CN103619318B

CN103619318B - 和细胞外基质相关的皮肤色斑分子标签

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Publication number: CN103619318B
Application number: CN201280030372.8A
Authority: CN
Inventors: F·贝尔内; C·杜瓦尔; O·德拉沙里埃; S·努沃; X·马拉
Original assignee: LOreal SA
Current assignee: LOreal SA
Priority date: 2011-04-22
Filing date: 2012-04-20
Publication date: 2018-06-05
Anticipated expiration: 2032-04-20
Also published as: JP2014516253A; EP2699221A1; US20150307940A1; JP6181042B2; JP2017176180A; EP2699221B1; KR102072783B1; KR20140043349A; JP6836950B2; CN103619318A; ES2624671T3; WO2012172220A1

Abstract

本发明涉及皮肤色斑的分子标签，包括基因TGFBR2、TGFBI、BMP2、SMAD3、THBS2、TGFBR3、SEMA5A、SMAD7、SOSTDC1、FRAS1、LEPREL1、MATN2、DST、PLOD2、ITGA2、COL6A3、CRTAP、LAMC1、LAMB3、LAMA3、ITGAV、ITGB1和ACTN1，和这种分子标签的各种用途。特别地，本发明涉及一种表征人类已知的或疑似的皮肤色斑的方法，包括对比来自所述色斑和来自相邻未受损皮肤的皮肤样品中与细胞外基质相关的至少一种真皮基因的表达水平，所述真皮基因选自由下述基因构成的列表：TGFBR2、TGFBI、BMP2、SMAD3、THBS2、TGFBR3、SEMA5A、SMAD7、SOSTDC1、FRAS1、LEPREL1、MATN2、DST、PLOD2、ITGA2、COL6A3、CRTAP、LAMC1、LAMB3、LAMA3、ITGAV、ITGB1和ACTN1。本发明也涉及评估色斑治疗功效的方法、治疗色斑的化妆品和治疗方法、和所述基因的各种调控子及它们的用途。

Description

和细胞外基质相关的皮肤色斑分子标签

技术领域

本发明涉及化妆领域并和皮肤有关。更一般地说，它涉及表征皮肤上的色斑以及这些色斑的治疗。

背景技术

皮肤色泽主要归因于表皮中的色素和黑色素。黑色素是由特定的位于表皮基底层的树突细胞，即黑色素细胞合成的。黑素生成发生在细胞器中，充满黑色素的黑色素体通过树突细胞转移到相邻的表皮细胞、角化细胞。皮肤色泽或构成性色素沉淀，从产生的黑色素总量及黑色素的化学本质上说，在个体之间是有差异的。黑色素是由酪氨酸(真黑素)或酪氨酸和半胱氨酸(褪黑素)形成的大分子。合成机理为主要使用酪氨酸酶和酪氨酸酶相关蛋白(Tyrp-1)。皮肤的色素沉淀是接触阳光的自然反应，即晒黑现象。

然而，在某种情况下色素沉淀的过程是可以被改变的，并因此导致色素沉淀缺陷、色素脱失(白癫、白化)或，相反的，色素沉淀过多、色素沉着过多。良性的色素沉着过多病的特征是异常积累(除了晒黑)黑色素，例如日光性雀斑样痣、黄褐斑、痤疮相关的色素沉淀、炎症后色素沉着、莱姆病、和毒漆皮炎或良性面部皮肤变色相关的色素沉淀。

日光性雀斑样痣，同样称为老年性雀斑样痣或日光性着色斑、雀斑、老年斑、或“老年雀斑”，是目前为止发生机率最高的色素损伤。这种类型的伤害发生在曝光的皮肤区域，例如脸部、手背、上肢特别是前臂背面、背后特别是背部顶部。这种伤害一般会影响40岁以上的人群。

肉眼可见的，日光性雀斑样痣是一种良性的深色到浅棕色的黑色素斑；它们有不同的但是不规则的边缘。它们的大小变化很大，变化范围从几毫米到两厘米以上。

尽管发生几率跟高，但目前仅有少数关于日光性雀斑样痣的生理学和发病机理的研究发表。根据目前有限的组织学研究结果，已知整个表皮的黑色素量都有增加，特别是在基底层。表皮嵴也在伸长，并在乳突真皮层呈梅花状外观[Montagna 1980，berRahman1996，Andersen1997，Cario-Andre2004]。最终，在相邻的崤之间交织形成桥接的或网状的外观。

与黑色素和噬黑素细胞相关的色素失控同样可能存在真皮层。

目前的治疗方法：

良性的皮肤色素失调一般是不被人注意的。

由于已证明日光性雀斑样痣的出现和持续接触阳光之间是相关的，预防它们的出现一般涉及在局部施用光防护物质例如防晒霜。在“治愈性”治疗中，已经研发了很多步骤，主要是化妆，以试图消除它们或减少它们的存在。消除或减少目前的这些问题通常基于使用减少黑色素细胞中的黑色素合成活动的祛斑处理。祛斑分子干扰黑素生成的一个或多个步骤。目前使用的主要通路是基于抑制酪氨酸酶，其为黑素生成过程的关建酶。那些处理的目标是降低或甚至阻止色素的合成。

已知的祛斑物质有对苯二酚和它的衍生物、曲酸、熊果甙、亚氨苯酚、抗坏血酸和它的衍生物、肉毒碱和苯醌的组合物、氨基苯酚衍生物、苯并噻唑衍生物、天然提取物、皮质激素类等。去角质成分经常和那些活性成分一起使用以增加去皮屑作用，并因此更容易地消除角化层中的黑色素。

另外一种非化妆治疗方法是通过使用激光或去皮等物理或化学方法破坏受损处。然而，这些相对有效的方法不能从病源上解决失调问题。在大多数情况下，日光性雀斑样痣会在治疗后很短时间内再次出现。

而且，现有的治疗方法有很大的缺点。祛斑物质通常具有一定的不稳定性，在低浓度下效力很低，其生物活性会影响其他功能，具有毒性或致敏性。

而且，由于它们不是针对导致色素沉淀失调的根本性原因，使得不同的祛斑治疗效果区别非常大。因此，对于特定治疗，例如在局部区域给药，特定的良性皮肤色素沉淀问题例如日光性雀斑样痣或黄褐斑可能会减弱或可能消失，而另一种情况则可能没有任何改变。这种不稳定性不仅会在不同个体的受损处发现，也能在同一个体不同的受损处发现。因此，良性皮肤色素沉淀的问题目前尚没有有效的局部治疗方法。

因此，有必要研制针对该类型受损更有效同时伤害更少的治疗方法。

为此，为了能够确定可以修正这些缺陷的新的靶标和活性成分，必须要确定出这种色素失调类型中可能存在的分子水平的失调和功能障碍。

现有技术关注的是色斑的治疗，更具体地是日光性雀斑样痣的治疗，公开了与黑色素细胞和黑素生成(黑素原生成酶、黑素粒蛋白质、黑素原生成中的关键旁分泌因子)紧密相关的分子在染色体组或蛋白水平的刺激。已在表皮层或真皮层发现以下蛋白：酪氨酸酶、色氨酸1、二氢氯噻(DCT)、Pmel-17、POMC、ET1、ETBR、SCF、c-KIT、KGF、KGFR、肝细胞生长因子(HGF)、MIA、TRPM1、黑色素A、红眼稀释剂、P53蛋白和IL1α。

进一步地，其他研究通过分析基因或蛋白的表达揭示了日光性或老年性雀斑样痣在分子水平的修饰或在细胞水平的修饰。然而，各种研究都没有讨论色斑表象下的机理或普遍的功能障碍。

现有技术中尚没有可靠的资料表明这种色素失调类型中的分子失调或功能障碍不属于与黑色素细胞和黑素原生成紧密相关的分子。

发明内容

本发明人首次证明与细胞外基质和真皮表皮连接处相关的真皮基因在色素失调中的参与导致了皮肤中出现色斑，更特别地是与TGF-β-SMAD信号通路相关的基因的参与。

细胞外基质在皮肤中起到结构作用，归因于它能够为组织和细胞提供支撑和粘连作用，及它的机械性能即它能够抵抗张力(特别归因于胶原蛋白的存在)，和压缩(特别归因于蛋白聚糖的存在)。

因其同样在调控表皮和真皮层体内平衡中起主要作用，它扮演着重要的生物学角色。因为，尤其是由于它的生长因子和细胞因子库属性，它涉及形态形成、增殖、细胞分化和组织修复。

真皮表皮连接处(DEJ)本身是由基膜产生的，基膜是由细胞外基质层形成的而且它把表皮从真皮中分离出来。它在两种组织之间构成了通透性屏障并调控分子，特别是营养物质的交换。它具备将表皮粘附和锚定在基质层下面的功能，以及表皮的结构性结合的功能。它同样在调控表皮细胞分化和迁移，以及表皮的形态发生中起到重要作用。

转化生长因子β(TGF-β)在大多数细胞中控制增殖、细胞分化和其他功能。它在免疫和癌症中起作用。

特定细胞分泌TGF-βs同时也是TGF-β的受体。SMADs组成TGF-β的信号通路。当TGF-β结合到膜受体上时能够实现信号转导。由该通路诱导的细胞应答对于特定的细胞可能是不同的，这取决于细胞背景。它是高度动态的信号体系。

典型通路中，TGF-β结合到II型膜受体上并和另一种I型受体形成二维复合体。III型受体(β聚糖)能够通过捕获TGF-β并将其成呈递给二维受体复合体协助这一过程。II型受体，结合到TGF-β，磷酸化I型受体，能够通过磷酸化胞质蛋白即SMAD家族(SMAD2和3)传导信号。由I型受体(R-SMAD)调控的SMAD家族，然后结合到正常SMAD、SMAD4以生成激活复合物。该复合物然后进入细胞核，在那里它可以作为众多基因的转录调控因子并因此导致激活应答或抑制应答。

由其他配体例如各种BMPs(骨形态发生蛋白)激活的特定I型受体能够通过其他SMADs(1、5、8)激活信号通路。

一般而言，通路的激活同样会导致抑制SMADs例如SMAD6和7的激活，这提供了一种负的逆调控。

TGF-β通路的靶基因中有众多编码细胞外基质分子的基因，包括胶原蛋白、弹性蛋白、纤连蛋白、血小板反应蛋白，它们主要提供结构作用，并同时包括编码参与基质更新和分子降解的基质重塑蛋白的基因。

该通路同样在真皮细胞产生众多的生长因子和细胞因子过程中有刺激或抑制效应。

由本发明人首次证明：与细胞外基质或真皮表皮连接处，特别是和TGF-β-SMAD信号通路相关的特定基因的转录水平在健康皮肤和色斑皮肤之间明显不同，因此表明细胞外基质和真皮表皮连接处的失调，特别是TGF-β-SMAD信号的失调与色素沉淀的调控，特别是诱导色斑外观的色素沉淀调控之间是相关的。

可能认为增加或减少涉及这些不同通路的依赖TGF-β或BMPs的特定蛋白，可能会导致增加的和／或异常的信号，其可以扰乱真皮、连接处的体内平衡并对表皮有撞击效应。

为了不会局限于某一特定理论，对与细胞外基质和真皮表皮连接处相关的不同基因表达的改变饰使得发明人相信：鉴于基质和真皮表皮连接处蛋白的作用，这些基因的失调作为整个真皮层修饰的一种信号，扰乱了表皮内平衡并产生了大量的修饰，特别是色斑表皮的组织结构(例如，真皮中表皮嵴的延长)。结果，表皮中黑色素含量继续增加，进而导致色斑生成。

本发明是关于在色斑皮肤和相邻健康皮肤中基因表达水平不同的分子标签，也是关于利用该标签技术的不同应用和方法，特别是为了在化妆治疗色斑中调整皮肤的色素沉淀或使皮肤光滑或使肤色均一。该分子标签由以下基因构成：TGFBR2(转化生长因子β-受体2[70／80千道尔顿])、TGFBI(转化生长因子β诱导的蛋白，68千道尔顿)、BMP2(骨形态发生蛋白质2)、SMAD3(SMAD家族成员3)、THBS2(血小板反应蛋白2)、TGFBR3(转化生长因子β-受体III)、SEMA5A(sema区域，7种血小板反应蛋白重复单元，信号素(semaphorin)5A)、SMAD7(SMAD家族成员7)、SOSTDC1(含硬化蛋白区域的蛋白1)、FRAS1(弗雷泽症侯群1)、LEPREL1(皮屑蛋白样蛋白1)、MATN2(母系蛋白2)、DST(肌张力障碍蛋白，也被称为BPAG1)、PLOD2(原骨胶原-赖氨酸、2-酮戊二酸5-双加氧酶2)、ITGA2(整联蛋白α2(CD49B，VLA-2受体的亚单位α2))、COL6A3(胶原蛋白类型6、α3)、CRTAP(软骨相关蛋白，也被称为LEPREL3)、LAMC1(层粘连蛋白γ1，原LAMB2)、LAMB3(层粘连蛋白β3)、LAMA3(层粘连蛋白α3)、ITGAV(整联蛋白αV(波连蛋白受体))、ITGB1(整合素β1)和ACTN1(辅肌动蛋白α1)。ITGB1基因也可能会从该列表中排除。SEMA5A和／或ITGB1基因也可能会从该列表中排除。

这些基因按功能可以分为以下几组：

-列表A：编码涉及TGF-β-SMAD信号传导通路激活的因子的基因：TGFBR2、TGFBI、BMP2、SMAD3、THBS2、TGFBR3、SEMA5A、SMAD7和SOSTDC1，然而，基因SEMA5A可选地从列表A中排除；和

-列表B，包括基因FRAS1、LEPREL1、MATN2、DST、PLOD2、ITGA2、COL6A3、CRTAP、LAMC1、LAMB3、LAMA3、ITGAV、ITGB1和ACTN1。基因ITGB1可选地从列表B中排除。在列表B中可以发现以下功能基团：

-编码胶原蛋白和细胞外基质成分，特别是基质丝状胶原蛋白以及与生物合成和胶原蛋白装配有关的分子的基因：LEPREL1、PLOD2、COL6A3和CRTAP；

-编码层粘连蛋白、细胞外基质粘附蛋白的基因：LAMC1、LAMB3和LAMA3；

-编码和基地膜区域有关的基质蛋白的基因：FRAS1、MATN2和DST；

-编码整联蛋白、涉及细胞和细胞外基质结合的基因：ITGA2和ITGAV，可选地和ITGB1；和

-编码肌动蛋白、细胞外基质成分的基因：ACTN1。

从真皮基因TGFBR2、TGFBI、BMP2、SMAD3、THBS2，TGFBR3、SEMA5A、SMAD7和SOSTDC1中优选的基因构成列表A：TGFBR2、TGFBI、BMP2、SMAD3、THBS2和TGFBR3。

从真皮基因FRAS1、LEPREL1、MATN2、DST、PLOD2、ITGA2、COL6A3、CRTAP、LAMC1、LAMB3、LAMA3、ITGAV、ITGB1和ACTN1中优选出的基因构成列表B：FRAS1、LEPREL1、MATN2、DST、PLOD2和ITGA2。

“所述基因”是指此处提到的人类基因。

基因列表A和B通过构成这些列表的不同基因之间已知的相互作用的数量相连。这些连接已经通过产生的相互作用网络证实，例如，使用IPA软件(Ingenuity通路分析)，其包括书目信息可以用于表明基因或蛋白质之间存在的各种直接或间接的联系。使用该IPA软件产生的相互作用网络事实上表明了一种基因和／或蛋白质之间直接或间接的连接：TGFBR2、TGFBR3、SMAD3、SMAD7、BMP2、THBS2(列表A)和MATN2、DST、ITGA2、COL6A3、LAMC1、LAMB3、ITGAV、ITGB1、ACTN1(列表B)。

进一步地，不同的书目文献也都阐明了上述列表A和上述列表B中提及的基因之间的直接相互作用，因而提供这两个家族之间功能性连接的凭证，特别是基因SMAD3和COL6A3之间(Verrecchia et al，2001)，TGFBR2、THBS2和COL6A3之间(Berking et al，2001)以及SMAD3和LAMC1之间(Kawata et al，2002)。

发明人事实上已经阐明了选自列表A和列表B中基因在色斑皮肤和相应的健康皮肤之间表达水平的显著的和可再现的调控。

进一步地，涉及色素沉着过多斑中的TGF-β信号通路的列表A中的基因调控，倾向于增加TGF-β-SMAD信号。列表A中观察到的调控因此表明了TGF-β-SMAD信号通路的激活／刺激和色素沉淀的增加是相关的，正如发明人在本发明实施例4中证实的。

在第一个方面，本发明特别涉及一种关于表征皮肤色斑的方法。该方法可以用于，尤其是用于确认案例中色斑的本质，后者已经非常明显，例如肉眼可见的。当不能观察到而只能推测到色斑的时候，该方法同样可以用于预测色斑的出现，或用于推断个人的皮肤有倾向形成皮肤色斑或倾向于形成色斑沉淀缺陷，例如不能观察到色斑。

关注的皮肤色斑是色素沉着过多斑或色素过度导致的色素沉着过多斑，或者和色素沉淀缺陷有关的色素脱失斑或脱失色素斑。特定的色素脱失根据本发明的上下文中可以想到的是白癜和白化。根据本发明上下文可以想到的良性的色素沉着过多病的例子是：以异常积累(除了晒黑)黑色素为特征，日光性雀斑样痣、黄褐斑、痤疮相关的色素沉淀、发炎后色素沉着过多、莱姆病、与毒漆皮炎或良性面部皮肤变色相关的色素沉淀。“色斑”在本发明中也包含错误的，瑕疵或色素沉淀的不规律导致的肤色不均一或皮肤色泽不均匀。

欲研究的色斑优选人类皮肤色斑。然而，本发明人已经证实：真皮细胞外基质和TGF-β-SMAD信号通路的失调都是绝对普遍的，因此类似的方法也可以想到用于其他受色斑影响的动物。在这种情况下，本发明的各种方法、用途或组合将以与本发明人类基因直系同源的方式使用考虑范围之内的物种的基因。

该方法包括对比所述色斑皮肤和所述未受损皮肤，优选同一个体的相邻未受损皮肤中，与细胞外基质相关的至少一种真皮基因的表达水平，所述真皮基因选自：TGFBR2、TGFBI、BMP2、SMAD3、THBS2、TGFBR3、SEMA5A、SMAD7、SOSTDC1、FRAS1、LEPREL1、MATN2、DST、PLOD2、ITGA2、COL6A3、CRTAP、LAMC1、LAMB3、LAMA3、ITGAV、ITGB1和ACTN1。或者，真皮基因可以选自与TGF-β-SMAD信号通路相关的基因构成的列表A；或者选自下述基因构成的列表B：FRAS1、LEPREL1、MATN2、DST、PLOD2、ITGA2、COL6A3、CRTAP、LAMC1、LAMB3、LAMA3、ITGAV和ACTN1。在一些实施例中，SEMA5A被排除在这个列表中。或者或此外，ITGB1也如此。

本发明的基因包括TGFBR2、TGFBI、BMP2、SMAD3、THBS2、TGFBR3、SEMA5A、SMAD7、SOSTDC1、FRAS1、LEPREL1、MATN2、DST、PLOD2、ITGA2、COL6A3、CRTAP、LAMC1、LAMB3、LAMA3、ITGAV、ITGB1和ACTN1。它们对于细胞外基质的结构或更新发挥作用；特别是它们是涉及TGF-β-SMAD信号通路激活的基因，或者是编码细胞外基质成分的基因或编码涉及基质成分合成的蛋白质的基因，或者和连接性基质的更新相关的基因，或者编码和真皮表皮连接处以及基膜区相关的基质蛋白的基因。本发明的基因和细胞外基质之间的连接属于上述的某一作用。

术语“本发明的基因”同样是指来自列表A的真皮基因；或实际上来自列表B的真皮基因。

基因SEMA5A和／或ITGB1基因也可能会从列表中排除。

进一步地，本发明所述基因已知都是真皮基因，因为它们主要在皮肤中表达并生成皮肤区蛋白质或真皮表面的真皮表皮连接处特征的蛋白质；相比之下，例如，生成角化蛋白、胞内蛋白或表皮蛋白，例如优选角化层中表达的蛋白。

在来自疑似的或已知的色斑和相邻未受损皮肤的皮肤中检测本发明至少一种基因的表达水平。优选地，检测来自色斑皮肤和相邻的未受损皮肤样品的基因表达水平。举例来说，该样品是皮肤活体组织检查。活体组织检查直径几毫米是足够的，例如2毫米或3毫米直径的活组织检查。完全切下受损处也是容易想到的。

术语本发明基因的“表达水平”是指用于研究的皮肤真皮细胞或样品细胞中的基因表达水平。

未受损区域优选为和色斑尽可能接近的相邻区域但是又要保持足够的距离以使得该区域或样品不会包含任何可能属于色斑区域的细胞。优选地，相邻未受损区域可能以和色斑区域类似的一定方式和灯光及阳光接触。可选地，未受损区域可能来自主体另一侧类似位置的对称区域，例如，如果是左手上的色斑，则未受损区域可能选自右手相应的位置。在这种情况下，未受损区域不是严格意义的相邻区域。术语“未受损”是指没有色斑的区域，或没有发生色素失调的区域，优选色素沉淀均匀的区域。

因为未受损区域起到参考的作用，它必须在任何情况下都尽可能的和色斑区域类似，但同时没有任何色素缺陷。

本说明书中的术语“基因表达水平”优选是指所述基因的转录程度。然而，它的表达水平同样可以理解为它的翻译程度，假设它是编码蛋白的基因。本发明的基因都是如此。

可以用本领域技术人员熟悉的不同方法直接或在逆转录之后，对所选基因的转录程度进行评估。转录程度可能具体采用市售的用于此目的的RNA或DNA阵列进行评估。一种可能的评估方法已经在实验部分进行了描述。

同样重要的是要注意本发明中的方法涉及对比至少一种本发明基因的表达水平，或者选自列表A或列表B中至少一种基因的表达水平。基于这个原因，在没有进行个体评估和对每个表达水平定量的情况下，也足以对两种表达水平之间的差异进行定量或定性评估。

至少一种本发明基因的表达水平可能通过参考或在标准化其他基因的表达水平之后进行评估，该表达水平假定在色斑和所选未受损皮肤区域之间基本一致。标准化该基因的方法是本领域技术人员熟知的，并可能取决于斑点所在的身体区域。在实施例中，下述基因用于标准化本发明基因的表达水平是可以被接受的，编码以下蛋白的基因：核糖体蛋白L13α(RPL13A)、β-2-微球蛋白(B2M)、核糖体蛋白S9(RPS9)、核糖体蛋白S28(RPS28)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)。

本发明的方法优选在体外进行，或实际上间接体内。

本发明方法的一个实施例中，色斑是非病理性斑点，它是良性的，特别是相对于病理性受损处例如：痣；它也可能是皮肤色素沉淀的失调。

优选地，根据本发明的方法包括对比至少两种，优选至少三种，或甚至五种本发明的不同基因的表达水平。同样可以对比至少6种基因，或甚至至少8种不同基因或甚至10、12、15、20或甚至本发明的全部基因的表达水平。

在一个实施例中，不同的基因选自TGFBR2、TGFBI、BMP2、SMAD3、THBS2、TGFBR3、SEMA5A、SMAD7和SOSTDC1，或实际上选自TGFBR2、TGFBI、BMP2、SMAD3、THBS2、TGFBR3、SMAD7和SOSTDC1。

当选择两种基因时，它们优选选自下述列表中6个优选的基因：TGFBR2、TGFBI、BMP2、SMAD3、THBS2和TGFBR3。在一个实施例中，所选基因可能是TGFBR2和TGFBI、或TGFBR2和BMP2、或TGFBI和BMP2、或TGFBR2和TGFBR3。从所述6种优选的基因中选出的任何一对都是本发明优选的组合。同样地，上述6个优选的基因中的一种基因和列表A中另一种基因的任意组合都是优选的。

以下组合是可以想到的3种基因的组合：TGFBR2、TGFBI和BMP2；TGFBR2、TGFBI和SMAD3；TGFBR2、TGFBI和TGFBR3；SMAD3、SEMA5A和SMAD7；TGFBR2、BMP2和SOSTDC1；和TGFBI、BMP2和SMAD3。

下列组合是可以想到的本发明中5个基因的组合：TGFBR2、TGFBI、BMP2、SMAD3和THBS2；TGFBR2、TGFBI、BMP2、SMAD3和TGFBR3；和TGFBR2、TGFBI、BMP2、THBS2和TGFBR3。

包括下述基因的特定组合：TGFBR2、TGFBI、BMP2、SMAD3、THBS2、TGFBR3、SEMA5A和SMAD7，它们共同的特征是都以相同的方式被调控；特别地，它们在色素沉着过多斑中都过度表达并且事实上它们都参与TGF-β-SMAD信号通路。根据本发明上下文，也可以想到其他组合，特别是至少一种基因选自TGFBR2、TGFBI、THBS2和TGFBR3；和至少一种基因选自SMAD3、SEMA5A和SMAD7的组合。

TGFBR2、TGFBI、BMP2、SMAD3、THBS2、TGFBR3、SEMA5A、SMAD7和SOSTDC1基因的共同特征是它们属于TGF-β-SMAD信号通路，并且在色斑以合作的方式被调控，例如基因TGFBR2、TGFBI、BMP2、SMAD3、THBS2、TGFBR3、SEMA5A和SMAD7在信号通路中以相同的方式正调控，而和基因SOSTDC1调控方式相反，SOSTDC1是BMP的拮抗物并在信号通路中负调控。

在另外一个实施例中，不同的基因选自列表B或选自以下6种优选的基因：FRAS1、LEPREL1、MATN2、DST、PLOD2和ITGA2。例如，这些选出的基因可能是FRAS1和LEPREL1，或实际上为FRAS1和MATN2，或实际上LEPREL和MATN2，或实际上DST和PLOD2。从所述6种优选的基因FRAS1、LEPREL1、MATN2、DST、PLOD2和ITGA2，选出的任何一对都是本发明优选的组合。同样地，上述6种优选的基因中的一种基因和列表B中另一种基因的任意组合都是优选的。

以下组合是可以想到的3种基因的组合：FRAS1、LEPREL1和MATN2；FRAS1、LEPREL1和DST；FRAS1、LEPREL1和PLOD2；FRAS1、MATN2和PLOD2；LEPREL1、MATN2和PLOD2。

以下组合是可以想到的5种基因的组合：FRAS1、LEPREL1、MATN2、DST和PLOD2；FRAS1、LEPREL1、MATN2、DST和ITGA2；FRAS1、LEPREL1、MATN2、PLOD2和ITGA2。

由这些基因构成的特别组合：FRAS1、LEPREL1、MATN2、DST、ITGA2、COL6A3、CRTAP、LAMC1、LAMB3、LAMA3、ITGAV和ACTN1，它们的共同特点是它们都以相同的方式被调控，特别是在色素沉着过多斑中的过表达。

根据本发明上下文也可以想到其他组合，特别是包含至少一种基因选自属于胶原蛋白家族，即LEPREL1、PLOD2、COL6A3和CRTAP；至少一种基因选自属于层粘连蛋白家族，即LAMC1、LAMB3和LAMA3；至少一种基因选自编码和基膜区相关的基质蛋白，即FRAS1、MATN2和DST；至少一种基因选自整合素家族，即ITGA2和ITGAV，以及可选地ITGB1；和基因ACTN1。

可选地，在本发明一个优选的实施例中，比较受损皮肤和健康皮肤之间基因的表达量，所述基因选自由基因LEPREL1、PLOD2、COL6A3和CRTAP构成的亚组。事实上，这些基因的共同特征是它们都属于胶原蛋白家族，特别是基质胶原纤维家族。

根据本发明上下文，也可以想到其他组合，特别是组合中至少一种基因选自FRAS1、LEPREL1、MATN2、DST、ITGA2、COL6A3、CRTAP、LAMC1、LAMB3、LAMA3、ITGAV和ACTN1；和基因PLOD2。

根据本发明的另一实施例，也可以想到其他组合，特别是这种组合其包含至少一种选自涉及TGF-β-SMAD信号通路即列表A的基因，和至少一种选自列表B的基因，优选FRAS1、LEPREL1、MATN2、DST、PLOD2和ITGA2。例如，一种可以想到的组合由选自TGFBR2、TGFBI、BMP2、SMAD3、THBS2、TGFBR3、SEMA5A、SMAD7、FRAS1、LEPREL1、MATN2、DST、ITGA2、COL6A3、CRTAP、LAMC1、LAMB3、LAMA3、ITGAV和ACTN1中的至少两种基因构成的，这些基因的共同特征是在色素沉着过多斑过表达。

其他的特定的组合是两种基因的组合，一种选自列表A，另一种选自列表B；3种基因的组合，两种选自列表A，一种选自列表B，或相反；4种基因的组合，每个列表选2种，或实际上说3种选自列表A和1种选自列表B，或相反。

一种特别优选的2种基因的组合为TGFBR2和MATN2的组合。特别优选的3种基因的组合为TGFBR2、BMP2和MATN2，以及TGFBR2、MATN2和LEPREL1的组合。特别优选的4种基因的组合是TGFBR2、BMP2、SMAD3和MATN2的组合；TGFBR2、MATN2、LEPREL1和PLOD2的组合；以及TGFBR2、BMP2、MATN2和LEPREL1的组合。

关于本发明这方面特定优选的基因的全部组合或亚组也都是本发明其他方面优选。

执行本发明的方法会得出这样的结论，如果表达水平是下述情况时，即疑似的或观察到的色斑就是色素沉着过多斑：

-如果选自以下的基因在色斑皮肤或色斑皮肤样品中与在相邻未受损皮肤或相邻未受损皮肤样品相比更高：TGFBR2、TGFBI、BMP2、SMAD3、THBS2、TGFBR3、SEMA5A、SMAD7、FRAS1、LEPREL1、MATN2、DST、ITGA2、COL6A3、CRTAP、LAMC1、LAMB3、LAMA3、ITGAV、ITGB1和ACTN1，和

-如果选自以下的基因在色斑皮肤或色斑皮肤样品中与在相邻未受损皮肤或相邻受损皮肤样品中的表达水平相比更低：SOSTDC1和PLOD2。

本申请发明人已经证明了：和相邻未受损皮肤相比，以下基因在色素沉着过多斑，特别是日光性雀斑样痣中过表达：TGFBR2、TGFBI、BMP2、SMAD3、THBS2、TGFBR3、SEMA5A、SMAD7、FRAS1、LEPREL1、MATN2、DST、ITGA2、COL6A3、CRTAP、LAMC1、LAMB3、LAMA3、ITGAV、ITGB1和ACTN1。他们也证明了：和相邻未受损皮肤相比，基因SOSTDC1和PLOD2在色素沉着过多斑皮肤，特别是日光性雀斑样痣中低表达。

相比之下，执行本发明的方法会得出这样的结论，如果表达水平是下述情况时，即疑似的或观察到的色斑是色素脱失斑：

-如果选自以下的基因在色斑皮肤或色斑皮肤样品中与在相邻的未受损皮肤或相邻未受损皮肤样品相比更低：TGFBR2、TGFBI、BMP2、SMAD3、THBS2、TGFBR3、SEMA5A、SMAD7、FRAS1、LEPREL1、MATN2、DST、ITGA2、COL6A3、CRTAP、LAMC1、LAMB3、LAMA3、ITGAV、ITGB1和ACTN1，和

-如果选自以下的基因在色斑皮肤或色斑皮肤样品中与在相邻未受损皮肤或相邻未受损皮肤样品相比更高：SOSTDC1和PLOD2。

术语“更高”或“更低”是指统计学意义的、高于背景噪音和可再现的表达水平的差异。例如，表达水平的差异至少为10％，即如果本发明的基因在未受损皮肤的表达水平固定为1，则在受损皮肤过表达的基因调控程度至少为1.1，在受损皮肤低表达的基因调控程度至多为0.9。

优选地，本发明的方法涉及至少两种基因，一种属于在色素沉着过多斑中过表达和在色素脱失斑中低表达的基因组，另一种则属于与色斑中第一种基因以相反方式调控的基因组。优选地，该方法涉及至少三种基因：从TGFBR2、TGFBI、BMP2、SMAD3、THBS2、TGFBR3、SEMA5A、SMAD7、FRAS1、LEPREL1、MATN2、DST、ITGA2、COL6A3、CRTAP、LAMC1、LAMB3、LAMA3、ITGAV、ITGB1和ACTN1中选择两种基因，从SOSTDC1和PLOD2中选择一种基因，与色斑中前两种基因以相反方式调控，或实际上前两种基因选自TGFBR2、TGFBI、BMP2、SMAD3、THBS2、TGFBR3、SEMA5A和SMAD7、和基因SOSTDC1；或实际上两种基因选自FRAS1、LEPREL1、MATN2、DST、ITGA2、COL6A3、CRTAP、LAMC1、LAMB3、LAMA3、ITGAV、ITGB1和ACTN1和基因PLOD2，与色斑前两种基因以相反方式调控。

优选地，根据所述表征方法，本发明基因的表达水平都在高加索人皮肤上进行对比。优选地，所述个体至少为40岁，优选至少50岁或甚至60岁。本发明考虑范围之内的个体优选女性。如上所述，本发明一种或多种基因的表达水平可能会和所述个体的皮肤样品进行对比。

进一步地，本申请发明人同样证明来自色斑和未受损皮肤，优选相邻的未受损皮肤之间其他真皮基因的差异调控。发明人特别证明了以下和细胞外基质相关的真皮基因的调控：

-编码胞外蛋白聚糖和糖蛋白的基因EFEMP1、ECM1、ASPN、HS3ST6、PAPLN、CHSY1和FLRT2；

-编码和基质重塑相关的蛋白的基因：MXRA5、LYZ、CTSL2、PLAU和TIMP1。

结果，根据本发明的所述表征方法同样包含了对比在所述色斑和未受损皮肤，优选相邻的未受损皮肤中至少一种真皮基因的表达水平，所述真皮基因选自下表：TGFBR2、TGFBI、BMP2、SMAD3、THBS2、TGFBR3、SEMA5A、SMAD7、SOSTDC1、FRAS1、LEPREL1、MATN2、DST、PLOD2、ITGA2、COL6A3、CRTAP、LAMC1、LAMB3、LAMA3、ITGAV、ITGB1和ACTN1，和至少第二种选自下述列表的基因EFEMP1、ECM1、ASPN、HS3ST6、PAPLN、CHSY1、FLRT2、MXRA5、LYZ、CTSL2、PLAU和TIMP1；例如第二种基因选自下述基因：EFEMP1、ECM1、ASPN、HS3ST6、PAPLN、CHSY1、FLRT2或实际上由下述基因构成的列表：MXRA5、LYZ、CTSL2、PLAU和TIMP1。

从真皮基因列表EFEMP1、ECM1、ASPN、HS3ST6、PAPLN、CHSY1、FLRT2优选的基因是EFEMP1、ECM1、ASPN、HS3ST6、PAPLN和CHSY1；MXRA5、LYZ、CTSL2、PLAU和TIMP1也是优选的基因。

优选地，第二种基因选自EFEMP1、ECM1、ASPN、HS3ST6、PAPLN、CHSY1和FLRT2，优选地EFEMP1、ECM1、ASPN、HS3ST6、PAPLN和CHSY1。可选地，第二种基因选自MXRA5、LYZ、CTSL2、PLAU和TIMP1。

在另一个实施例中，第一种基因选自涉及TGF-β-SMAD信号通路的列表A中的真皮基因；第二种基因如上所述。根据另一个实施例，第一种基因选自列表B；第二种基因用上述方法选择。

在一个特定实施例中，该方法包括对比至少3种不同的基因的表达水平，该3种基因一种选自TGFBR2、TGFBI、BMP2、SMAD3、THBS2、TGFBR3、SEMA5A、SMAD7和SOSTDC1；第二种选自EFEMP1、ECM1、ASPN、HS3ST6、PAPLN、CHSY1和FLRT2，第三种选自MXRA5、LYZ、CTSL2、PLAU和TIMP1。可选地，当选择3种基因时，第一种可能选自列表B，第二种和第三种用上述方法选择。根据另一个实施例，第一种基因选自下述基因：TGFBR2、TGFBI、BMP2、SMAD3、THBS2、TGFBR3、SEMA5A、SMAD7、SOSTDC1、FRAS1、LEPREL1、MATN2、DST、PLOD2、ITGA2、COL6A3、CRTAP、LAMC1、LAMB3、LAMA3、ITGAV、ITGB1和ACTN1；可选地，然而，SEMA5A被排除掉。

根据另一实施例，该方法包括对比至少4种不同的基因的表达水平，前三种基因用上述方法选择，第四种基因选自下述基因：FRAS1、LEPREL1、MATN2、DST、PLOD2、ITGA2、COL6A3、CRTAP、LAMC1、LAMB3、LAMA3、ITGAV、ITGB1和ACTN1。

上述所有的基因组合对于本发明其他方面也是优选的。

如果一种或多种补充基因选自EFEMP1、ECM1、ASPN、HS3ST6、PAPLN、CHSY1、FLRT2、MXRA5、LYZ、CTSL2、PLAU和TIMP1，如果表达水平是下述情况时，那么所述表征方法能够证实是色素沉着过多斑：

-如果选自以下的基因在色斑皮肤或色斑皮肤样品中与在相邻未受损皮肤或相邻未受损皮肤样品相比更高：EFEMP1、ASPN、PAPLN、CHSY1、MXRA5、LYZ、PLAU和TIMP1、和

-如果选自以下的基因在斑点皮肤或斑点皮肤样品中与在相邻未受损皮肤或相邻未受损皮肤样品相比更低：HS3ST6、FLRT2、ECM1和CTSL2。

相比之下，如果表达水平是下述情况时，本发明的方法可以证实是色素脱失斑：

-如果选自以下的基因在色斑皮肤或色斑皮肤样品中与在相邻未受损皮肤或相邻未受损皮肤样品相比更低：EFEMP1、ASPN、PAPLN、CHSY1、MXRA5、LYZ、PLAU和TIMP1、和

-选自以下的基因在色斑皮肤或色斑皮肤样品中与在相邻未受损皮肤或相邻未受损皮肤样品相比更高：HS3ST6、FLRT2、ECM1和CTSL2。

所述方法同样也是一种用于预测受试者中皮肤色斑形成的测试方法。在该操作中，至少一种基因，优选若干本发明的基因，在皮肤样品中的表达水平对比它们在正常皮肤中的表达水平。和正常皮肤表达水平呈显著修饰的表明，受试者皮肤倾向于形成皮肤色斑。

术语“正常皮肤”是指给定受试者身体特定区域的皮肤，已知是没有色斑的，例如没有暴露在阳光下的区域，或形成色斑倾向很低的区域。它同样是指所述基因在没有色斑的人体皮肤上的表达水平，优选地和受试者皮肤类型相同。上述标准的基因可以用于标准化本发明基因的表达水平。

在第二个方面，本发明也涉及一种使用发明人证明的分子标签评估治疗色斑或色素失调功效的方法。被评估的治疗可能是一种用于减弱色斑或其他色素沉淀调控，特别是使皮肤光滑，使肤色均一或抵抗皮肤变色的治疗方法。在第一个实施例中，该评估方法包含对比色斑皮肤中的至少一种真皮基因在治疗前后的表达水平的步骤，所述至少一种真皮基因选自本发明下述基因，即TGFBR2、TGFBI、BMP2、SMAD3、THBS2、TGFBR3、SEMA5A、SMAD7、SOSTDC1、FRAS1、LEPREL1、MATN2、DST、PLOD2、ITGA2、COL6A3、CRTAP、LAMC1、LAMB3、LAMA3、ITGAV、ITGB1和ACTN1。

在一个实施例中，基因选自TGFBR2、TGFBI、BMP2、SMAD3、THBS2、TGFBR3、SEMA5A、SMAD7和SOSTDC1，或实际上选自TGFBR2、TGFBI、BMP2、SMAD3、THBS2、TGFBR3、SMAD7和SOSTDC1。根据另一个实施例，基因选自FRAS1、LEPREL1、MATN2、DST、PLOD2、ITGA2、COL6A3、CRTAP、LAMC1、LAMB3、LAMA3、ITGAV、ITGB1和ACTN1。基因SEMA5A和／或ITGB1基因可选地从列表中排除。

在该评估方法中，所选一种基因或多种基因的表达水平在来自色斑的皮肤之间对比，或在来自相应的样品在治疗前后之间对比。因此，基因的表达水平在健康未受损皮肤之间没有对比。

根据本发明第一个方面所述的表征方法，借助于核糖体蛋白L13α(RPL13A)、β-2-微球蛋白(B2M)、核糖体蛋白S9(RPS9)、核糖体蛋白S28(RPS28)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)来标准化基因的表达。

使用上述评估方法，如果表达水平是下述情况时，给定的治疗被认为是对色素沉着过多斑有效的：

-如果选自下述的基因治疗后的表达水平低于治疗前的表达水平：TGFBR2、TGFBI、BMP2、SMAD3、THBS2、TGFBR3、SEMA5A、SMAD7、FRAS1、LEPREL1、MATN2、DST、ITGA2、COL6A3、CRTAP、LAMC1、LAMB3、LAMA3、ITGAV、ITGB1和ACTN1，和

-如果选自SOSTDC1和PLOD2的基因在治疗后的表达水平高于治疗前的表达水平。

相比之下，使用发明所述的评估方法，如果表达水平是下述情况时，给定的治疗被认为是对色素脱失斑有效的：

-如果选自下述的基因治疗后的表达水平高于治疗前的表达水平：TGFBR2、TGFBI、BMP2、SMAD3、THBS2、TGFBR3、SEMA5A、SMAD7、FRAS1、LEPREL1、MATN2、DST、ITGA2、COL6A3、CRTAP、LAMC1、LAMB3、LAMA3、ITGAV、ITGB1和ACTN1，和

-如果选自SOSTDC1和PLOD2的基因在治疗后的表达水平低于治疗前的表达水平。

如果所选基因在治疗前后是基本相同的，或实际上没有显著区别，则认为该治疗是无效的。

当对比一种以上基因的表达水平时，如果大多数被测试基因，优选全部被测单个基因对于治疗斑点或色素失调被认为是有效的，则认为该治疗是有效的。对于另一种所选基因，治疗优选没有效果的，而不是具有相反效果的。

根据另一个实施例，评估对皮肤色斑治疗功效的方法包括使用本发明方法表征所述色斑和色素失调，对比受损色斑皮肤或色素失调皮肤和健康皮肤在治疗前后观察到的表达水平的区别。

根据评估治疗功效的实施例，如果所选基因或取自色斑的受损皮肤中的基因和健康皮肤，优选相邻的皮肤之间表达水平的差异在治疗之后相比治疗前变小，则该治疗被认为是有效的。

当对比一种以上基因的表达水平时，如果大多数被测试基因，优选全部被测单个基因的治疗都是有效的，则优选得出结论：该治疗是有效的。

优选地，对比所述基因的表达水平，是在来自色斑的皮肤样品中进行的。

考虑范围之内的治疗方法，用本发明所述方法评估，而不限于某个特定类型的治疗。治疗方法可能使用化学分子、活性成分，特别是必要的油、核酸，特别是干扰RNA，蛋白复合物或任何其他分子或分子组合物。它也可能使用物理方法或波，特别是电磁波治疗。优选局部治疗，但是它也可能涉及评估经口、注射或通过其他给药途径的治疗功效。

被检测的方法可能是一种治疗方法用于减弱皮肤色斑或导致它消失，调节皮肤色素沉积，使皮肤光滑，使肤色均一或减弱皮肤变色。

根据本发明，特别优选的治疗方法是用化妆治疗，更特别地为局部化妆治疗。在这种情况下，考虑范围之内的色斑是一种非病理性色斑或色素失调，例如日光性雀斑样痣、日光性着色斑或老年型雀斑痣。

使用本发明的方法，也可以用于评估若干种治疗的组合的功效。事实上，可以评估能够把来自列表A或列表B的一种基因、一些或全部本发明的基因的表达水平恢复到它们在未受损皮肤中的表达水平的最佳组合。

使用上述的评估方法，可以评估新想到的治疗方法的功效或对现存的治疗色斑方法的功效进行定量或定性，无论他们是色素沉着过多或色素脱失。通过这种方式，也可以想到一些可能特别有效、协同或互补的治疗方法的组合。

正如根据本发明第一种方面所述的表征方法，优选对比本发明，或甚至列表A或实际上列表B中一种以上基因，优选至少两种、三种、五种、六种、八种、十种、十二种、十五种、十八种甚至全部基因的表达水平。

关于本发明第一个方面特别优选的基因或基因组合已经列出；本方面也优选同样的基因或组合。特别是，所选基因特别选自TGFBR2、TGFBI、BMP2、SMAD3、THBS2、TGFBR3、SEMA5A、SMAD7和SOSTDC1，更特别的选自基因TGFBR2、TGFBI、BMP2、SMAD3、THBS2和TGFBR3，特别优选的是从这些列表中选出的任意两种或三种的组合。根据另外一个实施例，基因选自列表B中的基因，特别是选自列表FRAS1、LEPREL1、MATN2、DST、PLOD2和ITGA2，特别优选的是从这些列表中选出的任意两种或三种组合。

进一步地，由于本发明人获得的关于其他真皮基因的表达水平在色斑处被调控的互补结果，所述评估方法优选使用：

-至少一种基因选自TGFBR2、TGFBI、BMP2、SMAD3、THBS2、TGFBR3、SEMA5A、SMAD7、SOSTDC1、FRAS1、LEPREL1、MATN2、DST、PLOD2、ITGA2、COL6A3、CRTAP、LAMC1、LAMB3、LAMA3、ITGAV、ITGB1和ACTN1，甚至优选的选自列表A或选自：TGFBR2、TGFBI、BMP2、SMAD3、THBS2和TGFBR3，或选自列表B，或再次选自FRAS1、LEPREL1、MATN2、DST、PLOD2和ITGA2和

-至少一种第二基因选自EFEMP1、ECM1、ASPN、HS3ST6、PAPLN、CHSY1、FLRT2、MXRA5、LYZ、CTSL2、PLAU和TIMP1。可选地，第二种基因选自EFEMP1、ECM1、ASPN、HS3ST6、PAPLN、CHSY1、FLRT2或实际上MXRA5、LYZ、CTSL2、PLAU和TIMP1。

从真皮基因EFEMP1、ECM1、ASPN、HS3ST6、PAPLN、CHSY1和FLRT2优选的基因为EFEMP1、ECM1、ASPN、HS3ST6、PAPLN和CHSY1。

如果一种或多种补充基因选自EFEMP1、ECM1、ASPN、HS3ST6、PAPLN、CHSY1、FLRT2、MXRA5、LYZ、CTSL2、PLAU和TIMP1，如果表达水平是下述情况时，那么所述评估方法认为对色素沉着过多斑的治疗是有效的：

-和治疗前相比，如果治疗后选自以下的基因表达水平降低：EFEMP1、ASPN、PAPLN、CHSY1、MXRA5、LYZ、PLAU和TIMP1，和

-和治疗前相比，如果治疗后选自以下的基因表达水平升高：HS3ST6、FLRT2、ECM1和CTSL2。

与之相反，如果表达水平是下述情况时，所述评估方法认为对色素脱失斑的治疗是有效的：

-和治疗前相比，如果治疗后选自以下的基因表达水平升高：EFEMP1、ASPN、PAPLN、CHSY1、MXRA5、LYZ、PLAU和TIMP1，和

-和治疗前相比，如果治疗后选自以下的基因表达水平降低：HS3ST6、FLRT2、ECM1和CTSL2。

优选的皮肤样本源自高加索人，优选的个体至少为40岁，优选至少50岁或甚至60岁。

优选地，根据本发明上下文和特别根据所述评估方法，它是一种色素沉着过多斑，更优选的是对日光性雀斑样痣、日光性着色斑或老年性雀斑样痣的治疗方法。

评估本发明治疗功效的方法优选在体外，或实际上间接体内进行。它也可以在体内进行。皮肤样品最好是在治疗前后从同一色斑处获取，如果所需色斑的大小不能够在治疗前后容易的获取，则在治疗前后从距离色斑非常近的地方获取。

本发明同样是关于一种体外评估治疗色斑功效的方法；该方法包括对比代表皮肤的细胞模型中至少一种真皮基因在治疗前后的表达水平，所述真皮基因选自TGFBR2、TGFBI、BMP2、SMAD3、THBS2、TGFBR3、SEMA5A、SMAD7、SOSTDC1、FRAS1、LEPREL1、MATN2、DST、PLOD2、ITGA2、COL6A3、CRTAP、LAMC1、LAMB3、LAMA3、ITGAV、ITGB1和ACTN1，或者所述所选基因的表达水平或表达产物活性。可选地，该基因可能选自和TGF-β-SMAD信号通路相关的列表A中的基因，含有或不含有SEMA5A，或实际上选自列表B，或实际上选自后面这个列表的各种亚组，即选自LEPREL1、PLOD2、COL6A3和CRTAP，或实际上选自LAMC1、LAMB3和LAMA3，或实际上选自FRAS1、MATN2和DST，或再次选自ITGA2、ITGAV和ITGB1，或ITGA2和ITGAV之间。

细胞模型可以是本领域技术人员所能想到的任何合适的类型。特别地，它可能是单个或共同培养的细胞模型或是重构的皮肤三维模型，或实际上间接体内培养的皮肤。存在的细胞模型可以代表色斑，更特别的是日光性雀斑样痣，根据上下文可以用于该方法。这种细胞模型不需要完全地模仿色斑(或雀斑痣)，但是需要模仿色斑中，特别是雀斑痣中观察到的生物事件、形态特征或色斑特征。这种体外模型是技术人员所熟知的。

根据上述体外方法的一个优选实施例，它包括对比至少两种基因、优选至少三种、五种或六种本发明基因的表达水平，正如本发明其他评估方法中所述，所述基因选自本发明的基因，或实际上选自列表A中的基因，包含或不含SEMA5A，或实际上选自列表B中的基因，包含或不包含ITGB1。最优选的基因是基因TGFBR2、TGFBI、BMP2、SMAD3、THBS2和TGFBR3，以及FRAS1、LEPREL1、MATN2、DST、PLOD2和ITGA2。

类似地，正如其他评估方法所述，它们优选采用至少两种基因：

-选自下述基因：TGFBR2、TGFBI、BMP2、SMAD3、THBS2、TGFBR3、SEMA5A、SMAD7和SOSTDC1，或实际上选自列表B，或再次选自TGFBR2、TGFBI、BMP2、SMAD3、THBS2、TGFBR3、SEMA5A、SMAD7、SOSTDC1、FRAS1、LEPREL1、MATN2、DST、PLOD2、ITGA2、COL6A3、CRTAP、LAMC1、LAMB3、LAMA3、ITGAV、ITGB1和ACTN1，和

-第二种基因选自EFEMP1、ECM1、ASPN、HS3ST6、PAPLN、CHSY1、FLRT2、MXRA5、LYZ、CTSL2、PLAU和TIMP1，优选的是EFEMP1、ECM1、ASPN、HS3ST6、PAPLN、CHSY1和FLRT2，或实际上选自MXRA5、LYZ、CTSL2、PLAU和TIMP1。

特别优选的是，第一种基因选自TGFBR2、TGFBI、BMP2、SMAD3、THBS2和TGFBR3，或实际上选自FRAS1、LEPREL1、MATN2、DST、PLOD2和ITGA2。

考虑到本发明的评估方法，在一个优选的实施例中，第一种基因选自由下述基因构成的亚组LEPREL1、PLOD2、COL6A3和CRTAP，属于胶原蛋白家族，特别是基质胶原纤维家族。

根据另外一个实施例，第一种基因选自由LAMC1、LAMB3和LAMA3基因构成的组，其编码层粘连蛋白，并在色素沉着过多斑中过表达。

根据另外一个实施例，第一种基因选自由FRAS1、MATN2和DST基因构成的组，其编码和基膜区相关的基质蛋白，并在色素沉着过多斑中过表达。

根据另外一个实施例，第一种基因选自由ITGA2、ITGAV和ITGB1基因构成的组，其编码整联蛋白，并在色素沉着过多斑中过表达。

可选地，该方法也可以采用编码肌动蛋白的ACTN1基因。

本发明另一个方面所述的全部特定基因的组合，同样对于这方面也是优选的。

进一步地，使用这些评估方法，可以通过突出本发明所述的评估治疗功效的方法中获得的结果，来促销在消费者中的治疗。因此，本发明也可以提供一种用于推荐一种产品的方法，该方法通过表明产品在测试步骤中的效应，并通过上述方法评估它的功效。因此，本发明也是关于一种促销化妆品或化妆治疗的方法，由通过上述至少一种方法强调所述产品或治疗的功效、行为或特性构成。

这种产品的宣传也可以使用任何沟通渠道。它能够通过销售人员在销售现场，借助收音机和电视，特别是广告来直接宣传。它也可以通过文字媒体，或其他文档的方式，特别是宣传目的(样张)的方式宣传。它也可以通过网络或任何其他合适数据网络宣传。它也可以直接通过产品宣传，特别是在它的包装或其他任何和它相关的宣传传单。本发明也涉及一种筛选用于治疗皮肤色斑的分子的方法，包括上述的一种评估方法以确定基于该分子的治疗功效。

在另一方面，本发明也是涉及一种用于治疗或预防非病理性皮肤色斑或人类皮肤失调的化妆方法，包括调控真皮基因的表达水平或活性，其中所述基因选自由下述基因构成的列表：TGFBR2、TGFBI、BMP2、SMAD3、THBS2、TGFBR3、SEMA5A、SMAD7、SOSTDC1、FRAS1、LEPREL1、MATN2、DST、PLOD2、ITGA2、COL6A3、CRTAP、LAMC1、LAMB3、LAMA3、ITGAV和ACTN1。可选地，该基因可能选自和TGF-β-SMAD信号通路相关的列表A中的真皮基因，含有或不含有SEMA5A，或实际上选自列表B，优选不含ITGB1，或实际上选自后面这个列表的各种亚组，即选自LEPREL1、PLOD2、COL6A3和CRTAP，或实际上选自LAMC1、LAMB3和LAMA3，或实际上选自FRAS1、MATN2和DST，或再次选自ITGA2、ITGAV和ITGB1，或ITGA2和ITGAV之间。

术语“非病理性皮肤色斑”包含良性色斑，仅基于审美原因而不是治疗原因而需要消除这种色斑。色素沉淀的失调情况包括色素瑕疵使得肤色不均一或皮肤色泽不均匀。

本发明人已经证明了本发明基因在皮肤色斑真皮层中的重要作用，特别是这些基因表达水平失调和色斑出现之间的联系。基于这个原因，停止或降低这些基因的调控是指观察到的失调可以减少或废除，因此在细胞外基质中该情况可以恢复，它是和色斑缺失可以兼容的，并因此具备均一的肤色和均匀的皮肤色泽。

基于本发明另一个方面的原因，优选，选自本发明一种以上的基因，例如至少两种基因，或至少三种、五种、六种、或八种。在一个实施例中，该化妆方法用途调控本发明所有基因，或选自列表A的全部基因，包含或不含SEMA5A，或实际上选自列表B的全部基因的表达水平。优选地，基因ITGB1从列表B中排除。本发明的化妆方法用于恢复到接近于健康皮肤，例如色斑相邻的健康皮肤中的表达水平。特别优选的基因是TGFBR2、TGFBI、BMP2、SMAD3、THBS2和TGFBR3，以及FRAS1、LEPREL1、MATN2、DST、PLOD2和ITGA2。

在一个优选的实施例中，所述色斑是色素沉着过多斑，例如日光性着色斑、日光型雀斑痣或老年型雀斑痣。在这种情况下，在本发明化妆方法中期望的调控是：

-全部、部分或临时抑制至少一种下述基因的表达：TGFBR2、TGFBI、BMP2、SMAD3、THBS2、TGFBR3、SEMA5A和SMAD7，或实际上选自基因FRAS1、LEPREL1、MATN2、DST、ITGA2、COL6A3、CRTAP、LAMC1、LAMB3、LAMA3、ITGAV、ITGB1和ACTN1，或实际上选自TGFBR2、TGFBI、BMP2、SMAD3、THBS2、TGFBR3、SEMA5A、SMAD7、FRAS1、LEPREL1、MATN2、DST、ITGA2、COL6A3、CRTAP、LAMC1、LAMB3、LAMA3、ITGAV、ITGB1和ACTN1，或实际上

-增加或暂时增加基因SOSTDC1或PLOD2的表达水平。

优选地，抑制并不是全部抑制而是部分抑制，倾向于降低所选基因的表达水平而且没有完全抑制它表达。

根据另一个实施例，所述色斑是色素脱失斑。在这种情况下，期望的调控和之前的情况相反；特别地，该方法目的在于提高至少一种下述基因的表达水平：TGFBR2、TGFBI、BMP2、SMAD3、THBS2、TGFBR3、SEMA5A和SMAD7，或实际上提高选自FRAS1、LEPREL1、MATN2、DST、ITGA2、COL6A3、CRTAP、LAMC1、LAMB3、LAMA3、ITGAV、ITGB1和ACTN1基因的表达水平，或实际上提高选自TGFBR2、TGFBI、BMP2、SMAD3、THBS2、TGFBR3、SEMA5A、SMAD7、FRAS1、LEPREL1、MATN2、DST、ITGA2、COL6A3、CRTAP、LAMC1、LAMB3、LAMA3、ITGAV、ITGB1和ACTN1基因的表达水平，或实际上用于抑制或降低基因SOSTDC1或PLOD2的表达水平。

术语“增加或降低表达水平”包括增加或降低转录所述基因的程度，和增加或降低翻译所述基因的程度，以及增加或降低由这些基因编码的蛋白活性。

优选地，调控本发明所期望的一种基因的表达水平的同时，本发明的化妆方法优选包括调控至少一种选自下述的真皮基因：EFEMP1、ECM1、ASPN、HS3ST6、PAPLN、CHSY1、FLRT2、MXRA5、LYZ、CTSL2和PLAU和TIMP1。从第二个列表中优选的真皮基因为EFEMP1、ECM1、ASPN、HS3ST6、PAPLN和CHSY1和基因MXRA5、LYZ、CTSL2、PLAU和TIMP1。

在治疗色素沉着过多斑中使用的调控为降低下述基因的表达水平：EFEMP1、ASPN、PAPLN、CHSY1、MXRA5、LYZ、PLAU和TIMP1，以及增加下述基因的表达水平：ECM1、HS3ST6、FLRT2和CTSL2。在治疗色素脱失斑的情况下，采用相反的调控。

根据本发明的化妆方法，其包括采用产品，特别是化学分子、天然提取物、核酸、多肽或治疗方法用于调控本发明至少一种真皮基因的表达水平或表达产物的活性。

这种调控优选通过直接针对本发明的至少一种基因和抑制它的表达的反义、微RNA或siRNA获得。

如果它是产品，优选局部使用。

优选地，该调控使用本发明基因中的一种基因的调控子。该调控子如实施例3和表3所述。例如，选自下述物质对于本发明的化妆方法是非常有利的：脱矿质骨粉(DBP)、吡格列酮、GW0742、鸡冠花黄酮类化合物、非诺贝特、氧化苦参碱、丹酚酸B、SB-431542，温脾汤合五苓散提取物、粉防己碱和N-乙酰基-丝氨酰-天门冬酰-赖氨酰-脯氨酸(Ac-SDKP)、维生素K2甲基萘醌类、β-氨基丙腈(bAPN)和凡德他尼(ZD64745)，或实际上使用低强度超声波，或和这些调控子中至少两种相关。

进一步地，对将要用根据第一个方面的方法进行处理的色斑进行表征之后，再使用对本发明的化妆方法是非常有利。事实上，第一步可以用于表征色斑，据此检测色斑区和未受损区，优选相邻的未受损区皮肤之间表达水平显著受到调控的基因。然后可能使用治疗方法，特别是通过所述基因的专门调控子，其可以作用于本发明的基因，所述基因在色斑处受到区别调控。

不考虑所述治疗，本发明的化妆方法可能也包含使用一种或多种其他活性化合物以加强预期效果，例如去色素物质、角质软化剂和／或去皮因子、抗氧化剂、化学或物理UV防晒品、抗-炎症和／或舒缓剂，或脱氧核糖核酸和它们的衍生物。

本发明的化妆方法同样适用于预防肤色或皮肤色泽出现色斑或其他失调，特别是色素沉着过多斑例如日光性雀斑样痣。

事实上，本发明人获得的数据以及实验部分列出的数据表明：细胞外基质，特别是TGF-β-SMAD信号通路的挑战，根据本发明人引入的基因在色斑出现之前是容易面临的。色素沉着过多斑的生物事件顺序可能如下：1)改变真皮(根据本申请中的基因表达水平的调控)，导致2)对表皮的修饰，使得在真皮中形成表皮嵴，导致3)增加真皮表皮连接处的长度并形成复杂网络，导致4)增加黑色素含量。

本发明同样涉及调控由下述基因构成的列表中的至少一种真皮基因的表达水平或表达产物的活性的调控子：TGFBR2、TGFBI、BMP2、SMAD3、THBS2、TGFBR3、SEMA5A、SMAD7、SOSTDC1、FRAS1、LEPREL1、MATN2、DST、PLOD2、ITGA2、COL6A3、CRTAP、LAMC1、LAMB3、LAMA3、ITGAV、ITGB1和ACTN1，用于在治疗非病理性皮肤色斑中的化妆品应用，或更一般地，用于调控皮肤色素沉淀的化妆品。可选地，该基因可能选自和TGF-β-SMAD信号通路相关的列表A中的基因，含有或不含SEMA5A，或实际上选自真皮基因的列表B，或实际上选自后面这个列表的不同亚组，即选自LEPREL1、PLOD2、COL6A3和CRTAP，或实际上选自LAMC1、LAMB3和LAMA3，或实际上选自FRAS1、MATN2和DST，或再次选自ITGA2、ITGAV和ITGB1，或ITGA2和ITGAV之间。基因ITGB1基因可以从各种列表中排除。

对于治疗色素沉着过多斑，使用的调控子是选自下述至少一种基因的抑制子：TGFBR2、TGFBI、BMP2、SMAD3、THBS2、TGFBR3、SEMA5A、SMAD7、FRAS1、LEPREL1、MATN2、DST、ITGA2、COL6A3、CRTAP、LAMC1、LAMB3、LAMA3、ITGAV、ITGB1和ACTN1，或实际上SOSTDC1或PLOD2的激活因子。优选地，抑制子是一种部分抑制剂，导致所述基因表达水平降低或导致所述基因表达产物活性降低，而不以任何方式完全停止所述基因的表达或所述基因表达产物的活性。一方面，调控子是选自下述至少一种基因的抑制子：TGFBR2、TGFBI、BMP2、SMAD3、THBS2、TGFBR3、SEMA5A和SMAD7，或不含SEMA5A，或实际上作为SOSTDC1的激活因子。在另一方面，该调控子是选自下述至少一种基因的抑制子：FRAS1、LEPREL1、MATN2、DST、ITGA2、COL6A3、CRTAP、LAMC1、LAMB3、LAMA3、ITGAV和ACTN1，或实际上是PLOD2的激活因子。

与之相反，对于治疗色素缺失斑，使用的调控子是选自下述至少一种基因的激活因子：TGFBR2、TGFBI、BMP2、SMAD3、THBS2、TGFBR3、SEMA5A、SMAD7、FRAS1、LEPREL1、MATN2、DST、ITGA2、COL6A3、CRTAP、LAMC1、LAMB3、LAMA3、ITGAV、ITGB1和ACTN1，或实际上SOSTDC1或PLOD2的抑制剂。在一个实施例中，调控子是选自下述至少一种基因的调控子：TGFBR2、TGFBI、BMP2、SMAD3、THBS2、TGFBR3、SEMA5A和SMAD7，或不含SEMA5A，或实际上作为SOSTDC1的抑制子。在另一个方面，该调控子是选自下述至少一种基因的激活因子：FRAS1、LEPREL1、MATN2、DST、ITGA2、COL6A3、CRTAP、LAMC1、LAMB3、LAMA3、ITGAV和ACTN1，或实际上是PLOD2的抑制子。

已知的和已分类的抑制子或激活因子例子见实验部分实施例3。这种调控子可能具体为丹酚酸B、温脾汤合五苓散提取物或低强度超声波，用于色素沉着过多斑的化妆治疗中。

已知的调控子也可以是反义分子、siRNAs和微RNAs。特别能想到的调控子是本发明基因的至少一种基因以及抑制它表达的反义分子、微RNAs和siRNAs。

本发明特别优选的调控子为脱矿质骨粉(DBP)、吡格列酮、GW0742、鸡冠花黄酮类化合物、非诺贝特、氧化苦参碱、丹酚酸B、SB-431542，温脾汤合五苓散提取物、粉防己碱和N-乙酰基-丝氨酰-天门冬酰-赖氨酰-脯氨酸(Ac-SDKP)、维生素K2甲基萘醌类、β-氨基丙腈(bAPN)和凡德他尼(ZD64745)，或实际上使用低强度超声波。可以想到使用至少两种调控子的组合。

调控子的有效剂量必须和期望的结果以及所使用的调控子的数量和类型相适应；它们按重量在0.001％至30％范围之间。

如上所述的用于本发明化妆方法的调控子联合下述基因的调控子：EFEMP1、ECM1、ASPN、HS3ST6、PAPLN、CHSY1、FLRT2，或实际上下述基因的调控子：MXRA5、LYZ、CTSL2、PLAU和TIMP1。

优选的基因组合已经描述过。

调控子可能和其他产品、活性成分或赋形剂共同使用。优选地，它们以合适的形式包装以用于局部施用，例如以油膏、霜或软膏，或任何适合皮肤护理的形式，例如水、血清、肥皂等。

已在本发明化妆方法部分描述过的各种实施方式也适用于上述化妆用途。

本发明的调控子特别用于使肤色均一，皮肤色泽均匀和抵抗皮肤变色的化妆品。

进一步地，本发明另一个方面涉及调控选自下述至少一种真皮基因的表达水平或表达产物的活性的调控子：TGFBR2、TGFBI、BMP2、SMAD3、THBS2、TGFBR3、SEMA5A、SMAD7、SOSTDC1、FRAS1、LEPREL1、MATN2、DST、PLOD2、ITGA2、COL6A3、CRTAP、LAMC1、LAMB3、LAMA3、ITGAV和ACTN1，所述调控子用于治疗皮肤色斑，例如治疗性处理。所述色斑可能为色素沉着过多斑，或实际上色素脱失斑。可选地，该基因可能选自和TGF-β-SMAD信号通路相关的列表A中的基因，或实际上选自列表B的真皮基因，或实际上选自后面这个列表的不同亚组，即选自LEPREL1、PLOD2、COL6A3和CRTAP，或实际上选自LAMC1、LAMB3和LAMA3，或实际上选自FRAS1、MATN2和DST，或再次选自ITGA2、ITGAV和ITGB1，或ITGA2和ITGAV之间。

本发明优选的调控子已经描述过。

根据本发明的不同方法和应用，考虑范围之内的色斑优选是色素沉着过多斑和更优选地日光性雀斑样痣、日光性着色斑或老年性雀斑样痣。本发明的方法和应用是基于发明人证明的色斑分子标签。

该分子标签的特征在于它由整个列表所述基因或部分列表所述基因构成。

本发明也是关于使用分子标签通过生物学功能缺陷作为一种筛选和预测日光性雀斑样痣的新方法。这种新方法基于对色斑皮肤和相邻未受损皮肤中全部或部分本发明所述基因的表达水平的研究。

本发明同样是关于这些基因作为一种体现受损处皮肤和相邻健康皮肤之间基因表达差异的分子标签，用于日光性雀斑样痣的治疗。该分子标签对确定选择合适的治疗方法以及检测产品(活性成分、分子、天然提取物)效果的构成明显优势，但也是一种对皮肤有益的方法(灯光、注射、口服)。本发明事实上可以用于评估产品或通过调控受损处全部或部分所述基因的表达水平使得它们的表达水平接近于相应的健康皮肤用于治疗日光性雀斑样痣功效的方法。

本发明也是一种筛选日光性雀斑样痣抑制因子或阻止因子的方法。它包括评估化合物抑制或增加所述基因表达和／或表达或所述基因的蛋白产物的活性和筛选能够阻止或治疗日光性雀斑样痣的那些因子。确保化合物的有效性可能通过单独培养模型或共培养模型或三维重建皮肤，或间接体内疗法或体内皮肤。

本发明同样是关于使用化合物对所识别的日光性雀斑样痣生物标志物的表达水平的调控，以预防或改正受损并恢复皮肤的正常状态，即恢复到接近健康未受损皮肤的表达水平。特别地，对所识别的用于阻止或治疗色素性皮肤变色(色素沉着过多或色素脱失)起作用的化合物尚未有相关报道。这种化合物报道见实施例3的表3。

所选的因子具体为对细胞外基质，特别是TGF-β-SMAD信号通路中过表达的蛋白的负调控子，或者是低表达蛋白的正调控子。

和细胞外基质，特别是TGF-β-SMAD信号通路相关的特定负调控子，可以举出的例子包括合成和／或分泌的抑制子和／或在雀斑痣皮肤中过表达的蛋白退化的激活因子。

与之相反，可以举出的正调控子例子为合成兴奋剂、分泌诱导物或在雀斑痣中低表达的蛋白退化的抑制子。

附图说明

图1：该图描述了使用TGF-β重构色素皮肤(RPS)的治疗方案。在该图中，T代表“用TGF-β治疗”，TGF-β的浓度为200皮克／毫升，4毫摩尔HCL和1毫克／毫升的BSA作为溶剂。含2％FBS的MEM3F’作为介质。等量的皮肤连续处理3天。在D0i，等量的皮肤接种角化细胞和黑色素细胞(图片中用K+M表示)并浸种7天。然后浮出水面培养两周；

图2：该图为使用实施例4中所述方案采用对照(2％SVF HCL／BSA)或TGFβ(200皮克／毫升)处理之后重构的色素皮肤的照片。上面两个照片为分离表皮上的多巴反应。下面两个照片为Fontana Masson染色；

图3：该图描述了根据实施例4中所述方案治疗的重构色斑皮肤的光照结果(图A和C)和黑色素定量结果(图B和D)。对照组处理采用2％SVF HCl／BSA处理，TGFB组对应于用浓度为200皮克／毫升的TGF-β处理。上面两个图片和下面两个图片和两个相似且独立的实验相对应。

具体实施方式

实验部分：

实施例1：转录研究

对比研究日光性雀斑样痣(LS)处受损皮肤和相邻的未受损皮肤(US)中的基因表达水平。

该研究的目的在于识别相关的、可再现的和显著的标志物，该标志物能够反应与日光性雀斑样痣形成的有关变化，以利用它们作为有效治疗的靶标或作为分析给定治疗功效的标志物。

简单来说，招募了15名女性志愿者参与了“全基因组”的转录组研究(美国昂飞公司阵列)。对于每个志愿者，经诊断在其手背处患有日光性雀斑样痣类型损伤，并且该日光性雀斑样痣诊断进一步通过表皮发光显微镜确认。该检查是为了：

1)使用真皮表皮连接处的标准(“指纹样结构”)确认受损处(日光性雀斑样痣专有的)以区分雀斑(缺乏指纹样结构，均匀的色素沉淀和虫蛀样边缘区域)和扁平脂漏性角化症(多发性粟丘疹样囊肿或假囊肿，和虫蛀样边缘区域，假囊性开口和指纹样图案)[Menzies et al；Carli et al]；

2)在将要进行皮肤活体组织检查的这些受损处确定结构／图案均匀区；

3)基于使用研发的特定软件(SQA软件，CMLA，ENS Cachan，UMR CNRS8536)对图象定量分析以确定表型。

以受损处为中心取直径为3毫米样本进行活体组织检查，同样的在相邻未受损皮肤区域也取类似面积皮肤用于活体组织检查。这些样品的RNA进行提取和扩增。生成的探针用于美国昂飞阵列中的杂交实验。30个活体组织检查切片会生成基因表达谱(每个志愿者2个活体组织检查切片)，在日光性雀斑样痣(LS)处和相邻的未受损皮肤(US)之间，每个志愿者和全部的志愿者之间进行对比分析。统计学上差异表达的基因(病人的几何平均数)也编译到列表中并按功能家族分类。

令人惊异和难以预料的是，发明人发现了几百种在US和LS之间差异表达的基因。共有约437中基因，其代表日光性雀斑样痣受损的广泛分子标签。437种已识别的基因，和健康皮肤相比，有169种基因显示对日光性雀斑样痣受损处皮肤正调控(上调)，同时有269种基因负调控日光性雀斑样痣(下调)。

这组基因又细分成多个功能性家族。

已识别的功能性家族或生物学过程中，发明人惊奇地发现一种家族的基因在分子水平反应了日光性雀斑样痣处细胞外基质和真皮表皮连接处的功能障碍。这些基因，都归到这种已知的“细胞外基质”功能性家族，其之前从未被报道过和日光性雀斑样痣有关，具体见如下列表和表1和2：

和健康皮肤相比，下述基因在日光性雀斑样痣中过表达：TGFBR2、TGFBI、BMP2、SMAD3、THBS2、TGFBR3、SEMA5A、SMAD7、EFEMP1、ASPN、PAPLN、CHSY1、MXRA5、LYZ、PLAU、TIMP1、FRAS1、LEPREL1、MATN2、DST、ITGA2、COL6A3、CRTAP、LAMC1、LAMB3、LAMA3、ITGAV、ITGB1和ACTN1。

和健康皮肤相比，下述基因在日光性雀斑样痣中低表达：SOSTDC1、ECM1、HS3ST6、FLRT2、CTSL2和PLOD2。

编码真皮成分或涉及与更新或重塑这种连接性基质相关的细胞外基质成分的合成有关的蛋白的基因，以及与编码和真皮表皮连接处和基膜区相关的基质蛋白的基因。该家族也包含了与TGF-β通路相关的，涉及细胞外基质成分合成的基因。该家族的基因基本都在日光性雀斑样痣处过表达。该家族基因全部源于色素失调或在日光性雀斑样痣处的基质中起绝对作用的位点。

表1：在日光性雀斑样痣中过表达的“细胞外基质”家族基因列表

表2：在日光性雀斑样痣低表达的“细胞外基质”家族基因列表

实施例2：材料与方法

选择15个带有表型II-IV，年龄在50至70岁之间的女性志愿者。她们在手背的日光性雀斑样痣尺寸至少为3毫米。它们通过表皮发光显微镜表征。通过表皮发光显微镜表征的各种优势已在实施例1中指明。

两个3毫米直径的活体组织检查取自每个病人的一只手。对于每个志愿者，一个活体组织检查对应日光性雀斑样痣受损处(LS)，而另一个对应其他相邻未受损皮肤(US)(同样由表皮发光显微镜确认)。

3毫米活体组织检查切片取样后即放在RNAlater(Qiagen目录76106)中在4℃放置16至24小时。次日，样品放置在-20℃等待匀浆化和提取步骤。解冻之后，样品用手术刀切碎以利于在转移到溶解缓冲剂之前匀浆化。

匀浆步骤用Potter搅拌器(Fisher Labosi目录A6391000)和不含核糖核酸酶的聚丙烯柱塞(Fisher Labosi目录A1419753)，使得可以在1.5毫升Eppendorf管中直接匀浆化。

用微量RNA提取试剂盒(RNeasy micro kit)(Qiagen目录：74004)根据生产商指示提取RNA。采用Ribogreen实验进行RNA定量分析(分子探针目录R11490)。质量通过安捷伦2100生物分析仪确认，其提供了28S核糖体RNA对18S核糖体RNA强度的比例以及RNA完整指数(RIN)，其把RNA降解考虑在内。高质量RNA的比例应为＞1.5，RIN＞7。

逆转录酶(RT)反应用来获得相应的cDNA。每个样品的两个探针通过扩增步骤由50纳克的RNA合成。cDNA用荧光色素标记，并杂交到芯片中，以显示人类基因组全部基因的表达水平。(包含54000个探针的美国昂飞公司U133A2.0U133A2.0型DNA生物阵列，使得可以研究47000个转录本的表达，其中包括38500特征基因)。美国昂飞公司微阵列套件(Mas5.0)用于获得每个转录本的检测信号。揭示特定的杂交并处理原始数据(提取、减去背景噪音、标准化)之后，比较健康皮肤和受损皮肤之间的基因表达水平。

每个样品中2Affymetrix HG_U133外加2个阵列是杂交的。

杂交的质量通过AffyPLM方法(Bolstad et al.，2005)和PCA(主成分分析)方法确定。

如果2个Affymetrix实验能够确保杂交质量，那么仅病人保留分析剩余物。对于本实验，最初15个人中的13个人可以用于分析。

进行健康皮肤和相应的日光性雀斑样痣皮肤的转录组图谱，意味着可以获得在两种情况下表达水平不同的基因列表并可以识别日光性雀斑样痣的生物标志物。该列表基于LS(受损皮肤)对US(未受损皮肤)之间的表达比例获得。代表13个病人的几何平均数的比例被留下来。

在受损皮肤和健康皮肤之间差异表达的基因列表的产生。

步骤：

-Affymetrix识别器的过滤(探针组)：只保留存在于至少一种活体组织检查切片的两个重复单元的探针组。过滤后，有23968组探针保留。

-降低病人影响：为了降低差别分析结果中观察到的病人影响，每个探针组的表达水平除以与4组实验对应的探针组的4个值的几何平均数。

-差别分析：通过结合两种方法获得的列表而产生，cNMF分析(共识非负矩阵分解算法)(Lee和Seung(1999)；Brunet et al.(2004)，Fogel et al.(2007)，Fogel et al.(2008))，已经识别了2638个探针组(包含1521个被诱导的探针组和1117个被抑制的探针组)和PLS(偏最小二乘回归)法，其已经识别了610个被调控的探针组。结合两个列表生成3248个探针组的列表。

-用于调控的过滤：为了被诱导的基因，选择13修正倍数(CF)≥1.5：562个被诱导的探针组的列表的几何平均值的探针组。对于被抑制的基因，选择13个修正倍数(CF)≤0.67：807个被抑制的探针组的几何平均值的探针组。总计：562+807=1369个被调控的探针组，即1077个探针组去重(1002cNMF途径+5PLS途径)。

-13个病人过滤：以直方图形式使得对1007个探针组的调控可视化，在13个病人中以相同方法筛选被调控的探针组。最终获得受损活体组织检查切片和未受损活体组织检查切片不同的132个探针组的列表，其在本研究的13个病人中以相同方法被调控。

-分析列表中1007个探针组

ο过滤用于P值分析(≤0.00001)

为了保留差别最大的基因，我们采用含1002个探针组的列表过滤用于P值分析，P≤0.00001。这种新的过滤产生827个探针组，其中添加来自PLS的5个探针组，832个探针组列表。

在注释搜索之后，消除未注释的基因和消除重复，确定在LS和US之间区别表达的437种基因的列表。169种基因在AL中过表达，和269种基因低表达。

使用基因分类、PubMed，和Scopus工具，研究基因的功能并把基因分类到功能性家族。

实施例3：调控子：

存在已知的用于调控雀斑痣中的蛋白质失调的化合物。下述可以用作细胞外基质基因／蛋白家族：

-贝特类包括非诺贝特，例如降低SMAD3的表达，

-生物碱包括氧化苦参碱，其降低SMAD3，或多酚，例如能够降低SMAD3和TGFBR2表达的丹酚酸B，

-天然提取物，特别是草药例如温脾汤合五苓散提取物，其能降低SMAD3的表达，

-咪唑家族的化合物，其是TGF-βR1的拮抗物，例如SB-431542，其降低SMAD3的表达，

-某种miRNAs，特别是miR183和miR29b，其降低ITGB1的表达，

-尿激酶类型纤溶酶原激活剂(uPA)的抑制子，例如p-对氨基苯甲脒或B4284-取代苯并[b]噻吩-2-carboxamodine，其降低PLAU活性，

-醋酸苯酯家族的化合物，例如NaPA，其降低PLAU的表达，

-噻唑烷二酮家族的化合物，包括吡格列酮，其降低BMP2和COL6A3的表达，

-噻唑化学家族的化合物，包括例如GW-0742，其降低BMP2的表达，

-四唑家族的化合物，例如缬沙坦，其降低TIMP1的表达，

由于蛋白酶PLOD2是细胞外家族，其在雀斑痣中低表达，下述化合物可能用于恢复它的表达水平：

-喹唑啉家族的化合物，例如凡德他尼(ZD647455)，其增加PLOD2的表达，

其他类型的调控子可能用于修正失调蛋白的表达／数量或活性。例如以下蛋白：

-核酸(优选反义RNA或RNAi)，中和抗体，

-电、光、机械或热的方式。例如，可能使用低强度超声波(LIPUS)以增加或PLOD2的数量或活性。

与之相反，在患有色素脱失斑的情况下，优选的调控子是可以增加下述基因的表达水平或蛋白活性：TGFBR2、TGFBI、BMP2、SMAD3、THBS2、TGFBR3、SEMA5A、SMAD7、EFEMP1、ASPN、PAPLN、CHSY1、MXRA5、LYZ、PLAU、TIMP1、FRAS1、LEPREL1、MATN2、DST、ITGA2、COL6A3、CRTAP、LAMC1、LAMB3、LAMA3、ITGAV、ITGB1和ACTN1，和那些能够降低下述基因的表达水平或蛋白活性：SOSTDC1、ECM1、HS3ST6、FLRT2、CTSL2和PLOD2。

这些调控子的例子已列在表3中。

实施例4：通过TGF-β处理刺激重构色素皮肤的色素沉淀

1)治疗方案。

用TGF-β治疗重构色素皮肤(RPS)的治疗方案见图1。如下所述：

等量的皮肤(格子)在胶原基质中包含活的成纤维细胞，并附着在培养皿底部(D-4)，然后用浓度为200皮克／毫升(溶剂：4毫摩尔HCl和1毫克／毫升的BSA；介质：含2％FBS的MEM3F)的TGF-β1(见图1T)处理3天(见图1D-3；D-2和D-1)。然后，色素表皮通过接种角化细胞和黑色素细胞的方式重构在等量的皮肤上(D0)。培养基浸渍1周，然后浮出水面培养2周(图1)。

分离样本以分析色素沉淀：

-分离表皮进行多巴反应之后可以观察到黑色素细胞的整合和形态；

-检测比色亮度可以提供样品清楚程度的信息(L*越低，样品越暗)；

-在Fontana Masson对皮肤切片染色之后，可以观察到黑色素；和

-通过图象分析可以测量表皮黑色素含量。

2)结果：

表明在用200皮克／毫升的TGF-β1处理后和对照组比较的结果(图2和3)：

-黑色素细胞存在于表皮中并保留校正后的树突形态；

-黑色素沉积物在表皮更高；

-样品的亮度降低(处理后再生的色斑皮肤变棕)；

-观察Fontana Masson染色的皮肤切片发现黑色素含量明显增加，并用图象分析对黑色素具体定量。

实验再次进行并确证所得结果(图3)。

结果表明：和未激活信号通路相比，激活TGF-β信号通路导致了皮肤色素沉淀的增多。

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Claims

1.一种体外评估对皮肤色斑治疗功效的方法，其包括：对比代表皮肤的细胞模型中与细胞外基质相关的至少一种真皮基因在治疗前后的表达水平，所述真皮基因选自由下述基因构成的列表：TGFBR2、TGFBI、BMP2、SMAD3、THBS2、TGFBR3、SEMA5A、SMAD7和SOSTDC1，或实际上选自由下述基因构成的列表：FRAS1、LEPREL1、MATN2、DST、PLOD2、ITGA2、COL6A3、CRTAP、LAMC1、LAMB3、LAMA3、ITGAV和ACTN1，或实际上所述所选基因的表达水平或表达产物的活性，

其中所述细胞模型是重构的皮肤三维模型。

2.调控至少一种选自下述列表的真皮基因的表达水平和表达产物活性的调控子在制备治疗非病理性皮肤色斑的化妆品组合物中的应用，所述基因选自由下述基因构成的列表：TGFBR2、TGFBI、BMP2、SMAD3、THBS2、TGFBR3、SEMA5A、SMAD7和SOSTDC1，或选自由下述基因构成的列表：FRAS1、LEPREL1、MATN2、DST、PLOD2、ITGA2、COL6A3、CRTAP、LAMC1、LAMB3、LAMA3、ITGAV和ACTN1，所述调控子可改变所选基因的表达水平或表达产物的活性。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述调控子为脱矿质骨粉(DBP)、吡格列酮、GW0742、鸡冠花黄酮类化合物、非诺贝特、氧化苦参碱、丹酚酸B、SB-431542，温脾汤合五苓散提取物、粉防己碱或N-乙酰基-丝氨酰-天门冬酰-赖氨酰-脯氨酸(Ac-SDKP)、维生素K2甲基萘醌类、β-氨基丙腈(bAPN)和凡德他尼(ZD6474 5)，或这些调控子中至少两种的组合。

4.调控至少一种选自下述列表的真皮基因的表达水平和表达产物活性的调控子在制备用于治疗皮肤色斑的组合物中的应用，所述基因选自由下述基因构成的列表：TGFBR2、TGFBI、BMP2、SMAD3、THBS2、TGFBR3、SEMA5A、SMAD7和SOSTDC1，或选自由下述基因构成的列表：FRAS1、LEPREL1、MATN2、DST、PLOD2、ITGA2、COL6A3、CRTAP、LAMC1、LAMB3、LAMA3、ITGAV和ACTN1，所述调控子可改变所选基因的表达水平或表达产物的活性。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述调控子选自脱矿质骨粉(DBP)、吡格列酮、GW0742、鸡冠花黄酮类化合物、非诺贝特、氧化苦参碱、丹酚酸B、SB-431542，温脾汤合五苓散提取物、粉防己碱、N-乙酰基-丝氨酰-天门冬酰-赖氨酰-脯氨酸(Ac-SDKP)、维生素K2甲基萘醌类、β-氨基丙腈(bAPN)和凡德他尼(ZD6474 5)。

6.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述色斑是色素沉着过多斑，并且如果所述基因选自TGFBR2、TGFBI、BMP2、SMAD3、THBS2、TGFBR3、SEMA5A、SMAD7、FRAS1、LEPREL1、MATN2、DST、ITGA2、COL6A3、CRTAP、LAMC1、LAMB3、LAMA3、ITGAV和ACTN1，则所述调控为抑制所述基因的表达水平或活性；和，如果所述基因选自SOSTDC1和PLOD2，则所述调控为增加所述基因的表达水平或活性。

7.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述色斑是日光性雀斑样痣，并且如果所述基因选自TGFBR2、TGFBI、BMP2、SMAD3、THBS2、TGFBR3、SEMA5A、SMAD7、FRAS1、LEPREL1、MATN2、DST、ITGA2、COL6A3、CRTAP、LAMC1、LAMB3、LAMA3、ITGAV和ACTN1，则所述调控为抑制所述基因的表达水平或活性；和，如果所述基因选自SOSTDC1和PLOD2，则所述调控为增加所述基因的表达水平或活性。

8.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述色斑是老年性雀斑样痣，并且如果所述基因选自TGFBR2、TGFBI、BMP2、SMAD3、THBS2、TGFBR3、SEMA5A、SMAD7、FRAS1、LEPREL1、MATN2、DST、ITGA2、COL6A3、CRTAP、LAMC1、LAMB3、LAMA3、ITGAV和ACTN1，则所述调控为抑制所述基因的表达水平或活性；和，如果所述基因选自SOSTDC1和PLOD2，则所述调控为增加所述基因的表达水平或活性。

9.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述色斑是日光性着色斑，并且如果所述基因选自TGFBR2、TGFBI、BMP2、SMAD3、THBS2、TGFBR3、SEMA5A、SMAD7、FRAS1、LEPREL1、MATN2、DST、ITGA2、COL6A3、CRTAP、LAMC1、LAMB3、LAMA3、ITGAV和ACTN1，则所述调控为抑制所述基因的表达水平或活性；和，如果所述基因选自SOSTDC1和PLOD2，则所述调控为增加所述基因的表达水平或活性。