WO2008066002A1 - Procédé de détection du virus de la mosaïque, ensemble d'amorces et nécessaire destinés à cette détection - Google Patents

Procédé de détection du virus de la mosaïque, ensemble d'amorces et nécessaire destinés à cette détection Download PDF

Info

Publication number
WO2008066002A1
WO2008066002A1 PCT/JP2007/072777 JP2007072777W WO2008066002A1 WO 2008066002 A1 WO2008066002 A1 WO 2008066002A1 JP 2007072777 W JP2007072777 W JP 2007072777W WO 2008066002 A1 WO2008066002 A1 WO 2008066002A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
mosaic virus
apple mosaic
detection
amplification
seq
Prior art date
Application number
PCT/JP2007/072777
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Yukio Okada
Yutaka Itoga
Original Assignee
Sapporo Breweries Limited
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sapporo Breweries Limited filed Critical Sapporo Breweries Limited
Priority to CN2007800442433A priority Critical patent/CN101563452B/zh
Priority to NZ578031A priority patent/NZ578031A/en
Priority to US12/516,960 priority patent/US20100143909A1/en
Priority to AT07832502T priority patent/ATE522606T1/de
Priority to EP07832502A priority patent/EP2090653B1/en
Publication of WO2008066002A1 publication Critical patent/WO2008066002A1/ja

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting upnore mosaic virus, a detection primer set, and a detection kit.
  • Apple mosaic virus is a phytopathogenic virus belonging to the genus Bromovirus, and is widely infected with hops (Humulus lupulus L.) and apples (Malus domestica Malus). Once the apple mosaic virus infects hops and apples, it is transmitted mainly by mechanical contact, increasing the damage caused by infection.
  • hops are cultivated using virus-free seedlings produced by shoot apical culture in order to prevent damage caused by apple mosaic virus. ing.
  • Apple mosaic virus infection surveys are regularly conducted to prevent secondary infection of Apple mosaic virus.
  • Apple Mosaic Virus Infection Survey it is common to detect the Apple Mosaic Virus infected with hops! / By ELISA.
  • the method for detecting apple mosaic virus by ELISA is the method of detecting apple mosaic virus particles and primary antibody contained in a specimen in a microplate on which a primary antibody specifically recognizing apple mosaic virus is solid-phased.
  • a reaction step a force that does not bind to the primary antibody, a step of washing the components in the specimen, an apple mosaic virus particle bound to the primary antibody, an enzyme label, and specifically recognizes the apple mosaic virus.
  • a step of reacting with the secondary antibody a step of washing the secondary antibody that did not bind to the apple mosaic virus particles, a step labeled with the secondary antibody, and the enzyme and chemiluminescent substrate or chemiluminescent substrate.
  • the amount of apple mosaic virus particles based on the enzymatic reaction step and the intensity of color or luminescence obtained by the enzymatic reaction. The steps of estimating It is.
  • Non-Patent Document 1 Pethybridge et al., 2004, Australianjournal of agricultural research, 55, p. 765-770
  • a signal indicating the presence of the virus may be evaluated as a background signal, or nonspecific binding may be evaluated as a signal indicating the presence of the Apple mosaic virus.
  • the detection method of Apple mosaic virus by ELISA method is composed of a plurality of step forces as described above, and each step is performed under the same conditions by determining the reaction time and the number of washings in the laboratory.
  • the work at each step becomes complicated and tends to hinder accurate evaluation.
  • the ELISA method is a method of detecting the virus particle itself as a target, it cannot detect a provirus integrated in the virus genome or the host genome. In the summer, when the particle content is known to be significantly reduced, hops infected with Apple mosaic virus may be considered false positives or not detected.
  • the object of the present invention is to improve the performance (potency and specificity) of antibodies that detect Apple mosaic virus, the number of specimens, and the place where the evaluation is performed.
  • the purpose is to provide a specific and highly sensitive method for detecting the Apple mosaic virus in every season of harvest and storage.
  • Another object of the present invention is to provide a primer set and detection kit for detecting apple mosaic virus used in this method.
  • the present invention provides an apple mosaic virus detection method comprising: an extraction step of extracting apple mosaic virus RNA from a specimen; Use a primer set that includes four types of oligonucleotides consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 4!
  • RT reverse transcript- Loop— medi ated isothermal amplification
  • LAMP reverse transcript- Loop— medi ated isothermal amplification
  • a detection method comprising:
  • RT-LAMP method reverse transcription-Loop-mediated isothermal amplification method
  • RT-LAMP method reverse transcription-Loop-mediated isothermal amplification method
  • the “RT-LAMP method” is a method in which a reverse transcription reaction and an isothermal gene amplification reaction by the LAMP method are combined to amplify a complementary cDNA to RNA in a saddle shape. The details of the principle are described in the pamphlet of WO 00/28082.
  • hop tissue strength RNA to be examined for the presence of Apple mosaic virus infection is extracted, and four types of nucleotide sequences IJ shown in SEQ ID NOs: 1 to 4 in the sequence listing are extracted from the extract.
  • a primer set containing the oligonucleotides and performing a cDNA amplification reaction using the RT-LAMP method it becomes possible to easily and highly sensitively detect the cDNA of a portion of the Apple Mosaic Virus genomic RNA. Can determine if there is a virus infection.
  • the base sequence of the RNA RNA consisting of the base sequence of Apple Mosaic virus genomic RNA complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing and the base sequence shown in SEQ ID NO: 1-4 in the sequence listing
  • the sequence is part of the coat protein gene of Apple Mosaic Virus, and the region of Apple Mosaic Virus genomic RNA containing these nucleotide sequences is suitable as a target region for amplifying cDNA by the RT-LAMP method. The Therefore, the presence or absence of Apple mosaic virus can be specifically detected by confirming the presence or absence of amplified cDNA.
  • the amplification step includes six types of nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 6 in the sequence listing. It is preferable to perform a cDNA amplification reaction by reverse transcription—Loop—mediated isothermal amplification (RT—LAMP) method using a primer set containing the oligonucleotides of No. 1 and RNA in a saddle shape.
  • RT—LAMP reverse transcription—Loop—mediated isothermal amplification
  • oligonucleotide consisting of the base sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 4 in the sequence listing two types of oligonucleotide consisting of the base sequences shown in SEQ ID NOS: 5 and 6 in the sequence listing are added as Loop Primers. If the cDNA amplification reaction is performed, the starting point of DNA synthesis can be increased, so that the amplification time can be shortened and more efficient detection of apple mosaic virus can be achieved.
  • the present invention also relates to four types of oligonucleotides consisting of the base sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 4 in the sequence listing or six types of oligonucleotides consisting of the base sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 6 in the sequence listing.
  • Apple mosaic virus infection was examined! // RNA extracted from hop tissue, and the above primer set was added to the extract and subjected to cDNA amplification reaction by RT-LAMP method. It becomes possible to detect the cDNA of a partial sequence of mosaic virus genomic RNA with simple power and high sensitivity, and to determine the presence or absence of Apple mosaic virus infection.
  • the present invention also relates to four types of oligonucleotides consisting of the base sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 4 in the sequence listing or six types of oligonucleotides consisting of the base sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 6 in the sequence listing.
  • a detection kit for apple mosaic virus containing a primer set for detecting apple mosaic virus, a reverse transcriptase, a strand displacement DNA synthase, dNTPs, and a buffer.
  • the cultivation time, harvest time, storage time It is possible to detect Apple mosaic virus with specific and high sensitivity in any season.
  • the primer set and detection kit for detecting apple mosaic virus of the present invention can be suitably used for the RT-LAMP method, and enables simple and highly sensitive detection of apple mosaic virus.
  • FIG. 1 Shows the positional relationship between a primer set comprising four types of oligonucleotides consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 4 in the sequence listing and the target region of Apple mosaic virus genomic RNA.
  • FIG. 1 Shows the positional relationship between a primer set comprising four types of oligonucleotides consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 4 in the sequence listing and the target region of Apple mosaic virus genomic RNA.
  • the method for detecting an apple mosaic virus of the present invention comprises an extraction step of extracting RNA of apple mosaic virus from a specimen, and four types of oligos comprising the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 4 in the sequence listing.
  • this RNA is converted into a vertical shape using a reverse transcription (Loop) -mediated isothermal amplification (RT-LAMP) method and an amplification step for performing cDNA amplification reaction, and a base represented by SEQ ID NO: 8 in the sequence listing.
  • RT-LAMP reverse transcription
  • amplification step for performing cDNA amplification reaction and a base represented by SEQ ID NO: 8 in the sequence listing.
  • a step of judging that the apple mosaic virus is present when amplification of the cDNA containing the sequence is recognized in the amplification step.
  • Apple mosaic virus refers to Apple Mosaic Ilarvirus, which is an RNA virus belonging to the genus Bromovirus.
  • the main hosts of Apple Mosaic Virus are hops (Humulus lupulus L.) and apples (Malus dom estica Malus), and hops infected with Apple Mosaic Virus have a reduced yield of spikelets and brewing beer. It is also known to cause a decrease in the content of alpha acid, which is a bitter substance necessary for food.
  • Examples of the "specimen" used in the above detection method include plant leaves, stems, roots and fruits.
  • the ability to exemplify the leaves is more preferable than the leaves that are preferable to the leaves and fruits because sampling is easy.
  • Examples of the time when the sample is sampled include cultivation, harvesting, and storage.
  • the sample is extracted in a buffer solution having a force S for extracting RNA of apple mosaic virus existing in plant cells surrounded by cell walls, for example, distilled water or a pH near weak alkalinity.
  • the RNA of Apple Mosaic virus can be extracted by physical homogenization.
  • the pH of the buffer used is preferably about pH 8.0 to pH 9.5, for example, as the buffer used, for example, Tris / HCl buffer, Tris / acetate buffer, phosphate buffer , Carbonate buffer, borate buffer and the like.
  • the buffer used for example, Tris / HCl buffer, Tris / acetate buffer, phosphate buffer , Carbonate buffer, borate buffer and the like.
  • RNA extraction from plants and genomic DNA extraction are suitable. For example, molecular cloning (Maniatis) Et al., 1989, Cold 'Spring' Nova 1 'Laboratory 1')).
  • CTAB cetyl trimethyl ammonium bromide
  • the homogenization may be performed using, for example, a polytron homogenizer, a Teflon homogenizer, a mortar, or the like, as long as the cell wall of the specimen can be broken and the RNA of the apple mosaic virus present in the plant cell can be extracted.
  • homogenization with the specimen frozen can more efficiently break the cell wall of the specimen and easily extract the RNA of the Apple mosaic virus present in the cells.
  • an RNA extraction buffer containing the above-mentioned guanidine thiocyanate or a genomic DNA extraction buffer containing CTAB the apple mosaic virus present in the cells can be obtained simply by repeated stirring with a vortex mixer or the like. Of genomic RNA can be extracted.
  • Apple mosaic virus genomic RNA extracted in the extraction step may be recovered as a precipitate by alcohol precipitation and replaced with a buffer suitable for the RT-LAMP method!
  • RNA of Apple Mozaic virus is extracted in a buffer solution with a pH close to weak alkalinity, use it as it is in the following amplification step. Is also possible.
  • the RNA of the upnore mosaic virus extracted in the extraction step is reverse-transcribed into a vertical shape using two types of oligonucleotides consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 2 and 4 in the sequence listing as primers.
  • the primer set containing 4 types of oligonucleotides consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 4 in the sequence listing the cDNA obtained by the reverse transcription reaction was converted into a vertical shape.
  • Loop-mediated isotherm amplification (hereinafter, LAMP) isothermal gene amplification reaction is repeated.
  • the amplification method of cDNA performed in the amplification step is called RT-LAMP method.
  • RT-LAMP method By performing RNA transcription, reverse transcription reaction to synthesize cDNA and isothermal gene amplification reaction by LAMP method at the same time, It can amplify a partial sequence cDNA of the target region of Apple Mosaic Virus genomic RNA.
  • Fig. 1 is a diagram showing the positional relationship between a primer set comprising 4 types of oligonucleotides consisting of nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs:! To 4 in the sequence listing and a target region of Apple Mosaic Virus genomic RNA. It is.
  • SEQ ID NO: 7 in the sequence listing shows the nucleotide sequence of cDNA of the target region of the apple mosaic virus genomic RNA! /.
  • oligonucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the sequence listing (hereinafter ApMV)
  • FIP primer is a FIP primer and can be designed by having the F2 region complementary to the F2c region at the 3 'end and the same sequence as the Flc region at the 5' end.
  • ApMV oligonucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 in the sequence listing
  • BIP primer is a BIP primer that can be designed by having the B2 region complementary to the B2c region at the 3 'end and the same sequence as the Blc region at the 5' end.
  • the oligonucleotide consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 in the Sequence Listing is an F3 primer and has an F3 region complementary to the F3c region.
  • the oligonucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 in the Sequence Listing is a B3 primer and has a B3 region that is complementary to the B3c region. Can design.
  • the amplification reaction of cDNA by the RT-LAMP method consists of four types of oligonucleotides consisting of the RNA of the Apple mosaic virus extracted in the extraction step and the base sequences shown in SEQ ID NOs:!
  • the reaction solution containing the primer set, reverse transcriptase, strand displacement DNA synthetase, dNTPs (dATP, dTTP, dGTP and dCTP), and buffer solution may be allowed to stand isothermally for a certain period of time. .
  • the temperature is preferably 50 ° C or higher and 75 ° C or lower, preferably 60 ° C or higher and 65 ° C or lower, more preferably 65 ° C. If the standing time is 15 minutes or longer, the ability to detect amplification of cDNA is preferably 15 minutes or longer and within 1 hour, more preferably 20 minutes or longer and within 40 minutes.
  • each reagent included in the Loopamp RNA amplification reagent kit (Eiken Chemical Co., Ltd.) can be used.
  • the bases represented by SEQ ID NOs: 5 and 6 in the sequence listing are used instead of the primer set comprising four types of oligonucleotides having the base sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 4 in the sequence listing. It is preferable to use 6 types of primer sets consisting of the base sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 6 in the sequence listing to which primers consisting of 2 types of oligonucleotides consisting of sequences are added.
  • ApMV oligonucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 5 in the sequence listing
  • LoopF primer and the oligonucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 6
  • ApMV—LoopB primer is located on the single-stranded part of the loop on the 5 ′ end side of the dumbbell structure that is the starting point of the amplification reaction.
  • Loop primer with complementary sequence ApMV—LoopF can be designed by having a sequence complementary to the sequence between the F1 and F2 regions in FIG. 1.
  • ApMV—LoopB is designed between the B1 and B2 regions in FIG. It can be designed by having a sequence complementary to the sequence.
  • the base sequence represented by SEQ ID NO: 8 in the sequence listing is repeatedly contained c If DNA amplification is observed in the above amplification step, it can be determined that Apple mosaic virus is present.
  • the base sequence represented by SEQ ID NO: 8 in the sequence listing is a cDNA of a partial sequence of the target region of the apple mosaic virus genomic RNA, and is repeatedly amplified by the RT-L AMP method using the above primer set.
  • Core array Apple Mosaic Virus Genomic RNA Bases Complementing this Core Sequence and Apple Mosaic Virus Genomic RNA Bases Comprising Four Oligonucleotides Consisting of the Base Sequences Shown in SEQ ID NOs: 1-4 in the Sequence Listing
  • the sequence is a partial sequence of the Apple Mosaic Virus coat protein gene.
  • the region of the Apple Mosaic Virus genomic RNA containing these nucleotide sequences is the target region for amplifying cDNA by the RT-LAMP method. Suitable as. Therefore, it is possible to specifically detect the presence or absence of Apple mosaic virus by confirming the presence or absence of amplified cDNA.
  • the determination of the presence or absence of apple mosaic virus can be made by, for example, observing the reaction solution after performing cDNA amplification reaction by RT-LAMP with the naked eye and confirming that the reaction solution is cloudy, the apple mosaic virus is It can be judged that it existed.
  • a fluorescence interferometer is added to this reaction solution, and it can be determined that apple mosaic virus is present when luminescence indicating amplification of cDNA is confirmed under UV irradiation.
  • the amplified cDNA is digested with restriction enzymes Alul or Taql present in the base sequence represented by SEQ ID NO: 8 in the sequence listing. It can be determined that Apple Mosaic Virus was present when two DNA fragments of 134 bp and 75 bp or 209 bp DNA fragments were confirmed by electrophoresis.
  • the primer set for detection of apple mosaic virus of the present invention includes four types of oligonucleotides consisting of the base sequences represented by SEQ ID NOS: 1 to 4 in the sequence listing or SEQ ID NOS: 1 to 6 in the sequence listing. It is characterized by containing 6 types of oligonucleotides consisting of the base sequences shown.
  • the above primer set can be synthesized with a DNA synthesizer based on the base sequence information of SEQ ID NOs:! To 6 in the sequence listing.
  • Various reagents necessary for using the method for detecting an apple mosaic virus of the present invention can be packaged in advance to form a kit. Specifically, it includes 4 types of oligonucleotides consisting of the base sequences shown in SEQ ID NOs:! To 4 in the sequence listing or 6 types of oligonucleotides consisting of the base sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 6 in the sequence listing.
  • Limer set 4 types of dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, and dTTP) that serve as substrates for nucleic acid synthesis, reverse transcriptase that synthesizes cDNA from RNA, strand displacement DNA synthase with strand displacement activity, suitable for enzymatic reactions
  • dNTPs dATP, dCTP, dGTP, and dTTP
  • reverse transcriptase that synthesizes cDNA from RNA
  • strand displacement DNA synthase with strand displacement activity suitable for enzymatic reactions
  • a buffer that gives suitable conditions, salts as cofactors (magnesium salt or manganese salt, etc.), protecting agents that stabilize enzymes and molds, and, if necessary, reagents necessary for detection of reaction products Can be provided as a kit.
  • the kit may include a positive control for confirming that the RT-LAMP reaction proceeds normally with the primer of the present invention.
  • a positive control for example, DNA containing a region amplified by the primer of the present invention can be mentioned.
  • the apple mosaic virus detection specimen and the control specimen are each frozen in liquid nitrogen, ground in a mortar until the tissue becomes powdery, and then added with 5 times the amount of distilled water and suspended. did.
  • the apple mosaic virus detection specimen and the control specimen suspension thus obtained were used as hop tissue samples in the following experiments.
  • RNA sample each hop tissue sample (each 40 U, 160 L 2 X CTAB solution (2% cetyltrimethylammonium bromide, 20 mM EDTA, 1.4 M NaCl, 5% ⁇ -mercaptoethanol, 0.1 M Tris, pH 9.5) was added and incubated at 65 ° C for 20 minutes, and then centrifuged at 15,000 rpm for 10 minutes to remove the residue as a precipitate, and the supernatant was transferred to a new Eppendorf tube. Add 200 L of isopropanol, mix, and centrifuge at 15,000 rpm for 10 minutes to recover the RNA as a precipitate, wash with 70% ethanol, air dry, dissolve in 40 L of sterile water, A sample was used.
  • X CTAB solution 2% cetyltrimethylammonium bromide, 20 mM EDTA, 1.4 M NaCl, 5% ⁇ -mercaptoethanol, 0.1 M Tris, pH 9.5
  • RNA samples for the apple mosaic virus detection sample and the control sample RNA samples obtained in this way were staged 10 3 times, 10 4 times, 10 5 times, 10 6 times and 10 7 times with sterile water, respectively. After dilution, 2 L of the sample was used as a diluted RNA sample for amplification of cDNA by RT-LAMP.
  • RNA dilution sample 1 of 2 X 10 4 minutes hop tissue samples, 2 X 10 5 minutes 1, 2 X 10 6 minutes 1, 2 X 10 7 minutes each 1 1 and 2 X 10 8 minutes Equivalent to
  • Primers include ApMV—FIP primer (SEQ ID NO: 1) as FIP primer, ApMV—BIP primer (SEQ ID NO: 2) as BIP primer, ApMV F3 primer (SEQ ID NO: 3) as F3 primer, ApMV—B3 primer as B3 primer ( SEQ ID NO: 4), 8 ⁇ -00? (SEQ ID NO: 5), and 8 ⁇ 1 $ —00: 6 (SEQ ID NO: 6) were used as Loop primers.
  • Amplification of cDNA by RT-LAMP method was performed using Loopamp RNA amplification reagent kit (manufactured by Eiken Chemical Co., Ltd.). Specifically, according to the manufacturer's protocol, each of the above diluted RNA samples (21) serially diluted in the reaction solution was added to each of the above six types of primers, reverse transcriptase, strand displacement DNA synthase, dNTPs and buffer solution were added, and the mixture was allowed to stand at 65 ° C for 50 minutes. [0059] 5) Detection of amplified cDNA
  • the cDNA amplified by the above-mentioned RT-LAMP cDNA amplification is the base sequence shown in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing corresponding to the partial sequence of the Apple mosaic virus coat protein gene cDNA. Therefore, it was judged that Apple mosaic virus was present when the reaction solution became cloudy.
  • Table 1 shows the results of detection of apple mosaic virus by the RT-LAMP method using the diluted RNA sample of the apple mosaic virus detection sample and the diluted RNA sample of the control sample.
  • ND Indicates that no cloudiness was observed.
  • Alul and Taql are present in the base sequence shown in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing, digestion with restriction enzymes Alul or Taql results in two cDNAs amplified by RT-LAMP, 134 bp and 75 bp, respectively. Or a 209 bp DNA fragment.
  • the gel after electrophoresis can be visualized by immersing it in ethidium bromide solution for 10 minutes to stain the fractionated DNA fragments and irradiating with ultraviolet rays.
  • Figure 2 shows the band obtained by digesting the cDNA amplified by the RT-LAMP method with the RNA-diluted sample of the apple mosaic virus detection sample with the restriction enzymes Alul or Taql and then performing polyacrylamide gel electrophoresis. It is a gel photograph which shows a pattern.
  • Example 1 when white turbidity indicating amplification of cDNA was observed by the RT-LAMP method, non-specific cDNA amplification did not occur. It was proved that a part of the protein gene was specifically amplified, and it became clear that the detection of apple mosaic virus was a result dependent on the presence of apple mosaic virus.
  • the detection method of apple mosaic virus by RT-LAMP method shown in Example 1 is a very sensitive method compared to the detection of apple mosaic virus by ELISA method described later. This suggests that it is possible to easily determine the presence or absence of Apple mosaic virus simply by visually judging the cloudiness.
  • Anti-Apple Mosaic Virus Antibody (Aglia, USA) that specifically recognizes Apple Mosaic Virus was added to 0.05 M SCB Nofer (1.59 g / L Na CO, 2.93 g / L
  • the antibody solid phase plate thus obtained was washed 5 times with tween-20, pH 7.4) at 5-minute intervals, and used as an ELISA plate for detection of apple mosaic virus in the following test.
  • apple mosaic virus detection specimens and control specimens protein specimen is 10 times each PBS-T / PVP solution, 10 twice, serially diluted 10 3 times, respectively are 200 L proteins
  • a diluted sample was subjected to ELISA. Protein sample not have any dilution, equivalent to one-half of hops tissue samples, 10-fold, 10 2-fold and 10 3 fold protein dilution sample diluted stage, the hop tissue samples 20 minutes 1, 2 10 1/2 , 2 X 10 1/3 , respectively.
  • each of the protein sample and each protein diluted sample was added to the above ELISA plate and allowed to stand still. Washed 5 times with 0.02 ⁇ PBS-T at 5-minute intervals, and diluted 200-fold with alkaline phosphatase-labeled anti-Apple mosaic virus antibody (Aglia, USA) 1000-fold with 0.02 ⁇ PBS-T ⁇ ⁇ L was aliquoted and left at 37 ° C for 3 hours.
  • each well of the ELISA plate was washed 5 times with 0.02M PBS-T at 5-minute intervals, and 200 substrate solutions (10% Diethanolamine, lg / L p-nitrophenyl disodium phosphate) was added, the mixture was allowed to react at room temperature for a certain period of time, and the absorbance at 405 ⁇ m was measured.
  • Table 2 shows the results of detection of apple mosaic virus by ELISA using protein samples for apple mosaic virus detection and protein diluted samples, protein samples for control samples and protein diluted samples. is there.
  • ND Indicates that no cloudiness was observed.
  • the primer set and detection kit for detecting apple mosaic virus of the present invention can be suitably used for the RT-LAMP method, and enables simple and highly sensitive detection of apple mosaic virus.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

明 細 書
アップルモザイクウィルスの検出方法、検出用プライマーセット及び検出 用キット
技術分野
[0001] アップノレモザイクウィルスの検出方法、検出用プライマーセット及び検出用キットに 関する。
背景技術
[0002] アップルモザイクウィルスは、ブロモウィルス属に属する植物病原性ウィルスであり、 ホップ (Humulus lupulus L. )及びリンゴ (Malus domestica Malus)に広く感 染する。アップルモザイクウィルスがホップ及びリンゴに一度感染すると、主に機械的 接触によって伝播し、感染被害が拡大する。
[0003] ドイツ、アメリカ、イギリス及びチェコ等のホップの主要生産国並びに日本では、アツ プルモザイクウィルスによる感染被害を防ぐため、茎頂培養によって生産したウィル スフリー苗を用いてホップの栽培が行われている。
[0004] ホップを栽培している農場では、アップルモザイクウィルスの感染調査が定期的に 行われ、アップルモザイクウィルスの二次感染を防いでいる。アップルモザイクウィル スの感染調査は、ホップに感染して!/、るアップルモザイクウィルスを ELISA法で検出 するのが一般的である。
[0005] ELISA法によるアップルモザイクウィルスの検出方法は、アップルモザイクウィルス を特異的に認識する一次抗体が固相されたマイクロプレート中で、検体に含まれるァ ップルモザイクウィルス粒子と一次抗体とを反応させるステップと、一次抗体に結合し な力、つた検体中の成分を洗浄するステップと、一次抗体と結合したアップルモザイク ウィルス粒子と、酵素標識され、かつ、アップルモザイクウィルスを特異的に認識する 二次抗体とを反応させるステップと、アップルモザイクウィルス粒子に結合しな力 た 二次抗体を洗浄するステップと、二次抗体に標識されて!、る酵素と化学発色基質又 は化学発光基質とを酵素反応させるステップと、酵素反応によって得られた発色又は 発光の強さからアップルモザイクウィルス粒子の量を見積もるステップと、から構成さ れる。
[0006] 非特許文献 1 : Pethybridgeら、 2004年、 Australianjournal of agricultural r esearch、 55巻、 p. 765— 770
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0007] しかしながら、 ELISA法で使用するアップルモザイクウィルスを認識する抗体の力 価や特異性が不十分な場合には、検体中に存在するアップルモザイクウィルス以外 の成分の影響を受けるため、アップルモザイクウィルスの存在を示すシグナルをバッ クグラウンドのシグナルとして評価したり、非特異的な結合をアップルモザイクウィルス の存在を示すシグナルとして評価したりすることが生じる。
[0008] また、 ELISA法によるアップルモザイクウィルスの検出方法は、上記の通り複数の ステップ力、ら構成されており、各ステップは実験室で反応時間及び洗浄回数等を決 めて同じ条件で作業する必要があるが、検体数が増加した場合には、各ステップで の作業は煩雑となり、正確な評価に支障をきたす傾向がある。
[0009] さらに、 ELISA法は、ウィルス粒子そのものをターゲットとして検出する方法である ため、ウィルスゲノム又は宿主ゲノムに組み込まれたプロウィルスを検出することはで きず、例えば、高温のためにアップルモザイクウィルス粒子の含有量が著しく低下す ることが知られている夏季には、アップルモザイクウィルスに感染されているホップで あっても擬陽性又は未検出と判断される場合がある。
[0010] そこで本発明の目的は、上記の問題点に鑑み、アップルモザイクウィルスを検出す る抗体の性能（力価及び特異性）、検体数及び評価を行う場所を選ばず、栽培時 '収 穫時 ·保管時等のあらゆる季節において、アップルモザイクウィルスを特異的かつ高 感度に検出する方法を提供することにある。本発明の目的はまた、この方法に使用 するアップルモザイクウィルスの検出用プライマーセット及び検出用キットを提供する ことにある。
課題を解決するための手段
[0011] 上記目的を達成するために、本発明は、アップルモザイクウィルスの検出方法であ つて、検体からアップルモザイクウィルスの RNAを抽出する抽出ステップと、配列表 の配列番号 1〜4で示される塩基配列からなる 4種類のオリゴヌクレオチドを含むプラ イマ一セットを用! /、て、この RNAを鎵型 ίこ Reverse transcription― Loop― medi ated isothermal amplification (RT— LAMP)法によって cDNAの増幅反応を 行う増幅ステップと、配列表の配列番号 8で示される塩基配列を含有する cDNAの 増幅が増幅ステップで認められた場合にアップルモザイクウィルスが存在すると判断 する判断ステップと、を含む検出方法を提供する。
[0012] 本発明者らは、等温の遺伝子増幅反応である Reverse transcription -Loop - mediated isothermal amplification法（以下、 RT— LAMP法）を利用し、アツ プルモザイクウィルスのコートタンパク質遺伝子の特定の領域を増幅することにより、 アップルモザイクウィルスの検出を簡易かつ高感度に行い得ることを見出した。ここで 、「RT— LAMP法」とは、逆転写反応と LAMP法による等温遺伝子増幅反応が組み 合わされ、 RNAを铸型にこれに相補的な cDNAを増幅する方法である。原理の詳 細部分については、国際公開第 00/28082号パンフレットに記載されている。
[0013] 上記検出方法に従って、アップルモザイクウィルスの感染の有無を調べたいホップ の組織力 RNAを抽出し、その抽出液に配列表の配列番号 1〜4で示される塩基配 歹 IJからなる 4種類のオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットを加えて RT— LAMP 法による cDNAの増幅反応を行えば、アップルモザイクウィルスのゲノム RNAの一 部配列の cDNAを簡易かつ高感度に検出することが可能となり、アップルモザイクゥ ィルスの感染の有無を判断できる。
[0014] また、配列表の配列番号 8で示される塩基配列に相補的なアップルモザイクウィル スのゲノム RNAの塩基配列及び配列表の配列番号 1〜4で示される塩基配列からな ノム RNAの塩基配列は、アップルモザイクウィルスのコートタンパク質遺伝子の一部 配列であり、これらの塩基配列を含有するアップルモザイクウィルスのゲノム RNAの 領域は、 RT— LAMP法によって cDNAを増幅するための標的領域として適してい る。このため、増幅された cDNAの有無を確認することによって、アップルモザイクゥ ィルスの有無を特異的に検出できる。
[0015] 上記増幅ステップは、配列表の配列番号 1〜6で示される塩基配列からなる 6種類 のオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットを用いて、前記 RNAを铸型に Reverse transcription— Loop— mediated isothermal ampliiic ation (RT― LAMP ) 法によって cDNAの増幅反応を行うステップであることが好ましい。
[0016] 配列表の配列番号 1〜4で示される塩基配列からなる 4種類のオリゴヌクレオチドに 、配列表の配列番号 5及び 6で示される塩基配列からなる 2種類のオリゴヌクレオチド を Loop Primerとして加えて cDNAの増幅反応を行えば、 DNA合成の起点を増や すことが可能となるため、増幅時間を短縮でき、より効率的なアップルモザイクウィル スの検出が可能となる。
[0017] また本発明は、配列表の配列番号 1〜4で示される塩基配列からなる 4種類のオリ ゴヌクレオチド又は配列表の配列番号 1〜6で示される塩基配列からなる 6種類のォ リゴヌクレオチド、を含むアップルモザイクウィルスの検出用プライマーセットを提供す
[0018] アップルモザイクウィルスの感染の有無を調べた!/、ホップの組織から RNAを抽出し 、その抽出液に上記プライマーセットを加えて RT— LAMP法による cDNAの増幅反 応を行えば、アップルモザイクウィルスのゲノム RNAの一部配列の cDNAを簡易力、 つ高感度に検出することが可能となり、アップルモザイクウィルスの感染の有無を判 断できる。
[0019] また本発明は、配列表の配列番号 1〜4で示される塩基配列からなる 4種類のオリ ゴヌクレオチド又は配列表の配列番号 1〜6で示される塩基配列からなる 6種類のォ リゴヌクレオチド、力もなるアップルモザイクウィルスの検出用プライマーセット、逆転 写酵素、鎖置換型 DNA合成酵素、 dNTPs及び緩衝液を含むアップルモザイクウイ ノレスの検出用キットを提供する。
[0020] 上記検出用キットがあれば、 RT— LAMP法によるアップルモザイクウィルスの検出 に必要な試薬を同時に入手することが可能であり、例えば、野外でアップルモザイク ウィルスの検出を行なう場合であっても、試薬の濃度調製等の煩雑な作業が不要と なり、簡易にアップルモザイクウィルスの検出を行なうことができる。
発明の効果
[0021] 本発明によれば、検体数及び評価を行う場所を選ばず、栽培時 ·収穫時 ·保管時 等のあらゆる季節において、アップルモザイクウィルスを特異的かつ高感度に検出す ること力 Sできる。また、本発明のアップルモザイクウィルスの検出用プライマーセット及 び検出用キットは、 RT— LAMP法に好適に使用でき、アップルモザイクウィルスの 簡易かつ高感度な検出を可能にする。
図面の簡単な説明
[0022] [図 1]配列表の配列番号 1〜4で示される塩基配列からなる 4種類のオリゴヌクレオチ ドを含むプライマーセットとアップルモザイクウィルスのゲノム RNAの標的領域との位 置関係を示した図である。
[図 2]アップルモザイクウィルス検出用検体の RNA希釈試料を用いて RT— LAMP 法で増幅された cDNAを制限酵素 Alul又は Taqlで消化し、ポリアクリルアミドゲル電 気泳動したときのバンドパターンを示すゲル写真である。
発明を実施するための最良の形態
[0023] 以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。
[0024] 本発明のアップルモザイクウィルスの検出方法は、検体からアップルモザイクウィル スの RNAを抽出する抽出ステップと、配列表の配列番号 1〜4で示される塩基配列 力、らなる 4種類のオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットを用いて、この RNAを铸 型に Reverse transcription― Loop― mediated isothermal ampliiication RT— LAMP)法によって cDNAの増幅反応を行う増幅ステップと、配列表の配列番 号 8で示される塩基配列を含有する cDNAの増幅が増幅ステップで認められた場合 にアップルモザイクウィルスが存在すると判断する判断ステップとを含むことを特徴と している。
[0025] 「アップルモザイクウィルス」とは、 Apple Mosaic Ilarvirusのことであって、ブロ モウィルス（Bromovirus)属に属する RNAウィルスである。アップルモザイクウィルス の宿主の主要なものは、ホップ（Humulus lupulus L. )及びリンゴ（Malus dom estica Malus)であり、アップルモザイクウィルスの感染を受けたホップは、毬花の 収量が減少し、ビール醸造に必要な苦味物質である α酸の含量の低下をも引き起こ すことが知られている。
[0026] 上記検出方法で使用する「検体」としては、例えば、植物の葉、茎、根及び果実等 を例示できる力 サンプリングが容易なことより葉及び果実が好ましぐ葉がより好まし い。検体をサンプリングする時期としては、例えば、栽培時、収穫時及び保管時等を 例示できる。
[0027] 上記抽出ステップでは、細胞壁で囲まれた植物細胞中に存在しているアップルモ ザイクウィルスの RNAを抽出する力 S、例えば、蒸留水又は弱アルカリ性付近の pHを 有する緩衝液中で検体を物理的にホモジナイズすることによりアップルモザイクウイ ルスの RN Aを抽出できる。
[0028] 使用する緩衝液の pHは、例えば、 pH8. 0〜pH9. 5付近が好ましぐ使用する緩 衝液としては、例えば、トリス/塩酸緩衝液、トリス/酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、炭 酸緩衝液、ホウ酸緩衝液等が挙げられる。また、検体からアップルモザイクウィルスの RNAをより効率的に抽出するには、植物から RNAを抽出する方法やゲノム DNAを 抽出する方法が適しており、これらの方法は、例えば、 Molecular cloning (Mania tisら、 1989年、コールド 'スプリング'ノヽーバ一'ラボラトリ一'プレス）等の遺伝子ェ 学プロトコールに記載されている。 RNAを抽出する方法では、グァニジンチオシァネ ートを、ケノム DNAを抽出" 5 ·0方法では、 Cetyl trimethyl ammonium bromid e (以下、 CTAB)を含有した抽出バッファーを使用するのがより好ましい。
[0029] ホモジナイズは、検体の細胞壁を壊し、植物細胞中に存在するアップルモザイクゥ ィルスの RNAを抽出できればよぐ例えば、ポリトロンホモジナイザー、テフロンホモ ジナイザー、乳鉢等を用いて行うことができる。また、検体を凍結した状態でホモジナ ィズすれば、より効率的に検体の細胞壁を壊し、細胞中に存在するアップルモザイク ウィルスの RNAを容易に抽出できる。また、上記したグァニジンチオシァネートを含 有する RNA抽出バッファーや CTABを含有するゲノム DNA抽出バッファーを使用 する場合には、ボルテックスミキサー等で撹拌を繰り返すだけでも、細胞中に存在す るアップルモザイクウィルスのゲノム RNAを抽出することが可能である。
[0030] 抽出ステップで抽出されたアップルモザイクウィルスのゲノム RNAは、アルコール 沈殿を行うことによって沈殿として回収し、 RT— LAMP法に適した緩衝液に置換し てもよ!/、が、蒸留水又は弱アルカリ性付近の pHを有する緩衝液中でアップルモザィ クウィルスの RNAを抽出した場合には、そのまま以下の増幅ステップで使用すること も可能である。
[0031] 増幅ステップでは、配列表の配列番号 2及び 4で示される塩基配列からなる二種類 のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、抽出ステップで抽出されたアップノレ モザイクウィルスの RNAを铸型に逆転写反応が行われ、引き続き、配列表の配列番 号 1〜4で示される塩基配列からなる 4種類のオリゴヌクレオチドを含むプライマーセ ットを用いて、逆転写反応で得られた cDNAを铸型に Loop— mediated isotherm al amplification法（以下、 LAMP法）による等温遺伝子増幅反応が繰り返し行わ れる。
[0032] 増幅ステップで行われる cDNAの増幅方法は、 RT— LAMP法と呼ばれ、 RNA力、 ら cDNAを合成する逆転写反応と LAMP法による等温遺伝子増幅反応とを同時に 等温で行うことによって、アップルモザイクウィルスのゲノム RNAの標的領域の一部 配列の cDNAを増幅できる。
[0033] 図 1は、配列表の配列番号;!〜 4で示される塩基配列からなる 4種類のオリゴヌタレ ォチドを含むプライマーセットとアップルモザイクウィルスのゲノム RNAの標的領域と の位置関係を示した図である。
[0034] 配列表の配列番号 7は、アップルモザイクウィルスのゲノム RNAの標的領域の cD NAの塩基配列を示して!/、る。
[0035] 配列表の配列番号 1で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（以下、 ApMV
— FIPプライマー）は FIPプライマーであり、 F2c領域と相補的な配列である F2領域 を 3'末端側に持ち、 5'末端側に Flc領域と同じ配列を持つようにすれば設計できる
[0036] 配列表の配列番号 2で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（以下、 ApMV
— BIPプライマー）は BIPプライマーであり、 B2c領域と相補的な配列である B2領域 を 3'末端側に持ち、 5'末端側に Blc領域と同じ配列を持つようにすれば設計できる
[0037] 配列表の配列番号 3で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（以下、 ApMV —F3プライマー）は、 F3プライマーであり、 F3c領域と相補的な配列である F3領域を 持つようにすれば設計できる。 [0038] 配列表の配列番号 4で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（以下、 ApMV —B3プライマー）は、 B3プライマーであり、 B3c領域と相補的な配列である B3領域 を持つようにすれば設計できる。
[0039] RT— LAMP法による cDNAの増幅反応は、抽出ステップで抽出されたアップルモ ザイクウィルスの RNAと、配列表の配列番号;!〜 4で示される塩基配列からなる 4種 類のオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットと、逆転写酵素と、鎖置換型 DNA合 成酵素と、 dNTPs (dATP、 dTTP、 dGTP及び dCTP)と、緩衝液と、を含む反応液 を、等温で一定時間静置すればよい。
[0040] 温度は、 50°C以上 75°C以下が好ましぐ 60°C以上 65°C以下がより好ましぐ 65°C 力 Sさらに好ましい。静置時間は、 15分以上であれば cDNAの増幅を検出できる力 1 5分以上 1時間以内が好ましぐ 20分以上 40分以内がより好ましい。
[0041] 逆転写酵素、鎖置換型 DNA合成酵素、 dNTPs及び緩衝液としては、例えば、 Lo opamp RNA増幅試薬キット（栄研化学社製）に含まれる各試薬を使用できる。
[0042] また、増幅ステップでは、配列表の配列番号 1〜4で示される塩基配列からなる 4種 類のオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットの代わりに、配列表の配列番号 5及び 6で示される塩基配列からなる 2種類のオリゴヌクレオチドからなるプライマーを加えた 配列表の配列番号 1〜6で示される塩基配列からなる 6種類のプライマーセットを使 用することが好ましい。
[0043] 配列表の配列番号 5で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（以下、 ApMV
LoopFプライマー）及び配列表の配列番号 6で示される塩基配列からなるオリゴヌ クレオチド（以下、 ApMV— LoopBプライマー）は、増幅反応の起点となるダンベル 構造の 5'末端側のループの 1本鎖部分に相補的な配列を持つ Loopプライマーであ る。 ApMV— LoopFは、図 1中の F1領域と F2領域の間の配列に相補的な配列を持 つようにすれば設計でき、 ApMV— LoopBは、図 1中の B1領域と B2領域の間の配 列に相補的な配列を持つようにすれば設計できる。 ApMV— LoopF及び ApMV— LoopBを用いることにより、 DNA合成の起点を増やすことが可能となり、増幅効率が 上がり、増幅に要する時間を 1/3〜； 1/2に短縮することが可能となる。
[0044] 判断ステップでは、配列表の配列番号 8で示される塩基配列を繰り返し含有する c DNAの増幅が上記増幅ステップで認められた場合に、アップルモザイクウィルスが 存在すると判断できる。
[0045] 配列表の配列番号 8で示される塩基配列は、アップルモザイクウィルスのゲノム RN Aの標的領域の一部配列の cDNAであって、上記プライマーセットを用いた RT— L AMP法で繰り返し増幅されるコア配列である。このコア配列に相補的なアップルモ ザイクウィルスのゲノム RNAの塩基配列及び配列表の配列番号 1〜4で示される塩 基配列からなる 4種類のオリゴヌクレオチドがそれぞれァニールするアップルモザイク ウィルスのゲノム RNAの塩基配列は、アップルモザイクウィルスのコートタンパク質遺 伝子の一部配列であり、これらの塩基配列を含有するアップルモザイクウィルスのゲ ノム RNAの領域は、 RT— LAMP法によって cDNAを増幅するための標的領域とし て適している。このため、増幅された cDNAの有無を確認することによって、アップル モザイクウィルスの有無を特異的に検出することを可能にしている。
[0046] アップルモザイクウィルスの有無の判断は、例えば、 RT— LAMP法による cDNA の増幅反応を行った後の反応液を肉眼で観察し、反応液の白濁が確認された場合 にアップルモザイクウィルスが存在したと判断できる。また、この反応液に蛍光インタ 一力レーターを加え、 UV照射下で cDNAの増幅を示す発光が確認された場合にァ ップルモザイクウィルスが存在したと判断できる。
[0047] より詳細にアップルモザイクウィルスの有無を判断するには、例えば、増幅された c DNAを配列表の配列番号 8で示される塩基配列中に存在する制限酵素 Alul又は T aqlで消化して電気泳動を行い、それぞれ 134bpと 75bpの 2つの DNA断片又は 20 9bpの DNA断片が確認された場合にアップルモザイクウィルスが存在したと判断で きる。
[0048] 本発明のアップルモザイクウィルスの検出用プライマーセットは、配列表の配列番 号 1〜4で示される塩基配列からなる 4種類のオリゴヌクレオチドを含むこと又は配列 表の配列番号 1〜6で示される塩基配列からなる 6種類のオリゴヌクレオチドを含むこ とを特徴としている。
[0049] 上記のプライマーセットは、配列表の配列番号;!〜 6のそれぞれの塩基配列情報を もとに、 DNA合成機で合成できる。 [0050] また、本発明のアップルモザイクウィルスの検出方法を使用するために必要な各種 の試薬類は、予めパッケージングしてキット化することができる。具体的には、配列表 の配列番号;!〜 4で示される塩基配列からなる 4種類のオリゴヌクレオチド又は配列 表の配列番号 1〜6で示される塩基配列からなる 6種類のオリゴヌクレオチドを含むプ ライマーセット、核酸合成の基質となる 4種類の dNTPs (dATP、 dCTP、 dGTP及び dTTP)、 RNAから cDNAを合成する逆転写酵素、鎖置換活性を有する鎖置換型 D NA合成酵素、酵素反応に好適な条件を与える緩衝液、補助因子としての塩類（マ グネシゥム塩又はマンガン塩等）、酵素や铸型を安定化する保護剤、さらに必要に応 じて反応生成物の検出に必要な試薬類をキットとして提供できる。
[0051] キットには、本発明のプライマーによって RT— LAMP反応が正常に進行することを 確認するための陽性対照（ポジティブコントロール)を含んでレ、てもよ!/、。陽性対照と しては、例えば、本発明のプライマーにより増幅される領域を含んだ DNAが挙げら れる。
実施例
[0052] 以下、実施例を挙げて本発明について更に詳しく説明する力 本発明はこれらの 実施例に限定されるものではない。
[0053] (実施例 1) RT— LAMP法によるアップルモザイクウィルスの検出
1 )アップルモザイクウィルスの検出に用いるホップ組織サンプルの調製
アップルモザイクウィルスに感染したホップの脇芽由来のホップ試験管苗から根を 除いたものをアップルモザイクウィルス検出用検体とし、ウィルスフリーのホップ試験 管苗から根を除!/、たものをコントロール検体とし、それぞれの検体からホップ組織サ ンプルを調製した。
[0054] アップルモザイクウィルス検出用検体及びコントロール検体は、それぞれ液体窒素 で凍結し、組織がパウダー状になるまで乳鉢で粉砕し、そこに検体重量に対し 5倍量 の蒸留水を加えて縣濁した。こうして得られたアップルモザイクウィルス検出用検体 及びコントロール検体の縣濁液は、それぞれホップ組織サンプルとして以下の実験 に用いた。
[0055] 2) RNA試料の調製 各ホップ組織サンプル（各 40 Uに、それぞれ 160 Lの 2 X CTAB溶液（2% セチルトリメチルアンモニゥムブロミド、 20mM EDTA、 1. 4M NaCl、 5% βーメ ルカプトエタノール、 0.1M トリス、 pH 9.5)を加え、 65°Cで 20分間保温した。その 後、 15, 000回転で 10分間遠心分離して残渣を沈殿として取り除き、その上清を新 しいエツペンドルフチューブに移した。そこに 200 Lのイソプロパノールを加えて混 和し、 15, 000回転で 10分間遠心分離することによって RNAを沈殿として回収し、 7 0%エタノールで洗浄後に風乾し、 40 Lの滅菌水で溶解して RNA試料とした。
[0056] こうして得られたアップルモザイクウィルス検出用検体の RNA試料及びコントロー ル検体の RNA試料は、それぞれ滅菌水で 103倍、 104倍、 105倍、 106倍及び 107倍 に段階希釈し、そのうちの 2 Lを RNA希釈試料として RT— LAMP法による cDNA の増幅反応に供試した。 RNA希釈試料は、ホップ組織サンプルの 2 X 104分の 1、 2 X 105分の 1、 2 X 106分の 1、 2 X 107分の 1及び 2 X 108分の 1にそれぞれ相当する
〇
[0057] 3) RT— LAMP法に使用するプライマー
プライマーには、 FIPプライマーとして ApMV— FIPプライマー（配列番号 1)、 BIP プライマーとして ApMV— BIPプライマー（配列番号 2)、 F3プライマーとして ApMV F3プライマー（配列番号 3)、 B3プライマーとして ApMV— B3プライマー（配列番 号 4)、 Loopプライマーとして八 ^^ーし00 ? (配列番号5)及び八 ^1¥—し00 ：6 ( 配列番号 6)を用いた。これらの 6種類のプライマーを使用して RT— LAMP法による cDNAの増幅を行うことで、アップルモザイクウィルスのコートタンパク質遺伝子の cD NAの一部配列である配列表の配列番号 8で示される塩基配列を繰り返して含有す る cDNAを増幅できる。
[0058] 4) RT— LAMP法による cDNAの増幅
RT— LAMP法による cDNAの増幅は、 Loopamp RNA増幅試薬キット（栄研化 学社製）を用いて行った。具体的には、製造元のプロトコールに従って、反応液に段 階希釈した上記 RNA希釈試料（2 1)をそれぞれ加え、そこに上記の 6種類のプライ マー、逆転写酵素、鎖置換型 DNA合成酵素、 dNTPs及び緩衝液を加え、 65°Cで、 50分間静置した。 [0059] 5)増幅した cDNAの検出
RT— LAMP法による cDNAの増幅が認められる場合には、遊離したピロリン酸が マグネシウムイオンと反応してピロリン酸マグネシウムを形成するため、反応液が白濁 した場合に cDNAの増幅が認められたと判定できる。上記の RT— LAMP法による c DNAの増幅で増幅される cDNAは、アップルモザイクウィルスのコートタンパク質遺 伝子の cDNAの一部配列に相当する配列表の配列番号 8で示される塩基配列であ るため、反応液が白濁した場合にアップルモザイクウィルスが存在すると判断した。
[0060] 表 1は、アップルモザイクウィルス検出用検体の RNA希釈試料及びコントロール検 体の RNA希釈試料を用いて、 RT— LAMP法でアップルモザイクウィルスの検出を 行なった結果である。
[0061] [表 1]
Figure imgf000013_0001
ND :白濁が認められなかったことを示す。
[0062] その結果、コントロール検体の RNA希釈試料では、いずれもアップルモザイクウイ ノレスは検出されなかった力 アップノレモザイクウィルス検出用検体の RNA希釈試料 では、ホップ組織サンプルを 2 X 107培希釈してもアップルモザイクウィルスを検出す ること力 Sできた。以上より、 RT— LAMP法による検出では、アップルモザイクウィルス が感染したアップルモザイクウィルス検出用検体でのみアップルモザイクウィルスが 検出されることが判明し、後述する ELISA法による検出よりも検出感度がはるかに高 いことが示唆された。
[0063] しかしながら、 RT— LAMP法で、非特異的に cDNAが増幅された場合であっても 反応液の白濁は認められるため、以下の実験により確認試験を行った。具体的には 、アップルモザイクウィルス検出用検体の RNA希釈試料を用いた RT— LAMP法に よる cDNAの増幅反応で、 cDNAの増幅が認められた各反応液の 1 μ Lを制限酵素 Alul又は Taqlで消化し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分画し、それぞれ 134bp と 75bpの 2本の DNA断片又は 209bpの DNA断片が検出されるか否かを確認した 。 Alul及び Taqlは配列表の配列番号 8に示される塩基配列中に存在するため、制 限酵素 Alul又は Taqlで消化することにより、 RT— LAMP法で増幅された cDNAを それぞれ 134bpと 75bpの 2本の DNA断片又は 209bpの DNA断片として検出する ことが可能となる。電気泳動後のゲルは、ェチジゥムブロマイド溶液に 10分間浸漬す ることにより分画された DNA断片を染色し、紫外線を照射することにより DNAバンド を可視化できる。
[0064] 図 2は、アップルモザイクウィルス検出用検体の RNA希釈試料を用いて RT— LA MP法で増幅された cDNAを制限酵素 Alul又は Taqlで消化し、ポリアクリルアミドゲ ル電気泳動したときのバンドパターンを示すゲル写真である。
[0065] その結果、 RT— LAMP法による cDNAの増幅反応で白濁が認められ、表 1でアツ プルモザイクウィルスが検出された各反応液中の cDNAは、いずれも制限酵素 Alul 又は Taqlで消化することによりそれぞれ 134bpと 75bpの 2本の DNA断片又は 209 bpの DNA断片のバンドが検出された。 Taqlで消化した cDNAを電気泳動したレー ンのゲノレ中に (ま、 209bpのメジャーノベンドの他に、 155bp、 98bp、 53bpのマイナー バンドが確認される力 LAMP法による cDNAの増幅反応では、標的領域の一部配 列の cDNAがつながった状態で増幅されるため、 209bpのメジャーバンドの他に、 1 55bp、 98bp、 53bpのマイナーバンドが確認されることは正しい結果であるといえる。
[0066] 以上より、上記の実施例 1において、 RT— LAMP法で cDNAの増幅を示す白濁 が認められた場合には、非特異的な cDNAの増幅が起こったのではなぐアップノレ モザイクウィルスのコートタンパク質遺伝子の一部が特異的に増幅したものであること が立証され、アップルモザイクウィルスの検出は、アップルモザイクウィルスの存在に 依存した結果であることが明ら力、となった。
[0067] したがって、実施例 1に示された RT— LAMP法によるアップルモザイクウィルスの 検出方法は、後述する ELISA法によるアップルモザイクウィルスの検出と比べて非 常に高感度な方法であり、反応液の白濁を視覚的に判断するだけで容易にアップル モザイクウィルスの有無を判定できる方法であることが示唆された。
[0068] (比較例 1) ELISA法によるアップルモザイクウィルスの検出 1)アップルモザイクウィルスの検出用の ELISA用プレートの作成
アップルモザイクウィルスを特異的に認識する抗アップルモザイクウィルス抗体（ァ グリア社、米国）を、 0. 05M SCBノ ッファー（1. 59g/L Na CO、 2. 93g/L
2 3
NaHCO、 pH9. 6)で 1 g/mLに希釈し、 96穴マイクロプレートに 0· 2mLずつ
3
注入し、 37°Cで 4時間静置した。その後、 0· 02M PBS -T (8. Og/L NaCl、 0. 2g/L KH PO 2. 9g/L Na HPO - 12H〇、 0. 2g/L KC1、 0. 5mL/L
2 4 2 4 2
tween— 20、 pH7. 4)を用いて 5分間隔で 5回洗浄し、こうして得られた抗体固相プ レートをアップルモザイクウィルスの検出用の ELISA用プレートとして以下の試験に 用いた。
[0069] 2) ELISA法による検出
実施例 1に記載したアップルモザイクウィルス検出用検体及びコントロール検体の 縣濁液から調製した各ホップ組織サンプル (各 40 L)に、 160 Lの蒸留水を加え 、さらに 200 しの PBS— T/PVP溶液（16· 0g/L NaCl、 0. 4g/L KH PO、
2 4
5. 8g/L Na HPO - 12H〇、 0. 4g/L KC1、 1. 0mL/L tween— 20、 40g
2 4 2
/L ポリビュルピロリドン、 pH7. 4)を加えて混合し、 15, 000回転で 10分間遠心 分離し、その上清を回収しタンパク質試料（200 μ L)とした。
[0070] さらに、アップルモザイクウィルス検出用検体及びコントロール検体のタンパク質試 料は、それぞれ PBS— T/PVP溶液で 10倍、 102倍、 103倍に段階希釈し、それぞ れ 200 Lをタンパク質希釈試料として ELISAに供試した。希釈をしていないタンパ ク質試料は、ホップ組織サンプルの 2分の 1に相当し、 10倍、 102倍及び 103倍に段 階希釈したタンパク質希釈試料は、ホップ組織サンプルの 20分の 1、 2 102分の1、 2 X 103分の 1にそれぞれ相当する。
[0071] 次にタンパク質試料及び各タンパク質希釈試料 (各 20011 L)のそれぞれを上記の ELISA用プレートに添加し、ー晚静置した。 0. 02Μ PBS—Tを用いて 5分間隔で 5回洗浄し、アルカリフォスファターゼ標識した抗アップルモザイクウィルス抗体（ァグ リア社、米国）を 0. 02Μ PBS—Tで 1000倍希釈したものを 200〃 Lずつカロえ、 37 °Cで 3時間静置した。その後、 ELISA用プレートの各ゥエルを 0. 02M PBS—Tを 用いて 5分間隔で 5回洗浄し、 200 しの基質溶液（10% Diethanolamine, lg/ L p—ニトロフエニル燐酸ニナトリウム）を加え、室温にて一定時間反応させ、 405η mの吸光度を測定した。
[0072] 表 2は、アップルモザイクウィルス検出用検体のタンパク質試料及び各タンパク質希 釈試料並びにコントロール検体のタンパク質試料及び各タンパク質希釈試料を用い て、 ELISA法でアップルモザイクウィルスの検出を行なった結果である。
[0073] [表 2]
Figure imgf000016_0001
ND :白濁が認められなかったことを示す。
[0074] その結果、コントロール検体の RNA希釈試料では、いずれもアップルモザイクウイ ノレスは検出されな力、つた力 アップノレモザイクウィルス検出用検体のタンパク質試料 及び各タンパク質希釈試料では、ホップ組織サンプルを 20倍希釈したものまでであ ればアップルモザイクウィルスを検出することができた。以上より、 ELISA法による検 出では、アップルモザイクウィルスが感染したアップルモザイクウィルス検出用検体で のみアップルモザイクウィルスが検出され、正常にアップルモザイクウィルスを検出し ていることが確認できた力 上記の RT— LAMP法による検出と比較して、検出感度 が少なくとも 106倍（100万倍)低いことが明らかとなった。
産業上の利用可能性
[0075] 本発明によれば、検体数及び評価を行う場所を選ばず、栽培時 ·収穫時 ·保管時 等のあらゆる季節において、アップルモザイクウィルスを特異的かつ高感度に検出す ること力 Sできる。また、本発明のアップルモザイクウィルスの検出用プライマーセット及 び検出用キットは、 RT— LAMP法に好適に使用でき、アップルモザイクウィルスの 簡易かつ高感度な検出を可能にする。

Claims

請求の範囲
[1] アップノレモザイクウィルスの検出方法であって、
検体からアップルモザイクウィルスの RNAを抽出する抽出ステップと、
配列表の配列番号 1〜4で示される塩基配列からなる 4種類のオリゴヌクレオチドを 含むプライマーセットを用いて、前記 RN Aを鎵型に Re verse transcription -Loo p— mediated isothermal amplification (RT— LAMP)法によって cDNAの増 幅反応を行う増幅ステップと、
配列表の配列番号 8で示される塩基配列を含有する cDNAの増幅が前記増幅ステ ップで認められた場合にアップルモザイクウィルスが存在すると判断する判断ステツ プと、
を含む、検出方法。
[2] 前記増幅ステップは、配列表の配列番号;!〜 6で示される塩基配列からなる 6種類 のオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットを用いて、前記 RNAを铸型に Reverse transcription— Loop— mediated isothermal ampliiic ation (RT― LAMP ) 法によって cDNAの増幅反応を行うステップである、請求項 1記載の検出方法。
[3] 配列表の配列番号 1〜4で示される塩基配列からなる 4種類のオリゴヌクレオチドを 含む、アップノレモザイクウィルスの検出用プライマーセット。
[4] 配列表の配列番号 1〜6で示される塩基配列からなる 6種類のオリゴヌクレオチドを 含む、アップノレモザイクウィルスの検出用プライマーセット。
[5] 請求項 3又は 4記載のプライマーセット、逆転写酵素、鎖置換型 DNA合成酵素、 d NTPs及び緩衝液を含む、アップルモザイクウィルスの検出用キット。
PCT/JP2007/072777 2006-11-30 2007-11-26 Procédé de détection du virus de la mosaïque, ensemble d'amorces et nécessaire destinés à cette détection WO2008066002A1 (fr)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2007800442433A CN101563452B (zh) 2006-11-30 2007-11-26 苹果花叶病毒的检测方法、检测用引物组及检测用试剂盒
NZ578031A NZ578031A (en) 2006-11-30 2007-11-26 Method for detection of apple mosaic virus, primer set for the detection, and kit for the detection
US12/516,960 US20100143909A1 (en) 2006-11-30 2007-11-26 Method for detection of apple mosaic virus, primer set for the detection, and kit for the detection
AT07832502T ATE522606T1 (de) 2006-11-30 2007-11-26 Verfahren zum nachweis von apfelmosaikvirus, primersatz für den nachweis und kit für den nachweis
EP07832502A EP2090653B1 (en) 2006-11-30 2007-11-26 Method for detection of apple mosaic virus, primer set for the detection, and kit for the detection

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2006-324371 2006-11-30
JP2006324371A JP2008136389A (ja) 2006-11-30 2006-11-30 アップルモザイクウイルスの検出方法、検出用プライマーセット及び検出用キット

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2008066002A1 true WO2008066002A1 (fr) 2008-06-05

Family

ID=39467794

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2007/072777 WO2008066002A1 (fr) 2006-11-30 2007-11-26 Procédé de détection du virus de la mosaïque, ensemble d'amorces et nécessaire destinés à cette détection

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20100143909A1 (ja)
EP (1) EP2090653B1 (ja)
JP (1) JP2008136389A (ja)
CN (1) CN101563452B (ja)
AT (1) ATE522606T1 (ja)
NZ (1) NZ578031A (ja)
WO (1) WO2008066002A1 (ja)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102230021A (zh) * 2011-06-03 2011-11-02 宁波检验检疫科学技术研究院 烟草环斑病毒rt-lamp检测试剂及制备方法和应用
CN109423527A (zh) * 2017-08-23 2019-03-05 河南省农业科学院植物保护研究所 采用反转录环介导等温扩增技术检测李属坏死环斑病毒（pnrsv）的方法
US10273544B2 (en) 2010-02-11 2019-04-30 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods for predicting likelihood of responding to treatment
CN111057794A (zh) * 2020-01-07 2020-04-24 徐世彦 一种用于苹果病毒病检测的引物组、试剂盒和检测方法

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101250388B1 (ko) 2011-04-21 2013-04-08 대한민국 콩 바이러스 다중 진단용 특이 프라이머 및 이의 용도
CN103215383A (zh) * 2013-04-28 2013-07-24 福建农林大学 辣椒轻斑驳病毒反转录-环介导等温扩增检测用引物及其应用
CN105349526B (zh) * 2015-11-22 2018-10-02 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所 一种采用多重内引物进行恒温扩增核酸的方法及应用
CN110184387B (zh) * 2019-05-10 2022-12-09 中国热带农业科学院热带生物技术研究所 用于检测anssv的rt-lamp检测引物及其应用、检测试剂和检测方法
CN110184386B (zh) * 2019-05-10 2022-12-09 中国热带农业科学院热带生物技术研究所 用于检测anrsv的rt-lamp检测引物及其应用、检测试剂和检测方法
CN111118224B (zh) * 2020-03-02 2022-07-15 北京市林业果树科学研究院 一种苹果花叶病的检测方法
CN112266979A (zh) * 2020-10-30 2021-01-26 安徽省农业科学院作物研究所 基于西瓜花叶病毒保守区域的rpa检测引物、检测方法及其应用
CN114019159B (zh) * 2021-11-09 2022-08-12 中国科学院西北生态环境资源研究院 一种日本山药花叶病毒的检测引物组合物、试剂盒及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000028082A1 (fr) 1998-11-09 2000-05-18 Eiken Kagaku Kabushiki Kaisha Procede de synthese d'acide nucleique
JP2004089180A (ja) * 2002-05-21 2004-03-25 Sysmex Corp サイトケラチン類の検出のための核酸増幅用プライマーおよび該プライマーを用いた検査方法

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH09173100A (ja) * 1995-10-27 1997-07-08 Sapporo Breweries Ltd ホップ潜在ウイルスの遺伝子及び該ウイルスの検出方法
ATE554164T1 (de) * 2002-02-20 2012-05-15 Sysmex Corp Primer für nukleinsäureamplifikation bei der detektion von haushaltsgen-mrna und testverfahren unter verwendung der primer
US8076080B2 (en) * 2002-05-21 2011-12-13 Sysmex Corporation Nucleic acid amplification primers for detecting cytokeratins and examination method with the use of the primers
JP2005218332A (ja) * 2004-02-04 2005-08-18 Nix Inc ウイルス遺伝子の検出方法
JP2006087407A (ja) * 2004-09-27 2006-04-06 Mitsui Norin Co Ltd アリサイクロバチルス・アシドテレストリスの同定方法
JP4580875B2 (ja) * 2006-01-20 2010-11-17 株式会社東芝 核酸検出法のためのプライマーの設計方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000028082A1 (fr) 1998-11-09 2000-05-18 Eiken Kagaku Kabushiki Kaisha Procede de synthese d'acide nucleique
JP2004089180A (ja) * 2002-05-21 2004-03-25 Sysmex Corp サイトケラチン類の検出のための核酸増幅用プライマーおよび該プライマーを用いた検査方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MANIATIS ET AL.: "Molecular cloning", 1989, COLD SPRING HARBOR LABORATORY PRESS
PETHYBRIDGE ET AL., AUSTRALIAN JOURNAL OF AGRICULTURAL RESEARCH, vol. 55, 2004, pages 765 - 770
PETRZIK K. ET AL.: "Screening of apple mosaic virus in hop cultivars in the Czech Republic by reverse transcription-polymerase chain reaction", ACTA VIROLOGICA, vol. 41, no. 2, 1997, pages 101 - 103, XP003022686 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10273544B2 (en) 2010-02-11 2019-04-30 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods for predicting likelihood of responding to treatment
US11214837B2 (en) 2010-02-11 2022-01-04 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods for predicting likelihood of responding to treatment
CN102230021A (zh) * 2011-06-03 2011-11-02 宁波检验检疫科学技术研究院 烟草环斑病毒rt-lamp检测试剂及制备方法和应用
CN102230021B (zh) * 2011-06-03 2013-04-03 宁波检验检疫科学技术研究院 烟草环斑病毒rt-lamp检测试剂及制备方法和应用
CN109423527A (zh) * 2017-08-23 2019-03-05 河南省农业科学院植物保护研究所 采用反转录环介导等温扩增技术检测李属坏死环斑病毒（pnrsv）的方法
CN111057794A (zh) * 2020-01-07 2020-04-24 徐世彦 一种用于苹果病毒病检测的引物组、试剂盒和检测方法

Also Published As

Publication number Publication date
ATE522606T1 (de) 2011-09-15
US20100143909A1 (en) 2010-06-10
JP2008136389A (ja) 2008-06-19
CN101563452A (zh) 2009-10-21
CN101563452B (zh) 2011-12-21
EP2090653B1 (en) 2011-08-31
EP2090653A1 (en) 2009-08-19
EP2090653A4 (en) 2010-06-30
NZ578031A (en) 2010-11-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2008066002A1 (fr) Procédé de détection du virus de la mosaïque, ensemble d'amorces et nécessaire destinés à cette détection
Nolasco et al. A method combining immunocapture and PCR amplification in a microtiter plate for the detection of plant viruses and subviral pathogens
Zhu et al. PAM-free loop-mediated isothermal amplification coupled with CRISPR/Cas12a cleavage (Cas-PfLAMP) for rapid detection of rice pathogens
WO2008066001A1 (fr) Procédé de détection du virus latent du houblon, ensemble d'amorces et nécessaire destinés à cette détection
JP2009502190A (ja) 臨床試料中のヒトパピローマウイルスの同定用のｉｎｖｉｔｒｏ診断キット
US8580514B2 (en) Microchip for identifying Phellinus species and the method thereof
JP6436598B1 (ja) イチゴの病原ウイルス由来の核酸を特異的に増幅するためのプライマーセットおよびイチゴの病原ウイルスの検出方法
Charoenvilaisiri et al. Development of a multiplex RT-PCR-ELISA to identify four distinct species of tospovirus
JP2009284832A (ja) 耐熱性菌類の検出方法
Ren et al. A reverse transcription loop‐mediated isothermal amplification assay for the detection of strawberry mottle virus
McInnes et al. Comparative structure of viroids and their rapid detection using radioactive and nonradioactive nucleic acid probes
JP2010004881A (ja) パエシロマイセスバリオッティの検出方法
WO2007119557A1 (ja) コイヘルペスウイルス（ｋｈｖ）の検出方法
CZ120598A3 (cs) Způsob kvantitativního stanovení a detekce mikroorganizmů, kit pro kvantitativní stanovení a detekci mikroorganizmů a jejich použití
CN101052720B (zh) H5型或h7型禽流感病毒的检测方法
KR102612102B1 (ko) 화상병균의 ai 균주와 ri 균주의 구별용 프라이머 세트
KR102449286B1 (ko) 표고버섯 신품종 설백향 판별용 caps 마커 및 이의 용도
KR101481246B1 (ko) 수박모자이크바이러스를 검출하기 위한 등온증폭 반응용 프라이머 조성물, 및 이의 이용
JP2010115122A (ja) アスペルギルスフミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｕｍｉｇａｔｕｓ）類縁菌の検出方法
JP2007135526A (ja) キュウリモザイクウイルスの診断法
Roy et al. An evaluation of nucleic acid-based molecular methods for the detection of plant viruses: a systematic review
JP2022123272A (ja) Ｒｔ－ｌａｍｐ法によるサツマイモ病原ウイルスの診断方法の開発
RU2234535C2 (ru) Субстрат для определения активности интегразы вируса иммунодефицита человека
Kumar et al. Diagnostics for production of disease free planting material of potato
KR101481245B1 (ko) 스쿼시모자이크바이러스를 검출하기 위한 등온증폭 반응용 프라이머 조성물, 및 이의 이용

Legal Events

Date Code Title Description
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 200780044243.3

Country of ref document: CN

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 07832502

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2007832502

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 578031

Country of ref document: NZ

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 12516960

Country of ref document: US