WO2008007648A1

WO2008007648A1 - Procédé de classification d'antigène, procédé d'identification d'antigène, procédé d'obtention d' un ensemble d'antigènes ou d'anticorps, procédés de construction d'un panel d'anticorps, anticorps et ens

Info

Publication number: WO2008007648A1
Application number: PCT/JP2007/063689
Authority: WO
Inventors: Atsushi Sugioka; Mototaka Sugiura; Yasushi Akahori; Nobuhiro Hayashi; Akihiko Takasaki; Miwa Morita; Gene Kurosawa; Mariko Sumitomo; Susumu Tsutsumi; Keiko Ogawa; Kazuki Matsuda; Chiho Muramatsu; Noriko Satou; Masachika Azuma; Yoshinori Ukai; Kazuhiro Suzuki; Yoshikazu Kurosawa; Miho Tanaka; Mamoru Shiraishi
Original assignee: Institute For Antibodies Co., Ltd.
Priority date: 2006-07-10
Filing date: 2007-07-09
Publication date: 2008-01-17
Also published as: EP2078732B1; JP2015143226A; EP2975057A1; US20140235833A1; EP2078732A4; EP2078732A1; US20090203538A1; US9388249B2; JP2017012181A; JP2014027941A; JP6063494B2; JP5382692B2; JPWO2008007648A1

Description

抗体の分類法、抗原の同定法、抗体又は抗体セットの取得法、抗体パネルの作成法、並びに抗体又は抗体セット及びその用途

技術分野

[0001] 本発明は複数の抗体を分類する方法、抗原の同定法、抗体の特徴などを表示したパネル、並びに疾患との関連性を有する抗体及びその用途に関する。

背景技術

[0002] 乳癌に対するハーセプチン (非特許文献 1)や悪性 Bリンパ腫に対するリツキサン（非特許文献 2)の成功は、癌に対する治療薬として抗体が有効であることを示した。ある種の抗体は、細胞膜上に存在する抗原分子と複合体を形成することで ADCC作用 (非特許文献 3)及び Z又は CDC作用（非特許文献 4)を発揮し、この作用によって標的細胞 (抗原を発現する細胞）を殺傷する。 ADCC作用や CDC作用がアポトーシスの引き金となることもある。このような抗体の作用は抗原特異的である。つまり、それが認識する抗原を発現している限り、癌細胞であるか正常細胞であるかを区別することなく抗体は作用を及ぼす。従って、癌に対する抗体治療薬開発の成否は、癌特異的に発現し、それを抗体が認識することで ADCC作用や CDC作用が引き起こされることになる抗原をいかに見つけ出す力にかかっている。このような抗原に対する抗体は、正常細胞に対する影響 (副作用）を最小限に抑えつつ標的癌細胞を確実に殺すことが可能な治療薬の有望な候補となる。

[0003] ところで、抗体創薬においては、細胞膜表面に存在する「インタタトな状態の」標的癌抗原を認識する抗体を取得することが不可欠といえるが、標的癌抗原が膜タンパク質であるという理由から、既知の癌抗原に対する抗体であってもその取得には困難が伴っていた。このような問題点を解消すベぐ本発明者らはこれまでに 1000億個もの独立したクローン力もなる巨大なヒト抗体ライブラリーを作製し、それを利用した癌細胞及び組織の細胞膜表面に存在するタンパク質 (細胞表面抗原）に対する抗体の網羅的取得法を確立した。（特許文献 1〜3)。

特許文献 1：国際公開第 01Z062907号パンフレット特許文献 2：国際公開第 2001Z096401号パンフレット

特許文献 3 :特開 2005— 185281号公報

非特干文献 1： Mass R, et ai.: The Concordance Between tne し linical Trials Assay (し TA) and Fluorescence in Situ HyDndization(FISH) in the Herceptin Pivotal Trials. ： Proc Am Soci Clin Oncol 19, 75a, 2000

非特許文献 2 : Berinstein NL, Grillo- Lopez AJ, White CA, Bence- Bruckler I, Malon ey D, Czuczman M, et al. Association of serum Rituximab (IDEC- C2B8) concentrati on and anti-tumor response in the treatment of recurrent low-grade or follicular non -Hodgkin's lymphoma. Annals of Oncology 1998, 9:995—1001.

非特許文献 3 : Bruggemann M., Williams G. T.， Bindon C. I., Clark M. R.， Walker M . R., JeiFeris R., Waldmann H., Neuberger M. S. (1987). Comparison of the effector f unctions of human immunoglobulins using a matched set of chimeric antibodies. J. E xp. Med., 166, 1351-1361.

非特許文献 4 : Loos M. (1982). The classical complement pathway: mechanism of act ivation of the first component by antigen-antibody complexes. Prog. Allergy, 30, 13 5-192. Mol Immunol. 1982 May;19(5):651-7.

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0004] 現在、本発明者らは、細胞表面抗原に対する抗体を網羅的に取得できる状態にある。次の段階として各抗体の抗原の同定、有用な抗体の選別が必要となる。しかしながら、網羅的に取得された抗体の抗原を個別に同定しょうとすれば膨大な労力と時間、及び相当な費用が必要とされる。

また、網羅的に取得された抗体の中には、親和性や反応性等の点力も劣るという理由又は他の抗体と実質的に同等であるとの理由など力不要と考えられるものが含まれている可能性があり、効率的に有用な抗体を選別する手段の提供が求められる。一方、網羅的に取得された抗体の中には診断薬や治療薬の候補など医療的見地力もみて非常に重要な抗体も含まれている可能性がある。

[0005] 以上の背景の下で本発明は、網羅的に取得された、細胞表面抗原に対する抗体が医療分野や研究分野などにおいて有効に利用されることを目指し、そのために有用な手段を提供することを目的とする。即ち本発明は、細胞表面抗原に対する複数の抗体を迅速に分類する手段を提供することを目的とする。また、これらの抗体の抗原を迅速に同定する手段を提供することを目的の一つとする。さらに、これらの手段によって得られる有益な情報の利用促進を図る手段を提供することも目的の一つとする。癌の治療や診断などに有効な抗体を提供することも本発明の目的の一つである。

課題を解決するための手段

以上の目的に鑑み、本発明者らは次のアプローチで抗体の解析を進めた。即ち、取得された抗体に対する細胞表面抗原を発現していると予想される細胞株を用意し、それに対して各抗体を反応させた後、フローサイトメトリー解析を行った。フローサイトメトリー解析の結果を示したヒストグラムに注目し、その類似性を基に各抗体を分類し、複数の抗体グループを得た。そして同一の抗体グループに属する抗体の抗原は共通することを確認した。この事実は、各抗体グループについて代表を選抜し、その抗原を同定すれば全ての抗体の抗原を決定できることを意味する。このように、本発明者らは網羅的且つ迅速に抗原を同定する手段を見出すことに成功した。一方、以上の手法に従って抗体の分類、抗原の同定を行うともに、各抗体グループと臨床検体との反応性を検討し、臨床応用可能な有用な抗体を検索した。その結果、特定の癌種に特異的な新規な抗体を見出すことに成功した。また、臨床検体を使用して得られた情報 (抗体と疾患との関連性）は診断法な!、し治療法の確立に極めて有益になるとの知見を得るに至った。

本発明は主として以上の成果ないし知見に基づき、以下の抗体の分類法などを提供する。

<抗体の分類法 >

[1] 以下のステップを含む、抗体の分類法、

(1)細胞表面抗原を認識する複数の抗体を用意するステップ、

(2)前記抗体の各々を同種類の細胞に接触させるステップ、

(3)ステップ（2)後の各細胞をフローサイトメトリーで解析し、抗体と細胞表面との反応性を示すデータを得るステップ、及び

(4)得られたデータを比較し、その類似性に基づ、て各抗体を分類するステップ。

[2] 前記細胞表面抗原がインタタトな状態の細胞表面抗原である、 [1]に記載の分類法。

[3] 前記細胞表面抗原が癌細胞の細胞表面抗原である、 [1]又は [2]に記載の分類法。

[4] 前記複数の抗体が、細胞表面抗原を認識するものとして抗体ライブラリーの中から選抜された各抗体クローンに由来する抗体の集合力もなる、 [1]に記載の分類法。

[5] 前記抗体ライブラリーがファージ抗体ライブラリーである、 [4]に記載の分類法。

[6] 前記抗体が、標識物質が結合又は融合された抗体である、 [1]に記載の分類法。

[7] 前記抗体が標識物質を含まな!/、抗体であり、ステップ（2)の後、前記細胞に結合した抗体を標識化するステップが実施される、 [1]に記載の分類法。

[8] 前記細胞が株化細胞である、 [1]に記載の分類法。

[9] 前記細胞が株化癌細胞である、 [1]に記載の分類法。

[10] 前記データが抗体結合量と細胞数との関係を示すヒストグラムであり、該ヒストグラムの形状の比較によって前記データの類似性が判定される、 [1]に記載の分類法。

[11] 前記データが抗体結合量と細胞数との関係を示すヒストグラムであり、該ヒストグラムの中央値、最頻値、最大値、範囲、標準偏差、尖度、及び歪度からなる群より選択される一以上の値に基づいて前記データの類似性が判定される、 [1]に記載の分類法。

[12] 前記ヒストグラムの中央値、最頻値、及び尖度の値に基づいて前記データの類似性が判定される、 [11]に記載の分類法。

[13] 前記抗体結合量が蛍光強度で示される、 [10]又は [11]に記載の分類法。

[14] ステップ (4)において、同一の又は類似性の高いデータを与える複数の抗体を一つの抗体グループとして分類する、 [1]に記載の分類法。 [15] 二種類以上の細胞を用意し、各細胞を用いてステップ（2)〜 (4)を行う、 [1] に記載の分類法。

[16] 前記細胞の中で少なくとも二種類の細胞に関して同一又は類似性の高いデータを与える複数の抗体を一つの抗体グループとして分類する、 [15]に記載の分類法。

[17] 分類の際又は分類後、細胞表面抗原に対する反応性が低いと判定された抗体を排除する、 [1]に記載の分類法。

[18] 抗体の分類結果をパネルとして表示する、 [1]に記載の分類法。

[19] ステップ (4)の後、以下のステップを行う、 [1]〜[18]のいずれかに記載の分類法、

(i)分類した抗体にそれぞれ、第 1パラメータ、第 2パラメータ、 · ·、及び第 nパラメ一タカもなる n個のパラメータ（但し、 nは 2以上の整数であり、各パラメータは 2個以上のパラメータ値を有し、各パラメータについて同一のパラメータ値が 2種類以上の抗体に付与される）の組合せを関連付けるステップ、

(ii)同一のパラメータ値を有する抗体を混合した抗体混合物をパラメータ毎に調製するステップ、

(iii)前記抗体混合物の各々について標的抗原との反応性を ELISAで調べ、反応性を示す抗体混合物を特定するステップ、

(iv)特定した抗体混合物が含有する抗体群に共通する、パラメータ名とパラメータ値の組合せを特定するステップ、

(V)ステップ (i)に供した抗体の中から、全パラメータに関して、前記ステップ (iv)で特定した組合せが該当する抗体を選抜するステップ、

(vi)選抜した抗体を一つの抗体グループとして分類するステップ。

[20] 各回の試行でパラメータの組合せが異なる条件下、前記ステップ (i)〜 (V)を複数回試行し、各回の結果が相矛盾しない抗体を選抜し、該抗体について前記ステップ (vi)を行う、 [19]に記載の分類法。

[21] ステップ (V)とステップ (vi)の間に以下のステップを実施する、 [19]に記載の分類法、 (v- 1)ステップ (v)で選抜した各抗体に対して、前記ステップ (i)と同じ要領で n個のパラメータの組合せを新たに関連付けるステップ、

(v- 2)同一のパラメータ値を有する抗体を混合した抗体混合物をパラメータ毎に調製するステップ、

(V— 3)前記抗体混合物の各々について標的抗原との反応性を ELISAで調べ、反応性を示す抗体混合物を特定するステップ、

(V— 4)特定した抗体混合物が含有する抗体群に共通する、パラメータ名とパラメータ値の組合せを特定するステップ、

(V— 5)ステップ (V— 1)に供した抗体の中から、全パラメータに関して、前記ステツプ (V— 4)で特定した組合せに該当する抗体を選抜するステップ。

[22] 前記ステップ (V— l)〜(v— 4)を 2回以上繰り返す、 [21]に記載の分類法。

[23] n= 3である、 [19]〜 [22]のいずれかに記載の分類法。

[24] 二種類以上の標的抗原を用意し、各標的抗原を用いてステップ (iii)〜 (vi)を行う、 [19]〜 [23]のいずれかに記載の分類法。

[25] 前記標的抗原力 HER1、 HER2、 CD46、 ITGA3、 ICAM1、 ALCAM、 CD147、 I gSF4、 BCAM、 ClqR、 CD44、 CD73、 LAR、 EpCAM及び HGFRからなる群より選択される抗原である、 [19]〜 [24]の、ずれかに記載の分類法。

<抗原の同定法 >

[26] 以下のステップを含む、抗原の同定法、

(2)前記抗体の各々を同種類の細胞に接触させるステップ、

(3)ステップ（2)後の各細胞をフローサイトメトリーで解析し、抗体と細胞表面との反応性を示すデータを得るステップ、

(4)得られたデータを比較し、その類似性に基づ!/ヽて各抗体を分類するステップ、

(5)ステップ (4)で形成された各抗体グループより一又は数個の抗体を選抜し、それらの抗原を同定するステップ、及び

(6)同一の抗体グループに属する各抗体の抗原は同一又は相互に高い関連性を有すると推定し、ステップ（5)で同定された抗原を抗体グループに関連付けるステツプ。

[27] ステップ（5)において、各抗体グループより一の抗体が選抜される、 [26]に記載の同定法。

[28] ステップ（5)において、フローサイトメトリー解析の結果より、抗原に対して高反応性であると判断された抗体が選抜される、 [26]に記載の同定法。

[29] ステップ（5)において、抗原の同定が免疫沈降試験、ウェスタンブロット、ァフィ-ティークロマトグラフィー、プロテオミタスの手法 (電気泳動、質量分析、ゲノムデータベース検索、バイオインフォマティックスによる分析）、及び対応遺伝子の発現解祈からなる群より選択される一以上の方法で行われる、 [26]に記載の同定法。

[30] ステップ (5)で同定された抗原と、ステップ (6)で該抗原が関連付けられた抗体グループに属する抗体との反応性を調べ、前記推定が正し、ことを確認するステツプを更に含む、 [26]に記載の同定法。

[31] 抗原の同定結果をパネルとして表示する、 [26]に記載の同定法。

[32] 前記パネルが以下の（a)〜（c)のいずれかである、 [31]に記載の同定法、

(a)ステップ（3)のフローサイトメトリー解析で同一又は相互に類似性の高いデータを与えた複数の抗体が一つの抗体グループとして表示され、各抗体グループとその抗原が関連付けられたパネル、

(b)ステップ（3)のフローサイトメトリー解析で同一又は相互に類似性の高いデータを与えた複数の抗体が一つの抗体グループとして表示され、各抗体グループとそれに認識される細胞表面抗原を発現する細胞とが関連付けられたパネル、及び

(c)ステップ（3)のフローサイトメトリー解析で同一又は相互に類似性の高いデータを与えた複数の抗体が一つの抗体グループとして表示され、各抗体グループと、その抗原と、及び該各抗体グループに認識される細胞表面抗原を発現する細胞とが相互に関連付けられたパネル。

<抗体又は抗体セットの取得法、取得される抗体又は抗体セット >

[33] 以下のステップを含む、特定の疾患との間に関連性を有する抗体の取得法、 (1) [1]に記載の分類法で分類された複数の抗体グループの中から一又は二以上の抗体グループを選抜するステップ、 (2)選抜した各抗体グループの抗体と、特定の疾患との反応性を、一種類又は二種類以上の疾患について調べるステップ、及び

(3) V、ずれかの疾患に対して特異的反応性を示した抗体が属する抗体グループの抗体を有用な抗体として選択するステップ。

[34] 以下のステップを含む、特定の疾患との間に関連性を有する抗体の取得法、

(1) [19]に記載の分類法で分類された複数の抗体グループの中から一又はニ以上の抗体グループを選抜するステップ、

(2)選抜した各抗体グループの抗体と、特定の疾患との反応性を、一種類又は二種類以上の疾患について調べるステップ、及び

[35] 以下のステップを含む、特定の疾患との間に関連性を有する抗体セットの取得法、

(1) [1]に記載の分類法で分類された複数の抗体グループの中から一又は二以上の抗体グループを選抜するステップ、

(3' )二つ以上の抗体が特異的反応性を示した疾患を選抜した後、該疾患に対して特異的反応性を示した抗体が属する抗体グループからそれぞれ抗体を選抜し、選抜した抗体同士を組み合わせるステップ。

[36]

以下のステップを含む、特定の疾患との間に関連性を有する抗体セットの取得法、

(1) [1]に記載の分類法で分類された複数の抗体グループの中から、認識する抗原が異なる二以上の抗体グループを選抜するステップ、

(2)選抜した各抗体グループの抗体と、特定の疾患との反応性を、二種類以上の疾患について調べるステップ、及び

(3) V、ずれかの疾患に対して特異的反応性を示した抗体が属する抗体グループからそれぞれ抗体を選抜し、選抜した抗体同士を組み合わせるステップ。 [37]

(3) V、ずれかの疾患に対して特異的反応性を示した抗体が属する抗体グループの抗体と、該抗体グループと抗原が共通する他の抗体グループの抗体とを選抜し、選抜した抗体同士を組み合わせるステップ。

[38] 以下のステップを含む、特定の疾患との間に関連性を有する抗体セットの取得法、

(1) [1]に記載の分類法で分類された複数の抗体グループの中から、認識する抗原が共通する二以上の抗体グループを選抜するステップ、

(2)選抜した各抗体グループの抗体と、特定の疾患の病態との反応性を、一種類又は二種類以上の病態について調べるステップ、及び

(3)反応性に関する情報を関連付けた上で、前記各抗体グループの抗体同士を組み合わせるステップ。

[39] 以下のステップを含む、特定の疾患との間に関連性を有する抗体セットの取得法、

[40] 以下のステップを含む、特定の疾患との間に関連性を有する抗体セットの取得法、 (1) [19]に記載の分類法で分類された複数の抗体グループの中から、認識する抗原が異なる二以上の抗体グループを選抜するステップ、

(3) V、ずれかの疾患に対して特異的反応性を示した抗体が属する抗体グループからそれぞれ抗体を選抜し、選抜した抗体同士を組み合わせるステップ。

[41] 以下のステップを含む、特定の疾患との間に関連性を有する抗体セットの取得法、

(1) [19]に記載の分類法で分類された複数の抗体グループの中から、認識する抗原が異なる二以上の抗体グループを選抜するステップ、

[42] 以下のステップを含む、特定の疾患との間に関連性を有する抗体セットの取得法、

(1) [19]に記載の分類法で分類された複数の抗体グループの中から、認識する抗原が共通する二以上の抗体グループを選抜するステップ、

[43] 前記疾患が、腎臓癌、肝細胞癌、胆肝癌、肺胞上皮癌、肺扁平上皮癌、肺腺癌、脾臓癌、大腸腺癌、及び卵巣癌力もなる群より選択される疾患である、 [33]〜[ 42]の!、ずれかに記載の取得法。

[44] ステップ（2)において、前記反応性が免疫染色法、免疫沈降法、フローサイトメトリー解析、細胞 ELISA、疾患関連分子 (疾患原因遺伝子産物等）と抗体との分子間相互作用解析、疾患モデル細胞 (ある!/、は動物)への適用試験からなる群より選択される一以上の方法で調べられる、 [33]〜 [42]の、ずれかに記載の取得法。

[45] [33]又は [34]に記載の方法で取得される、単離された抗体。

[46] [35]〜 [42]の、ずれかに記載の方法で取得される抗体セット。

<パネルの作成法、パネル、抗体又は抗体セットとパネルとの組合せ >

[47] 以下のステップを含む、抗体と疾患との関連性を表示したパネルの作成法、

(3)ステップ（2)の結果を抗体毎に関連付け、図又は表形式で表示するステップ。

[48] 以下のステップを含む、抗体と疾患との関連性を表示したパネルの作成法、

[49] 以下のステップを含む、抗体と病態との関連性を表示したパネルの作成法、

[50] 以下のステップを含む、抗体と疾患との関連性を表示したパネルの作成法、

(2)選抜した各抗体グループの抗体と、特定の疾患との反応性を、一種類又は二種類以上の疾患について調べるステップ、及び (3)ステップ（2)の結果を抗体毎に関連付け、図又は表形式で表示するステップ。

[51] 以下のステップを含む、抗体と疾患との関連性を表示したパネルの作成法、

[52] 以下のステップを含む、抗体と病態との関連性を表示したパネルの作成法、

[53] [47]〜 [52]の、ずれかに記載の方法で作成されたパネル。

[54] 以下の（a)〜（d)力もなる群より選択される、抗体又は抗体セットとパネルとの組合せ、

(a) [33]に記載の方法で取得される単離された抗体と、 [47]に記載の方法で作製されたパネルとの組合せ、

(b) [35]に記載の方法で取得される抗体セットと、 [47]に記載の方法で作製されたパネルとの組合せ、

(c) [36]に記載の方法で取得される抗体セットと、 [48]に記載の方法で作製されたパネルとの組合せ、

(d) [37]に記載の方法で取得される抗体セットと、 [48]に記載の方法で作製されたパネルとの組合せ、

(e) [38]に記載の方法で取得される抗体セットと、 [49]に記載の方法で作製されたパネルとの組合せ、

(f) [34]に記載の方法で取得される単離された抗体と、 [50]に記載の方法で作製されたパネルとの組合せ、 (g) [39]に記載の方法で取得される抗体セットと、 [50]に記載の方法で作製されたパネルとの組合せ、

(h) [40]に記載の方法で取得される抗体セットと、 [51]に記載の方法で作製されたパネルとの組合せ、

(i) [41]に記載の方法で取得される抗体セットと、 [51]に記載の方法で作製されたパネルとの組合せ、及び

(j) [42]に記載の方法で取得される抗体セットと、 [52]に記載の方法で作製されたパネルとの組合せ。

[55] 以下のステップを含む、細胞表面抗原が指標となる疾患の検査法、

(1)被検者より分離された細胞又は組織を用意するステップ、

(2)該細胞又は組織と、 [53]に記載のパネルに表示された各抗体との反応性を調ベるステップ、

(3)ステップ（2)の結果を前記パネルに照合するステップ。

<最適な治療法を選択する方法 >

[56] 以下のステップを含む、特定の疾患に対する最適な治療法を選択する方法、

(2)該細胞又は組織と、請求項 53に記載のパネルに表示された各抗体との反応性を調べるステップ、

(3)ステップ（2)の結果を前記パネルに照合するステップ、

(4)照合結果に従!、、有効な抗体を選択するステップ。

[57] 前記有効な抗体が、ステップ（2)にお、て特異的な反応性を示した抗体又はそれと等価な抗体である、 [56]に記載の方法。

[58] 前記特定の疾患が、 HER1、 HER2、 CD46、 ITGA3、 ICAM1、 ALCAM、 CD147 、 IgSF4、 BCAM、 ClqR、 CD44、 CD73、 LAR、 EpCAM及び HGFRからなる群より選択される細胞表面抗原が指標となる疾患である、 [56]又は [57]に記載の方法。

[59] 前記パネルに、 048-006抗体、 057-091抗体、 059-152抗体、 048-040抗体、 0 54- 101抗体、 055- 147抗体、 059- 173抗体、 067- 149抗体、 067- 176抗体、 015- 126抗体、 015- 044抗体、 015- 102抗体、 015- 136抗体、 015- 143抗体、 015- 209抗体、 039- 016抗体、 053- 216抗体、 075- 024抗体、 075- 110抗体、 086- 032抗体、 086- 035抗体、 086-036抗体、 086-061抗体、 086-138抗体、 086-182抗体、 035-224抗体、 045-01 1抗体、 051-144抗体、 052-053抗体、 052-073抗体、 053-049抗体、 3172-120抗体、 066-069抗体、 015-003抗体、 064-002抗体、 064-006抗体、 064-012a抗体、 064-012 b抗体、 064-014抗体、 064-054抗体、 064-085抗体、 064-093抗体、 064-116抗体、 0 65- 183抗体、 067- 142抗体、 068- 007抗体、 052- 033抗体、 053- 042抗体、 053- 051抗体、 053-059抗体、 053-085抗体、 035-234抗体、 040-107抗体、 041-118抗体、 066- 174抗体、 083-040抗体、 029-143抗体、 045-134抗体、 062-101抗体、 062-109抗体、 084-103抗体、 052-274抗体、 029-067抗体、 083-131抗体、 059-053抗体、 064-00 3抗体、 067- 213抗体、 067- 153抗体、 067- 126抗体、 067- 133抗体、 067- 287抗体、 0 64-044抗体、 065-030抗体、 065-358抗体、 066-019抗体、 079-085抗体、 067-024抗体及び 076-048抗体からなる群より選択される二以上の抗体が表示されている、 [56 ]〜 [58]の、ずれかに記載の方法。

[60] 以下のステップを含む、特定の疾患に対する最適な治療法を選択する方法、

(1) 048- 006抗体、 015- 126抗体、 067- 133抗体、 064- 044抗体、 076- 048抗体及び 0 59-053抗体からなる群より選択される一以上の抗体と、扁平上皮癌、腺扁平上皮癌

、細気管支肺胞上皮癌、腺癌、及び大細胞癌からなる群より選択される一以上の疾患の臨床癌組織との反応性が表示されたパネルと、被検者より分離された細胞又は組織を用意するステップ、

(2)該細胞又は組織と、該パネルに表示された各抗体との反応性を調べるステップ

(3)ステップ（2)の結果を前記パネルに照合するステップ、

(4)照合結果に従!、、有効な抗体を選択するステップ。

[61] 前記有効な抗体が、ステップ（2)にお、て特異的な反応性を示した抗体又はそれと等価な抗体である、 [60]に記載の方法。

[62] 前記特定の疾患が、扁平上皮癌、腺扁平上皮癌、細気管支肺胞上皮癌、腺癌、及び大細胞癌力もなる群より選択される疾患である、 [60]又は [61]に記載の方法。 <単離された抗体 >

[63] 以下の (1)〜(3)からなる群より選択される配列番号の組合せ (重鎖可変領域 C DR3のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR3のアミノ酸配列を示す配列番号)で規定される、重鎖可変領域 CDR3と軽鎖可変領域 CDR3を備えること、以下の (4)〜(6)力なる群より選択される配列番号の組合せ (重鎖可変領域 CDR2 のアミノ酸配列を示す配列番号、重鎖可変領域 CDR3のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR2のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR3のアミノ酸配列を示す配列番号)で規定される、重鎖可変領域 CDR2及び CDR3と軽鎖可変領域 CDR2及び CDR3を備えること、

以下の )〜 (9)及び (13)〜(18)力なる群より選択される配列番号の組合せ (重鎖可変領域 CDR1のアミノ酸配列を示す配列番号、重鎖可変領域 CDR2のアミノ酸配列を示す配列番号、重鎖可変領域 CDR3のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR1のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR2のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR3のアミノ酸配列を示す配列番号)で規定される、重鎖可変領域 CDR1〜CDR3と軽鎖可変領域 CDR1〜CDR3を備えること、又は

以下の (10)〜(12)及び (19)〜(24)力もなる群より選択される配列番号の組合せ (重鎖可変領域のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す配列番号)で規定される、重鎖可変領域と軽鎖可変領域を備えること、

を特徴とする HER1に対する特異的結合性を有する単離された抗体。

(1)配列番号: 4、配列番号: 8

(2)配列番号： 12、配列番号： 16

(3)配列番号： 20、配列番号： 24

(4)配列番号： 3、配列番号： 4、配列番号： 7、配列番号： 8

(5)配列番号： 11、配列番号： 12、配列番号： 15、配列番号： 16

(6)配列番号： 19、配列番号： 20、配列番号： 23、配列番号： 24

(7)配列番号： 2、配列番号： 3、配列番号： 4、配列番号： 6、配列番号： 7、配列番号： 8

(8)配列番号： 10、配列番号： 11、配列番号： 12、配列番号： 14、配列番号： 15、配列番号： 16

(9)配列番号： 18、配列番号： 19、配列番号： 20、配列番号： 22、配列番号： 23、配列番号： 24

(10)配列番号： 1、配列番号： 5

(11)配列番号： 9、配列番号： 13

(12)配列番号： 17、配列番号： 21

(13)配列番号： 484(VH CDR1)、配列番号： 485(VH CDR2)、配列番号： 486(VH C DR3)、配列番号： 488(VL CDR1)、配列番号： 489(VL CDR2)、配列番号： 490(VL CDR3)

(14)配列番号： 492(VH CDR1)、配列番号： 493(VH CDR2)、配列番号： 494(VH C DR3)、配列番号： 496(VL CDR1)、配列番号： 497(VL CDR2)、配列番号： 498(VL CDR3)

(15)、配列番号： 500(VH CDR1)、配列番号： 501(VH CDR2)、配列番号： 502(VH C DR3)、配列番号： 504(VL CDR1)、配列番号： 505(VL CDR2)、配列番号： 506(VL CDR3)

(16)配列番号： 508(VH CDR1)、配列番号： 509(VH CDR2)、配列番号： 510(VH C DR3)、配列番号： 512(VL CDR1)、配列番号： 513(VL CDR2)、配列番号： 514(VL CDR3)

(17)配列番号： 516(VH CDR1)、配列番号： 517(VH CDR2)、配列番号： 518(VH C DR3)、配列番号： 520(VL CDR1)、配列番号： 521(VL CDR2)、配列番号： 522(VL CDR3)

(18)配列番号： 524(VH CDR1)、配列番号： 525(VH CDR2)、配列番号： 526(VH C DR3)、配列番号： 528(VL CDR1)、配列番号： 529(VL CDR2)、配列番号： 530(VL CDR3)

(19)配列番号：483(VH)、配列番号： 487(VL)

(20)配列番号：491(VH)、配列番号： 495(VL)

(21)配列番号：499(VH)、配列番号： 503(VL)

(22)配列番号： 507(VH)、配列番号： 511(VL) (23)配列番号： 515(VH)、配列番号： 519(VL)

(24)配列番号： 523(VH)、配列番号： 527(VL)

[64] 以下の (1)に示す配列番号の組合せ (重鎖可変領域 CDR3のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR3のアミノ酸配列を示す配列番号)で規定される重鎖可変領域 CDR3と軽鎖可変領域 CDR3を備えること、

以下の (2)に示す配列番号の組合せ (重鎖可変領域 CDR2のアミノ酸配列を示す配列番号、重鎖可変領域 CDR3のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR2 のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR3のアミノ酸配列を示す配列番号)で規定される、重鎖可変領域 CDR2及び CDR3と軽鎖可変領域 CDR2及び CDR3 を備えること、

以下の (3)及び (5)〜(19)力なる群より選択される配列番号の組合せ (重鎖可変領域 CDR1のアミノ酸配列を示す配列番号、重鎖可変領域 CDR2のアミノ酸配列を示す配列番号、重鎖可変領域 CDR3のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR 1のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR2のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR3のアミノ酸配列を示す配列番号)で規定される、重鎖可変領域 CDR1〜CDR3と軽鎖可変領域 CDR1〜CDR3を備えること、又は

以下の (4)及び (20)〜(34)力なる群より選択される配列番号の組合せ (重鎖可変領域のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す配列番号）で規定される、重鎖可変領域と軽鎖可変領域を備えること、

を特徴とする、 HER2に対する特異的結合性を有する単離された抗体。

(1)配列番号： 28、配列番号： 32

(2)配列番号： 27、配列番号： 28、配列番号： 31、配列番号： 32

(3)配列番号： 26、配列番号： 27、配列番号： 28、配列番号： 30、配列番号： 31、配列番号： 32

(4)配列番号： 25、配列番号： 29

(5)配列番号： 532(VH CDR1)、配列番号： 533(VH CDR2)、配列番号： 534(VH CD R3)、配列番号： 536(VL CDR1)、配列番号： 537(VL CDR2)、配列番号： 538(VL C DR3) (6)配列番号： 540(VH CDR1)、配列番号： 541(VH CDR2)、配列番号： 542(VH CD R3)、配列番号： 544(VL CDR1)、配列番号： 545(VL CDR2)、配列番号： 546(VL C DR3)

(7)配列番号： 548(VH CDR1)、配列番号： 549(VH CDR2)、配列番号： 550(VH CD R3)、配列番号： 552(VL CDR1)、配列番号： 553(VL CDR2)、配列番号： 554(VL C DR3)

(8)配列番号： 556(VH CDR1)、配列番号： 557(VH CDR2)、配列番号： 558(VH CD R3)、配列番号： 560(VL CDR1)、配列番号： 561(VL CDR2)、配列番号： 562(VL C DR3)

(9)配列番号： 564(VH CDR1)、配列番号： 565(VH CDR2)、配列番号： 566(VH CD R3)、配列番号： 568(VL CDR1)、配列番号： 569(VL CDR2)、配列番号： 570(VL C DR3)

(10)配列番号： 572(VH CDR1)、配列番号： 573(VH CDR2)、配列番号： 574(VH C DR3)、配列番号： 576(VL CDR1)、配列番号： 577(VL CDR2)、配列番号： 578(VL CDR3)

(11)配列番号： 580(VH CDR1)、配列番号： 581(VH CDR2)、配列番号： 582(VH C DR3)、配列番号： 584(VL CDR1)、配列番号： 585(VL CDR2)、配列番号： 586(VL CDR3)

(12)配列番号： 588(VH CDR1)、配列番号： 589(VH CDR2)、配列番号： 590(VH C DR3)、配列番号： 592(VL CDR1)、配列番号： 593(VL CDR2)、配列番号： 594(VL CDR3)

(13)配列番号： 596(VH CDR1)、配列番号： 597(VH CDR2)、配列番号： 598(VH C DR3)、配列番号： 600(VL CDR1)、配列番号： 601(VL CDR2)、配列番号： 602(VL CDR3)

(14)配列番号： 604(VH CDR1)、配列番号： 605(VH CDR2)、配列番号： 606(VH C DR3)、配列番号： 608(VL CDR1)、配列番号： 609(VL CDR2)、配列番号： 610(VL CDR3)

(15)配列番号： 612(VH CDR1)、配列番号： 613(VH CDR2)、配列番号： 614(VH C DR3)、配列番号： 616(VL CDR1)、配列番号： 617(VL CDR2)、配列番号： 618(VL CDR3)

(16)配列番号： 620(VH CDR1)、配列番号： 621(VH CDR2)、配列番号： 622(VH C DR3)、配列番号： 624(VL CDR1)、配列番号： 625(VL CDR2)、配列番号： 626(VL CDR3)

(17)配列番号： 628(VH CDR1)、配列番号： 629(VH CDR2)、配列番号： 630(VH C DR3)、配列番号： 632(VL CDR1)、配列番号： 633(VL CDR2)、配列番号： 634(VL CDR3)

(18)配列番号： 636(VH CDR1)、配列番号： 637(VH CDR2)、配列番号： 638(VH C DR3)、配列番号： 640(VL CDR1)、配列番号： 641(VL CDR2)、配列番号： 642(VL CDR3)

(19)配列番号： 644(VH CDR1)、配列番号： 645(VH CDR2)、配列番号： 646(VH C DR3)、配列番号： 648(VL CDR1)、配列番号： 649(VL CDR2)、配列番号： 650(VL CDR3)

(20)配列番号 : 531(VH) 配列番号 535(VL)

(21)配列番号 : 539(VH) 配列番号 543(VL)

(22)配列番号： 547(VH) 配列番号 551(VL)

(23)配列番号 : 555(VH) 配列番号 559(VL)

(24)配列番号 : 563(VH) 配列番号 567(VL)

(25)配列番号 : 571(VH) 配列番号 575(VL)

(26)配列番号 : 579(VH) 配列番号 583(VL)

(27)配列番号 : 587(VH) 配列番号 591(VL)

(28)配列番号 : 595(VH) 配列番号 599(VL)

(29)配列番号 : 603(VH) 配列番号 607(VL)

(30)配列番号 : 611(VH) 配列番号 615(VL)

(31)配列番号 : 619(VH) 配列番号 623(VL)

(32)配列番号 : 627(VH) 配列番号 631(VL)

(33)配列番号 : 635(VH) 配列番号 639(VL) (34)配列番号： 643(VH)、配列番号： 647(VL)

[65] 以下の (1)〜 )力なる群より選択される配列番号の組合せ (重鎖可変領域 C DR3のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR3のアミノ酸配列を示す配列番号)で規定される重鎖可変領域 CDR3と軽鎖可変領域 CDR3を備えること、以下の (8)〜(14)力なる群より選択される配列番号の組合せ (重鎖可変領域 CDR2 のアミノ酸配列を示す配列番号、重鎖可変領域 CDR3のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR2のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR3のアミノ酸配列を示す配列番号)で規定される、重鎖可変領域 CDR2及び CDR3と軽鎖可変領域 CDR2及び CDR3を備えること、

以下の (15)〜(22)からなる群より選択される配列番号の組合せ (重鎖可変領域 CDR 1のアミノ酸配列を示す配列番号、重鎖可変領域 CDR2のアミノ酸配列を示す配列番号、重鎖可変領域 CDR3のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR1のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR2のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR3のアミノ酸配列を示す配列番号)で規定される、重鎖可変領域 CD R1〜CDR3と軽鎖可変領域 CDR1〜CDR3を備えること、又は

以下の (23)〜(30)力なる群より選択される配列番号の組合せ (重鎖可変領域のァミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す配列番号)で規定される、重鎖可変領域と軽鎖可変領域を備えること、

を特徴とする、 CD46抗原に対する特異的結合性を有する単離された抗体。

(1)配列番号： 36、配列番号： 40

(2)配列番号: 44、配列番号: 48

(3)配列番号： 52、配列番号： 56

(4)配列番号： 60、配列番号： 64

(5)配列番号： 68、配列番号： 72

(6)配列番号： 76、配列番号： 80

(7)配列番号： 84、配列番号： 88

(8)配列番号： 35、配列番号： 36、配列番号： 39、配列番号: 40

(9)配列番号: 43、配列番号: 44、配列番号: 47、配列番号: 48 (10)配列番号: 51、配列番号： 52、配列番号： 55、配列番号： 56

(11)配列番号: : 59、配列番号: 60、配列番号: 63、配列番号： 64

(12)配列番号: 67、配列番号: 68、配列番号： 71、配列番号： 72

(13)配列番号: 75、配列番号： 76、配列番号： 79、配列番号： 80

(14)配列番号: : 83、配列番号: 84、配列番号: 87、配列番号： 88

(15)配列番号: 34、配列番号： 35、配列番号： 36、配列番号： 38 配列番号： 39、配列番号: 40

(16)配列番号: 42、配列番号: 43、配列番号: 44、配列番号: 46 配列番号: 47、配列番号: 48

(17)配列番号: : 50、配列番号： 51、配列番号： 52、配列番号： 54 配列番号： 55、配列番号： 56

(18)配列番号: : 58、配列番号： 59、配列番号: 60、配列番号： 62 配列番号： 63、配列番号: 64

(19)配列番号: : 66、配列番号: 67、配列番号: 68、配列番号： 70 配列番号： 71、配列番号： 72

(20)配列番号: : 74、配列番号： 75、配列番号： 76、配列番号： 78 配列番号： 79、配列番号: 80

(21)配列番号: : 82、配列番号: 83、配列番号: 84、配列番号： 86 配列番号： 87、配列番号: 88

(22)配列番号： 756(VH CDR1)、配列番号： 757(VH CDR2)、配列番号： 758(VH C DR3)、配列番号： 760(VL CDR1)、配列番号： 761(VL CDR2)、配列番号： 762(VL

CDR3)

(23)配列番号: : 33、配列番号: : 37

(24)配列番号: :41、配列番号: :45

(25)配列番号: :49、配列番号: : 53

(26)配列番号: : 57、配列番号: : 61

(27)配列番号: : 65、配列番号: : 69

(28)配列番号: : 73、配列番号: : 77 (29)配列番号：81、配列番号： 85

(30)配列番号： 755(VH)、配列番号： 759(VL)

[66] 以下の (1)に示す配列番号の組合せ (重鎖可変領域 CDR3のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR3のアミノ酸配列を示す配列番号)で規定される重鎖可変領域 CDR3と軽鎖可変領域 CDR3を備えること、

以下の (3)及び (5)〜(16)力なる群より選択される配列番号の組合せ (重鎖可変領域 CDR1のアミノ酸配列を示す配列番号、重鎖可変領域 CDR2のアミノ酸配列を示す配列番号、重鎖可変領域 CDR3のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR 1のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR2のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR3のアミノ酸配列を示す配列番号)で規定される、重鎖可変領域 CDR1〜CDR3と軽鎖可変領域 CDR1〜CDR3を備えること、又は

以下の (4)及び (17)〜(28)力なる群より選択される配列番号の組合せ (重鎖可変領域のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す配列番号）で規定される、重鎖可変領域と軽鎖可変領域を備えること、

を特徴とする、 ITGA3に対する特異的結合性を有する単離された抗体。

(1)配列番号： 92、配列番号： 96

(2)配列番号： 91、配列番号： 92、配列番号： 95、配列番号： 96

(3)配列番号： 90、配列番号： 91、配列番号： 92、配列番号： 94、配列番号： 95、

(4)配列番号 : 89、配列番号： 93

(5)配列番号： 676(VH CDR1)、配列番号： 677(VH CDR2)、配列番号： 678(VH CD R3)、配列番号： 680(VL CDR1)、配列番号： 681(VL CDR2)、配列番号： 682(VL C DR3)

(6)配列番号： 684(VH CDR1)、配列番号： 685(VH CDR2)、配列番号： 686(VH CD R3)、配列番号： 688(VL CDR1)、配列番号： 689(VL CDR2)、配列番号： 690(VL C DR3)

(7)配列番号： 692(VH CDR1)、配列番号： 693(VH CDR2)、配列番号： 694(VH CD R3)、配列番号： 696(VL CDR1)、配列番号： 697(VL CDR2)、配列番号： 698(VL C DR3)

(8)配列番号： 700(VH CDR1)、配列番号： 701(VH CDR2)、配列番号： 702(VH CD R3)、配列番号： 704(VL CDR1)、配列番号： 705(VL CDR2)、配列番号： 706(VL C DR3)

(9)配列番号： 708(VH CDR1)、配列番号： 709(VH CDR2)、配列番号： 710(VH CD R3)、配列番号： 712(VL CDR1)、配列番号： 713(VL CDR2)、配列番号： 714(VL C DR3)

(10)配列番号： 716(VH CDR1)、配列番号： 717(VH CDR2)、配列番号： 718(VH C DR3)、配列番号： 720(VL CDR1)、配列番号： 721(VL CDR2)、配列番号： 722(VL CDR3)

(11)配列番号： 724(VH CDR1)、配列番号： 725(VH CDR2)、配列番号： 726(VH C DR3)、配列番号： 728(VL CDR1)、配列番号： 729(VL CDR2)、配列番号： 730(VL CDR3)

(12)配列番号： 732(VH CDR1)、配列番号： 733(VH CDR2)、配列番号： 734(VH C DR3)、配列番号： 736(VL CDR1)、配列番号： 737(VL CDR2)、配列番号： 738(VL CDR3)

(13)配列番号： 740(VH CDR1)、配列番号： 741(VH CDR2)、配列番号： 742(VH C DR3)、配列番号： 744(VL CDR1)、配列番号： 745(VL CDR2)、配列番号： 746(VL CDR3)

(14)配列番号： 748(VH CDR1)、配列番号： 749(VH CDR2)、配列番号： 750(VH C DR3)、配列番号： 752(VL CDR1)、配列番号： 753(VL CDR2)、配列番号： 754(VL CDR3)

(15)配列番号： 764(VH CDR1)、配列番号： 765(VH CDR2)、配列番号： 766(VH C DR3)、配列番号： 768(VL CDR1)、配列番号： 769(VL CDR2)、配列番号： 770(VL CDR3)

(16)配列番号： 772(VH CDR1)、配列番号： 773(VH CDR2)、配列番号： 774(VH C DR3)、配列番号： 776(VL CDR1)、配列番号： 777(VL CDR2)、配列番号： 778(VL CDR3)

(17)配列番号：675(VH)、配列番号： 679(VL)

(18)配列番号: : 683(VH) 配列番号: : 687(VL)

(19)配列番号: : 691(VH) 配列番号: : 695(VL)

(20)配列番号: : 699(VH) 配列番号: ： 703(VL)

(21)配列番号: ： 707(VH) 配列番号: : 711(VL)

(22)配列番号: : 715(VH) 配列番号: : 719(VL)

(23)配列番号: ： 723(VH) 配列番号: ： 727(VL)

(24)配列番号: : 731(VH) 配列番号: : 735(VL)

(25)配列番号: : 739(VH) 配列番号: ： 743(VL)

(26)配列番号: ： 747(VH) 配列番号: : 751(VL)

(27)配列番号: : 763(VH) 配列番号: : 767(VL)

(28)配列番号: : 771(VH) 配列番号: ： 775(VL)

[67] 以下の (1)〜(5)からなる群より選択される配列番号の組合せ (重鎖可変領域 C DR3のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR3のアミノ酸配列を示す配列番号)で規定される重鎖可変領域 CDR3と軽鎖可変領域 CDR3を備えること、以下の (6)〜(10)力なる群より選択される配列番号の組合せ (重鎖可変領域 CDR2 のアミノ酸配列を示す配列番号、重鎖可変領域 CDR3のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR2のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR3のアミノ酸配列を示す配列番号)で規定される、重鎖可変領域 CDR2及び CDR3と軽鎖可変領域 CDR2及び CDR3を備えること、

以下の (11)〜(15)からなる群より選択される配列番号の組合せ (重鎖可変領域 CDR 1のアミノ酸配列を示す配列番号、重鎖可変領域 CDR2のアミノ酸配列を示す配列番号、重鎖可変領域 CDR3のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR1のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR2のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR3のアミノ酸配列を示す配列番号)で規定される、重鎖可変領域 CD R1〜CDR3と軽鎖可変領域 CDR1〜CDR3を備えること、又は

以下の (16)〜(20)力もなる群より選択される配列番号の組合せ (重鎖可変領域のァミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す配列番号)で規定される、重鎖可変領域と軽鎖可変領域を備えること、

を特徴とする、 ICAM1に対する特異的結合性を有する単離された抗体。

(1)配列番号: 100、配列番号: 104

(2)配列番号: 108、配列番号: 112

(3)配列番号: 116、配列番号: 120

(4)配列番号: 124、配列番号: 128

(5)配列番号: 132、配列番号: 136

(6)配列番号： 99、配列番号： 100、配列番号： 103、配列番号： 104

(7)配列番号： 107、配列番号： 108、配列番号： 111、配列番号： 112

(8)配列番号： 115、配列番号： 116、配列番号： 119、配列番号： 120

(9)配列番号： 123、配列番号： 124、配列番号： 127、配列番号： 128

(10)配列番号： 131、配列番号： 132、配列番号： 135、配列番号： 136

(11)配列番号： 98、配列番号： 99、配列番号： 100、配列番号： 102、配列番号： 103 、配列番号： 104

(12)配列番号： 106、配列番号： 107、配列番号： 108、配列番号： 110、配列番号： 1 11、配列番号： 112

(13)配列番号： 114、配列番号： 115、配列番号： 116、配列番号： 118、配列番号： 1 19、配列番号： 120

(14)配列番号： 122、配列番号： 123、配列番号： 124、配列番号： 126、配列番号： 1 27、配列番号： 128

(15)配列番号： 130、配列番号： 131、配列番号： 132、配列番号： 134、配列番号： 1 35、配列番号： 136

(16)配列番号： 97、配列番号： 101

(17)配列番号： 105、配列番号： 109 (18)配列番号： 113、配列番号： 117

(19)配列番号： 121、配列番号： 125

(20)配列番号： 129、配列番号： 133

[68] 以下の (1)〜(5)からなる群より選択される配列番号の組合せ (重鎖可変領域 C DR3のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR3のアミノ酸配列を示す配列番号)で規定される重鎖可変領域 CDR3と軽鎖可変領域 CDR3を備えること、以下の (6)〜(10)力なる群より選択される配列番号の組合せ (重鎖可変領域 CDR2 のアミノ酸配列を示す配列番号、重鎖可変領域 CDR3のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR2のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR3のアミノ酸配列を示す配列番号)で規定される、重鎖可変領域 CDR2及び CDR3と軽鎖可変領域 CDR2及び CDR3を備えること、

以下の (11)〜(15)及び (21)〜(28)力もなる群より選択される配列番号の組合せ (重鎖可変領域 CDR1のアミノ酸配列を示す配列番号、重鎖可変領域 CDR2のアミノ酸配列を示す配列番号、重鎖可変領域 CDR3のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR1のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR2のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR3のアミノ酸配列を示す配列番号)で規定される、重鎖可変領域 CDR1〜CDR3と軽鎖可変領域 CDR1〜CDR3を備えること、又は

以下の (16)〜(20)及び (29)〜(36)力もなる群より選択される配列番号の組合せ (重鎖可変領域のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す配列番号)で規定される、重鎖可変領域と軽鎖可変領域を備えること、

を特徴とする、 ALCAMに対する特異的結合性を有する単離された抗体。

(1)配列番号： 140、配列番号： 144

(2)配列番号： 148、配列番号： 152

(3)配列番号： 156、配列番号： 160

(4)配列番号： 164、配列番号： 168

(5)配列番号： 172、配列番号： 176

(6)配列番号： 139、配列番号： 140、配列番号： 143、配列番号： 144

(7)配列番号： 147、配列番号： 148、配列番号： 151、配列番号： 152 (8)配列番号： 155、配列番号： 156、配列番号： 159、配列番号： 160

(9)配列番号： 163、配列番号： 164、配列番号： 167、配列番号： 168

(10)配列番号： 171、配列番号： 172、配列番号： 175、配列番号： 176

(11)配列番号： 138、配列番号： 139、配列番号： 140、配列番号： 142、配列番号： 1 43、配列番号： 144

(12)配列番号： 146、配列番号： 147、配列番号： 148、配列番号： 150、配列番号： 1 51、配列番号： 152

(13)配列番号： 154、配列番号： 155、配列番号： 156、配列番号： 158、配列番号： 1 59、配列番号： 160

(14)配列番号： 162、配列番号： 163、配列番号： 164、配列番号： 166、配列番号： 1 67、配列番号： 168

(15)配列番号： 170、配列番号： 171、配列番号： 172、配列番号： 174、配列番号： 1 75、配列番号： 176

(16)配列番号： 137、配列番号： 141

(17)配列番号： 145、配列番号： 149

(18)配列番号： 153、配列番号： 157

(19)配列番号： 161、配列番号： 165

(20)配列番号： 169、配列番号： 173

(21)配列番号： 780(VH CDR1)、配列番号： 781(VH CDR2)、配列番号 782(VH CD R3)、配列番号： 784(VL CDR1)、配列番号： 785(VL CDR2)、配列番号： 786(VL C DR3)

(22)配列番号： 788(VH CDR1)、配列番号： 789(VH CDR2)、配列番号： 790(VH C DR3)、配列番号： 792(VL CDR1)、配列番号： 793(VL CDR2)、配列番号： 794(VL CDR3)

(23)配列番号： 796(VH CDR1)、配列番号： 797(VH CDR2)、配列番号： 798(VH C DR3)、配列番号： 800(VL CDR1)、配列番号： 801(VL CDR2)、配列番号： 802(VL CDR3)

(24)配列番号： 804(VH CDR1)、配列番号： 805(VH CDR2)、配列番号： 806(VH C DR3)、配列番号： 808(VL CDR1)、配列番号： 809(VL CDR2)、配列番号： 810(VL CDR3)

(25)配列番号： 812(VH CDR1)、配列番号： 813(VH CDR2)、配列番号： 814(VH C DR3)、配列番号： 816(VL CDR1)、配列番号： 817(VL CDR2)、配列番号： 818(VL CDR3)

(26)配列番号： 820(VH CDR1)、配列番号： 821(VH CDR2)、配列番号： 822(VH C DR3)、配列番号： 824(VL CDR1)、配列番号： 825(VL CDR2)、配列番号： 826(VL CDR3)

(27)配列番号： 828(VH CDR1)、配列番号： 829(VH CDR2)、配列番号： 830(VH C DR3)、配列番号： 832(VL CDR1)、配列番号： 833(VL CDR2)、配列番号： 834(VL CDR3)

(28)配列番号： 836(VH CDR1)、配列番号： 837(VH CDR2)、配列番号： 838(VH C DR3)、配列番号： 840(VL CDR1)、配列番号： 841(VL CDR2)、配列番号： 842(VL

CDR3)

(29)配列番号: ： 779(VH) 配列番号: : 783(VL)

(30)配列番号: : 787(VH) 配列番号: : 791(VL)

(31)配列番号: : 795(VH) 配列番号: : 799(VL)

(32)配列番号: : 803(VH) 配列番号: : 807(VL)

(33)配列番号: : 811(VH) 配列番号: : 815(VL)

(34)配列番号: : 819(VH) 配列番号: : 823(VL)

(35)配列番号: : 827(VH) 配列番号: : 831(VL)

(36)配列番号: : 835(VH) 配列番号: : 839(VL)

[69] 以下の (1)に示す配列番号の組合せ (重鎖可変領域 CDR3のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR3のアミノ酸配列を示す配列番号)で規定される重鎖可変領域 CDR3と軽鎖可変領域 CDR3を備えること、

以下の (3)に示す配列番号の組合せ (重鎖可変領域 CDR1のアミノ酸配列を示す配列番号、重鎖可変領域 CDR2のアミノ酸配列を示す配列番号、重鎖可変領域 CDR3 のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR1のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR2のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR3のアミノ酸配列を示す配列番号)で規定される、重鎖可変領域 CDR1〜CDR3と軽鎖可変領域 CDR1〜CDR3を備えること、又は

以下の (4)に示す配列番号の組合せ (重鎖可変領域のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す配列番号)で規定される、重鎖可変領域と軽鎖可変領域を備えること、

を特徴とする、 CD147抗原に対する特異的結合性を有する単離された抗体。

(1)配列番号： 180、配列番号： 184

(2)配列番号： 179、配列番号： 180、配列番号： 183、配列番号： 184

(3)配列番号： 178、配列番号： 179、配列番号： 180、配列番号： 182、配列番号： 18 3、配列番号： 184

(4)配列番号： 177、配列番号： 181

[70] 以下の (1)に示す配列番号の組合せ (重鎖可変領域 CDR1のアミノ酸配列を示す配列番号、重鎖可変領域 CDR2のアミノ酸配列を示す配列番号、重鎖可変領域 C DR3のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR1のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR2のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR3のアミノ酸配列を示す配列番号)で規定される、重鎖可変領域 CDR1〜CDR3と軽鎖可変領域 CDR1〜CDR3を備えること、又は

以下の (2)に示す配列番号の組合せ (重鎖可変領域のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す配列番号)で規定される、重鎖可変領域と軽鎖可変領域を備えること、

を特徴とする、 ClqRに対する特異的結合性を有する単離された抗体。

(1)配列番号： (VH CDR1)452、配列番号： 453(VH CDR2)、配列番号： 454(VH CD R3)、配列番号： (VL CDR1)456、配列番号： 457(VL CDR2)、配列番号： 458(VL C DR3)

(2)配列番号： 451(VH)、配列番号： 455(VL)

[71] 以下の (1)に示す配列番号の組合せ (重鎖可変領域 CDR1のアミノ酸配列を示す配列番号、重鎖可変領域 CDR2のアミノ酸配列を示す配列番号、重鎖可変領域 C DR3のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR1のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR2のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR3のアミノ酸配列を示す配列番号)で規定される、重鎖可変領域 CDR1〜CDR3と軽鎖可変領域 CDR1〜CDR3を備えること、又は

を特徴とする、 CD44に対する特異的結合性を有する単離された抗体。

(1)配列番号： 460(VH CDR1)、配列番号： 461(VH CDR2)、配列番号： 462(VH CD R3)、配列番号： 464(VL CDR1)、配列番号： 465(VL CDR2)、配列番号： 466(VL C DR3)

(2)配列番号： 459(VH)、配列番号： 463(VL)

[72] 以下の (1)に示す配列番号の組合せ (重鎖可変領域 CDR1のアミノ酸配列を示す配列番号、重鎖可変領域 CDR2のアミノ酸配列を示す配列番号、重鎖可変領域 C DR3のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR1のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR2のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR3のアミノ酸配列を示す配列番号)で規定される、重鎖可変領域 CDR1〜CDR3と軽鎖可変領域 CDR1〜CDR3を備えること、又は

を特徴とする、 CD73に対する特異的結合性を有する単離された抗体。

(1)配列番号： 468(VH CDR1)、配列番号： 469(VH CDR2)、配列番号： 470(VH CD R3)、配列番号： 472(VL CDR1)、配列番号： 473(VL CDR2)、配列番号： 474(VL C DR3)

(2)配列番号： 467(VH)、配列番号： 471(VL)

[73] 以下の (1)に示す配列番号の組合せ (重鎖可変領域 CDR1のアミノ酸配列を示す配列番号、重鎖可変領域 CDR2のアミノ酸配列を示す配列番号、重鎖可変領域 C DR3のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR1のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR2のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR3のアミノ酸配列を示す配列番号)で規定される、重鎖可変領域 CDR1〜CDR3と軽鎖可変領域 CDR1〜CDR3を備えること、又は

を特徴とする、 EpCAMに対する特異的結合性を有する単離された抗体。

(1)配列番号： 476(VH CDR1)、配列番号： 477(VH CDR2)、配列番号： 478(VH CD R3)、配列番号： 480(VL CDR1)、配列番号： 481(VL CDR2)、配列番号： 482(VL C DR3)

(2)配列番号: 475(VH)、

配列番号： 479(VL)

[74] 以下の (1)〜(3)からなる群より選択される配列番号の組合せ (重鎖可変領域 C DR1のアミノ酸配列を示す配列番号、重鎖可変領域 CDR2のアミノ酸配列を示す配列番号、重鎖可変領域 CDR3のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR1のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR2のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR3のアミノ酸配列を示す配列番号)で規定される、重鎖可変領域 C DR1〜CDR3と軽鎖可変領域 CDR1〜CDR3を備えること、又は

以下の (4)〜(6)力なる群より選択される配列番号の組合せ (重鎖可変領域のァミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す配列番号)で規定される、重鎖可変領域と軽鎖可変領域を備えること、

を特徴とする、 HGFRに対する特異的結合性を有する単離された抗体。 (1)配列番号： 652(VH CDR1)、配列番号： 653(VH CDR2)、配列番号： 654(VH CD R3)、配列番号： 656(VL CDR1)、配列番号： 657(VL CDR2)、配列番号： 658(VL C DR3)

(2)配列番号： 660(VH CDR1)、配列番号： 661(VH CDR2)、配列番号： 662(VH CD R3)、配列番号： 664(VL CDR1)、配列番号： 665(VL CDR2)、配列番号： 666(VL C DR3)

(3)配列番号： 668(VH CDR1)、配列番号： 669(VH CDR2)、配列番号： 670(VH CD R3)、配列番号： 672(VL CDR1)、配列番号： 673(VL CDR2)、配列番号： 674(VL C DR3)

(4)配列番号： 651(VH)、配列番号： 655(VL)

(5)配列番号： 659(VH)、配列番号： 663(VL)

(6)配列番号： 667(VH)、配列番号： 671(VL)

[75] 以下の (1)〜(5)からなる群より選択される配列番号の組合せ (重鎖可変領域のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す配列番号)で規定される、重鎖可変領域と軽鎖可変領域を備えること、

を特徴とする、 LARに対する特異的結合性を有する単離された抗体。

(1)配列番号： 944(VH)、配列番号： 945(VL)

(2)配列番号： 946(VH)、配列番号： 947(VL)

(3)配列番号： 948(VH)、配列番号： 949(VL)

(4)配列番号： 950(VH)、配列番号： 951(VL)

(5)配列番号： 952(VH)、配列番号： 953(VL)

[76] 以下の (1)に示す配列番号の組合せ (重鎖可変領域のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す配列番号)で規定される、重鎖可変領域と軽鎖可変領域を備えること、

を特徴とする、 BCAMに対する特異的結合性を有する単離された抗体。

(1)配列番号： 954(VH)、配列番号： 955(VL)

<単離された核酸分子、ベクターなど >

[77] [63]〜 [76]の、ずれかに記載の抗体の重鎖可変領域及び Z又は軽鎖可変領域をコードする、単離された核酸分子。

[78] [77]に記載の核酸分子を発現可能に保持するベクター。

[79] [77]に記載の核酸分子が導入されて!ヽる形質転換体。

[80] [63]〜 [76]の、ずれかに記載の抗体を有効成分として含む癌治療剤。

[81] [63]〜 [76]の、ずれかに記載の抗体を含んでなる癌検査用又は癌研究用試薬。

[0013] <検査法>

[82] 胆肝癌又は脾臓癌の検査法であって、

(1)生体から分離された被検細胞又は組織を用意するステップ、及び

(2)被検細胞又は組織を対象として CD46抗原を検出するステップ、

を含む方法。

[83] 胆肝癌又は脾臓癌の検査法であって、

(2)被検細胞又は組織を対象として ITGA3を検出するステップ、

を含む方法。

[84] 腎臓癌、肝細胞癌又は胆肝癌の検査法であって、

(2)被検細胞又は組織を対象として ALCAMを検出するステップ、

を含む方法。

[85] 腎臓癌の検査法であって、

(2)被検細胞又は組織を対象として CD147抗原を検出するステップ、

を含む方法。

図面の簡単な説明

[0014] [図 1]特定の疾患に関連する抗体又は抗体セットの取得法の一例を示す図。

[図 2]特定の疾患に関連する抗体セットの取得法の他の例を示す図。

[図 3]特定の疾患に関連する抗体セットの取得法の他の例を示す図。

[図 4]特定の疾患に関連する抗体セットの取得法の他の例を示す図。 [図 5]scFv抗体遺伝子ライブラリーの作製に用いたベクターの模式図である。

[図 6]pscFvCA9- E8VHdVLdの構造を模式的に示した図である。

[図 7-l]pscFvCA9-E8VHdVLdのインサート部の塩基配列（配列番号： 401)及びそれにコードされるアミノ酸配列（配列番号: 402)を示した図である。

[図 7- 2]図 7— 1の続き。

[図 8-l]pscFvCA-E8VHdのインサートの塩基配列（配列番号: 405)及び制限酵素サイトと塩基配列によってコードされるアミノ酸配列（配列番号: 406)を示した図である

[図 8-2]図 8— 1の続き。

[図 9]肝癌細胞特異的抗体クローンのスクリーング過程を示す図である。

[図 10]抗体クローンの FCM反応性（代表例）。抗体クローン 035-011及び 041-101と未分化悪性肝臓癌細胞株 HLFとの反応性を示すヒストグラム (右)及び細胞蛍光染色像 (左）が示される。

[図 11]抗体クローンの FCM反応性（代表例）。抗体クローン 041- 129、 045- 134及び 05 2-042と未分化悪性肝臓癌細胞株 HLFとの反応性を示すヒストグラム (右)及び細胞蛍光染色像 (左）が示される。

[図 12]7種類の抗体について FCMで得られたヒストグラムを重ね書きした図。各ヒストグラムがユニークな形状を有することがわかる。

[図 13]7種類の抗体について FCMで得られたヒストグラムを重ね書きした図。全てのヒストグラムが相互に高い類似性を有することがわかる。

[図 14]4種類の抗体について FCMで得られたヒストグラムを重ね書きした図。全てのヒストグラムが相互に高い類似性を有することがわかる。

[図 15]2種類の抗体について FCMで得られたヒストグラムを重ね書きした図。二つのヒストグラムが相互に高い類似性を有することがわかる。

[図 16]3種類の抗体について、様々な細胞を対象に FCMを行い得られたヒストグラムを重ね書きした図。いずれの細胞を用いても、これらの抗体は相互に類似性の高いヒストグラムを与えることがわかる。

圆 17]FCM解析の結果を基に抗体群をグループィ匕する方法を示す図。 [図 18]FCM解析の結果を基に複数の抗体クローンを分類した表。表中の各記号は、ネガティブコントロール抗体が与えるヒストグラム（基準ヒストグラム）力ものシフト量を示す。◎はシフト量が 20倍以上であること (ヒストグラムのピーク値力基準ヒストグラムのピーク値の 20倍以上）、〇は同 10倍以上であること、△は同 3倍であること、 X は同 3倍未満であることをそれぞれ示す (斜線はデータなし)。

[図 19]CD147を対象抗原とした RNAiの結果。灰色 (a)； RNAiを行わなかった細胞に対し抗インフルエンザ抗体 YA14cp3を一次抗体として細胞染色、緑色 (b)； RNAiを行わなかった細胞に対し、 059-053cp3を一次抗体として細胞染色、赤色 (c)； RNAiを行つた細胞に対し、 059-053cp3を一次抗体として細胞染色。

[図 20]CD166を対象抗原とした RNAiの結果。灰色 (a)； RNAiを行わなかった細胞に対し抗インフルエンザ抗体 YA14cp3を一次抗体として細胞染色、緑色 (b)； RNAiを行わなかった細胞に対し、 035-234cp3を一次抗体として細胞染色、赤色 (c)； RNAiを行つた細胞に対し、 035-234cp3を一次抗体として細胞染色。

[図 21]HER1を対象抗原とした RNAiの結果。灰色 (a) ; RNAiを行わなかった細胞に対し抗インフルエンザ抗体 YA14cp3を一次抗体として細胞染色。緑色 (b)； RNAiを行わなかった細胞に対し、 048-006cp3を一次抗体として細胞染色。赤色 (c) ; RNAiを行つた細胞に対し、 048-006cp3を一次抗体として細胞染色。

[図 22]HER2を対象抗原とした RNAiの結果。灰色 (a)； RNAiを行わなかった細胞に対し抗インフルエンザ抗体 YA14cp3を一次抗体として細胞染色、緑色 (b)； RNAiを行わなかった細胞に対し、 015-126cp3を一次抗体として細胞染色、赤色 (c) ;RNAiを行つた細胞に対し、 015-126cp3を一次抗体として細胞染色。

[図 23]IgSF4を対象抗原とした RNAiの結果。灰色 (a)； RNAiを行わなかった細胞に対し抗インフルエンザ抗体 YA14cp3を一次抗体として細胞染色、水色 (b)； RNAiを行わなかった細胞に対し、 035-273cp3を一次抗体として細胞染色、橙色 (c) ; RNAiを行った細胞に対し、 035-273cp3を一次抗体として細胞染色。

[図 24]A: 048-006抗体及び 059-15抗体の EGF結合阻害活性 (A431細胞を使用）。 B : 048-006抗体の EGF結合阻害活性 (低濃度領域、 A431細胞を使用）。 C : 048-006 抗体の EGF結合阻害活性 (低濃度領域、 A431細胞を使用）。 [図 25] A : 048-006抗体、 059-152抗体の HERlリン酸化シグナル阻害活性（ウェスタンブロットの結果）。レーン 1 ;抗体無添加、レーン 2 ;HRl-007添加（10 /z g/ml)、レーン 3 ;048- 006抗体添加（1 g/ml)、レーン 4 ;048- 006抗体添加（10 /z g/ml)、レーン 5 ;059- 152抗体添加（1 g/ml)、レーン 6 ;059- 152抗体添加（10 /z g/ml)。上段は、抗リン酸化チロシン抗体（マウスモノクローナル抗体）によるウェスタンブロットの結果。下段は、抗 j8 actin抗体（ゥサギポリクローナル抗体）によるウェスタンブロットの結果。 B : 048-006抗体の HER1リン酸化シグナル阻害活性 (低濃度領域)。レーン 1；無処理、レーン 2 ;抗体無添加、レーン 3 ;HRl-007添加（1 g/ml)、レーン 4 ;048-006抗体添カ卩 (0.5 μ g/ml)、レーン 5 ;048— 006抗体添加 (0.1 μ g/ml)、レーン 6 ;048— 006抗体添加（0.05 g/ml)。抗体と 30分間インキュベーションの後 Herlが添加された。上段は、抗リン酸化チロシン抗体（マウスモノクローナル抗体）によるウェスタンブロットの結果。下段は、抗 j8 actin抗体（ゥサギポリクローナル抗体）によるウェスタンブロットの結果。 C： 048-006抗体及び 059-152抗体と Erbitux (ェルビタックス）の HER1リン酸化シグナル阻害効果の比較 (A-431細胞を使用。レーン l ;HRl-007、レーン 2 ;048-00 6抗体、レーン 3 ;059- 152抗体、レーン 4 ;Erbitux、レーン 5 ;抗体無添加（EGF(+))、レーン 6；抗体無添加 (EGF(-))。 D： 048-006抗体及び 059-152抗体と Erbitux (ェルビタックス）の HER1リン酸化シグナル阻害効果の比較（CCF-RC1細胞を使用）。レーン 1 ;HR1- 007、レーン 2 ;048- 006抗体、レーン 3 ;059- 152抗体、レーン 4 ;Erbitux、レーン 5；抗体無添加 (EGF(+))、レーン 6；抗体無添加 (EGF(-))。 E： 048-006抗体及び 05 9-152抗体クローンと Erbitux (ェルビタックス）の HER1リン酸化シグナル阻害効果の比較（Caki-1細胞を使用）。レーン l ;HRl-007、レーン 2 ;048-006抗体、レーン 3 ;05 9- 152抗体、レーン 4 ;Erbitux、レーン 5 ;抗体無添加（EGF(+))、レーン 6 ;抗体無添加（EGF (-))。

[図 26]BIACORE実験結果。固定方法： BIAcoreの CM5チップを使用し NHSを使用して HER1の部分配列をセンサーに固定。 048-006抗体を標記の濃度で流し、シグナルを観察した。

[図 27]ADCC活性試験の結果を示す図。使用抗体: ITGA3抗体、標的培養細胞: HL F₀ [図 28]ADCC活性試験の結果を示す図。使用抗体: HER1抗体、標的培養細胞: A-4 31。

[図 29]ADCC活性試験の結果を示す図。使用抗体: HER1抗体、標的培養細胞: A54 9。

[図 30]ADCC活性試験の結果を示す図。使用抗体: HER1抗体、標的培養細胞: AC HN。

[図 31]ADCC活性試験の結果を示す図。使用抗体: HER1抗体、標的培養細胞: CC F-RC-1₀

[図 32]ADCC活性試験の結果を示す図。使用抗体: HER1抗体、標的培養細胞: NCI - H1373。

[図 33]ADCC活性試験の結果を示す図。使用抗体: HER1抗体、標的培養細胞: SK- OV- 3。

[図 34]ADCC活性試験の結果を示す図。使用抗体: HER2抗体、標的培養細胞: BT- 474₀

[図 35]ADCC活性試験の結果を示す図。（a)使用抗体: ALCAM抗体である 066-174 、標的培養細胞: NCト H1373。（b)使用抗体: ALCAM抗体である 066-174、標的培養細胞： CW2。（c)使用抗体: ALCAM抗体である 066-174、標的培養細胞： NCI-H44 1。

[図 36]ADCC活性試験の結果を示す図。（a)使用抗体: ALCAM抗体である 035-234 、標的培養細胞: CW2。（b)使用抗体：： ALCAM抗体である 035-234、標的培養細胞： NCI-H441₀

[図 37]ADCC活性試験の結果を示す図。（a)使用抗体： ICAM抗体である 053-051、標的培養細胞: NCI-H441。（b)使用抗体: ICAM抗体である 053-051、標的培養細胞： HepG2。

[図 38]ADCC活性試験の結果を示す図。（a)使用抗体： ICAM抗体である 053-059、標的培養細胞: NCI-H441。（b)使用抗体: ICAM抗体である 053-059、標的培養細胞： HepG2。

[図 39]ADCC活性試験の結果を示す図。（a)使用抗体： ICAM抗体である 053-085、標的培養細胞: NCI-H441。（b)使用抗体: ICAM抗体である 053-085、標的培養細胞： HepG2。

[図 40]ADCC活性の抗体用量依存性。使用抗体: HER1抗体である 048-006抗体又は 059-152抗体、標的培養細胞： CCF-RC- 1。

[図 41]ADCC活性の抗体用量依存性。使用抗体: HER1抗体である 048-006抗体又は 059-152抗体、標的培養細胞： NCI-H1373。

[図 42]ADCC活性の抗体用量依存性。使用抗体: HER1抗体である 048-006抗体又は 059-152抗体、標的培養細胞: A-431。

[図 43]ADCC活性の抗体用量依存性。使用抗体: ALCAM抗体である 041-118抗体、標的培養細胞： NCト H 1373。

[図 44]ADCC活性の抗体用量依存性。使用抗体: EPCAM抗体である 067-153抗体、標的培養細胞: MKN-45。

[図 45]ADCC活性の抗体用量依存性。使用抗体: EPCAM抗体である 067-153抗体、標的培養細胞: HT-29。

[図 46]ADCC活性の抗体用量依存性。使用抗体: EPCAM抗体である 067-153抗体、標的培養細胞： NCト H 1373。

[図 47]ADCC活性の抗体用量依存性。使用抗体: HGFR抗体である 067-133抗体、標的培養細胞： NCト H 1373。

[図 48]細胞増殖阻害試験の結果を示す図。使用抗体: HER1抗体 (048-006)、標的対象培養細胞: A-431。

[図 49]細胞増殖阻害試験の結果を示す図。使用抗体: HER1抗体 (048-006)、標的対象培養細胞: ACHN。

[図 50]細胞増殖阻害試験の結果を示す図。使用抗体: HER1抗体 (048-006)、標的対象培養細胞： NCI- H 1373。

[図 51]細胞増殖阻害試験の結果を示す図。使用抗体: HER1抗体 (048-006)、標的対象培養細胞： SK-OV-3。

[図 52]細胞増殖阻害試験の結果を示す図。使用抗体: HER2抗体 (015-126)、標的対象培養細胞: BT-474。 [図 53]マウスを用いた抗腫瘍実験の結果を示す図。使用抗体： HER1抗体 (048-006) 、対象移植細胞：ヒト肺癌細胞 H1373細胞。

[図 54]マウスを用いた抗腫瘍実験の結果を示す図。使用抗体： HER1抗体 (048-006) 、対象移植細胞:類上皮腫 A-431。

[図 55]マウスを用いた抗腫瘍実験の結果を示す図。使用抗体： HER1抗体 (048-006) 、対象移植細胞:類上皮腫 A-431。

[図 56]マウスを用いた抗腫瘍実験の結果を示す図。使用抗体： HER1抗体 (059-152)

、対象移植細胞:類上皮腫 A-431。

[図 57]実験に使用した細胞株の培養条件を示す表。

[図 58]3次元 ELISAの概念図。各混合抗体の調製の仕方が示される。

[図 59]3次元 ELISAの概念図。抗体クローンの特定の手順が示される。

[図 60]プレート混合抗体を用いた E1ISA (抗原は CD147)の結果。

[図 61]行混合抗体を用いた E1ISA (抗原は CD147)の結果。

[図 62]列混合抗体を用いた E1ISA (抗原は CD147)の結果。

[図 63]プレート混合抗体を用いた E1ISA (抗原は HER1)の結果。

[図 64]行混合抗体を用いた E1ISA (抗原は HER1)の結果。

[図 65]列混合抗体を用いた E1ISA (抗原は HER1)の結果。

[図 66]選抜した抗体クローンを用いた ELISA (抗原は HER1)の結果。

[図 67]SKOv-3細胞に対する RNAi効果。 A:抗 ITGA3抗体、 B :抗 ITGB1抗体、 C : 015

-003 cp3抗体。破線： RNAiなし、実線： ITGA3 RNAi,薄い実線： ITGB1 RNAi,灰色：

1次抗体なし。

[図 68]臨床癌検体を用いた免疫染色によって特異的と判断された組織と、各抗体クローンとの対応関係。

[図 69]臨床癌検体と各抗体クローンの反応性。 +は免疫染色陽性、士は弱陽性、は免疫染色陰性を表す。

発明を実施するための最良の形態

(用語）

説明の便宜上、本明細書に使用される用語の一部についてその定義をまとめて以下に示す。

本明細書にぉ、て用語「〜を含む」又は「〜を含んでなる」は、「〜からなる」の意味をも含む表現として使用される。したがって例えば、「複数の要素 (部材)を含んで構成される物（又は方法)」と記載した場合には、それが意味するものとして「当該複数の要素 (部材)から構成される物 (又は方法)」も当然に考慮される。

[0016] 「疾患」は病気や疾病と同義であり、体に何らかの機能障害が起きている状態をいう。また、特に言及しない限り、本明細書では病状、病態、症状、容態など病気の状態 (様子)を表す語を包括するものとして用語「疾患」を使用する。即ち、用語「疾患」は、病状や病態などと置換可能なものとして使用される。

「単離された」とは、その本来の環境 (例えば天然の物質の場合は天然の環境)から取り出された状態、即ち人為的操作によって本来の存在状態と異なる状態で存在していることを意味する。

「単離された抗体」には、天然であって且つ何ら外的操作 (人為的操作)が施されていない抗体、即ちある個体の体内で産生され、そこに留まっている状態の抗体は含まれない。尚、単離された抗体は、典型的には、他の種類の抗体が混在していない状態、即ち単独で（同種の抗体の集合として)存在している。 CDR領域の場合の「単離された」状態には、単独で存在している状態に加え、抗体の他の領域とともに存在している状態も含まれる。即ち、用語「単離された CDR」には、単独で存在している C DRは勿論のこと、単離された抗体の一部として存在して!/、る CDRも含まれる。

[0017] 「HER1」は別名 erbBl、 c- erbB- 1、 EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor)、又は v- erbBとも呼ばれる。元来、 -ヮトリに感染して発癌 (erythroleukemia)を起こすレトロウィルス中に見出された癌遺伝子 erbBに対応して、ゲノム上に存在する遺伝子が単離され、それ力 ¾GFの受容体であることが判明した。ところで、リガンドである EGF ( Epidermal Growth Factor)は 1962年、マウス顎下線抽出液中に、新生マウスの眼瞼の開裂と、切歯の発生を促進する因子として見いだされ、細胞増殖 '分化'生存因子として幅広く研究されてきた。 EGFは 53個のアミノ酸力もなるペプチドで、 6個のシスティン残基によって形成される 3個のジスルフイドループカゝらなる特徴的な構造を持つ。この構造はその後、数多くの蛋白質にも認められ、 EGF様ドメインと呼ばれている。 EGFファミリ一は、 1個以上の EGF様ドメインを持ち、受容体型チロシンキナーゼ EG F受容体 (EGFR)ファミリー (別名 ErbBファミリー）に直接結合し、これを活性化する。一方、受容体 ErbBファミリ一は、現在 4種が明らかにされており、 EGFR(ErbB-l)、 Er bB-2、 ErbB-3、 ErbB-4と名付けられている。 ErbB-1と ErbB-2はさまざまなヒトの腫瘍に過剰発現し、予後や生存率の低下に関与している。また、これら受容体の刺激は細胞増殖に関与し、さらには腫瘍の進行、浸潤、転移に関わる複数のプロセスに関与している。現在までに、 EGFRに対する特異的リン酸ィ匕阻害剤が肺癌の治療薬として承認されている。多くの癌で高発現が見られており、 ImClone Systems社により cetu ximab (Erbitux,これはマウス/ヒトキメラ抗体)が開発され、既に上巿されている。 Erbit uxは、リガンドである EGFのレセプターへの結合による二量体化 EGFRのリン酸化による情報伝達経路の活性ィ匕の初期過程を阻害する。尚、 HER1のアミノ酸配列を配列番号： 369に示す。

「HER2」は別名 erbB- 2、 c-erbB-2、又は neuと呼ばれる。 HER2はレセプター型チロシンカイネースフアミリーに属し、乳癌、卵巣癌、胃癌などにおいて過剰発現や遺伝子の増幅が報告されている。 1985年にグリア細胞由来の脳腫瘍および乳癌で EGFR 類似遺伝子の領域を含む DNAが増幅（gene amplification)して!/ヽることが見出されたことにより発見された分子である。 HER2はその shedding levelが低ぐ癌治療におけるターゲット分子として非常に有効と考えられている。多くの施設において、腫瘍増殖促進あるいは抑制の作用を示すモノクローナル抗体 (MoAb)が作製されて、る。腫瘍増殖抑制効果を示す MoAbは抗体単独で、あるいはシスブラチンなどの抗癌剤との併用で臨床試験が行われその有効性が報告されている。 EGFRファミリーには 4種類存在するが、リガンド結合部位およびチロシンリン酸ィ匕酵素活性部位両方共有するのは EGFR(HERl)と HER4のみで、 HER2はリガンドを結合できず、その代わり二量体形成能力の点では、リガンドなしに初めから活性ィ匕された構造をとつている。因みに H ER3はチロシンリン酸化活性を欠、て!/、る。そのため HER2-HER3ヘテロ二量体は機能分子となる。 Genentech社は 1989年に既に HER2に対するマウスモノクローン抗体を 11種類単離していた。その中の 4D5をヒト化抗体化して Trastuzumab (Herceptin)開発に成功した。尚、 HER2のアミノ酸配列を配列番号： 370に示す。 [0019] 「CD46抗原」は別名 MCP (Membrane Co-factor Protein)、 gp45- 70、 HuLY- m5、 me asles virus receptor ^ MIC10、 TLX— B antigen ^ TRA2、 trophoblast leucocyte common antigenゝ trophoblast— lymphocyte cross-reactive antigenと呼はれ、分子量 56〜66kD aの O型糖鎖結合非ジスルフイド結合ダイマータンパクである。この分子は、 C3bまたは C4bに結合し、血漿中のセリンプロテアーゼゃ I因子による分解を促す補因子である Membrane Co-factor Protein (MCP)として知られている。はしかウィルス凝集素や A群連鎖球菌表面タンパクのレセプターでもある。胸腺細胞や Tリンパ球、 Bリンパ球、単球、顆粒球、 NK細胞、血小板、内皮細胞、上皮細胞および繊維芽細胞に発現しているが、赤血球には発現していないと報告されている。発癌に際して異常発現する癌特異抗原に対して、抗体産生が誘導され、補体による癌組織の攻撃 (complement- dependent cytotoxicity, CDC)を免れた細胞だけが実際には癌となるのではな!/、かという仮説に立って補体の阻害作用を持つ分子群の発現が詳細に解析されている。癌細胞に於ける CD46の異常発現の報告は多いが、癌特異抗原に対して抗体産生が誘導されていることを示す証拠は少ない。尚、 CD46抗原のアミノ酸配列を配列番号： 371に示す。

[0020] 「ITGA3、integrin alpha3)」は別名 alphajbetal Epiligrin Receptor ^ alpha3betal Integ rin、 Epiligrin Receptor ^ CD49c、 VLA— «3、 Gap b3、 ualactoprotein b3、又 ίま Laminin— 5 Receptorと呼ばれ、分子量 150kDaのインテグリン α 3鎖で、 130kDaのインテグリン j8 1 鎖（CD29分子）と非共有結合的に結合して VLA-3複合体 3 1または CD49c/CD 29)を形成する。ラミニンゃコラーゲン、フイブロネクチン、インべ一シンおよびェピリグリンのレセプターとして知られて、る。インテグリンは α鎖と j8鎖からなるヘテロ二量体分子である。 α鎖には 24種類、 j8鎖には 9種類あり、様々な組合せと選択的スプライシングによって多様な分子集団から構成されて、る。細胞外ドメインは細胞外マトリックス (コラーゲン、フイブロネクチン、ラミニン等）と結合し、細胞質側はタリン、フイラニン、ひァクチニンを介してァクチンフィラメントに結合する。接着分子として機能する力情報伝達分子としての役割が重要である。とりわけ《3 1分子はテトラスパニン分子 C151と会合している。尚、 ITGA3のアミノ酸配列を配列番号： 372に示す。

[0021] iCAMl (Intercellular adhesion molecule— 1)」は另 U名 Intercellular Adhesion Molecul e 1又は CD54 Antigenと呼ばれ、膜貫通糖タンパクであり、 N-結合型糖鎖の結合部位が 7箇所存在する。分子量は 90kDaである。 ICAMは、 Ig-superfamilyに属し、主として白血球の接着に係わることが知られる。抗原提示細胞 (APC)への Tリンパ球接着を媒介し、 T細胞と T細胞、または T細胞と B細胞の相互作用にも関与している。また単球やリンパ球、好中球が活性化した内皮細胞に接着する際にも関与する。 LFA-KC DllaZCD18)および Mac- 1 (CDllbZCD18)のインテグリンに結合する。またライノウィルスのレセプターでもある。内皮細胞の他、活性ィ匕した様々な種類の細胞に発現している。例えば単球に発現し、 Bおよび Tリンパ球、胸腺細胞、榭状細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、角化細胞、軟骨細胞および上皮細胞で発現増強する。上皮細胞が癌化するプロセスで獲得する必要がある性質は、細胞間に侵入 (invasion)すること、更には転移に際して遊送 (migration)し、定着する能力を挙げられる。そこで接着因子の発現が発癌に寄与すると考えられている。接着因子は大きぐセレクチン (E -、 P -、 L -)、免疫グロブリン様ドメインを持つ分子 (Ig-superfamily)、インテグリン、カドヘリンそして CD44と 5群に分けられている。癌化に際して、 Eカドヘリンの発現が抑制されていることは広く認められて、る。幾つかの癌で異常発現して、ることが報告されて、る。尚、 ICAM1のアミノ酸配列を配列番号： 373に示す。

「ALCAM (Activaed leukocyte cell adhesion molecule)]は別名 CD166抗原、 KG— C AM、 CD6 Ligand、 Neurolinとも呼ばれる膜貫通タンパクである。 10箇所の N結合型糖鎖附加部位を含む、免疫グロブリンスーパーファミリー分子である。分子量 100〜105 kDaで、 5個の細胞外 Ig様ドメインと 32アミノ酸の細胞内末端、短い膜貫通領域で構成されている。 ALCAMは接着分子の一つで、活性化された白血球上にあり、 CD6分子 (T細胞でシグナル受容体として働く）に対するリガンド分子として同定された。 ALCA Mは、 homophylic (ALCAM- ALCAM)もしくは heterophylic (ALCAM- CD6)な相互作用で接着因子としても働く。細胞間接着部位で、 ALCAMが膜に近い 3個の C2様ドメインを介してオリゴマーを形成しうることが示唆されて、る。 ALCAMの分布には細胞系統による限定はみられず、造血系細胞、内皮細胞、胸腺皮質及び髄質の上皮細胞、骨髄の間葉系幹細胞、線維芽細胞、肝細胞など様々な細胞種に発現している。末梢血では、活性化 T及び B細胞、単球、循環榭状細胞、そして顆粒球に弱く発現している。広範な組織分布を示す一方で、 ALCAMの発現は通常は増殖や遊走に関与する細胞集団に限定されている。胸腺では、 CD6+胸腺細胞や胸腺上皮細胞に ALC AMが発現することから、 CD6分子との相互作用力細胞の分ィ匕成熟に役立っていると考えられている。他にも、 ALCAM接着分子が胎児造血や血管芽細胞の分化、毛細血管形成に関与して、る可能性が示唆されて、る。 ALCAMの癌化に於ける役割として様々な推定 (MMP活性の制御、 internalizationと recylingが起こる、 ADM17や AD AM10 {a disintegrin and metalloproteaseの略)の基質となってヽる、 apoptosisや autop hasyからの防御)されている力決定的なものはない。 ALCAM- CD6の相互作用は相方向性のものと考えられる。尚、 ALCAMのアミノ酸配列を配列番号： 374に示す。「CD147抗原」は別名 BSG、 TCSF (Tumor cell-derived collagenase stimulatory fact or)、 5F7 protein、 OK blood group protein ^ basigin protein、 collagenase stimulatory f actor protein ^ EMMPRIN (Extracellular matrix metalloproteinase Inducer)、 M6 activ ation antigen ^又は human leukocyte activation antigen Mりなどと呼ばれ、免疫グロブリンスーパーファミリーに属する膜糖タンパク質である。 CD147抗原は 2つの顔を持つ。 1つは細胞表面で機能する場合であり、 2つの Igドメインを持つ膜糖タンパク質として MMP- 1、 2、 3(マトクックスメタ口プロテアーゼ）の活性化およびオリゴマンノースを認識するレクチン活性を発揮する。 MMPの活性ィ匕はとくに癌で注目されて、る（欧米では EMMPRINの名前でも知られる）。すなわち、癌細胞で発現する CD147抗原が周りの線維芽細胞で発現する MMPを活性ィ匕し、癌の浸潤に寄与するというものである。一方、オリゴマンノースレクチンの活性は神経細胞の相互作用に殊に重要で神経突起伸長などとの関わりが指摘されている。 2つ目の顔は細胞内での機能である。 CD147 抗原はホモ 2量体を形成し、それに N末側の Igドメインが必要で糖鎖の付カ卩は不要であると報告されている。 CD147については次のような興味深い報告がある。 integrin α 3 β 1と CD147が複合体を作っており、その場合は TM4SF (tetraspanin)分子は複合体に加わらない。癌化に際して CD 147の産生が anchorage- dependentな growthから inde pendentな growthへの変化を導く力それはヒアルロン酸 (hyaluronam)の産生によって促進されて、る。ヒアルロン酸のレセプターが CD44と RHAMMであることから興味深 V、。 CD147は MMP産生を誘導するがその MMPの作用により CD147の一部は可溶化する。 CD147は integrinと作用し細胞の構造に変化をもたらす。 CD147は血管新生に最も影響を与える。更にじ0147とじじ10 11 Aの大量発現—細胞増殖の関係も見つかっている。

尚、 CD147抗原のアミノ酸配列を配列番号： 375に示す。

[0024] 「IgSF4」は、ィムノグロブリン'スーパーファミリ^ ~ ·メンバー 4 (Immunogloblin superfa mily member4)の略称であり、 BL2、 ST17、 NECL2、 TSLC1、 IGSF4A、 SYNCAM、 sTS LC- 1とも呼ばれ、 NCAM(neural cell adhesion molecule)とアミノ酸配列の相同性を持つ。 IgSF4はヒト 11番染色体の llq23.2から発現していると考えられている。 IgSF4が抑制遺伝子として肺癌特異的に発現して!/ヽること、脳の神経接合に IgSF4が関与してヽること等がこれまで報告されている（Biederer T et al. Science. 2002 Aug 30;297(558 6):1525- 31)。 IgSF4の配列情報は NCBI- PUBMEDデータベースに収録されている。 ( Accession No.NM— 0丄433、 Dennition: Homo sapiens immunoglobulin superfamily, me mber 4 (IGSF4), mRNA)。発癌との関連では TSLCl(tumor suppressor in lung cancer 1)の名前で示される様に、癌抑制遺伝子として注目されている。しかし、 100%の成人性 T細胞白血病 (ATL)細胞で高発現が観察され、癌遺伝子と機能する可能性 (機能は不明）も示唆されている。尚、 IgSF4のアミノ酸配列を配列番号： 376に示す。

[0025] rciqRjは、タイプ I膜蛋白をコードィ匕する補体レセプターである。このタンパク質は補体タンパク質 Clq、マンノース結合性レクチン、及び肺のサーファタタント蛋白 Aのための受容体として作用する。 70kDaの 2つ以上のポリペプチドがジスルドフイド結合し ClqRを形成している。免疫複合体の除去は補体の重要な機能であり、 Clqレセプターは Clqのコラーゲン部分と結合することによって免疫複合体を食細胞と結合させる機能的な受容体である。 CD43と複合体を形成することが示唆されている。尚、 Clq Rのアミノ酸配列を配列番号： 446に示す。

[0026] 「CD44」は、細胞相互作用、細胞接着と細胞移動に関わる細胞表面糖蛋白質である hyaladherinファミリーに属する膜貫通タンパクである。ヒアルロン酸受容体で、この分子の選択的スプライシングゃ翻訳後修飾によるタンパク質の構造的で機能的な多様なアイソフォーム力腫瘍転移に関連している力もしれないと考えられている。 CD4 4分子は、ほとんどの細胞及び組織に発現している力通常、血小板、肝細胞、心筋、腎尿細管上皮、精巣、皮膚には発現していない。尚、 CD44のアミノ酸配列を配列番号： 447に示す。

[0027] 「CD73」は 5- prime- ribonucleotide phosphohydrolaseとも呼ばれ、中性 pH下にて pur ine 5- prime mononucleotidesを nucleosidesに変換する。酵素は原形質膜の外部の表面へのグリコシルホスファチジル.イノシトールを仲介し原形質膜の外部の表面へ結合している。 2つの 70kDaサブユニットのホモダイマーである。リンパ球分化のマーカ一として使用されている。この遺伝子の欠損が様々な免疫欠損病と関連していることがわかっている。尚、 CD73のアミノ酸配列を配列番号： 448に示す。

[0028] 「EpCAM」は、論文で複数回使用、引用されているものだけでも 22以上の呼称を有する。本抗原はゲノム上 2p21に存在し、全長 314aa, 34920 Daの蛋白である。本分子を mRNAレベルで調査した文献では、健常人において末梢血（PB)レベルで 100%、骨髄 (BM)レベルで 40%のヒトから PCRにて検出が見られるようである。臓器別には大腸にては検出出来るが、肝臓、前立腺、肺では検出出来ないとの報告されている。癌細胞株において p53との関連で p53の変異や欠損によって EpCAMのメチレーシヨンが失われ amplificationを誘導するという報告も存在する。尚、 EpCAMのアミノ酸配列を配列番号: 449に示す。

[0029] NIH3T3細胞を用いた癌遺伝子の探索の産物として最初に見つけられた Met遺伝子力 HGFR(Hepatocyte growth factor receptor)である。

factorとも呼はれ、見かけ上の機能が非常に異なる分子として全く独立に単離された。 HGFRは、 HE R1や PDGFと同様に細胞外にリガンド結合ドメインを有し、細胞質側にチロシンリン酸化酵素活性部位を有する受容体だが、その機能が非常に異なる。通常細胞増殖因子や分ィ匕誘導因子がレセプターに結合し、タンパク質のリン酸ィ匕が起こると、限られた幾つかの情報伝達経路 (Ras/MAPキナーゼ経路等）を通って最後に転写因子を活性化して特定の遺伝子セットを発現させる。この場合、その細胞応答の型を最終的に決めるのは転写因子である。そこで癌化によってどれかの増殖因子-レセプターの活性ィ匕が起こった場合も、癌化以外に細胞自身の劇的な変化が起こるとは考えにくい。現在癌化で epithelia卜 mesenchymal transition (EMT)と呼ばれる現象が注目されており、その中で中心的役割を果たす。そういった例では多数の分子が協調的に機能するので詳細な解析が必要となる。尚、 HGFRのアミノ酸配列を配列番号: 450 に示す。

[0030] LAR (Leukocyte common Antigen-Related)は PTP(protein tyrosine phosphatase)フアミリーに属する。 PTPsは細胞の癌化、分裂サイクル、分化、細胞成長などの様々な局面でのプロセスを調節する分子として知られている。構造は細胞外領域、一回膜貫通領域、そして 2つのタンデムな細胞質内触媒ドメイン（protein tyrosine phosphata seのホモログ）に分かれる。細胞外領域は 3つの Ig様ドメインと 9つの非 Ig様ドメインからなる神経細胞接着因子に似た構造 (NCAMのホモログ)を保持して、る。本分子の機能として上皮における adherents junctions形成の細胞接着に関与している。なお本分子はインスリン感受性の肥満細胞、インスリン耐性の細胞にぉ、て高発現が確認されており、インスリンとの関係が示唆されている。また、インスリン受容体強制発現体のインスリン受容体阻害活性を抗抗 LAR抗体が有することが報告されてヽる (Knoc k— down of LAR protein tyrosine phosphatase induces insulin resistance. :Mander A, Hodgkinson CP, Sale GJ.： FEBS Lett. 2005 Jun 6;579(14):3024— 8.)。

また、 LARは、白血球全般の膜に発現しタンパクチ口シンホスファターゼレセプタータイプ F (protein tyrosine phosphatase, receptor type, F； PTPRF)とも呼はれ、 Protei n sequence database of the Protein Information Resource (PIR)に TDHULKとしてタンパク配列（配列番号： 941)が登録されている。

[0031] BCAM (basal cell adhesion molecule) (Lutheran blood group)は、 CD239抗原とも呼ばれ、 Q86VC7(UniProtKB/Swiss-Prot)及び 13800 (PIR)でタンパク配列が登録されている（配列番号： 942)。染色体 19ql3.2_ql3.3における単一な遺伝子力選択的スプライシング産物を生じる。免疫グロブリン様ドメインをもつ糖タンパクである。一回膜貫通型で広く発現するが、すい臓に高発現し、脳での発現が低い。 BCAM抗原は、ある種の細胞で過剰調節され癌悪性化の誘起や、卵巣癌の生体内で過剰発現されていることが示されている。

[0032] 本発明において「肝癌」は広義に解釈することとし、肝癌腫及び肝肉腫を含む。また、本発明において用語「癌」は「腫瘍」と互換的に使用される。また、病理学的に診断が確定される前の段階、すなわち腫瘍としての良性、悪性のどちらかが確定される前には、良性腫瘍、良性悪性境界病変、悪性腫瘍を総括的に含む場合もあり得る。癌はその発生の母体となった臓器の名、もしくは発生母糸且織の名で呼ばれ、主なものを列記すると、舌癌、歯肉癌、咽頭癌、上顎癌、喉頭癌、唾液腺癌、食道癌、胃癌、小腸癌、大腸癌、直腸癌、肝臓癌、胆道癌、胆嚢癌、脾臓癌、肺癌、乳癌、甲状腺癌、副腎癌、脳下垂体腫瘍、松果体腫瘍、子宮癌、卵巣癌、膣癌、膀胱癌、腎臓癌、前立腺癌、尿道癌、網膜芽細胞腫、結膜癌、神経膠腫、神経膠芽細胞腫、皮膚癌、白血病、悪性リンパ腫、睾丸腫瘍、骨肉腫、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫、血管肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫などである。そして、さらに発生臓器の部位の特徴によって、上 *中，下咽頭癌、上部 ·中部 ·下部食道癌、胃噴門癌、胃幽門癌、子宫頸癌、子宮体癌などと細分類されているが、これらが限定的ではなく本発明の「癌」としての記載に含まれる。

[0033] 本明細書では必要に応じて、慣例に従い以下の略号 (括弧内）を使用する。

重鎖 (H鎖)、軽鎖 (L鎖)、重鎖可変領域 (VH)、軽鎖可変領域 (VL)、相補性決定領域 (CDR)、第 1相補性決定領域 (CDR1)、第 2相補性決定領域 (CDR2)、第 3相補性決定領域 (CDR3)重鎖の第 1相補性決定領域 (VH CDR1)、重鎖の第 2相補性決定領域 (VH CDR2)、重鎖の第 3相補性決定領域 (VH CDR3)軽鎖の第 1相補性決定領域 (VL CDR1)、軽鎖の第 2相補性決定領域 (VL CDR2)、軽鎖の第 3相補性決定領域 (VL CDR3)

[0034] 本発明の第 1の局面は抗体の分類法に関する。本発明の分類法は以下のステップを含むことを特徴とする。

(2)前記抗体の各々を同種類の細胞に接触させるステップ、

[0035] ステップ（1)

本発明の分類法ではまず、細胞表面抗原を認識する複数の抗体を用意する。説明の便宜上、本発明の分類法で分類される当該抗体のことを「サンプル抗体」とも呼ぶ本発明において「細胞表面抗原」とは、少なくともその一部が細胞外に存在し、細胞の表面に抗原決定基を形成する分子を!ヽぅ。例えば細胞膜貫通ドメイン及び細胞外ドメインを有する膜貫通型タンパク質や、 GPIアンカー型タンパク質のように糖脂質などを介して細胞膜に繋がれ、細胞外表面に存在することになるタンパク質などはこのような抗原決定基を形成することができる。細胞表面抗原は単純タンパク質 (基本的にアミノ酸のみを構成成分とするもの）や複合タンパク質 (アミノ酸以外の構成成分を含むもの。例えば糖タンパク質ゃリポタンパク質）、或いは修飾タンパク質 (リン酸ィ匕ゃァセチル化、メチルイ匕などの修飾を受けたタンパク質)等によって形成され得る。また、二以上の同種又は異種の分子が協同して抗原決定基を形成する場合もある。本発明における「細胞表面抗原」は、動物細胞に限らず、植物細胞、微生物細胞等の細胞表面抗原を含む。好ましくは、本発明の「細胞表面抗原」は動物細胞の細胞表面抗原である。動物細胞は多様な細胞表面抗原を有することが知られて、る。ここでの「動物細胞」は哺乳動物細胞及び非哺乳動物細胞を含むが、好ましくは哺乳動物細胞である。中でもヒト細胞が特に好ま、。

[0036] 好ましくは、インタタトな状態の細胞表面抗原を認識する複数の抗体が用意される。

「インタタトな状態」とは、本来の状態を維持していることをいい、「変性されていない状態」と同義である。

[0037] 「細胞表面抗原を認識する抗体」とは、抗原抗体間の特異性の高!ヽ認識機構によつて、細胞表面抗原を認識，結合する抗体をいう。抗体の由来、種類、クラス、形態などは特に限定されない。従って、本発明における「抗体」にはマウス、ラットなどの非ヒト動物の抗体、一部の領域を他の動物（ヒトを含む）のものに置換したキメラ抗体、ヒト化抗体、及びヒト抗体が含まれる。好ましくはヒト抗体又はヒト型抗体が用いられる。 Fa b、 Fab'、 F(ab')2、 scFv、又は dsFv抗体などの抗体断片を用いてもよぐまた治療用途にお、てそれらの VH及び VL (Fv領域）を用い IgG型に変換された抗体なども含まれる。

[0038] 細胞表面抗原を認識する抗体は例えば、抗体ライブラリーを細胞表面抗原に接触させた後、細胞表面抗原に結合した抗体を回収することにより調製することができる。このような調製法の一つとして、本発明者らが先に報告した方法 (特開 2005— 1852 81号公報）がある。当該方法によればファージ抗体ライブラリーの中から、インタタトな細胞表面抗原を認識する抗体クローンを効率的に選抜することができる。本発明では当該方法を利用して選抜された各抗体クローンに由来する抗体の集合を好適に利用できる。ここでの「各抗体クローンに由来する抗体」とは、選抜された各抗体クローンそのもの、又はその遺伝子を利用して調製されたものをいう。後者として例えば、選抜された抗体クローンの遺伝子で適当な宿主 (例えば大腸菌）を形質転換し、当該宿主で発現させた抗体や、当該宿主内又は他の宿主を利用して更なる遺伝子工学的改変を加えた後に発現させた抗体が該当する。

上記公報ではヒト Fv領域をもつ抗体として、 scFv-CL-cp3抗体 (軽鎖定常領域を介してファージタンパク質 cpIIIが scFVに融合した抗体）、 scFv-CL-pp抗体 (軽鎖定常領域を介して二つのプロテイン Aが scFVに融合した抗体）、 scFv- CL- pp- Avi抗体（sc Fv-CL-pp抗体にアビジンが融合した抗体）、 scFv-CL-Avi抗体 (軽鎖定常領域を介してアビジンが scFVに融合した抗体）、 scFv- CL- pp- Avi又は抗体 scFv- CL- Avi抗体がピオチン化された抗体 (アビジン部分にピオチンが結合した抗体)等が開示される。本発明ではこれらのいずれかの型の抗体を好適に用いることができる。これらヒト Fv 領域をもつ抗体は治療用抗体を提供する上で非常に有用である (治療用抗体の作製を有利に進めることができる）。

尚、特開 2005— 185281号公報に開示された全ての内容は参照により援用される。

[0039] 別々に調製された抗体同士を組み合わせたものを、本発明における「細胞表面抗原を認識する複数の抗体」として使用してもよい。この場合、各抗体の調製方法は同一であっても異なって!/ヽてもよ！/ヽ。

[0040] 予め標識物質が結合又は融合された抗体 (これらをまとめて「標識済サンプル抗体」ともいう）を使用することもできる。前者の例として、蛍光色素で標識化した抗体を挙げることができる。後者の例として GFP (Green Fluorescent Protein)や RFP (Red Fluor escent Protein)等の蛍光タンパク質が融合された抗体 (蛍光タンパク質融合抗体)を挙げることができる。このような蛍光タンパク質融合型抗体は遺伝子工学的手法を用 V、て容易に調製することができる。 [0041] ステップ（2)

次に、サンプル抗体の各々を同種類の細胞に接触させる。即ち、使用する細胞を定め、当該細胞とサンプル抗体との接触操作をサンプル抗体ごとに実施する。使用する細胞の表面抗原を認識するサンプル抗体であれば細胞表面に結合する。サンプル抗体の結合量はそれが認識する細胞表面抗原の発現量に依存する。

サンプル抗体との接触に供される細胞は特に限定されず、様々な動物細胞、植物細胞、微生物細胞等の中から任意に選択することができる。例えば、好ましい一態様として、特定の疾患に罹患した (又は特定の病態を呈する）患者由来の細胞を用いる。「特定の疾患」とは例えば例えば各種の癌などが挙げられる。細胞の由来する組織や臓器は特に限定されないが、例えば腎臓癌、肝細胞癌、胆肝癌、肺胞上皮癌、肺扁平上皮癌、肺腺癌、脾臓癌、大腸腺癌、卵巣癌等である。

[0042] 均一性の高、細胞集団を形成する細胞を用いることが好ま、。後述のフローサイトメトリー解析の際により簡単ないし単純なデータが得られ、データの比較が容易になり、し力も信頼性の高い比較結果をもたらす力もである。このような細胞の典型は株化細胞 (細胞株)である。例えば肝細胞癌細胞株 HepG2、未分化型肝細胞癌細胞株 HLF、肝細胞癌細胞株 OCTH、肝内胆管細胞癌細胞株 RBE、脾癌細胞株 PANC-1、脾臓癌細胞株 MIA-Paca2、腎臓癌細胞株 CCFRC1、腎臓癌細胞株 Caki-1、腎臓癌細胞株 ACHN、腎臓癌細胞株 293T、卵巣癌細胞株 KF28、卵巣癌細胞株 SKOv3、卵巣癌細胞株 KF-28、卵巣癌細胞株 RMG-1、卵巣癌細胞株 RMG-2、乳癌細胞株 BT4 74、外陰部粘膜上皮細胞株 A431、胃癌細胞株 SNU-5、胃癌細胞株 MKN45、胃癌細胞株 NCI-N87、癌細胞株 RERF-LC-AI、肺腺癌細胞株 PC 14、肺癌細胞株 NCI-H44 1、肺扁平上皮癌 EBC1、肺腺癌細胞株 H1373、肺腺癌細胞株 A549、肺腺癌細胞株 Calu-3,肺腺癌細胞株 PC14、大腸癌細胞株 CaCo2、大腸癌細胞株 CW2、ハムスタ一卵巣癌細胞株 CHO等の株化癌細胞を好適な細胞として採用することができる。尚、培養操作によって均一性が高められた細胞も好ま、細胞の一つである。

[0043] 各サンプル抗体と細胞との接触操作は適当な溶液中で行われる。その際、サンプル抗体の特性に影響を与えることなぐ且つ細胞に損傷を与えない条件に設定することが好ましい。例えば、当該細胞の生存 ·増殖に適した培養液中、リン酸系やクェン酸系バッファ一中、生理食塩水中、あるいはそれらに非特異的吸着を抑えるための B SA等をカ卩えた溶液などにおいて、室温力低温 (例えば 0°C〜25°C、好ましくは 4°C 〜15°C)の温度条件下、 20分〜 3時間程度、細胞とサンプル抗体とを共存させる。この間、溶液を撹拌することにしてもよい。

尚、信頼性の高いデータが得られるよう、各サンプル抗体と細胞とを接触させる際の条件は原則として統一する。

[0044] 以上の接触操作の後、必要に応じて (即ち、標識済サンプル抗体を利用した場合以外）、標識化を行う。ここでの「標識化」とは、細胞表面に結合したサンプル抗体を標識することをいう。例えば、サンプル抗体に対する特異的結合能を有する抗体に標識物質を結合させたもの (検出抗体)を、接触操作後の細胞と反応 (接触)させることによって標識ィ匕を行うことができる。サンプル抗体に検出抗体を直接結合させるのではなぐ両者の間に他の抗体等を介在させることにしてもよい。このように様々な標識ィ匕の手法を採用することができ、当業者であれば適切な手法を選択することが可能である。フローサイトメトリー解析では通常、蛍光色素が標識物質として使用される。例えば、 Alexa488、 AMCA、 Cascade Blue (登録商標）、 FITC、 PerCPTM、 CyTM3、 Texas Red (登録商標）、 CyTM5、 APC、 TRITC等の蛍光色素を使用することができる

[0045] ステップ（3)

続いて、ステップ（2)後の各細胞をフローサイトメトリーで解析し、抗体と細胞表面との反応性を示すデータを得る。即ち、サンプル抗体との接触操作を経た細胞をフロ一サイトメトリー解析に供し、サンプル抗体の結合性を調べる。好ましくは、ここでの「反応性」を示すデータとして、抗体結合量と細胞数との関係を表すヒストグラムが用いられる。即ち、抗体結合量をパラメータとした 1パラメータ 'ヒストグラムが用いられる。 1 ノラメータ'ヒストグラムとは、フローサイトメトリーにおける表示法の 1種であり、通常は

、 1つの指標 (パラメータ）を X軸にとり、細胞数を Y軸にとって表示したグラフをいう。フローサイトメトリー解析のための装置は例えばベックマン ·コールター株式会社、日本ベタトン'ディッキンソン株式会社など力も販売されており、本発明ではこれらを利用することができる。基本的な操作法、解析条件などは装置に添付の取扱説明書に従えばよい。また、フローサイトメトリー解析に関する論文や成書も数多く存在し、例えば、 Cao TM, et al. Cancer. 2001 Jun 15;91(12):2205- 13.、 Storek KJ, et al. Blood 9 7: 3380—3389、 WEIR' S HANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY Vol.11 く Blackwell Science), Little MT and R. Storb Nture Reviews Cancer 2002 2: 231—23 8、等が参考になる。

[0046] フローサイトメトリー解析の典型的な操作手順を以下に示す。サンプル抗体と細胞とを反応させた後、蛍光色素で標識した検出抗体を反応させ、細胞を蛍光標識化しておく。細胞表面に存在する抗原量に応じて、結合するサンプル抗体量に差が生じる結果、細胞の蛍光標識量が異なることになる。従って、蛍光強度を測定することによつて当該細胞の表面に存在する抗原とサンプル抗体との親和性及び抗原量を推定することができる。通常は、蛍光強度の検出に先行し、前方散乱光 (Forward Scatter: FSC)及び側方散乱光 (Side Scatter: SSC)を測定してゲートをかけ、目的の細胞集団の蛍光強度のみを測定する。具体的には例えば、前方散乱光及び側方散乱光をそれぞれ X軸及び Y軸にとり、ドットプロット展開から得られるデータにおいて生細胞と思われる細胞集団 (株化細胞や培養細胞を使用した場合は均一性の極めて高、細胞集団となる）にゲートをかけ、ゲート内の蛍光強度を測定する。測定結果はヒストグラムなどの形式に表示する。尚、フローサイトメトリー解析で得られるヒストグラムに関連する各用語の意味を以下に記す。

[0047] 「標本数」とはデータ数であり、通常 nで表される。「合計」とはデータの合計であり、通常 Tと表記される。「平均値 (Mean)」とはデータの平均であり、合計を標本数で割ることで求められる。平均値は異常データの影響を受けやすい。「中央値 (Median)」とはデータを昇順に並べたとき中央に位置する値である。データ数が偶数の場合は通常、中央の二つの値の平均を中央値とする。中央値は平均値に比較して異常データの影響を受け難ぐ集団の特色をより正確に表す。「最頻値 (Mode)」とはデータの中で頻度が最大となる値である。フローサイトメトリー解析の場合はピーク値と同義である。最頻値は平均値に比較して異常データの影響を受けにくい。「最大値」とはデータの最大の値であり、通常、 Maxと表記される。「範囲（Range)」とは最大値と最小値の差でありレンジとも呼称される。通常 Rと表記される。「分散」とはデータのばらつきの程度を示す値であり、これが大きい程ばらつきが大きいことになる。通常 Vと表記される。偏差平方和を標本数 (標本調査の場合は (標本数— 1) )で割った値が分散となる。「標準偏差」とは分散の平方根であり、通常、 uと表記される。「変動係数」とは標準偏差を平均値で割った値であり、通常 CVと表記される。標準偏差ではデータのばらつきの程度がわ力もないため、標準偏差を平均値で割り正規ィ匕する。フローサイトメトリー解析では装置の分解能を示す数値として頻用される。「尖度」とは集団の分布を表す一つの指標であり、通常 Hと表記される。尖度が 0の場合は正規分布である。尖度が 0より大きい場合は正規分布よりも頂部が尖った分布となり、 0よりも小さい場合は正規分布よりも偏平な分布となる。「歪度」とは集団の分布の左右対称性を示す値であり、通常、 Gと表記される。歪度が 0の場合は左右対称の分布である。歪度が 0より大き、場合は右方向に歪んだ分布となる。歪度が 0より小さ、場合は左方向に歪んだ分布となる。

[0048] ステップ（4)

次に、得られたデータを比較し、その類似性に基づいて各サンプル抗体を分類する。ここでの「類似性に基づいて」とは、分類基準としてデータの類似性が利用されることを意味する。データの類似性に基づき分類する際の基準 (分類基準)の例を以下に示す。

(a)同一の又は類似性の高いデータを与える複数の抗体を、共通の抗原を認識するものとして一つの抗体グループとする。具体的には例えば、細胞の分布を示すヒストグラムの山の形を尖度、歪度等によって判定し、類似性の極めて高いヒストグラムを与える抗体群を一つのグループとする。

(b)特有のデータを与える抗体はそれのみで一つの抗体グループとする。

(c)抗原との反応性が低!ヽ抗体を排除する ( 、ずれのグループにも属さなヽとする)。本発明では、好ましくは、以上の分類基準 (a)〜(c)から選択されるいずれか又は二つ以上によって各抗体を分類する。

[0049] データの類似性は、当該データを規定するパラメータに基づいて判定することができるが、具体的な判定方法はデータの種類に依存する。データが数値で表される場合を例に採れば、数値の近似の程度によってデータの類似性を判断することができる（例えば、データとして 1、 2、 5が与えられた場合、 1と 2の間において類似性が高いと判断する)。

また、データとしてヒストグラムが与えられた場合、データの類似性をヒストグラムの形状に基づいて判定することができる。本発明者らの検討の結果、フローサイトメトリ一解析におけるヒストグラムの形状が抗原の種類に高度に依存することが判明した。換言すれば、認識する抗原が同一であれば、抗体の種類に拘わらず同一の又は類似性の高い形状のヒストグラムが取得されることが明ら力となった。この事実に鑑み本発明の一態様ではフローサイトメトリー解析の結果を示すヒストグラムの形状を比較してデータの類似性を判定する。具体的には目視による形状の比較、又はヒストグラムを規定する一又は二以上のパラメータの値の比較によってデータの類似性を判定することができる。ここでのパラメータとして、ヒストグラムの中央値、最頻値、最大値、範囲、標準偏差、尖度、及び歪度力なる群より選択される一以上の値を用いることができる。好ましくは二つ以上、更に好ましくは三つ以上、より一層好ましくは四つ以上の値に基づいて判定を行う。判定の際に使用するパラメータ数を増やすことによって判定精度を高めることができる。これらのパラメータの中でもヒストグラムの形状に深く関与するパラメータである中央値、最頻値、又は尖度を採用することが高精度の判定を行うために有利であると言える。好ましくはこれらのパラメータの中から二つ以上を組み合わせて用いる。具体的には例えば、中央値、最頻値、及び尖度に基づきヒストグラムの類似性を判定するとよ、。

比較対象の二つのデータ力採用したパラメータについて近似した値を与えるとき、当該二つのデータ間の類似性は高いと判定することができる。二つの値の差（二つの値を A、 B (A≥B)としたときの 100 X (A— B) ZA(%) )が 10%以内、好ましくは 5 %以内、更に好ましくは 3%以内のときに、当該二つの値は近似していると判断する本発明の一態様では、サンプル抗体を分類する際又は分類後、細胞表面抗原に対する反応性が低いと考えられるサンプル抗体を排除する。これによつて、有用性の高ヽサンプル抗体のみ力もなる抗体グループを形成することができる。抗体の反応性の程度は、フローサイトメトリー解析の結果を利用して判定することができる。具体的には、判定対象のサンプル抗体にっヽて得られたヒストグラムの最頻値 (ピーク値）と、当該サンプル抗体が属する抗体グループ内にぉ、て反応性が最大のサンプル抗体につ、て得られたヒストグラムの最頻値 (即ち、当該グループ内での最大の最頻値)とを比較する。その結果、前者が後者の 1Z2以下、好ましくは 1Z5以下、更に好ましくは lZioの場合、判定対象のサンプル抗体の反応性は低いと判定する。

[0051] 本発明の一態様では、二種類以上の細胞に対して各サンプル抗体の反応性が調ベられ、その結果を用いて各サンプル抗体を分類する。即ち、二種類以上の細胞を用意し、各細胞を用いてステップ（2)〜 (4)を行なう。

ところで細胞表面抗原の発現量、分布などは細胞の種類に依存する。従って、ある細胞を用いて得られたデータの類似性が高い二つの抗体、即ち抗原が共通する二つの抗体は、他の細胞を用いた場合にも類似性の高いデータを与えるはずである。このことから、比較される二つの抗体力二種類以上の細胞について類似性の高いデータを与えた場合、それらの抗原が共通する確率は極めて高いといえる。また、このような結果が得られた場合には当該二つの抗体の抗原が共通するものと容易に判定できる。このように、二種類以上の細胞を用いることによって、抗原の同一性の判断をより正確かつ容易に行うことができる。

本発明の好ましい一態様では、少なくとも二種類の細胞に関して同一又は類似性の高いデータを与えたサンプル抗体同士を一つの抗体グループとして分類する。また、二種類以上の細胞を用いた場合の分類結果をみれば、発現する抗原の種類や量などを当該細胞間で比較できる。従って、これらの細胞の性状を研究する上でより有益な情報を与えることになる。

[0052] 本発明の一態様では分類結果をパネルとして表示する。本明細書にぉ、て「パネル」とは、複数種類の要素 (例えば抗原、抗体、抗体グループ、細胞、疾患名、病態名）が互いに関連付けられた状態でディスプレイや紙などの媒体上に表又は図形式で表示されたものをいう。各要素はその通常の名称、略称、通称、又はそれを表す記号や符号などで表される。本発明のパネルでは二種類以上の要素について相互の関連性が示される。

本発明において「関連付ける」とは、二つ以上の要素を結びつけることをいう。従つて、抗原と抗体グループとの関連性を示す表形式のパネルでは、例えば、両者を近接して表示したり、両者を同一のセル内に表示したり、或いは両者の間を線などで結んだりすることによって、両者が組を形成していることを理解できるようにする。

[0053] ここでのパネルでは、典型的には、フローサイトメトリー解析に供した細胞が発現する抗原毎 (又は関連性の高ヽ抗原毎）に抗体グループが関連付けられて表示される。従って、このパネルをみれば、当該細胞の表面抗原の研究などに有用な抗体へのアクセスが可能となる。このように本発明のパネルはそれ自体で大きな価値をもつ。二種類以上の細胞を用いて作成されたパネルの場合、細胞間で共通して発現している抗原の有無、発現量などの把握をも可能となり、一層高い価値を有する。

本発明のパネルにおいて、抗原に対する反応性に従い抗体を規則的に配列させるとよい。これによつて、反応性に関する抗体間の差異が一目瞭然となる。

[0054] 本発明の分類法によれば、同一の抗原 (又は関連性の高い抗原)を認識する複数の抗体が相互に関連付けられることになる。換言すれば、抗原毎 (又は関連性の高い複数の抗原毎）にそれを認識する抗体の集合 (抗体グループ）が得られる。これら抗体グループは細胞表面抗原の研究に有用であり、特に細胞の分類手段としての利用価値が高い。また、本発明の分類法によれば抗原毎 (又は関連性の高い複数の抗原毎）に多数の抗体を迅速に分類できる。即ち、本発明の分類法は多数の抗体を分類するために適したものであり、抗体の網羅的分類を可能とする。抗原について使用する表現「関連性の高、」又は「高ヽ関連性を有する」とは、同一の分子ではな、ものの、協同して一つの機能を発揮する場合 (例えば、結合して機能的に一つの複合体を構成する場合)など、二つ以上の抗原が生体にぉヽて密接な関連性を有することをいう。

本発明の分類法によれば、典型的には、抗原毎 (又は関連性の高い複数の抗原毎 )に複数の抗体が関連付けられることになる。従って、ある抗原の研究をする際、複数の抗体を利用することや、場合に応じて適した抗体を選択的に使用することなどが可能となる。このことは、良好な結果や意義深い知見をもたらすことに繋がり、研究を有利に進めることができることを意味する。

一方、本発明の分類法を実行することにより、特定の細胞 (即ちサンプル抗体との接触に供した細胞）の細胞表面抗原 (抗原は未知であるものの）の発現量や分布状況を把握できる。このように本発明の分類法は、特定の細胞の性状に関する有益な情報を与え、当該細胞 (特にその表面抗原）の研究に有用なものでもある。

尚、サンプル抗体の全てついて抗原が未知の場合、各抗体グループが関連付けられた抗原はいずれも未同定のものとなる。一方、サンプル抗体の一部として、同定済の抗原に対する抗体を混ぜておけば、当該抗体が属する抗体グループが関連付けられた抗原は同定済のものとなる。このように、同定済の抗原に対して抗体グループを関連付けることも可能である。

以上の分類法によれば、抗原と特定の細胞の表面との反応性に基づき抗体が分類され、抗体グループが形成される。従って、同一の抗体グループに属する抗体であれば、分類の際に使用した細胞の表面に対する反応性は同一（又は高度に類似）である。しかしながら、同一の抗体グループに属する抗体の全てが同一の抗原を認識するとの保証はない。認識する抗原が同じであっても、当該抗原を細胞表面に発現する細胞に対する反応性が異なる場合があり、またその逆の場合 (認識する抗原が異なる場合であつても、当該抗原を細胞表面に発現する細胞に対する反応性が同じ場合、例えば複合体のそれぞれ一方を認識する場合)もあり得るからである。

そこで、認識する抗原毎に抗体グループが形成されるようにするため、本発明の一態様ではステップ (4)の後、以下のステップ (i)〜 (vi)を行う。

(i)分類した抗体にそれぞれ、第 1パラメータ、第 2パラメータ、 · ·、及び第 nパラメ一タカもなる n個のパラメータ（但し、 nは 2以上の整数であり、各パラメータは 2個以上のパラメータ値を有し、各パラメータについて同一のパラメータ値が二以上の抗体に付与される）の組合せを関連付けるステップ、

(iv)特定した抗体混合物が含有する抗体群に共通する、パラメータ名とパラメータ値の組合せを特定するステップ、 (v)ステップ (i)に供した抗体の中から、全パラメータに関して、前記ステップ (iv)で特定した組合せが該当する抗体を選抜するステップ、

[0056] この態様の分類法によれば、認識する抗原毎に抗体グループを形成することが可能となる。即ち、同じ抗原を認識する様々な個性を有する抗体群が得られる。また、各抗体に複数のパラメータの組合せを関連付けた上で所定の規則に従い抗体混合物の調製を行い、そして抗体混合物を用いた ELISA (Enzyme-Linked imunosorbent assay)の結果を基に標的抗原を認識する抗体を決定すると!/、う独自の手法によって、迅速且つ効率的に抗体を分類することができる。さらには、抗体が分類されるのと同時に少なくとも一部の抗体については抗原が同定されることになる。つまり、この態様の分類法は、抗原が同定された抗体を迅速且つ効率的に得る方法であるとみることもでき、抗原が同定された抗体数の飛躍的な増大を促す。一方、分類結果は、フロ一サイトメトリー解析に使用した細胞表面における抗原の存在様式や発現様式を示すことになり、抗体の用途 (癌治療等)の研究 *開発にとって極めて有用な情報を与える。また、分類結果によって、ある抗原の存在が明らかになった場合、当該抗原と複合体を形成するなどして存在する蓋然性が高ヽと考えられる未知抗原 (複合体カウンターパートなど)の吊り出しも可能となる。即ち、この態様の分類法は新規抗原又は新規分子複合体の決定に対しても非常に有効に機能する。

以下、各ステップの詳細を説明するが、説明の便宜上、この態様の分類法のことを「n次元 ELISA法」とも呼ぶ。

[0057] ステップ（i)

このステップでは、先行するステップ (ステップ（1)〜 (4) )によって分類した抗体にそれぞれ、第 1パラメータ、第 2パラメータ、 · ·、及び第 nパラメータ力もなる n個のパラメータの組合せを関連付ける。これによつて各抗体は n次元の番地 (第 1パラメータのパラメータ値、第 2パラメータのパラメータ値、 · ·、及び第 nパラメータのパラメータ値）をもつことになる。

通常、先行するステップによって分類された抗体の全部に対して関連付けを行うが、これに限るものではない。即ち、先行するステップによって分類された抗体の一部のみに関連付けを行うことにしてもよい。この場合、一部の抗体は分類対象から除かれること〖こなる。

[0058] ここでの nは 2以上の整数である。つまり、各抗体には 2個以上のパラメータの組合せが関連付けられる。 nの数に上限は特にないが、 nの数が大きすぎれば後続のステップ (例えば抗体混合物の調製、反応性を示す抗体混合物の特定など)の操作が過度に複雑ィ匕することから、 nの数は好ましくは 3〜5である。

[0059] 一方、各パラメータは 2個以上のパラメータ値を有することとし、各パラメータについて同一のパラメータ値が 2種類以上の抗体に付与されるようにする。具体例を示すと、第 1パラメータがとり得るパラメータ値を 1、 2、 3及び 4とし、各パラメータ値をそれぞれ 5種類の抗体に付与する。ノラメータ値の数はパラメータ毎に設定されるものである。またパラメータの数と同様、パラメータ値の数の上限は特にない。後述のステップ (iv)及び (V)における解析の効率ィ匕及び精度向上のために、各抗体混合物に含まれることになる抗体の種類は過度に多くないことが好ましい。従って、各抗体混合物に含まれる抗体の種類が好ましくは 200以下、更に好ましくは 100以下となるように各ノラメータ値の数を設定するとよい。具体的には例えばパラメータ値の数を 2〜： LOO の間に設定することができる。尚、各抗体混合物に含まれる抗体の種類はパラメータの設定に依存するものであり、抗体混合物間で一致しなくてもよい。

[0060] ステップ（ii)

このステップでは、同一のパラメータ値を有する抗体を混合した抗体混合物を調製する。抗体混合物はパラメータ毎に調製する。例えば、第 1パラメータが 1、 2、 3及び 4のパラメータ値をとる場合、第 1パラメータとして 1の値が付与された抗体を混合した抗体混合物、第 1パラメータとして 2の値が付与された抗体を混合した抗体混合物、第 1パラメータとして 3の値が付与された抗体を混合した抗体混合物、第 1パラメータとして 4の値が付与された抗体を混合した抗体混合物を調製する。同様の手順で残りのパラメータに関しても抗体混合物を調製する。このようにして、第 1パラメータが取りうるパラメータ値の数、第 2パラメータが取りうるパラメータ値の数、 · · ·、及び第 nパラメータが取りうるパラメータ値の数の総計と同数の抗体混合物が調製されることになる通常、同一のパラメータ値を有する全抗体を混合した抗体混合物が調製される。伹し、これに限るものではなぐ同一のパラメータ値を有する全抗体の中から一部を選抜し、それらを混合することで抗体混合物を調製することにしてもよい。このように、この段階で抗体の選別を行ってもょ、。

[0061] 全ての抗体が等量ずつ抗体混合物に含有され、且つ抗体毎の存在量 (即ち、抗体の種類ごとの濃度)が抗体混合物間で等しくなるように抗体混合物を調製することが好ましい。このように抗体量を揃えることによって、後続の ELISAでの反応性に基づく抗体混合物の特定が容易になる。

[0062] ステップ（iii)

このステップでは、抗体混合物の各々について標的抗原との反応性を ELISAで調ベ、反応性を示す抗体混合物を特定する。抗体混合物を調製する際に使用した抗体の中に、標的抗原を認識する抗体が一つでも含まれていた場合、複数の抗体混合物が反応性を示すことになる。一方、標的抗原を認識する抗体が皆無の場合、いずれの抗体混合物も反応性を示さない。この場合には以降の操作を行うことなく終了する。

ここでの標的抗原としては、 HER1、 HER2、 CD46、 ITGA3、 ICAM1、 ALCAM、 CD14 7、 IgSF4、 BCAM、 ClqR、 CD44、 CD73、 LAR、 EpCAM、 HGFR等を用いることができる。標的抗原は任意に選択可能である。後述の同定法 (ステップ (5)及び (6) )によつて決定した抗原をここでの標的抗原として用いてもょ、。

[0063] ステップ（iv)

このステップでは、特定した抗体混合物が含有する抗体群に共通する、パラメータ名とパラメータ値の組合せを特定する。本発明では、ここで特定された組合せを、「陽性の組合せ」とする。具体的には、陽性の組合せを (第 1パラメータ、ノラメータ値 al) 、（第 2パラメータ、パラメータ値 a2)、 · ·（第 nパラメータ、パラメータ値 an)のように特定する。ステップ (iii)において反応性の程度が異なる複数の抗体混合物が認められた場合は、反応性の程度毎に同様の特定を行うとよい。例えば中程度の陽性の組合せとして、（第 1パラメータ、パラメータ値 al)、（第 2パラメータ、ノラメータ値 a2)、 · · · (第 nパラメータ、パラメータ値 an)のように特定し、高い陽性の組合せとして (第 1パラメータ、パラメータ値 b l)、（第 2パラメータ、パラメータ値 b2)、 · · ·（第 nパラメータ、パラメータ値 bn)のように特定すればょ、。

[0064] ステップ（V)

このステップでは、ステップ (i)に供した抗体の中から、全パラメータに関して、ステツプ (iv)で特定した組合せが該当する抗体を選抜する。即ち、全パラメータが陽性の組合せである抗体を選抜する。例えば、陽性の組合せとして (第 1パラメータ、パラメータ値 al)、（第 2パラメータ、パラメータ値 a2)、 · · ·（第 nパラメータ、パラメータ値 an) が特定された場合、（パラメータ値 al、パラメータ値 a2、 · · · ·、パラメータ値 an)をもつ抗体が選抜されることになる。

[0065] ステップよ

このステップでは、選抜した抗体を一つの抗体グループとして分類する。これによつて標的抗原に反応性を示す抗体群がグループ化されることになる。換言すれば、抗原が決定された抗体群が得られることになる。尚、ステップ (V)によって一つの抗体のみが選抜された場合は当該抗体のみで一つの抗体グループとする。

[0066] 二種類以上の標的抗原を用意し、各標的抗原を用いて以上のステップ (iii)〜 (vi) を行うことにすれば、認識する抗原が異なる二つ以上の抗体群を得ることが可能となる。

[0067] 本発明の一態様では、各回の試行でパラメータの組合せが異なる条件下、ステップ

(i)〜 (V)を複数回試行する。例えば、第 1回目の試行では数字力もなる 4個のパラメータの組合せ（例えば、抗体 1 (001、 001、 001、 001)、抗体 2 (002、 002、 002、 0 02)、 · · を各抗体に関連付けて解析し、第 2回目の試行ではアルファベットからなる 3個のパラメータの組合せ（例えば、抗体 1 ( α α α、 a a a、 a a α ) ,抗体 2 ( β β β、 β β β、 β β β、 β β β >、 · · を各抗体に関連付けて解析する。尚、各回の試行にお、て形成される抗体グループが完全に同一とならな、ようにする。ここでの「抗体グループが完全に同一」とは、グループ数が一致し、且つ各グループに含まれる抗体の種類が全グループに亘つて一致することを意味する。

複数回の試行後、各回の結果が相矛盾することなぐ標的抗原と結合陽性反応を示した抗体を選抜する。そして、選抜された抗体 (複数の抗体)を用いてステップ (vi) を行う。

このように複数回の試行を行い、相矛盾しない結果を与える（即ち、辻棲の合う）抗体のみを選抜することによって、標的抗原反応性の抗体（目的の抗体)を効率的に得ることがでさる。

ステップ (i)〜(v)の試行回数は特に制限されるものではなぐ扱う抗体数、 1回の試行にお!、て予想される「陽性の組合せ」の数などを考慮して任意に設定される。例えば試行回数を 2〜5回とすることができる。

[0068] 本発明の更なる一態様では、ステップ (V)とステップ (vi)の間に以下のステップを実施する。

(V— 1)ステップ (V)で選抜した各抗体に対して、前記ステップ (i)と同じ要領で n個のパラメータの組合せを新たに関連付けるステップ、

(V— 5)ステップ (V— 1)に供した抗体の中から、全パラメータに関して、前記ステツプ (V— 4)で特定した組合せが該当する抗体を選抜するステップ。

尚、必要に応じてステップ (V— 1)〜 (V— 4)を 2回以上繰り返す。

[0069] この態様では、 1回の試行によって選抜された抗体に対して、新たにパラメータの組合せを関連付けた後、再び抗体の選抜を行う。このように繰り返し試行を行い、目的の抗体を絞り込む。これによつて分類精度が向上する。

[0070] ここで、図 58及び 59を参照しながら、 n次元 ELISA法の原理をより具体的に説明する。図 58及び 59は n= 3の場合（三次元 ELISA法）の概念図である。この例では汎用的な 96ウェルマイクロウェルプレートを使用する。まず、抗体クローン数に合わせて必要な数のプレートを用意する。この例では抗体クローン数を 4,800とし、プレートを 50 枚 (合計 4,800ゥル)用意する。次に、抗体クローンを順番にゥエルに入れ、抗体クローンをプレート内で整列させる。これによつて各抗体クローンには、プレート番号 (第 1パラメータ）、プレートの行名 ( 第 2パラメータ）、及びプレートの列番号 (第 3パラメータ)力もなる番地が関連付けられる。例えば第 1プレートの第 A行、第 1列のゥエルの抗体クローンの番地は（1, A, 1) となる。

続いて、プレート番号が同一の抗体クローンの混合物（プレート混合抗体と呼ぶ）、プレートの行名が同一のクローンの抗体クローンの混合物（行混合抗体と呼ぶ）、及びプレートの列番号が同一の抗体クローンの混合物（列混合抗体と呼ぶ）をそれぞれ調製する（図 58)。各混合抗体の数は順に 50 (第 1プレート混合抗体〜第 50プレート混合抗体)、 8 (第 A行混合抗体〜第 H行混合抗体)、及び 12 (第 1列混合抗体〜第 1 2列混合抗体)となる。

以上のようにして調製した混合抗体を、新たに用意した 96ウェルマイクロウェルプレ一トのゥエルに順番に入れ、混合抗体をプレート内で整列させる。この例では、プレート内の第 1列〜第 7列をプレート混合抗体に、第 8列を行混合抗体に、第 9列〜第 10 列を列混合抗体にそれぞれ割り当てる（図 59上段)。このようにして得られたプレートを使用して ELISA法を実施する。そして、反応性を示したゥエルを調べることによって、目的の抗体クローン (標的抗原に反応性を示す抗体クローン)の番地を特定する。この例では、第 3プレートのプレート混合抗体が入れられたゥエル、第 E行の行混合抗体が入れられたゥエル、第 3列の列混合抗体が入れられたゥヱルが反応性を示し、目的の抗体の番地として（3, E, 3)が特定されることになる（図 59下段)。最後に、特定した番地が関連付けられた抗体クローンを目的の抗体として得る。

本発明の第 2の局面は、本発明の分類法で分類された各抗体の抗原を同定する方法を提供する。本発明の同定法では、上記本発明の分類法の各ステップ（1)〜(4) に続、て以下のステップを行う。

(6)同一の抗体グループに属する各抗体の抗原は同一又は相互に高い関連性を有すると推定し、ステップ（5)で同定された抗原を抗体グループに関連づけるステツプ。

[0072] ステップ（5)

このステップでは、同定作業を進めることになる抗体を選抜する。選抜基準は特に限定されるものではないが、フローサイトメトリー解析の結果より、抗原に対して高反応性であると判断される抗体を選抜するとよ!/ヽ。当該抗体を用いれば抗原抗体反応を利用した同定作業を有利に進めることができるからである。

選抜する抗体の数は典型的には一つである力これに限られるものではない。必要に応じて数個（例えば二個又は三個）の抗体を選抜する。一つの抗体グループから複数の抗体を選抜することにすれば、各抗体の同定結果を相互に比較することによつて同定結果の信頼性を高めることができる。その一方で、必要以上に多くの抗体を選抜してその同定作業を進めることは過度の作業負担をもたらし、本発明が意図する本来の効果を減殺する。そこで、選抜する抗体の数は少数であることが好ましい。具体的には、 5個以下であることが好ましぐ 3個以下であることが更に好ましぐ 2個以下であることが最も好ましい。本発明の本来の効果を最大とするためには、各抗体グループ力も選抜する抗体の数を一つとする。

[0073] 選抜した抗体 (以下、「選抜抗体」）についての抗原の同定は、質量分析、免疫沈降試験、ウェスタンブロット、ァフィ-ティークロマトグラフィー、 RNAi、プロテオミタスの手法 (電気泳動、質量分析、ゲノムデータベース検索、バイオインフォマティックスによる分析)、及び対応遺伝子の発現解析等の方法を利用して行うことができる。この中でも質量分析を基盤技術とするプロテオミタスの手法による方法は未知抗原の同定に適したものであり、本発明の方法において採用する同定法として好ましい。尚、これらの方法は互いに排他的なものではなぐ必要に応じて二つ以上を組み合わせて用いることができる。

[0074] 質量分析とは、タンパク質やペプチド等の試料から生成させたイオンを質量/電荷（ m/z)に従い分離した後、その強度を測定することにより、試料の質量を決定する方法である。 ESI法（Electro Spray Ionization :エレクトロスプレーイオン化法）や MALDI法（ Matrix Assisted Laser Deporption Ionization :マトリックス支援レーサー脱離イオンィ匕法)などソフトイオンィ匕法が開発されたことによって、タンパク質やペプチド等の生体試料の解析に質量分析が汎用されるようになった。

[0075] 質量分析装置は一般にイオン源、質量分析計、及び検出器の組み合わせで構成され、試料の種類や分析目的に応じて種々の質量分析装置が市販されている。タンパク質やペプチドの同定には、 ESI Q-TOF MS等のタンデム質量分析による MS/MS (Mass spectrometry I mass spectrometry)、 MALDI-TOF MS等が禾 lj用される。液体クロマトグラフィーと質量分析器を組み合わせた測定法 (LC-MAS (液体クロマトグラフィー Zエレクトロスプレーイオン化質量分析装置)や LC- MS/MS等)なども利用できる

[0076] タンデム質量分析装置では二つの質量分析計が直列に連結されており、イオン源で生成したイオンを第一の質量分析計 (MS1)で分離し、単一のイオンピークのみを選択的に通過させた後、それに不活性ガス粒子などを衝突させてプロダクトイオンに分解し、このプロダクトイオンを第二の質量分析計 (MS2)で分析する。第一の質量分析計 (MS1)と第二の質量分析計 (MS2)の組み合わせにより、 Q- TOF、 TOF- TOF、 Q- Q、 Q- IT (Iontrap :イオントラップ)などのタンデム質量分析装置が存在する。 Q-T OF (四重極質量分析計（Quadrupole mass spectrometer : Q- MS)と TOF質量分析計（ Time-of-flight mass spectrometer: TOF- MS)が直列に連結されているタンデム質量分析装置)のように異なる 2種類の質量分析計カゝら構成されたハイブリッド型のタンデム質量分析装置は MS/MS測定能に優れており、タンパク質やペプチドのアミノ酸配列の同定に適する。

質量分析装置による結果力アミノ酸配列を同定するには実験結果を用いてゲノムデータ検索を行う PMF法（ペプチドマスフィンガープリンティング法）や MS/MSイオンサーチ法等が利用される。また、ゲノムデータ検索を伴わずに MS/MSスペクトルから数学的演算によりアミノ酸配列を決定していく de novo sequencing法を利用してもよい

[0077] 一方、免疫沈降試験やウェスタンブロット法、ァフィユティークロマトグラフィー、 RNA iなどは、選抜抗体が既知抗原を認識して!/ヽると予想される場合に有効な方法である。これらの方法では選抜抗体と既知抗原との反応性が調べられる。即ち、免疫沈降試験においては選抜抗体と特定の既知抗原が免疫沈降物を形成する力否かが調べられ、免疫沈降物を形成する場合には当該既知抗原が選抜抗体の抗原であると判断される。一方、ウェスタンプロット法では PVDF膜等に転写した抗原タンパク質を選抜抗体が認識する力否かが調べられる。また、ァフィユティークロマトグラフィーでは特定の既知抗原を担持させたカラムへの選択抗体の吸着性が調べられ、吸着性の有無又はその程度による判断が行われる。ここでの既知抗原としては一般に市販されているもの、或いは遺伝子力も独自に発現させ精製したものが利用できる。また、免疫沈降試験やウェスタンプロット法、ァフィユティークロマトグラフィー等の操作法は常法に従えばょ、。 RNAiでの検証は強制発現させた細胞或、は抗体反応対象細胞に既知抗原の RNAiを作用させ、当該対象抗体の染色性が FCM、細胞免疫染色などの度合、が下がった場合、対象抗原を認識して、たと判断できる。

[0078] ステップ（6)

本発明の同定法では、ステップ（5)に続いて、同一の抗体グループに属する各抗体の抗原は同一又は相互に高い関連性を有すると推定する。この推定に従い、ステップ（5)で同定された抗原を抗体グループに関連づける。これによつて、同一の抗体グループに属する全ての抗体が一つの抗原に対して関連付けられることになる。

[0079] 本発明の一態様では、上記の推定 (抗原の関連性に関する推定)を検証する。即ち、この態様では、ステップ (5)で同定された抗原と、ステップ (6)で該抗原が関連付けられた抗体グループに属する抗体との反応性を調べ、上記推定が正 U、ことを確認する。具体的にはまず、検証が必要な抗体グループの中から抗体を選抜する。好ましくは全ての抗体を選抜し、その反応性を検証する。次に、同定された抗原 (以下、「同定抗原」）に対する各抗体の反応性を免疫沈降試験や ELISA (細胞 ELISAを含む）、 RNAiにより調べる。例えば免疫沈降試験では、同定抗原を発現する細胞の溶解液又は抽出液などに抗体を反応させた後、免疫沈降物として回収されたタンパク質を電気泳動などで検出することによって、同定抗原に対する各抗体の反応性を確認することができる。一方、 ELISAでは例えば、同定抗原が固定ィ匕されたゥエルの調製、抗体の添加、標識抗体の添加、標識量の測定といった一連の操作によって、同定抗原に対する各抗体の反応性を確認することができる。また、同定抗原を強制発現させた細胞に対する結合性を調べること (細胞 ELISA)によっても、同定抗原に対する各抗原の反応性を確認することができる。 RNAiでの検証は同定抗原を強制発現させた細胞或！ヽは抗体反応する対象細胞に既知抗原の RNAiを作用させ、当該対象抗体の染色性が FCM、細胞免疫染色などの度合いが下がった場合、対象抗原を認識していたと判断できる。

さらに、疾患関連分子 (疾患原因遺伝子産物、等)が精製蛋白質又はリコンビナント蛋白質等、何らかの形態として得られれば、それと抗体との分子間相互作用を in vitr o (蛍光分光法、ゲル濾過、超遠心を用いる古典的な方法、表面プラズモン共鳴現象を用いる方法、水晶発振子マイクロバランスを用いる方法等)又は in vivo (—分子追跡法、光共鳴エネノレ ~~ 移 (fluorescence resonance energy transfer: FRET) % 測法等)で調べることができる。

以上の確認試験によって、同定抗原と各抗体との間に特異的反応性が認められた場合、上記の推定に間違いがないと判断する。

[0080] 本発明の一態様では同定結果をパネルとして表示する。具体的には以下の（a)〜

(c) (D 、ずれかのパネルを作成する。

(a)ステップ（3)のフローサイトメトリー解析で同一又は相互に類似性の高いデータを与えた複数の抗体が一つの抗体グループとして表示され、各抗体グループとその抗原が関連付けられたパネル。

(b)ステップ（3)のフローサイトメトリー解析で同一又は相互に類似性の高いデータを与えた複数の抗体が一つの抗体グループとして表示され、各抗体グループとそれに認識される細胞表面抗原を発現する細胞とが関連付けられたパネル。

(c)ステップ（3)のフローサイトメトリー解析で同一又は類似性の高いヒストグラムを与えた複数の抗体が一つの抗体グループとして表示され、各抗体グループと、その抗原と、及び該各抗体グループに認識される細胞表面抗原を発現する細胞とが相互に関連付けられたパネル。

以上の各パネルは、同定された抗原に関する研究、パネルに表示された特定の細胞の研究や分類などに有用である。

[0081] パネル (a)では抗原毎に抗体グループが関連付けられて表示される。従って、ある抗原に対する抗体を検索したい場合に有用である。パネル (a)は、本発明のステップ (3)のフローサイトメトリー解析で同一又は相互に類似性の高いデータを与えた複数の抗体を一つの抗体グループとし、本発明のステップ（5)及び（6)による同定結果を用いて各抗体グループとその抗原とを関連付け、図又は表形式で表示することによつて作成することができる。

[0082] パネル (b)では抗体グループと細胞との関連性が示される。従って、特定の細胞表面抗原に対する抗体を検索したい場合に有用である。また、抗体グループと複数の細胞との関連性を表示するパネルとすれば、細胞表面抗原の分布に関する有益な情報を与える。パネル (b)は、本発明のステップ（3)のフローサイトメトリー解析で同一又は相互に類似性の高いデータを与えた複数の抗体を一つの抗体グループとし、本発明のステップ（5)及び (6)による同定結果を用いて各抗体グループとそれに認識される細胞表面抗原を発現する細胞とを関連付け、図又は表形式で表示することによって作成することができる。

[0083] パネル（c)はパネル（a)とパネル（b)とを組み合わせたものである。このパネルによれば、特定の細胞が発現する細胞表面抗原の種類や分布状況が把握できると同時に、注目する抗原に対する抗体を容易且つ迅速に検索できる。パネル (c)は、本発明のステップ（3)のフローサイトメトリー解析で同一又は類似性の高いヒストグラムを与えた複数の抗体を一つの群とし、本発明のステップ（5)及び (6)による同定結果を用いて各抗体グループと、その抗原と、及び該各抗体グループに認識される細胞表面抗原を発現する細胞とを相互に関連付け、図又は表形式で表示することによって作成することができる。

[0084] 本発明の同定法では抗体グループ内の一部の抗体についてのみ抗原の同定を行い、その他の抗体については推定により抗原を決定する。従って、抗体毎に同定作業を行う場合に比較して、必要な労力及び時間を大幅に低減できる。即ち、本発明の同定法によれば各抗体の抗原を迅速且つ容易に決定することができる。尚、後述の実施例に示すように、本発明者らが検討した限りにおいて推定の誤りは確認されず、本法の信頼性の高さが確認されている。

一方、本発明の同定法によれば、特定の細胞が発現する表面抗原の種類を把握できる。また、その発現量に関する情報も得られる。二種類以上の細胞を用いて抗体の分類を行った場合にぉヽては、細胞表面抗原の分布状況にっヽての情報も得られる。このように本発明の同定法は、細胞表面抗原に関する有益な情報をもたらすものである。

本発明の同定法によれば結果として、同定された抗原毎 (又は関連性の高い複数の抗原毎）にそれを認識する抗体の集合 (抗体グループ)が得られる。これら抗体グループは細胞表面抗原の研究、疾患の分類'診断などに有用であり、治療分野への応用も期待される。

[0085] 本発明は更に、本発明の分類法又は同定法で得られる情報の用途を提供する。当該用途の一つとして本発明の第 3の局面は、特定の疾患との間に関連性を有する抗体又は抗体セットの取得法に関する。本発明の抗体の取得法 (第 3の局面の第 1態様）は以下のステップを含む。

(1)本発明の分類法で分類された複数の抗体グループの中から一又は二以上の抗体グループを選抜するステップ、

[0086] 一方、本発明の抗体セットの取得法 (第 3の局面の第 2態様)では、ステップ (3)に代えて次のステップ（3，）を行う。

(3' )二つ以上の抗体が特異的反応性を示した疾患を選抜した後、該疾患に対して特異的反応性を示した抗体が属する抗体グループからそれぞれ抗体を選抜し、選抜した抗体体同士を組み合わせるステップ。

[0087] 以下、各ステップの詳細について図 1を参照しながら説明する。説明の便宜上、図

1では、本発明の分類法によって抗体グループ 1〜5が得られており、各抗体グループには 3個ずつの抗体が属するとする。また、この例では各抗体グループの抗原が既に同定されたものとしている。

まず、ステップ（1)では、注目すべき抗体グループ (抗体グループ 1、 3、 5)を選抜する（図 1、（1) )。この例のように二以上の抗体グループを選抜することにしてもよい次に、ステップ（2)では、選抜した各抗体グループの抗体と、特定の疾患との反応性を調べる。具体的には、特定の疾患に罹患した患者由来の検体 (細胞又は組織）を用意し、これに対して各抗体が反応するか否かを調べる（図 1、（2) )。選抜した各抗体グループの中から二以上の抗体を選抜し、それらについて反応性を調べることにしてもよい。ここでの「特定の疾患」は特に限定されないが、各種の癌、例えば腎臓癌、肝細胞癌、胆肝癌、肺胞上皮癌、肺扁平上皮癌、肺腺癌、脾臓癌、大腸腺癌、又は卵巣癌などである。図 1の例では同時に二種類以上の疾患との反応性を調べることにしているがこれに限られるものではなぐ一種類の疾患との反応性を調べることにしてもよい。また、ある疾患の中でも特定の病態との反応性を調べることにしてもよい。

[0088] 患者由来の検体との反応性は、免疫組織化学的染色法、免疫沈降法、フローサイトメトリー解析、細胞 ELISAなどを利用して検出'評価することができる。これらの方法は互いに排他的なものではなぐ必要に応じて二つ以上を組み合わせて用いることができる。この中でも免疫組織ィ匕学的染色法を採用することが好ましい。免疫組織化学的染色法によれば迅速で感度のよい検出が可能である。また、操作も比較的簡便である。

免疫組織化学的染色法では、患者より採取した組織と抗体とを接触させた後、特異的に結合した抗体を検出する。具体的には、以下に示す免疫組織化学的染色法に従って本発明の方法を実施することができる。

[0089] 生体組織の免疫組織ィ匕学的染色は一般に以下の手順 (a)〜(j)で実施される。尚、生体組織の免疫組織化学的染色法につ!ヽては様々な文献及び成書を参照することができる (例えば、「酵素抗体法、改訂第 3版」、渡辺慶一、中根一穂編集、学際企画)。

(a)固定'パラフィン包埋

外科的に生体より採取した組織をホルマリンゃパラフオルムアルデヒド、無水ェチルアルコール等によって固定する。その後パラフィン包埋する。一般にアルコールで脱水した後キシレンで処理し、最後にパラフィンで包埋する。ノラフィンで包埋された標本を所望の厚さ（例えば 3〜5 μ m厚）に薄切し、スライドガラス上に伸展させる。尚、パラフィン包埋標本に代えてアルコール固定標本、乾燥封入した標本、凍結標本などを用いる場合もある。

(b)脱パラフィン

一般にキシレン、アルコール、及び精製水で順に処理する。

(c)前処理 (抗原賦活）

必要に応じて抗原賦活のために酵素処理、加熱処理及び Z又は加圧処理等を行

(d)内因性ペルォキシダーゼ除去

染色の際の標識物質としてペルォキシダーゼを使用する場合、過酸化水素水で処理して内因性ペルォキシダーゼ活性を除去しておく。

(e)非特異的反応阻害

切片をゥシ血清アルブミン溶液 (例えば 1%溶液)で数分から数十分程度処理して非特異的反応を阻害する。尚、ゥシ血清アルブミンを含有させた抗体溶液を使用して次の一次抗体反応を行うこととし、この工程を省略してもよい。

(f)一次抗体反応

適当な濃度に希釈した抗体をスライドガラス上の切片に滴下し、その後数十分〜数時間反応させる。反応終了後、リン酸緩衝液など適当な緩衝液で洗浄する。

(g)標識試薬の添加

標識物質としてペルォキシダーゼが頻用される。ペルォキシダーゼを結合させた 2 次抗体をスライドガラス上の切片に滴下し、その後数十分〜数時間反応させる。反応終了後、リン酸緩衝液など適当な緩衝液で洗浄する。

(h)発色反応

トリス緩衝液に DAB (3,3'-diaminobenzidine)を溶解する。続、て過酸化水素水を添加する。このようにして調製した発色用溶液を数分間 (例えば 5分間)切片に浸透させ、発色させる。発色後、切片を水道水で十分に洗浄し、 DABを除去する。

(i)核染色

マイヤーのへマトキシリンを数秒〜数十秒反応させて核染色を行う。流水で洗浄し色出しする (通常、数分間)。

(j)脱水、透徹、封入

アルコールで脱水した後、キシレンで透徹処理し、最後に合成樹脂やグリセリン、ゴムシロップなどで封入する。

[0090] いずれかの疾患に対して特異的反応性が認められた抗体は、当該疾患を特徴づける細胞表面抗原を高感度で検出することが可能であり、当該疾患の診断又は治療用抗体としての利用ないし応用が期待できる。そこでステップ（3)ではこのような抗体が属する抗体グループの抗体を選択する（図 1、（3) )。その結果、この例では、疾患 Aに関して抗体グループ 1の抗体 (抗体 1 1、 1 2又は 1 3)と抗体グループ 3の抗体 (抗体 3— 1、 3— 2又は 3— 3)、疾患 Bに関して抗体グループ 5の抗体 (抗体 5— 1、 5— 2又は 5— 3)が選択されることになる。このようにして、特定の疾患に特異的な抗体が取得される。

[0091] ステップ（3' )では、二つ以上の抗体が特異的反応性を示した疾患を選抜した後、当該疾患に対して特異的反応性を示した抗体が属する抗体グループからそれぞれ抗体を選抜し、選抜された抗体同士を組み合わせる（図 1、（3' ) )。即ち、この例では疾患 Aを選抜し、疾患 Aに対して特異的反応性を示した抗体が属する抗体グループである抗体グループ 1及び 3の抗体を組み合わせる。このようにして、特定の疾患に特異的な抗体セットが取得される。

[0092] ここで、抗体グループ内の各抗体の間で特異性 (交差反応性)等を比較し、最も優れた特性を有する抗体を最終的に選択することにしてもよ、 (この例では抗体 1 2、抗体 3— 3、抗体 5— 3が選択される。図 1、（4) )。このステップをカ卩えることにより、より有用性の高い抗体又は抗体セットを得ることができる。

また、特定の疾患に反応を示すとして選抜された抗体に、当該疾患に反応性を有しな、任意の抗体を組み合わせて抗体セットを構成してもよ、 (この例では抗体ダループ 1の抗体及び抗体グループ 3の抗体に例えば抗体 4 1を組み合わせる）。このような抗体セットを利用すれば、当該疾患のさらに詳細な特徴付けが可能となる。

[0093] 本発明の取得法によれば、疾患特異的抗原に対する抗体 (又は抗体セット）が得られる。当該抗体 (又は抗体セット）は、そのまま又は必要な改変を加えた上で、当該疾患又は病態の研究，分類 '診断'治療などに有用である。このように本法は医療分野にお、て極めて有益なツールを提供する。

[0094] この局面の第 3態様は、以下のステップを含む抗体セットの取得法を提供する。

(1)本発明の分類法で分類された複数の抗体グループの中から、認識する抗原が異なる二以上の抗体グループを選抜するステップ、

[0095] 以下、各ステップの詳細について図 2を参照しながら説明する。説明の便宜上、図 2では、本発明の分類法によって抗体グループ 1〜6が得られており、各抗体グループには 3個ずつ抗体が属するとする。抗体グループ 1〜3の抗原 (抗原 A)は共通する。同様に抗体グループ 4及び 5の抗原 (抗原 B)は共通する。

この態様のステップ（1)では、認識する抗原が異なる二以上の抗体グループ (抗体グループ 1、 4、 6)を選抜する（図 2、（1) )。続くステップ（2)では、選抜した各抗体グループの中の抗体 (抗体 1 1、 4 1、 6— 1)と特定の疾患 (疾患 A〜D)との反応性を調べる（図 2、（2) )。ステップ（3)では、いずれかの疾患に対して特異的反応性を示した抗体が属する抗体グループの抗体を組み合わせる。即ち、この例では疾患 A に特異的反応性を示した抗体 1 1が属する抗体グループ 1の抗体と、疾患 Bに特異的反応性を示した抗体 4 1が属する抗体グループ 4の抗体とを組み合わせて抗体セットとする（図 2、（3) )。このようにして、疾患 Aに特異的な抗体と、疾患 Bに特異的な抗体を含む抗体セット (抗体 1 1と抗体 4 1)が取得される。この抗体セットは例えば疾患 A又は疾患 Bの検出に有用であり、特に疾患 Aと Bの識別に有効な試薬となる。

尚、抗体グループ内の各抗体の間で特異性 (交差反応性)等を比較し、最も優れた特性を有する抗体を最終的に選択することにしてもよい (この例では抗体 1 2と抗体 4 3力選択される。図 2、（4) )。このステップを加えることにより、より有用性の高い抗体セットを得ることができる。 [0096] この局面の第 4態様は、本発明の分類法及び同定法を実施した結果、認識する抗原が共通する複数の抗体グループが得られて、ることを前提として、以下のステップを含む抗体セットの取得法を提供する。

[0097] 以下、各ステップの詳細について図 3を参照しながら説明する。説明の便宜上、図 3では、本発明の分類法によって抗体グループ 1〜6が得られており、各抗体グループには 3個ずつ抗体が属するとする。抗体グループ 1〜3の抗原 (抗原 A)は共通する。同様に抗体グループ 4及び 5の抗原 (抗原 B)は共通する。

この態様のステップ（1)では、認識する抗原が異なる二以上の抗体グループ (抗体グループ 1、 4、 6)を選抜する（図 3、（1) )。続くステップ（2)では、選抜した各抗体グループの中の抗体 (抗体 1 1、 4 1、 6— 1)と特定の疾患 (疾患 A〜D)との反応性を調べる（図 3、（2) )。ステップ（3)では、いずれかの疾患に対して特異的反応性が認められた抗体が属する抗体グループの抗体と、当該グループと抗原が共通する他の抗体グループの抗体をそれぞれ選抜し、選抜した抗体同士を組み合わせて抗体セットとする（図 3、（3) )。即ち、この例では疾患 Aに対して特異的反応性を示した抗体 1 1が属する抗体グループ 1の抗体と、抗体グループ 1と抗原が共通する抗体グループ 2及び 3の抗体とを組み合わせる。このようにして、疾患 Aに特異的な抗体セットが取得される。同様に、疾患 Bに対して特異的反応性を示した抗体 4 1が属する抗体グループ 4の抗体と、抗体グループ 4と抗原が共通する抗体グループ 5の抗体とを組み合わせる。このようにして、疾患 Bに特異的な抗体セットが取得される。この例に示すように、ここでの「他の抗体グループ」は一つに限らず複数であってもよい。

[0098] ここで、同じ臓器の癌であっても患者によって病態 (悪性度）が大きく異なることがある。この病態の相違には、特定の抗原の発現態様が関与すると予想される。一方、この態様の方法で得られる抗体セットは、典型的には、認識する抗原のレベルでは差はないが、ェピトープのレベルで互いに異なる抗体の集合力もなる。即ち、認識するェピトープが異なる複数の抗体を含む抗体セットである。このような抗体セットは、抗原の発現態様を多面的に検出ないし評価することを可能にするものであり、例えば癌等における特定の病態の検出や悪性度の判定に有用である。

尚、抗体グループ内の各抗体の間で特異性 (交差反応性)等を比較し、最も優れた特性を有する抗体を最終的に選択することにしてもよい（図 3、（4) )。このステップを加えることにより、より有用性の高い抗体セットを得ることができる。

[0099] この局面の第 5態様は、本発明の分類法及び同定法を実施した結果、認識する抗原が共通する複数の抗体グループが得られて、ることを前提として、以下のステップを含む抗体セットの取得法を提供する。

(1)本発明の分類法で分類された複数の抗体グループの中から、認識する抗原が共通する二以上の抗体グループを選抜するステップ、

[0100] 以下、各ステップの詳細について図 4を参照しながら説明する。説明の便宜上、図 4では、本発明の分類法によって抗体グループ 1〜6が得られており、各抗体グループには 3個ずつ抗体が属するとする。抗体グループ 1〜3の抗原 (抗原 A)は共通する。同様に抗体グループ 4及び 5の抗原 (抗原 B)は共通する。

この態様のステップ（1)では、認識する抗原が共通する抗体グループの中からニ以上の抗体グループ (抗体グループ 1〜3)を選抜する（図 4、（1) )。続くステップ（2)では、選抜した各抗体グループの抗体 (抗体 1 1、 2- 1, 3- 1)について、特定の疾患の様々な病態との反応性を調べる（図 4、 (2) )。具体的には特定の疾患の様々な病態についてそれぞれ、患者由来の検体 (細胞又は組織)を用意し、それと各抗体との反応性を調べる。ステップ（3)では、得られた反応性に関する情報を関連付けた上で（図 4、 (2)の右欄）、選抜した各抗体グループ (抗体グループ 1〜3)の抗体同士を組み合わせて抗体セットとする（図 4、（3) )。このようにして、特定の疾病に関する病態特異的抗体セットが取得される（この例では抗体グループ 1〜3の抗体力もなる、疾病 Aの病態特異的抗体セットが得られる)。この態様の方法で得られる抗体セットは、典型的には、それに対する抗原のレベルでは差はないが、ェピトープのレベルで互いに異なる抗体の集合力もなる。従って、上記態様の抗体セットと同様に、例えば癌等における特定の病態の検出や悪性度の判定に有用な抗体セットとなる。尚、いずれの病態との間にも特異的反応性が認められな力つた抗体を排除した上で抗体セットを構築することが好ましい。

抗体グループ内の各抗体の間で特異性 (交差反応性)等を比較し、最も優れた特性を有する抗体を最終的に選択することにしてもょヽ（この例では抗体 1 2、 2— 1、 3— 3力選択される。図 4、（4) )。このステップを加えることにより、より有用性の高い抗体セットを得ることができる。

[0101] 本発明の更なる局面は、抗体と疾患 (又は病態）との関連性を表示したパネルを作成する方法を提供する。この局面の第 1態様では次のステップが行われる。

(2)選抜した各抗体グループの抗体と、特定の疾患との反応性を、一種類又は二以上の疾患について調べるステップ、及び

[0102] ステップ（1)で一の抗体グループを選抜することにした場合、一つの抗体に関して

、又は抗原が共通する複数の抗体に関して特定の疾患との関連性が表示されたパネルが得られる。後者の場合、抗原が共通する複数の抗体について、疾患との関連性の観点力の差異ないし相違点（交差反応性などに起因するもの）を読み取ることができる。即ち、当該パネルは抗体の特性について重要な示唆を与える。一方、ステップ（1)で二以上の抗体グループを選抜した場合、抗原が異なる複数の抗体 (但し、ステップ（1)で各抗体グループより数個の抗体を選抜することにした場合は、抗原が共通する抗体が混在することになる）に関して特定の疾患との関連性が表示されたパネルが得られる。このパネルは疾患の研究 ·分類 '診断などに有用な抗体群に関する情報を与えるものであり、それ自体が大きな価値をもつ。このパネルからは複数の抗原と疾患との関連性も読み取ることができる。即ち、当該パネルは各抗原と疾患との関連性や抗原間の関連性について重要な示唆を与える。

ここで、ステップ（2)において、二種類以上の疾患について抗体の反応性を調べることが好ましい。このようにすれば、抗体毎に二種類以上の疾患との関連性 (リンケ一ジ）が表示されたパネルが得られる。当該パネルでは、より多くの情報が提示されることはもとより、疾患間の関連性をも提示され、当該疾患の研究，分類'診断などに有用且つ重要な示唆が得られる。

[0103] この局面の第 2態様では次のステップが行われる。

( 1)本発明の分類法で分類された複数の抗体グループの中から、認識する抗原が異なる二以上の抗体グループを選抜するステップ、

[0104] この態様では、抗原が異なる複数の抗体に関して特定の疾患との関連性が表示されたパネルが得られる。このパネルは疾患の研究 ·分類 '診断などに有用な抗体群に関する情報を与えるものであり、それ自体が大きな価値をもつ。このパネルからは複数の抗原と疾患との関連性 (リンケージ)も読み取ることができる。即ち、当該パネルは各抗原と疾患との関連性や抗原間の関連性について重要な示唆を与える。

[0105] ここで、ステップ（2)において、二種類以上の疾患について抗体の反応性を調べることが好ましい。このようにすれば、抗体毎に二種類以上の疾患との関連性が表示されたパネルが得られる。当該パネルでは、より多くの情報が提示されることはもとより、疾患間の関連性をも提示され、当該疾患の研究 ·分類 '診断などに有用且つ重要な示唆が得られる。

[0106] この局面の第 3態様では次のステップが行われる。

( 1)本発明の分類法で分類された複数の抗体グループの中から、認識する抗原が共通する二以上の抗体グループを選抜するステップ、 (2)選抜した各抗体グループの抗体と、特定の疾患の病態との反応性を、一種類又は二種類以上の病態について調べるステップ、及び

[0107] この態様では、抗原が共通する複数の抗体に関して、特定の疾患の病態との関連性が表示されたパネルが得られる。このパネルは各病態の研究や病態間の差異に関する研究、病態の分類、又は病態レベルでの診断などに有用な抗体群に関する情報を与えるものであり、それ自体が大きな価値をもつ。

ここで、ステップ（2)において、二種類以上の病態について抗体の反応性を調べることが好ましい。このようにすれば、抗体毎に二種類以上の病態との関連性が表示されたパネルが得られる。当該パネルでは、より多くの情報が提示されることはもとより、病態間の関連性をも提示され、各病態の研究 ·分類 '診断などに有用且つ重要な示唆が得られる。

[0108] 尚、この局面の第 1態様は、本発明の第 3局面の第 1態様及び第 2態様に対応する。同様に、第 2態様は第 3局面の第 3態様及び第 4態様に、第 3態様は第 3局面の第 5態様にそれぞれ対応する。従って、この局面において特に言及されない事項についてはそれぞれ、対応する第 3局面の説明が援用される。

[0109] 本発明のパネルにお、て「抗体と疾患 (又は病態）との関連性」は、対象疾患 (又は病態）が抗体に陽性又は陰性であることを示す文字 (例えば「陽性」「陰性」「ポジティブ」「ネガティブ」）や記号 (例えば「〇」「X」「P」「N」）などで表示される。二段階表示ではなぐ例えば強陽性、中程度陽性、弱陽性、及び陰性の 4段階で表示する等、多段階表示によって関連性を示すことにしてもよい。

一つのパネルに表示される抗体の数は特に限定されないが、例えば 1〜： LOOO、好ましく ίま 2〜100、更に好ましく ίま 5〜50である。

また、抗体と特定の疾患 (又は病態)との関連性に加えて、各抗体の抗原を明示することにしてちょい。

[0110] この局面のパネルと、上記本発明の取得法で得られた抗体 (又は抗体セット）との組合せは、疾患や病態の研究 ·分類 '診断などに極めて有効なツールとなる。即ち当該組合せによれば、疾患又は病態特異的な抗体 (又は抗体セット)と、当該抗体 (又は抗体セット）と疾患又は病態との関連性の情報が同時に提供される。

[0111] 本発明は更に上記パネルの用途に関する。即ち、以下のステップを含む、細胞表面抗原が指標となる疾患の検査法を提供する。

( 1)被検者より分離された細胞又は組織を用意するステップ。

(2)該細胞又は組織と、本発明のパネル (抗体と疾患 (又は病態）との関連性を表示したパネル）に表示された各抗体との反応性を調べるステップ。

(3)ステップ（2)の結果を前記パネルに照合するステップ。

[0112] 本発明の検査法によれば、検査対象の疾患又は病態 (以下、「対象疾患」という）について、被検者の罹患の有無や罹患リスク、病態などに関する情報が得られる。即ち、本発明の検査法は対象疾患の診断のために有益な手段となる。また、治療と並行して本発明の検査法を実施すれば、検査結果を基に治療効果を評価することができる。このように本発明の検査法を治療効果のモニターに利用してもよい。

[0113] ステップ（1)では、被検者 (即ち生体)より分離された細胞又は組織 (以下、「被検細胞等」という）を用意する。「被検者より分離された」とは、被検者の細胞又は組織の一部が摘出され、生体である被検者と完全に隔離されている状態をいう。対象疾患に関する情報 (罹患の有無、罹患リスクなど)を必要とする者が被検者となる。被検者は、対象疾患の患者であっても、見かけ上の健常者であってもよい。「見かけ上の健常者」とは、本発明の検査法が適用される以前において対象疾患の患者と認定されていない者のことをいう。

[0114] ステップ（2)では、被検細胞等と、本発明のパネルに表示された各抗体との反応性を調べる。即ち、免疫学的手法 (例えば免疫組織化学的染色法)を用い、各抗体が認識する抗原を被検細胞等が発現してヽるかを調べる。免疫学的手法によれば通常、抗原の発現量に関する情報も得られる。そこで、抗原の発現の有無に加えて発現量も調べること〖こしてもよい。免疫学的手法として例えば、 ELISA法、ラジオィムノアッセィ、フローサイトメトリー解析、免疫沈降法、ィムノブロッテイング等の方法が挙げられる。

[0115] ステップ（3)では、ステップ（2)の結果 (各抗体の反応性)を本発明のパネルに照合する。本発明のパネルでは各抗体と疾患又病態との関連性が表示されている。従つて、このステップによって、各抗体の反応性を介して被検細胞等と疾患との関連性が明らかとなる。

[0116] 上記パネルの更なる用途として、本発明は以下の方法も提供する。即ち、以下のステツプを含む、特定の疾患に対する最適な治療法を選択する方法である。

(3)ステップ（2)の結果を前記パネルに照合するステップ。

(4)照合結果に従!、、有効な抗体を選択するステップ。

[0117] 本発明の選択法では、上記の検査法と同様にステップ（1)〜（3)を実施した後、照合結果に従い、有効な抗体を選択する (ステップ (4) )。有効な抗体として、典型的には、ステップ（2)において特異的な反応性を示した抗体が選択される。ステップ（2) にお!ヽて特異的な反応性を示した抗体と等価な抗体を選択することにしてもよ!ヽ。「等価な抗体」とは、基準となる抗体 (基準抗体)と同等の特性 (反応性や活性)をもつ抗体である。等価な抗体の一例として、重鎖可変領域の配列及び軽鎖可変領域の配列が、基準抗体のそれと実質的な差がない (完全同一、又は反応性や活性などに影響を与えな、軽微な差を有する)抗体を挙げることができる。等価な抗体の他の一例として、基準抗体と比較したとき、重鎖可変領域を構成する各 CDRの配列及び軽鎖可変領域を構成する各 CDRの配列の全てにおいて差が認められない抗体を挙げることがでさる。

本発明の選択法が適用される疾患は、 HER1、 HER2、 CD46、 ITGA3、 ICAM1、 AL CAM, CD147、 IgSF4、 BCAM、 ClqR、 CD44、 CD73、 LAR、 EpCAM及び HGFRからなる群より選択される細胞表面抗原が指標となる疾患である。即ち、これらの細胞表面抗原の発現によって特徴付けられる様々な疾患に対する最適な治療法を選択するために本発明を利用可能である。本発明の選択法によれば、患者毎に最適な治療法を選択でき、テーラーメイド型医療が実現する。

[0118] 本発明の選択法で使用されるパネルに、 048-006抗体、 057-091抗体、 059-152抗体、 048- 040抗体、 054- 101抗体、 055- 147抗体、 059- 173抗体、 067- 149抗体、 067- 176抗体、 015-126抗体、 015-044抗体、 015-102抗体、 015-136抗体、 015-143抗体、 015- 209抗体、 039- 016抗体、 053- 216抗体、 075- 024抗体、 075- 110抗体、 086-03 2抗体、 086- 035抗体、 086- 036抗体、 086- 061抗体、 086- 138抗体、 086- 182抗体、 0 35-224抗体、 045-011抗体、 051-144抗体、 052-053抗体、 052-073抗体、 053-049抗体、 3172- 120抗体、 066- 069抗体、 015- 003抗体、 064- 002抗体、 064- 006抗体、 064 -012a抗体、 064-012b抗体、 064-014抗体、 064-054抗体、 064-085抗体、 064-093抗体、 064- 116抗体、 065- 183抗体、 067- 142抗体、 068- 007抗体、 052- 033抗体、 053- 042抗体、 053- 051抗体、 053- 059抗体、 053- 085抗体、 035- 234抗体、 040- 107抗体、 041-118抗体、 066-174抗体、 083-040抗体、 029-143抗体、 045-134抗体、 062-10 1抗体、 062- 109抗体、 084- 103抗体、 052- 274抗体、 029- 067抗体、 083- 131抗体、 0 59-053抗体、 064-003抗体、 067-213抗体、 067-153抗体、 067-126抗体、 067-133抗体、 067-287抗体、 064-044抗体、 065-030抗体、 065-358抗体、 066-019抗体、 079- 085抗体、 067-024抗体、及び 076-048抗体からなる群より選択される二以上の抗体が表示されて、ることが好まし、。

[0119] 本発明の選択法の一態様では、以下のステップが実施される。

、細気管支肺胞上皮癌、腺癌、及び大細胞癌からなる群より選択される一以上の疾患の臨床癌組織との反応性が表示されたパネルと、被検者より分離された細胞又は組織を用意するステップ。

(3)ステップ（2)の結果を前記パネルに照合するステップ。

(4)照合結果に従!、、有効な抗体を選択するステップ。

[0120] この態様のステップ（1)では、本発明者らが取得に成功した抗体と、特定の疾患の臨床癌組織との反応性が表示されたパネルを用意する。併せて、被検者より分離された細胞又は組織を用意する。ステップ（2)以降は上記の態様と同様に実施する。尚、この態様で使用されるパネルの具体例は図 69に示すパネルである。この態様においても、有効な抗体として、ステップ（2)において特異的な反応性を示した抗体又はそれと等価な抗体が選択される。この態様の選択法は、扁平上皮癌、腺扁平上皮癌、細気管支肺胞上皮癌、腺癌、又は大細胞癌に対する最適な治療法の選択に好適である。

[0121] 本発明の更なる局面は、以上の抗体の取得法 (又は抗体セットの取得法)で取得される単離された抗体 (又は抗体セット）を提供する。後述の実施例に示すように、本発明者らは本発明の方法によって HER1に関連性を有する抗体、 HER2に関連性を有する抗体、 CD46に関連性を有する抗体、 ITGA3に関連性を有する抗体、 ICAM1に関連性を有する抗体、 ALCAMに関連性を有する抗体、 CD147に関連性を有する抗体、 ClqRに関連性を有する抗体、 CD44に関連性を有する抗体、 CD73に関連性を有する抗体、 EpCAMに関連性を有する抗体、 HGFRに関連性を有する抗体、 LAR 関連性を有する抗体、及び BCAMに関連性を有する抗体を実際に取得することに成功した。また、現在の検査法では同一疾患 (病態）と判定される二つの臨床検体を識別できる抗体が得られた。この抗体を用いれば、抗原の発現状態に基づいて特定の疾患を新たに分類することが可能であり、また当該疾患の検査も可能となる。

[0122] 本発明の更なる局面は、本発明者らが取得に成功した抗体及びその用途を提供する。後述の実施例に示す通り、本発明者らは HER1に対する抗体を 9種類 (048-00 6抗体、 057- 091抗体、 059- 152抗体、 048- 040抗体、 054- 101抗体、 055- 147抗体、 0 59-173抗体、 067-149抗体、 067-176抗体）、 HER2に対する抗体を 16種類（015-126 抗体、 015-044抗体、 015-102抗体、 015-136抗体、 015-143抗体、 015-209抗体、 03 9-016抗体、 053-216抗体、 075-024抗体、 075-110抗体、 086-032抗体、 086-035抗体、 086-036抗体、 086-061抗体、 086-138抗体、 086-182抗体）、 CD46に対する抗体を 8種類（035-224抗体、 045-011抗体、 051-144抗体、 052-053抗体、 052-073抗体、 053-049抗体、 3172-120抗体、 066-069抗体）、 ITGA3に対する抗体を 13種類（015- 003抗体、 064-002抗体、 064-006抗体、 064-012a抗体、 064-012b抗体、 064-014抗体、 064-054抗体、 064-085抗体、 064-093抗体、 064-116抗体、 065-183抗体、 067- 142抗体、 068-007抗体）、 ICAM1に対する抗体を 5種類（052-033抗体、 053-042抗体、 053-051抗体、 053-059抗体、 053-085抗体）、 ALCAMに対する抗体を 13種類（0 35-234抗体、 040-107抗体、 041-118抗体、 066-174抗体、 083-040抗体、 029-143抗体、 045-134抗体、 062-101抗体、 062-109抗体、 084-103抗体、 052-274抗体、 029- 067抗体、 083-131抗体）、 CD147に対する抗体を 1種類（059-053抗体）、 ClqRに対する抗体を 1種類（070-016抗体）、 CD44に対する抗体を 1種類（064-003抗体）、 CD 73に対する抗体を 1種類（067-213抗体）、 EpCAMに対する抗体を 1種類（067-153抗体）、 HGFRに対する抗体を 3種類（067-126抗体、 067-133抗体、 067-287抗体）、 LA Rに対する抗体を 5種類（064-044抗体、 065-030抗体、 065-358抗体、 066-019抗体、 079-085抗体）、及び BCAMに対する抗体を 1種類（067-024抗体）取得すること〖こ成功した。これらの抗体はいずれも、細胞膜表面上に発現している状態の抗原における細胞外ドメインを認識することから、細胞 ·組織染色等に有用である。各抗体の可変領域の配列を解析した結果、以下の配列情報が得られた。尚、抗体名に続けて、重鎖可変領域のアミノ酸配列；重鎖 CDR1のアミノ酸配列；重鎖 CDR2のアミノ酸配列；重鎖 CDR3のアミノ酸配列；軽鎖可変領域のアミノ酸配列；軽鎖 CDR1のアミノ酸配列；軽鎖 CDR2のアミノ酸配列；軽鎖 CDR3のアミノ酸配列の順で記載する。

1. HER1に対する抗体

複数の抗体クローンが取得された。その中にはアミノ酸配列が同一のものも含まれて、た。配列を詳細に解析したのは下記 9種の抗体クローンである。

048-006抗体配列番号： 1(VH)；配列番号： 2(VH CDR1)；配列番号： 3(VH CDR2) ；配列番号： 4(VH CDR3)；配列番号： 5(VL)；配列番号： 6(VL CDR1)；配列番号： 7(V L CDR2)；配列番号： 8(VL CDR3)

057-091抗体配列番号： 9(VH)；配列番号： 10(VH CDR1)；配列番号： 11(VH CD R2)；配列番号： 12(VH CDR3)；配列番号： 13(VL) ;配列番号： 14(VL CDR1) ;配列番号： 15(VL CDR2)；配列番号： 16(VL CDR3)

059-152抗体配列番号： 17(VH) ;配列番号： 18(VH CDR1) ;配列番号： 19(VH C DR2)；配列番号： 20(VH CDR3)；配列番号： 21(VL)；配列番号： 22(VL CDR1) ;配列番号： 23(VL CDR2)；配列番号： 24(VL CDR3)

048-040抗体配列番号： 483(VH)；配列番号： 484(VH CDR1)；配列番号： 485(V H CDR2) ;配列番号： 486(VH CDR3) ;配列番号： 487(VL) ;配列番号： 488(VL CDR 1) ;配列番号： 489(VL CDR2) ;配列番号： 490(VL CDR3)

054- 101抗体配列番号： 491(VH) ;配列番号： 492(VH CDR1) ;配列番号： 493(V H CDR2) ;配列番号： 494(VH CDR3) ;配列番号： 495(VL) ;配列番号： 496(VL CDR 1) ;配列番号： 497(VL CDR2) ;配列番号： 498(VL CDR3)

055- 147抗体配列番号： 499(VH) ;配列番号： 500(VH CDR1) ;配列番号： 501(V H CDR2) ;配列番号： 502(VH CDR3) ;配列番号： 503(VL) ;配列番号： 504(VL CDR 1)；配列番号： 505(VL CDR2)；配列番号： 506(VL CDR3)

059-173抗体配列番号： 507(VH)；配列番号： 508(VH CDR1)；配列番号： 509(V H CDR2)；配列番号： 510(VH CDR3)；配列番号： 511(VL)；配列番号： 512(VL CDR 1)；配列番号： 513(VL CDR2)；配列番号： 514(VL CDR3)

067-149抗体配列番号： 515(VH) ;配列番号： 516(VH CDR1) ;配列番号： 517(V H CDR2) ;配列番号： 518(VH CDR3) ;配列番号： 519(VL) ;配列番号： 520(VL CDR 1) ;配列番号： 521(VL CDR2) ;配列番号： 522(VL CDR3)

067-176抗体配列番号： 523(VH) ;配列番号： 524(VH CDR1) ;配列番号： 525(V H CDR2) ;配列番号： 526(VH CDR3) ;配列番号： 527(VL) ;配列番号： 528(VL CDR 1)；配列番号： 529(VL CDR2)；配列番号： 530(VL CDR3)

尚、後述の実施例に示すように、これらの抗体と脾癌細胞株 PANC-1、腎臓癌細胞株 CCFRC1、腎臓癌細胞株 Caki- 1、卵巣癌細胞株 KF28、胃癌細胞株 SNU- 5、肺扁平上皮癌細胞株 RERF-LC-AI、卵巣癌細胞株 RMG-1、未分化型肝細胞癌細胞株 H LF、卵巣癌細胞株 SKOv3、肺腺癌細胞株 PC14、腎臓癌細胞株 ACHN、肺扁平上皮癌細胞株 EBC1、外陰部粘膜上皮細胞株 A431、肺腺癌細胞株 H1373、肝細胞癌細胞株 HepG2、及び腎臓癌臨床検体榭立細胞株との関連性 (以上、細胞株染色の結果に基づく）、並びに腎臓癌、肝細胞癌、胆肝癌、肺扁平上皮癌、肺腺癌、及び脾臓癌との関連性 (以上、組織染色の結果に基づく）が実験的に確認された。

2. HER2に対する抗体

複数の抗体クローンが取得された。その中にはアミノ酸配列が同一のものも含まれて、た。配列を詳細に解析したのは下記 16種の抗体クローンである。

015-126抗体配列番号： 25(VH)；配列番号： 26(VH CDR1)；配列番号： 27(VH C DR2)；配列番号： 28(VH CDR3)；配列番号： 29(VL)；配列番号： 30(VL CDR1)；配列番号： 31(VL CDR2)；配列番号： 32(VL CDR3)

015-044抗体配列番号： 531(VH);配列番号： 532(VH CDR1);配列番号： 533(V H CDR2);配列番号： 534(VH CDR3);配列番号： 535(VL);配列番号： 536(VL CDR 1);配列番号： 537(VL CDR2);配列番号： 538(VL CDR3)

015-102抗体配列番号： 539(VH);配列番号： 540(VH CDR1);配列番号： 541(V H CDR2);配列番号： 542(VH CDR3);配列番号： 543(VL);配列番号： 544(VL CDR 1)；配列番号： 545(VL CDR2)；配列番号： 546(VL CDR3)

015-136抗体配列番号： 547(VH)；配列番号： 548(VH CDR1)；配列番号： 549(V H CDR2);配列番号： 550(VH CDR3);配列番号： 551(VL);配列番号： 552(VL CDR 1)；配列番号： 553(VL CDR2)；配列番号： 554(VL CDR3)

015-143抗体配列番号： 555(VH);配列番号： 556(VH CDR1);配列番号： 557(V H CDR2);配列番号： 558(VH CDR3);配列番号： 559(VL);配列番号： 560(VL CDR 1);配列番号： 561(VL CDR2);配列番号： 562(VL CDR3)

015-209抗体配列番号： 563(VH);配列番号： 564(VH CDR1);配列番号： 565(V H CDR2);配列番号： 566(VH CDR3);配列番号： 567(VL);配列番号： 568(VL CDR 1)；配列番号： 569(VL CDR2)；配列番号： 570(VL CDR3)

039-016抗体配列番号： 571(VH);配列番号： 572(VH CDR1);配列番号： 573(V H CDR2);配列番号： 574(VH CDR3);配列番号： 575(VL);配列番号： 576(VL CDR 1)；配列番号： 577(VL CDR2)；配列番号： 578(VL CDR3)

053-216抗体配列番号： 579(VH);配列番号： 580(VH CDR1);配列番号： 581(V H CDR2);配列番号： 582(VH CDR3);配列番号： 583(VL);配列番号： 584(VL CDR 1)；配列番号： 585(VL CDR2)；配列番号： 586(VL CDR3)

075-024抗体配列番号： 587(VH)；配列番号： 588(VH CDR1)；配列番号： 589(V H CDR2);配列番号： 590(VH CDR3);配列番号： 591(VL);配列番号： 592(VL CDR 1)；配列番号： 593(VL CDR2)；配列番号： 594(VL CDR3)

075-110抗体配列番号： 595(VH);配列番号： 596(VH CDR1);配列番号： 597(V H CDR2);配列番号： 598(VH CDR3);配列番号： 599(VL);配列番号： 600(VL CDR 1)；配列番号： 601(VL CDR2)；配列番号： 602(VL CDR3)

086-032抗体配列番号： 603(VH)；配列番号： 604(VH CDR1)；配列番号： 605(V H CDR2) ;配列番号： 606(VH CDR3) ;配列番号： 607(VL) ;配列番号： 608(VL CDR 1) ;配列番号： 609(VL CDR2) ;配列番号： 610(VL CDR3)

086-035抗体配列番号： 611(VH)；配列番号： 612(VH CDR1)；配列番号： 613(V H CDR2) ;配列番号： 614(VH CDR3) ;配列番号： 615(VL) ;配列番号： 616(VL CDR 1)；配列番号： 617(VL CDR2)；配列番号： 618(VL CDR3)

086-036抗体配列番号： 619(VH) ;配列番号： 620(VH CDR1) ;配列番号： 621(V H CDR2) ;配列番号： 622(VH CDR3) ;配列番号： 623(VL) ;配列番号： 624(VL CDR 1)；配列番号： 625(VL CDR2)；配列番号： 626(VL CDR3)

086-061抗体配列番号： 627(VH) ;配列番号： 628(VH CDR1) ;配列番号： 629(V H CDR2) ;配列番号： 630(VH CDR3) ;配列番号： 631(VL) ;配列番号： 632(VL CDR 1)；配列番号： 633(VL CDR2)；配列番号： 634(VL CDR3)

086-138抗体配列番号： 635(VH) ;配列番号： 636(VH CDR1) ;配列番号： 637(V H CDR2) ;配列番号： 638(VH CDR3) ;配列番号： 639(VL) ;配列番号： 640(VL CDR 1)；配列番号： 641(VL CDR2)；配列番号： 642(VL CDR3)

086-182抗体配列番号： 643(VH)；配列番号： 644(VH CDR1)；配列番号： 645(V H CDR2) ;配列番号： 646(VH CDR3) ;配列番号： 647(VL) ;配列番号： 648(VL CDR 1)；配列番号： 649(VL CDR2)；配列番号： 650(VL CDR3)

後述の実施例に示すように、これらの抗体と肺腺癌細胞株 Calu-3、卵巣癌細胞株 S KOv3、及び乳癌細胞株 BT474との関連性 (以上、細胞株染色の結果に基づく）が実験的に確認された。

3. CD46に対する抗体

複数の抗体クローンが取得された。その中にはアミノ酸配列が同一のものも含まれていた。最終的に 87種の抗体クローンが同定された。配列を詳細に解析したのは下記 8種の抗体クローンである。

035-224抗体配列番号： 33(VH)；配列番号： 34(VH CDR1)；配列番号： 35(VH C DR2)；配列番号： 36(VH CDR3)；配列番号： 37(VL)；配列番号： 38(VL CDR1) ;配列番号： 39(VL CDR2)；配列番号： 40(VL CDR3)

045-011抗体配列番号： 41(VH)；配列番号： 42(VH CDR1)；配列番号： 43(VH C DR2)；配列番号： 44(VH CDR3)；配列番号： 45(VL)；配列番号： 46(VL CDR1) ;配列番号： 47(VL CDR2)；配列番号： 48(VL CDR3)

051- 144抗体配列番号： 49(VH)；配列番号： 50(VH CDR1)；配列番号： 51(VH C DR2)；配列番号： 52(VH CDR3)；配列番号： 53(VL)；配列番号： 54(VL CDR1)；配列番号： 55(VL CDR2)；配列番号： 56(VL CDR3)

052- 053抗体配列番号： 57(VH)；配列番号： 58(VH CDR1)；配列番号： 59(VH C DR2)；配列番号： 60(VH CDR3)；配列番号： 61(VL)；配列番号： 62(VL CDR1) ;配列番号： 63(VL CDR2)；配列番号： 64(VL CDR3)

052- 073抗体配列番号： 65(VH)；配列番号： 66(VH CDR1)；配列番号： 67(VH C DR2)；配列番号： 68(VH CDR3)；配列番号： 69(VL)；配列番号： 70(VL CDR1)；配列番号： 71(VL CDR2)；配列番号： 72(VL CDR3)

053- 049抗体配列番号： 73(VH)；配列番号： 74(VH CDR1)；配列番号： 75(VH C DR2)；配列番号： 76(VH CDR3)；配列番号： 77(VL)；配列番号： 78(VL CDR1)；配列番号： 79(VL CDR2)；配列番号： 80(VL CDR3)

3172-120抗体配列番号： 81(VH) ;配列番号： 82(VH CDR1) ;配列番号： 83(VH CDR2)；配列番号： 84(VH CDR3)；配列番号： 85(VL)；配列番号： 86(VL CDR1) ;配列番号： 87(VL CDR2)；配列番号： 88(VL CDR3)

066-069抗体配列番号： 755(VH)；配列番号： 756(VH CDR1)；配列番号： 757(V H CDR2) ;配列番号： 758(VH CDR3) ;配列番号： 759(VL) ;配列番号： 760(VL CDR 1) ;配列番号： 761(VL CDR2) ;配列番号： 762(VL CDR3)

後述の実施例に示すように、これらの抗体と大腸癌細胞株 CaCo2、胃癌細胞株 MK N45、未分化型肝細胞癌細胞株 HLF、肝臓癌細胞株 HepG2、肝内胆管細胞癌細胞株 RBE、脾臓癌細胞株 PANC1、腎臓癌細胞株 CCFRC1、腎臓癌細胞株 Caki_l、肺癌細胞株 NCト H441、肺扁平上皮癌 EBC1、胃癌細胞株 NCト N87、胃癌細胞株 SNU- 5、肺扁平上皮癌細胞株 RERF-LC-AI、肝細胞癌臨床検体、乳癌細胞株 BT474、腎臓癌細胞株 293T、肺腺癌細胞株 PC 14、腎臓癌細胞株 ACHN、及び肺腺癌細胞株 H 1373との関連性 (以上、細胞株染色の結果に基づく）、並びに腎臓癌、肝細胞癌、胆肝癌、肺腺癌、及び脾癌との関連性 (以上、組織染色の結果に基づく）が実験的に確認された。

4. ITGA3に対する抗体

複数の抗体クローンが取得された。その中にはアミノ酸配列が同一のものも含まれて、た。配列を詳細に解析したのは下記 13種の抗体クローンである。

015-003抗体配列番号： 89(VH)；配列番号： 90(VH CDR1)；配列番号： 91(VH C DR2)；配列番号： 92(VH CDR3)；配列番号： 93(VL)；配列番号： 94(VL CDR1)；配列番号： 95(VL CDR2)；配列番号： 96(VL CDR3)

064-002抗体配列番号： 675(VH)；配列番号： 676(VH CDR1)；配列番号： 677(V H CDR2) ;配列番号： 678(VH CDR3) ;配列番号： 679(VL) ;配列番号： 680(VL CDR 1) ;配列番号： 681(VL CDR2) ;配列番号： 682(VL CDR3)

064-006抗体配列番号： 683(VH)；配列番号： 684(VH CDR1)；配列番号： 685(V H CDR2) ;配列番号： 686(VH CDR3) ;配列番号： 687(VL) ;配列番号： 688(VL CDR 1)；配列番号： 689(VL CDR2)；配列番号： 690(VL CDR3)

064-012a抗体配列番号： 691(VH) ;配列番号： 692(VH CDR1) ;配列番号： 693( VH CDR2) ;配列番号： 694(VH CDR3)；配列番号： 695(VL)；配列番号： 696(VL C DR1) ;配列番号： 697(VL CDR2) ;配列番号： 698(VL CDR3)

064-012b抗体配列番号： 699(VH) ;配列番号： 700(VH CDR1) ;配列番号： 701( VH CDR2)；配列番号： 702(VH CDR3)；配列番号： 703(VL)；配列番号： 704(VL C DR1)；配列番号： 705(VL CDR2)；配列番号： 706(VL CDR3)

064-014抗体配列番号： 707(VH)；配列番号： 708(VH CDR1)；配列番号： 709(V H CDR2) ;配列番号： 710(VH CDR3) ;配列番号： 711(VL) ;配列番号： 712(VL CDR 1) ;配列番号： 713(VL CDR2) ;配列番号： 714(VL CDR3)

064-054抗体配列番号： 715(VH)；配列番号： 716(VH CDR1)；配列番号： 717(V H CDR2) ;配列番号： 718(VH CDR3) ;配列番号： 719(VL) ;配列番号： 720(VL CDR 1) ;配列番号： 721(VL CDR2) ;配列番号： 722(VL CDR3)

064-085抗体配列番号： 723(VH)；配列番号： 724(VH CDR1)；配列番号： 725(V H CDR2) ;配列番号： 726(VH CDR3) ;配列番号： 727(VL) ;配列番号： 728(VL CDR 1)；配列番号： 729(VL CDR2)；配列番号： 730(VL CDR3)

064-093抗体配列番号： 731(VH) ;配列番号： 732(VH CDR1) ;配列番号： 733(V H CDR2) ;配列番号： 734(VH CDR3) ;配列番号： 735(VL) ;配列番号： 736(VL CDR 1)；配列番号： 737(VL CDR2)；配列番号： 738(VL CDR3)

064- 116抗体配列番号： 739(VH)；配列番号： 740(VH CDR1)；配列番号： 741(V H CDR2) ;配列番号： 742(VH CDR3) ;配列番号： 743(VL) ;配列番号： 744(VL CDR 1)；配列番号： 745(VL CDR2)；配列番号： 746(VL CDR3)

065- 183抗体配列番号： 747(VH)；配列番号： 748(VH CDR1)；配列番号： 749(V H CDR2) ;配列番号： 750(VH CDR3) ;配列番号： 751(VL) ;配列番号： 752(VL CDR 1)；配列番号： 753(VL CDR2)；配列番号： 754(VL CDR3)

067- 142抗体配列番号： 763(VH)；配列番号： 764(VH CDR1)；配列番号： 765(V H CDR2) ;配列番号： 766(VH CDR3) ;配列番号： 767(VL) ;配列番号： 768(VL CDR 1)；配列番号： 769(VL CDR2)；配列番号： 770(VL CDR3)

068- 007抗体配列番号： 771(VH)；配列番号： 772(VH CDR1)；配列番号： 773(V H CDR2) ;配列番号： 774(VH CDR3) ;配列番号： 775(VL) ;配列番号： 776(VL CDR 1)；配列番号： 777(VL CDR2)；配列番号： 778(VL CDR3)

後述の実施例に示すように、これらの抗体と未分化型肝細胞癌細胞株 HLF、卵巣癌細胞株 SKOv3、腎臓癌細胞株 ACHN、腎臓癌細胞株 Caki_l、肺腺癌細胞株 H137 3、肺扁平上皮癌 EBC1、外陰部粘膜上皮細胞株 A431、乳癌細胞株 BT474、肺腺癌細胞株 PC14、腎臓癌細胞株 CCFRC1、肝細胞癌細胞株 OCTH、肝内胆管細胞癌 R BE、脾臓癌細胞株 PANC- 1、脾臓癌細胞株 MIA- Paca2、肺腺癌細胞株 A549、肺腺癌細胞株 NCI-N441、肺扁平上皮癌細胞株 Calu-3、肺扁平上皮癌細胞株 RERF-LC -AI、胃癌細胞株 SNU5、胃癌細胞株 MKN45、胃癌細胞株 NCト N87、大腸癌細胞株 CW2、卵巣癌細胞株 SKOv3、卵巣癌細胞株 KF-28、卵巣癌細胞株 RMG-1、及び卵巣癌細胞株 RMG-2との関連性 (以上、細胞株染色の結果に基づく）、並びに胆肝癌及び脾臓癌の関連性 (以上、組織染色の結果に基づく）が実験的に確認された。 5. ICAM1に対する抗体複数の抗体クローンが取得された。その中にはアミノ酸配列が同一のものも含まれていた。最終的に 22種の抗体クローンが同定された。配列を詳細に解析したのは下記 5種の抗体クローンである。

052- 033抗体配列番号： 97(VH)；配列番号： 98(VH CDR1)；配列番号： 99(VH C DR2)；配列番号： 100(VH CDR3)；配列番号： 101(VL) ;配列番号： 102(VL CDR1) ; 配列番号： 103(VL CDR2)；配列番号： 104(VL CDR3)

053- 042抗体配列番号： 105(VH)；配列番号： 106(VH CDR1)；配列番号： 107(V H CDR2)；配列番号： 108(VH CDR3)；配列番号： 109(VL) ;配列番号： 110(VL CD R1) ;配列番号： 111(VL CDR2)；配列番号： 112(VL CDR3)

053-051抗体配列番号： 113(VH) ;配列番号： 114(VH CDR1) ;配列番号： 115(V H CDR2)；配列番号： 116(VH CDR3)；配列番号： 117(VL) ;配列番号： 118(VL CD R1) ;配列番号： 119(VL CDR2)；配列番号： 120(VL CDR3)

053-059抗体配列番号： 121(VH) ;配列番号： 122(VH CDR1) ;配列番号： 123(V H CDR2)；配列番号： 124(VH CDR3)；配列番号： 125(VL) ;配列番号： 126(VL CD R1) ;配列番号： 127(VL CDR2)；配列番号： 128(VL CDR3)

053-085抗体配列番号： 129(VH)；配列番号： 130(VH CDR1)；配列番号： 131(V H CDR2)；配列番号： 132(VH CDR3)；配列番号： 133(VL) ;配列番号： 134(VL CD R1) ;配列番号： 135(VL CDR2)；配列番号： 136(VL CDR3)

後述の実施例に示すように、これらの抗体と肝癌細胞株 H印 G2、肺腺癌細胞株 PC 14、及び腎臓臨床検体より榭立した細胞株との関連性 (以上、細胞株染色の結果に基づく）、並びに肝細胞癌との関連性 (以上、組織染色の結果に基づく）が実験的に確認された。

6. ALCAMに対する抗体

035-234抗体配列番号： 137(VH) ;配列番号： 138(VH CDR1) ;配列番号： 139(V H CDR2)；配列番号： 140(VH CDR3)；配列番号： 141(VL) ;配列番号： 142(VL CD R1) ;配列番号： 143(VL CDR2)；配列番号： 144(VL CDR3) 040- 107抗体配列番号： 145(VH)；配列番号： 146(VH CDR1)；配列番号： 147(V H CDR2)；配列番号： 148(VH CDR3)；配列番号： 149(VL);配列番号： 150(VL CD R1);配列番号： 151(VL CDR2)；配列番号： 152(VL CDR3)

041- 118抗体配列番号： 153(VH);配列番号： 154(VH CDR1);配列番号： 155(V H CDR2)；配列番号： 156(VH CDR3)；配列番号： 157(VL);配列番号： 158(VL CD R1);配列番号： 159(VL CDR2)；配列番号： 160(VL CDR3)

066-174抗体配列番号： 161(VH);配列番号： 162(VH CDR1);配列番号： 163(V H CDR2)；配列番号： 164(VH CDR3)；配列番号： 165(VL);配列番号： 166(VL CD R1);配列番号： 167(VL CDR2)；配列番号： 168(VL CDR3)

083- 040抗体配列番号： 169(VH);配列番号： 170(VH CDR1);配列番号： 171(V H CDR2)；配列番号： 172(VH CDR3)；配列番号： 173(VL);配列番号： 174(VL CD R1);配列番号： 175(VL CDR2)；配列番号： 176(VL CDR3)

029-143抗体配列番号： 779(VH);配列番号： 780(VH CDR1);配列番号： 781(V H CDR2);配列番号 782(VH CDR3);配列番号： 783(VL);配列番号： 784(VL CDR1 )；配列番号： 785(VL CDR2)；配列番号： 786(VL CDR3)

045-134抗体配列番号： 787(VH)；配列番号： 788(VH CDR1)；配列番号： 789(V H CDR2);配列番号： 790(VH CDR3);配列番号： 791(VL);配列番号： 792(VL CDR 1)；配列番号： 793(VL CDR2)；配列番号： 794(VL CDR3)

062-101抗体配列番号： 795(VH);配列番号： 796(VH CDR1);配列番号： 797(V H CDR2);配列番号： 798(VH CDR3);配列番号： 799(VL);配列番号： 800(VL CDR 1)；配列番号： 801(VL CDR2)；配列番号： 802(VL CDR3)

062-109抗体配列番号： 803(VH)；配列番号： 804(VH CDR1)；配列番号： 805(V H CDR2);配列番号： 806(VH CDR3);配列番号： 807(VL);配列番号： 808(VL CDR 1);配列番号： 809(VL CDR2);配列番号： 810(VL CDR3)

084- 103抗体配列番号： 811(VH)；配列番号： 812(VH CDR1)；配列番号： 813(V H CDR2);配列番号： 814(VH CDR3);配列番号： 815(VL);配列番号： 816(VL CDR 1)；配列番号： 817(VL CDR2)；配列番号： 818(VL CDR3)

052-274抗体配列番号： 819(VH);配列番号： 820(VH CDR1);配列番号： 821(V H CDR2) ;配列番号： 822(VH CDR3) ;配列番号： 823(VL) ;配列番号： 824(VL CDR 1)；配列番号： 825(VL CDR2)；配列番号： 826(VL CDR3)

029-067抗体配列番号： 827(VH)；配列番号： 828(VH CDR1)；配列番号： 829(V H CDR2) ;配列番号： 830(VH CDR3) ;配列番号： 831(VL) ;配列番号： 832(VL CDR 1)；配列番号： 833(VL CDR2)；配列番号： 834(VL CDR3)

083-131抗体配列番号： 835(VH) ;配列番号： 836(VH CDR1) ;配列番号： 837(V H CDR2) ;配列番号： 838(VH CDR3) ;配列番号： 839(VL) ;配列番号： 840(VL CDR 1)；配列番号： 841(VL CDR2)；配列番号： 842(VL CDR3)

後述の実施例に示すように、これらの抗体と肝癌細胞株（HepG2、 OCTH、 Hep3B、 HLF)、腎臓癌細胞株（Caki-1、 CCFRC1、 ACHN、 293T、臨床検体より榭立した細胞株）、肺癌細胞株（PC 14、 NCI- H441、 EBC- 1、 RERF- LC- AI、 A549、 H1373)、卵巣癌細胞株（SKOv3、 KF-28、 RMG1、 RMG2)、胃癌細胞株（NCI-N87)、大腸癌細胞株 (CW2)、乳癌細胞株 (BT474)、急性骨髄性白血病 AML臨床検体、及びハムスタ一卵巣癌細胞株 CHOとの関連性 (以上、細胞株染色の結果に基づく）、並びに腎臓癌、肝細胞癌、胆肝癌、肺扁平上皮癌、肺胞上皮癌、及び大腸腺癌との関連性 (以上、組織染色の結果に基づく）が実験的に確認された。

[0129] 7. CD147に対する抗体

複数の抗体クローンが取得された。その中にはアミノ酸配列が同一のものも含まれて、た。配列を詳細に解析したのは下記 1種の抗体クローンである。

059-053抗体配列番号： 177(VH)；配列番号： 178(VH CDR1)；配列番号： 179(V H CDR2)；配列番号： 180(VH CDR3)；配列番号： 181(VL) ;配列番号： 182(VL CD R1) ;配列番号： 183(VL CDR2)；配列番号： 184(VL CDR3)

後述の実施例に示すように、これらの抗体と肝臓癌細胞株 H印 G2、腎臓癌細胞株 CCFRC1、腎臓癌細胞株 ACHN、腎臓癌細胞株 Caki- 1、肺腺癌 PC 14、及び腎臓癌臨床検体より榭立細胞株との関連性 (以上、細胞株染色の結果に基づく）、並びに腎臓癌との関連性 (以上、組織染色の結果に基づく）が実験的に確認された。

[0130] 8. ClqRに対する抗体

070-016抗体配列番号： 451(VH) ;配列番号： (VH CDR1)452 ;配列番号： 453(V H CDR2) ;配列番号： 454(VH CDR3) ;配列番号： 455(VL) ;配列番号： (VL CDR1)4 56 ;配列番号： 457(VL CDR2) ;配列番号： 458(VL CDR3)

この抗体と白血病との関連性が実験的に確認された。即ち、この抗体を用いた細胞株染色では、白血病 AML細胞株 Nohnol及び白血病 AML臨床検体で強陽性 (MFI= 20以上)であった。また、白血病細胞株を生育する過程において、この抗体を生育環境下に添加すると速やかなる癌細胞の凝集が確認出来る。しかもこれらの現象を引き起こすのに必要な抗体量は比較的低濃度である。

[0131] 9. CD44に対する抗体

064-003抗体配列番号： 459(VH) ;配列番号： 460(VH CDR1) ;配列番号： 461(V H CDR2) ;配列番号： 462(VH CDR3) ;配列番号： 463(VL) ;配列番号： 464(VL CDR 1) ;配列番号： 465(VL CDR2) ;配列番号： 466(VL CDR3)

この抗体と肝癌、肺癌、卵巣癌、及び胃癌との関連性が実験的に確認された。即ち、この抗体を用いた細胞株染色では、肝細胞癌 HLF、肺腺癌細胞株 PC14、肺腺癌細胞株 NCト H1373、卵巣腺癌細胞株 SKOv3で強陽性 (MFI=20倍以上)であり、類表皮癌細胞株 A431、肺扁平上皮癌 EBC1で弱陽性 (MFI=3倍以上)であった。また、この抗体を用いた免疫染色では、肺腺癌臨床検体にお!、て癌特異的染色像を示す例を認め、肺胞上皮癌、肺扁平上皮癌において癌部弱陽性であった。

[0132] 10. CD73に対する抗体

067-213抗体配列番号： 467(VH) ;配列番号： 468(VH CDR1) ;配列番号： 469(V H CDR2) ;配列番号： 470(VH CDR3) ;配列番号： 471(VL) ;配列番号： 472(VL CDR 1) ;配列番号： 473(VL CDR2) ;配列番号： 474(VL CDR3)

この抗体と肝癌、肺癌、及び卵巣癌との関連性が実験的に確認された。即ち、この抗体を用いた細胞株染色では、肺腺癌細胞株 NCI-H1373、肺扁平上皮癌 EBC1で強陽性 (MFI=20倍以上)であり、肝癌細胞株 HLF、卵巣腺癌細胞株 SKOv3、肺腺癌細胞株 PC14で弱陽性 (MFI=3倍以上)であった。また、この抗体を用いた免疫染色では肺腺癌臨床検体において癌特異的染色像が得られ、肺扁平上皮癌において癌部弱陽性の染色像が得られた。

[0133] 11. EpCAMに対する抗体

067-153抗体配列番号： 475(VH) ;配列番号： 476(VH CDR1) ;配列番号： 477(V H CDR2) ;配列番号： 478(VH CDR3) ;配列番号： 479(VL) ;配列番号： 480(VL CDR 1) ;配列番号： 481(VL CDR2) ;配列番号： 482(VL CDR3)

この抗体と肝癌、肺癌、卵巣癌、胃癌、及び大腸癌との関連性が実験的に確認された。即ち、この抗体を用いた細胞株染色では、肺腺癌細胞株 NCI-H1373、肺扁平上皮癌細胞株 LK-2で強陽性 (MFI=20倍以上)であり、肺扁平上皮癌 EBC1、肺腺癌細胞株 PC14で陽性 (MFI=10倍以上)であり、卵巣腺癌細胞株 SKOv3で弱陽性 (MFI =3倍以上)であった。また、この抗体を用いた免疫染色では大腸癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、胃癌の各臨床検体において極めて良好な癌特異的染色像が得られ、一部の肝細胞癌臨床検体において癌部弱陽性の染色像が得られた。

[0134] 12. HGFRに対する抗体

複数の抗体クローンが取得された。その中にはアミノ酸配列が同一のものも含まれていた。最終的に 87種の抗体クローンが同定された。配列を詳細に解析したのは下記 3種の抗体クローンである。

067-126抗体配列番号： 651(VH) ;配列番号： 652(VH CDR1) ;配列番号： 653(V H CDR2) ;配列番号： 654(VH CDR3) ;配列番号： 655(VL) ;配列番号： 656(VL CDR 1) ;配列番号： 657(VL CDR2) ;配列番号： 658(VL CDR3)

067-133抗体配列番号： 659(VH) ;配列番号： 660(VH CDR1) ;配列番号： 661(V H CDR2) ;配列番号： 662(VH CDR3) ;配列番号： 663(VL) ;配列番号： 664(VL CDR 1)；配列番号： 665(VL CDR2)；配列番号： 666(VL CDR3) 067-287抗体配列番号： 667(VH)；配列番号： 668(VH CDR1)；配列番号： 669(V H CDR2) ;配列番号： 670(VH CDR3) ;配列番号： 671(VL) ;配列番号： 672(VL CDR 1)；配列番号： 673(VL CDR2)；配列番号： 674(VL CDR3)

これら抗体と肺癌、肝癌、卵巣癌、大腸癌、及び胃癌との関連性が実験的に確認された。即ち、これらの抗体を用いた細胞株染色では、肺扁平上皮癌 EBC1で強陽性（ MFI=20倍以上)であり、肺胞癌 NCI-H1373で陽性 (MFI=10倍以上)であり、類表皮癌細胞株 A431、卵巣腺癌細胞株 SKOv3、肺腺癌細胞株 PC14、肝細胞癌 HLFで弱陽性 (MFI=3倍以上)であった。また、これらの抗体を用いた免疫染色では、一部の肺扁平上皮癌臨床検体において癌部弱陽性を認めた。

[0135] 13. LARに対する抗体

複数の抗体クローンが取得された。その中にはアミノ酸配列が同一のものも含まれて、た。配列を詳細に解析したのは下記 5種の抗体クローンである。

064- 044抗体配列番号： 944(VH)；配列番号： 945(VL)

065- 030抗体配列番号： 946(VH)；配列番号： 947(VL)

065- 358抗体配列番号： 948(VH)；配列番号： 949(VL)

066- 019抗体配列番号： 950(VH) ;配列番号： 951(VL)

079-085抗体配列番号： 952(VH)；配列番号： 953(VL)

これら抗体を用いた免疫染色では、一部の肺癌臨床検体において癌部に陽性を認めた。

[0136] 14. BCAMに対する抗体

067- 024抗体配列番号： 954(VH)；配列番号： 955(VL)

この抗体を用いた免疫染色では、一部の肺癌、肝臓がん、腎臓がん臨床検体において癌部に陽性を認めた。

[0137] この局面の第 1の形態は、 HER1に対する特異的結合性を有する単離された抗体を提供する。この形態の抗体は、以下の (1)〜(3)からなる群より選択される配列番号の組合せ (重鎖可変領域 CDR3のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR3 のアミノ酸配列を示す配列番号)で規定される重鎖可変領域 CDR3と軽鎖可変領域 C DR3を備える。好ましくは以下の (4)〜(6)力なる群より選択される配列番号の組合せ (重鎖可変領域 CDR2のアミノ酸配列を示す配列番号、重鎖可変領域 CDR3のァミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR2のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR3のアミノ酸配列を示す配列番号)で規定される、重鎖可変領域 CDR2 及び CDR3と軽鎖可変領域 CDR2及び CDR3を備える。更に好ましくは以下の )〜 (9) 及び (13)〜(18)力なる群より選択される配列番号の組合せ (重鎖可変領域 CDR1のアミノ酸配列を示す配列番号、重鎖可変領域 CDR2のアミノ酸配列を示す配列番号、重鎖可変領域 CDR3のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR1のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR2のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR3のアミノ酸配列を示す配列番号)で規定される、重鎖可変領域 CDR1〜 CDR3と軽鎖可変領域 CDR1〜CDR3を備える。最も好ましくは以下の (10)〜(12)及び ( 19)〜(24)力なる群より選択される配列番号の組合せ (重鎖可変領域のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す配列番号)で規定される、重鎖可変領域と軽鎖可変領域を備える。

(CDR3の組合せ）

(1)配列番号: 4、配列番号: 8

(2)配列番号： 12、配列番号： 16

(3)配列番号： 20、配列番号： 24

[0138] (CDR2と CDR3の組合せ）

[0139] (CDR1〜CDR3の組合せ）

(7)配列番号： 2、配列番号： 3、配列番号： 4、配列番号： 6配列番号： 7、配列番号： 8

(重鎖可変領域と軽鎖可変領域の組合せ）

(10)配列番号： 1、配列番号： 5

(11)配列番号： 9、配列番号： 13

(12)配列番号： 17、配列番号： 21

(19)配列番号： 483(VH)、配列番号： 487(VL)

(20)配列番号： 491(VH)、配列番号： 495(VL)

(21)配列番号： 499(VH)、配列番号： 503(VL)

(22)配列番号： 507(VH)、配列番号： 511(VL)

(23)配列番号： 515(VH)、配列番号： 519(VL) (24)配列番号： 523(VH)、配列番号： 527(VL)

[0141] 尚、（1)、（4)、（7)、（10)は 048- 006抗体に対応し、（2)、（5)、（8)、（11)は 057- 091抗体に対応し、（3)、（6)、（9)、（12)は 059- 152抗体に対応し、（13)、（19)は 048- 040抗体に対応し、（14)、（20)は 054- 101抗体に対応し、（15)、（21)は 055- 147抗体に対応し、（16)、 (22) は 059-173抗体に対応し、（17)、（23)は 067-149抗体に対応し、（18)、（24)は 067-176抗体に対応する。従って本発明の抗体では HER1に対する高い特異性を期待できる。

[0142] この局面の第 2の形態は、 HER2に対する特異的結合性を有する単離された抗体を提供する。この形態の抗体は、以下の (1)に示す配列番号の組合せ (重鎖可変領域 C DR3のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR3のアミノ酸配列を示す配列番号)で規定される重鎖可変領域 CDR3と軽鎖可変領域 CDR3を備える。好ましくは以下の (2)に示す配列番号の組合せ (重鎖可変領域 CDR2のアミノ酸配列を示す配列番号、重鎖可変領域 CDR3のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR2のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR3のアミノ酸配列を示す配列番号）で規定される、重鎖可変領域 CDR2及び CDR3と軽鎖可変領域 CDR2及び CDR3を備える。更に好ましくは以下の (3)及び (5)〜(19)力なる群より選択される配列番号の組合せ (重鎖可変領域 CDR1のアミノ酸配列を示す配列番号、重鎖可変領域 CDR2のアミノ酸配列を示す配列番号、重鎖可変領域 CDR3のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR1のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR2のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR3のアミノ酸配列を示す配列番号)で規定される、重鎖可変領域 CDR1〜CDR3と軽鎖可変領域 CDR1〜CDR3を備える。最も好ましくは以下の (4)及び (20)〜(34)力なる群より選択される配列番号の組合せ (重鎖可変領域のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す配列番号)で規定される、重鎖可変領域と軽鎖可変領域を備える。

(CDR3の組合せ）

(1)配列番号： 28、配列番号： 32

[0143] (CDR2と CDR3の組合せ）

[0144] (CDR1〜CDR3の組合せ） (3)配列番号： 26、配列番号： 27、配列番号： 28、配列番号： 30、配列番号： 31、配列番号： 32

(5)配列番号： 532(VH CDR1)、配列番号： 533(VH CDR2)、配列番号： 534(VH CD R3)、配列番号： 536(VL CDR1)、配列番号： 537(VL CDR2)、配列番号： 538(VL C DR3)

(6)配列番号： 540(VH CDR1)、配列番号： 541(VH CDR2)、配列番号： 542(VH CD R3)、配列番号： 544(VL CDR1)、配列番号： 545(VL CDR2)、配列番号： 546(VL C DR3)

(重鎖可変領域と軽鎖可変領域の組合せ）

(4)配列番号： 25、配列番号： 29

(20)配列番号： 531(VH)、配列番号： 535(VL)

(21)配列番号： 539(VH)、配列番号： 543(VL)

(22)配列番号： 547(VH)、配列番号： 551(VL)

(23)配列番号： 555(VH)、配列番号： 559(VL)

(24)配列番号： 563(VH)、配列番号： 567(VL)

(25)配列番号： 571(VH)、配列番号： 575(VL)

(26)配列番号： 579(VH)、配列番号： 583(VL) (27)配列番号: : 587(VH) 配列番号: : 591(VL)

(28)配列番号: : 595(VH) 配列番号: : 599(VL)

(29)配列番号: : 603(VH) 配列番号: : 607(VL)

(30)配列番号: : 611(VH) 配列番号: : 615(VL)

(31)配列番号: : 619(VH) 配列番号: : 623(VL)

(32)配列番号: : 627(VH) 配列番号: : 631(VL)

(33)配列番号: : 635(VH) 配列番号: : 639(VL)

(34)配列番号: : 643(VH) 配列番号: : 647(VL)

[0146] 尚、（1)〜(4)は 015-126抗体に対応し、（5)、（20)は 015-044抗体に対応し、（6)、 (21) は 015-102抗体に対応し、（7)、（22)は 015-136抗体に対応し、（8)、（23)は 015-143抗体に対応し、（9)、（24)は 015-209抗体に対応し、（10)、（25)は 039-016抗体に対応し、 (11 ), (26)は 053-216抗体に対応し、（12)、（27)は 075-024抗体に対応し、（13)、（28)は 075 -110抗体に対応し、（14)、（29)は 086-032抗体に対応し、（15)、（30)は 086-035抗体に対応し、（16)、（31)は 086- 036抗体に対応し、（17)、（32)は 086- 061抗体に対応し、 (18) （33)は 086-138抗体に対応し、（19)、（34)は 086-182抗体に対応する。従って本発明の抗体では HER2に対する高い特異性を期待できる。

[0147] この局面の第 3の形態は、 CD46抗原に対する特異的結合性を有する単離された抗体を提供する。この形態の抗体は、以下の (1)〜 )力なる群より選択される配列番号の組合せ (重鎖可変領域 CDR3のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 C DR3のアミノ酸配列を示す配列番号)で規定される重鎖可変領域 CDR3と軽鎖可変領域 CDR3を備える。好ましくは以下の (8)〜(14)力なる群より選択される配列番号の組合せ (重鎖可変領域 CDR2のアミノ酸配列を示す配列番号、重鎖可変領域 CDR3のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR2のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR3のアミノ酸配列を示す配列番号)で規定される、重鎖可変領域 C DR2及び CDR3と軽鎖可変領域 CDR2及び CDR3を備える。更に好ましくは以下の (15) 〜(21)からなる群より選択される配列番号の組合せ (重鎖可変領域 CDR1のアミノ酸配列を示す配列番号、重鎖可変領域 CDR2のアミノ酸配列を示す配列番号、重鎖可変領域 CDR3のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR1のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR2のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR3のアミノ酸配列を示す配列番号)で規定される、重鎖可変領域 CDR1〜CDR3と軽鎖可変領域 CDR1〜CDR3を備える。最も好ましくは以下の (22)〜(28)力もなる群より選択される配列番号の組合せ (重鎖可変領域のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す配列番号)で規定される、重鎖可変領域と軽鎖可変領域を備える。

(CDR3の組合せ）

(1)配列番号: :36、配列番号: :40

(2)配列番号: :44、配列番号: :48

(3)配列番号: :52、配列番号: :56

(4)配列番号: :60、配列番号: :64

(5)配列番号: :68、配列番号: :72

(6)配列番号: :76、配列番号: :80

(7)配列番号: :84、配列番号: :88

(CDR2と CDR3の組合せ）

(9)配列番号: 43、配列番号: 44、配列番号: 47、配列番号: 48

(10)配列番号: 51、配列番号: :52、配列番号: :55、配列番号: :56

(11)配列番号: :59、配列番号: :60、配列番号: :63、配列番号: :64

(12)配列番号: 67、配列番号: :68、配列番号: :71、配列番号: :72

(13)配列番号: 75、配列番号: :76、配列番号: :79、配列番号: :80

(14)配列番号: :83、配列番号: :84、配列番号: :87、配列番号: :88

(CDR1〜CDR3の組合せ）

(15)配列番号： 34、配列番号： 35、配列番号： 36、配列番号： 38、配列番号： 39、配列番号: 40

(16)配列番号: 42、配列番号: 43、配列番号: 44、配列番号: 46、配列番号: 47、配列番号: 48

(17)配列番号： 50、配列番号： 51、配列番号： 52、配列番号： 54、配列番号： 55、配列番号： 56

(18)配列番号： 58、配列番号： 59、配列番号： 60、配列番号： 62、配列番号： 63、配列番号: 64

(19)配列番号： 66、配列番号： 67、配列番号： 68、配列番号： 70、配列番号： 71、配列番号： 72

(20)配列番号： 74、配列番号： 75、配列番号： 76、配列番号： 78、配列番号： 79、配列番号: 80

(21)配列番号： 82、配列番号： 83、配列番号： 84、配列番号： 86、配列番号： 87、配列番号: 88

(22)配列番号： 756(VH CDR1)、配列番号： 757(VH CDR2)、配列番号： 758(VH C DR3)、配列番号： 760(VL CDR1)、配列番号： 761(VL CDR2)、配列番号： 762(VL CDR3)

[0150] (重鎖可変領域と軽鎖可変領域の組合せ）

(23)配列番号 33、配列番号: : 37

(24)配列番号 41、配列番号: :45

(25)配列番号 49、配列番号: : 53

(26)配列番号 57、配列番号: : 61

(27)配列番号 65、配列番号: : 69

(28)配列番号 73、配列番号: : 77

(29)配列番号 81、配列番号: : 85

(30)配列番号： 755(VH)、配列番号： 759(VL)

[0151] 尚、（1)、（8)、（15)、（23)は 035- 224抗体に対応し、（2)、（9)、（16)、（24)は 045- 011抗体に対応し、（3)、（10)、（17)、（25)は 051- 144抗体に対応し、（4)、（11)、（18)、（26)は 052- 0 53抗体に対応し、（5)、（12)、（19)、（27)は 052- 073抗体に対応し、（6)、（13)、（20)、 (28) は 053-049抗体に対応し、（7)、（14)、（21)、（29)は 3172-120抗体に対応し、（22)、 (30) は 066-069抗体に対応する。従って本発明の抗体では CD46抗原に対する高ヽ特異性を期待できる。

[0152] この局面の第 4の形態は、 ITGA3に対する特異的結合性を有する単離された抗体を提供する。この形態の抗体は、以下の (1)に示す配列番号の組合せ (重鎖可変領域 CDR3のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR3のアミノ酸配列を示す配列番号)で規定される重鎖可変領域 CDR3と軽鎖可変領域 CDR3を備える。好ましくは以下の (2)に示す配列番号の組合せ (重鎖可変領域 CDR2のアミノ酸配列を示す配列番号、重鎖可変領域 CDR3のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR 2のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR3のアミノ酸配列を示す配列番号)で規定される、重鎖可変領域 CDR2及び CDR3と軽鎖可変領域 CDR2及び CDR3 を備える。更に好ましくは以下の (3)及び (5)〜(17)力なる群より選択される配列番号の組合せ (重鎖可変領域 CDR1のアミノ酸配列を示す配列番号、重鎖可変領域 CDR 2のアミノ酸配列を示す配列番号、重鎖可変領域 CDR3のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR1のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR2のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR3のアミノ酸配列を示す配列番号)で規定される、重鎖可変領域 CDR1〜CDR3と軽鎖可変領域 CDR1〜CDR3を備える。最も好ましくは以下の (4)及び (18)〜(30)力なる群より選択される配列番号の組合せ (重鎖可変領域のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す配列番号)で規定される、重鎖可変領域と軽鎖可変領域を備える。

(CDR3の組合せ）

(1)配列番号： 92、配列番号： 96

[0153] (CDR2と CDR3の組合せ）

[0154] (CDR1〜CDR3の組合せ）

(3)配列番号： 90、配列番号： 91、配列番号： 92、配列番号： 94、配列番号： 95、配列番号： 96

(15)配列番号： 764(VH CDR1)、配列番号： 765(VH CDR2)、配列番号： 766(VH C DR3)、配列番号： 768(VL CDR1)、配列番号： 769(VL CDR2)、配列番号： 770(VL CDR3) (16)配列番号： 772(VH CDR1)、配列番号： 773(VH CDR2)、配列番号： 774(VH C DR3)、配列番号： 776(VL CDR1)、配列番号： 777(VL CDR2)、配列番号： 778(VL CDR3)

(重鎖可変領域と軽鎖可変領域の組合せ）

(4)配列番号 : 89、配列番号： 93

(17)配列番号: : 675(VH) 配列番号: : 679(VL)

(18)配列番号: : 683(VH) 配列番号: : 687(VL)

(19)配列番号: : 691(VH) 配列番号: : 695(VL)

(20)配列番号: : 699(VH) 配列番号: ： 703(VL)

(21)配列番号: ： 707(VH) 配列番号: : 711(VL)

(22)配列番号: : 715(VH) 配列番号: : 719(VL)

(23)配列番号: ： 723(VH) 配列番号: ： 727(VL)

(24)配列番号: : 731(VH) 配列番号: : 735(VL)

(25)配列番号: : 739(VH) 配列番号: ： 743(VL)

(26)配列番号: ： 747(VH) 配列番号: : 751(VL)

(27)配列番号: : 763(VH) 配列番号: : 767(VL)

(28)配列番号: : 771(VH) 配列番号: ： 775(VL)

[0156] 尚、（1)〜(4)は 015-003抗体に対応し、（5)、（17)は 064-002抗体に対応し、（6)、 (18) は 064-006抗体に対応し、（7)、（19)は 064-012a抗体に対応し、（8)、（20)は 064-012b抗体に対応し、（9)、（21)は 064-014抗体に対応し、（10)、（22)は 064-054抗体に対応し、 ( 11)、（23)は 064- 085抗体に対応し、（12)、（24)は 064- 093抗体に対応し、（13)、（25)は 0 64-116抗体に対応し、（14)、（26)は 065-183抗体に対応し、（15)、（27)は 067-142抗体に対応し、（16)、（28)は 068-007抗体に対応する。従って本発明の抗体では ITGA3に対する高!、特異性を期待できる。

[0157] この局面の第 5の形態は、 ICAM1に対する特異的結合性を有する単離された抗体を提供する。この形態の抗体は、以下の (1)〜(5)からなる群より選択される配列番号の組合せ (重鎖可変領域 CDR3のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR 3のアミノ酸配列を示す配列番号)で規定される重鎖可変領域 CDR3と軽鎖可変領域 CDR3を備える。好ましくは以下の (6)〜(10)力なる群より選択される配列番号の組合せ (重鎖可変領域 CDR2のアミノ酸配列を示す配列番号、重鎖可変領域 CDR3のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR2のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR3のアミノ酸配列を示す配列番号)で規定される、重鎖可変領域 CD R2及び CDR3と軽鎖可変領域 CDR2及び CDR3を備える。更に好ましくは以下の (11) 〜(15)力なる群より選択される配列番号の組合せ (重鎖可変領域 CDR1のアミノ酸配列を示す配列番号、重鎖可変領域 CDR2のアミノ酸配列を示す配列番号、重鎖可変領域 CDR3のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR1のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR2のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR3のアミノ酸配列を示す配列番号)で規定される、重鎖可変領域 CDR1〜CDR3と軽鎖可変領域 CDR1〜CDR3を備える。最も好ましくは以下の (16)〜(20)力もなる群より選択される配列番号の組合せ (重鎖可変領域のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す配列番号)で規定される、重鎖可変領域と軽鎖可変領域を備える。

(CDR3の組合せ）

(1)配列番号: 100、配列番号: 104

(2)配列番号: 108、配列番号: 112

(3)配列番号: 116、配列番号: 120

(4)配列番号: 124、配列番号: 128

(5)配列番号: 132、配列番号: 136

[0158] (CDR2と CDR3の組合せ）

[0159] (CDR1〜CDR3の組合せ）

[0160] (重鎖可変領域と軽鎖可変領域の組合せ）

(16)配列番号： 97、配列番号： 101

(17)配列番号： 105、配列番号： 109

(18)配列番号： 113、配列番号： 117

(19)配列番号： 121、配列番号： 125

(20)配列番号： 129、配列番号： 133

[0161] 尚、（1)、（6)、（11)、（16)は 052- 033抗体に対応し、（2)、（7)、（12)、（17)は 053- 042抗体に対応し、（3)、（8)、（13)、（18)は 053— 051抗体に対応し、（4)、（9)、（14)、（19)は 053— 059 抗体に対応し、（5)、（10)、（15)、（20)は 053-085抗体に対応する。従って本発明の抗体では ICAM1に対する高!、特異性を期待できる。

[0162] この局面の第 6の形態は、 ALCAMに対する特異的結合性を有する単離された抗体を提供する。この形態の抗体は、以下の (1)〜(5)からなる群より選択される配列番号の組合せ (重鎖可変領域 CDR3のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR 3のアミノ酸配列を示す配列番号)で規定される重鎖可変領域 CDR3と軽鎖可変領域 CDR3を備える。好ましくは以下の (6)〜(10)力なる群より選択される配列番号の組合せ (重鎖可変領域 CDR2のアミノ酸配列を示す配列番号、重鎖可変領域 CDR3のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR2のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR3のアミノ酸配列を示す配列番号)で規定される、重鎖可変領域 C DR2及び CDR3と軽鎖可変領域 CDR2及び CDR3を備える。更に好ましくは以下の (11) 〜(15)及び (21)〜(28)力なる群より選択される配列番号の組合せ (重鎖可変領域 C DRlのアミノ酸配列を示す配列番号、重鎖可変領域 CDR2のアミノ酸配列を示す配列番号、重鎖可変領域 CDR3のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR1のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR2のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR3のアミノ酸配列を示す配列番号)で規定される、重鎖可変領域 C DR1〜CDR3と軽鎖可変領域 CDR1〜CDR3を備える。最も好ましくは以下の (16)〜(2 0)及び (29)〜(36)力なる群より選択される配列番号の組合せ (重鎖可変領域のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す配列番号)で規定される、重鎖可変領域と軽鎖可変領域を備える。

(CDR3の組合せ）

(1)配列番号: 140、配列番号: 144

(2)配列番号: 148、配列番号: 152

(3)配列番号: 156、配列番号: 160

(4)配列番号: 164、配列番号: 168

(5)配列番号: 172、配列番号: 176

[0163] (CDR2と CDR3の組合せ）

(7)配列番号： 147、配列番号： 148、配列番号： 151、配列番号： 152

(8)配列番号： 155、配列番号： 156、配列番号： 159、配列番号： 160

[0164] (CDR1〜CDR3の組合せ）

(13)配列番号： 154、配列番号： 155、配列番号： 156、配列番号： 158、配列番号： 1 59、配列番号： 160 (14)配列番号： 162、配列番号： 163、配列番号： 164、配列番号： 166、配列番号： 1 67、配列番号： 168

(28)配列番号： 836(VH CDR1)、配列番号： 837(VH CDR2)、配列番号： 838(VH C DR3)、配列番号： 840(VL CDR1)、配列番号： 841(VL CDR2)、配列番号： 842(VL CDR3) [0165] (重鎖可変領域と軽鎖可変領域の組合せ）

(16)配列番号： 137、配列番号： 141

(17)配列番号： 145、配列番号： 149

(18)配列番号： 153、配列番号： 157

(19)配列番号： 161、配列番号： 165

(20)配列番号： 169、配列番号： 173

(29)配列番号： 779(VH)、配列番号： 783(VL)

(30)配列番号： 787(VH)、配列番号： 791(VL)

(31)配列番号： 795(VH)、配列番号： 799(VL)

(32)配列番号： 803(VH)、配列番号： 807(VL)

(33)配列番号： 811(VH)、配列番号： 815(VL)

(34)配列番号： 819(VH)、配列番号： 823(VL)

(35)配列番号： 827(VH)、配列番号： 831(VL)

(36)配列番号： 835(VH)、配列番号： 839(VL)

[0166] 尚、（1)、（6)、（11)、（16)は 035- 234抗体に対応し、（2)、（7)、（12)、（17)は 040- 107抗体に対応し、（3)、（8)、（13)、 (18)は 041-118抗体に対応し、 (4)、（9)、（14)、 (19)は 066- 174 抗体に対応し、（5)、（10)、（15)、（20)は 083- 040抗体に対応し、（21)、（29)は 029- 143抗体に対応し、（22)、（30)は 045-134抗体に対応し、（23)、（31)は 062-101抗体に対応し、 (24)、（32)は 062-109抗体に対応し、（25)、（33)は 084-103抗体に対応し、（26)、（34)は 0 52-274抗体に対応し、（27)、（35)は 029-067抗体に対応し、（28)、（36)は 083-131抗体に対応する。従って本発明の抗体では ALCAMに対する高ヽ特異性を期待できる。

[0167] この局面の第 7の形態は、 CD147抗原に対する特異的結合性を有する単離された抗体を提供する。この形態の抗体は、以下の (1)に示す配列番号の組合せ (重鎖可変領域 CDR3のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR3のアミノ酸配列を示す配列番号)で規定される重鎖可変領域 CDR3と軽鎖可変領域 CDR3を備える。好ましくは以下の (2)に示す配列番号の組合せ (重鎖可変領域 CDR2のアミノ酸配列を示す配列番号、重鎖可変領域 CDR3のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR2のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR3のアミノ酸配列を示す配列番号)で規定される、重鎖可変領域 CDR2及び CDR3と軽鎖可変領域 CDR2及び C DR3を備える。更に好ましくは以下の (3)に示す配列番号の組合せ (重鎖可変領域 C DR1のアミノ酸配列を示す配列番号、重鎖可変領域 CDR2のアミノ酸配列を示す配列番号、重鎖可変領域 CDR3のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR1のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR2のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR3のアミノ酸配列を示す配列番号)で規定される、重鎖可変領域 C DR1〜CDR3と軽鎖可変領域 CDR1〜CDR3を備える。最も好ましくは以下の (4)に示す配列番号の組合せ (重鎖可変領域のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す配列番号)で規定される、重鎖可変領域と軽鎖可変領域を備える。

(CDR3の組合せ）

(1)配列番号： 180、配列番号： 184

[0168] (CDR2と CDR3の組合せ）

[0169] (CDR1〜CDR3の組合せ）

[0170] (重鎖可変領域と軽鎖可変領域の組合せ）

(4)配列番号： 177、配列番号： 181

[0171] 尚、（1)〜(4)は 059-053抗体に対応する。従って本発明の抗体では CD147抗原に対する高、特異性を期待できる。

[0172] この局面の第 8の形態は、 ClqRに対する特異的結合性を有する単離された抗体を提供する。この形態の抗体は、以下の (1)に示す配列番号の組合せ (重鎖可変領域 C DR1のアミノ酸配列を示す配列番号、重鎖可変領域 CDR2のアミノ酸配列を示す配列番号、重鎖可変領域 CDR3のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR1のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR2のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR3のアミノ酸配列を示す配列番号)で規定される、重鎖可変領域 C DR1〜CDR3と軽鎖可変領域 CDR1〜CDR3を備える。好ましくは以下の (2)に示す配列番号の組合せ (重鎖可変領域のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域のァミノ酸配列を示す配列番号)で規定される、重鎖可変領域と軽鎖可変領域を備える。 (CDR1〜CDR3の組合せ）

[0173] (重鎖可変領域と軽鎖可変領域の組合せ）

(2)配列番号： 451(VH)、配列番号： 455(VL)

[0174] 尚、（1)、（2)は 070-016抗体に対応する。従って本発明の抗体では ClqRに対する高い特異性を期待できる。

[0175] この局面の第 9の形態は、 CD44に対する特異的結合性を有する単離された抗体を提供する。この形態の抗体は、以下の (1)に示す配列番号の組合せ (重鎖可変領域 C DR1のアミノ酸配列を示す配列番号、重鎖可変領域 CDR2のアミノ酸配列を示す配列番号、重鎖可変領域 CDR3のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR1のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR2のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR3のアミノ酸配列を示す配列番号)で規定される、重鎖可変領域 C DR1〜CDR3と軽鎖可変領域 CDR1〜CDR3を備える。好ましくは以下の (2)に示す配列番号の組合せ (重鎖可変領域のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域のァミノ酸配列を示す配列番号)で規定される、重鎖可変領域と軽鎖可変領域を備える。 (CDR1〜CDR3の組合せ）

[0176] (重鎖可変領域と軽鎖可変領域の組合せ）

(2)配列番号： 459(VH)、配列番号： 463(VL)

[0177] 尚、（1)、（2)は 064-003抗体に対応する。従って本発明の抗体では CD44に対する高い特異性を期待できる。

[0178] この局面の第 10の形態は、 CD73に対する特異的結合性を有する単離された抗体を提供する。この形態の抗体は、以下の (1)に示す配列番号の組合せ (重鎖可変領域 CDR1のアミノ酸配列を示す配列番号、重鎖可変領域 CDR2のアミノ酸配列を示す配列番号、重鎖可変領域 CDR3のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR 1のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR2のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR3のアミノ酸配列を示す配列番号)で規定される、重鎖可変領域 CDR1〜CDR3と軽鎖可変領域 CDR1〜CDR3を備える。好ましくは以下の (2)に示す配列番号の組合せ (重鎖可変領域のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す配列番号)で規定される、重鎖可変領域と軽鎖可変領域を備える。

(CDR1〜CDR3の組合せ）

[0179] (重鎖可変領域と軽鎖可変領域の組合せ）

(2)配列番号： 467(VH)、配列番号： 471(VL)

[0180] 尚、（1)、（2)は 067-213抗体に対応する。従って本発明の抗体では CD73に対する高い特異性を期待できる。

[0181] この局面の第 11の形態は、 EpCAMに対する特異的結合性を有する単離された抗体を提供する。この形態の抗体は、以下の (1)に示す配列番号の組合せ (重鎖可変領域 CDR1のアミノ酸配列を示す配列番号、重鎖可変領域 CDR2のアミノ酸配列を示す配列番号、重鎖可変領域 CDR3のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 C DR1のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR2のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR3のアミノ酸配列を示す配列番号)で規定される、重鎖可変領域 CDR1〜CDR3と軽鎖可変領域 CDR1〜CDR3を備える。好ましくは以下の (2)に示す配列番号の組合せ (重鎖可変領域のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す配列番号)で規定される、重鎖可変領域と軽鎖可変領域を備える。

(CDR1〜CDR3の組合せ） (1)配列番号： 476(VH CDR1)、配列番号： 477(VH CDR2)、配列番号： 478(VH CD R3)、配列番号： 480(VL CDR1)、配列番号： 481(VL CDR2)、配列番号： 482(VL C DR3)

[0182] (重鎖可変領域と軽鎖可変領域の組合せ）

(2)配列番号: 475(VH)、

配列番号： 479(VL)

[0183] 尚、（1)、（2)は 067-153抗体に対応する。従って本発明の抗体では EpCAMに対する高い特異性を期待できる。

[0184] この局面の第 12の形態は、 HGFRに対する特異的結合性を有する単離された抗体を提供する。この形態の抗体は、以下の (1)〜(3)からなる群より選択される配列番号の組合せ (重鎖可変領域 CDR1のアミノ酸配列を示す配列番号、重鎖可変領域 CDR 2のアミノ酸配列を示す配列番号、重鎖可変領域 CDR3のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR1のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR2のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR3のアミノ酸配列を示す配列番号)で規定される、重鎖可変領域 CDR1〜CDR3と軽鎖可変領域 CDR1〜CDR3を備える。好ましくは以下の (4)〜(6)力なる群より選択される配列番号の組合せ (重鎖可変領域のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す配列番号）で規定される、重鎖可変領域と軽鎖可変領域を備える。

(CDR1〜CDR3の組合せ）

(1)配列番号： 652(VH CDR1)、配列番号： 653(VH CDR2)、配列番号： 654(VH CD R3)、配列番号： 656(VL CDR1)、配列番号： 657(VL CDR2)、配列番号： 658(VL C DR3)

(3)配列番号： 668(VH CDR1)、配列番号： 669(VH CDR2)、配列番号： 670(VH CD R3)、配列番号： 672(VL CDR1)、配列番号： 673(VL CDR2)、配列番号： 674(VL C DR3) [0185] (重鎖可変領域と軽鎖可変領域の組合せ)

(4)配列番号 651(VH)、配列番号 655(VL)

(5)配列番号 659(VH)、配列番号 663(VL)

(6)配列番号 667(VH)、配列番号 671(VL)

[0186] 尚、（1)、（4)は 067- 126抗体に対応し、（2)、（5)は 067- 133抗体に対応し、（3)、（6)は 06 7-287抗体に対応する。従って本発明の抗体では HGFRに対する高、特異性を期待できる。

[0187] この局面の第 13の形態は、 LARに対する特異的結合性を有する単離された抗体を提供する。この形態の抗体は、以下の (1)〜(5)からなる群より選択される配列番号の組合せ (重鎖可変領域のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す配列番号)で規定される、重鎖可変領域と軽鎖可変領域を備える。

[0188] (重鎖可変領域と軽鎖可変領域の組合せ）

(1)配列番号 944(VH)、配列番号 945(VL)

(2)配列番号 946(VH)、配列番号 947(VL)

(3)配列番号 948(VH)、配列番号 949(VL)

(4)配列番号 950(VH)、配列番号 951(VL)

(5)配列番号 952(VH)、配列番号 953(VL)

[0189] 尚、（1)は 064-044抗体に対応し、（2)は 065-030抗体に対応し、（3)は 065-358抗体に対応し、（4)は 066-019抗体に対応し、（5)は 079-085抗体に対応する。従って本発明の抗体では LARに対する高い特異性を期待できる。

[0190] この局面の第 14の形態は、 BCAMに対する特異的結合性を有する単離された抗体を提供する。この形態の抗体は、以下の (1)の配列番号の組合せ (重鎖可変領域のァミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す配列番号)で規定される、重鎖可変領域と軽鎖可変領域を備える。

[0191] (重鎖可変領域と軽鎖可変領域の組合せ）

(1)配列番号： 954(VH)、配列番号： 955(VL)

[0192] 尚、（1)は 067-024抗体に対応する。従って本発明の抗体では BCAMに対する高い特異性を期待できる。 [0193] 本発明の抗体の可変領域においてフレームワーク領域 (FR領域）の配列は、対応する抗原に対する特異的結合性に実質的な影響のない限り、特に限定されない。例えば、本発明の抗体をヒト化抗体として構築する場合には、公知のヒト抗体の FR領域を用いることができる。また、検出用の試薬として使用される抗体又はヒト以外の動物種への適用に使用される抗体を構築する場合など、ヒト抗体 FR領域を使用しなくとも期待される効果が奏される場合ゃヒト抗体 FR領域を使用することがむしろ適当でない場合がある。このような場合には、ヒト以外の動物種 (例えばマウスゃラット）の FR領域を用いることができる。

[0194] 本発明の抗体は一態様において、可変領域に加えて定常領域を含む (例えば IgG 型抗体の場合など)。当該態様における定常領域の配列は特に限定されない。例えば、後述のように本発明の抗体をヒト化抗体として構築する場合には、公知のヒト抗体の定常領域を用いることができる。また、上記 FR領域と同様に、ヒト以外の動物種（例えばマウスゃラット）の定常領域を用いることもできる。

[0195] 本発明の抗体の一形態はヒト化抗体である。ここでの「ヒト化抗体」とは、ヒトの抗体に構造を類似させた抗体のことをいい、抗体の定常領域のみをヒト抗体のものに置換したヒト型キメラ抗体、及び定常領域及び可変領域に存在する CDR (相補性決定領域)以外の部分をヒト抗体のものに置換したヒト型 CDR移植 (CDR-grafted)抗体 (P.T. Johons et al., Nature 321,522(1986))を含む。ヒト型 CDR移植抗体の抗原結合活性を高めるため、マウス抗体と相同性の高いヒト抗体 FRを選択する方法、相同性の高いヒト型化抗体を作製する方法、ヒト抗体にマウス CDRを移植した後さらに FR領域のアミノ酸を置換する方法の改良技術もすでに開発され (米国特許第 5585089号、米国特許第 5693761号、米国特許第 5693762号、米国特許第 6180370号、欧州特許第 4512 16号、欧州特許第 682040号、特許第 2828340号などを参照）、本発明のヒト型抗体の作製に利用することもできる。

ヒト型キメラ抗体は例えば、上記の H鎖可変領域の構造及び Z又は L鎖可変領域の構造を有する抗体の定常領域をヒト抗体の定常領域に置換することにより作製することができる。ヒト抗体の定常領域としては公知のものを採用することができる。以下に、ヒト型キメラ抗体の作製方法の一例を示す。まず、特定の抗原 (例えば、今回判明した特定癌発現性抗原の HER1、 HER2、 CD4 6、 ITGA3、 ICAM1、 ALCAM、又は CD147等）に対するマウス抗体を産生するハイブリドーマより mRNAを抽出し、常法に従って cDNAを合成する。合成した cDNAをべクタ一に組み込み cDNAライブラリーを構築する。この cDNAライブラリーから、 H鎖遺伝子フラグメント及び L鎖遺伝子フラグメントをプローブとして用いることにより、 H鎖遺伝子及び L鎖遺伝子を含有するベクターを選択する。選択されたベクターの挿入配列のシークェンシングを行うことにより、 H鎖可変領域及び L鎖可変領域の遺伝子の配列が決定される。このようにして得られた配列データを基に H鎖可変領域をコードする D NAをィ匕学合成、生化学的切断 Z再結合等により作製する。得られた H鎖可変領域をコードする DNAを、ヒト H鎖定常領域をコードする DNAとライゲーシヨンして発現用べクターに組込むことにより H鎖発現ベクターを作製する。発現ベクターとしては例えば S V40 virus basedベクター、 EB virus basedベクター、 BPV (パピローマウィルス） based ベクターなどを用いることができる力これらに限定されるものではない。一方、同様の方法により L鎖発現ベクターを作製する。これら H鎖発現ベクター及び L鎖発現べクターにより宿主細胞を共形質転換する。宿主細胞としては CHO細胞 (チャイニーズノヽムスター卵巣 )(A.Wright& S丄. Morrison, J.Immunol.160, 3393-3402 (1998))、 SP2/0 細胞 (マウスミエローマ) (K.Motmans et al, Eur.J.Cancer Prev.5,512- 519 (1996),R.P. Junghans et al, Cancer Res.50, 1495-1502 (1990》などが好適に用いられる。また、形質転換にはリポフエクチン法 (R.W.Malone et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,6077 (19 89), P丄. Feigner et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84,7413 (1987)、エレクト口ポレーション法、リン酸カルシウム法 (F丄. Graham & A.J.van der Eb.Virology 52,456-467(1973)) 、 DEAE-Dextran法等が好適に用いられる。

形質転換体を培養した後、形質転換体の細胞内又は培養液よりヒト型キメラ抗体を分離する。抗体の分離、精製には、遠心分離、硫安分画、塩析、限外濾過、了フィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーなどの方法を適宜組み合わせて利用することができる。

一方、ヒト型 CDR移植抗体は例えば以下の方法により作製することができる。まず、上記キメラ抗体の製造方法の欄で述べた方法により、特定の抗原に対する抗体の H 鎖可変領域及び L鎖可変領域のアミノ酸配列及びそれをコードする塩基配列を決定する。併せて各 CDR領域のアミノ酸配列及び塩基配列を決定する。

具体的な CDRの塩基配列として、以下の、ずれかの組合せを用いることが好ましヽ。尚、重鎖可変領域 CDR1の塩基配列を示す配列番号、重鎖可変領域 CDR2の塩基配列を示す配列番号、重鎖可変領域 CDR3の塩基配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR1の塩基配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR2の塩基配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR3の塩基配列を示す配列番号の順で示す。

(1)配列番号 186、配列番号 187、配列番号 188、配列番号 190、配列番号 191、配列番号 192

(2)配列番号 194、配列番号 195、配列番号 196、配列番号 198、配列番号 199、配列番号 200

(3)配列番号： 202、配列番号： 203 、配列番号： 204、配列番号： 206、配列番号： 20 7、配列番号： 208

(4)配列番号： 210、配列番号： 211、配列番号： 212、配列番号： 214、配列番号： 21 5、配列番号： 126

(5)配列番号： 218、配列番号： 219、配列番号： 220、配列番号： 222、配列番号： 22 3、配列番号： 224

(6)配列番号： 226、配列番号： 227、配列番号： 228、配列番号： 230、配列番号： 23 1、配列番号： 232

(7)配列番号： 234、配列番号： 235、配列番号： 236、配列番号： 238、配列番号： 23 9、配列番号： 240

(8)配列番号： 242、配列番号： 243、配列番号： 244、配列番号： 246、配列番号： 24 7、配列番号： 248

(9)配列番号： 250、配列番号： 251、配列番号： 252、配列番号： 254、配列番号： 25 5、配列番号： 256

(10)配列番号： 258、配列番号： 259、配列番号： 260、配列番号： 262、配列番号： 2 63、配列番号： 264

(11)配列番号： 266、配列番号： 267、配列番号： 268、配列番号： 270、配列番号： 2 71、配列番号： 272

(12)配列番号： 274、配列番号： 275、配列番号： 276、配列番号： 278、配列番号： 2 79、配列番号： 280

(13)配列番号： 282、配列番号： 283、配列番号： 284、配列番号： 286、配列番号： 2 87、配列番号： 288

(14)配列番号： 290、配列番号： 291、配列番号： 292、配列番号： 294、配列番号： 2 95、配列番号： 296

(15)配列番号： 298、配列番号： 299、配列番号： 300、配列番号： 302、配列番号： 3 03、配列番号： 304

(16)配列番号： 306、配列番号： 307、配列番号： 308、配列番号： 310、配列番号： 3 11、配列番号： 312

(17)配列番号： 314、配列番号： 315、配列番号： 316、配列番号： 318、配列番号： 3 19、配列番号： 320

(18)配列番号： 322、配列番号： 323、配列番号： 324、配列番号： 326、配列番号： 3 27、配列番号： 328

(19)配列番号： 330、配列番号： 331、配列番号： 332、配列番号： 334、配列番号： 3 35、配列番号： 336

(20)配列番号： 338、配列番号： 339、配列番号： 340、配列番号： 342、配列番号： 3 43、配列番号： 344

(21)配列番号： 346、配列番号： 347、配列番号： 348、配列番号： 350、配列番号： 3 51、配列番号： 352

(22)配列番号： 354、配列番号： 355、配列番号： 356、配列番号： 358、配列番号： 3 59、配列番号： 360

(23)配列番号： 362、配列番号： 363、配列番号： 364、配列番号： 366、配列番号： 3 67、配列番号： 368

尚、これらの組合せは上から順に 048-006抗体、 057-091抗体、 059-152抗体（以上、 HER1に対する抗体）、 015-126抗体（HER2に対する抗体）、 035-224抗体、 045-01 1抗体、 051- 144抗体、 052- 053抗体、 052- 073抗体、 053- 049抗体、 3172- 120抗体（以上、 CD46に対する抗体）、 015-003抗体（ITGA3に対する抗体）、 052-033抗体、 05 3-042抗体、 053-051抗体、 053-059抗体、 053-085抗体（以上、 ICAM1に対する抗体 )、 035-234抗体、 040-107抗体、 041-118抗体、 066-174抗体、 083-040抗体（以上、 ALCAMに対する抗体）、 059-053抗体（CD 147に対する抗体）〖こおける CDR1〜CDR 3の組合せに相当する。

[0197] 次に、 CDR領域を挟んで存在する FR (フレームワーク領域)を選択する。 FRの選択には、およそ三つの方法が採用できる。 1つめの方法は、 NEWM、 REIなど既に三次元構造の明ら力となったヒト抗体フレームを用いる方法である（Riechmann L. et al., N ature 332, 323— 3Z7 (1988); Tempst, PR. et al., Protein Engineering 7, 1501—1507 ( 1994); Ellis JH. etal, J. Immunol 155, 925-937 (1995))。 2つめの方法は、目的のマウス抗体可変領域と最も高いホモロジ一を持つヒト抗体可変領域をデータベースより選択し、その FRを用いる方法である（Queen C. et al., Proc Natl Acad SciUSA 86, 10 029-10033 (1989); Rozak MJ. et al., J Biol Chem 271, 22611-22618 (1996); Shearm an CW. et al., J.Immunol 147, 4366-4373 (1991))。 3つめの方法は、ヒト抗体の FRで最も共通に用いられるアミノ酸を選択する方法である（Sato K. et al., Mol Immunol 31 , 371-381 (1994); Kobinger F. et al., Protein Engineering 6, 971—980 (1993); Kettle borough CA. et al., Protein Engineering 4, 773-783 (1991))。本発明ではこれらいずれの方法を用いることもできる。

[0198] 尚、選択されたヒト FRのアミノ酸配列を改変したアミノ酸配列であっても、最終的に得られるヒト型 CDR移植抗体力対応する抗原（HER1、 HER2、 CD46、 ITGA3、 ICAM 1、 ALCAM, CD147等）に対する特異的結合性を有する限り、 FRのアミノ酸配列として利用することができる。特に、選択されたヒト FRのアミノ酸の一部を CDRの由来となつた抗体の FRのアミノ酸に変更した場合、抗体の特性が維持される可能性が高!、。改変されるアミノ酸の数は好ましくは FR全体の 30%以下であり、更に好ましくは FR全体の 20 %以下であり、更に更に好ましくは FR全体の 10 %以下である。

次に、これらいずれかの方法により選択した FRと上記 CDRとを組み合わせることにより H鎖可変領域及び L鎖可変領域をコードする DNAを設計する。この設計を基に H 鎖可変領域をコードする DNAと L鎖可変領域をコードする DNAをィ匕学合成、生化学的切断 Z再結合等によりそれぞれ作製する。そして H鎖可変領域をコードする DNA を、ヒト免疫グロブリン H鎖定常領域をコードする DNAとともに発現ベクターに組み込み H鎖発現ベクターを構築する。同様に、 L鎖可変領域をコードする DNAを、ヒト免疫グロブリン L鎖定常領域をコードする DNAとともに発現ベクターに組み込み L鎖発現ベクターを構築する。発現ベクターとしては例えば SV40 virus basedベクター、 EB vir us basedベクター、 BPV (パピローマウイノレス） basedベクターなどを用いることができる力これらに限定されるものではない。

以上の方法で作製された H鎖発現ベクター及び L鎖発現ベクターにより宿主細胞を共形質転換する。宿主細胞としては CHO細胞 (チャイニーズノヽムスター卵巣 XA.Wrig ht& S丄. Morrison, J.Immunol.160, 3393-3402 (1998))、 SP2/0細胞 (マウスミエローマ） (K.Motmans et al., Eur.J. Cancer Prev.5,512- 519 (1996),R.P.Junghans et al., Cancer Res.50,1495-1502 (1990》などが好適に用いられる。また、形質転換にはリポフエクチン法 (R.W.Malone et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,6077 (1989), P丄. Feigner et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84,7413 (1987)、エレクト口ポレーシヨン法、リン酸カルシウム法 (F丄. Graham & A.J.van der Eb.Virology 52,456-467(1973》、 DEAE- Dextran法等が好適に用いられる。

形質転換体を培養した後、形質転換体の細胞内又は培養液よりヒト型 CDR移植抗体を分離する。抗体の分離、精製には、遠心分離、硫安分画、塩析、限外濾過、ァフィ-ティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィ一などの方法を適宜組み合わせて利用することができる。

本発明の抗体を基にして又は本発明の抗体をコードする遺伝子の配列情報を基にして抗体断片を作製することができる。抗体断片としては Fab、 Fab'、 F(ab')2、 scFv、 d sFv抗体が挙げられる。

Fabは、 IgGをシスティン存在下パパイン消化することにより得られる、 L鎖と H鎖可変領域、並びに CH1ドメイン及びヒンジ部の一部力もなる H鎖フラグメントとから構成される分子量約 5万の断片である。本発明では、上記抗体をパパイン消化することにより得ることができる。また、上記抗体の H鎖の一部及び L鎖をコードする DNAを適当なベクタ一に組み込み、当該ベクターを用いて形質転換した形質転換体より Fabを調製することちでさる。

Fab'は、後述の F(ab')2の H鎖間のジスルフイド結合を切断することにより得られる分子量が約 5万の断片である。本発明では、上記抗体をペプシン消化し、還元剤を用いてジスルフイド結合を切断することにより得られる。また、 Fab同様に、 Fab'をコードする DNAを用いて遺伝子工学的に調製することもできる。

F(ab')2は、 IgGをペプシン消化することにより得られる、 L鎖と H鎖可変領域、並びに CH1ドメイン及びヒンジ部の一部からなる H鎖フラグメントとから構成される断片（Fab') がジスルフイド結合で結合した分子量約 10万の断片である。本発明では、上記抗体をペプシン消化することにより得られる。また、 Fab同様に、 F(ab')2をコードする DNAを用いて遺伝子工学的に調製することもできる。

scFvは、 H鎖可変領域と L鎖可変領域とからなる Fvを、片方の鎖の C末端と他方の N 末端とを適当なペプチドリンカ一で連結し一本鎖化した抗体断片である。ペプチドリンカーとしては例えば柔軟性の高い（GGGGS) 3などを用いることができる。例えば、上記抗体の H鎖可変領域及び L鎖可変領域をコードする DNAとペプチドリンカーをコードする DNAを用いて scFv抗体をコードする DNAを構築し、これを適当なベクターに組み込み、当該ベクターを用いて形質転換した形質転換体より scFvを調製することができる。

dsFvは、 H鎖可変領域及び L鎖可変領域の適切な位置に Cys残基を導入し、 H鎖可変領域と L鎖可変領域とをジスルフイド結合により安定化させた Fv断片である。各鎖における Cys残基の導入位置は分子モデリングにより予測される立体構造に基づき決定することができる。本発明では例えば上記抗体の H鎖可変領域及び L鎖可変領域のアミノ酸配列力立体構造を予測し、力かる予測に基づき変異を導入した H鎖可変領域及び L鎖可変領域をそれぞれコードする DNAを構築し、これを適当なベクタ一に組み込み、そして当該ベクターを用いて形質転換した形質転換体より dsFvを調製することができる。

尚、適当なリンカ一を用いて scFv抗体、 dcFv抗体などを連結させたり、ストレプトァビジンを融合させたりして抗体断片を多量体ィ匕することもできる。

本発明の抗体 (抗体断片を含む）に低分子化合物、タンパク質、標識物質などを融合又は結合させることにより、融合抗体又は標識ィ匕抗体を構成することができる。標識物質としては 1251等の放射性物質、ペルォキシダーゼ、 /3 D ガラクトシダーゼ、マイクロペルォキシダーゼ、ホースラディッシュペルォキシダーゼ（HRP)、フルォレセインイソチオシァネート（FITC)、ローダミンイソチオシァネート（RITC)、ァノレカリホスファターゼ、ピオチンなどを用いることができる。

[0200] 本発明の抗体 (抗体断片を含む）は、対応する抗原に対する特異的結合性によつて、当該抗原を特異的に発現する癌細胞に対して特異的に結合する。この特性を利用すれば、癌細胞 (又は癌組織)の標識、検出などが行える。遺伝子組み換え技術によって、この特異的結合能のある VH、 VLを IgGの定常領域 (Fc領域）と融合させることで IgG型抗体へ変換することもできる。こうして得られる IgG型抗体には、 NK細胞上の Fcレセプターを介した細胞傷害作用の発揮も期待される。ところで、 IgG定常領域にはサブクラスが存在する。ヒトの各 IgGサブクラスの Fcレセプターとの結合につ!ヽては、 IgGlと IgG3が最も強ぐ IgG4は中程度であり、 IgG2は弱いといわれており、 IgG 型抗体への変換の際にはこの点を考慮して定常領域を選択するのが好ましい。尚、以前の出願（特開 2005-185281及び PCT/JP2006/303195)で本発明者らは IgG型抗体に変換する代わりに、二次抗体を介した細胞傷害作用のアツセィ法を提案している。

実際、後述の実施例に示すように ITGA3抗体である 015-003抗体、 HER1抗体である 048-006抗体、及び HER2抗体である 015-126抗体には ADCC活性が認められることから、それ自体を癌細胞の傷害 (殺傷）に利用できる。ここで、ヒト化或いはヒト IgG 型抗体に変換した本発明の抗体を用いれば、免疫系によって攻撃、排除されにくくなり、期待される作用を良好に発揮するとともに、重篤な副作用の発生を回避することが可能となる。

さらには、本発明の抗体を、薬物等を特定の癌細胞特異的に送達させるための媒体 (運搬体)として利用することもできる。即ち、本発明の抗体の用途として、特定の癌細胞を標的とした DDS (Drug delivery system)が想定される。

尚、本発明の抗体の各用途については以下に詳述される。

[0201] (診断用途）本発明の他の局面は、 CD46抗原、 ITGA3、 1^^\1及びじ0147抗原の発現（分布) に関する知見に基づき、これらの診断マーカーとしての利用に関する。具体的には、この局面の一態様は、 CD46抗原が胆肝癌及び脾臓癌に発現していることを見出したことに基づき、胆肝癌又は脾臓癌の検査法を提供する。当該方法は以下のステツプを含む。

ステップ (1)：生体から分離された被検細胞又は組織を用意するステップ。

ステップ (2)：被検細胞又は組織を対象として CD46抗原を検出するステップ。

本発明の検査法によって得られる情報は、胆肝癌の診断又は脾臓癌の診断に有益である。例えば、胆肝癌患者を対象として上記方法を実施して得られた情報は、当該患者の病態の評価ないし把握、治療効果の評価などに利用できる。例えば、胆肝癌の治療と並行して本発明の方法を実施すれば、結果として得られる情報を基に治療効果を評価することができる。具体的には、薬剤投与後に本発明の方法を実施することで肝細胞における CD46抗原の発現量の変化を調べ、発現量の増減から治療効果を判定することができる。このように本発明の方法を治療効果のモニターに利用してちよい。

一方、患者以外の者、即ち胆肝癌が認定されていない者を対象とした場合に得られた情報は、胆肝癌に関して罹患の有無の判定、罹患リスクの評価等に利用できる。本発明の方法によれば遺伝子の発現量という客観性に優れた指標を基に肝癌の診断を行えることから、その価値は非常に高、と、える。

以下、本発明を構成する各ステップを詳細に説明する。

1.ステップ (1)

ステップ (1)では対象 (被検者、生体)から分離された細胞又は組織を用意する。患者 (胆肝癌患者又は脾臓癌患者）に限らず、健常者 (胆肝癌又は脾臓癌のおそれがある者を含む)をここでの対象とすることもできる。例えば、バイオプシー（生検)で採取した、対象の組織の一部を被検細胞又は組織として本発明の方法に供することができる。

本発明において「被検細胞又は組織」とは、本発明の方法における検出をする際の試料 (対象）となる細胞又は組織である。被検細胞又は組織は生体より分離される。即ち、生体より分離された状態の被検細胞又は組織に対して本発明が適用される。「生体より分離された」とは、被検細胞又は組織が存在する生体組織の一部を摘出することによって、被検細胞又は組織がその由来の生体と完全に隔離されている状態をいう。ステップ (2)において免疫学的検出法を採用する場合には通常、被検細胞は生体で存在して、た状態、即ち周囲の細胞と結合した状態で (組織片として)調製され、本発明の方法に使用される。尚、被検細胞を周囲の細胞力も分離 (単離)した後に本発明の方法に使用してもよい。

2.ステップ (2)

ステップ (2)では、用意した被検細胞又は組織を対象として CD46抗原を検出する。「 CD46抗原を検出する」とは、 CD46抗原が発現して、るか否か (発現の有無）を調べること、又は CD46抗原の発現量を絶対量として又は相対量として把握することをヽぅ。ここでの相対量の基準を例えば、悪性度に応じて用意した標準試料の CD46抗原量にすることができる。通常は、 CD46抗原の発現の有無、及び発現している場合にはその量が調べられることになる。 CD46抗原を検出する際に厳密に CD46抗原量を定量することは必須でな、。

本発明の一態様では CD46抗原の転写産物である mRNAをターゲットとした検出法を実施する。 mRNAの検出（測定）には RT-PCR法、特異的なプローブを用いた各種ハイブリダィゼーシヨン法（例えばノザンハイブリダィゼーシヨン、 in situハイブリダィゼーシヨン)などの常法を採用できる。本発明の他の態様では、 CD46抗原の発現産物（タンパク質)をターゲットとした検出法を実施する。

免疫学的手法 (例えば免疫組織化学的染色法)で CD46抗原を検出することが好ましい。免疫学的手法では抗 CD46抗原抗体が使用され、当該抗体の結合性 (結合量 )を指標として CD46抗原タンパク質が検出される。免疫学的検出法によれば迅速で感度のよい検出が可能となる。また、操作も簡便である。尚、検出方法としては例えば、 ELISA法、ラジオィムノアツセィ、 FCM、免疫沈降法、ィムノブロッテイング等の方法が挙げられる。

免疫組織ィ匕学的染色法によれば、迅速に且つ感度よく CD46抗原を検出できる。また、操作も簡便である。従って、 CD46抗原の検出に伴う被検者 (患者)への負担も小さくなる。

免疫組織化学的染色法では通常、まず被検細胞に抗 CD46抗体を接触させるステップを実施し、その後、抗 CD46抗体の結合量を調べる。具体的には、上記の免疫組織ィ匕学的染色法に従って本発明の方法を実施することができる。

[0204] 免疫学的染色法に使用する抗 CD46抗体は、 CD46抗原に対する特異的結合性を有する限り、その種類や由来などは特に限定されない。抗 CD46抗体はポリクローナル抗体、オリゴクローナル抗体 (数種〜数十種の抗体の混合物）、及びモノクローナル抗体のいずれでもよい。ポリクローナル抗体又はオリゴクローナル抗体としては、動物免疫して得た抗血清由来の IgG画分のほか、抗原によるァフィユティー精製抗体を使用できる。抗 CD46抗体力 Fab、 Fab'、 F(ab')2、 scFv、 dsFv抗体などの抗体断片であってもよい。

[0205] 抗 CD46抗体は、免疫学的手法、ファージディスプレイ法、リボソームディスプレイ法などを利用して調製することができる。

免疫学的手法によるポリクローナル抗体の調製は次の手順で行うことができる。抗原 (CD46又はその一部）を調製し、これを用いてゥサギ等の動物に免疫を施す。抗原としては、ヒト CD46の他、マウス CD46などヒト以外の種の CD46を用いることができる。これらの CD46は、生体試料を精製することにより得ることができる。また、組換え C D46を用いることもできる。組換えヒト CD46は例えば、 CD46をコードする遺伝子（遺伝子の一部であってもよい）を、ベクターを用いて適当な宿主に導入し、得られた組換え細胞内で発現させることにより調製される。

免疫惹起作用を増強するために、キャリアタンパク質を結合させた抗原を用いてもよい。キャリアタンパク質としては KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin)、 BSA (Bovine S erum Albumin)、 OVA (Ovalbumin)などが使用される。キャリアタンパク質の結合にはカルボジイミド法、グルタールアルデヒド法、ジァゾ縮合法、 MBS (マレイミドベンゾィルォキシコハク酸イミド)法などを使用できる。一方、 CD46 (又はその一部）を、 GST、 j8ガラクトシダーゼ、マルトース結合タンパク、又はヒスチジン（His)タグ等との融合タンパク質として発現させた抗原を用いることもできる。このような融合タンパク質は、汎用的な方法により簡便に精製することができる。 [0206] 必要に応じて免疫を繰り返し、十分に抗体価が上昇した時点で採血し、遠心処理などによって血清を得る。得られた抗血清をァフィユティー精製し、ポリクローナル抗体とする。

一方、モノクローナル抗体については次の手順で調製することができる。まず、上記と同様の手順で免疫操作を実施する。必要に応じて免疫を繰り返し、十分に抗体価が上昇した時点で免疫動物から抗体産生細胞を摘出する。次に、得られた抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを融合してノ、イブリドーマを得る。続いて、このハイプリドーマをモノクローナルィ匕した後、目的タンパク質に対して高い特異性を有する抗体を産生するクローンを選択する。選択されたクローンの培養液を精製することによって目的の抗体が得られる。一方、ハイプリドーマを所望数以上に増殖させた後、これを動物（例えばマウス)の腹腔内に移植し、腹水内で増殖させて腹水を精製することにより目的の抗体を取得することもできる。上記培養液の精製又は腹水の精製には、プロティン。、プロテイン A等を用いたァフィユティークロマトグラフィーが好適に用いられる。また、抗原を固相化したァフィユティークロマトグラフィーを用いることもできる。更には、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、硫安分画、及び遠心分離等の方法を用いることもできる。これらの方法は単独な、し任意に組み合わされて用いられる。

[0207] CD46抗原への特異的結合性を保持することを条件として、得られた抗体に種々の改変を施すことができる。本発明では、このような改変抗体を利用してもよい。

[0208] 抗 CD46抗体として標識化抗体を使用すれば、標識量を指標に結合抗体量を直接検出することが可能である。従って、より簡易な方法となる。その反面、標識物質を結合させた抗 CD46抗体を用意する必要があることに加えて、検出感度が一般に低くなるという問題点がある。そこで、標識物質を結合させた二次抗体を利用する方法、二次抗体と標識物質を結合させたポリマーを利用する方法など、間接的検出方法を利用することが好ましい。ここでの二次抗体とは、抗 CD46抗体に特異的結合性を有する抗体であって例えばゥサギ抗体として抗 CD46抗体を調製した場合には抗ゥサギ Ig G抗体を使用できる。ゥサギやャギ、マウスなど様々な種の抗体に対して使用可能な標識二次抗体が市販されており（例えばフナコシ株式会社やコスモ'バイオ株式会社など）、本発明で使用する抗 CD46抗体に応じて適切なものを適宜選択して使用することができる。

[0209] 標識物質には、ペルォキシダーゼ、 j8— D—ガラクトシダーゼ、マイクロペルォキシダーゼ、ホースラディッシュペルォキシダーゼ（HRP)、フルォレセインイソチオシァネート（FITC)、ローダミンイソチオシァネート（RITC)、アルカリホスファターゼ、ピオチン、及び放射性物質の中から任意に選択されるものが好適に用いられる。特に、ビォチンを標識物質として用いてアビジンペルォキシダーゼを反応させる方法によれば高感度の検出が可能である。

[0210] 上記本発明の抗体をここでの抗 CD46抗体として利用してもよい。具体的には例えば、本発明者らが取得に成功した抗体（035-224抗体、 045-011抗体、 051-144抗体、 052-053抗体、 052-073抗体、 053-049抗体、又は 3172-120抗体）を利用することができる。

[0211] この局面の他の態様は、 ITGA3が胆肝癌及び脾臓癌に発現していることを見出したことに基づき、胆肝癌又は脾臓癌の検査法を提供する。当該方法は以下のステツプを含む。

ステップ (1)：生体から分離された被検細胞又は組織を用意するステップ。ステップ (2)：被検細胞又は組織を対象として ITGA3を検出するステップ。本発明の検査法によって得られた情報は、胆肝癌の診断又は脾臓癌の診断に有益である。尚、検査結果の利用法や各ステップの詳細については、 CD46抗原の場合と同様であるのでその説明を省略する。

[0212] この局面の更なる態様では、 ALCAMが腎臓癌、肝細胞癌及び胆肝癌に発現していることを見出したことに基づき、腎臓癌、肝細胞癌又は胆肝癌診断用の情報を取得する方法が提供される。当該方法は以下のステップを含む。

ステップ (1)：生体から分離された被検細胞又は組織を用意するステップ。ステップ (2)：被検細胞又は組織を対象として ALCAMを検出するステップ。本発明の検査法によって得られた情報は、腎臓癌の診断、肝細胞癌の診断、又は胆肝癌の診断に有益である。尚、検査結果の利用法や各ステップの詳細については

、 CD46抗原の場合と同様であるのでその説明を省略する。 [0213] この局面はさらに他の態様として、 CD147抗原が腎臓癌に発現していることを見出したことに基づき、腎臓癌の検査法が提供される。当該方法は以下のステップを含むステップ (1)：生体から分離された被検細胞又は組織を用意するステップ。ステップ (2)：被検細胞又は組織を対象として CD147抗原を検出するステップ。

本発明の検査法によって得られた情報は、腎臓癌の診断に有益である。尚、検査結果の利用法や各ステップの詳細については、 CD46抗原の場合と同様であるのでその説明を省略する。

[0214] (治療用途）

後述の実施例に示すように、本発明者らは特定の癌細胞に対して抗体依存性細胞性細胞傷害（Antibody- Dependent Cell-mediated Cytotoxicity,以下 ADCCと略す）活性を発揮する抗体の取得に成功した。また、これらの抗体を IgG型に変換し、抗体治療薬への応用の可能性を検討したところ、 V、ずれの抗体も良好な抗腫瘍効果を示した。これらの知見に基づき本発明の更なる局面は、本発明者らが取得に成功した抗体の癌治療用途への適用に関する。

この局面ではまず、 ITGA3、 HER1、 HER2、 ALCAM、 EpCAM又は HGFRを標的として利用することで、癌細胞特異的に作用し傷害することが可能な薬剤 (癌治療剤)及びそれを用いた治療方法が提供される。本発明の薬剤の一態様では、抗 ITGA3抗体が有効成分として含有される。本発明の薬剤の好ましい一態様では、 ADCC活性を有する抗 ITGA3抗体が有効成分として含有される。この態様の薬剤では、 ADCC活性を利用した細胞傷害によって治療効果を得ることができる。 ADCC活性を有する抗 I TGA3抗体として、後述の実施例に示す 015-003抗体 (ITGA3に対する特異的結合性及び ADCC活性を維持する限りにおいて一部改変したものであってもよい）、又はこれを基に構築されたタイプの異なる抗体 (例えば IgG型）を用いることができる。この抗体は ITGA3に対する特異的結合性と ADCC活性を併せ持つ。従って、 ITGA3を発現する癌細胞に特異的に結合し、その後 ADCC活性を発揮し、癌細胞に傷害を与えることが可能である。この態様の薬剤の標的癌細胞は特に限定されないが、例えば胆肝癌細胞、脾臓癌細胞を標的とすることができる。 [0215] 本発明の他の態様では、抗 HER1抗体が有効成分として含有される。本発明の薬剤の好ま、一態様では、 ADCC活性を有する抗 HER1抗体が有効成分として含有される。この態様の薬剤では、 ADCC活性を利用した細胞傷害によって、治療効果を得ることができる。さらに好ましい態様の薬剤では、 ADCC活性を利用した細胞傷害にカロえ、リガンドである EGFの HER1への結合阻害、及び/又は HER1のリン酸化シグナル阻害を伴っていることにより、いっそう高い治療効果を得ることができる。このような ADCC活性を有する抗 HER1抗体として、後述の実施例に示す 048-006、 059-152 抗体 (HER1に対する特異的結合性及び ADCC活性を維持する限りにおヽて一部改変したものであってもよい）、又はこれを基に構築されたタイプの異なる抗体 (例えば I gG型）を用いることができる。これらの抗体は HER1に対する特異的結合性と、 EGFの HER1への結合阻害、 HER1のリン酸化シグナル阻害及び ADCC活性を併せ持つ。従つて、 HER1を発現する癌細胞に特異的に結合し、 EGFの HER1への結合阻害及び/ 又は HER1のリン酸化シグナル阻害によって HER1活性を阻害し、その後 ADCC活性を発揮し、癌細胞に傷害を与えることが可能である。また、当該抗体は癌細胞に対する増殖抑制作用及び動物モデルでの抗腫瘍効果も発揮することが確認されており、抗体医薬へのその利用が大いに期待される。この態様の薬剤の標的癌細胞は特に限定されないが、例えば腎臓癌細胞、肝細胞癌細胞、胆肝癌細胞、肺扁平上皮癌細胞、肺腺癌細胞、脾臓癌細胞を標的とすることができる。

[0216] 本発明のさらに他の態様では、抗 HER2抗体が有効成分として含有される。本発明の薬剤の好まし、一態様では、 ADCC活性を有する抗 HER2抗体が有効成分として含有される。この態様の薬剤では、 ADCC活性を利用した細胞傷害によって治療効果を得ることができる。 ADCC活性を有する抗 HER2抗体として、後述の実施例に示す 015-126抗体 (HER2に対する特異的結合性及び ADCC活性を維持する限りにおいて一部改変したものであってもよい）、又はこれを基に構築されたタイプの異なる抗体 (例えば IgG型）を用いることができる。この抗体は HER2に対する特異的結合性と A DCC活性を併せ持つ。従って、 HER2を発現する癌細胞に特異的に結合し、その後 ADCC活性を発揮し、癌細胞に傷害を与えることが可能である。また、当該抗体は癌細胞に対する増殖抑制作用も発揮することが確認されており、抗体医薬へのその利用が大いに期待される。この態様の薬剤の標的癌細胞は特に限定されないが、例えば腎臓癌細胞、肝癌細胞、肺腺癌細胞を標的とすることができる。

[0217] 本発明のさらに他の態様では、抗 ALCAM抗体が有効成分として含有される。本発明の薬剤の好ましヽー態様では、 ADCC活性を有する抗 ALCAM抗体が有効成分として含有される。この態様の薬剤では、 ADCC活性を利用した細胞傷害によって治療効果を得ることができる。 ADCC活性を有する抗 ALCAM抗体として、後述の実施例に示す 041-118抗体 (ALCAMに対する特異的結合性及び ADCC活性を維持する限りにおいて一部改変したものであってもよい）、又はこれを基に構築されたタイプの異なる抗体 (例えば IgG型）を用いることができる。この抗体は ALCAMに対する特異的結合性と ADCC活性を併せ持つ。従って、 ALCAMを発現する癌細胞に特異的に結合し、その後 ADCC活性を発揮し、癌細胞に傷害を与えることが可能である。この態様の薬剤の標的癌細胞は特に限定されないが、例えば肺腺癌細胞を標的とすることができる。

[0218] 本発明のさらに他の態様では、抗 EpCAM抗体が有効成分として含有される。本発明の薬剤の好ましヽー態様では、 ADCC活性を有する抗 EpCAM抗体が有効成分として含有される。この態様の薬剤では、 ADCC活性を利用した細胞傷害によって治療効果を得ることができる。 ADCC活性を有する抗 EpCAM抗体として、後述の実施例に示す 067-153抗体 (EpCAMに対する特異的結合性及び ADCC活性を維持する限りにおいて一部改変したものであってもよい）、又はこれを基に構築されたタイプの異なる抗体 (例えば IgG型）を用いることができる。この抗体は EpCAMに対する特異的結合性と ADCC活性を併せ持つ。従って、 EpCAMを発現する癌細胞に特異的に結合し、その後 ADCC活性を発揮し、癌細胞に傷害を与えることが可能である。この態様の薬剤の標的癌細胞は特に限定されないが、例えば、胃充実型腺癌、結腸腺癌、肺腺癌細胞を標的とすることができる。

[0219] 本発明のさらに他の態様では、抗 HGFR抗体が有効成分として含有される。本発明の薬剤の好ましヽー態様では、 ADCC活性を有する抗 HGFR抗体が有効成分として含有される。この態様の薬剤では、 ADCC活性を利用した細胞傷害によって治療効果を得ることができる。 ADCC活性を有する抗 HGFR抗体として、後述の実施例に示す 067-133抗体 (HGFRに対する特異的結合性及び ADCC活性を維持する限りにおいて一部改変したものであってもよい）、又はこれを基に構築されたタイプの異なる抗体 (例えば IgG型）を用いることができる。この抗体は HGFRに対する特異的結合性と ADCC活性を併せ持つ。従って、 HGFRを発現する癌細胞に特異的に結合し、その後 ADCC活性を発揮し、癌細胞に傷害を与えることが可能である。この態様の薬剤の標的癌細胞は特に限定されないが、例えば、肺腺癌細胞を標的とすることができる。

[0220] 本発明は更に、標的細胞において HER1、 HER2、 CD46、 ITGA3、 ICAM1、 ALCAM 、又は CD147の発現を阻害ないし抑制することによって、標的細胞の悪性度低下又は正常化を促す方法を提供する。

ここで、本発明者らの検討によって、これまでに CD46との関連性について特別の報告のな!/、胆肝癌及び脾臓癌にお!、て CD46の特異的な発現が認められた (後述の実施例の欄を参照)。同様に、胆肝癌及び脾臓癌と ITGA3の発現との関連性、腎臓癌、肝細胞癌及び胆肝癌と ALCAMとの関連性、並びに腎臓癌と CD147との関連性が明ら力となった (後述の実施例の欄を参照)。この知見に基づけば、 CD46に関しては胆肝癌細胞及び脾臓癌細胞が、 ITGA3に関しては胆肝癌細胞及び脾臓癌細胞が、 CD147に関しては腎臓癌細胞が、それぞれ新規且つ有効な標的細胞となる。

尚、各抗原の発現の阻害ないし抑制は、アンチセンス法や RNA干渉によって、或いはリボザィムの使用によって行うことができる。

[0221] アンチセンス法による発現阻害を行う場合には例えば、標的細胞内で転写されたときに、本タンパク質をコードする mRNAの固有の部分に相補的な RNAを生成するアンチセンス 'コンストラクトが使用される。このようなアンチセンス 'コンストラクトは例えば、発現プラスミドの形態で標的細胞に導入される。一方、アンチセンス'コンストラクトとして、標的細胞内に導入されたときに、本タンパク質をコードする mRNAZ又はゲノム DNA配列とハイブリダィズしてその発現を阻害するオリゴヌクレオチド 'プローブを採用することもできる。このようなオリゴヌクレオチド 'プローブとしては、好ましくは、ェキソヌクレアーゼ及び Z又はエンドヌクレアーゼなどの内因性ヌクレアーゼに対して抵抗性であるものが用いられる。

アンチセンス核酸として DNA分子を使用する場合、本タンパク質をコードする mRNA の翻訳開始部位 (例えば- 10〜+10の領域)を含む領域に由来するオリゴデォキシリボヌクレオチドが好ましい。

[0222] アンチセンス核酸と、標的核酸との間の相補性は厳密であることが好ましいが、多少のミスマッチが存在して、てもよ、。標的核酸に対するアンチセンス核酸のハイブリダィズ能は一般に、両核酸の相補性の程度及び長さの両方に依存する。通常、使用するアンチセンス核酸が長いほど、ミスマッチの数が多くても、標的核酸との間に安定な二重鎖 (又は三重鎖)を形成することができる。当業者であれば、標準的な手法を用いて、許容可能なミスマッチの程度を確認することができる。

[0223] アンチセンス核酸は DNA、 RNA、若しくはこれらのキメラ混合物、又はこれらの誘導体や改変型であってもよい。また、一本鎖でも二本鎖でもよい。塩基部分、糖部分、又はリン酸骨格部分を修飾することで、アンチセンス核酸の安定性、ハイブリダィゼーシヨン能等を向上させることなどができる。また、アンチセンス核酸に、細胞膜輸送を促す物質（例えば Letsinger et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:6553-6 556; Lemaitre et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. 84:648-652; PCT Publication No. W088/09810, published December 15, 1988を参照されたい)や、特定の細胞に対する親和性を高める物質などを付加してもよ、。

アンチセンス核酸は例えば市販の自動 DNA合成装置 (例えばアプライド 'バイオシステムズ社等)を使用するなど、常法で合成することができる。核酸修飾体や誘導体の作製には例えば、 Stein et al.(1988), Nucl. Acids Res. 16:3209や Sarin et al., (198 8), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:7448- 7451等を参照することができる。

[0224] 標的細胞内におけるアンチセンス核酸の作用を高めるために、 pol IIや pol IIIといつた強力なプロモーターを利用することができる。即ち、このようなプロモーターの制御下に配置されたアンチセンス核酸を含むコンストラクトを標的細胞に導入すれば、当該プロモーターの作用によって十分な量のアンチセンス核酸の転写を確保できる。アンチセンス核酸の発現は、哺乳動物細胞 (好ましくはヒト細胞)で機能することが知られている任意のプロモーター（誘導性プロモーター又は構成的プロモーター）によって行うことができる。例えば、 SV40初期プロモーター領域（Bernoist and Chambon , 1981, Nature 290:304-310)、ラウス肉腫ウィルスの 3'末端領域由来のプロモーター（ Yamamoto et al, 1980, Cell 22:787-797)、疱疹チミジン'キナーゼ 'プロモーター (Wa gner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1441- 1445)等のプロモーターを使用することができる。

[0225] 本発明の一態様では、 RNA干渉 (RNAi)により本タンパク質の発現阻害を行う。 RN Aiは、真核細胞内で引き起こすことが可能な、配列特異的な転写後遺伝子抑制のプロセスである。 RNA干渉では、標的 mRNAの配列に対応する配列を有する二本鎖 RN A (dsRNA)が使用される。哺乳動物細胞は、 dsRNAの影響を受ける 2つの経路 (配列特異的経路及び配列非特異的経路)を有することが知られて!/、る。配列特異的経路においては、比較的長い dsRNAが短い干渉性の RNA(siRNA)に分割される。この siR NAは、それぞれが 3'末端に突出部を有する約 19ヌクレオチドの siRNAを形成する約 2 1ヌクレオチドのセンス及びアンチセンス鎖を有する。他方、配列非特異的経路は、所定の長さ以上であれば配列に関係なぐ任意の dsRNAによって惹起されると考えられている。この経路では、 dsRNAが二つの酵素、即ち、活性型となり翻訳開始因子 el F2をリン酸化することでタンパク質合成のすべてを停止させる PKRと、 RNAase L活性化分子の合成に関与する 2',5'オリゴアデニル酸シンターゼが活性化される。本発明の方法では、この非特異的経路の進行を最小限に留めるために、約 30塩基対より短い dsRNAを使用することが好ましい (Hunter et al. (1975) J Biol Chem 250: 409-17; Manche et al. (1992) Mol Cell Biol 12: 5239—48; Minks et al. (1979) J Biol Chem 25 4: 10180-3;及び Elbashir et al. (2001) Nature 411: 494- 8を参照されたい）。

尚、 RNAiは様々な細胞種（例えば、 HeLa細胞、 NIH/3T3細胞、 COS細胞、 293細胞等）において遺伝子発現を減少させる効果的な手段であることが確認されている。また、通常は、アンチセンス法よりも効果的に発現阻害を行える。

[0226] RNAiに使用する dsRNAは、化学合成によって、又は適当な発現ベクターを用いて i n vitro又は in vivoで調製することができる。後者の方法は、比較的長い dsRNAの調製を行うことに特に有効である。 dsRNAの設計には通常、標的核酸に固有の配列 (連続配列）が利用される。尚、適当な標的配列を選択するためのプログラム及びアルゴリズムが開発されている。

[0227] 本発明の他の一態様ではリボザィムにより ITGA3等の発現阻害を行う。部位特異的認識配列で mRNAを開裂させるリボザィムを用いて、本タンパク質をコードする mRNA を破壊することもできる力好ましくはハンマーヘッド'リボザィムを使用する。ハンマ一ヘッド .リボザィムの構築方法については例えば Haseloff _and Gerlach, 1988, Natur e, 334:585-591を参考にすることができる。

アンチセンス法の場合と同様に、例えば安定性やターゲット能を向上させることを目的として、修飾されたオリゴヌクレオチドを用いてリボザィムを構築してもよい。効果的な量のリボザィムを標的細胞内で生成させるために、例えば、強力なプロモーター（例えば pol IIや pol III)の制御下に、当該リボザィムをコードする DNAを配置した核酸コンストラクトを使用することが好ましい。

[0228] 本発明の治療方法 (癌細胞等の悪性度低下又は正常化を促す方法を含む）に使用される薬剤の製剤化は常法に従って行うことができる。製剤化する場合には、製剤上許容される他の成分 (例えば、担体、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、無痛化剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水など)を含有させることができる。賦形剤としては乳糖、デンプン、ソルビトール、 D-マン-トール、白糖等を用いることができる。崩壊剤としてはデンプン、カルボキシメチルセルロース、炭酸カルシウム等を用いることができる。緩衝剤としてはリン酸塩、クェン酸塩、酢酸塩等を用いることができる。乳化剤としてはアラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、トラガント等を用いることができる。懸濁剤としてはモノステアリン酸グリセリン、モノステアリン酸アルミニウム、メチノレセノレロース、カノレボキシメチノレセノレロース、ヒドロキシメチノレセノレロース、ラウリノレ硫酸ナトリウム等を用いることができる。無痛ィ匕剤としてはべンジルアルコール、クロ口ブタノール、ソルビトール等を用いることができる。安定剤としてはプロピレングリコール、ジエチリン亜硫酸塩、ァスコルビン酸等を用いることができる。保存剤としてはフェノール、塩化ベンザルコ-ゥム、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルパラベン等を用いることができる。防腐剤としては塩ィ匕ベンザルコ-ゥム、パラォキシ安息香酸、クロロブタノール等と用いることができる。

[0229] 製剤化する場合の剤型も特に限定されず、例えば錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、力プセル剤、シロップ剤、注射剤、外用剤、及び座剤などとして調製できる。

本発明の薬剤を用いた治療にぉ、ては、癌細胞又は成人 T細胞白血病細胞を保有する対象 (患者）に本発明の薬剤が投与される。本発明の薬剤はその形態に応じて経口投与又は非経口投与 (静脈内、動脈内、皮下、筋肉、腹腔内注射、標的細胞への直接導入など）によって対象 (患者）に適用され得る。

薬剤の投与量は症状、患者の年齢、性別、及び体重などによって異なるが、当業者であれば適宜適当な投与量を設定することが可能である。例えば、成人 (体重約 6 0kg)を対象として一日当たりの有効成分量が約 O.OOlmg〜約 lOOmgとなるよう投与量を設定することができる。投与スケジュールとしては例えば一日一回〜数回、二日に一回、或いは三日に一回などを採用できる。投与スケジュールの設定においては、患者の病状や薬剤の効果持続時間などを考慮することができる。

[0230] 本発明の薬剤の別の態様では、抗 HER1抗体、抗 HER2抗体、抗 CD46抗体、抗 ITG A3抗体、抗 ICAM1抗体、抗 ALCAM抗体、抗 CD147抗体を DDS用の運搬体として利用する。つまりこの態様は抗 HER1抗体等に薬物 (細胞毒など)又は放射性同位元素など (これらをまとめて「活性成分」ともヽぅ)を結合して得られる免疫複合体を提供する。殺細胞活性又は細胞傷害活性を持つ薬物 (細胞毒)を含有する免疫複合体は一般にィムノトキシンと呼ばれる。細胞毒の例には、タキノール、シトカラシン B、ダラミシジン D、臭化工チジゥム、ェメチン、ミトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、ァクチノマイシン D、 1-デヒドロテストステロン、糖質コルチコイド、プロ力イン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、及びプロマイシン並びにこれらの類似体又は同族体を挙げることができる。

本発明の免疫複合体に含有させる活性成分として、所望の生物活性を有するタンパク質又はペプチドを使用してもよい。このような目的において使用可能なタンパク質等の候補として、アブリン、リシン A、シユードモナス'ェキソトキシン、ジフテリア毒素、腫瘍壊死因子、インターフェロン- γ、インターロイキン- 1 (IL-1)、インターロイキン- 2 (IL-2)、インターロイキン- 6 (IL-6)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（G M-CSF)、顆粒球コロニー刺激因子（G- CSF)リンホカインを例示できる。

[0231] 活性部分を抗体に結合させる技術は公知であり、例えば Monoclonal Antibodies An d Cancer Therapy, Reisfeld et al. 、edsj, pp. 243—56 (Alan R. Liss, Inc. 1985)、し ont rolled Drug Delivery (2nd edition.), Robinson et al. (eds.), pp. 623—53 (Marcel Dekk er, Inc. 1987)、 Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985)、 Thorpe et al., "The Preparation An d Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62: 119-58 (1982)を参照することができる。

[0232] (本発明に使用されるキット）

本発明の各方法 (診断用の情報を取得する方法など)を、キット化した試薬等を用いて実施してもよい。本発明の他の局面はこのような目的に使用されるキットを提供する。例えば、本発明の方法における検出に利用される核酸 (プローブやプライマー )、反応用試薬、希釈液、反応容器などをキットに含めることができる。尚、本発明のキットには通常、使用説明書が添付される。

キットを用いることによって、本発明の方法をより簡便に且つより短時間で実施することが可能となる。

実施例

[0233] 1. scFv抗体遺伝子ライブラリーを作製するためのベクターの作製

1-1 scFv抗体遺伝子ライブラリーを作製するためのベクターの作製

図 5に概念的に示すように、 pTZ19Rファージミドベクター（フアルマシア）に M13ファージの pelB (シグナル配列)、 His6タグ配列、 M13ファージの cp3蛋白質（ Δ cp3 (198aa -406aa) N端欠失キヤプシド蛋白質 3)配列、 proteinA蛋白質配列を適当な制限酵素部位で組み込みベクター pAALFabを作製した (Iba Y. et al., Gene 194： 35-46, 1997 .参照)。この pAALFabから組み込み用ベクター pFCAH9-E8dを作成した。

[0234] このベクターの所定の位置に重鎖と軽鎖の遺伝子を挿入することにより、実際の抗体蛋白質発現ベクターが完成することとなる。完成したベクターによって発現される抗体の形状は scFv型であり、軽鎖定常領域 CL遺伝子は前述の cp3遺伝子と結合されており、結果として発現蛋白質は scFv-CL-cp3の形状となる。具体的には、以下のような操作を行った。

用いたプライマー：

527 Reverse (配列番号： 377)： 5 ' - C AGGAAAC AGCTATGAC- 3 '

599 E8VHf- PstR: (配列番号： 378)

3し CGGCTCCAAGTCGACGTCGTCA- 5 '

544 E8VHf- PstF: (配列番号： 379)

AGTTGTCCTGCACAGCTTCTGGCTTCAACATTAA-3'

545 E8VHf- XbaR: (配列番号： 380)

ACTTTTCCCAGATCTCACCTAACCTTCCTAA-5'

546 E8VHf- XbaF: (配列番号： 381)

ATATGACCCGAAGGACAAGGCCACTATAACAGCA-3'

547 E8VHf- EcoR (配列番号： 382)

TGTCGACTTAAGGGAC-5 '

548 E8VHf- EcoF (配列番号： 383)

GT-3'

549 E8VHf-BstR (配列番号： 384) :

TTCCGTGGTGCCAGTGGCACAAGG-5 '

590 His6- SmaR (配列番号： 385) :

CGAA-5'

542 E8VLf- SacF (配列番号： 386)：

AAACTGTCACCATCACATGT-3'

539 E8VLf- KpnR (配列番号： 387) : TACCATGGTCGTC-5'

542 E8VLf-KpnF (配列番号： 388)：

543 E8VLf- BamR (配列番号： 389) :

GTTCCAAGTCACCGTCACCTAGGCCTTGTGTT-5'

562 E8VLf- XhoR (配列番号： 390) :

563 E8VLf- XhoF (配列番号：391) :

613 NheR (配列番号： 392) :

3し ATCGACAGCT- 5'

600 E8VLKpnXhoR (配列番号： 393) :

3し AAGCCACCTCCATGGTTCGAGCTCTAGTTT- 5'

LCP3ASC (配列番号： 394)： hCHlBst (配列番号： 395) :

CCCTGG-3'

hCHlmidAS (配列番号： 396) :

3し GGGAGTCGTCGCAGCACTGGCACGGGAGGTCGTCGAA- 5 hCHlmidS (配列番号： 397) :

5し GGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTCGTGACCGTGCCC- 3' hCHlH6 (配列番号： 398) :

GGTAGTAGTGGTA— 5 ' hCHlH6Sma (配列番号： 399) : CGAACG-5'

702 BstXhoF (配列番号： 400)：

5 -GGCACCACGGTCACCGTCTCGAGCGCCTCCACC-3'

[0235] く pFCAH3- E8T H鎖部分の作製 >

1) pAALFabを铸型にして 527-599を用いた PCR, 547-590を用いた PCRを行、DNA 断片を作製した。

2) 544-545, 546-547,548-549にて PCRを行!ヽ DNA断片を作製した。

3) 1) 2)を混合し 527,590による PCRを行い、これを pAALFabの Hindlll- Smal siteにクローンニングした。

[0236] く PFCAH3- E8T L鎖部分 >

4) 542- 562 , 561 -613を用!、た PCRを行、DNA断片を作製した。

5) 538-539,542-543にて PCRを行!、DNA断片を作製した。

6) 4) 5)を混合し 538,562による PCRを行い、これを pAALFabの Sad- Nhel siteにクローンニングした。

[0237] <pFCAH9-E8d>

7) VH stuffer部分の作製

pFCAH3- E8Tを XbaI,EcoRIにて消化、 klenow fragmentを作用させて平滑末端に変えた後 self ligationさせて VH部分の stufferを作製した。

8) VL stuffer部分の作製

pFCAH3- E8Tを铸型にして 527- 600にて PCR。 7)の Hindlll- Xhol siteにクロー-ングした。

9)これを Kpnlにて消化、 self ligationさせて VL部分の stufferを作製した。

10) SfiI,NcoI,SpeI siteの導入

pFCAH3- E8Tを铸型にして 527- 663にて PCR。 1)の Hindm- Sad siteにクロー-ングした。

11) AscI siteの導入 pFCAH3- E8Tを铸型にして 527- LCP3ASCにて PCRし、それを Sacl完全消化、 Sail部分消化した 2)にクローユングした。

12) gammaCHl部分をヒト遺伝子に変換

ヒト gammaCHl部分には BstPI siteが存在するためこれをなくす設計でクロー-ングを行った。ヘントウ腺 cDNAを铸型にして hCHlBst- hCHlmidS, hCHlmidAS- hCHlH6 にて PCRしたのち、これを混合して hCHlBst-hCH16Smaにて PCRし、その DNA断片を 3)の BstPI-Sma siteにクローユングした

13) Xho siteの導入

12)を铸型に 702-663にて PCRを行い、これを 12)の BstPI-SacI siteにクローユングした。

[0238] く pscFvCA9- E8VHdVLdの作製 >

pFCAH9-E8d 3 g (3 L) (図 5Dを参照）を BstPI (3U/ L) 3 L、 10 X H buffer 5 μ L、 DW39 /Z Lと混合し、 37°Cで 2時間、制限酵素処理を行った。処理後、エタノール沈殿して得られた沈殿を 10 Lの TEバッファーに溶解した。これに、 Sacl (10 U/ μ L ) 1 L、 10 X L buffer 5 μ DW34 μ Lを混合して 37°Cで 2時間、制限酵素処理した後、ァガロースゲル電気泳動して、 4.7kb断片を回収した。回収物をエタノール沈殿して 10 μ Lとした（pFCAH9— E8d BstPI- Sacl断片）。

[0239] 一方、プライマー linF(100pmol/ μ L)5 μ Lとプライマー linR(100pmol/ ^ L) 5 ^ Lを混合し、 94°Cで 5分加熱した後、 80°C5分、 70°C5分、室温放置 30分によりァニールさせた。このうち、 2 μ Lと上記で得られた pFCAH9- E8d BstPI- Sacl断片 1 μ L、 lO X ligatio n bufferl .5 μ L、 DW 9.5 μ L、 T4DNAligase 1 μ Lを混合し、 16°Cで 16時間反応させた。反応後、エタノール沈殿して 3 /z Lに濃縮し、そのうち 1.5 /z Lを用いて、大腸菌 DH12 Sコンビテントセル 20 μ Lをエレクト口ポレーシヨンにより形質転換した。得られたクローンのプラスミドを抽出し、塩基配列を確認して、 pscFvCA9-E8VHdVLdと名づけた。図 6に pscFvCA9- E8VHdVLdの構造を模式的に示した。また、図 7— 1〜図 7— 2に psc FvCA9-E8VHdVLdのインサート部の塩基配列（配列番号： 401)及びそれにコードされるアミノ酸配列（配列番号： 402)を示した。

プライマー linF (配列番号： 403) TGGTGGGTCCATGGCCGACATCGAGCT

プライマー linR (配列番号： 404)

CGATGTCGGCCATGGACC CACCGCCTCTCGAGACG

[0240] 1-2重鎖可変領域 (VH)を一時的にクローユングするためのベクターの作製

公知の手法 (Iba Y. et al., Gene 194:35-46, 1997.参照)に従って、まず pAALFabベクタ一（図 5A)を作製した。 pAALFabベクターの Xbalから EcoRIの間を欠落させ、新たに制限酵素切断部位 Kpn I, Sfi I, Nco I, Spe Iを付カ卩して、 pFCAH3-E8T (図 5B)を経て、 VH (重鎖可変領域)をクロー-ング可能としたベクター pscFvCA-E8VHd (図 5C )を作製し、重鎖可変領域を一時的にクローユングするためのベクターとした。図 8— 1〜図 8— 2に pscFvCA-E8VHdのインサートの塩基配列（配列番号： 405)及び制限酵素サイトと塩基配列によってコードされるアミノ酸配列 (配列番号: 406)を示した。

[0241] 具体的には、 primer610と primer611をァニールさせ、それを pFCAH3- E8Tの BstPI- Sad siteにクローユングして single chainの作製を行なった。さらに、 primer527と primer 619にて PCRを行い、これをさらに Hindm- Pstl siteにクローユングし、 SfiI,NcoI siteの導入を行った。以下にベクターの作製に用いたプライマー配列を示す。

610 scBstSpeSacF (配列番号： 407) :

611 scBstSpeSacR (配列番号： 408)：

527 Reverse (配列番号： 409)：

5 ' - C AGGAAAC AGCTATGAC- 3 '

619 E8VHf-SfiNcoPstR(配列番号：410)：

[0242] 2.ィムノグロブリン軽鎖ライブラリーの作製 2-1 PCRを用いたィムノグロブリン軽鎖遺伝子の単離

骨髄細胞 (検体 No.59) 4 X 107 cells,および臍帯血と末梢血のリンパ球から、巿販のキット (Pharmacia Biotech社製 QuickPrep Micro mRNA Purification Kit)を用いて、 2.6 μ gの mRNAを得た。この mRNAから cDNAを作製した。 cDNAは、 GibcoBRL社製 SuperScriptPreamplification Systemによって作製した。プライマーには、オリゴ dTを用いた。得られた cDNAを铸型にして、軽鎖遺伝子の取得用 5'プライマー（ κ 1〜 κ 6、 λ 1〜え 6 )と 3，プライマー（hCKASCプライマーまたは hCLASCプライマー）を用いて、 PCRを行った。 PCR産物は、フエノール処理後、エタノール沈殿して 10 Lの TEバッファーに懸濁した。用いたプライマーの塩基配列と PCRの条件は以下のとおりである。軽鎖遺伝子取得用プライマーの塩基配列中、下線部は Ncolサイト、 Asdサイトを示す。

5'—プライマー κ 1〜 κ 6

hVKla (配列番号： 411) :

GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC GACATCCAGATGACCCA GTCTCC

1^! 2& (配列番号：412)：

GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC GATGTTGTGATGACTCA GTCTCC

1^! 3& (配列番号：413)：

GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC GAAATTGTGTTGACGCA GTCTCC

1^! 4& (配列番号：414)：

GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC GACATCGTGATGACCCA GTCTCC

1^! 5& (配列番号：415)：

GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC GAAACGACACTCACGCA GTCTCC

hVK6a (配列番号： 416) : GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC GAAATTGTGCTGACTCA GTCTCC

5' -プライマー λ ΐ〜え 6

1^し1 (配列番号：417)：

GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC CAGTCTGTGTTGACGCA GCCGCC

hVL2 (配列番号： 418) :

GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC CAGTCTGCCCTGACTCA GCCTGC

1^! 3& (配列番号：419)：

GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC TCCTATGTGCTGACTCA GCCACC

hVL3b (配列番号： 420) :

GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC TCTTCTGAGCTGACTCA GGACCC

hVL4 (配列番号： 421) :

GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC CACGTTATACTGACTCA ACCGCC

hVL5 (配列番号： 422) :

GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC CAGGCTGTGCTCACTCA GCCGCC

hVL6 (配列番号： 423) :

GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC AATTTTATGCTGACTCA GCCCCA

3， -プライマー hCKASC (配列番号： 424)：

3 ' -プライマー HCLASC (配列番号： 425)： [0244] PCRの条件

cDNA 2μL

10 X buffer # 1 (KODに添付） 10 L

dNTP mix(2.0mM) lO^L

25mM MgC12 4μL

5'側プライマー (lOOpmol/ L) lμL

3'側プライマー (lOOpmol/ L) lμL

滅菌済 MilliQ 71 μL

KOD DNA polymerase (東洋紡 2.5U/ μL) lμL

94°C 1分、 55°C 2分、 74°C 1分を 35サイクル

[0245] 2-2-1軽鎖遺伝子のファージミドへの組込み

1で得た PCR産物を以下の条件で制限酵素処理した。

PCR産物 10 L

10XNEB4(AscI【こ添付） 5μL

滅菌済 MilliQ 33 μL

Ascl (NEB社 10 U/ μ L) lμL

Ncol (宝酒造社 10 U//ZL) lμL

[0246] 37°Cで 1時間、 50°Cで 1時間反応後、そのうち 10 μ L分をァガロースゲル電気泳動し、 600bp付近のバンドを切り出して、ジーンクリーン IIキット (フナコシ株式会社)で精製した。 PCR産物と同様に制限酵素処理した pscFvCA9-E8VHdVLdをジーンクリーン II キットで精製し、制限酵素処理した PCR産物と以下の条件で 16°Cで 4時間〜一晩反応させることによりライゲーシヨンした。

制限酵素処理した _pscFvCA9- E8VHdVLd 2 L

制限酵素処理した PCR産物 1 μ L

10 X ligation buffer 1.5 μ L

(Τ4 DNA ligaseに添付）

10mM ATP 1.5 ,uL

滅菌済 MilliQ 8μL T4 DNA ligase (宝酒造 10 U/ L) l μ L

[0247] 2-2-2ファージミドの大腸菌への導入

得られた ligated DNAを用いて以下のように大腸菌 DH12Sを形質転換した。即ち、 li gated DNAをー且エタノール沈殿し、 1/5TE(TEを滅菌済 MilliQで 5倍希釈したもの) 3 μ Lに溶解した。そのうち、 1.5 μ Lをコンビテントセル DH12S(GIBCO BRL製) 20 μしに懸濁し、以下の条件でエレクト口ポレーシヨンを行った。

エレクト口ポレーター

BRL社 CeU— Porator(Cat.series 1600)

設定条件； voltage booster 4k Ω

capacitance 3ύ0 μ r

DC volts し ονν Ω

charge rate Fast

[0248] 形質転換した上記の大腸菌を形質転換用培地 (SOB) 2mLに植え、 37°Cで 1時間振盪培養したあと、一部を寒天培地 (Ampプレート）にまき、残りは、 0.1%グルコース、 10 0 g/mLアンピシリン含有 2 X TY培地で培養し、グリセリンストックした。寒天培地は 30 °Cで incubateし、生えてきたコロニーを楊枝でつついて分離し、それぞれプラスミドを調製し、軽鎖遺伝子の塩基配列を調べた。

[0249] SOB培地： 950mLの精製水に次の成分を加えて振とうし、完全に溶解した後 250mM の KC1溶液 10mLをカ卩え、 5N NaOHで pH7.0に調製した。精製水を加えて lOOOmLに調整した後、オートクレーブで 20分間滅菌し、使用直前に滅菌した 2Mの MgC12を 5m L加えた。

bacto-tryptone 20g

bacto— yeast extract 5g

NaCl 0.5g

2 X YT培地： 900mLの精製水に次の成分をカ卩えて振とうし、完全に溶解した後 5N Na OHで pHを 7.0に調製し、精製水を加えて lOOOmLとした。オートクレーブで 20分間滅菌して使用した。

bacto-tryptone log bacto— yeast extract lOg

NaCl 5g

その他の試薬は以下から購入した。

メーカー品名

シグマアンピシリンナトリウム

和光純薬フエノール

シグマ BSA

DIFCO 2 X YT培地

和光純薬カナマイシン硫酸塩

ナカライテスタポリエチレングリコール 6000

ナカライテスタ Tween20

片山化学 NaCl

和光純薬 IPTG

和光純薬スキムミルク

和光純薬アジィ匕ナトリウム

和光純薬トリェチルァミン

和光純薬過酸化水素

和光純薬 OPD錠

和光純薬エタノール

[0250] κ 1、 κ 2、 κ 3、 κ 4、 κ 5、および κ 6、並びにえ 1、 λ 2、 3a、 3b、 λ 4、 λ 5、 λ 6

、 λ 7、 λ 8、 λ 9、および λ 10の全てについて以上の操作を行い、目的のクローンが得られているかどうか確認した。続いて κ 1、 κ 2などの各グループのクローンを in viv oでの使用頻度に近い比率になるように混合した。これら軽鎖の各グループは、それぞれ実際の生体内でどのような割合で発現しているのかが既に知られている。 PCR 法で増幅してベクターに組み込んだこれらの遺伝子クローンを、 in vivoでの使用頻度に近い比率になるように混合し VLライブラリ一とした。 VLライブラリーにおける各 fa milyの構成比率を以下に示す。

[0251] [表 1] VA:

* Griffith AD et al. EMBO J. (1994) 13, 3245-60.

**発表時記載なし。

***プライマー VK6- 2で作製した cDNAとプライマー VK6- 3で作製した cDNAを等量混合。

[表 2] νλ

* Griffith AD et al. EMBO J. (1994) 13, 3245—60. *2発表時記載なし。

*3プライマー VL2で作製した cDNA5%とプライマー VL2-2で作製した cDNA10%を混合

*4プライマー VL3a-2で作製した cDNA17%とプライマー VL3bで作製した cDNA15%を混合。

*5プライマー VL4aで作製した cDNAO.5%とプライマー VL4bで作製した cDNAO.5%とプライマー VL4cで作製した cDNAO.5%を混合。

*6プライマー VL5abdeで作製した cDNAO.5%とプライマー VL5cで作製した cDNAO.5% を混合。

[0253] 3.軽鎖遺伝子ライブラリーと重鎖遺伝子ライブラリーの組み合わせライブラリー（scFv 抗体遺伝子ライブラリー）の作製

3-1-1 PCRを用いたィムノグロブリン重鎖遺伝子の単離

2-1と同様の手順を用いて臍帯血、骨髄液、および末梢血のリンパ球、並びに扁桃腺； ^り human μ primer ( 下にすプフイマ ~~ (O634) fc5l、 random hexamer¾ 用いて cDNAを調製し、この cDNAを铸型にして、以下に示すヒト抗体重鎖遺伝子の取得用 5 'プライマー（VH1〜VH7)と 3，プライマー（human JHプライマー 4種を等量混合したもの、以下に示すプライマーの 697〜700)、または、 human プライマー（以下に示すプライマーの 634)を用いて、 PCRを行った。表中、下線をつけた部分は Sfil サイトを示す。 hVH2aは germ line VH2 familyに対応していないため、新たに VH2a-2 を設計した。また hVH4aでは VH4ファミリー全体に対応していないため、新たに hVH4 a-2を設計した。 VH5aも germ line VH5 subfamilyに対応していなかつたため新たに V H5a-2を設計した。また VH7に対応する primerとして hVH7を設計した。これらについても遺伝子増幅を行い、 pscFvCA-E8VHdに組み込み、どのような遺伝子がとれたのかを塩基配列決定した。 hVH5a_2については hVHlaと配列が酷似しているため、 hV Hlaで増幅させたものと同様の遺伝子産物が得られることが予想されるためこれについては使用しなかった。 PCR産物は、フエノール処理後、エタノール沈殿して 10 L の TEバッファーに懸濁した。

[0254] 634 hum μ CH1R (配列番号： 426)： ATGGAGTCGGGAAGGAAGTC 各 VH familyの増幅に使用した primer

Human VH primer Sfil siteを下線で示す。

628 hVHla (配列番号： 427) :

GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC CAGGTGCAGCTGGTGCA GTCTGG

629 hVH2a (配列番号： 428)：

GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC CAGGTCAACTTAAGGGA GTCTGG

630 hVH3a (配列番号： 429)：

GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC GAGGTGCAGCTGGTGGA GTCTGG

631 hVH4a (配列番号： 430) :

GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC CAGGTGCAGCTGCAGGA GTCGGG

632 hVH5a (配列番号： 431) :

GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC CAGGTGCAGCTGTTGCA GTCTGC

633 hVH6a (配列番号： 432)：

GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC CAGGTACAGCTGCAGCA GTCAGG

629-2 hVH2a-2 (配列番号： 433) :

GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC CAGRTCACCTTGAAGGA GTCTGGTCC

631- 2 hVH4a-2 (配列番号： 434) :

GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC CAGGTGCAGCTACAGCA GTGGGG

632- 2 hVH5a-2 (配列番号： 435) :

GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC GAGGTGCAGCTGGTGCA GTCTGG

712 hVH7(配列番号： 436):

GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC CAGGTGCAGCTGGTGCA ATCTGGGTCTGAGT

Human JH primer BstPI, Xhol siteを下線で示す。

697 hJHl- 2(配列番号： 437):

GGTGGAGGCACTCGAGACGGTGACCAGGGTGC

698 hJH3 (配列番号： 438)：

GGTGGAGGCACTCGAGACGGTGACCATTGTCC

699 hJH4-5 (配列番号： 439)：

GGTGGAGGCACTCGAGACGGTGACCAGGGTTC

700 hJH6 (配列番号： 440)：

GGTGGAGGCACTCGAGACGGTGACCGTGGTCC

cDNA 2μL

10 X buffer #l(KODに添付） 10/zL

dNTP mix(2.0mM) lO^L

25mM MgC12 4μL

5'側プライマー (lOOpmol/ L) lμL

3'側プライマー (lOOpmol/ L) lμL

滅菌済 MilliQ 71 μL

KOD DNA polymerase (東洋紡 2.5U/ ^ L) lμL

PCR条件： 94°C 1分、 55°C 2分、 74°C 1分を 35サイクル

3-1-2重鎖遺伝子ライブラリーの作製

3-1-1で得た PCR産物を以下の条件で制限酵素処理した。

PCR産物 10 L

10 X K buffer (宝酒造） 5μL

滅菌済 MilliQ 33 μL

Sfil (NEBネ土 10 υ/μ lμL Xhol (宝酒造 12 Ό/ μ l μ L

37°Cで 2時間反応後、そのうち 10 L分をァガロース電気泳動し、 400bp付近のバンドを切り出して、ジーンクリーン IIキット (フナコシ株式会社)で精製した。 PCR産物と同様に制限酵素処理した pscFvCA-E8VHdをジーンクリーン IIキットで精製し、制限酵素処理した PCR産物と以下の条件で 16°Cで 4時間〜一晩反応させることによりライゲーシヨンした。

制限酵素処理した pscFvCA- E8VHd 2 μ L

制限酵素処理した PCR産物 1 μ L

10 X ligation buffer 1.5 μ L

(Τ4 DNA ligaseに添付）

10mM ATP 1.5 ,u L

滅菌済 MilliQ 8 μ L

T4 DNA ligase (宝酒造 10 U/ L)l L

[0256] 3-1-3ファージミドの大腸菌への導入

得られた DNAを大腸菌 DH12Sに形質転換した。具体的には DNAをー且エタノール沈殿し、 1/5TE TEを滅菌済 MilliQで 5倍希釈したもの) 3 Lに溶解する。そのうち、 1.5 μ Lをコンビテントセル DH12S(GIBCO BRL製) 20 μ Lに懸濁し、エレクト口ポレーシヨン法により形質転換を行った。

エレクト口ポレーター

BRL社 CeU— Porator(Cat.series 1600)

設定条件； voltage booster 4k Ω

capacitance 3ύ0 μ r

DC volts し ονν Ω

charge rate Fast

[0257] 形質転換用培地 (SOB) 2mLに上記操作の終了した形質転換大腸菌を植え、 37°C で 1時間振盪培養したあと、一部を寒天培地 (Ampプレート）にまき、残りは、 0.1%ダルコース、 100 g/mLアンピシリン含有 2 X YT培地で培養し、グリセリンストックした。寒天培地は 30°Cでインキュベートし、生えてきたコロニーを楊枝でつついて分離し、それぞれプラスミドを調製し、重鎖遺伝子の塩基配列を調べた。 VH1〜VH7の全てについてこれらのことを行い、目的のクローンが得られているかどうか確認した。これらの各グループ（ファミリー）のクローンを in vivoでの使用頻度に近、比率になるように混合して VHライブラリ一とした。 VHライブラリーにおける各ファミリーの構成比率を以下に示す。

[表 3]

^Griffith AD et al. EMBO J. (1994) 13, 3245-60.

**実際には VH1と VH5は同一のプライマーで増幅されるため、分離して集計できない。

***VH4プライマーで作製した cDNAと VH4-2プライマーで作製した cDNAを混合してこの割合とした。

3-2組み合わせ遺伝子ライブラリーの作製

VHライブラリー 200 /z gを下記条件で Hindlllと Xholで消化し、重鎖遺伝子を切り出して、ジーンクリーン IIキットで精製した。 VHライブラリー 200 μ_§ 100 L

10 ΧΚ buffer (宝酒造） 40 /zL

滅菌済 MilliQ 205 μ L

Hindlll (宝酒造 40 U/^L) 30 L

Xhol (宝酒造 50 U/^L) 25 μL

VLライブラリーの挿入されたベクター pscFvCA9-E8VHdVLdについても下記条件で Hindlllと Xholで消化し、軽鎖遺伝子を含む断片を、ジーンクリーン IIキットで精製した

VLライブラリーを挿入した pscFvCA9-E8VHdVLd 100 ^ g 100 L

10 XK buffer (宝酒造） 40 /zL

滅菌済 Milli- Q 230 μ L

Hindlll (宝酒造 40 U/^L) 15 μL

Xhol (宝酒造 50 U/^L) 15 μL

次に、 VH遺伝子ライブラリー断片と軽鎖遺伝子の挿入された pscFvCA9- E8VHdVL dベクターを、次の条件下、 16°Cでー晚反応させてライゲーシヨンした。

制限酵素処理した

VHライブラリー断片 lO^g 50 /zL

制限酵素処理した

VLライブラリーの断片

を含む pscFvCA9— E8VHdVLd 40;zg 50 μL

10 X ligation buffer

(T4 DNA ligaseに添付） 100 L

lOmM ATP 100 μ L

滅菌済 MilliQ 670 μ L

T4 DNA ligase (宝酒造 10 U/ L) 30 ^ L

反応の終了した DNAを用、て大腸菌 DH 12Sを形質転換した。具体的には DNAを一且エタノール沈殿し、 1/5TE(TEを滅菌済 MilliQで 5倍希釈したもの )30 Lに溶解した。これをコンビテントセル DH12S(GIBCO BRL製) 500 Lに懸濁し、エレクト口ポレーシヨンを行った。

[0261] エレクト口ポレーター

BRL社 CeU— Porator(Cat.series 1600)

設定条件； voltage booster 4k Ω

capacitance 3ύ0 μ r

DC volts し ονν Ω

charge rate Fast

[0262] 形質転換用培地 (SOB) 12mLに上記操作の終了した大腸菌を植え、 37°Cで 1時間振盪培養したあと、一部を寒天培地 (Ampプレート）にまき、残りは、 0.1%グルコース、 100 g/mLアンピシリン含有 2 X YT培地 500 mLで培養し、グリセリンストックした。寒天培地は 30°Cでインキュベートし、生えてきたコロニーの数力得られたクローンの数を推定した。 8.5 X 1010クローンが得られた。

[0263] 4. scFv-CL抗体遺伝子ライブラリーから scFv-CL抗体ファージライブラリーの作製

1。/₀グルコース及び _{100 μ} g/_mLのアンピシリンをカ卩えた 2 X YT培地 300mLを入れた 5リットルのフラスコ 16本に AIMS- 5懸濁液を 2.5mLを加え、 37°Cで振とう培養し 1時間おきに波長 600 における吸光度を測定しながら、吸光度が 1.0になるまで増殖させた。培養液にヘルパーファージ液 (M13K07)をフラスコ当たり 12mLカ卩えてヘルパーファージを感染させ、 37°Cで 2時間培養し、ヘルパーファージ感染済み DH12Sとした。

5リットルのフラスコ 24本に 2 X YT培地 600mLと 100 g/mLのアンピシリン 0.6mL 50 μ g/m 38Lのカナマイシン 0.8mL、ヘルパーファージ感染済み DH12S 200mLをカロえて 37°Cで 20時間振とう培養した。

[0264] 菌体は 4°Cで 8000rpm 10分間遠心し、上清を集めた。上清に 20%のポリエチレングリコール /2.5M NaCl 4Lを加えて約 20分間静かに攪拌した後、 4°Cで 8000rpm 2 0分間遠心、沈殿を 1Lの PBSで溶かし、 20%のポリエチレングリコール Z2.5M NaCl 2 00mLをカ卩えて約 20分間静か〖こ攪拌した後、 4°Cで 8000rpm 20分間遠心した。上清を捨ててさらに 4°Cで 8000rpm 3分間遠心して沈殿を回収した。沈殿は 0.05% NaN3 をカロえた PBSで溶解し、 4°Cで 1000rpm 15分間遠心し、上清を回収した後、 4°Cで 8 000rpm 3分間さらに遠心して上清を回収した。回収したファージ溶液の力価は以下のようにチェックした。すなわち、ファージ溶液を PBSで 106、 107、 108倍希釈し、その 10 Lを DH12S 990 Lに感染させ、 37°Cで 1 時間培養した。これを LBGAプレートに 100 L播いて 30°Cで 18時間培養した。コロニーの数をカウントすることにより希釈前の原液の力価を算出した。ファージ溶液原液を 0.05% NaN3を含む PBSに 2 X 1014/mLになるよう懸濁した。

[0265] 5.癌細胞特異的抗体クローンの取得

5-1 癌細胞株を使用したファージ抗体スクリーニング

各種癌細胞株或、は臨床検体に関するファージ抗体を以下の手順で単離した。用いた細胞株の種類は以下の通りである。各細胞株の培養条件は図 38の表に記載される。

脾癌細胞株 PANC- 1、 MIA-Paca2

腎臓癌細胞株 CCFRC1、 Caki- 1、 CCFRC1、 Caki- 1、 ACHN

卵巣癌細胞株 KF28、 RMG- 1、 RMG- 2、 SKOv3

胃癌細胞株 SNU- 5、 MKN45, NCI-N87

肺扁平上皮癌細胞株 RERF-LC-AI、 EBC1

肺腺癌細胞株 Calu-3、 NCI-H441, A549、 PC 14

肝細胞癌細胞株 HepG2、 OCTH、 Hep3B

肝細胞癌臨床検体 (HCV陽性)、

肝内胆管細胞癌細胞株 RBE

胃癌細胞株 SNU5、 MKN45, NCI-N87

大腸癌細胞株 CW2、 CaCo2

急性骨髄性白血病 AML臨床検体

[0266] 付着性細胞株群については 6ゥヱルプレート（Falcon 3516)において、 ATL由来細胞株などの浮遊細胞株は浮遊培養フラスコ（70ml (スラントネック)）において、培地 (R PMI- 1640 : Sigma- Aldrich社製、 10%ゥシ胎児血清、 1%ペニシリン一ストレプトマイシン溶液)を用い、 C02インキュベーター内、 37°Cで培養したものを使用した。

付着性細胞株は 2mg/ml collagenase I(Gibco BRL)/cell dissociation buffer(Gibco B RL)で培養皿から解離させたのち、 10%FBS/DMEMにて回収した。一方、浮遊系細胞の場合は一度培地を除くためにそのままの状態で遠心分離 (400xg, 4°C, 2分)した。このような操作の後、各細胞を 1%BSA, 0.05%NaN3/PBS(BSA液)にて洗浄し、遠心分離 (400xg, 4°C, 2分)し上清を除いた。

臨床組織材料に由来する臨床検体力の細胞の調製に関しては 6ゥエルプレート（

Falcon 3516)において、培地（RPMI- 1640 : Sigma- Aldrich社製、 10%ゥシ胎児血清、

1%ペニシリン一ストレプトマイシン溶液）を用い、 C02インキュベーター内、 37°Cで培養したものを使用した。

[0267] 細胞を冷却した PBSで洗い、細胞数 4x107をスクリーニングに使用した。これに 1x10 13cfoのヒト抗体ファージライブラリーを混ぜ、反応液の終濃度を 1%BSA- 0.1%NaN3/M EM、容積 1.6mlとし、 4°Cにて 4時間ゆっくり回転させて反応させた。反応終了後、反応液を二つに分け、それぞれを 0.6mlの有機溶液 (d¾utyl phtalate cycloheximide 9:1 )の上に重層し、マイクロ遠心機にて 3000rpmの遠心力を 2分間作用させ、細胞をチューブの底に沈降させた。それぞれのチューブについて、溶液を捨て、細胞を 0.7mlの 1%BSA/MEMで懸濁、 0.7mlの有機溶媒の上に重層して遠心した。この操作をもう一度繰り返したのち、溶液を捨て、細胞を 0.3mlの PBSで懸濁、液体窒素で凍結し、 37 °Cで融解した。

[0268] これを OD0.5の大腸菌 DH12S 20mlに 1時間感染させ、その一部をアンピシリンプレートに蒔いて回収されたファージの titerを算出した。ファージ感染大腸菌は 600mlの 2 xYTGA培地（2xYT, 200 μ g/ml ampicillin sulfate, 1% glucose)にて 30°Cで通夜培養した。この通夜培養 10mlを 2xYTA培地（2xYT, 200 μ g/ml ampicillin sulfate) 200mlと混ぜ、 37°Cにて 1時間培養後ヘルパーファージ K07を 1x1011入れ、 37°Cにて 1.5時間培養したのち、 800mlの 2xYTGAK(2xYT, 200 μ g/ml ampicillin sulfate, 0.05% gluco se, 50 μ g/ml kanamycin)を入れて 30°Cにて通夜培養した。これを 8000rpmにて 10分間遠心して上清 11を調製、それに 200mlの PEG液（20% polyetyleneglycol 6000, 2.5M NaCl)を混ぜてよくかきまぜたのち、 8000rpm 10分間の遠心を行いファージを沈殿させた。これを 10mlの PBS/0.05%NaN3に懸濁し、その一部を使用して大腸菌感染数を調べた。これが 1stスクリーニングのファージである。

2ndスクリーニングには細胞数 2x107と 1stスクリーニングファージ lxlOlOcfoを使用し、反応液の容積を 0.8mlとした。反応液は l%BSA-0.1%NaN3/MEMで、全体のスケールを 1 stスクリーニングと同量で行つた。

3rdスクリーニングは 2ndファージ 1x109 cfoを使用する以外は 2ndスクリーニングと同じ条件で行った。

ファージ回収率が上がった場合その時点でスクリーニングラウンドを終了とし回収率が上がらない場合 4th以降スクリーニングラウンドの場合も行うが、直前のラウンドで回収したファージを使用し、 1x109 cfoの量のファージを用い同様におこなった。

各種細胞株につ、てのスクリーニングも上記に対するスクリ一ユングと同様にして行つた o

[0269] 5-2 抗体クローンの選抜

HepG2でのスクリーニングを例に取るとスクリーニングラウンド 3rdスクリーニングで回収率が上がったことから（図 9)、この段階で HepG2細胞特異的な抗体クローンが濃縮されたと判断し、数百個のクローンをピックアップした。次にこれらの陽性のクローンについて、 H鎖部分の塩基配列解析を行い、塩基配列の種類力重複を除き取得した抗体を分類しこれらについて、抗体発現チェックを行い、さらに以下の手順で発現陽性のクローンを選択した。

[0270] 6.抗体クローンの塩基配列決定

スクリーニングによって得られた抗体ファージ感染大腸菌を希釈して、 100 /z g/mlの ampicillinの入った普通寒天培地に蒔き、得られるコロニーをピックアップして 2xYTG A培地にて 30°C通夜培養、クラボウの PI-50にて DNAを抽出、 dideoxy法で塩基配列を決定し、塩基配列の同一な重複クローンを除いた。また、この通夜培養 0.05mlを 1.2 mlの 2xYTAI(2xYT, 200 μ g/ml ampicillin sulfate,0.5mM IPTG)に植えて 30°Cにて通夜培養、マイクロ遠心機にて 15000rpm 5分間遠心して上清をとつた。

[0271] 7.抗体クローンの発現確認

7-1 抗体クローンの選択

抗体は cp3融合タンパクとして発現されるので、それを用いた発現検討を行った。即ち、まず前段落で得られた上清を Maxisorp(NUNC)に 37°Cにて 2時間反応させた後、液を捨て、 5%BSA/PBS/0.05%NaN3を 37°Cにて 2時間反応させてブロッキングを行つた。液を捨て、 0.05%Tween/PBSで 5000倍希釈したゥサギ抗 cp3抗体 (株式会社医学生物学研究所）を室温にて 1時間反応させた後 PBSで洗浄し、 0.05%Tween/PBSで 2000倍希釈した HRP標識ャギ抗ゥサギ IgG抗体 (株式会社医学生物学研究所)を室温にて 1時間反応させた後 PBSで洗浄し、 100 1の OPD液を室温にて 2〜10分反応させ、 2N硫酸にて反応を停止し、 SPECTRAmax 340PC (Molecular Devices)にて 492η mの吸光度を測定した。

上清を反応させな、ネガティブ wellをコントロールとし、その吸光度の 2倍以上にならないものは、発現していないと判断し、以後の解析からは除いた。

[0272] 7-2 抗体サンプルの調製

7-2-1 cp型抗体発現大腸菌の作製

発現していた抗体クローンに関して該当のファージ感染大腸菌 10mlを YTGAに植菌し、 30°Cにて一昼夜震盪培養した (前培養液)。これを 41の YT0.05GAに加え、 30°C にて培養した。菌の O.D.が 0.5になったとき、 1M IPTGを 4mlカ卩え、その後 30°Cにて一昼夜震盪培養した。培養終了後、冷却遠心機にて 10000g、 4°C、 10分間遠心し、得られた培養上清に等量の飽和硫酸アンモ-ゥム水溶液を加え、室温にて 1時間攪拌した。この溶液を冷却遠心機にて 10000g、 4°C、 15分間遠心したのち、上清を捨て、得られた沈澱を PBS-NaN3溶液 20mlにて懸濁したのち、冷却遠心機にて 10000g、 4°C、 5分間遠心し上清を回収した。これを PBSにて一昼夜透析した。これに、 0.05%NaN3/P BSにて平衡ィ匕したその上清抗 cp3マウスモノクローナル抗体 (株式会社医学生物学研究所)をィ匕学的に固定ィ匕セファロースビーズを用い、抗体ァフィユティーカラムを作成、上清を自然滴下させてビーズに反応しな力つた成分をパススルーさせた。この力ラムを PBS 100mlにて 2回洗浄したのち、 0.1%Tween20/PBS 30mlにて 4回洗浄、さらに PBS 100mlにて 2回洗浄した。これに 0.2M Glycine- HC1 pH3 4mlを 3回ゆっくり加えて溶出成分を回収したのち、 3M Tris 80 1を添カ卩して中和した (抗体溶液)。これを Ml LLEX-GP 0.22 mフィルタ一にて濾過した後 O.D.を測定し、抗体収量を求めた。

[0273] 7-2-2 pp型抗体発現大腸菌の作製

得られた抗体クローンは元々 cp3型である。この DNAをクラボウ H-50にて抽出し、制限酵素 Sailにて消化、自己再結合させたのち大腸菌 DH12Sに導入して形質転換したのち LBGAプレートに蒔いて 30°Cにて通夜培養、得られた大腸菌コロニーを 2xYTGA にて通夜培養し、卯型抗体発現大腸菌液を得た。

PP型の抗体クローンを発現するプラスミドを組み込んだ大腸菌 10mlを YTGAに植菌し、 30°Cにて一昼夜震盪培養した (前培養液)。これを 41の YT0.05GAに加え、 30°Cにて培養した。菌の O.D.が 0.5になったとき、 1M IPTGを 4mlカ卩え、その後 30°Cにて一昼夜震盪培養した。培養終了後、冷却遠心機にて 10000g、 4°C、 10分間遠心し、得られた培養上清に等量の飽和硫酸アンモ-ゥム水溶液を加え、室温にて 1時間攪拌した。この溶液を冷却遠心機にて 10000g、 4°C、 15分間遠心したのち、上清を捨て、得られた沈澱を PBS-NaN3溶液 20mlにて懸濁したのち、冷却遠心機にて 10000g、 4°C、 5 分間遠心し上清を回収した。これを PBSにて一昼夜透析した。これに、 0.05%NaN3/P BSにて平衡化した IgG sepharose 6 Fast Flow(AmershamBiosciences社） 2mlを添カロし 4°Cにて一昼夜震盪させながら反応させた。この混合液をカラムに移したのち自然滴下させてビーズに反応しなかった成分をパススルーさせた。このカラムを PBS 100ml にて 2回洗浄したのち、 0.1%Tween20/PBS 30mlにて 4回洗浄、さらに PBS 100mlにて 2 回洗浄した。これに 0.2M Glycine-HCl pH3 4mlを 3回ゆっくり加えて溶出成分を回収したのち、 3M Tris 80 μ 1を添カ卩して中和した（抗体溶液）。これを MILLEX- GP 0.22 μ mフィルタ一にて濾過した後 O.D.を測定し、抗体収量を求めた。

[0274] 8.抗体クローンの各種細胞株に対する反応性

8-1 FCM (フローサイトメトリー）解析

単離した各種抗体クローンの各種細胞株に対する反応性を以下の通り FCMで確認した。実験操作は次の通りとした。まず、付着性細胞株については 6ゥエルプレート (F alcon 3516)において、 ATL由来細胞株などの浮遊細胞株は浮遊培養フラスコ（70ml( スラントネック)）において、培地（RPMI-1640 : Sigma-Aldrich社製、 10%ゥシ胎児血清、 1%ペニシリン一ストレプトマイシン溶液）を用い、 C02インキュベーター内、 37°Cで培養したものを使用した。

[0275] i)付着性細胞株は 2mg/ml collagenase I(Gibco BRL)/cell dissociation buffer(Gibco BRL)で培養皿から解離させたのち、 10%FBS/D MEMにて回収した。一方、浮遊系細胞の場合は一度培地を除くためにそのままの状態で遠心分離 (400xg, 4°C, 2分)した。このような操作の後、各細胞を 2.5%BSA, 0.05%NaN3/PBS(BSA液)にて洗浄し、 2. 5% normal goat serum/BSA液 100 μ 1に懸濁して氷上に 30分静置した後、 106個/ well になるように分注し、遠心分離 (400xg, 4°C, 2分)し上清を除いた。

[0276] ii-l) cp3型抗体の場合、 5 /z g/mlになるようにカ卩えて、氷上に 1時間静置した。これを BSA液にて一度洗浄したのち、抗 cp3マウスモノクローナル抗体 (株式会社医学生物学研究所 ) 5 /z g/ml BSA液 100 1にて懸濁し、氷上に 1時間静置した。これを BSA 液にて一度洗浄したのち、 Alexa488結合抗マウス IgGャギ抗体（Molecularprobe社製 ) 5 g/ml BSA液 100 1にて懸濁し、氷上に 1時間静置した。これを BSA液にて二度洗浄したのち、 BSA液 500 μ 1にて懸濁し、固定液（ホルムアルデヒド）50 μ 1を添カロし、 10分静置した。その後 PBS 150 1添加し、セルストレイナー（Becton Dickinson社製）にて処理したのち、 Becton Dickinson社製 FACScaliver (FCM)にて細胞集団の蛍光強度を解析した ((1)〜(3))。

[0277] ii-2) pp型 (protein A型)抗体の場合、 5 μ g/mlになるように加えて、氷上に 1時間静置した。これを BSA液にて一度洗浄したのち、 Alexa488結合抗マウス IgGャギ抗体 (M olecularprobe社製） 5 g/ml BSA液 100 μ 1にて懸濁し、氷上に 1時間静置した。これを BSA液にて二度洗浄したのち、 BSA液 500 1にて懸濁し、固定液（ホルムアルデヒド） 50 1を添カ卩し、 10分静置した。その後 PBS 150 1添加し、セルストレイナー（Becto n Dickinson社製）にて処理したのち、 Becton Dickinson社製 FACScaliver (FCM)にて細胞集団の蛍光強度を解析した。

[0278] 本解析では検出抗体にあら力じめ蛍光色素 (Alexa488等）を標識しておき、サンプル抗体を細胞と反応させた後、検出抗体と反応させた。細胞の表面に存在する抗原量に応じて結合する抗体量に差が生じ、その結果蛍光強度が異なってくるため、その細胞の表面に存在する抗原との親和性及び抗原量を推定することができる。更に死細胞およびデブリス等を測定値から除去する為、前方散乱光 (Foward Scatter: FS C)を X軸に、側方散乱光 (Side Scatter: SSC)を Y軸にとり、ドットプロット展開から得られるデータより、生細胞と思われる集団 (培養細胞使用の為ほぼ同一集団）にゲートをかけ、このゲート内のみ蛍光強度の測定を行った。

[0279] 8-2 パネル作成 FCMの結果から、抗体結合量と細胞数との関係を表すヒストグラムを作成した。抗体結合量をパラメータとした 1パラメータ ·ヒストグラムを描ヽた。 1パラメータ ·ヒストグラムとは、フローサイトメトリーにおける表示法の 1種で、 1つの指標 (パラメータ）を X軸にとり、細胞数を Y軸にとって表示したグラフである。

FCMの結果の代表例を図 10〜12に示す。これらの図に示されるように、基本的には FCMの挙動は細胞と抗体の組み合わせによりユニークなものとなる。尚、図 10及び 11は、上記の方法で得られた scFv抗体と未分化悪性肝臓癌細胞株 HLFとの反応性を示すヒストグラム (右）と細胞蛍光染色像 (左)である。全ての抗体 (5種類）につ、て陽性パターンが得られて、るが、それぞれ非常に個性のある山の形を示して、る。この山の形状は抗原のェピトープの個性を反映していると思われる。図 12は複数のヒストグラム (使用した抗体が異なる）を重ねたものである。ヒストグラムの山がそれぞれ非常に個性的であることがわかる。し力しながら網羅的に FCM解析を続けていく中で、図 13〜 15に示すような類似性の極めて高、ヒストグラムを与える抗体群が認められた。また、図 16に示すように、どの細胞株を用いて FCM解析を行なっても一貫して類似性の高いヒストグラムを与える抗体群が認められた。図 16は 3種類の抗体 (035- 234抗体、 040-107抗体、 041-118抗体）について得られたヒストグラムを比較した図である。後の検討によって、これら三種類の抗体は全て ALCAMを認識していることが判明した。

図 17は FCM解析の結果を基に抗体群をグループィ匕する方法を示すものである。即ち、使用する細胞の種類に関わらず、 FCM解析での挙動（ヒストグラムの形状）が類似する複数の抗体を同一のグループとし、パネルイ匕する。尚、基本的には、ヒストグラムの形状が同一（重ね書きしたときに山が重なる）となる一群の抗体を一つのグループとするが、ヒストグラムの中央値、最頻値 (ピーク値）、尖度等の因子で基準を設定し、それに基づいてグループィ匕してもよい。

以上の手法に基づ、て、複数の抗体クローンを分類した。まず、使用した細胞株毎に、各抗体クローンにつ、て得られたヒストグラムを重ね書きすることによって各ヒストグラムを相互に比較し、抗体クローン間の類似性、及び抗体クローンの反応性を求めた。そして当該類似性及び反応性に基づき抗体クローンを分類し、表にまとめた（図 18)。このように 8個の抗体グループ（以下の説明では、表の上から順にグループ 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8とする）を得られた。尚、図 18では、後に同定された抗原の情報も表示している。表中の各記号は、ネガティブコントロール抗体が与えるヒストグラム（基準ヒストグラム）力ものシフト量を示す。◎はシフト量が 20倍以上であること（ヒストグラムのピーク値力基準ヒストグラムのピーク値の 20倍以上）、〇は同 10倍以上であること、△は同 3倍であること、 Xは同 3倍未満であることをそれぞれ示す (斜線はデータなし)。尚、シフト量が多いほど反応性が高いことになる。

次に、作成したパネルの各抗体群の抗原が共通してヽることを以下の手順で検証した。

9.抗体クローンが認識するタンパク質 (抗原)の同定

9-1 免疫沈降用固相化抗体の調製

まず、 pp型抗体溶液をカップリング緩衝溶液（0.1M NaHC03-NaOH pH9)にて透祈した。すなわち、抗体溶液を透析膜（Snake Skin Pleated Dialysis Tubing 10,000 M WCO)に封入し、これをカップリング緩衝溶液（0.1M NaHC03- NaOH pH9) 1.5Lに沈め、 4°Cでスターラーにて 2〜3時間撹拌したのち、緩衝溶液を交換して更に 2〜3時間透析した。その後もう一度緩衝溶液を交換して一昼夜透析した。

次に固相化に使用する活性化 CNBr-activated Sepharose 4Bを調製した。即ち、 A mersham Biosciences社製 CNBr- activated Sepharose 4Bを ImM HC1にて膨潤させた後、ァスピレーターで吸引した。これにカップリング緩衝溶液 50mlを添加し撹拌してからァスピレーターで吸引し、吸引したまま更にカツプリング緩衝溶液を加えた。

抗体の固相化は以下のようにして行った。即ち、 5mgの抗体溶液 10mlに対して活性化ゲル lmlをカ卩え、室温にて 2時間反応させた。反応終了後、ゲルをカラムに移し、力ップリング緩衝溶液 lmlにて 10回洗浄し、未反応抗体の有無を O.D.測定により確認した。固相化ゲルは、 0.2M Glycine-NaOH pH8溶液 5mlにて 2回置換し、さらに同液 5ml を添カ卩して室温にて 2時間静置したのち、液を自然滴下し、これに 0.2M Glycine- HC1 pH3 5mlを添カ卩して置換、さらに同液 5ml添カ卩し 5分間静置したのち自然滴下した。最後にカラムを PBS 20mlにて置換したのち自然滴下し、 1%NP40、プロテアーゼインヒビター、 0.05%NaN3/PBSを添カ卩してゲルを回収した。 [0282] 9-2 細胞膜上蛋白のピオチン標識および cell lysateの作製

培養肝癌細胞株のピオチン標識は以下のようにして行った。即ち、 5枚の 15cmディッシュにて培養した培養細胞 HLFを PBSにて 2回洗浄したのち、 cell dissociation buff er(GIBCO社製)にて 5mg/ml濃度に調整した collagenaseKGIBCO社製)をカ卩えて、 CO 2インキュベータ一にて 37°Cで反応させ、細胞を遊離させたのち、培地にて回収し、これを PBS (-)にて 2回洗浄したのち、血球計算盤にて細胞数を算出し、約 5xl07/mlになるよう PBS (-)にて懸濁した。これに PBSにて lmg/mlになるように調整した EZ-Link Su lfo-NHS-LC-Biotinylation Kit (PIERCE社）を等量カ卩え、室温にて 30分静置したのち、 PBSにて 2回洗浄した。

ピオチン標識細胞についての cell lysateは以下のように調製した。即ち、上記のビォチン標識細胞に 4mlの lysis buffer(l% NP40/detergent base solution, detergent bas e solutionの組成は 20mM HEPES pH8.0, 140mM NaCl,プロテアーゼインヒビター)を加え、細胞を懸濁し、これを冷却しておいたダウンスホモジナイザーに入れてホモジナイズしたのち、溶液に 1/2量 (2ml)の detergent mix solution (1%NP40, tritonX- 100,b — D— Maltoside'n— Octyl b— D— Glucoside, ,n— Octyl b— D— Maltoside, ,n— Decyl b— D— Mai toside,デォキシコール酸各 0.5%/detergent base solution)をカ卩え 4°Cにて 4時間回転混和した。この溶液を 100,000rpmにて 30分間遠心したのち MILLEX- GP 0.22 μ mフィルターにて濾過した。

[0283] 9-3 免疫沈降反応

まず、固相化された抗体 (以降、抗体ビーズと表記)約 60 1分 (溶液として約 150 1 )を 2mlチューブに入れ、そこに 4mM biotinを 1/10 volume (15 μ 1程）添加した。これに、培養皿 0.5枚分の lysate (600 μ 1)と 60 μ 1の biotin液を混合したものをカ卩え、 4°Cにて撹拌させながら数時間反応させた後、チューブを遠心 (5500g,l分， 4°C)し、上清を除いた。これに洗浄用 biotin/lysis- T buffer(0.5mM biotin, 0.1%Tween20/PBS)を 800 1 加え、転倒混和を 2、 3回行ったのち、チューブを遠心 (5500g, 1分， 4°C)し、上清を除いた。この洗浄操作を再度行った後、抗体ビーズに溶出用クェン酸液 (50mMタエン酸 PH2.5)を 30 1カ卩え、撹拌したのち、チューブを遠心（5500g, lmin, 4°C)し、上清を回収した。残った抗体ビーズに再度溶出用クェン酸溶液を 30 1加え、撹拌し、チユーブを遠心 (5500g, lmin, 4°C)し、上清を回収した。この溶出操作をさらに 3回繰り返してサンプル溶液を回収し、それに 3M Trisをカ卩えて中和した。このサンプルを SDS -PAGEにて泳動し、銀染色にてバンドの確認を行った。このサンプルについては、同時にストレプトアビジン一 HRP(Anti- Streptavidin, IgG Fraction, Conjugated to Perox idase CORTEX biochem社）を使用したウェスタンブロットを行いビォチン化された膜蛋白のバンドを検出した。

[0284] 9-4 切り出されたバンドについてのマススペクトル解析

9-4-1 ゲル内トリプシン消化

検出された膜蛋白に対応する部分をゲル内でトリプシン消化し、ペプチドを回収した。 SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動を常法に従い行い、クマシ一ブリリアントブルーで染色することで得られたバンドを切り出した。これを 200mM重炭酸アンモ-ゥム -50%ァセトニトリル溶液に浸し、 37°Cで 45分間振盪後、溶液を廃棄して、同じ操作を 2回繰り返すことでクマシ一ブリリアントブルーを除いた。このゲルを減圧乾燥し、それに 40mM重炭酸アンモ-ゥム (pH8.1)-10%ァセトニトリルに溶かしたトリプシン（20 μ g /ml)をゲルスライスの単位面積 (mm2)あたり 4 μ 1加えて、室温で 1時間置!、て充分に浸潤させた。これに先にカ卩えた量の 2.5倍量のトリプシン溶液をカ卩えて、 37°Cで 18時間静置した。これをポアサイズが 0.22 μ mのフィルター付きチューブで濾過して、トリプシンにより抗原が切断されて生じたペプチドを回収した。

[0285] 9-4-2 質量分析による抗原の同定

ゲル内トリプシン消化により得られた試料を、エレクトロスプレーイオンィ匕方式イオントラップ四重極型質量分析装置につないだ HPLCにかけた。 HPLCの逆相クロマトダラフィ一力ラムから、 0.1%TFAを含む 0%から 80%のァセトニトリルの直線濃度勾配変化により、疎水性の違!、で順次溶出される各ペプチドをエレクトロスプレー法でイオンィ匕し、各ペプチドの質量を分析した。

[0286] 同時に、それらのイオンの飛行経路の途中に置いたヘリウム原子との衝突により生じる各ペプチドの限定分解産物の質量を分析した。限定分解によりひとつのアミノ酸がはずれると、はずれたアミノ酸の質量分だけ小さいイオンが観測されるので、その質量差によりはずれたアミノ酸の種類を同定できる。さらにもうひとつアミノ酸がはずれると、はずれたアミノ酸の質量分だけ小さいイオンが観測されるので、その質量差によりはずれたアミノ酸の種類を同様に同定できる。同様の実験データ解析を進めることで、内部アミノ酸配列を決定することができる。得られたアミノ酸内部配列のセットを、公開されているアミノ酸配列データベースを用いて検索することにより、抗原の同定を行った。その結果、以下に示す通り、各抗体クローンの抗原が同定され、同一のグループの抗体は抗原が共通することが確認された。尚、同定結果は、同定された蛋白質のアミノ酸配列力も類推される総質量が、トリプシン分解を行う前の抗原の SD Sポリアクリルアミド電気泳動の結果により得られる分子量の実験データと矛盾しないことで、確認された。

グループ 1に属する抗体の抗原： HER1 (別名： ErbBl、 c-erbB- 1、 EGFR (Epidermal

Growtn r actor Receptor)、 v-eroB)

グループ 2に属する抗体の抗原： HER-2 (別名： ErbB2、 c-erbB-2、 neu)

グループ 3に属する抗体の抗原： CD46抗原（別名： MCP (membrane cofactor protei n)、 gp45- 70、 HuLY- m5、 measles virus receptor ^ MIC10、 TLX- B antigen ^ TRA2、 tr ophoblast leucocyte common antigen ^ trophoblast— lymphocyte cross-reactive antige n)

グループ 4に属する抗体の抗原： ITGA3 (integrin alpha3) (別名： alpha3betal Epilig rin Receptor alpha3betal Integrm、 Epiligrin Receptor CD49c、 VLA— 3、 Gap b3、 ua lactoprotein b3、 Laminin- 5 Receptor )

グループ 5に属する抗体の抗原： ICAM1 (Intercellular adhesion molecule- 1) (別名： Intercellular Adhesion Molecule 1、 CD54 Antigen)

グループ 6に属する抗体の抗原： ALCAM (Activaed leukocyte cell adhesion molecu le) (別名： KG— CAM、 CD166 Antigen, CD6 Ligand、 Activated Leukocyte Cell Adhe sion Molecule^ Neurolin

グループ 7に属する抗体の抗原： CD147抗原（別名： BSG、 TCSF (Tumor cell-deriv ed collagenase stimulatory factor;、 5ト protein、 OK blood group protein basigin pr otein、 collagenase stimulatory factor protein EMMPRIN (Extracellular matrix metall oproteinase Inducer)、 M6 activation antigen human leukocyte activation antigen M 6)

グループ 8に属する抗体の抗原： IgSF4 (別名： BL2、 ST17、 NECL2、 TSLC1、 IGSF4 A、 SYNCAM、 sTSLC-1)

[0287] 以上の同定結果より、 HER1に対する抗体クローンを 3個（048-006抗体、 057-091抗体、 059-152抗体）、 HER-2に対する抗体クローンを 1個（015-126抗体）、 CD46抗原に対する抗体クローンを 7個（035- 224抗体、 045- 011抗体、 051- 144抗体、 052-053 抗体、 052-073抗体、 053-049抗体、 3172-120抗体）、 ITGA3に対する抗体クローンを 1個（015-003抗体）、 ICAM1に対する抗体クローンを 5個（052-033抗体、 053-042抗体、 053-051抗体、 053-059抗体、 053-085抗体）、 ALCAMに対する抗体クローンを 5 個（035- 234抗体、 040- 107抗体、 041- 118抗体、 066- 174抗体、 083- 040抗体）、 CD 1 47抗原に対する抗体クローンを 1個（059-053抗体）、 IgSF4に対する抗体クローンを 1 0個、取得できたことが明ら力となった。尚、以下の通り各抗体クローンのアミノ酸配列が同定された (IgSF4に対する抗体クローンは省略)。

[0288] <グループ 1の抗体 >

(1) 048- 006抗体

配列番号： 1(VH)、配列番号： 2(VH CDR1)、配列番号： 3(VH CDR2)、配列番号： 4 (VH CDR3)、配列番号： 5(VL)、配列番号： 6(VL CDR1)、配列番号： 7(VL CDR2)、配列番号： 8(VL CDR3)

(2) 057-091抗体

配列番号： 9(VH)、配列番号： 10(VH CDR1)、配列番号： 11(VH CDR2)、配列番号： 12(VH CDR3)、配列番号： 13(VL)、配列番号： 14(VL CDR1)、配列番号： 15(V L CDR2)、配列番号： 16(VL CDR3)

(3) 059-152抗体配列番号： 17(VH)、配列番号： 18(VH CDR1)、配列番号： 19(VH CDR2)、配列番号： 20(VH CDR3)、配列番号： 21(VL)、配列番号： 22(VL CDR1)、配列番号： 23(VL CDR2)、配列番号： 24(VL CDR3)

[0289] <グループ 2の抗体 >

(1)015- 126抗体

配列番号： 25(VH)、配列番号： 26(VH CDR1)、配列番号： 27(VH CDR2)、配列番号： 28(VH CDR3)、配列番号： 29(VL)、配列番号： 30(VL CDR1)、配列番号： 31(V L CDR2)、配列番号： 32(VL CDR3)

<グノレープ 3の抗体 >

(1) 035- 224抗体

配列番号： 33(VH)、配列番号： 34(VH CDR1)、配列番号： 35(VH CDR2)、配列番号： 36(VH CDR3)、配列番号： 37(VL)、配列番号： 38(VL CDR1)、配列番号： 39(V L CDR2)、配列番号： 40(VL CDR3)

(2) 045-011抗体

配列番号： 41(VH)、配列番号： 42(VH CDR1)、配列番号： 43(VH CDR2)、配列番号： 44(VH CDR3)、配列番号： 45(VL)、配列番号： 46(VL CDR1)、配列番号： 47(V L CDR2)、配列番号： 48(VL CDR3)

(3) 051- 144抗体

配列番号： 49(VH)、配列番号： 50(VH CDR1)、配列番号： 51(VH CDR2)、配列番号： 52(VH CDR3)、配列番号： 53(VL)、配列番号： 54(VL CDR1)、配列番号： 55(V L CDR2)、配列番号： 56(VL CDR3)

(4) 052-053抗体

配列番号： 57(VH)、配列番号： 58(VH CDR1)、配列番号： 59(VH CDR2)、配列番号： 60(VH CDR3)、配列番号： 61(VL)、配列番号： 62(VL CDR1)、配列番号： 63(V L CDR2)、配列番号： 64(VL CDR3)

(5) 052-073抗体

配列番号： 65(VH)、配列番号： 66(VH CDR1)、配列番号： 67(VH CDR2)、配列番号： 68(VH CDR3)、配列番号： 69(VL)、配列番号： 70(VL CDR1)、配列番号： 71(V L CDR2)、配列番号： 72(VL CDR3)

(6) 053-049抗体

配列番号： 73(VH)、配列番号： 74(VH CDR1)、配列番号： 75(VH CDR2)、配列番号： 76(VH CDR3)、配列番号： 77(VL)、配列番号： 78(VL CDR1)、配列番号： 79(V L CDR2)、配列番号： 80(VL CDR3)

(7) 3172- 120抗体配列番号： 81(VH)、配列番号： 82(VH CDR1)、配列番号： 83(VH CDR2)、配列番号： 84(VH CDR3)、配列番号： 85(VL)、配列番号： 86(VL CDR1)、配列番号： 87(V L CDR2)、配列番号： 88(VL CDR3)

[0291] <グループ 4の抗体 >

(1)015- 003抗体

配列番号： 89(VH)、配列番号： 90(VH CDR1)、配列番号： 91(VH CDR2)、配列番号： 92(VH CDR3)、配列番号： 93(VL)、配列番号： 94(VL CDR1)、配列番号： 95(V L CDR2)、配列番号： 96(VL CDR3)

[0292] <グループ 5の抗体 >

(1) 052-033抗体

配列番号： 97(VH)、配列番号： 98(VH CDR1)、配列番号： 99(VH CDR2)、配列番号： 100(VH CDR3)、配列番号： 101(VL)、配列番号： 102(VL CDR1)、配列番号： 1 03(VL CDR2)、配列番号： 104(VL CDR3)

(2) 053-042抗体

配列番号： 105(VH)、配列番号： 106(VH CDR1)、配列番号： 107(VH CDR2)、配列番号： 108(VH CDR3)、配列番号： 109(VL)、配列番号： 110(VL CDR1)、配列番号： 111(VL CDR2)、配列番号： 112(VL CDR3)

(3) 053-051抗体

配列番号： 113(VH)、配列番号： 114(VH CDR1)、配列番号： 115(VH CDR2)、配列番号： 116(VH CDR3)、配列番号： 117(VL)、配列番号： 118(VL CDR1)、配列番号： 119(VL CDR2)、配列番号： 120(VL CDR3)

(4) 053-059抗体

配列番号： 121(VH)、配列番号： 122(VH CDR1)、配列番号： 123(VH CDR2)、配列番号： 124(VH CDR3)、配列番号： 125(VL)、配列番号： 126(VL CDR1)、配列番号： 127(VL CDR2)、配列番号： 128(VL CDR3)

(5) 053-085抗体

配列番号： 129(VH)、配列番号： 130(VH CDR1)、配列番号： 131(VH CDR2)、配列番号： 132(VH CDR3)、配列番号： 133(VL)、配列番号： 134(VL CDR1)、配列番号： 135(VL CDR2)、配列番号： 136(VL CDR3)

[0293] <グループ 6の抗体 >

(1) 035- 234抗体

配列番号： 137(VH)、配列番号： 138(VH CDR1)、配列番号： 139(VH CDR2)、配列番号： 140(VH CDR3)、配列番号： 141(VL)、配列番号： 142(VL CDR1)、配列番号： 143(VL CDR2)、配列番号： 144(VL CDR3)

(2) 040-107抗体

配列番号： 145(VH)、配列番号： 146(VH CDR1)、配列番号： 147(VH CDR2)、配列番号： 148(VH CDR3)、配列番号： 149(VL)、配列番号： 150(VL CDR1)、配列番号： 151(VL CDR2)、配列番号： 152(VL CDR3)

(3) 041-118抗体

配列番号： 153(VH)、配列番号： 154(VH CDR1)、配列番号： 155(VH CDR2)、配列番号： 156(VH CDR3)、配列番号： 157(VL)、配列番号： 158(VL CDR1)、配列番号： 159(VL CDR2)、配列番号： 160(VL CDR3)

(4) 066-174抗体

配列番号： 161(VH)、配列番号： 162(VH CDR1)、配列番号： 163(VH CDR2)、配列番号： 164(VH CDR3)、配列番号： 165(VL)、配列番号： 166(VL CDR1)、配列番号： 167(VL CDR2)、配列番号： 168(VL CDR3)

(5) 083-040抗体

配列番号： 169(VH)、配列番号： 170(VH CDR1)、配列番号： 171(VH CDR2)、配列番号： 172(VH CDR3)、配列番号： 173(VL)、配列番号： 174(VL CDR1)、配列番号： 175(VL CDR2)、配列番号： 176(VL CDR3)

[0294] <グループ 7の抗体 >

(1)059-053抗体

配列番号： 177(VH)、配列番号： 178(VH CDR1)、配列番号： 179(VH CDR2)、配列番号： 180(VH CDR3)、配列番号： 181(VL)、配列番号： 182(VL CDR1)、配列番号： 183(VL CDR2)、配列番号： 184(VL CDR3)

[0295] 10. RNAi及び免疫染色による抗原確認単離した抗体が、同定された抗原を認識してヽることを再確認することを目的として、二重鎖オリゴ RNAを細胞に作用させて抗原遺伝子ノックダウンを行い、その細胞に対する当該単離抗原同定抗体の免疫染色性を調べた。

まず、細胞を 6well培養皿にて培養し、約 30%コンフルになるよう準備した。これにリポフエクタミン 2000 (Invitrogen社製）を 5 μ 1と下記のオリゴ RNA lOOpmolを混ぜたものを作用させ、 2日後に細胞をコラゲナーゼではがして回収し、これに cp3型の検証用精製抗体を 5 g/mlの濃度で作用させた。洗浄したのち、ゥサギ抗 cp3抗体を 2 g/m 1濃度で作用させた。洗浄後、 Alexa488標識抗ゥサギ IgGを 2 g/mlで作用させた。これを洗浄したのち OptiLyse (NOTECH社製）50 1にて 10分間固定し、 PBS 1mlをカロえて希釈し、これを FACS Caliver(Beckmann社製）にて測定した。抗体反応液及び洗浄は 2.5% BSA/PBS液を使用した。

[0296] 対象抗原： CD147

使用したオリゴ RNAの配列： CAGAGCUACACAUUGAGAACCUGAA (配列番号： 4 41)

対象細胞：腎淡明細胞癌 CCFRC1細胞

検証抗体： 059-053cp3抗体

[0297] 対象抗原： CD 166

使用したオリゴ RNAの配列： UACCUAUGUGCAGAGGAAUUAUGAU (配列番号： 4 42)

対象細胞：腎淡明細胞癌 CCFRC1細胞

検証抗体： 035-234cp3抗体

[0298] 対象抗原： HER1

使用したオリゴ RNAの配列： GCAACCAUCUAAACCUGAAAUUGUA (配列番号： 4 43)

対象細胞：肝細胞癌 HLF細胞

検証抗体： 048-006cp3抗体

[0299] 対象抗原： HER2

使用したオリゴ RNAの配列： UAAUAGAGGUUGUCGAAGGCUGGGC (配列番号： 444)

対象細胞：卵巣癌 SKOv-3細胞

検証抗体： 015- 126cp3抗体

[0300] 対象抗原： IgSF4

使用したオリゴ RNAの配列： CCCAACAGGCAGACCAUUUAUUUCA (配列番号： 4 45)

対象細胞：肝細胞癌 HLF細胞

検証抗体： 035-273cp3抗体

[0301] 結果を図 19〜23に示す。図 19は CD147を対象抗原とした RNAiの結果、図 20は C D166を対象抗原とした RNAiの結果、図 21は HER1を対象抗原とした RNAiの結果、図 22は HER2を対象抗原とした RNAiの結果、図 23は IgSF4を対象抗原とした RNAiの結果である。これらの結果から明らかなように、いずれの検証抗体についても、 RNAiを行った細胞集団では、 RNAiを行わな力つた細胞集団に比較して、抗体による染色性 (即ち反応性)が著しく低下していた。このように、対応する抗原をノックダウンするオリゴ RNAを用いた RNAi実験によって、単離した各抗体が、同定された抗原を認識していることが再確認された。

[0302] 11.細胞染色及び組織染色による、各抗体の反応性の検討

11-1 実験方法

(1)細胞染色

糸田胞 i3~2mg/ml coliagenase I(Gibco BRL)/ cell dissociation buifer(uioco BRL)で; ¾· 養皿から解離させたのち、 10%FBS/DMEMにて回収し、 1x105を使用した。これを 2.5% BSA, 0.05%NaN3/PBS(BSA液)にて洗浄したのち、 2.5% normal goat serum/BSA液 10 0 /z 1に懸濁して氷上に 30分静置したのち、 cp3型抗体を 5 /z g/mlになるようにカ卩えて、氷上に 1時間静置した。これを BSA液にて一度洗浄したのち、抗 cp3マウスモノクロ一ナル抗体 (株式会社医学生物学研究所 ) 5 g/ml BSA液 100 1にて懸濁し、氷上に 1 時間静置した。これを BSA液にて一度洗浄したのち、 ALEXA488結合抗マウス IgGャギ抗体 (Molecularprobe社製） 5 g/ml BSA液 100 μ 1にて懸濁し、氷上に 1時間静置した。これを BSA液にて二度洗浄したのち、上清を捨て、これにベックマン'コールタ一社製 OptiLyse B 50 1をカ卩えて室温にて 10分間静置し、細胞を固定した。これに 1 ng DAPI/BSA液 950 /z 1をカ卩え、室温にて 10分静置、遠心して細胞を集め、 ICN社製 MULTITEST SLIDEに封入して顕微鏡観察した。

(2)組織染色

(2-1)抗体サンプルの調製

大腸菌通夜培養液 0.5mlを 6mlの 2χΥΤΑΙ(2χΥΤ, , 200 μ g/ml ampicillin sulfate,0.5m M IPTG)に植えて 30°Cにて通夜培養、マイクロ遠心機にて lOOOOrpm 5分間遠心して上清を回収した。これに等量の飽和硫安をカ卩えて室温に 30分静置したのち、室温にて lOOOOrpm 5分間遠心して上清を捨て、得られた沈殿物を 0.6mlの PBS_0.05%NaN3, complete液にて懸濁、 4°Cにて 15000rpm 5分間遠心して上清を回収した。

(2-2)切片作製

摘出された組織は 5mm X 5mm X 10mmほどの大きさにし、 4°Cの 4%PFA/0.01%グルタールアルデヒド /0.1M力コジル酸バッファーに入れ（PFAは和光純薬、グルタールァルデヒドは関東化学、力コジル酸ナトリウムは SIGMA)、電子レンジ（SHARP)を用いてマイクロウエーブ固定した後に、同固定液にて 4°Cで 1時間再固定した。それから 10% sucrose/PBSに移し 4°Cにて 4時間浸漬後、 15%sucrose/PBSに置換して 4°Cにて 4時間浸漬したのち、 20%/sucrose/PBSに置換して 4°Cにて一晚浸漬させ、 OTC compou ndにて包埋、ドライアイス 'へキサン中で急速に凍結した。これを、クリオスタツト（Reich ert-Jung 2800 FRIGCUT E)にて 4 mの厚さに薄切し，シランコートスライドガラス（ MATSUNAMI)に貼り付け、冷風ドライヤーにて 30分風乾した。

(2-3)染色

切片を貼付したスライドガラスは、 PBS中で 5分間ずつ 3回浸漬して親水化した。次に 50 1の 0.3%H2O2/0.1%NaN3を滴下し、室温にて 10分間反応させて内因性ペルォキシダーゼのブロッキングをおこなった後、 PBSで 5分間ずつ 3回洗浄した。そして 2 %BSA/PBS中で室温で 10分間反応させ、非特異反応のブロッキングをした。その後、余分な液を落としたところへ抗体サンプル 50 1を滴下し、室温にて 1時間反応させたのち、 PBSで 5分間ずつ 3回洗浄した。次に、 50 1の抗 CP3ゥサギ抗体 5 g/mlを滴下し、室温にて 45分間二次抗体反応させたのち、 PBSで 5分間ずつ 3回洗浄した。そして 50 μ 1のパーォキシダーゼ標識デキストラン結合抗ゥサギィムノグロブリン ·ャギポリクローナル抗体 (DAKO)を滴下して、室温にて 30分間三次抗体反応を行った。これを PBSで 5分間ずつ 3回洗浄したのち、 50 1の0 8'1"[202発色液を滴下し、褐色に発色後、蒸留水を満たしたバットに移して反応を停止させた。その後 10分間水洗したのち、へマトキシリンによる核染後、脱水'透徹し、マリノールにて封入し、鏡検した。

[0304] 11-2 実験結果

(1)抗 HER1抗体群（グループ 1)

細胞株染色 (含む FACS)で陽性を示した癌種：脾癌細胞株 PANC-1、腎臓癌細胞株 CCFRC1、腎臓癌細胞株 Caki- 1、卵巣癌細胞株 KF28、胃癌細胞株 SNU- 5、肺扁平上皮癌細胞株 RERF-LC-AI、卵巣癌細胞株 RMG-1、未分化型肝細胞癌細胞株 H LF、卵巣癌細胞株 SKOv3、肺腺癌細胞株 PC14、腎臓癌細胞株 ACHN、肺扁平上皮癌細胞株 EBC1、外陰部粘膜上皮細胞株 A431、肺腺癌細胞株 H1373、肝細胞癌細胞株 HepG2、腎臓癌臨床検体榭立細胞株

細胞株染色 (含む FACS)で陰性を示した癌種：乳癌細胞株 BT474、ハムスター卵巣癌細胞株 CHO

組織染色で陽性を示した癌種:腎臓癌、肝細胞癌、肝内胆管細胞癌、肺扁平上皮癌、肺腺癌、脾臓癌

[0305] (2)抗 HER2抗体群（グループ 2)

細胞株染色 (含む FACS)で陽性を示した癌種：肺腺癌細胞株 Calu-3、卵巣癌細胞株 SKOv3、乳癌細胞株 BT474

細胞株染色 (含む FACS)で陰性を示した癌種：肝細胞癌細胞株 HLF、肺腺癌細胞株 PC 14、腎臓癌細胞株 ACHN、腎臓癌細胞株 293T、ハムスター卵巣癌細胞株 CHO 、腎臓癌細胞株 Caki_l、腎臓胃癌細胞株 CCFRC1、腎臓癌臨床検体榭立細胞株

[0306] (3)抗 CD46抗体群

細胞株染色 (含む FACS)で陽性を示した癌種：大腸癌細胞株 CaCo2、胃癌細胞株 MKN45,未分化型肝細胞癌細胞株 HLF、肝臓癌細胞株 HepG2、肝内胆管細胞癌細胞株 RBE、脾臓癌細胞株 PANC1、腎臓癌細胞株 CCFRC1、腎臓癌細胞株 Caki-1、肺腺癌細胞株 NCH"I441、肺扁平上皮癌 EBC1、胃癌細胞株 NCト N87、胃癌細胞株 SNU- 5、肺扁平上皮癌細胞株 RERF-LC-AI、肝細胞癌臨床検体、乳癌細胞株 BT47 4、腎臓癌細胞株 293T、肺腺癌細胞株 PC 14、腎臓癌細胞株 ACHN、肺腺癌細胞株 H1373

細胞株染色 (含む FACS)で陰性を示した癌種：ハムスター卵巣癌細胞株 CHO、外陰部粘膜上皮細胞株 A431

組織染色で陽性を示した癌種:腎臓癌、肝細胞癌、肝内胆管細胞癌、肺腺癌、脾癌

尚、これまでに CD46抗原との関連性について特別の報告のない肝内胆管細胞癌及び脾臓癌においても CD46抗原の特異的な発現が認められた。

[0307] (4)抗 ITGA3抗体群（グループ 4)

細胞株染色 (含む FACS)で陽性を示した癌種：未分化型肝細胞癌細胞株 HLF、卵巣癌細胞株 SKOv3、腎臓癌細胞株 ACHN、腎臓癌細胞株 Caki-1、肺腺癌細胞株 HI 373、肺扁平上皮癌 EBC1、外陰部粘膜上皮細胞株 A431、乳癌細胞株 BT474、肺腺癌細胞株 PC14、腎臓癌細胞株 CCFRC1、肝細胞癌細胞株 OCTH、肝内胆管細胞癌細胞株 RBE、脾臓癌細胞株 PANC- 1、脾臓癌細胞株 MIA- Paca2、肺腺癌細胞株 A54 9、肺腺癌細胞株 NCI-N441、肺腺癌細胞株 Calu-3、肺扁平上皮癌細胞株 RERF-LC -AI、胃癌細胞株 SNU5、胃癌細胞株 MKN45、胃癌細胞株 NCト N87、大腸癌細胞株 CW2、卵巣癌細胞株 SKOv3、卵巣癌細胞株 KF-28、卵巣癌細胞株 RMG-1、卵巣癌細胞株 RMG-2

細胞株染色 (含む FACS)で陰性を示した癌種：腎臓癌細胞株 293T、肝細胞癌細胞株 HepG2、ハムスター卵巣癌細胞株 CHO

組織染色で陽性を示した癌種:肝内胆管細胞癌、脾臓癌

尚、これまでに ITGA3との関連性について特別の報告のない胆肝癌及び脾臓癌にぉ、ても ITGA3の特異的な発現が認められた。

[0308] (5)抗 ICAM1抗体群（グループ 5)

細胞株染色 (含む FACS)で陽性を示した癌種：肝癌細胞株 HepG2、肺腺癌細胞株 PC14、腎臓臨床検体より榭立した細胞株

細胞株染色 (含む FACS)で陰性を示した癌種：未分化型肝細胞癌細胞株 HLF、卵巣癌細胞株 SKOv3、乳癌細胞株 BT474、腎臓癌細胞株 293T、腎臓癌細胞株 ACHN 、腎臓癌細胞株 Caki-1、肺腺癌細胞株 PC 14、腎臓癌細胞株 CCFRC1、ハムスター卵巣癌細胞株 CHO

組織染色で陽性を示した癌種：肝細胞癌

[0309] (6)抗 ALCAM抗体群（グループ 6)

細胞株染色 (含む FACS)で陽性を示した癌種:肝癌細胞株 HepG2、 OCTH、 Hep3 B、及び HLF、腎臓癌細胞株 Caki- 1、 CCFRC1、 ACHN, 293T、及び臨床検体より榭立した細胞株、肺癌細胞株 PC 14、 NCI-H441, EBC- 1、 RERF- LC-AI、 A549、及び H 1373、卵巣癌細胞株 SKOv3、 KF-28、 RMG1、及び RMG2、胃癌細胞株 NCI-N87、大腸癌細胞株 CW2、乳癌細胞株 BT474、急性骨髄性白血病 AML臨床検体、ハムスタ一卵巣癌細胞株 CHO

細胞株染色 (含む FACS)で陰性を示した癌種：外陰部粘膜上皮細胞株 A431 組織染色で陽性を示した癌種:腎臓癌、肝細胞癌、肝内胆管細胞癌、肺扁平上皮癌、肺胞上皮癌、大腸腺癌

尚、これまでに ALCAMとの関連性について特別の報告のない腎臓癌、肝細胞癌及び胆肝癌においても ALCAMの特異的な発現が認められた。

[0310] (7)抗 CD147抗体群（グループ 7)

細胞株染色 (含む FACS)で陽性を示した癌種：肝臓癌細胞株 HepG2、腎臓癌細胞株 CCFRC1、腎臓癌細胞株 ACHN、腎臓癌細胞株 Caki- 1、肺腺癌 PC14、腎臓癌臨床検体より榭立細胞株

細胞株染色 (含む FACS)で陰性を示した癌種：ハムスター卵巣癌細胞株 CHO 組織染色で陽性を示した癌種:腎臓癌

尚、これまでに CD 147抗原との関連性にっ、て特別の報告のない腎臓癌にお！、ても CD 147の特異的な発現が認められた。

[0311] 12. IgG型抗体への変換

12-1 IgG型抗体遺伝子の構築

抗体医薬としての有効性を探るため、一部の抗体を IgG型へ変換した。まず、 scFVcp3型抗体の VH、 VL遺伝子を用い、それを IgGlの Fc領域と遺伝子の塩基配列内にクローユングする際必要な制限酵素サイトが無いことを確認した。抗体遺伝子を铸型とし、 H鎖と L鎖増幅用プライマーを用い、 PCRを行った。増幅産物を IgGl construction vectorの CMVプロモーター下流へライゲーシヨンし、 IgG型抗体遺伝子を含むプラスミド DNAを得た。

[0312] 12-2 IgG型抗体の発現

プラスミド DNAの CHO- K1細胞へのトランスフエクシヨンには GenePORTER Reagent ( Gene Therapy Systems社： T201007)を使用した。まず、 60mm培養皿に CHO- Kl細胞が 2 X 104cells/mlになるように、トランスフエクシヨンの前日力準備してお!、た（培地は a - MEM(Invitrogen:12561- 056)に 10%FCS (ェキテック社: 268- 1)添カ卩したものを使用)。

プラスミド DNA 8 μ gを 250 μ Lの血清非含有培地（Serum Free Medium,以下 SFMと略す- (Invtrogen: 12052-098 CHO-S-SFMII)に溶かし、 0.22 mのフィルターにかけた。 GenePORTER Reagent 40 μ Lを 250 μ Lの SFMに加えた。

SFMに溶かしたプラスミド DNAと GenePORTER Reagentをすばやく混ぜ、室温 30min 静置した。

細胞を SFM 2mlで 2回洗い、プラスミド DNA- GenePORTER mixture (Transfection M edium)を細胞の入ったプレートにゆっくり加え、インキュベーター内、 37°C、 5時間培し 7こ。

トランスフエクシヨン用培地を吸引し、 a MEM 10%FCSで 2回洗った後、 α ΜΕΜ 10 %FCSを 5ml加え、インキュベーター内、 37°C、 48時間培養した。

a MEM lO^oFCS + TOO .u g/ml G418 (Sigma:G7034)の培地 10mLに置き換え、セレクシヨンを開始した (以後の mediumは a MEM lO^oFCS + TOO .u g/mL G418を使用)。 3 7°C、 48時間培養後、細胞を PBS 10mLにて洗浄し、 0.25%Trypsin-EDTA (Sigma T40 49) 750 /z Lにて処理後、 a MEM 5mLカ卩ぇプレートより剥離、回収し細胞数を測定した。その結果を元に限界希釈を lOcells/200 /ζ L/ゥヱル（96ゥヱルプレート 2枚）の条件で行った。 14日間培養後、各 wellの培養上清を用いて ELISAを行い、 IgG型抗体の発現を確認した。

[0313] 12-3 培養上清力もの発現タンパク (IgG)の精製 Protein G Sepharose 4 Fast Flow(amersham pharmacia biotech: 17-0618-01) lmL をカラムにつめ、 5mLの PBSで平衡ィ匕した。培養上清をアプライ、流速 1滴 /2秒で送液し、発現タンパク (IgG)をカラムに結合させた。 10mLの PBSを流速 1滴 /2秒で送液し、非吸着成分を洗浄後、 6mLの溶出バッファー（0.2Mグリシン- HCl,pH3)を流速 1滴/ 秒で送液、溶出液を lmLずつ 1.5mlチューブに回収した。回収チューブにはあらかじめ中和バッファー（3M Tris- HCl OO /z Lを添加、回収と同時に中和した。溶出液をまとめ 750 Lまで濃縮、溶液置換（PBS、 complete, 0.01%NaN3)を行い、 SDS— PAGE によって抗体タンパクの濃度を算出した。

13.取得に成功した抗 HER1抗体（048-006抗体）による EGF結合阻害実験

13-1 実験手順

A431細胞を 15 φ培養皿で培養し（培地： 10% FBS及び 1% PS含有 DMEM)、 90%コンフルェント時に細胞を cell dissociation buffer(GIBCO社: 13151-014)で剥がして回収した。 1.0% BSA及び 0.05% NaN3含有 PBSを 2mlカ卩ぇ懸濁した。 4°Cで 30分間静置した後、 96ゥエル V底プレートの各ゥエルへ 100 (約 2.5 X 105 cells)ずつ分注した。遠心 (650G) 2分間で細胞を沈殿させ上清を除く。 1.0% BSA含有 PBSを用いて調製した各抗体溶液（HR1- 00⁷[10 μ g/ml], 48- 006[10 μ g/ml, 5 μ g/ml, 1 μ g/ml], 59-152[10 μ g/ml, 5 μ g/ml, 1 μ g/ml]) 200 μ 1を加え、細胞を懸濁した。 4°Cで 1時間静置した後、ピオチン'ラベルした EGF (ピオチン化 EGF: 50 g/ml)を終濃度 1 μ g/mlになるように各ゥエルに添加し、細胞を懸濁した。尚、ピオチン化 EGFは以下の方法で作製した。まず、 EGF (PBS (-)で lmg/mlに調製； AUSTRAL Biologicals社: GF- 010- 5) 50 1へ、 EZ- Link Sulfo-NHS-LC-Biotin (PBS(-)で2mg/mlに調製;PIERCE社:21335)を 25 μ 1 加える。室温で 30分間静置した後、 1Mグリシン (ρΗ=7.0〜8.0)を 10 1カ卩える。室温で 30分間静置した後、 PBS (-)を 15 1カ卩ぇ 4°Cで保存した（終濃度 500 g/ml)。これを 1. 0% BSA含有 PBSで 10倍希釈して実験に使用した。

4°Cで 1時間静置した後、遠心（650G)を 2分間行い、上清を除く。 1.0% BSA含有 PB Sを 180 1カ卩えた後、遠心（650G)を 2分間行い、上清を除く。 HRP標識ストレプトアビジン（0.2 μ g/ml (1.0%BSA含有 PBS)； PIERCE社: 21126)を 100 μ 1加え、細胞を懸濁した。 4°Cで 1時間後、遠心（650G)を 2分間行い、上清を除く。 1.0% BSA含有 PBSを 180 /z l加えた後、遠心 (650G)を 2分間行い、上清を除く。この操作を再度行う。 OPD (Wa ko社: 154-01673)発色溶液を 100 1加え、細胞を懸濁した。室温で 4分後、発色停止溶液（2N H2S04)を 100 /z lカ卩える。遠心（650G)を 2分間行い、上清を平底プレートへ移す。プレートリーダーで 492應の吸光度 (A492)を測定し、数値化した。

[0315] 13-2 結果

結果を図 24に示す。コントロールの HR1-007は、 EGFの結合に何の影響も及ぼさないが、 048-006抗体と 059-152抗体は EGFの結合を阻害している。但し、 048-006抗体が EGFの結合をほぼ完全に阻害できるのに対し、 059-152抗体は濃度を上げても、完全な阻害効果は得られな力つた。尚、 048-006抗体は 0.02 g/ml程度の低濃度でも阻害効果を示す (図 24C)。

本結果は、各抗体 (048-006抗体、 059-152抗体)の EGFとの拮抗活性力抗腫瘍性などの薬理作用の一部となる可能性を示唆した。

[0316] 14.取得に成功した抗 HER1抗体（048-006抗体）の HER1のリン酸化シグナル阻害実験

リン酸化抗体を用い、取得に成功した抗 HER1抗体（048-006抗体）が HER1のリン酸化シグナルを阻害する力検討した。具体的には、 3種類細胞（腎細胞癌 (CCF-RC1、 Caki-1)及び類上皮がん（A431) )を用い、 048-006抗体及び 059-152抗体の阻害効果とェルビタックスの阻害効果を比較した。

[0317] 14-1 実験手順

各細胞を 6ゥエル培養皿で培養し、 60%コンフルェント時に培地（10% FBS及び 1% PS 含有 DMEM)を DMEMへ置換した。 16時間後、各抗体（HR1-007, 048-006, 059-152 (PBS (-)で 2mg/mlに調製)）とエルビタックスをそれぞれ終濃度 10 μ g/mlまたは 1 μ g/ mlになるように各ゥエルへ添カ卩した。 30分後、 EGF (PBS(-)で20 _iu g/mlに調製）を終濃度 1 μ g/mlになるように各 wellへ添カ卩した。 30分後、各ゥエルを PBS (-)で洗い、液体窒素で培養皿ごと急速凍結した。各ゥエルへ lysis buffer (50mM Tris(pH7.4), 150mM N aCl, ImM Na3V04, lOmM NaF, 1% TritonXlOO, complete(Roche社: 11836145001)) を加え、細胞を懸濁して遠心チューブへ移した。 10分間の遠心処理（10000G)によつて細胞屑を沈殿させ、上清の一部を SDS-PAGEに供した。メンブレンに転写し、一次抗体に抗リン酸化チロシン抗体（1 μ g/ml;upstate社: 05-321)又は抗 13 -actin抗体（1 μ g/ml;abcam¾：: ab25139)、二次抗体に 2次抗体反応： HRP標識抗マウス IgG)を用いてウェスタンブロットを行った。露光は、 A431細胞の際は、感光 1-2秒、 CCF-RC 1 細胞の際は感光 10秒、 Caki-1の際は感光 1分を要した (元々 EGFによる外部刺激に対する細胞感受性に大きな違!、があった)。

[0318] 14-2 結果

結果を図 25 (A及び B : A431細胞を用いたウェスタンブロットの結果、 C〜E :取得に成功した抗体とエルビタックスの HER1リン酸ィ匕シグナル阻害効果の比較）に示す。 C CF- RC 1及び A-431細胞の系では、コントロールの HR1-007は、 HER1のリン酸化シグナルに何の影響も及ぼさな、が、 048-006抗体と 059-152抗体は濃度依存的にシグナルを阻害している。 048-006抗体は EGFの結合をほぼ完全に阻害し、 HER1の自己リン酸化もほぼ完全に阻害した。 059-152抗体は EGFの結合を半分程度阻害した。また、 048-006抗体よりも弱いながらも HER1の自己リン酸化も阻害した。 048-006抗体と 059-152抗体の阻害能はともに、ェルビタックスを凌駕するものであり、特に 048-006 抗体の阻害能は際立っている。

尚、 EGFによる外部刺激に対する感受性は細胞種によって異なる。そのため、 Caki -1の様に EGFによる外部刺激にほとんど感受性の無い細胞を使用した場合、抗体によるシグナル阻害効果の差が認められない結果となった。

本結果により、各抗体（048-006抗体及び 059-152抗体）が EGFに対する HER1の感受性細胞に対して、 HER1のチロシンキナーゼ回路を抑制する活性を有し、増殖阻害ゃ抗腫瘍作用などの薬理作用を発揮する可能性が示唆された。

[0319] 15. BIAcoreによる結合定数の測定

取得に成功した抗体 048-006、 059-152に関して、発現 Herlとの解離定数を測定した。

15-1 実験手順

( 1) Herl部分配列の強制発現

HER1のシグナル以降の領域力膜貫通領域の直前までの配列 (発現部位 26位〜 645位の 621アミノ酸（配列番号： 943)をクローユングした。クロー-ング並びに発現には pSecTagllベクター（インビトロジェン）を使用した。本ベクターに挿入することによつて myc及び hisタグが付加される。

[0320] (2)発現細胞の回収

293T細胞を培養した 15 φ培養皿 (80%コンフルェント )1枚用意し、細胞が剥離しないように注意しながら培地交換した後、培養に供した。これによつて 90-100%コンフルェントで細胞が凝集している状態を形成させた。細胞回収の前日、最後の培地交換を行った。溶液 Aとして、 D- MEM (無血清) 1.9mlに DNA 75 μ 1を添カ卩し、タッピング調整した。また、溶液 Βとして、 D- MEM (無血清) 1.9mlに Lipo 75 1を添加し、タツピング（50mlファルコン)調整した。

溶液 Bの作製から 1分後、溶液 Bを 5mlピペットで溶液 Aに添加し、すぐさまピぺッテイングし、室温で 20分間インキュベートした。 50ml培養容器（ファルコン）に D- MEM (無血清) 22.5mlを計りとり、血清 2.5mlを添カ卩した後、 37°Cで 15分間インキュベートし、 D- MEM (血清入り)とした。

293T細胞が凝集した状態の 15 φ培養皿力も培地を除き、細胞が剥離しないように注意しながら壁伝いに D- MEM (無血清) 25mlを加えた。添カ卩した D- MEM (無血清)をァスピレーターで吸い出し、 D- MEM (血清入り) 25mlをカ卩えた。

D- MEM (血清入り)の作製から 20分後に溶液 Aと溶液 Bの混合液 3.8mlを 25mlのピぺットで細胞に添加し、細胞を剥離した。ピペッティング操作で細胞をほぐした後、 C02 インキュベーター内で 2日間静置した。 2日後、上清を回収し、タンパク精製に供した

[0321] (3)分泌タンパク精製 (Nト NTA)

Nト NTAァガロースゲル (QIAGEN)2ml (ベッドボリューム lml)をカラムに充填し、 PBS にて平衡ィ匕した後、（2)で回収した上清をカラムに供した。フロースルー液を再度力ラムに供した。 PBS 5mlで洗浄し、吸光度 (280nm)〈0.005になるまで 20, 50, 100, 250, 500 mMイミダゾール /PBS各 5mlで段階溶出した。さらに 0.5M EDTA/PBS 10mlで溶出した。透析により溶液置換し、 BIAcore固定ィ匕サンプルとした。

[0322] (4) BIAcore測定

抗体クローンと発現した Her 1との相互作用を調べ、 KD (解離定数； kd/ka)を決定した。解析には、 BIAcorelOOOバイオセンサー装置を使用した。

カルボキシメチルデキストラン（Sensor Chip CM5)、 Research grade, BIACORE)センサーチップを用いた。 CM5マトリックスへの静電吸着、及び CM5上のリシル基と活性ィ匕したカルボキシル基との共有結合により、抗原 (Herl)をチップに固定した。 EDC ZNHSカップリングイ匕学反応によって、カルボキシル基を活性ィ匕した。

流速 5 μ LZ分、 HBS— EP (BIACORE)の条件下、 EDCZNHS (ァミンカップリングキット、 BIACOREを EDC、 NHSを当量混合）を用い、 CM5上のリシル基の活性化後（コンタクトタイム 2.4分）に、 HBS— EP (BIACORE)でチップを洗浄した。続いて Herl (20 /z g/ml^ Sigma製、 0.6mgタンパク質/ mlを 10mM酢酸（pH4. 0)で希釈）をチップに加えた。チップを HBS— EP洗浄した後、続いて、 1Mのエタノールァミン (pH8.5)をカロえ、残存する活性ィ匕カルボキシル基を不活性ィ匕した。その後、 50mMの NaOHで洗浄し、共有結合していない Herlを全て除去した。尚、すべての解析実験は、 HBS— EP流速 35 μ 1/分 HBS— EP (BIACORE)、 25°Cの条件下で実施し、再生は 50mMの NaOHを用いて行った (1分間)。

059-152抗体又は 048-006抗体を図中の各濃度で HBS— EP流速 35 μ 1/分で反応させ、結合定数を解析した。

[0323] 15-2 結果

結果を図 26に示す。 048-006抗体は、各測定点において KD=10-11 (M)を越える非常に強い結合力を示した。なお、各検出値に基づいた Globalフィッティングの実際の値は 4.8 X 10-13 (M)であったがこれは BIAcoreの信頼出来る測定限界を越えて!/ヽた。 059-152抗体については、結合解離曲線を検出するに至らな力つた。これは本抗体が人工的に作製された強制発現体の高次構造を認識出来ていない事に起因すると考えられる。換言すれば、複合体の高次構造、或いはインタタトな膜上タンパクでしか取り得なヽ高次構造を本抗体が認識してヽることが示唆された。

[0324] 16.抗 HER1抗体、抗 HER2抗体、抗 ITGA3抗体、抗 ALCAM抗体、抗 ICAM抗体の細胞傷害性試験 (ADCC活性測定）

抗体依存性細胞性細胞傷害（ADCC： Antibody- Dependent Cell-mediated Cytotox icity)は、ウィルス感染細胞など人体にとって有害な細胞を殺傷、攻撃する免疫反応であり、膜表面に広く抗体が結合した細胞を標的と見なし、ナチュラルキラー細胞や単球を主とする「エフェクター細胞」が攻撃する機構である。 ADCCによる細胞傷害性は、細胞膜表面抗原に特異的に結合する抗体、およびエフェクター細胞の組み合わせに依存して起きる。

腫瘍表面抗原に特異的に結合する抗体のうちのいくつかは抗腫瘍効果、がん治療効果が示され、抗体医薬として販売されているが、これら抗体の主要な作用機序は A DCCであるという報告がなされている。そこで、本発明者らが単離に成功したがん抗原特異的抗体に抗腫瘍効果があるか、即ちがん治療用抗体として有望であるかを評価するための方法として、 ADCCの検出を試みた。以下に示す実験では標的細胞に対象抗原を認識するヒ HgG型抗体クローンを反応させてエフェクター細胞に提示するという方法を用いた。 ADCCの検出は、エフェクター細胞により攻撃された標的がん細胞力培地中へ漏出する乳酸デヒドロゲナーゼの酵素活性を、試薬の発色で検出する原理の細胞傷害性検出キットを用い、傷害の度合いを算出した。

16-1 ADCCの誘導 1(ITGA3抗体である 015-003抗体の場合： scFVcp3型抗体を使用）

ITGA3抗体である 015-003抗体については scFVcp3型抗体を使用し、 anti-M13 pill rabbit ant¾odyを組み合わせたアツセィ系によって ADCC活性を検討した。また、使用した標的対象培養細胞は肝がん HLF細胞である。操作手順は以下の通りとした。

(1)以下の手順でボランティアより末梢血を採取し単核球を分離する。まず、ボランティァから採血したへパリン添カ卩末梢血 30 mlを PBSで 80 mlに希釈し、遠心チューブ 4 本に 10 mlのリンパ球単離試薬 Ficoll Paque Plus (Amersham Bioscience社製）を分注しておいたものに静かに重層し、遠心分離 (400 X g、 20°C、 40分)した。単核球画分（リンパ球と単球を含む）を回収して冷 PBSにて 80 mlに希釈し、遠心分離 (200 x g、 4°C 、 15分）により沈殿させた。

(2)最終密度が 5.0 X 106 cells/mlになるように冷細胞傷害性試験培地（Cytotoxic Me dium、以下 CTMと略す。 RPMI- 1640培地、 1% (v/v)ゥシ胎児血清、 1% (v/v) Penicilli n - Streptomycin Solutionゝ 1% (v/v) 1 M HEPES buffer (pH7.0) : Invitrogen社製）培地にけん濁し、エフェクター細胞とする。 (3)直径 150mmの培養皿上で液体培地 1 (Minimum Essntial Medium Alpha Medium: I nvitrogen社製、 10% (v/v)ゥシ胎児血清： Equitic- Bio社製、 1% (v/v) Penicillin - Str eptomycin Solution : Sigma-Aldrich社製）にて標的対象培養細胞を成育させた。液体培地を除去し、細胞を PBS 10 mlで 2回洗浄し溶液を除去した後、 4 % (w/v)コラゲナーゼ Type IV(lnvitrogen社製）を 5 mlカ卩ぇ 37°Cで 10分保温させることにより細胞を培養皿から剥離させた。さらに 5 mlの液体培地 2 (RPMI-1640、 10% (v/v)ゥシ胎児血清、 1% (v/v) Penicillin - Streptomycin Solution： Sigma-Aldrich社製）（RPMI- 1640 : Si gma- Aldrich社製、 10%ゥシ胎児血清、 1%ペニシリン一ストレプトマイシン溶液）をカロえてコラゲナーゼ反応を停止させ、浮遊した細胞を回収し、細胞懸濁液を得た。

(4) (3)の細胞懸濁液の細胞密度を測定した後、遠心分離して上清を除き、最終密度 1.5 X 105 cells/mlになるように冷 CTM培地にけん濁する。

(5)氷上の V底 96wellマルチプレートに標的細胞を 100 μ 1ずつ分注する。

(6) 2 μ g/mlの scFv- pillファージ抗体- CTM溶液を 100 μ 1ずつ分注し、 60分間氷上で反応させる。

(7)遠心分離（Swing rotor: 500 x g, 4 °C, 10 min.)した後上清を除く。

(8)細胞ペレットを 5

pillゥサギポリクローナル抗体- CTM溶液（それぞれ 150 1ずつ）にけん濁した後、 100 1分を U底 96wellマルチプレートへ移す。

(9) (2)のエフヱクタ一細胞（または 2% Triton X-100-CTM溶液）を加え、遠心分離（Swi ng rotor: 50 x g, 。し, 5 min jする。

(10) 5% C02、 37 °Cで 4時間反応させる。

(11)反応後、遠心分離（Swing rotor: 500 x g, 4 °C, 10 min.)して上清 100 μ 1を平底 9 6wellマルチプレートへ移す。

(12) LDH活性測定試薬（Roche) 100 μ 1を加え、室温で 30 min.反応させる。

(13)マイクロプレート吸光光度計で OD490、 OD690を測定する。

16-2 ADCCの誘導 2 (HER1抗体である 048-006抗体、 HER2抗体である 015-126抗体、 ALCAM抗体である 066-174抗体及び 035-234抗体及び 041-118抗体、 ICAM抗体である 053-051抗体、 053-059抗体及び 053-085抗体、 EPCAM抗体である 067-153 抗体、 HGFR抗体である 067-133抗体の場合： IgG型抗体を使用） HER1抗体である 048-006抗体については IgG型抗体を使用して ADCC活性を検討した。使用した標的対象培養細胞は A-431、 A549 (以上、類上皮腫)、 ACHN、 CCF- RC-1 (以上、腎癌）、 NCト H1373 (肺がん）、 SK- OV- 3 (卵巣がん）である。

HER2抗体である 015-126抗体についても IgG型抗体を使用した ADCC活性を検討した。使用した標的対象培養細胞は乳がん BT-474である。

ALCAM抗体である 066-174抗体及び 035-234抗体については IgG型抗体を使用して ADCC活性を検討した。使用した標的対象培養細胞は NCト H1373 (肺腺癌）、 CW 2 (大腸癌）、又は NCト H441 (肺癌)である。

ICAM抗体である 053-051抗体、 053-059抗体及び 053-085抗体につ!、ては IgG型抗体を使用して ADCC活性を検討した。使用した標的対象培養細胞は HepG2 (肝細胞癌）、 NCI- H441 (肺癌）である。

また、 HER1抗体である 048-006抗体又は 059-152抗体の CCF-RC-1 (腎癌）、 NCI- H1373 (肺がん)及び A-431 (類上皮がん）に対する作用に関して、 ADCC活性の抗体用量依存性を IgG型抗体最終濃度 0.01-10 μ g/mlの範囲で検討した。

ALCAM抗体である 041-118抗体については IgG型抗体を使用し、 ADCC活性の抗体用量依存性を検討した。使用した標的対象培養細胞は NCト H1373 (肺腺癌)である。

EPCAM抗体である 067-153抗体につ!、ては IgG型抗体を使用し、 ADCC活性の抗体用量依存性を検討した。使用した標的対象培養細胞は MKN-45 (胃充実型腺癌)、 HT-29 (結腸腺癌）、 NCI-H1373 (肺がん）である。

HGFR抗体である 067-133抗体にっヽては IgG型抗体を使用し、 ADCC活性の抗体用量依存性を検討した。使用した標的対象培養細胞は NCト H1373 (肺がん）である。

ADCC活性の抗体用量依存性に関しては基本的に E/T Ratio (エフェクター細胞と標的細胞の比率) 80:1で溶液中の最終抗体濃度抗体濃度 0.01 μ g/mlから 10 g/ml 或いは 10-6 μ g/mlから 10 μ g/mlの測定点で測定した。

それぞれの測定点につき、標的細胞に抗体とエフェクター細胞添加し、 4時間後に ADCC活性を測定した。 NCI-H1373については E/T Ratio 100:1で ADCC活性を測定した。操作手順は 16-1に記載した手順に準じた力反応の詳細は以下のとおりとした。即ち、 U底 96ウェルマルチプレート（Becton Dickinson社製）に 1ゥエルあたり 66 μ 1の標的細胞（2 X 104 cells)を入れ、 IgG型抗体（3 μ g/ml) 66 μ 1をカ卩えたのち、 66 μ 1の末梢血単核球懸濁液（7.5 X 105 cells)を加えた。 E/T ratio (エフェクター細胞と標的細胞の比率）は 20とした。細胞同士の会合を促すため遠心分離 (60 X g、 4°C、 5分)を行い細胞を底部へ沈めたのち、 37°C、 5 % C02の条件に設定した培養装置で 240分保温して ADCC反応を誘導した。各抗体サンプルは CTM溶液として調製した。また、それぞれのサンプルについて陰性コントロールとして CTMを用い、乳酸デヒドロゲナーゼの最大遊離量コントロールとして、標的細胞に 100 μ 1の 2% Triton Χ-100 - CTM溶液をカ卩えたものを用いた (Triton X-100によりあら力じめ細胞を破壊)。また、それぞれの実験群につき 3つのゥエルを使用した。

[0327] 16-3 ADCC活性の測定

cFVcp3型抗体を用いたアツセィ、 IgG型抗体を用いたアツセィの!、ずれにつヽても、 ADCC活性は発色の程度、すなわち培養上清中に遊離した乳酸デヒドロゲナーゼの濃度に比例し、標的細胞のダメージの指標となる。発色開始から 30分後、分光光度計により吸光度（OD490 - OD620 (バックグラウンド吸光度)）を測定し、各実験群にっき 3つのゥエルの吸光度を平均し細胞傷害性指数 (Cytotoxic Index)を算出した。あら力じめ培地のみの吸光度を引き算し、以下の計算式のように行った。

[0328] [数 1]

相対 LDH活性 =OD490— OD690

細胞由来 LDH活性 =実験値（溶液のみコントロール）

細胞傷害性（％) = (実験値エフェクター細胞コントロール標的細胞コントロール） Z (細胞 + Triton X- 100コントロール標的細胞コントロール） X 100

尚、抗体に細胞傷害活性がない場合、生体成分を使用した実験系であるが故の測定誤差に起因して、この算出方法で求めた細胞傷害性がマイナスの値を示すことがある。

[0329] 16-4 測定結果

ADCC活性の測定結果を図 27 (ITGA3抗体を使用、標的培養細胞は HLF)、図 28 (HER1抗体を使用、標的培養細胞は A-431)、図 29 (HER1抗体を使用、標的培養細胞は A549)、図 30 (HER1抗体を使用、標的培養細胞は ACHN)、図 31 (HER1抗体を使用、標的培養細胞は CCF-RC-1)、図 32 (HER1抗体を使用、標的培養細胞は NCI - H1373)、図 33 (HER1抗体を使用、標的培養細胞は SK-OV-3)、図 34 (HER2抗体を使用、標的培養細胞は BT-474)、図 35 (ALCAM抗体である 066-174を使用、標的培養細胞は NCI- H1373、 CW2、又は NCI- H441)、図 36 (ALCAM抗体である 035- 23 4を使用、標的培養細胞は CW2、又は NCI-H441)、図 37 (ICAM抗体である 053-051 を使用、標的培養細胞は NCI-H441、 HepG2)、図 38 (ICAM抗体である 053-059を使用、標的培養細胞は NCI-H441、 HepG2)、及び図 39 (ICAM抗体である 053-085を使用、標的培養細胞は NCト H441、 HepG2)に示す。

また、 ADCC活性の抗体用量依存性の測定結果を図 40 (HER1抗体の 048-006又は 059- 152抗体を使用、標的培養細胞は CCF- RC- 1)、図 41 (HER1抗体の 048- 006 又は 059-152抗体抗体を使用、標的培養細胞は NCI-H1373)、図 42 (HER1抗体の 0 48-006又は 059-152抗体抗体を使用、標的培養細胞は A-431)、図 43 (ALCAM抗体である 041-118抗体を使用、標的培養細胞は NCI-H1373)、図 44 (EPCAM抗体である 067-153抗体を使用、標的培養細胞は MKN-45)、図 45 (EPCAM抗体である 067-1 53抗体を使用、標的培養細胞は HT-29)、図 46 (EPCAM抗体である 067-153抗体を使用、標的培養細胞は NCI-H1373)図 47 (HGFR抗体である 067-133抗体を使用、標的培養細胞は NCI-H1373)に示す。

ITGA3抗体（015-003)、 HER1抗体（048-006)及び HER2抗体（015-126)の!、ずれについても、エフェクター細胞を加えた実験群において有意に細胞傷害性が上昇していた。即ち、これらいずれの抗体についても、標的細胞に特異的に結合した抗体をエフェクター細胞が認識し、そして標的細胞を攻撃することによる細胞傷害活性が認められた。

尚、表面抗原に関連しな！ヽ抗ハブ毒抗体 (対照抗体) HR1-007や抗体クローンを加えない実験群では細胞傷害性の上昇は見られな力つた。

ALCAM抗体（066- 174及び 035- 234)、 ICAM抗体（053- 051、 053- 059及び 053- 085 )のいずれについても、抗ノヽブ毒抗体 (対照抗体) HR1-007実験群より有意に細胞傷害性が上昇していた。以上、抗体依存性細胞性細胞傷害は有意な差をもって対照抗体 (HR1-007)のそれより高、事が見事に証明されて!、る。

以上の結果から、 HER1、 HER2、 ITGA3、 ALCAM、 ICAM、 EPCAM及び HGFRのそれぞれについて、それを介して癌細胞を特異的に認識し、そして ADCC活性による傷害効果を発揮する抗体の取得に成功したことが確認された。換言すれば、それぞれの癌細胞を標的とする抗体医薬として有望な抗体を取得することに成功した。

抗体用量依存性試験の結果では、 HER1抗体 (048-006)に関しては 0.01 μ g/mlでも顕著な効果が確認でき、低用量でもその効果が期待できることが判明した。

048-006抗体及び 059-152抗体につ!、ては、 HER1が発現して!/、る細胞株にお！、て強い ADCC活性を示す傾向を認めた。しかしながら、使用する抗体濃度領域や細胞株の種類においてその活性に差違を示した。 A431細胞に対しては、 0.001 μ g/mlで活性の違いが観察された。概して、低濃度領域においては 059-152抗体の活性は 04 8-006抗体のそれよりも優位であった。

また、 EPCAM抗体の 067- 153抗体は 0.01 μ g/ml以上の濃度において ΜΚΝ- 45(胃充実型腺癌)細胞株に対して優れた ADCC活性を示し、 HT-29(結腸腺癌)細胞株に対しては lOpg/ml以上の濃度において優れた ADCC活性を示すとともに 1 μ g/ml付近での活性は 80%以上とヽぅ驚異的なスコアが得られた。 NCI-H1373肺腺癌)細胞株に対する ADCC活性は 0.01 μ g/ml以上の濃度で 50%以上という驚異的なスコアを示したまた、 ALCAM抗体の 041- 118抗体は NCI- H1373(肺腺癌)細胞株に対し、 0.01 μ g/ ml以上の濃度で顕著な効果を認め、低用量でもその効果が期待できることが判明した。

また、 HGFR抗体である 067-133抗体は NCI-H1373(肺腺癌)細胞株に対して 0.01 μ g/ml以上の濃度で顕著な効果を認め、 10 g/mlの濃度領域においての活性は 40% 以上とヽぅ強ヽ活性を示した。

以上の結果より、低用量 (低濃度)であっても十分な ADCC活性を示す、有望な抗体群の取得に成功したことが確認された。尚、複数のヒト由来のリンパ球画分を用いた同様の実験によっても、以上の結果と同様の結果が得られ、再現性の高さを確認した。

[0331] 17.癌細胞増殖阻害試験

一部の抗体医薬は ADCC作用ではなく（又は ADCC作用に加えて）、癌の増殖阻害作用によってその薬効を奏する。そこで、抗体医薬としての有効性をさらに検証すベぐ今回単離に成功した抗体の癌増殖阻害活性を以下の手順で検討した。

17-1 試験方法

(1)培養皿内で生育させた標的培養細胞を 4% Collagenaseで剥離し、用いた培地でけん濁する。

(2)細胞密度を測定した後、遠心分離して上清を除き、最終密度 1.0 X 104 cells/mlになるように RPMI- 1640(10% FBS, 1% Penicillin - Streptomycin)培地にけん濁する。

(3)平底 96wellマルチプレートに標的細胞を 100 μ 1ずつ分注する。

(4) 20 μ g/mlのヒト IgGモノクローナル抗体溶液を 100 μ 1ずつ分注する。

(5) 5% C02、 37°Cで 5日間反応させる。

(6)培地を除き、生細胞測定試薬 (XTT: Roche)を各 wellに 150 1分注する。

(7) 5% C02、 37°Cで 4時間反応させる。

(8)反応後、マイクロプレート吸光光度計で OD490、 OD690を測定し、以下の計算式に基づいて生細胞数を算出する。

[0332] [数 2]

XTT還元量（発色の度合い） =OD490— OD690

細胞由来 XTT還元活性 = (実験値）（溶液のみのコントロール）

尚、細胞由来 XTT還元活性は生細胞数に比例する。

[0333] 17-2 結果

結果を図 48 (HER1抗体 (048-006)を使用、標的対象培養細胞は A-431)、図 49 (H ERl抗体（048-006)を使用、標的対象培養細胞は ACHN)、図 50 (HER1抗体（048-0 06)を使用、標的対象培養細胞は NCト H1373)図 51 (HER1抗体 (048-006)を使用、標的対象培養細胞は SK-OV-3)、図 52 (HER2抗体 (015-126)を使用、標的対象培養細胞は BT-474)に示す。

これらの図からわ力るように、癌細胞増殖阻害性を有する抗体の取得に成功したことが確認された。即ち、これらの抗体は、癌細胞の増殖を押さえる抗体医薬としても有効である可能性が示された。

[0334] 18.マウスを用いた抗腫瘍実験

次に、癌細胞移植マウスを用いて、単離に成功した抗体が in vivoで抗腫瘍活性を示すか否かを確認した。

18-1 使用した動物及び細胞株

4週齢の雌 BALB/cヌードマウス（日本チヤ一ルス ·リバ一 (株））を 1週間馴化飼育したのちに実験に用いた。飼育は SPF環境下でおこない、滅菌した水と飼料を与えた。ヒト肺癌細胞 H1373或いは類上皮腫 A-431は 37°C、 5%C02存在下、 10%FBS含有 RP Ml培地にて培養維持継代したものを用いた。

[0335] 18-2 抗腫瘍実験の方法

ヌードマウス側背部皮下にヒト肺癌細胞 H1373細胞を 1 X 107個移植して腫瘍を作製し、腫瘍体積が lcm3になった時点で腫瘍を 3mm角に細切し、準備したヌードマウス背部皮下に継代移植した。移植後、推定腫瘍体積力 S200mm3になったところで、抗体の投与を開始した。腫瘍径および体重は週 2回計測し、推定腫瘍体積を W=a X b 2,2 (W:推定腫瘍体積 (mm3)、 a :長径 (mm)、 b :短径 (mm))の式より求めた。実験群は、コントロール群（p_BS投与）と 048-006 IgG投与群（0.5mg/個体）の 2群とし、投与経路は腹腔内投与とした。週 2回のペースで 8回投与し、その抗腫瘍効果を検討した

[0336] また、 ERBITUX (ェルビタックス：セツキシマブ，ブリストルマイヤーズスクイブ社）を比較群或いはその相加性検討群として用いた。 ERBITUXを単独で用いる場合は投与量を 0.25mg/個体とした。 ERBITUXを併用する場合は ERBITUXの投与量を 0.25mg/ 個体、 048-006 IgGの投与量を 0.25mg/個体とした。投与後、経過を観察した。

[0337] 類上皮腫 A-431を用いる場合は 5週齢の雌 BALB/cヌードマウスヌードマウス側背部皮下に類上皮腫 A-431を同様に 5 X 106個移植して腫瘍を作製し、推定腫瘍体積が 2 00mm3になったところで、抗体の投与を開始した。投与経路は腹腔内投与とした。 04

8- 006の IgG型抗体は、週 2回のペースで 6回投与し、その抗腫瘍効果を検討した。 05

9- 152の IgG型抗体投与群（0.25mgまたは l.OOmgの抗体量を 0.5mlの PBSに希釈したもの/個体）は、週 2回のペースで 6回投与し、その抗腫瘍効果を継続して経過も観察した。

[0338] 18-3 結果

抗体 (048-006の IgG型抗体)投与群は、コントロール群（PBS投与）に比較し有意に推定腫瘍体積が小さくなり、明らかな抗腫瘍効果が認められ、 ERBITUXに匹敵する効果を確認した（図 53〜56)。一方、抗体 (059-152の IgG型抗体)投与群は、コント口ール群 (PBS投与）に比較し有意に推定腫瘍体積が小さくなり、明らかな抗腫瘍効果が確認され、その効果は ERBITUXより優れていた（図 56)。 059-152抗体の方力 048 -006抗体や市販の ERBITUXよりも強い腫瘍抑制効果を示した。このように、取得に成功した抗体は in vivoモデルでも抗腫瘍効果を発揮することが確認された。即ち、抗体医薬として非常に有望であることが示されたといえる。

[0339] 19.三次元 ELISAによる解析

(1)スクリーニングされたクローン群の培養による抗体発現と、抗体混合物の調製

1.〜5.に記載した方法でスクリーニングされたクローン（約 4000クローン）のファージ感染大腸菌を 1クローン Zwellとなるように 41枚の 96wellプレートに移し、 100 μ 1/wel 1の YTGA培地（YT培地 + 1% Glucose +200 μ g/ml Ampicillin)で 30°C、ー晚振とう培養した。次に、プレート毎、第 1列〜第 6列の全 wellの培養液を 10 1ずつ混合することでグループィ匕し (但し、第 28プレートについては第 1列〜第 7列を一つのグループとした）、合計 41のプレート混合抗体を得た。 7〜12列についても同様にグループィ匕し (伹し、第 28プレート及び第 35プレートを除く）、合計 39のプレート混合抗体を得た。また、プレートを 7グループ（1グループに 3、 6又は 7枚）に分けた後、グループ毎、各行の全 wellの培養液を 10 1ずつ混合することでグループ化し、合計 56の行混合抗体を得た。最後に、プレートを 5グループ（1グループに 3、 9又は 10枚）に分けた後、グループ毎、各列の全 wellの培養液を 10 1ずつ混合することでグループィ匕し、合計 54の列混合抗体 (一部につ!ヽては 2列を一つのグループとした)を得た。

各混合抗体に 100mlの YT0.05GA培地（YT培地 + 0.05% Glucose +200 μ g/ml Ampi cillin)をカ卩え、 30°Cで OD600nm=0.3〜0.5程度になるまで振とう培養した後、終濃度力 S0.5mMになるように IPTGを加え、更に 30°Cでー晚振とう培養した。 4°C10000rpml5 分間の遠心を行って培養上清を回収、硫酸アンモ-ゥム 29.1gをゆっくり加え混ぜた後、 4°C10000rpm20分間の遠心を行って沈さを回収し、これを 5mlの PBS/NaN3/com pleteに懸濁した。懸濁液を 4°C、 10000rpm、 20分間の条件で遠心して上清を回収し、 20倍濃縮の混合抗体 (190種類)を得た。

[0340] (2)三次元 ELISAによる測定

得られた 20倍濃縮の混合抗体（190種類)を用いて三次元 ELISAを行った。まず、 P BSにて 20 μ g/mlの濃度に調製した抗原を Maxisorp(Nunc)に 50 μ 1/wellカ卩え、 37°Cにて 2時間反応させ感作した。各 well内の液を除去した後、 5%スキムミルク/ PBSを 200 1 /wellカ卩え、 37°Cにて 2時間反応させブロッキングした。各 well内の液を除去した後、 P BSで洗浄し、 20倍濃縮の混合抗体を 100 1/wellカ卩え、 37°Cにて 1時間反応させた。 P BSで洗浄し、 0.05%Tween/PBSで 5000倍希釈したゥサギ抗 cp3抗体（MBL製）を 100 μ 1/wellカ卩え、 37°Cにて 1時間反応させた。 PBSで洗浄し、 0.05%Tween/PBSで 2000倍希釈した HRP標識ャギ抗ゥサギ IgG抗体 (MBL)を 100 1/wellカ卩え、 37°Cにて 1時間反応させた。 PBSで洗浄し、基質溶液を 100 1/wellカ卩えた。基質溶液は以下のように作製した。即ち、 12mlの 0.1Mクェン酸—リン酸水素 2ナトリウム (pH5.1)に終濃度が 0.01 %になるように H202を加え、さらに OPD錠 (和光純薬）を 1錠カ卩えた。

2N硫酸を 100 μ 1/wellカ卩えて反応を停止し、プレートリーダー（和光純薬サンライズリモート）にて 492nmの吸光度を測定した。

測定結果を図 60〜62 (CD147を抗原とした ELISA)及び図 63〜65 (HER1を抗原とした ELISA)に示す。

以上の三次元 ELISAの結果を基に陽性クローンを選抜した。即ち、陽性の結果を与えたプレート、行、列の情報より交点を探索し、交点に存在する抗体クローンを選抜した。選抜した抗体クローンを 75 /z l/wellの YTGA培地で 30°C、ー晚振とう培養した。 200 1 の丫丁0.05〇培地に培養液を植菌し、 37°Cで 4時間静置培養した後、終濃度が ImMになるように IPTGをカ卩え、 30°Cでー晚振とう培養した。 4°C、 3000rpm、 10 分間の条件で遠心を行い、培養上清を回収した。

[0341] (3)選抜した抗体クローンの反応性

PBSにて 10 μ g/mlの濃度に調製した抗原（CD147又は HER1)を Maxisorp(Nunc)に 5 0 /z l/wellカ卩え、 37°Cにて 2時間反応させ感作した。各 well内の液を除去した後、 5%スキムミルク/ PBSを 200 1/wellカ卩え、 37°Cにて 2時間反応させブロッキングした。各 well 内の液を除去した後、 PBSで洗浄し、選抜されたクローンの培養上清を 100 1/wellカロえ、 37°Cにて 1時間反応させた。 PBSで洗浄し、 0.05%Tween/PBSで 5000倍希釈したゥサギ抗 cp3抗体 (MBL製）を 100 1/wellカ卩え、 37°Cにて 1時間反応させた。 PBSで洗浄し、 0.05%Tween/PBSで 2000倍希釈した HRP標識ャギ抗ゥサギ IgG抗体（MBL)を 100 1/wellカ卩え、 37°Cにて 1時間反応させた。 PBSで洗浄し、基質溶液を 100 /z 1/wellカロえた。 2N硫酸を 100 μ 1/wellカ卩ぇ反応を停止し、プレートリーダー（和光純薬サンライズリモート）にて 492nmの吸光度を測定した。 HER1を抗原とした ELISAの結果を図 66 に示した。図 66のグラフからわ力るように、 HER1に対するモノクローナル抗体が多数得られている。

[0342] 20.新たに取得された抗体

本発明の分類法及び同定法を利用することによって以下の抗体を取得することに成功した。

(l)ClqRに対する抗体

070-016抗体

(a)アミノ酸配列

配列番号： 451(VH) ;配列番号： (VH CDR1)452 ;配列番号： 453(VH CDR2) ;配列番号： 454(VH CDR3)、配列番号： 455(VL) ;配列番号： (VL CDR1)456 ;配列番号： 457(VL CDR2) ;配列番号： 458(VL CDR3)

(b)塩基配列

配列番号： 843(VH)；配列番号： 844(VL)

[0343] (2)CD44に対する抗体

064-003抗体

(a)アミノ酸配列

配列番号： 459(VH) ;配列番号： 460(VH CDR1) ;配列番号： 461(VH CDR2) ;配列番号： 462(VH CDR3)；配列番号： 463(VL)；配列番号： 464(VL CDR1)；配列番号： 465(VL CDR2) ;配列番号： 466(VL CDR3) (b)塩基配列

配列番号： 845(VH)；配列番号： 846(VL)

[0344] (3)CD73に対する抗体

067-213抗体

(a)アミノ酸配列

配列番号： 467(VH) ;配列番号： 468(VH CDR1) ;配列番号： 469(VH CDR2) ;配列番号： 470(VH CDR3) ;配列番号： 471(VL) ;配列番号： 472(VL CDR1) ;配列番号： 473(VL CDR2) ;配列番号： 474(VL CDR3)

(b)塩基配列

配列番号： 847VH)；配列番号： 848(VL)

[0345] (4)EpCAMに対する抗体

067-153抗体

(a)アミノ酸配列

配列番号： 475(VH) ;配列番号： 476(VH CDR1) ;配列番号： 477(VH CDR2) ;配列番号： 478(VH CDR3)；配列番号： 479(VL)；配列番号： 480(VL CDR1)；配列番号： 481(VL CDR2) ;配列番号： 482(VL CDR3)

(b)塩基配列

配列番号： 849(VH)；配列番号： 850(VL)

[0346] (5)HER1に対する抗体

048-040抗体

(a)アミノ酸配列

配列番号： 483(VH) ;配列番号： 484(VH CDR1) ;配列番号： 485(VH CDR2) ;配列番号： 486(VH CDR3)；配列番号： 487(VL)；配列番号： 488(VL CDR1)；配列番号： 489(VL CDR2) ;配列番号： 490(VL CDR3)

(b)塩基配列

配列番号：851 (VH)；配列番号： 852(VL)

[0347] 054-101抗体

(a)アミノ酸配列配列番号： 491(VH) ;配列番号： 492(VH CDR1) ;配列番号： 493(VH CDR2) ;配列番号： 494(VH CDR3)；配列番号： 495(VL)；配列番号： 496(VL CDR1)；配列番号： 497(VL CDR2) ;配列番号： 498(VL CDR3)

(b)塩基配列

配列番号： 853(VH)；配列番号： 854(VL)

[0348] 055-147抗体

(a)アミノ酸配列

配列番号： 499(VH) ;配列番号： 500(VH CDR1) ;配列番号： 501(VH CDR2) ;配列番号： 502(VH CDR3)；配列番号： 503(VL)；配列番号： 504(VL CDR1)；配列番号： 505(VL CDR2) ;配列番号： 506(VL CDR3)

(b)塩基配列

配列番号： 855(VH)；配列番号： 856(VL)

[0349] 059- 173抗体

(a)アミノ酸配列

配列番号： 507(VH)；配列番号： 508(VH CDR1)；配列番号： 509(VH CDR2)；配列番号： 510(VH CDR3) ;配列番号： 511(VL) ;配列番号： 512(VL CDR1) ;配列番号： 513(VL CDR2) ;配列番号： 514(VL CDR3)

(b)塩基配列

配列番号： 857(VH)；配列番号： 858(VL)

[0350] 067-149抗体

(a)アミノ酸配列

配列番号： 515(VH)；配列番号： 516(VH CDR1)；配列番号： 517(VH CDR2)；配列番号： 518(VH CDR3)；配列番号： 519(VL)；配列番号： 520(VL CDR1)；配列番号： 521(VL CDR2) ;配列番号： 522(VL CDR3)

(b)塩基配列

配列番号： 859(VH)；配列番号： 860(VL)

[0351] 067-176抗体

(a)アミノ酸配列配列番号： 523(VH)；配列番号： 524(VH CDR1)；配列番号： 525(VH CDR2)；配列番号： 526(VH CDR3)；配列番号： 527(VL)；配列番号： 528(VL CDR1)；配列番号： 529(VL CDR2) ;配列番号： 530(VL CDR3)

(b)塩基配列

配列番号： 861(VH)；配列番号： 862(VL)

[0352] (6)HER2に対する抗体

015-044抗体

(a)アミノ酸配列

配列番号： 531(VH) ;配列番号： 532(VH CDR1) ;配列番号： 533(VH CDR2) ;配列番号： 534(VH CDR3) ;配列番号： 535(VL) ;配列番号： 536(VL CDR1) ;配列番号： 537(VL CDR2) ;配列番号： 538(VL CDR3)

(b)塩基配列

配列番号： 863(VH)；配列番号： 864(VL)

[0353] 015- 102抗体

(a)アミノ酸配列

配列番号： 539(VH)；配列番号： 540(VH CDR1)；配列番号： 541(VH CDR2)；配列番号： 542(VH CDR3)；配列番号： 543(VL)；配列番号： 544(VL CDR1)；配列番号： 545(VL CDR2) ;配列番号： 546(VL CDR3)

(b)塩基配列

配列番号： 865(VH)；配列番号： 866(VL)

[0354] 015- 136抗体

(a)アミノ酸配列

配列番号： 547(VH)；配列番号： 548(VH CDR1)；配列番号： 549(VH CDR2)；配列番号： 550(VH CDR3) ;配列番号： 551(VL) ;配列番号： 552(VL CDR1) ;配列番号： 553(VL CDR2) ;配列番号： 554(VL CDR3)

(b)塩基配列

配列番号： 867(VH)；配列番号： 868(VL)

[0355] 015-143抗体 (a)アミノ酸配列

配列番号： 555(VH)；配列番号： 556(VH CDR1)；配列番号： 557(VH CDR2)；配列番号： 558(VH CDR3) ;配列番号： 559(VL) ;配列番号： 560(VL CDR1) ;配列番号： 561(VL CDR2) ;配列番号： 562(VL CDR3)

(b)塩基配列

配列番号： 869(VH)；配列番号： 870(VL)

[0356] 015- 209抗体

(a)アミノ酸配列

配列番号： 563(VH)；配列番号： 564(VH CDR1)；配列番号： 565(VH CDR2)；配列番号： 566(VH CDR3)；配列番号： 567(VL)；配列番号： 568(VL CDR1)；配列番号： 569(VL CDR2) ;配列番号： 570(VL CDR3)

(b)塩基配列

配列番号： 871(VH)；配列番号： 872(VL)

[0357] 039- 016抗体

(a)アミノ酸配列

配列番号： 571(VH) ;配列番号： 572(VH CDR1) ;配列番号： 573(VH CDR2) ;配列番号： 574(VH CDR3)；配列番号： 575(VL)；配列番号： 576(VL CDR1)；配列番号： 577(VL CDR2) ;配列番号： 578(VL CDR3)

(b)塩基配列

配列番号： 873(VH)；配列番号： 874(VL)

[0358] 053-216抗体

(a)アミノ酸配列

配列番号： 579(VH) ;配列番号： 580(VH CDR1) ;配列番号： 581(VH CDR2) ;配列番号： 582(VH CDR3)；配列番号： 583(VL)；配列番号： 584(VL CDR1)；配列番号： 585(VL CDR2) ;配列番号： 586(VL CDR3)

(b)塩基配列

配列番号： 875(VH)；配列番号： 876(VL)

[0359] 075- 024抗体 (a)アミノ酸配列

配列番号： 587(VH)；配列番号： 588(VH CDR1)；配列番号： 589(VH CDR2)；配列番号： 590(VH CDR3) ;配列番号： 591(VL) ;配列番号： 592(VL CDR1) ;配列番号： 593(VL CDR2) ;配列番号： 594(VL CDR3)

(b)塩基配列

配列番号： 877(VH)；配列番号： 878(VL)

[0360] 075-110抗体

(a)アミノ酸配列

配列番号： 595(VH)；配列番号： 596(VH CDR1)；配列番号： 597(VH CDR2)；配列番号： 598(VH CDR3)；配列番号： 599(VL)；配列番号： 600(VL CDR1)；配列番号： 601(VL CDR2) ;配列番号： 602(VL CDR3)

(b)塩基配列

配列番号： 879(VH)；配列番号： 880(VL)

[0361] 086- 032抗体

(a)アミノ酸配列

配列番号： 603(VH)；配列番号： 604(VH CDR1)；配列番号： 605(VH CDR2)；配列番号： 606(VH CDR3)；配列番号： 607(VL)；配列番号： 608(VL CDR1)；配列番号： 609(VL CDR2) ;配列番号： 610(VL CDR3)

(b)塩基配列

配列番号： 881(VH)；配列番号： 882(VL)

[0362] 086- 035抗体

(a)アミノ酸配列

配列番号： 611(VH)；配列番号： 612(VH CDR1)；配列番号： 613(VH CDR2)；配列番号： 614(VH CDR3) ;配列番号： 615(VL) ;配列番号： 616(VL CDR1) ;配列番号： 617(VL CDR2) ;配列番号： 618(VL CDR3)

(b)塩基配列

配列番号： 883(VH)；配列番号： 884(VL)

[0363] 086- 036抗体 (a)アミノ酸配列

配列番号： 619(VH) ;配列番号： 620(VH CDR1) ;配列番号： 621(VH CDR2) ;配列番号： 622(VH CDR3)；配列番号： 623(VL)；配列番号： 624(VL CDR1)；配列番号： 625(VL CDR2) ;配列番号： 626(VL CDR3)

(b)塩基配列

配列番号： 885(VH)；配列番号： 886(VL)

[0364] 086- 061抗体

(a)アミノ酸配列

配列番号： 627(VH) ;配列番号： 628(VH CDR1) ;配列番号： 629(VH CDR2) ;配列番号： 630(VH CDR3) ;配列番号： 631(VL) ;配列番号： 632(VL CDR1) ;配列番号： 633(VL CDR2) ;配列番号： 634(VL CDR3)

(b)塩基配列

配列番号： 887(VH)；配列番号： 888(VL)

[0365] 086- 138抗体

(a)アミノ酸配列

配列番号： 635(VH) ;配列番号： 636(VH CDR1) ;配列番号： 637(VH CDR2) ;配列番号： 638(VH CDR3)；配列番号： 639(VL)；配列番号： 640(VL CDR1)；配列番号： 641(VL CDR2) ;配列番号： 642(VL CDR3)

(b)塩基配列

配列番号： 889(VH)；配列番号： 890(VL)

[0366] 086-182抗体

(a)アミノ酸配列

配列番号： 643(VH)；配列番号： 644(VH CDR1)；配列番号： 645(VH CDR2)；配列番号： 646(VH CDR3)；配列番号： 647(VL)；配列番号： 648(VL CDR1)；配列番号： 649(VL CDR2) ;配列番号： 650(VL CDR3)

(b)塩基配列

配列番号：891 (VH)；配列番号： 892(VL)

[0367] (7)HGFRに対する抗体 067-126抗体

(a)アミノ酸配列

配列番号： 651(VH);配列番号： 652(VH CDR1);配列番号： 653(VH CDR2);配列番号： 654(VH CDR3);配列番号： 655(VL);配列番号： 656(VL CDR1);配列番号： 657(VL CDR2);配列番号： 658(VL CDR3)

(b)塩基配列

配列番号： 893(VH)；配列番号： 894(VL)

[0368] 067-133抗体

(a)アミノ酸配列

配列番号： 659(VH);配列番号： 660(VH CDR1);配列番号： 661(VH CDR2);配列番号： 662(VH CDR3)；配列番号： 663(VL)；配列番号： 664(VL CDR1)；配列番号： 665(VL CDR2);配列番号： 666(VL CDR3)

(b)塩基配列

配列番号： 895(VH)；配列番号： 896(VL)

[0369] 067- 287抗体

(a)アミノ酸配列

配列番号： 667(VH);配列番号： 668(VH CDR1);配列番号： 669(VH CDR2);配列番号： 670(VH CDR3);配列番号： 671(VL);配列番号： 672(VL CDR1);配列番号： 673(VL CDR2);配列番号： 674(VL CDR3)

(b)塩基配列

配列番号： 897(VH)；配列番号： 898(VL)

[0370] (8)ITGA3に対する抗体

064-002抗体

(a)アミノ酸配列

配列番号： 675(VH);配列番号： 676(VH CDR1);配列番号： 677(VH CDR2);配列番号： 678(VH CDR3)；配列番号： 679(VL)；配列番号： 680(VL CDR1)；配列番号： 681(VL CDR2);配列番号： 682(VL CDR3)

(b)塩基配列配列番号： 899(VH)；配列番号： 900(VL)

[0371] 064-006抗体

(a)アミノ酸配列

配列番号： 683(VH) ;配列番号： 684(VH CDR1) ;配列番号： 685(VH CDR2) ;配列番号： 686(VH CDR3)；配列番号： 687(VL)；配列番号： 688(VL CDR1)；配列番号： 689(VL CDR2) ;配列番号： 690(VL CDR3)

(b)塩基配列

配列番号： 901(VH)；配列番号： 902(VL)

[0372] 064- 012a抗体

(a)アミノ酸配列

配列番号： 691(VH) ;配列番号： 692(VH CDR1) ;配列番号： 693(VH CDR2) ;配列番号： 694(VH CDR3) ;配列番号： 695(VL) ;配列番号： 696(VL CDR1) ;配列番号： 697(VL CDR2) ;配列番号： 698(VL CDR3)

(b)塩基配列

配列番号： 903(VH)；配列番号： 904(VL)

[0373] 064-012b抗体

(a)アミノ酸配列

配列番号： 699(VH)；配列番号： 700(VH CDR1)；配列番号： 701(VH CDR2)；配列番号： 702(VH CDR3)；配列番号： 703(VL)；配列番号： 704(VL CDR1)；配列番号： 705(VL CDR2) ;配列番号： 706(VL CDR3)

(b)塩基配列

配列番号： 905(VH)；配列番号： 906(VL)

[0374] 064- 014抗体

(a)アミノ酸配列

配列番号： 707(VH)；配列番号： 708(VH CDR1)；配列番号： 709(VH CDR2)；配列番号： 710(VH CDR3) ;配列番号： 711(VL) ;配列番号： 712(VL CDR1) ;配列番号： 713(VL CDR2) ;配列番号： 714(VL CDR3)

(b)塩基配列配列番号： 907(VH)；配列番号： 908(VL)

[0375] 064- 054抗体

(a)アミノ酸配列

配列番号： 715(VH)；配列番号： 716(VH CDR1)；配列番号： 717(VH CDR2)；配列番号： 718(VH CDR3) ;配列番号： 719(VL) ;配列番号： 720(VL CDR1) ;配列番号： 721(VL CDR2) ;配列番号： 722(VL CDR3)

(b)塩基配列

配列番号： 909(VH)；配列番号： 910(VL)

[0376] 064-085抗体

(a)アミノ酸配列

配列番号： 723(VH)；配列番号： 724(VH CDR1)；配列番号： 725(VH CDR2)；配列番号： 726(VH CDR3)；配列番号： 727(VL)；配列番号： 728(VL CDR1)；配列番号： 729(VL CDR2) ;配列番号： 730(VL CDR3)

(b)塩基配列

配列番号：911 (VH)；配列番号： 912(VL)

[0377] 064-093抗体

(a)アミノ酸配列

配列番号： 731(VH) ;配列番号： 732(VH CDR1) ;配列番号： 733(VH CDR2) ;配列番号： 734(VH CDR3)；配列番号： 735(VL)；配列番号： 736(VL CDR1)；配列番号： 737(VL CDR2) ;配列番号： 738(VL CDR3)

(b)塩基配列

配列番号： 913(VH)；配列番号： 914(VL)

[0378] 064-116抗体

(a)アミノ酸配列

配列番号： 739(VH)；配列番号： 740(VH CDR1)；配列番号： 741(VH CDR2)；配列番号： 742(VH CDR3)；配列番号： 743(VL)；配列番号： 744(VL CDR1)；配列番号： 745(VL CDR2) ;配列番号： 746(VL CDR3)

(b)塩基配列配列番号： 915(VH)；配列番号： 916(VL)

[0379] 065- 183抗体

(a)アミノ酸配列

配列番号： 747(VH)；配列番号： 748(VH CDR1)；配列番号： 749(VH CDR2)；配列番号： 750(VH CDR3) ;配列番号： 751(VL) ;配列番号： 752(VL CDR1) ;配列番号： 753(VL CDR2) ;配列番号： 754(VL CDR3)

(b)塩基配列

配列番号： 917(VH)；配列番号： 918(VL)

[0380] 067-142抗体

(a)アミノ酸配列

配列番号： 763(VH)；配列番号： 764(VH CDR1)；配列番号： 765(VH CDR2)；配列番号： 766(VH CDR3)；配列番号： 767(VL)；配列番号： 768(VL CDR1)；配列番号： 769(VL CDR2) ;配列番号： 770(VL CDR3)

(b)塩基配列

配列番号： 921(VH)；配列番号： 922(VL)

[0381] 068- 007抗体

(a)アミノ酸配列

配列番号： 771(VH)；配列番号： 772(VH CDR1)；配列番号： 773(VH CDR2)；配列番号： 774(VH CDR3)；配列番号： 775(VL)；配列番号： 776(VL CDR1)；配列番号： 777(VL CDR2) ;配列番号： 778(VL CDR3)

(b)塩基配列

配列番号： 923(VH)；配列番号： 924(VL)

[0382] (9)ALCAMに対する抗体

029-143抗体

(a)アミノ酸配列

配列番号： 779(VH) ;配列番号： 780(VH CDR1) ;配列番号： 781(VH CDR2) ;配列番号 782(VH CDR3)；配列番号： 783(VL)；配列番号： 784(VL CDR1)；配列番号： 7 85(VL CDR2) ;配列番号： 786(VL CDR3) (b)塩基配列

配列番号： 925(VH)；配列番号： 926(VL)

[0383] 045- 134抗体

(a)アミノ酸配列

配列番号： 787(VH)；配列番号： 788(VH CDR1)；配列番号： 789(VH CDR2)；配列番号： 790(VH CDR3) ;配列番号： 791(VL) ;配列番号： 792(VL CDR1) ;配列番号： 793(VL CDR2) ;配列番号： 794(VL CDR3)

(b)塩基配列

配列番号： 927(VH)；配列番号： 928(VL)

[0384] 062- 101抗体

(a)アミノ酸配列

配列番号： 795(VH)；配列番号： 796(VH CDR1)；配列番号： 797(VH CDR2)；配列番号： 798(VH CDR3)；配列番号： 799(VL)；配列番号： 800(VL CDR1)；配列番号： 801(VL CDR2) ;配列番号： 802(VL CDR3)

(b)塩基配列

配列番号： 929(VH)；配列番号： 930(VL)

[0385] 062-109抗体

(a)アミノ酸配列

配列番号： 803(VH)；配列番号： 804(VH CDR1)；配列番号： 805(VH CDR2)；配列番号： 806(VH CDR3)；配列番号： 807(VL)；配列番号： 808(VL CDR1)；配列番号： 809(VL CDR2) ;配列番号： 810(VL CDR3)

(b)塩基配列

配列番号：931 (VH)；配列番号： 932(VL)

[0386] 084-103抗体

(a)アミノ酸配列

配列番号： 811(VH)；配列番号： 812(VH CDR1)；配列番号： 813(VH CDR2)；配列番号： 814(VH CDR3) ;配列番号： 815(VL) ;配列番号： 816(VL CDR1) ;配列番号： 817(VL CDR2) ;配列番号： 818(VL CDR3) (b)塩基配列

配列番号： 933(VH)；配列番号： 934(VL)

[0387] 052-274抗体

(a)アミノ酸配列

配列番号： 819(VH) ;配列番号： 820(VH CDR1) ;配列番号： 821(VH CDR2) ;配列番号： 822(VH CDR3)；配列番号： 823(VL)；配列番号： 824(VL CDR1)；配列番号： 825(VL CDR2) ;配列番号： 826(VL CDR3)

(b)塩基配列

配列番号： 935(VH)；配列番号： 936(VL)

[0388] 029-067抗体

(a)アミノ酸配列

配列番号： 827(VH) ;配列番号： 828(VH CDR1) ;配列番号： 829(VH CDR2) ;配列番号： 830(VH CDR3) ;配列番号： 831(VL) ;配列番号： 832(VL CDR1) ;配列番号： 833(VL CDR2) ;配列番号： 834(VL CDR3)

(b)塩基配列

配列番号： 937(VH)；配列番号： 938(VL)

[0389] 083- 131抗体

(a)アミノ酸配列

配列番号： 835(VH) ;配列番号： 836(VH CDR1) ;配列番号： 837(VH CDR2) ;配列番号： 838(VH CDR3)；配列番号： 839(VL)；配列番号： 840(VL CDR1)；配列番号： 841(VL CDR2) ;配列番号： 842(VL CDR3)

(b)塩基配列

配列番号： 939(VH)；配列番号： 940(VL)

[0390] (10)CD46に対する抗体

066-069抗体

(a)アミノ酸配列

配列番号： 755(VH)；配列番号： 756(VH CDR1)；配列番号： 757(VH CDR2)；配列番号： 758(VH CDR3)；配列番号： 759(VL)；配列番号： 760(VL CDR1)；配列番号： 761(VL CDR2) ;配列番号： 762(VL CDR3) (b)塩基配列

配列番号： 919(VH)；配列番号： 920(VL) [0391] (ll)LARに対する抗体

064-044抗体

(a)アミノ酸配列

配列番号： 944(VH)；配列番号： 945(VL)

(b)塩基配列

配列番号： 956(VH)；配列番号： 957(VL) [0392] 065- 030抗体

(a)アミノ酸配列

配列番号： 946(VH)；配列番号： 947(VL)

(b)塩基配列

配列番号： 958(VH)；配列番号： 959(VL) [0393] 065- 358抗体

(a)アミノ酸配列

配列番号： 948(VH)；配列番号： 949(VL)

(b)塩基配列

配列番号： 960(VH)；配列番号： 961(VL) [0394] 066- 019抗体

(a)アミノ酸配列

配列番号： 950(VH)；配列番号： 951(VL)

(b)塩基配列

配列番号： 962(VH)；配列番号： 963(VL) [0395] 079- 085抗体

(a)アミノ酸配列

配列番号： 952(VH)；配列番号： 953(VL)

(b)塩基配列配列番号： 964(VH)；配列番号： 965(VL)

[0396] (12)BCAMに対する抗体

067- 024抗体

(a)アミノ酸配列

配列番号： 954(VH)；配列番号： 955(VL)

(b)塩基配列

配列番号： 966(VH)；配列番号： 967(VL)

(13)IgSF4に対する抗体

076-048抗体

(a)アミノ酸配列

配列番号： 968(VH)；配列番号： 969(VL)

(b)塩基配列

配列番号： 970(VH)；配列番号： 971(VL)

[0397] 21. ITGA3抗体であることの確認実験

免疫沈降マススペクトル解析の結果より、一部の抗体群について、それに含まれる抗体は VLA complexを認識していることがわかつつていた力抗原が ITGA3なの力 I TGB1なの力、それとも CD151などの複合体を形成する他の分子なのかを厳密な意味で決定できていなかった。そこで、抗体クローン（015-003, 064-002, 064-006, 064 -012, 064-014, 064-054, 064-085, 064-091, 064-093, 064-116, 065-183, 067-142 , 068-007)について RNAiを用いてその抗原を検証することにした。

[0398] 21-1 実験手順

Invitrogen社より購入した ITGA3 stealth oligo RNA 400pmolと Invitrogen社製 lipofect RNAi MAX 100 μ 1を GIBCO- BRL社製 Opti- MEMI 8mlと混ぜ、室温にて 10分間静置した後、これにの SKOv- 3細胞液 4ml (2xl06cells)と RPMI 1640-10%FBS 28mlを入れ、 10cm培養皿 4枚に播種した後、 C02培養器内で 2日間培養した。培養後の細胞に 1 %トリプシン溶液を作用させて細胞を遊離し、 5%BSA/PBS液にて回収し、最終的に lm 1の細胞浮遊液とした。実験は ITGB1についても同様にして行った。 RNAiなしの群（コントロール群）については、 stealth oligoを作用させない以外、同様の条件とした。回収した細胞 50 /z lに 2.5 /z lの正常ャギ血清を加えた後、 1次抗体液をカ卩え、 5%BS A/PBSにて終量を 100 μ 1とした。 1次抗体（抗 ITGA3抗体又は抗 ITGB1抗体 (CHEMI CON社製マウスモノクローナル抗体)）の使用量は 1 μ 1とし、検討対象のサンプル (例えば 015-003 cp3型抗体）については 10倍濃縮上清を 7 1使用することにした。次に、室温にて 10分間静置した後、遠心処理に供した。上清を廃棄した後、 5%BSA /PBS 200 1をカ卩えて洗浄した。続いて、サンプル 015-003cp3型抗体については、抗 cp3マウスモノクローナル抗体（MBL社特製）を 5 μ g/mlの濃度になるよう 5%BSA/PBS で希釈したものを 100 1添加した後、室温にて 10分間静置した。遠心処理後、上清を廃棄した。 5%BSA/PBS 200 1をカ卩えて洗浄した後、 5%BSA/PBSにて 1000倍希釈した ALEXA488標識抗マウス IgGャギ抗体 100 /z 1を反応させた。室温にて 10分間静置した後、遠心処理して上清を廃棄し、 5%BSA/PBS 200 1をカ卩えて洗浄した。このようにして得られた細胞を OptilyseB (ベックマンコールター社製） 50 μ 1に懸濁した。 10分間静置した後、 PBS 600 1を加えて希釈した。続いて CeU- Strainer (BD Falcon社製）で処理した後、 FACS Caliber (ベックマンコールター社製）を用いた測定に供した。

[0399] 21-2 結果

以上の RNAi実験の結果を図 67に示す。 A (抗 ITGA3抗体を用いた FCMの結果）と B (抗 ITGB1抗体を用いた FCMの結果)ではピークパターンが相違することがわかる。サンプル（015- 003, 064-002, 064-006, 064-012, 064-014, 064-054, 064-085, 064 -091, 064-093, 064-116, 065-183, 067-142, 068-007)については、いずれも Aと同様のピークパターン (C)を示した。この結果より、これらの抗体クローンの認識抗原は ITGA3であることが確認された。

尚、抗 HER1抗体、抗 HER2抗体、抗 HGFR抗体、抗 IgSF4抗体、抗 EpCAM抗体、抗 CD147抗体、抗 CD166抗体、又は抗 MCP抗体として取得された各抗体について同様の RNAi実験を行った結果、抗原に誤りはなぐ本発明の方法 (パネルを用いた方法や三次元 ELISA方）の有用性が確認された。

[0400] 22.各抗体クローンの癌組織特異性

取得に成功した抗体クローンの臨床癌検体に対する免疫染色性を、上記 11.の欄に記載した方法と同様の方法で検討したところ、図 68に示す結果が得られた。これらの抗体クローンは、対応する癌の研究や診断に有用である。

また、いくつかの癌について、ステージの異なる臨床検体を用意し、それに対する抗体クローンの免疫染色性を調べた。その結果、いくつかの抗体クローンは癌腫特異的な染色性にカ卩え、ステージ特異的な染色性も示した（図 69)。このように実際の臨床組織では、同一の癌腫、同一の悪性度であったとしても各抗体クローンに対する反応性に差を認めた。本結果は、本発明が提供する抗体セットを利用することで癌における新たなテーラメーメイド型診断を行うことができ、今までの診断基準よりも更に詳細な診断、換言すれば癌のステージ及び病態の再分類ィ匕が可能になることを示している。一方、抗体セットによる癌のステージ及び病態の細分類ィ匕は同時に治療方針の決定にも役立つ。また、特異的な反応性が認められた抗体は、治療用抗体としても有用であると同時にドラッグスクリーニングにおけるツールとしても有用である。このように、本発明が提供する抗体セットは、癌のテーラーメイド診断を可能にするだけでなぐ癌のテーラーメイド型治療をも実現し得るという、非常に大きな価値、意義をもつ。

産業上の利用可能性

[0401] 本発明によれば、細胞表面抗原に対する複数の抗体を迅速に分類する手段が提供される。また、分類された抗体の抗原を迅速に同定する手段も提供される。これらの手段を利用することによって癌の治療や診断、或、は癌の発症機構の研究等に有用な抗体を効率的に取得することが可能となる。また、本発明の分類法及び抗原の同定法を利用すれば、有用な抗体セットとそれらの特性を表示したパネルを提供することができ、テーラーメイド型医療への多大な貢献が期待される。

一方、本発明では、癌特異的に発現する抗原を認識する抗体が提供される。これらの抗体は、それが認識する癌表面膜蛋白を特異的に発現する癌細胞を標的とした治療用抗体、診断用抗体、研究用抗体等として利用されることが期待される。

[0402] この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。

本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする _c

Claims

請求の範囲

[I] 以下のステップを含む、抗体の分類法、

(2)前記抗体の各々を同種類の細胞に接触させるステップ、

[2] 前記細胞表面抗原がインタタトな状態の細胞表面抗原である、請求項 1に記載の分類法。

[3] 前記細胞表面抗原が癌細胞の細胞表面抗原である、請求項 1又は 2に記載の分類法。

[4] 前記複数の抗体が、細胞表面抗原を認識するものとして抗体ライブラリーの中から選抜された各抗体クローンに由来する抗体の集合力もなる、請求項 1に記載の分類法。

[5] 前記抗体ライブラリーがファージ抗体ライブラリーである、請求項 4に記載の分類法

[6] 前記抗体が、標識物質が結合又は融合された抗体である、請求項 1に記載の分類法。

[7] 前記抗体が標識物質を含まな!/、抗体であり、ステップ（2)の後、前記細胞に結合した抗体を標識化するステップが実施される、請求項 1に記載の分類法。

[8] 前記細胞が株化細胞である、請求項 1に記載の分類法。

[9] 前記細胞が株化癌細胞である、請求項 1に記載の分類法。

[10] 前記データが抗体結合量と細胞数との関係を示すヒストグラムであり、該ヒストグラムの形状の比較によって前記データの類似性が判定される、請求項 1に記載の分類法

[II] 前記データが抗体結合量と細胞数との関係を示すヒストグラムであり、該ヒストグラムの中央値、最頻値、最大値、範囲、標準偏差、尖度、及び歪度力なる群より選択されるー以上の値に基づ!/、て前記データの類似性が判定される、請求項 1に記載の分類法。

[12] 前記ヒストグラムの中央値、最頻値、及び尖度の値に基づいて前記データの類似性が判定される、請求項 11に記載の分類法。

[13] 前記抗体結合量が蛍光強度で示される、請求項 10又は 11に記載の分類法。

[14] ステップ (4)にお、て、同一の又は類似性の高!、データを与える複数の抗体を一つの抗体グループとして分類する、請求項 1に記載の分類法。

[15] 二種類以上の細胞を用意し、各細胞を用いてステップ（2)〜 (4)を行う、請求項 1 に記載の分類法。

[16] 前記細胞の中で少なくとも二種類の細胞に関して同一又は類似性の高いデータを与える複数の抗体を一つの抗体グループとして分類する、請求項 15に記載の分類法。

[17] 分類の際又は分類後、細胞表面抗原に対する反応性が低!ヽと判定された抗体を排除する、請求項 1に記載の分類法。

[18] 抗体の分類結果をパネルとして表示する、請求項 1に記載の分類法。

[19] ステップ (4)の後、以下のステップを行う、請求項 1〜18のいずれかに記載の分類法、

(i)分類した抗体にそれぞれ、第 1パラメータ、第 2パラメータ、 · ·、及び第 nパラメ一タカもなる n個のパラメータ（但し、 nは 2以上の整数であり、各パラメータは 2個以上のノラメータ値を有し、各パラメータについて同一のパラメータ値が 2種類以上の抗体に付与される）の組合せを関連付けるステップ、

(V)ステップ (i)に供した抗体の中から、全パラメータに関して、前記ステップ (iv)で特定した組合せが該当する抗体を選抜するステップ、 (vi)選抜した抗体を一つの抗体グループとして分類するステップ。

[20] 各回の試行でパラメータの組合せが異なる条件下、前記ステップ (i)〜 (V)を複数回試行し、各回の結果が相矛盾しない抗体を選抜し、該抗体について前記ステップ (vi)を行う、請求項 19に記載の分類法。

[21] ステップ (V)とステップ (vi)の間に以下のステップを実施する、請求項 19に記載の分類法、

[22] 前記ステップ (V— l)〜(v— 4)を 2回以上繰り返す、請求項 21に記載の分類法。

[23] n= 3である、請求項 19〜22のいずれかに記載の分類法。

[24] 二種類以上の標的抗原を用意し、各標的抗原を用いてステップ (iii)〜 (vi)を行う、請求項 19〜23のいずれかに記載の分類法。

[25] 前記標的抗原力 HER1、 HER2、 CD46、 ITGA3、 ICAM1、 ALCAM、 CD147、 IgSF4

、 BCAM、 ClqR、 CD44、 CD73、 LAR、 EpCAM及び HGFRからなる群より選択される抗原である、請求項 19〜24のいずれかに記載の分類法。

[26] 以下のステップを含む、抗原の同定法、

(2)前記抗体の各々を同種類の細胞に接触させるステップ、

(3)ステップ（2)後の各細胞をフローサイトメトリーで解析し、抗体と細胞表面との反応性を示すデータを得るステップ、 (4)得られたデータを比較し、その類似性に基づ!/ヽて各抗体を分類するステップ、

[27] ステップ（5)にお、て、各抗体グループより一の抗体が選抜される、請求項 26に記載の同定法。

[28] ステップ（5)において、フローサイトメトリー解析の結果より、抗原に対して高反応性であると判断された抗体が選抜される、請求項 26に記載の同定法。

[29] ステップ（5)において、抗原の同定が免疫沈降試験、ウェスタンブロット、ァフィ-ティークロマトグラフィー、プロテオミタスの手法 (電気泳動、質量分析、ゲノムデータべース検索、ノィォインフォマティックスによる分析）、及び対応遺伝子の発現解析からなる群より選択される一以上の方法で行われる、請求項 26に記載の同定法。

[30] ステップ (5)で同定された抗原と、ステップ (6)で該抗原が関連付けられた抗体グループに属する抗体との反応性を調べ、前記推定が正し、ことを確認するステップを更に含む、請求項 26に記載の同定法。

[31] 抗原の同定結果をパネルとして表示する、請求項 26に記載の同定法。

[32] 前記パネルが以下の（a)〜（c)のいずれかである、請求項 31に記載の同定法、

[33] 以下のステップを含む、特定の疾患との間に関連性を有する抗体の取得法、

(1)請求項 1に記載の分類法で分類された複数の抗体グループの中から一又は二以上の抗体グループを選抜するステップ、

(1)請求項 19に記載の分類法で分類された複数の抗体グループの中から一又は二以上の抗体グループを選抜するステップ、

[36] 以下のステップを含む、特定の疾患との間に関連性を有する抗体セットの取得法、

(1)請求項 1に記載の分類法で分類された複数の抗体グループの中から、認識する抗原が異なる二以上の抗体グループを選抜するステップ、

(2)選抜した各抗体グループの抗体と、特定の疾患との反応性を、二種類以上の疾患について調べるステップ、及び (3) V、ずれかの疾患に対して特異的反応性を示した抗体が属する抗体グループからそれぞれ抗体を選抜し、選抜した抗体同士を組み合わせるステップ。

[37] 以下のステップを含む、特定の疾患との間に関連性を有する抗体セットの取得法、

(1)請求項 1に記載の分類法で分類された複数の抗体グループの中から、認識する抗原が共通する二以上の抗体グループを選抜するステップ、

(3)二つ以上の抗体が特異的反応性を示した疾患を選抜した後、該疾患に対して特異的反応性を示した抗体が属する抗体グループからそれぞれ抗体を選抜し、選抜した抗体同士を組み合わせるステップ。

[40] 以下のステップを含む、特定の疾患との間に関連性を有する抗体セットの取得法、

(1)請求項 19に記載の分類法で分類された複数の抗体グループの中から、認識する抗原が異なる二以上の抗体グループを選抜するステップ、 (2)選抜した各抗体グループの抗体と、特定の疾患との反応性を、二種類以上の疾患について調べるステップ、及び

(1)請求項 19に記載の分類法で分類された複数の抗体グループの中から、認識する抗原が異なる二以上の抗体グループを選抜するステップ、

(1)請求項 19に記載の分類法で分類された複数の抗体グループの中から、認識する抗原が共通する二以上の抗体グループを選抜するステップ、

[43] 前記疾患が、腎臓癌、肝細胞癌、胆肝癌、肺胞上皮癌、肺扁平上皮癌、肺腺癌、脾臓癌、大腸腺癌、及び卵巣癌力もなる群より選択される疾患である、請求項 33〜4 2の!、ずれかに記載の取得法。

[44] ステップ（2)にお、て、前記反応性が免疫染色法、免疫沈降法、フローサイトメトリ一解析、細胞 ELISA、疾患関連分子 (疾患原因遺伝子産物等）と抗体との分子間相互作用解析、疾患モデル細胞 (ある!/、は動物)への適用試験からなる群より選択される一以上の方法で調べられる、請求項 33〜42のいずれかに記載の取得法。

[45] 請求項 33又は 34に記載の方法で取得される、単離された抗体。

[46] 請求項 35〜42の、ずれかに記載の方法で取得される抗体セット。 [47] 以下のステップを含む、抗体と疾患との関連性を表示したパネルの作成法、

[53] 請求項 47〜52の!ヽずれかに記載の方法で作成されたパネル。

(a)請求項 33に記載の方法で取得される単離された抗体と、請求項 47に記載の方法で作製されたパネルとの組合せ、

(b)請求項 35に記載の方法で取得される抗体セットと、請求項 47に記載の方法で作製されたパネルとの組合せ、

(c)請求項 36に記載の方法で取得される抗体セットと、請求項 48に記載の方法で作製されたパネルとの組合せ、

(d)請求項 37に記載の方法で取得される抗体セットと、請求項 48に記載の方法で作製されたパネルとの組合せ、

(e)請求項 38に記載の方法で取得される抗体セットと、請求項 49に記載の方法で作製されたパネルとの組合せ、

(f)請求項 34に記載の方法で取得される単離された抗体と、請求項 50に記載の方法で作製されたパネルとの組合せ、

(g)請求項 39に記載の方法で取得される抗体セットと、請求項 50に記載の方法で作製されたパネルとの組合せ、

(h)請求項 40に記載の方法で取得される抗体セットと、請求項 51に記載の方法で作製されたパネルとの組合せ、

(i)請求項 41に記載の方法で取得される抗体セットと、請求項 51に記載の方法で作製されたパネルとの組合せ、及び

(j)請求項 42に記載の方法で取得される抗体セットと、請求項 52に記載の方法で作製されたパネルとの組合せ。

以下のステップを含む、細胞表面抗原が指標となる疾患の検査法、

(3)ステップ（2)の結果を前記パネルに照合するステップ。

以下のステップを含む、特定の疾患に対する最適な治療法を選択する方法、

(3)ステップ（2)の結果を前記パネルに照合するステップ、

(4)照合結果に従!、、有効な抗体を選択するステップ。

前記有効な抗体が、ステップ（2)において特異的な反応性を示した抗体又はそれと等価な抗体である、請求項 56に記載の方法。

前記特定の疾患が、 HER1、 HER2、 CD46、 ITGA3、 ICAM1、 ALCAM、 CD147、 IgS F4、 BCAM、 ClqR、 CD44、 CD73、 LAR、 EpCAM及び HGFRからなる群より選択される細胞表面抗原が指標となる疾患である、請求項 56に記載の方法。

前記パネルに、 048-006抗体、 057-091抗体、 059-152抗体、 048-040抗体、 054-10 1抗体、 055- 147抗体、 059- 173抗体、 067- 149抗体、 067- 176抗体、 015- 126抗体、 0 15- 044抗体、 015- 102抗体、 015- 136抗体、 015- 143抗体、 015- 209抗体、 039- 016抗体、 053-216抗体、 075-024抗体、 075-110抗体、 086-032抗体、 086-035抗体、 086- 036抗体、 086-061抗体、 086-138抗体、 086-182抗体、 035-224抗体、 045-011抗体、 051- 144抗体、 052- 053抗体、 052- 073抗体、 053- 049抗体、 3172- 120抗体、 066-0 69抗体、 015- 003抗体、 064- 002抗体、 064- 006抗体、 064- 012a抗体、 064- 012b抗体、 064-014抗体、 064-054抗体、 064-085抗体、 064-093抗体、 064-116抗体、 065-18 3抗体、 067-142抗体、 068-007抗体、 052-033抗体、 053-042抗体、 053-051抗体、 0 53-059抗体、 053-085抗体、 035-234抗体、 040-107抗体、 041-118抗体、 066-174抗体、 083-040抗体、 029-143抗体、 045-134抗体、 062-101抗体、 062-109抗体、 084- 103抗体、 052- 274抗体、 029- 067抗体、 083- 131抗体、 059- 053抗体、 064- 003抗体、 067-213抗体、 067-153抗体、 067-126抗体、 067-133抗体、 067-287抗体、 064-04 4抗体、 065-030抗体、 065-358抗体、 066-019抗体、 079-085抗体、 067-024抗体及び 076-048抗体からなる群より選択される二以上の抗体が表示されている、請求項 5 6に記載の方法。

(3)ステップ（2)の結果を前記パネルに照合するステップ、

(4)照合結果に従!、、有効な抗体を選択するステップ。

[61] 前記有効な抗体が、ステップ（2)にお、て特異的な反応性を示した抗体又はそれと等価な抗体である、請求項 60に記載の方法。

[62] 前記特定の疾患が、扁平上皮癌、腺扁平上皮癌、細気管支肺胞上皮癌、腺癌、及び大細胞癌からなる群より選択される疾患である、請求項 60に記載の方法。

[63] 以下の (1)〜(3)からなる群より選択される配列番号の組合せ (重鎖可変領域 CDR3 のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR3のアミノ酸配列を示す配列番号)で規定される、重鎖可変領域 CDR3と軽鎖可変領域 CDR3を備えること、

以下の (4)〜(6)力なる群より選択される配列番号の組合せ (重鎖可変領域 CDR2 のアミノ酸配列を示す配列番号、重鎖可変領域 CDR3のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR2のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR3のアミノ酸配列を示す配列番号)で規定される、重鎖可変領域 CDR2及び CDR3と軽鎖可変領域 CDR2及び CDR3を備えること、

(1)配列番号: 4、配列番号: 8

(2)配列番号： 12、配列番号： 16

(3)配列番号： 20、配列番号： 24

(10)配列番号： 1、配列番号： 5

(11)配列番号： 9、配列番号： 13

(12)配列番号： 17、配列番号： 21

(18)配列番号： 524(VH CDR1)、配列番号： 525(VH CDR2)、配列番号： 526(VH C DR3)、配列番号： 528(VL CDR1)、配列番号： 529(VL CDR2)、配列番号： 530(VL

CDR3)

(19)配列番号: :483(VH) 配列番号: :487(VL)

(20)配列番号: :491(VH) 配列番号: :495(VL)

(21)配列番号: :499(VH) 配列番号: ： 503(VL)

(22)配列番号: ： 507(VH) 配列番号: : 511(VL)

(23)配列番号: : 515(VH) 配列番号: : 519(VL)

(24)配列番号: : 523(VH) 配列番号: : 527(VL)

(1)配列番号： 28、配列番号： 32

(4)配列番号： 25、配列番号： 29

(17)配列番号： 628(VH CDR1)、配列番号： 629(VH CDR2)、配列番号： 630(VH C DR3)、配列番号： 632(VL CDR1)、配列番号： 633(VL CDR2)、配列番号： 634(VL CDR3) (18)配列番号： 636(VH CDR1)、配列番号： 637(VH CDR2)、配列番号： 638(VH C DR3)、配列番号： 640(VL CDR1)、配列番号： 641(VL CDR2)、配列番号： 642(VL CDR3)

(20)配列番号: :531(VH) 配列番号: :535(VL)

(21)配列番号: :539(VH) 配列番号: ： 543(VL)

(22)配列番号: ： 547(VH) 配列番号: :551(VL)

(23)配列番号: :555(VH) 配列番号: :559(VL)

(24)配列番号: :563(VH) 配列番号: :567(VL)

(25)配列番号: :571(VH) 配列番号: :575(VL)

(26)配列番号: :579(VH) 配列番号: :583(VL)

(27)配列番号: :587(VH) 配列番号: :591(VL)

(28)配列番号: :595(VH) 配列番号: :599(VL)

(29)配列番号: :603(VH) 配列番号: :607(VL)

(30)配列番号: :611(VH) 配列番号: :615(VL)

(31)配列番号: :619(VH) 配列番号: :623(VL)

(32)配列番号: :627(VH) 配列番号: :631(VL)

(33)配列番号: :635(VH) 配列番号: :639(VL)

(34)配列番号: :643(VH) 配列番号: :647(VL)

以下の (1)〜 )力なる群より選択される配列番号の組合せ (重鎖可変領域 CDR3 のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR3のアミノ酸配列を示す配列番号)で規定される重鎖可変領域 CDR3と軽鎖可変領域 CDR3を備えること、

以下の (8)〜(14)力なる群より選択される配列番号の組合せ (重鎖可変領域 CDR2 のアミノ酸配列を示す配列番号、重鎖可変領域 CDR3のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR2のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR3のアミノ酸配列を示す配列番号)で規定される、重鎖可変領域 CDR2及び CDR3と軽鎖可変領域 CDR2及び CDR3を備えること、

(1)配列番号： 36、配列番号： 40

(2)配列番号: 44、配列番号: 48

(3)配列番号： 52、配列番号： 56

(4)配列番号： 60、配列番号： 64

(5)配列番号： 68、配列番号： 72

(6)配列番号： 76、配列番号： 80

(7)配列番号： 84、配列番号： 88

(9)配列番号: 43、配列番号: 44、配列番号: 47、配列番号: 48

(10)配列番号： 51、配列番号： 52、配列番号： 55、配列番号： 56

(11)配列番号： 59、配列番号： 60、配列番号： 63、配列番号： 64

(12)配列番号： 67、配列番号： 68、配列番号： 71、配列番号： 72

(13)配列番号： 75、配列番号： 76、配列番号： 79、配列番号： 80

(14)配列番号：83、配列番号： 84、配列番号： 87、配列番号： 88

(23)配列番号 33、配列番号: : 37

(24)配列番号 41、配列番号: :45

(25)配列番号 49、配列番号: : 53

(26)配列番号 57、配列番号: : 61

(27)配列番号 65、配列番号: : 69

(28)配列番号 73、配列番号: : 77

(29)配列番号 81、配列番号: : 85

(30)配列番号： 755(VH)、配列番号： 759(VL)

(1)配列番号： 92、配列番号： 96

(4)配列番号 : 89、配列番号： 93

(8)配列番号： 700(VH CDR1)、配列番号： 701(VH CDR2)、配列番号： 702(VH CD R3)、配列番号： 704(VL CDR1)、配列番号： 705(VL CDR2)、配列番号： 706(VL C DR3) (9)配列番号： 708(VH CDR1)、配列番号： 709(VH CDR2)、配列番号： 710(VH CD R3)、配列番号： 712(VL CDR1)、配列番号： 713(VL CDR2)、配列番号： 714(VL C DR3)

(17)配列番号： 675(VH)、配列番号： 679(VL)

(18)配列番号： 683(VH)、配列番号： 687(VL)

(19)配列番号： 691(VH)、配列番号： 695(VL)

(20)配列番号： 699(VH)、配列番号： 703(VL) (21)配列番号:： 707(VH) 配列番号: : 711(VL)

(22)配列番号: : 715(VH) 配列番号: : 719(VL)

(23)配列番号: ： 723(VH) 配列番号: ： 727(VL)

(24)配列番号: : 731(VH) 配列番号: : 735(VL)

(25)配列番号: : 739(VH) 配列番号: ： 743(VL)

(26)配列番号: ： 747(VH) 配列番号: : 751(VL)

(27)配列番号: : 763(VH) 配列番号: : 767(VL)

(28)配列番号: : 771(VH) 配列番号: ： 775(VL)

以下の (1)〜(5)からなる群より選択される配列番号の組合せ (重鎖可変領域 CDR3 のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR3のアミノ酸配列を示す配列番号)で規定される重鎖可変領域 CDR3と軽鎖可変領域 CDR3を備えること、

以下の (6)〜(10)力なる群より選択される配列番号の組合せ (重鎖可変領域 CDR2 のアミノ酸配列を示す配列番号、重鎖可変領域 CDR3のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR2のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR3のアミノ酸配列を示す配列番号)で規定される、重鎖可変領域 CDR2及び CDR3と軽鎖可変領域 CDR2及び CDR3を備えること、

以下の (11)〜(15)からなる群より選択される配列番号の組合せ (重鎖可変領域 CDR 1のアミノ酸配列を示す配列番号、重鎖可変領域 CDR2のアミノ酸配列を示す配列番号、重鎖可変領域 CDR3のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR1のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR2のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR3のアミノ酸配列を示す配列番号)で規定される、重鎖可変領域 CD R1 CDR3と軽鎖可変領域 CDR1 CDR3を備えること、又は

(1)配列番号： 100、配列番号： 104

(2)配列番号： 108、配列番号： 112 (3)配列番号: : 116、配列番号: 120

(4)配列番号: : 124、配列番号: 128

(5)配列番号: : 132、配列番号: 136

(6)配列番号: ： 99、配列番号： 100、配列番号： 103、配列番号： 104

(7)配列番号: : 107、配列番号: 108、配列番号: 111、配列番号: 112

(8)配列番号: : 115、配列番号: 116、配列番号: 119、配列番号: 120

(9)配列番号: : 123、配列番号: 124、配列番号: 127、配列番号: 128

(16)配列番号： 97、配列番号： 101

(17)配列番号： 105、配列番号： 109

(18)配列番号： 113、配列番号： 117

(19)配列番号： 121、配列番号： 125

(20)配列番号： 129、配列番号： 133

(1)配列番号: 140、配列番号: 144

(2)配列番号: 148、配列番号: 152

(3)配列番号: 156、配列番号: 160

(4)配列番号: 164、配列番号: 168

(5)配列番号: 172、配列番号: 176

(6)配列番号: 139、配列番号: 140、配列番号: 143、配列番号: 144

(7)配列番号: 147、配列番号: 148、配列番号: 151、配列番号: 152

(8)配列番号: 155、配列番号: 156、配列番号: 159、配列番号: 160

(9)配列番号: 163、配列番号: 164、配列番号: 167、配列番号: 168

(16)配列番号： 137、配列番号： 141

(17)配列番号： 145、配列番号： 149

(18)配列番号： 153、配列番号： 157

(19)配列番号： 161、配列番号： 165

(20)配列番号： 169、配列番号： 173

(26)配列番号： 820(VH CDR1)、配列番号： 821(VH CDR2)、配列番号： 822(VH C DR3)、配列番号： 824(VL CDR1)、配列番号： 825(VL CDR2)、配列番号： 826(VL CDR3) (27)配列番号： 828(VH CDR1)、配列番号： 829(VH CDR2)、配列番号： 830(VH C DR3)、配列番号： 832(VL CDR1)、配列番号： 833(VL CDR2)、配列番号： 834(VL CDR3)

CDR3)

(29)配列番号: ： 779(VH) 配列番号: : 783(VL)

(30)配列番号: : 787(VH) 配列番号: : 791(VL)

(31)配列番号: : 795(VH) 配列番号: : 799(VL)

(32)配列番号: : 803(VH) 配列番号: : 807(VL)

(33)配列番号: : 811(VH) 配列番号: : 815(VL)

(34)配列番号: : 819(VH) 配列番号: : 823(VL)

(35)配列番号: : 827(VH) 配列番号: : 831(VL)

(36)配列番号: : 835(VH) 配列番号: : 839(VL)

以下の (3)に示す配列番号の組合せ (重鎖可変領域 CDR1のアミノ酸配列を示す配列番号、重鎖可変領域 CDR2のアミノ酸配列を示す配列番号、重鎖可変領域 CDR3 のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR1のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR2のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR3のアミノ酸配列を示す配列番号)で規定される、重鎖可変領域 CDR1 CDR3と軽鎖可変領域 CDR1 CDR3を備えること、又は以下の (4)に示す配列番号の組合せ (重鎖可変領域のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す配列番号)で規定される、重鎖可変領域と軽鎖可変領域を備えること、

(1)配列番号： 180、配列番号： 184

(4)配列番号： 177、配列番号： 181

[70] 以下の (1)に示す配列番号の組合せ (重鎖可変領域 CDR1のアミノ酸配列を示す配列番号、重鎖可変領域 CDR2のアミノ酸配列を示す配列番号、重鎖可変領域 CDR3 のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR1のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR2のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR3のアミノ酸配列を示す配列番号)で規定される、重鎖可変領域 CDR1〜CDR3と軽鎖可変領域 CDR1〜CDR3を備えること、又は

(2)配列番号： 451(VH)、配列番号： 455(VL)

[71] 以下の (1)に示す配列番号の組合せ (重鎖可変領域 CDR1のアミノ酸配列を示す配列番号、重鎖可変領域 CDR2のアミノ酸配列を示す配列番号、重鎖可変領域 CDR3 のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR1のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR2のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR3のアミノ酸配列を示す配列番号)で規定される、重鎖可変領域 CDR1〜CDR3と軽鎖可変領域 CDR1〜CDR3を備えること、又は

(2)配列番号： 459(VH)、配列番号： 463(VL)

[72] 以下の (1)に示す配列番号の組合せ (重鎖可変領域 CDR1のアミノ酸配列を示す配列番号、重鎖可変領域 CDR2のアミノ酸配列を示す配列番号、重鎖可変領域 CDR3 のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR1のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR2のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR3のアミノ酸配列を示す配列番号)で規定される、重鎖可変領域 CDR1〜CDR3と軽鎖可変領域 CDR1〜CDR3を備えること、又は

(2)配列番号： 467(VH)、配列番号： 471(VL)

[73] 以下の (1)に示す配列番号の組合せ (重鎖可変領域 CDR1のアミノ酸配列を示す配列番号、重鎖可変領域 CDR2のアミノ酸配列を示す配列番号、重鎖可変領域 CDR3 のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR1のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR2のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR3のアミノ酸配列を示す配列番号)で規定される、重鎖可変領域 CDR1〜CDR3と軽鎖可変領域 CDR1〜CDR3を備えること、又は

(2)配列番号: 475(VH)、

配列番号： 479(VL)

以下の (1)〜(3)からなる群より選択される配列番号の組合せ (重鎖可変領域 CDR1 のアミノ酸配列を示す配列番号、重鎖可変領域 CDR2のアミノ酸配列を示す配列番号、重鎖可変領域 CDR3のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR1のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR2のアミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域 CDR3のアミノ酸配列を示す配列番号)で規定される、重鎖可変領域 CD R1〜CDR3と軽鎖可変領域 CDR1〜CDR3を備えること、又は

を特徴とする、 HGFRに対する特異的結合性を有する単離された抗体。

(4)配列番号： 651(VH)、配列番号： 655(VL)

(5)配列番号： 659(VH)、配列番号： 663(VL)

(6)配列番号： 667(VH)、配列番号： 671(VL)

[75] 以下の (1)〜(5)からなる群より選択される配列番号の組合せ (重鎖可変領域のァミノ酸配列を示す配列番号、軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す配列番号)で規定される、重鎖可変領域と軽鎖可変領域を備えること、

(1)配列番号： 944(VH)、配列番号： 945(VL)

(2)配列番号： 946(VH)、配列番号： 947(VL)

(3)配列番号： 948(VH)、配列番号： 949(VL)

(4)配列番号： 950(VH)、配列番号： 951(VL)

(5)配列番号： 952(VH)、配列番号： 953(VL)

(1)配列番号： 954(VH)、配列番号： 955(VL)

[77] 請求項 63〜76の、ずれかに記載の抗体の重鎖可変領域及び Z又は軽鎖可変領域をコードする、単離された核酸分子。

[78] 請求項 77に記載の核酸分子を発現可能に保持するベクター。

[79] 請求項 77に記載の核酸分子が導入されてヽる形質転換体。

[80] 請求項 63〜76の、ずれかに記載の抗体を有効成分として含む癌治療剤。

[81] 請求項 63〜76のいずれかに記載の抗体を含んでなる癌検査用又は癌研究用試薬。

[82] 胆肝癌又は脾臓癌の検査法であって、

(2)被検細胞又は組織を対象として CD46抗原を検出するステップ、を含む方法。

[83] 胆肝癌又は脾臓癌の検査法であって、

(2)被検細胞又は組織を対象として ITGA3を検出するステップ、を含む方法。

[84] 腎臓癌、肝細胞癌又は胆肝癌の検査法であって、

(2)被検細胞又は組織を対象として ALCAMを検出するステップ、を含む方法。

[85] 腎臓癌の検査法であって、

(2)被検細胞又は組織を対象として CD147抗原を検出するステップ、を含む方法。