WO2007126104A1 - しみ部位亢進遺伝子群を指標とした皮膚しみ形成予知方法、皮膚しみ形成抑制剤のスクリーニング方法 - Google Patents

しみ部位亢進遺伝子群を指標とした皮膚しみ形成予知方法、皮膚しみ形成抑制剤のスクリーニング方法 Download PDF

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Jiro Kishimoto
Osamu Moro
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    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • the present invention relates to a skin examination method for predicting the formation of skin spots.
  • melanin pigments are collected one after another and the surrounding epidermis. It will be sent to the cell. If the melanin pigment is produced at a fast pace and the turnover is not normal due to the influence of ultraviolet rays, etc., the melanin pigment will not be discharged to the outside and will remain on the skin. It is thought to end up.
  • the present inventor has eagerly investigated whether it is possible to provide a means for predicting whether or not the skin is likely to be stained before the skin is stained. And this inventor is senile pigment spot part and normal control As a result of microarray praying of RNA derived from the epidermis and upper dermis of 11 cases, it was found that the expression of the following genes was specifically enhanced or suppressed in the senile pigment spot site. Therefore, it was clarified that it was possible to determine that the skin was susceptible to stain formation by examining the expression of the following genes in human skin.
  • NM_015973 Galanin (GAL) neuropeptide suppression of inflammation 17159 2.58
  • the present invention provides a skin screening method for predicting skin spot formation.
  • This method is characterized in that a sebaceous gland gene is judged to be a skin that easily forms a stain when the expression of the gene in the epidermis is increased compared to the expression in the normal epidermis.
  • a stain is a brown or dark brown flat patch appearing on the skin.
  • the stains written this time mainly refer to senile pigment spots.
  • the sebaceous gland gene whose expression is enhanced is a gene encoding a protein selected from the group consisting of Table 1.
  • the present invention is a skin) f skin cancer 'inspection method for predicting spot formation, wherein the gene encoding a protein selected from the group consisting of Table 2 is expressed in normal epidermis. A method characterized by judging that the skin is easy to form a stain when it is enhanced compared to the expression of.
  • the present invention is a skin test method for predicting the formation of skin stains, and when the expression in Table 3 is lower than the expression in normal epidermis, it is easy to form a stain.
  • the variation in expression of the gene in the epidermis is determined by measuring the amount of the protein in the epidermis.
  • the measurement is performed by EL Isa method or RIA method using an antibody specific for the protein.
  • the variation in the expression of the gene in the epidermis is determined by measuring the amount of mRNA encoding the protein extracted from the epidermis.
  • the measurement of the mRNA is performed by a polymerase chain reaction method.
  • the present invention is a method for screening a skin blemishes formation inhibitory factor and / or a skin blemishes removal factor, which comprises expressing a candidate compound as an expression of the gene and / or an activity of a protein as a gene product thereof.
  • a method characterized by evaluating the ability to inhibit or enhance, and selecting an inhibitor or an activator having the ability to inhibit or enhance as a skin stain formation inhibiting factor and / or a skin stain removing factor.
  • this method applies the inhibitor or activator having the ability to inhibit or enhance the above to a skin model, and selects a drug having an effect of suppressing skin stain formation and removing Z or skin stain. Comprising.
  • the present invention relates to a gene encoding a protein selected from the group consisting of MLSTD 1, M0GAT 1, FADS2, FADS 1, HSD3 B1, EL0VL3, BG1, PECR, FABP7, FA2H, HA02, AL0X 15B.
  • the present invention provides a whitening method, a stain formation inhibiting method, or a stain removing method by suppressing the increase in the expression of. According to the present invention, it is possible to provide a skin inspection method for predicting the formation of skin spots.
  • Fig. 1 shows the distribution of differential expression of lipid-enhanced genes in the spot site and nearby normal sites by in-situ tubular hybridization.
  • the amber color of the white arrow indicates the epidermis where the signal was detected.
  • Each gene has been shown to have an increased tendency in the epidermis of the spot site.
  • Fig. 2 shows the distribution of the expression of the stratum corneum constituent protein in the skin and the distribution of the expression difference between the spot part of the stratum corneum constituent protein and the normal part nearby by fluorescence immunostaining.
  • the green part of the white arrow indicates the granule layer where the signal was detected.
  • Each gene has been shown to have a decreasing tendency in the epidermis of the spot site.
  • Figure 3 shows the results of counting the number of stratum corneum, comparing the number of stratum corneum with safranin, visualizing the stratum corneum by swelling with alkali.
  • the picture shows an example.
  • the average value of the number of stratum corneum in each of the 6 samples is shown in the graph. It is shown that the number of stratum corneum is larger in the spot portion than in the normal vicinity region.
  • Figure 4 shows a comparison of the number of proliferating cells. Specifically, the results show a comparison of dividing cells at a spot site and a nearby normal site using a Ki-67 antibody that specifically stains cells at the division stage. Three fluorescent immunostaining photographs are shown, indicating that there are few positive cells at the spot site. This fluorescence To show that is not masked by melanin, a combined photograph with the transmitted light image is shown. In addition, the number of positive cells per mm tissue is counted and summarized in a graph. The average value indicates that there are significantly fewer proliferating cells at the spot.
  • the present invention provides a skin test method for predicting skin, preferably human skin spot formation.
  • this method when the expression of a gene selected from the group consisting of Tables 1, 2, and 3 in the target epidermis is increased or decreased compared to the expression in normal epidermis, the skin is likely to be stained. It is characterized by judging.
  • the expression of the above-mentioned gene in the epidermis is 10% or more, or 20% or more, or 30% or more, or 50% or more, or 70% or more, or 100% compared to those in the control epidermis. If it has been enhanced, it can be determined that the skin is easy to form a stain.
  • the skin to be examined can be the epidermis of any part of the face, neck, arms, limbs, back, etc. where it can easily be spotted and concerned.
  • Normal epidermis without stain formation i.e., control epidermis, for example, in the vicinity of normal spots in the same individual, or in the epidermis of areas that are difficult to be exposed to ultraviolet rays and are difficult to compare with, such as the abdomen and buttocks.
  • the method for collecting a sample from the epidermis may be obtained according to a conventional method according to the type of detection object and the detection method, and is preferably obtained according to a biopsy technique.
  • the enhancement or suppression of the gene in the epidermis is determined, for example, by measuring the amount of protein encoded by the gene in the epidermis.
  • this measurement uses an antibody specific for the above protein, and is a well-known method in the art, for example, immunostaining using a fluorescent substance, dye, enzyme, etc., Western plot method, immunoassay method, etc.
  • it can be carried out by various methods such as ELISA and RIA.
  • It can also be determined by extracting MA from the epidermis and measuring the amount of mMA encoding the gene. Extraction of mMA and measurement of its amount are well known in the art. For example, RNA is quantified by quantitative polymerase chain reaction (PCR).
  • PCR quantitative polymerase chain reaction
  • RNA is quantified by quantitative polymerase chain reaction (PCR).
  • the expression of the gene is specifically enhanced or suppressed in the epidermis at the spot site compared to the non-stain site. It is based on finding out. Therefore, it is possible to suppress skin blot formation and / or remove the formed stain using as an index the suppression or enhancement of the expression of the gene in the epidermis and / or the activity of the protein that is the gene product thereof. It is presumed that a drug that can be developed can be developed.
  • the present invention provides a pharmaceutical or external composition for skin comprising an inhibitor that inhibits the expression of the gene or an activator that enhances it as an anti-skin formation factor and / or an anti-skin removal factor.
  • the composition according to the present invention can prevent or eliminate the formation of a skin latent stain.
  • the pharmaceutical or external composition for skin of the present invention is applied in the form of, for example, an aqueous solution, oil solution, other solution, emulsion, cream, gel, suspension, microcapsule, powder, granule, capsule, solid preparation, etc.
  • aqueous solution oil solution
  • other solution emulsion
  • cream gel
  • suspension microcapsule
  • powder granule
  • capsule solid preparation
  • the inhibitor or activator is used as a skin stain formation inhibitor and / or a skin stain remover, without particular limitation, for example, based on the total amount of the composition, OO lm M ⁇ : LM, preferably Will contain about 0.1 to L0 mM, more preferably about 0.1 to L0 mM.
  • lotions, emulsions, creams, ointments, plasters, haptics, aerosols, and other external skin preparations are suitable for the purposes of the present invention.
  • the topical skin preparations described here include basic cosmetics such as pharmaceuticals, quasi-drugs (ointments, etc.), cosmetics [face wash, milk, cream, jewel, essence (beauty serum), packs, masks, etc. Makeup cosmetics such as foundations and lipsticks; oral cosmetics, aromatic cosmetics, hair cosmetics, body cosmetics, etc.].
  • the pharmaceutical or external composition for skin of the present invention is preferably applied as a cosmetic for preventing stains.
  • the pharmaceutical or skin external composition of the present invention conventionally known excipients and fragrances, etc., fats and oils, surfactants, preservatives, sequestering agents, water-soluble substances are used according to the desired dosage form.
  • Polymers, thickeners, pigments and other powder components, UV protection agents, humectants, antioxidants, pH adjusters, cleaning agents, drying agents, emulsifiers, and the like are appropriately blended.
  • other medicinal ingredients can be added to the pharmaceutical or external composition of the present invention as long as the expected effects are not impaired by the addition.
  • the present invention further provides a method of screening for a skin stain formation inhibitor and / or a skin stain removal factor.
  • the candidate compound is evaluated for the ability to inhibit or enhance the expression of the gene and / or the activity of the protein that is the gene product. It is characterized by being selected as an inhibitory factor and / or a skin stain removal factor.
  • the screening method further comprises applying the inhibitor or activator having the ability to inhibit or enhance the skin model to inhibit the formation of skin spots and / or the effect of removing the skin spots. Including selecting overnight.
  • the step of confirming the above-mentioned inhibitor or inhibition of skin blot formation and / or the effect of removing skin blot is the skin model, for example, skin cell monolayer culture, co-culture.
  • 3D culture and blotting model mice Japanese Patent Application No. 2 0 0 3— 3 4 3 5 4 9) can be used.
  • an inhibitor solution or an overnight solution, such as an aqueous solution is prepared and then repeatedly applied to the skin of a skin blot model animal.
  • Geriatric pigmentation was informed consent. 40 male or older volunteers 1 Of the 6 back stains, senile pigmentation was selected by dermatologists to identify the epidermis and upper dermis. Collected by 3 mm biopsy under local anesthesia. The collection was performed according to the guidelines of the Shiseido Ethics Committee.
  • RNA samples were synthesized from 100 to 300 ng of total RNA using a Low RNA Input linear amplification & labeling kit (Agilent). After purification by RNeasy (Qiagen, recommended by the manufacturer), Whole Human Genome Oligoarray (Agilent, G411 2A) and hybridization were washed, and data were read with an Agilent scanner.
  • Fig. 1 In order to investigate the expression distribution of lipid-enhanced genes in the skin, an inn si hybrid hybridization was performed (Fig. 1). FADS 2, AL0X, and ⁇ 28, which were examined by microarray analysis, were found to be expressed in the epidermis and confirmed to be elevated at the spot site. Among the stratum corneum constituent proteins that accounted for the majority of the expression-reduced genes, the expression distribution in the skin of filaggrin and imporkurin expressed in the granule layer was examined by immunostaining (Fig. 2). A tendency to decrease the expression of these proteins was confirmed at the spot site.
  • the stratum corneum itself was expected to change due to a decrease in stratum corneum constituent proteins, the stratum corneum was visualized and the number thereof was counted (Fig. 3). As a result, it was shown that the number of stratum corneum was large at the spot site. This indicates a decrease in stratum corneum peeling. Decreased keratinocyte differentiation was suggested by the decrease in stratum corneum protein and stratum corneum detachment.

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Abstract

本発明は、皮膚しみ形成を予知するための皮膚検査方法を提供する。この方法は、表皮中のMLSTD1, MOGAT1, FADS2, FADS1, HSD3B1, ELOVL3, BG1, PECR, FABP7, FA2H, HAO2, ALOX15B, PDE6A, LZTS1, SEC14L4, BAMBI, CIDEA, TERE1, GAL, THRSP, INSIG1, CUTL2の発現が正常な表皮中の発現に比べて亢進している場合、もしくはRBBP6, MSMB, WIF1, ANKRD12, FLG, SYNE2, SCEL, NKTR, AMBPが低下している場合、しみ形成し易い皮膚であると判断することを特徴とする方法を提供する。

Description

明 細 書 しみ部位亢進遺伝子群を指標とした皮膚しみ形成予知方法、 皮 Γ し み形成抑制剤のスクリーニング方法 技術分野
本発明は皮膚しみ形成を予知するための皮膚検査方法に関する。 背景技術
紫外線やホルモンのアンバランス、 精神的ス トレスなどによりメ ラノサイ ト （色素形成細胞） 内の酵素チロシナ一ゼの働きが異常に 活性化されると、 メラニン色素が次々とっく りだされて周辺の表皮 細胞に送られてしまう。 メラニン色素のつく りだされるペースが速 く、 また紫外線等の影響でターンオーバーが正常でなくなると、 メ ラニン色素が外へ排出されず、 肌に残ってしまい、 その結果肌にし みができてしまうものと考えられる。
しみができてしまったら、 できるだけ早くその手入れをすること が好ましく、 そのために美容技術者による視感（視覚）によるしみの 官能評価や、 皮膚状態の撮像装置、 測色計等の機器を用いるしみの 定量的評価により、 しみの有無の早期判定が望まれる （特開 2 0 0 3— 1 4 4 3 9 3号公報） 。
一旦しみができてしまうと、 その除去は容易ではなく、 肌の新陳 代謝を良く して不要なメラニンを早く追い出し、 余計なメラニンを 作らないようにするなどの手入れが必要となる。 従って、 しみがで きる前に肌の手入れを行うことが好ましい。 しかしながら、 しみの でき易さには個体差があり、 またその原因となる条件も様々である ため、 しみができることを予知することは一般に困難である。 よつ て、 しみができる前にしみができ易い状態であるか否かを予知でき る手段があればしみ予防対策として極めて有効である。
表皮正常部位のサンプルを採取し、 それぞれについて NT— 3、 A D A M 9または H B— E G Fを検出することを指標にして上記評 価を目指した報告がある （特開 2 0 0 3 — 2 4 5 0 9 7 )。 また c — K I Tや E Tの阻害を持ってシミ対策を目指した報告がある （特開 2 0 0 4— 8 3 5 5 1 ) 。 しかしシミ生成の複雑な生体病理反応が 完全に解明されていないうえ、 複数の色素合成刺激経路が知られて いる現状では、 少数の遺伝子に着目してシミ生成の判断をしたり対 処をしたりする場合、 完全な解決が行えているかは懸念がつきまと う。 そこで、 広範囲の遺伝子の変動を検出して、 それらを診断の指 標とする報告が出てきている （特開 2 0 0 4— 2 0 5 2 4 6 ) 。 た だしこの報告は皮膚への日光暴露による変動遺伝子を S AG E法と いう方法で検出したもので、 シミ自体への広範な解析に基づく判断 や対処方法の確立が求められていた。
そこで我々は、 シミモデルマウスのシミ部位と正常部位をマイク ロアレイにより比較することにより、 シミ部位特徴的な慢性炎症状 態をつきとめた （特開 2 0 0 5— 1 0 6 7 4 5、 特開 2 0 0 5— 1 1 0 5 0 5 ) 。 そして今回ヒ トにおいて典型的なしみの一つである 、 老人性色素斑部位と正常部位の比較により、 前記特徴に加え、 シ ミ部位での皮脂腺関連遺伝子の亢進、 角化関連遺伝子の抑制などを 見出した。 発明の開示
本発明者は上記問題を鑑み、 肌にしみができる前に肌がしみので き易い状態であるか否かを予知できる手段を提供できるかを鋭意検 討した。 そして、 本発明者は老人性色素斑部位と正常コントロール 部位の 1 1例の表皮及び真皮上層由来の R N Aのマイクロアレイ解 祈の結果、 老人性色素斑部位において下記の遺伝子の発現が特異的 に亢進または抑制されていることを見出した。 従って、 ヒ トの皮廣 において、 下記の遺伝子の発現を調べることで、 しみ形成し易い皮 膚であると判断することが可能であることが明らかとなった。
表 1 ( 1 ) 脂質関連の亢進遺伝子
Figure imgf000004_0001
表 2 ( 2 ) 情報伝達関連の亢進遺伝子
遗伝子 ID 遗伝子名 機 能 発 現
レベル割合
■—000440 ホスホジエステラーゼ 6A、 cGM 光受容体に関する 542 3. 41
P -特異性、 桿体、 アルファ（PD
E6A)
NM—021020 ロイシンジッパー、 推定腫瘍 転写因子；腫瘍抑制 1488 2. 04 抑制因子 (LZTS1)
NM_174977 SEC14 -様 (S. cerevis iae) Pl3キナーゼの阻害 658 1. 91
(SEC14L4)
M— 012342 BMP及びァクチビン膜結合阻害 TGFbシグナリングの阻害 704 2. 18 因子ホモログ' (Xe聊 us laevis
) (BAMBI)
NM_001279 細胞死誘導性 DFFA様エフェク アポトーシスの活性化 1968 1. 92 ター（C画）、 転写物
NM— 013319 移行上皮応答夕ンパク質 (TERE 腫瘍抑制 1352 1. 85
1)
NM_015973 ガラニン（GAL) ニューロべプチド ；炎症の抑 17159 2. 58 制
BC031989 甲状腺ホルモンレスボンシブ 脂質合成の調節 11297 2. 38
(SP0T14ホモログ、 ラット）
(THRSP)
NMJ05542 インシユリン誘発遺伝子 1 脂質合成及び炭水化物の代謝 1718 2. 30
(INSIG1) , 転写物変異体 1 の調節
AB006631 カツト-ライク 2 (ショウジヨウ 転写因子 206 2. 26 バエ） (CUTL2)
表 3 ( 3 ) 発現抑制遺伝子群
Figure imgf000006_0001
上記遺伝子のいずれも、 皮膚色素関連の報告は存在しない。 従つ て、 しみとの関係でこれら遺伝子の発現が亢進又は抑制されること は極めて驚くべき事実である。
第一の観点において、 本発明は皮膚しみ形成を予知するための皮 膚検查方法を提供する。 この方法は、 皮脂腺系遺伝子が、 表皮中の 遺伝子の発現が正常な表皮中の発現に比べて亢進している場合、 し み形成し易い皮膚であると判断することを特徴とする。 こ こで、 し みとは、 皮膚に現われる茶褐色ないし濃褐色の平面状斑紋をいう。 なかでも今回表記するしみは、 主に老人性色素斑をさす。
好適な態様において、 皮脂腺系遺伝子の内の発現の亢進される表 皮中の遺伝子は表 1から成る群から選ばれるタンパク質をコードす る遺伝子である。 第二の観点において、 本発明は皮) f しみ形成を予知するための皮 瘤 '検査方法であって、 表 2から成る群から選ばれるタンパク質をコ ―ドする遺伝子の発現が正常な表皮中の発現に比べて亢進している 場合、 しみ形成し易い皮磨'であると判断することを特徴とする方法 を提供する。
第三の観点において、 本発明は皮膚しみ形成を予知するための皮 膚検査方法であって、 表 3の発現が正常な表皮中の発現に比べて低 下している場合、 しみ形成し易い皮膚であると判断することを特徴 とする方法を提供する。
好適な態様において、 上記表皮中の遺伝子の発現の変動は、 表皮 中の前記タンパク質の量を測定することにより決定される。
さらに好適には、 上記測定は上記タンパク質に特異的な抗体を利 用する EL I SA法又は RIA法により行われる。
別の好適な態様において、 上記表皮中の前記遺伝子の発現の変動 は、 表皮から抽出された前記タンパク質をコードする mRNAの量を測 定することにより決定される。 好ましくは、 上記 mRNAの測定はポリ メラ一ゼ連鎖反応法により行われる。
第四の観点において、 本発明は皮膚しみ形成抑制因子及び/又は 皮膚しみ除去因子をスクリーニングする方法であって、 候補化合物 を上記遺伝子の発現及び/又はその遺伝子産物たる夕ンパク質の活 性を阻害又は亢進する能力について評価し、 当該阻害又は亢進能力 を有するインヒビ夕一又はァクチべ一ターを皮膚しみ形成抑制因子 及び/又は皮膚しみ除去因子として選定することを特徴とする方法 を提供する。
好適な態様において、 この方法は上記阻害又は亢進能力を有する インヒビター又はァクチべ一夕一を皮膚モデルに適用し、 皮膚しみ 形成抑制及び Z又は皮膚しみ除去効果を有する薬剤を選定すること を含んで成る。
第五の観点において本発明は、 MLSTD 1, M0GAT 1, FADS2, FADS 1, HSD3 B l, EL0VL3, BG l, PECR, FABP7, FA2H, HA02, AL0X 15Bから成る群から選ば れるタンパク質をコードする遺伝子の発現の亢進を抑制することに よる、 美白方法、 しみ形成抑制方法又はしみ除去方法を提供する。 本発明により、 皮膚しみ形成を予知するための皮膚検査方法提供 が可能となる。 図面の簡単な説明
図 1 は、 脂質系亢進遺伝子の皮膚での分布 in s i tu八イブリダィ ゼーションによる脂質系亢進遺伝子のシミ部位と近傍正常部位での 発現差分布の結果を示す。 白矢印部分の紺色がシグナルの検出され た表皮部位。 各遺伝子ともシミ部位の表皮で亢進傾向があることが 示されている。
図 2は、 角層構成タンパクの皮膚内での分布蛍光免疫染色による 角層構成タンパクのシミ部位と近傍正常部位での発現差分布の結果 を示す。 白矢印部分の緑色がシグナルの検出された顆粒層部位。 各 遺伝子ともシミ部位の表皮で低下傾向があることが示されている。
図 3は、 角層枚数の比較角層をサフラニン染色後、 アルカリで膨 潤させて可視化し、 角層枚数を数えた結果を示す。 写真はその一例 を示している。 6サンプルの各 4箇所ずつの角層枚数の平均値をグ ラフに示した。 シミ部位では近傍正常部位と比べ角層枚数が多いこ とが示されている。
図 4は、 増殖細胞の数の比較を示す。 詳しくは、 分裂期の細胞を 特異的に染色する K i- 67抗体によってシミ部位と近傍正常部位での 分裂細胞を比較した結果を示す。 3例の蛍光免疫染色写真が示され ておりシミ部位で陽性細胞が少ないことが示されている。 この蛍光 がメラニンによってマスクされているのではないことを示すため、 透過光像との結合写真が示されている。 さらに組織 1 m mあたりの 陽性細胞数を数え、 グラフにまとめてある。 その平均値は有意にシ ミ部位で増殖細胞が少ないことを示している。 発明を実施するための最良の形態
上述の通り、 上記遺伝子に関し皮膚色素関連の報告は存在しない 。 本発明者は老人性色素斑部位と正常部位各々の皮膚由来の R N A のマイクロアレイ解析の結果、 非しみ部位と比べ、 しみ部位の表皮 において上記各遺伝子の発現が特異的に亢進もしくは抑制されてい ることを見出した。 従って、 これら遺伝子を指標とすることで、 皮 膚しみ形成を予知することができるものと推認できる。
皮膚しみ形成を予知するための皮膚検査方法
本発明は、 皮膚、 好ましくはヒ ト皮膚しみ形成を予知するための 皮膚検査方法を提供する。 この方法は、 対象表皮における表 1 、 2 、 3から成る群から選ばれる遺伝子の発現が正常な表皮中の発現に 比べて亢進もしくは低下している場合、 しみ形成のし易い皮膚であ ると判断することを特徴とする。 その評価基準として、 例えば表皮 中の上記遺伝子の発現がコントロール表皮中のそれらと比べ 10 %以 上、 又は 20 %以上、 又は 30 %以上、 又は 50 %以上、 又は 70 %以上、 又は 1 00 %以上亢進していたなら 「しみ形成のし易い皮膚である」 と判断する、 としてよい。
検査すべき皮膚は、 例えば顔、 首、 腕、 肢、 背中など、 しみがで きやすく、 またしみ形成の気になるあらゆる部分の表皮であってよ い。 しみ形成のない正常表皮、 即ちコントロール表皮としては、 例 えば同一個体のシミの近傍正常部や、 紫外線に曝されにく く、 比較 的しみのできにくい部位の表皮、 例えば腹部、 臀部の表皮であって よい。 表皮からサンプルを採取する方法は、 検出対象や検出方法の 種類に応じて定法に従って採取すればよく、 好ましくはバイオプシ の手法に準じて採取する。
表皮中の上記遺伝子の亢進又は抑制は、 例えば表皮中の当該遺伝 子によりコードされるタンパク質の量を測定することにより決定さ れる。 好ましくは、 この測定は上記タンパク質に特異的な抗体を利 用し、 当業界において周知の方法、 例えば蛍光物質、 色素、 酵素等 を利用する免疫染色法、 ウエスタンプロッ ト法、 免疫測定方法、 例 えば E L I S A法、 R I A法等、 様々な方法により実施できる。 ま た、 表皮から MAを抽出し、 当該遺伝子をコードする mMAの量を測 定することにより決定することもできる。 mMAの抽出、 その量の測 定も当業界において周知であり、 例えば RNAの定量は定量ボリメラ —ゼ連鎖反応法 （PCR) により行われる。
表皮中の上記遺伝子に対し高ス トリ ンジェント条件下でハイプリ ダイゼ一シヨン可能なポリヌクレオチドの発現は、 表皮から RNAを 抽出し、 上記ポリヌクレオチドに対応する mMAの量を測定すること により決定することもできる。 mMAの抽出、 その量の測定も当業界 において周知であり、 例えば RNAの定量は定量ポリメラ一ゼ連鎖反 応法 （PCR) により行われる。
上述の通り本発明は、 しみ部位及び非しみ部位の各々の皮膚由来 の R N Aのマイクロアレイ解析の結果、 非しみ部位と比べ、 しみ部 位の表皮において上記遺伝子の発現が特異的に亢進もしくは抑制さ れていることを見出したことに基づく。 従って、 表皮中の上記遺伝 子の発現及び/もしくはその遺伝子産物たる上記タンパク質の活性 を抑えるもしくは亢進することを指標として、 皮膚のしみ形成を抑 える及び/又は形成されたしみを除去することができる薬剤の開発 が行えるものと推認される。 従って、 本発明は上記遺伝子の発現を阻害するィンヒピ夕一もし くは亢進するァクチべ一ターを皮腐しみ形成抑制因子及び 又は皮 膚しみ除去因子として含んで成る医薬又は皮膚外用組成物を提供す る。 本発明に係る組成物は皮潜のしみ形成を予防又はしみを除去す ることができる。
本発明の医薬又は皮膚外用組成物は、 例えば水溶液、 油液、 その 他の溶液、 乳液、 クリーム、 ゲル、 懸濁液、 マイクロカプセル、 粉 末、 顆粒、 カプセル、 固形剤等の形態で適用される。 従来から公知 の方法でこれらの形態に調製したうえで、 ローショ ン製剤、 乳液剤 、 クリーム剤、 軟膏剤、 硬膏剤、 ハツプ剤、 エアゾール剤、 水一油
2層系、 水一油一粉末 3層系、 注射剤、 内服剤 （錠剤、 散剤、 顆粒 剤、 丸剤、 シロップ剤、 トローチ剤等） 、 坐剤等として、 身体に塗 布、 貼付、 噴霧、 注射、 飲用、 挿入することができる。 当該組成物 は上記インヒビターもしくはァクチべ一夕一を皮膚しみ形成抑制因 子及び 又は皮膚しみ除去因子として、 特に限定することなく、 組 成物全量に基づき例えば 0 . O O l m M〜： L M、 好ましくは 0 . 0 1〜： L 0 0 m M、 より好ましくは 0 . 1〜： L 0 m M程度含有するで あろう。
これらの剤型の中でも、 ローション製剤、 乳液剤、 クリーム剤、 軟膏剤、 硬膏剤、 ハツプ剤、 エアゾール剤等の皮膚外用剤が、 本発 明の目的に適する剤型である。 なお、 ここで記す皮膚外用剤には、 医薬品、 医薬部外品 （軟膏剤等） 、 化粧料 [洗顔料、 乳液、 クリー ム、 ジエル、 エッセンス （美容液） 、 パック · マスク等の基礎化粧 品 ； ファンデーション、 口紅等のメーキヤップ化粧品 ； 口腔化粧品 、 芳香化粧品、 毛髪化粧品、 ボディ化粧品等] が含まれる。 特に本 発明の医薬又は皮膚外用組成物は、 しみ予防の化粧料としての適用 が好適である。 本発明の医薬又は皮膚外用組成物においては、 所望する剤型に応 じて従来公知の賦形剤や香料等をはじめ、 油脂類、 界面活性剤、 防 腐剤、 金属イオン封鎖剤、 水溶性高分子、 増粘剤、 顔料等の粉末成 分、 紫外線防御剤、 保湿剤、 酸化防止剤、 p H調整剤、 洗浄剤、 乾 燥剤、 乳化剤等が適宜配合される。 さらにこの他の薬効成分を本発 明の医薬又は皮膚外用組成物に配合することは、 その配合により所 期の効果を損なわない範囲内で可能である。
皮膚しみ形成抑制因子及び/又は皮膚しみ除去因子をスクリ一ニン グする方法
本発明はさらに、 皮膚しみ形成抑制因子及び/又は皮膚しみ除去 因子をスクリーニングする方法も提供する。 この方法は、 候補化合 物を上記遺伝子の発現及び/もしくその遺伝子産物たる上記夕ンパ ク質の活性を抑える阻害又は亢進能力について評価し、 当該阻害能 力を有するインヒピ夕ーを皮膚しみ形成抑制因子及び/又は皮膚し み除去因子として選定することを特徴とする。
好適な態様において、 上記スクリーニング方法は更に、 上記阻害 又は亢進能力を有するインヒビターもしくはァクチべ一夕一を皮膚 モデルに適用し、 皮膚しみ形成抑制及び 又は皮膚しみ除去効果を 有するインヒビ夕一もしくはァクチべ一夕一を選定することを含ん で成る。
上記インヒビターもしくはァクチべ一夕一の皮膚しみ形成抑制及 び 又は皮膚しみ除去効果についての確認する工程はこのィンヒビ 夕一もしくはァクチべ一夕一を皮膚モデル、 例えば、 皮膚細胞単層 培養、 共培養、 3次元培養、 しみモデルマウス (特願 2 0 0 3— 3 4 3 5 4 9 ) を利用して実施することができる。 好適な態様におい ては、 このインヒビ夕一もしくはァクチべ一夕一の溶液、 例えば水 溶液を調製してから皮膚しみモデル動物の皮膚に繰り返し塗布し、 しみの形成を評価することで、 上記効果の有無を判定することがで さる。
以下、 具体例を挙げて、 本発明を更に具体的に説明する。 なお、 本発明はこれにより限定されるものではない。 実施例
老人性色素斑サンプル
老人性色素斑はィンフォームドコンセントを行った 4 0代以上の 男性のポランティア 1 6名の背中にあるシミのうち、 老人性色素斑 を皮膚科医の鑑別により選定し 、 表皮及び真皮上層を局所麻酔下 3 m mバイオプシにより採取した 。 採取に当っては資生堂倫理委員会 によるガイ ドラインに従つた。
皮膚からの R N A採取
老人性色素斑及びコント口一ルとして近傍正常部及び臀部より採 取した皮膚片を液体窒素で凍結し破砕後、 IS0GEN (日本ジーン社、 メーカー推奨プロ 卜コル） により RNAを抽出、 RNeasy (Qiagen社） により精製した。 RNAはバイオアナライザー（アジレントテクノロジ 一社）で電気泳動し、 品質、 精製度を確認した。
マイクロアレイ用サンプルの反応
サンプルの調製及びハイプリダイゼ一ショ ンはアジレント社推奨 プロ トコルに準じた。 トータル R N A 100〜 300ngから、 Low RNA In put リニア増幅 &ラベル化キッ ト （アジレント社） を用いてラベル cRNAを合成した。 RNeasy (Qiagen社，メーカー推奨プロ トコル） に て精製後、 Whole Human Genomeオリゴアレイ （アジレント社、 G411 2A) とハイブリダィゼ一シヨン、 洗浄し、 アジレント社スキャナー によりデータ読み取りを行った。
解析結果 約 40000種の遺伝子の発現を網羅的に解析した結果、 老人性色素 斑皮^においては 9例の臀部の非露光部コントロールと比べると、 メラノサイ ト関連遺伝子の亢進に加えて、 炎症系の遺伝子の亢進が 特徴的であった。 このシミ Z非露光部の比較はシミモデルマウスで の解析に相当し、 結果も合致したものとなった。 次に老人性色素斑 近傍の正常部との 1 1例の比較においてはメラノサイ ト関連、 炎症 系遺伝子等各種亢進遺伝子とともに、 表 1， 2に示したような脂質 関連遺伝子や情報伝達系遺伝子の発現の亢進と、 表 3に示したよう な角化関連遺伝子を含む遺伝子群が抑制されていることが特徴的で あった。
脂質系亢進遺伝子の皮膚での発現分布を調べるため i n s i t uハイ ブリダィゼ一シヨンを行った （図 1 ) 。 マイクロアレイ解析で亢進 していた脂質系遺伝子のうち調べた FADS 2, AL0X, ΖΑΠ 28は、 表皮 での発現が認められ、 かつシミ部位での亢進傾向が確認された。 発現低下遺伝子の中で多数を占めていた角層構成タンパクのうち 、 顆粒層で発現するフィ ラグリン及びインポルクリンの皮膚内での 発現分布を免疫染色により調べた （図 2 ) 。 シミ部位でこれらタン パクの発現低下傾向が確認された。
角層構成タンパクの低下から角層自体の変化が予想されたため、 角層を可視化してその枚数を数えた （図 3 ) 。 その結果シミ部位で 角層枚数が多いことが示された。 これは角層剥離の低下を示してい る。 角層構成タンパクと角層剥離の低下からケラチノサイ トの分化 の低下が示唆された。
そこでケラチノサイ トの増殖はどうか見たところ （図 4 ) シミ部 位基底層で明らかに増殖細胞が少ないことが観察された。 これらは ほとんどが基底層のケラチノサイ トと考えられる。 つまりケラチノ サイ トの増殖低下、 角層形成と剥離の低下がシミ部位で起き、 結果 としてターンオーバーの低下が生じていると考えられる。 これに加 え、 シミ部位では脂質系の遺伝子の過剰亢進が起き、 ケラチノサイ 卜の分化異常が生じていると考えられる。 このような状況に加え、 露光部位で特徴的だった慢性炎症傾向によるメラノサイ 卜の刺激な どが加わり、 メラニンの過剩生産、 ターンオーバ一の低下によるメ ラニン滞留が生じ、 色素沈着が形成されていると考えられる。

Claims

1. 皮) しみ形成を予知するための皮 )¾'検査方法であって、 MLST Dl, MOGATl, FADS2, FADSl, HSD3B1, EL0VL3, BGl, PECR, FABP7, FA2H, HA02 ， AL0X15Bから成る群から選ばれるタンパク質をコードする遺伝子の 発現が正常な表皮中の発現に比べて亢進している場合、 しみ形成し 易い皮潜であると判断することを特徴とする方法。
2. 皮膚しみ形成を予知するための皮膚検查方法であって、 PDE6 A, LZTSl, SEC14L4, BAMBI, CIDEA, TEREl, GAL, THRSP, INSIGl, CUTL2から 成る群から選ばれるタンパク質をコードする遺伝子の発現が正常な 表皮中の発現に比べて亢進している場合、 しみ形成し易い皮膚であ ると判断することを特徴とする方法。
3. 皮膚しみ形成を予知するための皮膚検查方法であって、 RBBP 6, MSMB, WIFl, ANKRD12, FLG, SYNE2, SCEL, NKTR, AMBPから成る群から選 ばれるタンパク質をコードする遺伝子の発現が正常な表皮中の発現 に比べて低下している場合しみ形成し易い皮膚であると判断するこ とを特徴とする方法。
4. 前記表皮中の前記遺伝子の発現の亢進が、 表皮から抽出され た前記タンパク質をコ一ドする! iiRNAの量を測定することにより決定 される、 請求項 1〜 3のいずれか 1項記載の方法。
5. 皮膚しみ形成抑制因子及び/又は皮膚しみ除去因子をスクリ 一二ングする方法であって、 候補化合物を請求項 1〜 2のいずれか
1項に規定する遺伝子の発現及び Z又は当該遺伝子のタンパク質産 物の活性を阻害する能力について評価し、 当該阻害能力を有するィ ンヒビ夕—を皮膚しみ形成抑制因子及びノ又は皮膚しみ除去因子と して選定することを特徴とする方法。
6. 更に、 前記阻害能力を有するインヒビ夕一を皮膚モデルに適 用し、 皮 しみ形成抑制及び 又は皮朥しみ除去効果を有するィン ヒビ夕一を選定することを含んで成る、 請求項 5記載の方法。
7 . 皮府しみ形成抑制因子及び/又は皮朥しみ除去因子をスクリ 一二ングする方法であって、 候補化合物を請求項 3に規定する遺伝 子の発現及び Z又は当該遺伝子のタンパク質産物の活性を亢進する 能力について評価し、 当該亢進能力を有するァクチべ一夕一を皮膚 しみ形成抑制因子及び 又は皮腐しみ除去因子として選定すること を特徴とする方法。
8 . 更に、 前記亢進能力を有するァクチべ一夕一を皮膚モデルに 適用し、 皮膚しみ形成抑制及び/又は皮膚しみ除去効果を有するァ クチべ一ターを選定することを含んで成る、 請求項 7記載の方法。
9 . MLSTD 1, M0GAT 1, FADS 2, FADS 1, HSD3B 1, EL0VL3, BG 1, PECR, FABP7 , FA2H, HA02, AL0X 15Bから成る群から選ばれるタンパク質をコードす る遺伝子の発現の亢進を抑制することによる、 美白方法、 しみ形成 抑制方法又はしみ除去方法。
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