体との反応性が減弱した抗原の反応性を賦活化する という方法がある。 1970年代に導入されたプロテア一ゼを用いた切片の消化による方 法 （Protease-induced epitope retrieval, 以下 「PIER法」 または 「プロテアーゼ抗 原賦活化法」 と指称される） においては、 トリプシン、 ペプシンなどによる切片の消化 が免疫染色の前に行われる。 この方法では、切片自体が消化されることに起因する切片 のガラスからの剥離や染色結果の不安定性等の問題があった。
[0008]
その後、 熱誘導抗原賦活化法 （Heat- induced epitope retrieval, 以下 「HIER法」 または 「熱誘導抗原賦活化法」 と指称される） が、 1990年代に開発された。 マイクロ ウェーブ、煮沸ゃォ一トクレーブを用いて加熱すると、高温処理により抗原が加水分解 される結果、 ェピトープが抗体と結合可能になるといわれている。 グリピカン 3の肝癌 における発現も、 これまでは HIER法によって検出されてきた （非特許文献 1〜 5およ び特許文献 1) 。 しかしながら、 抗グリビカン 3抗体が血管や肝類洞の上皮細胞と交 ¾ 反応性を示すため、正常肝細胞由来のタンパク質ライゼ一卜とのブロッキング反応を予 め施してこうした交叉結合を除外するような煩雑な処理が必要であり（非特許文献 4)、 元来細胞膜上に発現しているダリビカン 3が細胞質性に発現しているように観察され る等 （非特許文献 2) 、 従来用いられている HIER法では肝癌組織でのグリピカン 3の 発現が正確に検出できず、 従来の HIER法に替わる当該発現の正確な検出方法の開発が 求められていた。
[0009]
[非特許文献 1 ] CapurroM, Wanless IR, Sherman M, Deboer G， Shi W, Miyoshi E, Filmus J.， (2003) Gastroenterology 125(1), 89 - 97
[非特許文献 2] Yamauchi N, Watanabe A, Hishinuma M, Ohashi K, Midorikawa Y， Morishi ta Y, Niki T， Shibahara J， Mori M, Makuuchi M， Hippo Y， Kodaraa T, Iwanar i H， Aburatani H, Fukayama M. , (2005) Mod Pathol 18(12), 1591-8
[非特許文献 3] Libbrecht L， Severi T， Cassiman D， Vender Borght S, Pirenne J, Nevens F, Verslype C, van Pelt J, Roskams T. , (2006) Am J Surg Pathol 30(11), 1405-11
[非特許文献 4] Grozdanov PN, Yovchev MI, Dabeva MD. , (2006) Lab Invest 86(12), 1272-84
[非特許文献 5] Llovet, J:M.， Chen, Y. , Wurmbach, E.， Roayaie, S. , Fiel, M. I., Schwartz, M. , Thung, S.N.， Khitrov, G. , Zhang, W. , Villanueva, A., Battiston, ， Mazzaferro, V. , Bruix, J. , Waxman, S. , Friedman, S. L. , (2006) Gastroenterology 131(6), 1758-1767
[特許文献 1] W02003100429
[特許文献 2] W02006006693
[特許文献 3] W02004022739
発明の開示
[00 1 0]
[発明が解決しょうとする課題]
本発明はこのような情況に鑑みて為されたものであり、その目的は、肝癌組織におけ るダリピカン 3の発現の態様を正確に検出することを可能とする方法を提供すること にある。
[00 1 1]
[課題を解決するための手段] 本発明者らは、肝癌組織におけるグリピカン 3抗原の 発現を検出する際に、熱誘導抗原賦活化法による抗原賦活化処理と、 プロテアーゼ抗原 賦活化法による抗原賦活化処理とを組み合わせることによって、グリビカン 3抗原の発 現量や発現態様の差異を免疫組織化学的染色法によって検出できることを見出して本 発明を完成した。 このことにより、 従来の HIER法ではグリピカン 3が高発現している と認定されていた検体を、ダリビカン 3の発現量に応じて段階的に類別することが可能 となった。
[0012]
すなわち、 本願出願は以下の発明；
[ 1 ]被験体における肝癌細胞の存在を検出するためのインビトロの免疫アツセィ方法 であって、
(a)前記被験体から調製された後に、パラフィンに包まれて透過性の支持体に取り付 けられた、同一被験体より少なくとも二つの同視し得る一組の組織標品がパラフィン包 埋切片として提供され、
(b) 前記一組の組織標品の脱パラフィン処理が実施され、
(c) 前記（b)処理が実施された同視し得る一組の組織標品の一方に対して熱誘導抗 原賦活化法による抗原賦活化処理が施され、他方に対してプロテアーゼ抗原賦活化法に よる抗原賦活化処理が施され、
(d)前記（c)処理が施された組織標品中に存するグリピカン 3と抗グリビカン 3抗 体との複合体の形成に適切な条件下で、当該標品に対して抗グリビカン 3抗体が接触さ れ、
(e)複合体の存在が検出され、 ここで、 複合体が存在する場合に被験体において肝癌 細胞が存在すると判定される、
の各工程を含む方法；
[2] 前記熱誘導抗原賦活化法がマイクロ波による加熱である [1] に記載の方法； [3]前記熱誘導抗原賦活化法がオートクレープによる加熱である [ 1 ]に記載の方法； [4]前記プロテア一ゼ抗原賦活化法に用いるプロテア一ゼが、 ペプシン、 トリプシン およびプロテアーゼ Kからなる群より選択される、 [1] から [3] のいずれかに記載 の方法；
[5] 複合体を検出するための検出反応が酵素反応である、 [1] から [4] のいずれ かに記載の方法；
[ 6 ]前記抗グリピカン 3抗体がグリピカン 3の C末端ポリぺプチドに結合する抗体で ある、 [1] から [5] のいずれかに記載の方法；
[7]グリビカン 3の C末端ポリペプチドが配列番号 1に記載の 359番目のアミノ酸 から 580番目のアミノ酸からなるポリペプチド、 または、 375番目のアミノ酸から 580番目のアミノ酸からなるポリペプチドである [6] に記載の方法；
[8]前記抗グリビカン 3抗体が GC 33抗体である [6]または [7]に記載の方法；
[9] 前記抗グリビカン 3抗体が 1 G 12抗体である [1] から [5] のいずれかに記 載の方法； [10]工程（e)において、複合体の存在が数値化されて検出される、 [1]から [9] のいずれかに記載の方法；
[1 1] 前記数値化が以下の式；
I RCp=PR+ (S I -C p) +SP
[式中、
I RCpは、 グリピカン 3の発現量スコアであり、
P Rは、 検鏡下で前記複合体が検出される細胞の割合をスコァ化した数値であり、 S I— C pは、検鏡下で前記複合体が視野中細胞の細胞質において検出される染色強度 をスコア化した数値であり、 SPは、検鏡下での視野中細胞の細胞膜において完全な膜 染色を示す細胞の割合をスコア化した数値である]
にしたがって算出される、 [10] に記載の方法；
[12] 前記数値化が以下の式；
I RCB=PR+ (S I -Cm) + S P
[式中、
I RCmは、 グリピカン 3の膜局在スコアであり、
P Rは、 検鏡下で前記複合体が検出される細胞の割合をスコア化した数値であり、
S I一 Cmは、検鏡下で前記複合体が視野中細胞の細胞膜において検出される染色強度 をスコア化した数値であり、
S Pは、検鏡下での視野中細胞の細胞膜において完全な膜染色を示す細胞の割合をスコ ァ化した数値である]
にしたがって算出される、 [10] に記載の方法；
[13] [1 1] および [12] に記載の方法により算出されたスコアに基づいて、 被 験体に存在する肝癌細胞を分類する方法；
[14] [1 1] および [12] に記載の方法により算出されたスコアに基づいて、 被 験体に抗グリビカン 3抗体を含む抗癌剤を投与するか否かを決定する方法；
[15] [11] および [12] に記載の方法により算出されたスコアに基づいて、 被 験体に対する肝癌治療における抗グリピカン 3抗体を含む抗癌剤の投与量を決定する 方法；を提供するものである。
図面の簡単な説明
[0013]
[図 1] S Iのスコアの各グレードを表す図である。
[図 2] S Pのスコアの各グレードを表す図である。
[図 3] HuH— 7および He p G 2細胞移植モデルの標品の染色結果を示す図である。
[図 4] ヒト肝癌の臨床検体から調製された標品の染色結果を示す図である。
[図 5 A] hGC33抗体のヒト肝癌移植マウスモデルにおける抗腫瘍効果を表す図である。
[図 5 B] hGC33抗体のヒト肝癌移植マウスモデルにおける抗腫瘍効果を表す図である。 [図 5 C ] hGC33抗体のヒト肝癌移植マウスモデルにおける抗腫瘍効果を表す図である。
[図 5 D] hGC33抗体のヒト肝癌移植マウスモデルにおける抗腫瘍効果を表す図である。
[ 0 0 1 4 ]
本明細書は、 本願の優先権の基礎である特願 2 0 0 8— 0 6 8 3 1 6号の明細書に記 載された内容を包含する。
発明を実施するための最良の形態
[ 0 0 1 5 ]
組織 fe品
本明細書中で使用される用語「組織標品」 とは、 個体、体液（例えば、 血液、 血清、 血漿、 および髄液） 、 組織培養物もしくは組織切片等から得られる任意の生物学的標品 をいう。生物学的標品として用いられるものとして被験体標品が好適に挙げられる。好 ましい被験体標品は、 被験体から得られた組織であり、 さらに好ましくは、 被験体の肝 組織である。肝組織を採取する方法としては公知の方法である生検 （バイオプシー） が 好適に用いられる。肝生検とは細く長い針が皮膚の表面から直接肝臓に刺され、肝臓の 組織が採取される方法をいう。 通常、 針が穿刺される部位は右胸下部の肋間である。術 前に超音波検査装置を用いて穿刺部の安全性が確認された上で、 穿刺部が消毒される。 更に皮膚から肝臓の表面までが麻酔の対象となり、穿刺部の皮膚が小切開された後に穿 刺針が穿刺される。
[ 0 0 1 6 ]
本発明においては、組織標品が顕微鏡下で透過光線によって観察されるために、組織 標品が顕微鏡に使用される光線を十分に透過する程度に薄切される。薄切の前段階とし て組織標品が固定される。すなわち、 組織 ·細胞の蛋白質に脱水や変性を起こさせて凝 固させることによって、組織を構成する細胞が速やかに死滅し、その構造が安定化およ び不溶化される。 まず、 固定の対象とされる組織標品が、 パラフィン包埋切片を作るの に適した大きさおよび形の断片として手術用メス等の刃物で切り取られる。次いで、 固 定を実施するために用いられる試薬である固定液中で当該断片が浸漬される。固定液と しては、 ホルマリン、 更に好ましくは中性緩衝ホルマリンが好適に使用される。 中性緩 衝ホルマリンの濃度は組織標品の特性または物性に応じて適宜選択される。濃度は 1〜 5 0 %、好ましくは 5〜2 5 %、更に好ましくは 1 0〜1 5 %の間で適宜変更されて使 用され得る。組織標品が浸漬された固定液が真空ポンプを用いて適宜脱気される。固定 は組織標本を常圧および室温の条件下で固定液中に数時間放置することによって実施 される。 固定に要する時間は、 1時間から 7日間、 好ましくは 2時間から 3日間、 また 好ましくは 3時間から 2 4時間、更に好ましくは 4時間から 1 6時間の範囲で適宜選択 され得る。 固定の後にリン酸緩衝液等に更に数時間 （2時間から 4 8時間、 好ましくは 3時間から 2 4時間、更に好ましくは 4時間から 1 6時間の範囲で適宜選択され得る時 間） 、 適宜浸潰される。 [ 0 0 1 7 ]
次に、 固定が適用された組織標品から、凍結切片法またはパラフィン切片法を用いて 切片が好適に作製され得る。 凍結切片法の好適な例としては、 0. T. co即 ound (Mi l es.
Inc) 中に組織を投入して凍結させたものを、 クリオスタツト （凍結切片作製装置） を 用いて薄切する方法が挙げられる。パラフィン切片法においては、 固定が適用された組 織標品が包埋剤に浸漬され固められることにより、 均一かつ適切な硬度が付与される。 包埋剤としては、パラフィンが好適に使用され得る。固定が適用された組織標品はエタ ノールを用いて脱水される。 具体的には、 組織標品が 7 0 %エタノール、 8 0 %ェ夕ノ —ル、 1 0 0 %エタノールに順次浸漬されることによって、当該組織標品が脱水される。 浸漬に要する時間および回数は、 1時間から数日および 1回から 3回の範囲で適宜選択 され得る。 また、 室温または 4でにおいても浸漬され得るが、 4でにおいて浸漬される 場合には、浸漬時間は終夜等その時間が長いほうが好ましい。次いでその液相がキシレ ンに置換された後に、組織標品がパラフィンによって包埋される。その液相のキシレン への置換に要する時間は 1時間から数時間の範囲で適宜選択され得る。その際に、室温 で置換され得るし、 4 においても置換され得るが、 4でにおいて置換される場合には、 置換の時間は、終夜等その時間が長いほうが好ましい。パラフィン包埋に要する時間お よび回数は、 1時間から数時間および 1回から 4回の範囲で適宜選択され得る。その際 に、 室温で包埋され得るし、 4でにおいても包埋され得るが、 4でにおいて包埋される場 合には、 包埋の時間は、 終夜等その時間が長いほうが好ましい。 また、 パラフィン包埋 反応が自動化処理されるパラフィン包埋装置 （EG1 160、 Leica等） を用いることによつ て、 組織標品が好適にパラフィン包埋され得る。
[ 0 0 1 8 ]
上述のようにしてパラフィン包埋された組織標品を台木に接着することによって「ブ ロック」が作製され、 このブロックがミクロ I ムよって 1から 2 0 x mの厚さから選 択される所望の厚さに薄切される。薄切された組織切片は透過性の支持体であるスライ ドグラス上に静置されることにより固着される。 この場合において、組織切片の剥離を 防止するためにスライドガラスに 0 . 0 1 %ポリー1^—リジン （Sigma) を塗布し乾燥さ せたスライドグラスも好適に使用され得る。固着された組織切片は数分から 1時間の間 から選択される適切な時間風乾される。
[ 0 0 1 9 ]
本発明においては、上述のように調製され、透過性の支持体上に取り付けられた二つ の組織標品が一組用意される。この当該組織標品は組織上同視され得る二つの組織標品 であることが望ましい。 「同視され得る」 とは、 相比較する二つの組織標品がその組織 標品が由来する被験体標品中でほぼ同一の細胞または組織から構成されていることを 意味する。例えば、隣接する切片として調製された二つの組織標品は同視され得る二つ の組織標品である。本発明においても特段別に記載しない限り、 「同視され得る二つの 組織標品」とは隣接する切片として調製された二つの組織標品をいうが、これに加えて、 隣接する切片として調製されていなくとも二つの組織標品を構成する細胞または組織 の構成が当該二つの組織標品間で同視できるものであれば「同視され得る二つの組織標 品」 に該当する。細胞または組織の構成が当該二つの組織標品間で同視できる場合とし ては、 例えば、 （1) 組織切片中の平面座標上で同一の位置に同一の細胞から由来する 細胞の切片が存在する場合、 （2) 当該細胞の切片が当該平面座標上の同一の位置に存 在する割合が少なくとも 50%以上、好ましくは 60%以上、 また好ましくは 70%以 上、 更に好ましくは 80%以上、 より好ましくは 90%以上、 特に好ましくは 95%以 上である場合、 等が好適に例示される。
[0020]
抗原賦活化
本発明の方法においては、ホルマリン固定により抗体との反応性が減弱した抗原の反 応性を賦活化する。本発明においては、 二つの組織標品のうち一の標品に対して、 プロ テアーゼ抗原賦活化法 （PIER法） を適用し、 他方の標品に対して、 熱誘導抗原賦活化 法 （HIER法） を適用し、 抗体と反応させたときの両者間の染色程度の相違を数値化す る。
[0021]
熱誘導抗原陚活化法は、マイク口波による加熱方法ゃォートクレーブによる加熱方法、 または、 煮沸処理による加熱方法等が適宜用いられる。 液温が約 98T:に保たれるよう に 780Wの出力で煮沸処理する場合、 処理等賦活化に要する時間は 5分一 60分の間か ら適宜選択され、 例えば 10分間である。 抗原の賦活化処理は、 1 OmMクェン酸ナト リウム緩衝液の他、 市販の Target Retrieval Solution (DakoCytomat ion) 等の中で行 うことができる。下記の実施例においては Target Retrieval Solut ionを使用する。賦 活化処理の結果として抗グリピカン 3抗体が認識する抗原中のェピト一プが抗体との 結合性を獲得して、後述する抗原と抗体の複合体の検出が可能となるものであれば、 い ずれの緩衝液、 水溶液も好適に用いられる。
[0022]
プロテアーゼ抗原賦活化法において使用されるプロテアーゼは、その種類や由来につ いて特に限定されるものでなく、一般的に入手可能なプロテアーゼを適宜選択して使用 され得る。 用いられるプロテア一ゼの例として、 0. 01N塩酸中 0. 05%濃度のぺ プシン、 または、 pH7. 6の Tr i s緩衝液中 0. 01 %濃度の C a C 12を更に含 有する 0. 1%濃度のトリプシン、 1 OmMの EDTAおよび 0. 5%の SDSを含む pH 7. 8の 1 OmM T r i s塩酸緩衝液中 1〜 50 / g/ml濃度のプロテア一ゼ K 等が好適に挙げられる。 さらにプロテア一ゼ Kを用いる場合、 その反応液の pHは 6. 5から 9. 5の間で適宜選択され、 SH試薬やトリプシン阻害剤ゃキモトリブシン阻害 剤も適宜利用され得る。本明細書実施例中で記載されるヒストファイン HER2キット （M 0N0) (ニチレイバイオサイエンス） に添付されるプロテアーゼもこうした好適なプロ テア一ゼの具体例として挙げられる。プロテア一ゼ抗原賦活化は通常 37でにて行われ る力^反応温度は 25でから 50での範囲内において適宜変更され得る。 プロテア一ゼ 抗原賦活化が 37 にて行われる場合には、反応時間は例えば 1分から 5時間の間で適 宜選択され、 例えば、 15分、 30分、 45分、 1時間、 2時間、 3時間、 4時間等で ある。賦活化処理が終了した後、 当該処理が施された組織標品は洗浄用緩衝液によって 洗浄される。 洗浄用緩衝液は PBS (Phosphate buffer saline) が好適に用いられる 他、 Tr i s塩酸緩衝液も好適に使用され得る。通常、 洗浄条件としては室温にて 5分 間の洗浄を 3回実施する方法が採用されるが、洗浄の時間および温度は適宜変更され得 る。
[0023]
抗グリビカン 3抗体
本発明の方法に用いられる抗グリビカン 3抗体は、グリビカン 3に結合する活性を有 していればいずれの抗体も好適に使用され得る。特に好適な抗体の例は、下記の実施例 において開示される GC 33抗体（特許文献 2)や 1 G12抗体（特許文献 1)である。 また、 これらの公知の抗体の他にも、 グリピカン 3を免疫抗原として使用して非ヒト動 物を免疫することによって、本発明に好適に用いられる抗グリピカン 3抗体を取得する ことができる。特許文献 1、特許文献 2にはこうした抗グリピカン 3抗体の作製方法が 記載されており、当業者であれば当該方法に基づいて適宜所望の抗グリビカン 3坊体を 取得することが可能である。
[0024]
抗グリピカン 3抗体のダリビカン 3への結合は当業者に公知の方法により好適に検 出され得る。 例えば、 EL I SA (酵素結合免疫吸着検定法） 、 E I A (酵素免疫測定 法） 、 R I A (放射免疫測定法） あるいは蛍光免疫法などを用いることができる。 これ らの方法は、 一般的な教示書である 「Antibodies A Laboratory Manual. Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988」 に記載されている。
[0025]
抗原を発現している細胞に対する抗体の結合活性を測定する方法としては、 例えば、 Antibodies A Laboratory Manual. (Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor La boratory,' 1988)中の 359— 420ぺ一ジに記載されている方法が挙げられる。すな わち、 細胞を抗原とする EL I SAや FACS (fluorescence activated cell sorti ng) の原理によって好適に評価され得る。 EL I SAフォーマツ卜においては、細胞へ の抗体の結合活性は、酵素反応によって生成するシグナルレベルを比較することによつ て定量的に評価される。すなわち、抗原を強制発現させた細胞を固定化した EL I S A プレートに被験抗体を加え、被験抗体を認識する酵素標識抗体を利用して、細胞に結合 した抗体が検出される。 あるいは FACSにおいては、 被験抗体の希釈系列を作成し、 抗 原を強制発現させた細胞に対する抗体結合力価 （titer) を決定することにより、 細胞 に対する結合活性が比較され得る。
[0026]
F ACSフォーマツトにより、 EL I S Aプレート等の担体に結合していない、緩衝 液等に懸濁した細胞表面上に発現している抗原と当該抗原に対する抗体との結合を測 定することができる。 このような測定に使用するフローサイトメ一夕一としては、例え ば、 FACSCanto™ II， FACSAr i a™, FACSArray™, FACSVantage™ SE， FACSCalibur™ (以 上、 BD Biosciences) や、 EPICS ALTRA HyPerSort, Cytomics FC 500, EPICS XL-MCL ADC, EPICSXL ADC, Cell Lab Quanta I Cell Lab Quanta SC (以上、 Beckman Coulter) などが挙げられる。
[0027]
抗グリビカン 3抗体の抗原に対する結合活性を測定する好適な方法の一例として、グ リビカン 3を発現する細胞と反応させた被検抗体を認識する二次抗体を用いる方法が 挙げられる。 グリピカン 3を発現する細胞を被検抗体と反応させ、 F I TC標識した二 次抗体で染色後、 FACSCalibur (BD) により測定を行い、 その蛍光強度を CELL QUEST Software (BD) を用いて解析する。 本方法によれば、 FACSCal iburにより測定を行った 場合において、その蛍光強度を CELL QUEST Softwareを用いて解析する方法によって得 られる Geome ic Meanの値 （被検 Geo_Mean値） を、 一次抗体として対照抗体を用いた ときの対照 Geo-Mean値と比較することによって、 抗原に対する抗体の結合活性を判定 することができる。 Geo-Mean値 （Geometric Mean) を求める計算式は、 CELL QUEST So ftware User' s Guide (BD biosciences社）に記載されている。
[0028]
組織標品と抗グリビカン 3抗体との反応
熱誘導抗原賦活化法による抗原賦活化処理が施された組織標品およびプロテアーゼ 抗原賦活化法による抗原賦活化処理が施された組織標品に対して、抗グリビカン 3抗体 を一次抗体として反応させる。当該反応は抗グリビカン 3抗体が抗原中のェピト一プを 認識して抗原抗体複合体を形成するのに適切な条件下で実施される。通常、 当該反応は 4でにて終夜、 または 37でにて 1時間実施されるが、 反応条件は、坊体が抗原中のェ ピトープを認識して抗原抗体複合体を形成するのに適切な範囲で適宜変更され得る。例 えば、反応温度は 4でから 50 の範囲内で変更され得るし、反応時間は 1分から 7日 の間で変更され得る。低温での反応が実施される場合には長い時間反応させることが好 ましい。一次抗体反応が終了した後、 組織標品は洗浄用緩衝液によって洗浄される。洗 浄用緩衝液は PBS (Phosphate buffer saline) が好適に用いられる他、 T r i s塩 酸緩衝液も好適に使用され得る。通常、洗浄条件としては室温にて 5分間の洗浄を 3回 実施する方法が採用されるが、 洗浄の時間および温度は適宜変更され得る。
[0029] 次いで、一次抗体反応が施された組織標品に対して、 一次抗体を認識する二次抗体を 反応させる。通常、二次抗体を可視化するための標識物質によって予め標識された二次 抗体が用いられる。標識物質としては、 F I TC (フルォレセインイソチオシァネート） や Cy2 (Amersham) 、 A 1 e x a 488 (Molecular Probe) 等の蛍光色素、 ペルォ キシダ一ゼゃアルカリフォスファターゼ等の酵素、または金コロイド等が好適に挙げら れる。
[0030]
二次抗体との反応は、抗グリビカン 3抗体と、 当該抗グリビカン 3抗体を認識する二 次抗体とが抗原抗体複合体を形成するのに適切な条件下で実施される。通常、 当該反応 は室温または 37°Cにて 30分乃至 1時間実施されるが、抗グリビカン 3抗体と二次抗 体とが抗原抗体複合体を形成するのに適切な範囲で適宜変更され得る。例えば、反応温 度は 4でから 50での範囲内で変更され得るし、反応時間は 1分から 7日の間で変更さ れ得る。低温での反応が実施される場合には長い時間反応させることが好ましい。二次 抗体反応が終了した後、組織標品は洗浄用緩衝液によつて洗净される。洗浄用緩衝液は PBS (Phosphate buffer saline) が好適に用いられる他、 Tr i s塩酸緩衝液も好 適に使用され得る。通常、洗浄条件としては室温にて 5分間の洗诤を 3回実施する方法 が採用されるが、 洗浄の時間および温度は適宜変更され得る。
[0031]
次に、二次抗体反応が施された組織標品に対して、標識物質を可視化する物質を反応 させる。二次抗体の標識物質としてペルォキシダーゼを用いた場合には、 0. 02%過 酸化水素水と pH 7. 2の 0. 1 Mトリス塩酸緩衝液で 0. 1%濃度に調製された D A B (ジァミノべンジジン）溶液とをインキュベート直前に等量混合することによって得 られる反応液で組織標品がインキュベートされる。 DABの他には、 DAB— N iや A EC+ (以上、 DAK0) 等の発色基質が適宜選択され得る。 インキュベートの過程におい て、時折顕微鏡下で発色の程度を観察し、適切な発色が確認された段階で組織標品を P B Sに浸漬することによって可視化反応が止められる。
[0032]
二次抗体の標識物質として、 アルカリフォスファターゼを用いた場合には、 BC I P (5—プロモー 4—クロ口— 3—インドリルリン酸） ZNBT (ニトロブル一テトラゾ リウム） （Zymed)基質溶液 （1011 濃度の1^8〇 12および 28mM濃度のNaC 1 を含有する pH 9. 8の 5 OmM炭酸ナトリウム緩衝液に、 0. 4mM濃度でNBTぉ よび 0. 38mM濃度で BC I Pが溶解されたもの）で組織標品がインキュベートされ る。 また、 BC I Pおよび NBTの他には、 Pe rmanen t Red、 Fa s t Red, または. Fuc h s i n+ (以上、 DAKO) 等も適宜使用されうる。 インキュベー トに先立って、 1 mM濃度の内在性アル力リフォスファタ一ゼの阻害剤である塩化レバ ミソ一ル （ナカライテスク） 、 0. 1M塩化ナトリウムおよび 5 OmM塩化マグネシゥ ムを含む 0. 1Mトリス—塩酸緩衝液 （pH9. 5) と、 室温にて 1分から数時間プレ インキュベートしてもよい。 インキュベートの過程において、 時折顕微鏡下で観察し、 反応最終産物である紫色のホルマザンの沈着が観察された段階で、組織標品を水洗また は 2%ポリビニルアルコールを含む TBSによる反応停止の後、 TBST (0. 1%の Twe e n 20を含む TB S) にて洗浄される。金コロイドが二次抗体の標識として使 用される場合には、銀増感によつて金粒子に金属銀が付着されることによって金コロイ ドが可視化される。 銀増感の方法は当業者に公知である。
[0033]
F I TC (フルォレセインイソチオシァネート） や Cy 2 (Amersham) , A 1 e x a 488 (Molecular Probe)等の蛍光色素を二次抗体の標識物質として用いた場合には、 可視化物質の反応工程は不要であり、 当該蛍光物質の励起波長の光を照射して、放出さ れる光が蛍光顕微鏡を用いることによつて適宜検出され得る。
[0034]
肝癌組織の分類と治療効果の予測
グリピカン 3は肝癌組織において消化を受けてその N末端部分が血清中に遊離する ことが知られている （特許文献 3) 。 したがって、 本発明の方法において、 そのような 消化を受けて血清中に遊離するダリビカン 3の N末端の部分べプチドに結合する抗体 を用いた場合には、当該抗体は消化を受けた後になお細胞表面上に係留する C末端の部 分ポリペプチドには結合することができない。 一方、 本発明の方法において、 C末端の 部分べプチドに結合する抗体を用いた場合には、当該抗体は消化を受けた後になお細胞 表面上に係留する C末端の部分ポリペプチドに結合することができる。すなわち、本発 明に使用される抗グリピカン 3抗体を目的によって適宜選択することによって、消化を 受けるか否かに関わらず細胞表面上に係留するダリビカン 3の部分ポリペプチドを検 出することも、消化されるまでは細胞表面に係留されるが消化を受けた後には血清中に 遊離されるグリビカン 3の部分ポリペプチドを検出することも可能である。
[0035]
肝癌の治療および予防に抗グリピカン 3抗体が有用であることが見いだされている (特許文献 3) 。 このような治療用抗グリビカン 3抗体が奏する殺細胞活性は、 主に、 細胞表面上に係留された C末端の部分ポリぺプチドに結合した抗グリピカン 3抗体の F c部分にエフェク夕一細胞や補体が結合することにより開始される抗体依存性細胞 傷害活性 （ADCC活性） や補体依存性細胞傷害活性 （CDC活性） によって発揮され る。 したがって、抗グリビカン 3抗体が結合するェピトープの肝癌組織における存否の 観点から治療用抗グリビカン 3抗体による肝癌の治療効果を予測する場合には、本発明 の方法において、 C末端の部分ポリペプチドに結合する抗グリビカン 3抗体が好適に使 用され得る。
[0036] グリピカン 3が肝癌組織において消化を受ける部位は、配列番号 1で表されるダリピ カン 3分子の 3 5 8番目と 3 5 9番目のアミノ酸、 または、 3 7 4番目と 3 7 5番目の アミノ酸のポリべプチド結合であることが示唆されている（特許文献 3 )。したがって、 本発明で好適に使用される C末端の部分ポリぺプチドに結合する抗グリピカン 3抗体 としては、配列番号 1で表されるグリピカン 3分子の 3 5 9番目から 5 8 0番目のアミ ノ酸からなるポリペプチド、 または、 3 7 5番目から 5 8 0番目のアミノ酸からなるポ リぺプチドに結合する抗体が挙げられる。
[ 0 0 3 7 ]
一方で、治療用抗グリピカン 3抗体による治療効果をグリピカン 3分子の成熟化の観 点から予測する場合には、本発明の方法において、 N末端の部分ポリペプチドに結合す る抗グリビカン 3抗体を用いることができる。 この場合、 N末端の部分ポリペプチドに 結合する抗グリピカン 3抗体によって認識されるダリピカン 3分子はより成熟化して いない治療標的分子として、そのようなダリピカン 3分子を発現する肝癌細胞はより成 熟化していない治療標的細胞として、それぞれ性格付けされ得る。 グリピカン 3分子の C末端の部分ポリペプチドに結合する抗グリビカン 3抗体は、成熟化のいかんに関わら ずグリピカン 3分子を検出する。一方、 グリピカン 3分子の N末端の部分ポリペプチド に結合する抗グリビカン 3抗体は成,熟化前のダリビカン 3分子を検出するが、成熟化後 のグリピカン 3分子は検出しない。すなわち、 グリピカン 3分子の C末端の部分ボリべ プチドに結合する抗体と、 N末端の部分ポリぺプチドに結合する抗体との 2種類の抗体 を使用することによって、本発明の方法によって検出されるダリビカン 3分子およびグ リピカン 3分子を発現する肝癌細胞を成熟化の度合いにより分類することが可能とな る。
[ 0 0 3 8 ]
この分類方法について、 以下により具体的に記載する。一次抗体として、 グリピカン 3分子の C末端の部分ポリペプチドに結合する抗グリビカン 3抗体と、グリビカン 3分 子の N末端の部分ポリぺプチドに結合する抗グリビカン 3抗体との 2種類の抗体を用 意する。同一被験者から 2つの組織標品を調製し、その一方に対してはグリピカン 3分 子の N末端の部分ポリぺプチドに結合する抗グリピカン 3抗体が一次抗体として反応 に供され、他方に対してはダリビカン 3分子の C末端の部分ポリペプチドに結合する抗 グリビカン 3抗体が一次抗体として反応に供される。ダリビカン 3分子の N末端の部分 ポリぺプチドに結合する抗グリピカン 3抗体を用いて検出されるグリピカン 3分子は、 その成熟化の程度という観点から、より成熟化されていない分子と評価されることが可 能であり、そのようなグリピカン 3分子を発現する肝癌細胞は、 より成熟ィ匕されていな い細胞と評価されることが可能である。 また、 グリピカン 3分子の N末端の部分ポリべ プチドに結合する抗グリピカン 3抗体では検出されないが、グリビカン 3分子の C末端 の部分ポリぺプチドに結合する抗グリピカン 3抗体を用いて検出されるダリピカン 3 分子は、その成熟ィ匕の程度という観点から、 より成熟化されている分子と評価されるこ とが可能であり、そのようなグリピカン 3分子を発現する肝癌細胞は、 より成熟化され ている細胞と評価されることが可能である。
[ 0 0 3 9 ]
グリビカン 3分子の N末端の部分ポリペプチドに結合する抗グリビカン 3抗体と、グ リピカン 3分子の C末端の部分ポリペプチドに結合する抗グリビカン 3抗体とが互い に異なる抗体のサブクラスに属する場合、あるいは異なる種類の動物で生成されたもの である場合には、 1つの組織標品を用いて測定を行うことが可能である。 この場合にお いては、 N末端の部分ポリペプチドに結合する抗グリビカン 3抗体を認識する二次抗体 と、 C末端の部分ポリペプチドに結合する抗グリピカン 3抗体を認識する二次抗体とを、 異なる種類の酵素または蛍光で標識することにより、 1つの組織標品上で 2種類の抗グ リビカン 3抗体を用いる検出が可能となる。
[ 0 0 4 0 ]
抗グリピカン 3抗体との反応性の数値化
本発明は抗原賦活化反応（すなわち、熱誘導抗原賦活化法およびプロテアーゼ抗原賦 活化法） の相違に基づいて、 グリピカン 3と抗グリビカン 3抗体とから形成される抗原 抗体複合体の顕微鏡下での検出の程度および態様の相違を数値化する方法を提供する。
[ 0 0 4 1 ]
1つの態様においては、 数値化は以下の式 （1 ) ；
I RCp= P R + ( S I— C p ) + S P
[式中、
I RCpは、 グリピカン 3の発現量スコアであり、
P Rは、 検鏡下で前記複合体が検出される細胞の割合をスコア化した数値であり、
S I 一 C pは、検鏡下で前記複合体が視野中細胞の細胞質において検出される染色強度 をスコア化した数値であり、
S Pは、検鏡下での視野中細胞の細胞膜において完全な膜染色を示す細胞の割合をスコ ァ化した数値である]
にしたがって行う。
P Rのスコアは、
( a ) 4倍または 1 0倍の対物レンズを用いた検鏡下での視野中細胞のうち；
( i ) 前記複合体が検出される細胞の割合がゼロの検体のスコアを 0、
( i i ) 当該割合が 2 0 %未満の検体のスコアを 1、
( i i i ) 当該割合が 2 0 %以上で 5 0 %未満の検体のスコアを 2、
( i V ) 当該割合が 5 0 %以上の検体のスコアを 3として算出し、
S I— C pのスコアは、
( b ) 検鏡下での視野中細胞の細胞質において、 ( i )前記頭鏡が 4倍または 10倍の対物レンズを用いられた場合に前記複合体が検出 される細胞の割合がゼロの検体のスコアを 0、
( i i)前記頭鏡が 10倍の対物レンズを用いられた場合に不明りようであるがうつす らと陽性反応が認められる検体のスコアを 1、
(i i i) 4倍の対物レンズでうつすらと陽性反応が認められる検体のスコアを 2、 ( i V) 4倍の対物レンズでも十分認識可能である陽性反応が認められる検体のスコア を 3、
(V) 4倍の対物レンズで、明確に認識され強い陽性反応が認められる検体のスコアを 4として算出し、
S Pのスコアは、
( c ) 検鏡下での視野中細胞の細胞膜における前記複合体の検出において、
( i ) 細胞膜における陽性反応が認められない検体のスコアを 0、
(i i)陽性反応が認められる細胞のうち 20 %未満の細胞が完全な膜染色を示す検体 のスコアを 1、
( i i i )陽性反応が認められる細胞のうち 20 %以上で 50 %未満の細胞が完全な膜 染色を示す検体のスコアを 2、
( i V)陽性反応が認められる細胞のうち 50 %以上の細胞が完全な膜染色を示す検体 のスコアを 3として算出する。
[0042]
別の態様においては、 数値化は以下の式 （2) ；
I RCm=PR+ (S I— Cm) +SP
[式中、
I RCmは、 グリピカン 3の膜局在スコアであり、
P Rは、 検鏡下で前記複合体が検出される細胞の割合をスコア化した数値であり、
S I一 Cmは、検鏡下で前記複合体が視野中細胞の細胞膜において検出される染色強度 をスコア化した数値であり、
S Pは、検鏡下での視野中細胞の細胞膜において完全な膜染色を示す細胞の割合をスコ ァ化した数値である]
にしたがって行う。
PRのスコアは、
(a) 4倍または 10倍の対物レンズを用いた検鏡下での視野中細胞のうち；
( i ) 前記複合体が検出される細胞の割合がゼロの検体のスコアを 0、
( i i ) 当該割合が 20%未満の検体のスコアを 1、
( i i i ) 当該割合が 20%以上で 50%未満の検体のスコアを 2、
( i V) 当該割合が 50%以上の検体のスコアを 3として算出し、
S I—Cmのスコアは、 ( b ) 検鏡下での視野中細胞の細胞膜において、
( i )前記顕鏡が 4倍または 1 0倍の対物レンズを用いられた場合に前記複合体が検出 される細胞の割合がゼロの検体のスコアを 0、
( i i )前記顕鏡が 1 0倍の対物レンズを用いられた場合に不明りようであるがうつす らと陽性反応が認められる検体のスコアを 1、
( i i i ) 4倍の対物レンズで不明りょうであるが 1 0倍の対物レンズで十分認識可能 である陽性反応が認められる検体のスコアを 2、
( i V ) 4倍の対物レンズでも十分認識可能である陽性反応が認められる検体のスコア を 3、
( V ) 4倍の対物レンズで、 明確に認識され強い陽性反応が認められる検体のスコアを 4として算出し、
S Pのスコアは、
( c ) 検鏡下での視野中細胞の細胞膜における前記複合体の検出において、
( i ) 細胞膜における陽性反応が認められない検体のスコアを 0、
( 1 1 )陽性反応が認められる細胞のうち 2 0 %未満の細胞が完全な膜染色を示す検体 のスコアを 1、
( i i i )陽性反応が認められる細胞のうち 2 0 %以上で 5 0 %未満の細胞が完全な膜 染色を示す検体のスコアを 2、
( i v )陽性反応が認められる細胞のうち 5 0 %以上の細胞が完全な膜染色を示す検体 のスコアを 3として算出する。
[ 0 0 4 3 ]
この場合において、熱誘導抗原賦活化法が施された組織標品と、 プロテアーゼ抗原賦 活化法が施された組織標品のそれぞれについて、 上述の式 （1 ) および式 （2 ) に基づ いて算出されるスコアが決定される。 式（1 ) に基づいて算出されるスコアはグリピ力 ン 3の発現量を反映したスコアであり、 式（2 ) に基づいて算出されるスコアはグリピ カン 3の細胞膜での発現の局在を反映したスコアである。本発明の数値化の方法に基づ けば、被験体に存在する肝癌細胞をグリピカン 3の発現量や発現の態様に基づいて分類 することが可能となる。下記の実施例に示されるように、実際の肝癌患者から採取され た組織標品を用いて分類が有効に実施されることが確認された。 さらに、 ダリピカン 3 の発現量が決定されている肝癌細胞株である H u H— 7または H e p G 2を移植した 肝癌動物モデルにおいても、 当該分類が有効に実施されることが確認された。
[ 0 0 4 4 ]
さらに本発明において、肝癌動物モデルに対して治療用抗グリビカン 3抗体を投与し た結果、本発明の方法にしたがって数値化により分類された肝癌におけるダリビカン 3 の発現量および発現態様の相違と、治療用抗グリビカン 3抗体による肝癌の洽療に対す る効果の相違が互いに相関することが実証された。すなわち、本発明にしたがって数値 化されたスコアの相違に基づいて、治療用抗グリビカン 3抗体の治療効果の相違が判断 されることが示された。本発明にしたがう数値化の方法に基づけば、抗グリビカン 3抗 体を有効成分として含む肝癌治療剤を用いた肝癌治療の効果を予測することが可能と なる。 また、 本発明にしたがう数値化の方法に基づけば、 抗グリビカン 3抗体を用いた 肝癌治療において所望の効果を得るために必要な治療用抗グリピカン 3抗体の必要投 与量を決定することができる。
実施例
[0045]
以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により 限定されるものではない。
[0046]
(実施例 1 )
ダリビカン 3を発現するヒト肝癌細胞株のマウス腹部皮下への移植モデルを用いたグ リビカン 3の免疫染色
(1) 細胞株
肝癌細胞株として HuH- 7細胞 （ヒューマンサイエンス研究資源バンク） 、 HepG2細胞 (ATCC) が用いられた。 HuH- 7は、 10%FBS (BI0NET) を含む Dulbecco' s Modifid Eagl e's Medium培地 (SIGMA) にて、 HepG2は 10%FBS、 1 mmol/L MEM Sodium Pyruvate (In vi trogen) 、 1 mmol/L MEM Non-Essent ial Amino Acid (Invi trogen) を含む Minimum Essential Medium Eagle培地 (SIGMA) にて、 維持継代された。
[0047]
(2) GPC3発現量の測定
(2- 1) 測定方法
HuH- 7細胞および HepG2細胞における GPC3の発現量は、 マウス抗ヒト GPC3モノクロ —ナル抗体 （クローン名： GC33、 WO2006/O06693に記載される。 ） を用いて、 QIFI- Kit (DakoCytomation) により測定された。測定方法は付属の説明書に記載された方法が実 施された。
[0048]
使用された GC33抗体は室温にて溶解後、 PBSにて 1 mg/mlに調製された。 陰性対照 として、 凍結乾燥状態の mIgG2a (1バイアル分） が 500 1の 「日本薬局方 注射用水 大塚蒸留水」 に溶解されたものが用いられた。 5X105の各細胞が 98 1の 0.5 w/v% BSA (Sigraa-Aldrich) が添加された Cel 1 WASH細胞洗浄溶液 （べクトン ·ディツキンソ ン） （以下 FACS- PBSと指称される。 ） に懸濁された。 GC33および mIgG2aがそれぞれ 2 1および 5^ 1添加された当該各懸濁液が 4でにて 30分間静置された。 その後、 1ml の FACS- PBSが添加された当該各懸濁液が 4でにおいて 5000 rpmにて 1分間の遠心分離 操作に供されることにより細胞が分画された。 当該細胞は 98 1の FACS- PBSに再び懸 濁された。
[0049]
また前記の操作と並行して以下の操作も行われた。 QIFIKITに付属しているキヤリブ レ一シヨンビーズおよびセッ卜アップビーズ 100 1に lmlの FACS- PBSが添加され、 4t: において 5000 i"pmにて 1分間の遠心分離操作により洗浄された。 当該ビーズは 98 1 の FACS- PBSに懸濁された。 前記の細胞およびビーズに対して QIFIKITに付属している FITC標識ャギ抗マウス抗体が各 2 1ずつ添加され、 当該細胞およびビーズが 4T:にて 45分間の反応に供された。 次に lmlの FACS-PBSが添加された前記の反応液が にお いて 5000 rpmにて 1分間の遠心分離操作に供された。 沈降された細胞およびビーズは lmlの FACS-PBSに懸濁された。全自動細胞解析装置 EPICS- XL (Beckman Coulter) を用 いて、標識されたセットアップビーズの測定により生じる 2つのピークが測定画面内に 入るように出力が調整された。全自動細胞解析装置 EPICS- XLを用いて GC33抗体が反応 に供された細胞サンプル、 mIgG2aが反応に供された細胞サンプル、 およびキヤリブレ —シヨンビーズが発する各蛍光の Mean fluorescence Intensity (MFI) 値が測定され た。 キャリブレーションビーズの 5つの MFI値と Antibody- Binding Capacity (ABC) 値を基礎として Microsoft Office Excel 2003 SP2 (Microsoft Corporation) を用い て最適直線が作図された。当該直線の検量線に各細胞の MFI値を代入されて ABC値が求 められた。 GC33抗体が反応に供されたサンプルの ABC値から mIgG2aが反応に供された サンプルの ABC値を引いた値が抗体結合部位数とされた。
[0050]
その結果、 HuH-7におけるグリピカン 3の発現量は、 細胞当たり 1.25X105分子であ つた。 HepG2におけるグリピカン 3の発現量は、 細胞当たり 9.67X 105分子であった。
[005 1]
(3) ヒト肝癌細胞株のマウス腹部皮下への移植モデルの作製
HuH- 7および HepG2の各細胞が、 （1) に記載されるその維持継代用の培地と MATRI GEL Matrix (BD Bioscience) を等量含む溶液にて 1 ml当たり 5X107細胞になるよう に調製された。各細胞のマウスへの移植前日に、予め抗ァシァロ GM 1抗体（和光純薬、 1バイアルの内容物が lmlの蒸留水に溶解され更に 4mlの生理食塩水によって希釈さ れた。 ） 100 1がォスで 5週齢の SC I Dマウス （日本クレア） の腹腔内へ投与され た。 当該抗ァシァロ GM1抗体 （和光純薬） は、 1バイアルの内容物が lmlの蒸留水 に溶解され更に 4mlの生理食塩水によって希釈されることによって調製された。 その 翌日、 当該マウスの腹部皮下へ 100 1の当該各細胞懸濁液 （すなわち、 マウス一匹当 たり 5X106細胞） が移植された。
[0052],
(4) 腫瘍組織切片の作製法の検討
( 3 )で作製した HepG2の移植モデルより採取された均一な移植組織片が手術用メス を用いて四等分された。 その内の一断片が 10%中性緩衝ホルマリンで 24時間固定され た。 固定化された組織片はその後自動包埋装置 ETP- 150C (サクラファインテックジャ パン） を用いてパラフィン包埋され、 4Tにて保存された （A法） 。
[ 0 0 5 3 ]
次に、 別の一断片は 4%パラホルムアルデヒドを含有する PLP固定液 （10mM濃度の N aI04、 75mM濃度のリジン、 37. 5mM濃度のリン酸緩衝液、 2 農度のパラホルムアルデヒ ド） を用いて 4でにおいて 6時間固定された後に PBS (リン酸緩衝生理食塩水、 10mM、 p H7. 4) にて 4でにおいて洗浄された。 次いで当該断片が 4でにおいて終夜および室温に おいて 2時間アセトン中にて脱水された。 さらに、 当該断片は安息香酸メチルで一時間 およびキシレンで一時間清浄化され、 前記同様パラフィンに包埋され、 4でにて保存さ れた （B法） 。
[ 0 0 5 4 ]
A法、および、 B法で作製されたパラフィン包埋標品は免疫組織染色の適用直前にク リオスタツトミクロトーム上で薄切され、風乾された後に脱パラフィン処理され染色に 供された。
[ 0 0 5 5 ]
次に、別の一断片は PLP固定液を用いて 4T:において 6から 8時間浸漬された後に 4で において段階的ショ糖濃度を有する PBSに順次浸潤された （10%ショ糖濃度の PBSで 4 時間、 15%ショ糖濃度の PBSで 4時間、 および 20%ショ糖で終夜の期間） 。 次いで当 該断片が Ti ssue- Tek OCT compound (Sakura Finetechnical) 中に包埋されドライアイ スァセトン浴中で凍結された。凍結されたプロックはクリオスタツトミクロト一ム上で 薄切され、 薄切切片は風乾後— 80でにて保存された （C法） 。
[ 0 0 5 6 ]
別の一断片は Ti ssue- Tek OCT co即 ound中に 4でにおいて包埋されドライアイスァ セトン浴中で凍結された。凍結されたブロックはクリオス夕ットミクロトーム上で複数 の切片に薄切された後に、 当該切片は風乾され下記の異なる方法で固定化された。その 内の一切片は 4でにおいて 4%パラホルムアルデヒド中で 30分固定された （D法） 。別 の一切片は 4でにおいてアセトン中で 10分固定された （E法） 。 更に別の切片は室温 において 10%中性緩衝ホルマリン中で 30分固定された （F法） 。 D法、 E法および F 法による固定化切片はトリス緩衝生理食塩水 （TBS、 50mM、 pH7. 4) を用いて 5分間、 3 回洗浄された後に風乾され一 80でにて保存された。
[ 0 0 5 7 ]
前記のように調製された組織切片が以下に示す免疫組織化学的染色に用いられた。一 次抗体として、 GC33抗体 (IgG2a) または 1G12抗体 (Bi oMosai c, IgGl) がそれぞれ 2. 5 t g/mlおよび l . O z g/mlの濃度で使用された。 染色に際して、 染色に必要な試薬は L SAB-2ki t (Dako Cytomat ion)に同梱された試薬が使用された。 染色方法はキット付属の 説明書に記載の方法が実施された。固定化時間が短時間だったため抗原賦活化は実施さ れなかった。かかる免疫組織化学的染色過程において形成された抗原抗体複合体は、ぺ ルォキシダーゼージァミノべンジジン （MB) 反応により可視化された。 対比染色とし てはへマトキシリンが用いられた。 なお、 一次抗体の対照抗体として、 GC33の場合に はマウス IgG2および 1G12の場合には IgGlが使用された。 各方法当たり 3例ずつが評 価され、 その結果が表 1に示されている。
[0058]
1]
Figure imgf000021_0001
A 24時間固定、 抗原賦活化無処理
B ： 2· 4時間固定、 ォ一トクレーブによる ¾t原賦活化処理
C： 24時間固定、 マイクロウエーブによる抗原賦活化処理
D： 2· 4時間固定、 プロテアーゼ処理による抗原賦活化処理
E ： 7日間固定、 抗原賦活化無処理
F ： 7日間固定、 オートクレープによる抗原賦活化処理
[0059]
免疫染色における染色性は、以下に示すようなパラメーターによってグレード化され た。 すなわち；
PR (陽性細胞率） グレードについて；
4倍または 10倍の対物レンズを用いた検鏡下での視野中細胞のうち；
( i ) 前記複合体が検出される細胞の割合が 50 %以下の標品を 「L」 、
( i i )前記複合体が検出される細胞の割合が 50%以上 70%未満の標品を「MLJ、 (i i i)前記複合体が検出される細胞の割合が 70 %以上で 90 %未満の標品を「M
H」 、
( i v) 前記複合体が検出される細胞の割合が 90%以上の標品を 「HJ 、 として PRのグレードが決定され、
S I (染色強度スコア） について；
( i ) 軽微陽性の染色を示す標品を 「+lJ 、
( i i) 弱陽性の染色を示す標品を 「+2」 、 ( i i i )中程度陽性またはノおよび強陽性を伴う、弱陽性の染色を示す標品を「+ 3」、
( i V) 中程度陽性の染色を示す標品を 「+4」 、
(V) 強陽性の染色を示す標品を 「+5j 、
として S Iのスコアが決定され、
S P (細胞膜染色性） について；
4倍または 10倍の対物レンズを用いた検鏡下での視野中細胞のうち；
( i ) 細胞が細胞膜の一部のみ染色される標品を 「I」 、
(1 1)ほとんどの細胞の細胞膜の一部が染色され、一部の細胞の細胞膜が円周状に染 色される標品を 「I I」 、
(i i i) ほとんどの細胞の細胞膜が円周状に染色される標品を 「I I I」 、 として S Pのスコアが決定された。
[0060]
S Iのスコアの各グレード （+1、 +2、 +4および +5) の標準染色像が図 1に示 される。 Aは S Iが + 1の標品を、 Bは S Iが +2の標品を、 SS Iが +4の標品を、 Dは S Iが + 5の標品をそれぞれ示す。 また、 SPのスコアの各グレード （+ 1、 + I Iおよび + I I I) の染色像が図 2に示される。 Aは S Pが Iの標品を、 Bは S Iが I I Iの標品をそれぞれ示す。
[0061]
C法から F法のいずれの方法で調製された標品の S Iおよび S Pのグレードは共に 低く、 十分な染色像が得られていないことが示された。 また、 当該標品における形態的 な構造も保存されていなかった。 A法と B法との比較においては、 B法で調製された標 品の S Iおよび SPのグレードがいずれも高く （S Iが +3から +5で、 ？が1 Iま たは I I I) 、 PRグレードも 90¾以の細胞が陽性 （H) と判定された。 一方、 A法で は S Iが +3から +5で、 SPが Iまたは I Iと判定され、 PRグレードも Lないし M Hと判定された。 GC33抗体と 1G12抗体の相違という点では、 GC33抗体はいずれも 1G1 2抗体よりもより強い染色像を与えた。
[0062]
( 5 ) 腫瘍組織切片の作製の際の固定化時間および抗原賦活化法の検討
( 3 )で作製した HepG2の移植モデルより採取された均一な移植組織片の固定化時間 が以下のように検討された。 （4) で記載された A法における 10%中性緩衝ホルマリ ンによる固定時間を 24時間と 7日間とした標品が調製された。 また、 それぞれの固定 時間で調製された標品は、 以下に記載されるォ一トクレーブ、 マイクロウエーブ、 プロ テアーゼのうちのいずれかの賦活化法によりそれぞれ賦活化された。 target retrieva
1 solution, pH6 (DAKO) が 10倍希釈された溶液中で標品を 121でにおいて 10分間の オートクレープ処理することによって、オートクレープにより賦活化された標品が調製 された。 同一溶液中において標品を 4回、 780Wにて 5分間加熱することによりマイク 口ウェーブにより賦活化された標品が調製された。 Hi s tof i neHer2 ki t (MONO) (二チレ ィバイオサイエンス） に付属の AR試薬によって室温にて 5分反応された標品もまた別 に調製された。
[ 0 0 6 3 ]
前記のように調製された組織切片が以下に示す免疫組織化学的染色に用いられた。一 次抗体として、 GC33抗体 （IgG2a) または 1G12抗体 （Bi oMosai c、 IgGl) がそれぞれ 2. 5 g/mlおよび 1. 0 g/mlの濃度で使用された。 染色に際して、 染色に必要な試薬は L SAB-2ki tに同梱された試薬が使用された。 染色方法はキット付属の説明書に記載の方 法が実施された。固定化時間が短時間だったため抗原賦活化は実施されなかった。かか る免疫組織化学的染色過程において形成された抗原抗体複合体は、ペルォキシダーゼ - ジァミノべンジジン （DAB) 反応により可視化された。 対比染色としてはへマトキシリ ンが用いられた。 なお、 一次抗体の対照抗体として、 GC33の場合にはマウス IgG2およ び 1G12の場合には IgGlが使用された。各固定化時間および各賦活化反応が適用された 標品当たり 3例ずつが評価され、その結果が表 2に示されている。抗原賦活化法の比較 において、マイクロウエーブ法はオートクレープ法よりも若干優れた S Iおよび S Pグ レードを示す結果を与えた。一方、 プロテア一ゼ法による抗原賦活化処理がされた標品 は、その P Rグレ一ドおよび S Iスコアとともに S Pスコアにおいてもその他の抗原賦 活化処理がされた標品よりも優れた染色性を示した。
[0064]
[表 2]
Figure imgf000024_0001
A： 24時間固定 抗原賦活化無処理
B ： 24時間固定、 ォー'トクレーブによる抗原賦活化処理
C： 24時間固定 マイクロウエーブによる抗原 ^化処理.
D： 24時間固^、 プロテアーゼ処理による抗原賦活化処理
E： 7日'.間固定、 抗原 ·賦活化無処理
F ： 7日.間固定、 オートクレープによる抗原賦 化処理
G： 7日間固^、マイクロウェーブによる抗原賦活化処理
H： 7日間 @¾、プロテア一ゼ 理による抗原 活化処理
[0065]
(6) 腫瘍組織切片の免疫組織化学染色
(6- 1) 組織標品の作製および染色
(2) で作製した移植モデルより採取された移植組織片が 10%中性緩衝ホルマリンに 7日間浸漬することによって固定され、 次いで常法に従い当該組織片のパラフィン包埋 プロック標本が作製された。このブロック標本より薄切された組織切片が以下に示す免 疫組織化学的染色に用いられた。
[0066]
一次抗体として、 GC33抗体 （IgG2a) が使用された。 染色に際して、 染色に必要な試 薬はヒストファイン HER2キット （MONO) (ニチレイバイオサイエンス） に同梱された 試薬が使用された。 一次抗体として GC33抗体を使用した以外は、 染色方法はキット付 属の説明書に記載の方法が実施された。 なお、 抗原賦活化処理としては、 プロテアーゼ 処理（同キッ卜に付属しているプロテアーゼを用いて室温にて 5分間の反応に供する処 理） または、 10倍希釈した Target Retrieval Solution (DakoCytomat ion) 中で 121"C にて 10分間ォ一トクレーブ処理が実施された。 かかる免疫組織化学的染色過程におい て形成された抗原抗体複合体は、 ペルォキシダーゼージァミノべンジジン （DAB) 反応 により可視化された。対比染色としてはへマトキシリンが用いられた。 なお、 一次抗体 の対照抗体として、 マウス IgG2が使用された。
[0067]
(6-2) 染色結果の評価
マウス抗ヒトグリビカン 3抗体を用いた免疫染色による染色性が、下記に示される 3 つのパラメ一夕一 （陽性細胞率： PR、 染色強度： S I、 細胞膜染色パターン： SP) によって評価された。
[0068]
すなわち；
P R (陽性細胞率） 値を；
4倍または 10倍の対物レンズを用いた検鏡下での視野中細胞のうち；
( i ) 前記複合体が検出される細胞の割合がゼロの検体のスコアを 0、
( 1 1) 当該割合が 20%未満の検体のスコアを 1、
(i l l) 当該割合が 20%以上で 50%未満の検体のスコアを 2、
( i V) 当該割合が 50%以上の検体のスコアを 3として PRのスコアを算出し、 細胞質の染色性を反映する （S I -Cp) (細胞質染色強度） 値を；
検鏡下での視野中細胞の細胞質において、
( i )前記検鏡が 4倍または 10倍の対物レンズを用いられた場合に前記複合体が検出 される細胞の割合がゼロの検体のスコアを 0、
( i Π前記検鏡が 10倍の対物レンズを用いられた場合に不明りようであるがうつす らと陽性反応が認められる検体のスコアを 1、
( i i i ) 4倍の対物レンズでうつすらと陽性反応が認められる検体のスコアを 2、 ( i v) 4倍の対物レンズでも十分認識可能である陽性反応が認められる検体のスコア を 3、
(V) 4倍の対物レンズで、 明確に認識され強い陽性反応が認められる検体のスコアを 4として S I—C pのスコアを算出し、
細胞膜の染色性を反映する （S I— Cm) (細胞膜の染色強度） 値を；
検鏡下での視野中細胞の細胞膜において、
( i )前記検鏡が 4倍または 10倍の対物レンズを用いられた場合に前記複合体が検出 される細胞の割合がゼロの検体のスコアを 0、
( i i)前記検鏡が 10倍の対物レンズを用いられた場合に不明りようであるがうつす らと陽性反応が認められる検体のスコアを 1、
( i i i) 4倍の対物レンズ不明りようであるが 10倍の対物レンズで十分認識可能で ある陽性反応が認められる検体のスコアを 2、
( i V) 4倍の対物レンズでも十分認識可能である陽性反応が認められる検体のスコア を 3、
(V) 4倍の対物レンズで、明確に認識され強い陽性反応が認められる検体のスコアを 4として S I—Cmのスコアを算出し、
S P (細胞膜染色パターン） 値を；
検鏡下での視野中細胞の細胞膜における前記複合体の検出において、
( i ) 細胞膜における陽性反応が認められない検体のスコアを 0
(i i)陽性反応が認められる細胞のうち 20 %未満の細胞が完全な膜染色を示す検体 のスコアを 1
( i i i )陽性反応が認められる細胞のうち 20 %以上で 50 %未満の細胞が完全な膜 染色を示す検体のスコアを 2
( i V)陽性反応が認められる細胞のうち 50 %以上の細胞が完全な膜染色を示す検体 のスコアを 3として S Pのスコアを算出する；
方法によって各パラメ一夕一が数値化された。なお、 S I一 Cmを用いて算出されるト —タルスコアは I RCB S I—Cpを用いて算出されるトータルスコアは I RCpと表記 された。
[0069]
(6-3) 染色性の評価
HuH- 7および HepG2が移植された動物モデルから由来する組織標品がォートクレーブ 処理された場合の染色像が図 3に示される。 Aは HuH— 7移植モデルから調製された 切片にォートクレーブ処理による熱誘導抗原賦活化処理をした標品の染色像を、 Bは H uH- 7移植モデルから調製された切片にプロテア一ゼ抗原賦活化処理をした標品の 染色像を、 Cは He pG 2移植モデルから調製された切片にォ一トクレーブ処理による 熱誘導抗原賦活化処理をした標品の染色像を、 Dは He pG 2移植モデルから調製され た切片にプロテア一ゼ抗原賦活化処理をした標品の染色像を表す。
[0070]
また、 個別の染色パラメ一夕一のスコアが表 3に示されている。 HuH- 7および HepG2 が移植された動物モデルから由来する組織標品から算出される IRCpの値はいずれも 7 で、 HuH- 7と HepG2間でその値の差は観察されなかった。 また、 それらの IRCllの値はい ずれも 5であり、 両者間でその値の差はみられなかった。 （表 3および図 3)
[0071]
ほ 3]
Figure imgf000026_0001
[0072]
一方、 HuH- 7および HepG2が移植された動物モデルから由来する組織標品に対してプ 口テア一ゼ処理が施された場合の個別の染色パラメ一夕一のスコアも表 3に示されて いる。プロテアーゼ処理が施された組織標品から得られる S I—C mおよび S I - C p のスコアは、オートクレープ処理された標品から得られるそれらの値と比べて高い傾向 が観察された。 個別の染色パラメ一夕一から算出されるトータルスコアとしては、. HuH -7および HepG2が移植された組織標品から得られた I RCpの値は、 それぞれ 4および 8 であった。また、 HuH-7および HepG2が移植された組織標品から得られた I RCllの値は、 それぞれ 4および 9であった（表 3および図 3 )。図 3最下段の写真に示されるように、 プロテアーゼ処理した組織標品が染色された場合にあっては、ダリビカン 3を発現して いない細胞、 グリピカン 3を中等度に発現した細胞、 グリピカン 3を強く発現した細胞 がそれぞれ明確に区別され得る。 これに対して、 ォ一トクレーブ処理された組織標品を 染色した場合にあっては、 そのような定量性が得られなかった。更に、 オートクレープ 処理された組織標品を染色した場合にあっては、炎症細胞等に対する非特異的反応が頻 繁に認められた。
[ 0 0 7 3 ]
以上の結果から、ォ一トクレーブ処理と比較してプロテア一ゼ処理による抗原賦活化 は、 グリピカン 3の発現量の違いがより正確に反映される方法であることが示された。 また、組織標品の細胞膜の染色性の観点からは、 ォ一トクレーブ処理と比較してプロテ ァーゼ処理が優れていることが明らかとされた。
[ 0 0 7 4 ]
(実施例 2 )
ヒト肝細胞癌組織標品を用いた GPC3免疫染色におけるプロテアーゼによる抗原賦活化 効果
( 1 ) ヒト肝細胞癌サンプルにおける免疫組織化学染色
( 1 - 1 ) 標本作製および染色方法
ヒト肝細胞癌サンプルが 1( ^中性緩衝ホルマリンに一定時間以上浸漬固定された。次 に、常法に従いパラフィン包埋ブロック標本が作製された。上記ブロック標本より薄切 された組織切片が免疫組織化学的染色に用いられた。免疫組織化学染色は実施例 1と同 様の手法により、 実施された。
[ 0 0 7 5 ]
( 1 - 2 ) 染色結果の評価方法
実施例 1 ( 6— 2 ) の記載に基づいて、 マウス抗ヒト GPC3抗体免疫染色による染色 性が下記に示される 3つのパラメ一夕一 （陽性細胞率： P R、 染色強度： S I、 細胞膜 染色パターン： S P ) によって評価された。
[ 0 0 7 6 ]
すなわち；
P R (陽性細胞率） 値を；
4倍または 1 0倍の対物レンズを用いた検鏡下での視野中細胞のうち； ( i ) 前記複合体が検出される細胞の割合がゼロの検体のスコアを 0、
(i i) 当該割合が 20%未満の検体のスコアを 1、
(i i i) 当該割合が 20%以上で 50%未満の検体のスコアを 2、
( i V) 当該割合が 50%以上の検体のスコアを 3として PRのスコアを算出し、 細胞質の染色性を反映する （S I— Cp) (細胞質染色強度） 値を；
検鏡下での視野中細胞の細胞質において、
( i )前記検鏡が 4倍または 10倍の対物レンズを用いられた場合に前記複合体が検出 される細胞の割合がゼロの検体のスコアを 0、
( i i)前記検鏡が 10倍の対物レンズを用いられた場合に不明りようであるがうつす らと陽性反応が認められる検体のスコアを 1、
(i i i) 4倍の対物レンズでうつすらと陽性反応が認められる検体のスコアを 2、 ( i V) 4倍の対物レンズでも十分認識可能である陽性反応が認められる検体のスコア を 3、
(V) 4倍の対物レンズで、 明確に認識され強い陽性反応が認められる検体のスコアを 4として S Iのスコアを算出し、
細胞膜の染色性を反映する （S I - Cm) (細胞膜の染色強度） 値を；
検鏡下での視野中細胞の細胞膜において、
( i )前記検鏡が 4倍または 10倍の対物レンズを用いられた場合に前記複合体が検出 される細胞の割合がゼロの検体のスコアを 0、
( i i)前記検鏡が 10倍の対物レンズを用いられた場合に不明りようであるがうつす らと陽性反応が認められる検体のスコアを 1、
(i i i) 4倍の対物レンズで不明りようであるが 10倍の対物レンズで十分認識可能 である陽性反応が認められる検体のスコアを 2、
( i V) 4倍の対物レンズでも十分認識可能である陽性反応が認められる検体のスコア を 3、
(V) 4倍の対物レンズで、 明確に認識され強い陽性反応が認められる検体のスコアを 4として S Iのスコアを算出し、
SP (細胞膜染色パターン） 値を；
検鏡下での視野中細胞の細胞膜における前記複合体の検出において、
( i ) 細胞膜における陽性反応が認められない検体のスコアを 0、
( i i )陽性反応が認められる細胞のうち 20 %未満の細胞が完全な膜染色を示す検体 のスコアを 1、
( i i i )陽性反応が認められる細胞のうち 20 %以上で 50 %未満の細胞が完全な膜 染色を示す検体のスコアを 2、
( i V)陽性反応が認められる細胞のうち 50 %以上の細胞が完全な膜染色を示す検体 のスコアを 3として S Pのスコアを算出する； 方法によって各パラメーターが数値化された。
[0077]
また、 併せて、 非特異的染色 （バックグラウンド） の程度 （炎症性細胞や間質の染色 性から判断される） についても評価が行われた。
[0078]
(1-3) 結果および結論
抗原賦活化処理をした標品の染色像が図 4に示される。 Aは症例 Aの検体から調製さ れた切片にォートクレーブ処理による熱誘導抗原賦活化処理をした標品の染色像を、 B は症例 Aの検体から調製された切片にプロテアーゼ抗原賦活化処理をした標品の染色 像を、 Cは症例 Bの検体から調製された切片にォ一トクレ一ブ処理による熱誘導抗原賦 活化処理をした標品の染色像を、 Dは症例 Bの検体から調製された切片にプロテアーゼ 抗原賦活化処理をした標品の染色像を、 Eは症例 Cの検体から調製された切片にォート クレーブ処理による熱誘導抗原賦活化処理をした標品の染色像を、 Fは症例 Cの検体か ら調製ざれた切片にプロテァーゼ抗原賦活化処理をした標品の染色像をそれぞれ表す。
[0079]
図 4および表 4に示されるように、オートクレープ処理がされた組織標品においては、 症例 A、 B、 Cいずれも図中の肝細胞癌領域において、 PRのスコアが 3 (50%以上 の領域で陽性） であった。 また、 膜染色強度および膜染色パターンについては、 症例 A および Bでは、 膜局在がみられなかった （S I—Cm=0および S P— Cm=0) のに 対し、 症例 Cでは、 膜発現が認められ、 スコアはそれぞれ S I— Cm=l、 SP— Cm =2であった。 なお、 いずれの症例でも、 炎症性細胞や間質において、 図 4症例 Bの写 真に示されるような非特異的陽性反応が認められる傾向があった。
[0080]
4]
Figure imgf000029_0001
[0081]
一方、 プロテアーゼ処理がされた組織標品においては、 PRのスコアが症例 Aでは、 1 (20%未満の領域が陽性） 、 症例 Bでは 2 (20— 50 %の領域で陽性） 、 症例 C では 3 (50%以上の領域で陽性） であった。 また、 膜染色強度および膜染色パターン については、症例 Aの各スコアは S I— Cm=lおよび SP— Cm=lであった。 また 症例 Bの各スコアは、 S I一 Cm= 3および S P— Cm=2であった。症例 Cにおいて は、 明瞭な膜発現が認められ、 その各スコアはそれぞれ S I— Cm=4、 SP— Cm =
3であった。 なお、 ォ一トクレーブ処理がされた組織標品とは異なり、 プロテアーゼ処 理がされた組織標品では、 非特異的陽性反応はほとんど認められなかった。
[0082]
以上の結果から、オートクレープと比較してプロテアーゼ処理による抗原賦活化法は、 臨床肝細胞癌サンプルを用いた GPC3免疫染色において、 GPC3の発現量の違いをより正 確に反映する方法である可能性が示唆された。 また、 細胞膜染色性についても、 プロテ ァーゼ処理が優れていることが明らかとなった。 さらに、 プロテア一ゼ法では、 非特異 的陽性反応が最小限であることから、 抗 GPC3抗体による特異的陽性反応をより的確に 捉えることが可能であることが示された。
[0083]
(実施例 3 )
GPC3発現ヒト肝癌細胞株移植マウスモデルに対する抗 GPC3抗体の薬効
(1) 細胞株
移植に供する細胞として HuH- 7細胞および HepG2細胞が用いられた。 HuH-7細胞は 蕭 BS (BI0NET) を含む Dulbecco's Modi fid Eagle's Medium培地 (SIGMA) 中で、 HepG2 細胞は層 BS、 1 mmol/1 MEM Sodium Pyruvate (Invi trogen) , 1誦 ol/l MEM Non-Essent ial Amino Acid (Invi trogen) を含む Minimum Essent ial Medium Eagle培地 (SIGMA) 中で、 それぞれ維持継代された。
[0084]
(2) ヒト肝癌細胞株移植マウスモデルの作製
各細胞が、 上述の継代用培地と Matrigel Matrix (BD Bioscience) とをそれぞれ等 量含む溶液を用いて 1ml 当たり 5X107個細胞になるように調製された。 細胞の移植前 日に、 あらかじめ lOO tl の抗ァシァロ GM1抗体 （和光純薬、 1バイアルが 5ml の PBSで溶解されたもの） がその腹腔内へ投与された SC I Dマウス （ォス、 5週齢、 日 本クレア） の腹部皮下へ、 100 1 の当該細胞懸濁液が移植された。 すなわち、 マウス 一匹当たり 5X106細胞が投与された。 腫瘍体積は以下の式にて算出され、 腫瘍体積の 平均が 117〜330匪3になった時点でモデルが成立したものとした。
式 1 ：腫瘍体積 =長径 X短径 X短径 /2
[0085]
(3) 投与抗体の調製
治療用抗体として、 ヒト化抗ヒト GPC3モノクローナル抗体 （クローン名： hGC33、 公 開出願 WO2006/006693に記載されている。 ） が投与の当日に、 濾過滅菌された PBSを 用いて、 0.5 nig/ml、0· 1 mg/mlまたは 0.05 mg/mlになるように調製され、それぞれ 5 mg/kg 投与群、 1 mg/kg投与群、 0.5 mg/kg投与群に対する投与試料として用いられた。
[0086]
(4) 抗体投与
( 2 )で記載したように作製された HuH- 7細胞移植マウスモデルに対してはその移植 後 20日目より、 HepG2細胞移植マウスモデルに対してはその移植後 26日より、 それぞ れ週に 1 回ずつ、 三週間の間にわたり、 上記 （3) で調製された投与試料が 10 ml /kg の用量で尾静脈より投与された。 陰性対照として、 濾過滅菌した PBS (Vehicle) が前 記と同様に週に 1 回ずつ、 三週間の間にわたり、 10 ml/kgの用量で尾静脈より投与さ れた。 いずれの群も、 1群当たり 5〜6匹のマウスから構成された。
[0087]
(5) 抗腫瘍効果の評価
hGC33抗体のヒト肝癌移植マウスモデルにおける抗腫瘍効果が、 腫瘍体積の継時変化 (図 5A) および最終投与日より一週間後の腫瘍湿重量 （図 5 B) で評価された。 図 5 Aは、 He pG2移植マウスモデルにおける腫瘍体積の継時変化を表す図である。菱形 はべヒクルを投与した群、 四角は hGC33抗体を 1 mg/kgで投与した群、 丸は hGC33抗体 を 5 mg/kgで投与した群の腫瘍体積の経時変化を表す。 hGC33抗体を投与した時点を矢 印で示す。 図中 *は有意差検定による有意水準 Pが P〈0.05であることを表す。 また、 図中 **は有意差検定による有意水準 Pが P〈0.0001であることを表す。 図 5 Bは、 H uH— 7移植マウスモデルにおける腫瘍体積の維時変化を表す図である。菱形はべヒク ルを投与した群、四角は hGC33抗体を I mg/kgで投与した群、丸は hGC33抗体を 5 mg/kg で投与した群の腫瘍体積の経時変化を表す。 hGC33抗体を投与した時点を矢印で示す。 図中 *は有意差検定による有意水準 Pが P〈0.05であることを表す。 また、 図中 **は 有意差検定による有意水準 Pが P〈0.0001であることを表す。 図 5 Cは、 He pG2移 植マウスモデルにおける、最終投与日から一週間後の腫瘍湿重量を示す図である。図中 *は有意差検定による有意水準 Pが P〈0.05であることを表す。 また、 図中 **は有意 差検定による有意水準 Pが Ρ〈0· 0001であることを表す。 図 5Dは、 HuH— 7移植マ ウスモデルにおける、最終投与日から一週間後の腫瘍湿重量を示す図である。図中 *は 有意差検定による有意水準 Pが P<0.05であることを表す。 また、 図中 **は有意差検 定による有意水準 Pが P〈0.0001であることを表す。
[0088]
統計解析に際しては SAS前臨床パッケージ （SAS Institute) が用いられた。 最終測 定日の腫瘍体積が用いられて、有意差検定が Dunne 11型多重比較法によって評価された。 その結果、図 5 Aおよび図 5 Bに示すように、 hGC33抗体投与群における腫瘍の増殖は、 Vehicle投与群におけるそれと比較して有意に抑制されていることが認められた。また、 抗体の薬効は HepG2細胞移植モデルにおいて比較的強く、 HuH-7細胞移植モデルにおい ては比較的弱いことが明らかとなつた。
[ 0 0 8 9 ]
以上より、プロテアーゼ抗原賦活化法によって調製された組織標本の免疫組織染色に よる解析結果から抗原の発現量が高く、 細胞膜局在性の発現態様を示すと判定される HepG2細胞が移植されたマウスモデルに対して高い抗腫瘍効果を示すことが明らかとな つた。これに対して前記の解析結果から抗原の発現量が低いと診断される HuH-7細胞が 移植されたマウスモデルに対しては低レ ^抗腫瘍効果を示すことが明らかとなった。こう した相違は従来の熱誘導抗原賦活化法による解析では導き出すことができない結論で あり、従来の熱誘導抗原賦活化法とプロテアーゼ抗原賦活化法を組み合わせることによ つて GPC3抗体の薬効を有効に判断できることが明らかとなった。
[ 0 0 9 0 ]
本明細書中で引用した全ての刊行物、 特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書 中にとり入れるものとする。

Claims

請求の範囲
[1]
被験体における肝癌細胞の存在を検出するためのインビトロの免疫アツセィ方法であ つて、
(a)前記被験体から調製された後に、パラフィンに包まれて透過性の支持体に取り付 けられた、同一被験体より少なくとも二つの同視し得る一組の組織標品がパラフィン包 埋切片として提供され、
(b) 前記一組の組織標品の脱パラフィン処理が実施され、
(c)前記（b)処理が実施された同視し得る一組の組織標品の一方に対して熱誘導抗 原賦活化法による抗原賦活化処理が施され、他方に対してプロテア一ゼ抗原賦活化法に よる抗原賦活化処理が施され、
(d) 前記（c)処理が施された組織標品中に存するグリピカン 3と抗グリビカン 3抗 体との複合体の形成に適切な条件下で、当該標品に対して抗グリビカン 3抗体が接触さ れ、 （e) 複合体の存在が検出され、 ここで、 複合体が存在する場合に被験体において 肝癌細胞が存在すると判定される、
の各工程を含む方法。
[2]
前記熱誘導抗原賦活化法がマイクロ波による加熱である請求項 1に記載の方法。
[3]
前記熱誘導抗原賦活化法がオートクレープによる加熱である請求項 1に記載の方法。
[4]
前記プロテアーゼ抗原賦活化法に用いるプロテア一ゼが、 ペプシン、 トリプシンおよび プロテア一ゼ Kからなる群より選択される、 請求項 1から 3のいずれかに記載の方法。
[5]
複合体を検出するための検出反応が酵素反応である、請求項 1から 4のいずれかに記載 の方法。
[6]
前記抗グリピカン 3抗体がグリビカン 3の C末端ポリぺプチドに結合する抗体である、 請求項 1から 5のいずれかに記載の方法。
[7]
グリピカン 3の C末端ポリぺプチドが配列番号 1に記載の 359番目のアミノ酸から 580番目のアミノ酸からなるポリペプチド、 または、 375番目のアミノ酸から 58 0番目のアミノ酸からなるポリペプチドである請求項 6に記載の方法。
[8]
前記抗グリビカン 3抗体が GC 33抗体である請求項 6または 7に記載の方法。
[9] 前記抗グリビカン 3抗体が 1 G 12抗体である請求項 1から 5のいずれかに記載の方 法。
[10]
工程 （e) において、 複合体の存在が数値化されて検出される、 請求項 1から 9のいず れかに記載の方法。 .
[1 1]
前記数値化が以下の式；
I RCp=PR+ (S I -C p) +S P
[式中、
I RCpは、 グリピカン 3の発現量スコアであり、
PRは、 検鏡下で前記複合体が検出される細胞の割合をスコア化した数値であり、
S I— C pは、検鏡下で前記複合体が視野中細胞の細胞質において検出される染色強度 をスコア化した数値であり、
S Pは、検鏡下での視野中細胞の細胞膜において完全な膜染色を示す細胞の割合をスコ ァ化した数値である] にしたがって算出される、 請求項 10に記載の方法。
[12]
前記数値化が以下の式；
I RCm=PR+ (S I - Cm) +S P
[式中、
I RCnは、 グリピカン 3の膜局在スコアであり、
P Rは、 検鏡下で前記複合体が検出される細胞の割合をスコア化した数値であり、
S I一 Cmは、検鏡下で前記複合体が視野中細胞の細胞膜において検出される染色強度 をスコア化した数値であり、
S Pは、検鏡下での視野中細胞の細胞膜において完全な膜染色を示す細胞の割合をスコ ァ化した数値である]
にしたがって算出される、 請求項 10に記載の方法。
[13]
請求項 1 1および 12に記載の方法により算出されたスコアに基づいて、被験体に存在 する肝癌細胞を分類する方法。
[14]
請求項 1 1および 12に記載の方法により算出されたスコアに基づいて、被験体に抗グ リピカン 3抗体を含む抗癌剤を投与するか否かを決定する方法。
[15]
請求項 1 1および 12に記載の方法により算出されたスコアに基づいて、被験体に対す る肝癌治療における抗グリピカン 3抗体を含む抗癌剤の投与量を決定する方法。
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