KR102072783B1 - 세포외 매트릭스와 연관되는, 피부 색소 반점의 분자 지표 - Google Patents

세포외 매트릭스와 연관되는, 피부 색소 반점의 분자 지표 Download PDF

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Abstract

본 발명은 유전자 TGFBR2, TGFBI, BMP2, SMAD3, THBS2, TGFBR3, SEMA5A, SMAD7, SOSTDC1, FRAS1, LEPREL1, MATN2, DST, PLOD2, ITGA2, COL6A3, CRTAP, LAMC1, LAMB3, LAMA3, ITGAV, ITGB1 및 ACTN1을 포함하는 피부 색소 반점의 분자 지표에 관한 것이며, 이러한 지표의 다양한 적용에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 인간에게서 알려지거나 의심되는 색소 반점을 특징화하는 방법에 관한 것으로서, 상기 반점에서 획득한 피부 샘플 및 인접한 비손상 피부에서 획득한 피부 샘플에서, 유전자 TGFBR2, TGFBI, BMP2, SMAD3, THBS2, TGFBR3, SEMA5A, SMAD7, SOSTDC1, FRAS1, LEPREL1, MATN2, DST, PLOD2, ITGA2, COL6A3, CRTAP, LAMC1, LAMB3, LAMA3, ITGAV, ITGB1 및 ACTN1로 구성되는 리스트에서 선택되는 세포외 매트릭스에 연관된 하나 이상의 진피 유전자의 발현 수준을 비교하는 단계를 포함한다. 또한, 본 발명은 색소 반점 처치의 효능을 평가하는 방법, 색소 반점을 처치하기 위한 화장학적 및 치료학적 방법, 및 상기 유전자에 대한 다양한 조정인자들, 및 이들의 사용방법에 관한 것이다.

Description

세포외 매트릭스와 연관되는, 피부 색소 반점의 분자 지표{MOLECULAR SIGNATURE OF CUTANEOUS PIGMENTARY SPOTS, ASSOCIATED WITH THE EXTRACELLULAR MATRIX}
본 발명은 화장품 분야에 관련되며, 피부에 관한 것이다. 보다 일반적으로, 본 발명은 피부상의 색소 반점의 특징화의 범위 내에 있으며, 상기 반점의 치료에 관한 것이다.
피부색은 표피에서 색소 멜라닌의 존재에 주로 기인한다. 멜라닌은 표피의 기저층에 위치하는 특이적 수지상세포, 즉 멜라노사이트에 의해 합성된다. 멜라닌형성은, 멜라닌으로 적재될 때 수지상조직을 통해 이웃하는 표피세포인 케라티노사이트로 이동되는 세포소기관인 멜라노좀에서 발생한다. 피부색 또는 구성 색소침착은 멜라닌의 화학적 성질 뿐만 아니라 생성된 멜라닌의 양이 각각 상이하다. 멜라닌은 티로신으로부터 형성된 거대분자(유멜라닌)이거나, 또는 티로신 및 시스테인으로부터 형성된 거대분자(페오멜라닌)이다. 합성 메카니즘에는 효소로서 주로 티로시나아제 및 티로시나아제-연관 단백질(Tyrp-1)이 이용된다. 피부의 색소침착은 태양에 대한 노출, 즉 태닝의 현상에 의해 자연적으로 자극된다.
그러나, 색소침착의 과정이 변형되어 색소침착 결함인 저색소침착(백반증, 백색증)이 유발되거나 또는 그 반대로 색소침착 과잉인 과다색소침착이 유발될 수 있는 상황이 존재한다. 양성 과다색소침착 장애는 멜라닌의 비정상적인 축적(태닝과는 구별됨)을 특징으로 가지며, 여기서 언급될 수 있는 것에는 화학선 흑색점, 흑피증, 여드름-연관 색소침착, 염증후 색소침착, 라임병, 옻중독 관련 색소침착 또는 양성 안면 색소이상이 포함된다.
화학선 흑색점은 노인성 또는 일광성 흑색점, 검버섯, 노인반점, 또는 "노인성 주근깨"라고도 알려져 있으며, 이는 가장 빈번하게 발생하는 색소 병변이다. 이러한 유형의 병변은 광노출된 피부의 부위에서 나타나며, 예컨대 얼굴, 손등, 상지, 특히 팔뚝의 등쪽, 등, 특히 등의 상부에서 나타난다. 이는 일반적으로 40세 이상의 개체에게 영향을 미친다.
육안적으로, 화학선 흑색점은 양성의 진한 갈색에서 연한 갈색을 띠는 착색 반점에 의해 나타나며; 이는 뚜렷하지만 불규칙적인 가장자리를 갖는다. 이는 크기가 매우 다양하며, 몇 밀리미터부터 2 센티미터 이상까지일 수 있다.
이의 높은 빈도수에도 불구하고, 화학선 흑색점의 생리학 및 발병론에 대해서는 소수의 연구만이 개시되었다. 희박하게 존재하는 조직학적 연구들에 기초하여, 전체 표피의 멜라닌 적재에서, 특히 기저층에서 증가된 것으로 알려져 있다. 또한, 유두 진피에서 곤봉 모양의 외관을 나타낼 수 있는 표피 능선(epidermal ridge)의 신장이 존재한다[Montagna 1980, ber Rahman 1996, Andersen 1997, Cario-Andre 2004]. 마지막으로, 인접하는 능선 사이에서 문합이 발생하여 가교 또는 망상 외관을 생성할 수 있다.
또한, 멜라닌 및 멜라노파지의 존재에서 색소 실금(pigmentary incontinence)이 진피에 존재할 수 있다.
최근의 처치법:
양성 피부 색소 장애는 일반적으로 보기에 안 좋은 것으로 여겨진다.
화학선 흑색점의 출현과 태양에 대한 만성 노출 사이에 입증된 연관성 때문에, 화학선 흑색점의 출현을 방지하는 것에는 일반적으로 자외선차단제와 같은 광보호 물질의 국부 적용이 포함된다. "치유" 처치의 경우, 화학선 흑색점을 제거하거나 이의 존재를 감소시키기 위하여 많은 과정들, 주로 화장 목적의 과정들이 개발되었다. 이러한 문제의 존재를 제거하거나 감소시키는 것은 통상적으로 멜라노사이트의 멜라닌 합성 활성을 감소시키는 것에 기초한 탈색소 처치에 근거한다. 탈색소 분자는 멜라닌형성의 하나 이상의 단계들을 방해한다. 오늘날 사용되는 주된 경로들 중 하나는 멜라닌형성 과정에서 주요한 효소들 중 하나인 티로시나아제를 억제하는 것에 근거한다. 이들 처치는 색소의 합성을 감소시키거나 심지어 중단시키는 것을 목적으로 한다.
주로 알려져 있는 탈색소 물질들은 히드로퀴논 및 이의 유도체, 코지산, 아르부틴, 이미노페놀, 아스코르브산 및 이의 유도체, 카르니틴 및 퀴논의 조합, 아미노페놀 유도체, 벤조티아졸 유도체, 천연 추출물, 코르티코이드 등이다. 또한, 박리를 증가시키고 이에 따라 각질층에 존재하는 멜라닌을 보다 쉽게 제거하기 위하여 엑스폴리안츠는 활성성분들과 자주 연합된다.
또다른 비화장품적 처치 방법은 레이저 또는 필링을 이용한 물리적 또는 화학적 수단에 의해 병변을 파괴하는 단계로 구성된다. 그러나, 이는 장애의 원인을 다루지 않는 비교적 직설적인 과정들이다. 다수의 경우, 화학선 흑색점은 치료 후 단시간 내에 재출현한다.
더욱이, 기존의 처치법은 중대한 단점을 갖고 있다. 탈색소 물질은 통상적으로 특정 양의 불안정성, 저농도에서의 저효율성, 다른 기능들에 영향을 미치는 생물학적 활성, 독소 성질 또는 알레르기 성질을 수반한다.
또한, 이는 색소침착 탈조절의 근본을 이루는 원인을 표적으로 하지 않기 때문에, 다양한 탈색소 처치법들에 대한 반응은 매우 상이하다. 따라서, (예를 들어, 국부 방식으로) 투여되는 특정 처치법에 대해, 화학선 흑색점 또는 흑피증과 같은 특정의 양성 피부 색소침착 문제점이 약화되거나 사라질 수 있는 반면, 다른 문제점은 전혀 변하지 않는다. 이러한 가변성은 다른 개체의 병변들 사이에서 관찰될 수 있으며, 또한 같은 개체의 다른 병변들에 대해서도 관찰될 수 있다. 따라서, 양성 피부 색소침착 문제점은 현재의 어떠한 국부 처치법도 유효하지 않은 상태로 남아 있다.
이에 따라, 이러한 유형의 병변에 대해 더 효과적이면서 덜 해로운 처치법을 개발할 필요성이 존재한다.
이를 위해, 새로운 표적을 식별할 수 있도록, 그리고 상기 결함들을 보정할 수 있는 활성성분을 선택할 수 있도록, 상기 유형의 색소 장애에 존재할 수 있는 분자적 탈조절 및 기능이상을 확인하는 것이 필요하다.
색소 반점, 특히 화학선 흑색점의 처치에 관한 선행기술에는, 멜라노사이트 및 멜라닌형성과 밀접하게 연관되는 분자(멜라닌형성 효소, 멜라노좀 단백질, 멜라닌형성에서 주요한 파라크린 인자)의 게놈 또는 단백질 수준에서의 자극에 대해 개시되어 있다. 표피 또는 진피에서 하기의 단백질들이 발견된다: 티로시나아제, TRP1, DCT, Pmel-17, POMC, ET1, ETBR, SCF, c-KIT, KGF, KGFR, 간세포 성장인자(HGF), MIA, TRPM1, melan-A, 핑크 아이 딜루션(pink eye dilution), P53 및 IL1α.
또한, 다른 연구들에서는, 유전자 또는 단백질의 발현 분석에 의한 일과성 또는 노인성 흑색점의 분자적 또는 세포적 변형에 대해 개시하고 있다. 그러나, 이와 같이 다양한 연구들에서도, 색소 반점의 출현의 기저를 이루는 메카니즘 또는 일반적 기능이상에 대해서는 어떠한 것도 논의되고 있지 않다.
선행기술의 어떠한 문헌에서도, 멜라노사이트 및 멜라닌형성과 밀접하게 연관되는 분자를 넘어서 상기 유형의 색소 장애에 존재할 수 있는 분자적 탈조절 또는 기능이상을 신뢰성있게 나타내지 않고 있다.
본 발명자들은, 피부상에 색소 반점을 유발하는 색소 탈조절(deregulation)에서 진피표피 접합부와 세포외 매트릭스에 관련되는 진피 유전자의 관여, 특히 TGF-베타 - SMAD 신호 경로와 관련되는 유전자의 관여를 처음으로 입증하였다.
세포외 매트릭스는 피부에서 구조적인 역할을 수행하는데, 그 이유는 조직과 세포에 대한 지지 및 응집을 제공하는 그의 능력 때문이고, 그의 기계적 성질 때문이며, 이는 (특히, 콜라겐의 존재에 기인한) 장력과 (특히, 프로테오글리칸의 존재에 기인한) 압축에 저항할 수 있다는 것을 의미한다.
이는 또한 표피 및 진피 항상성의 조절에 있어서 주된 주역이기 때문에, 중요한 생물학적 역할을 수행한다. 특히 이의 성장인자 및 사이토킨 저장소 성질에 기인하여, 형태형성, 증식, 세포 분화 및 조직 회복에 관여한다.
진피표피 접합부(DEJ: dermoepidermal junction) 그 자체는 세포외 매트릭스 층으로 구성되고 표피를 진피로부터 분리하는 기저막에 의해 생성된다. 이는 투과 장벽을 구성하며, 2개의 조직 사이에서 분자, 특히 영양소의 교환을 조절한다. 이는 아래에 있는 매트릭스에 대한 표피의 부착 및 고정의 기능을 수행하고, 상피의 구조적 응집의 기능을 수행한다. 또한, 이는 분화의 조절 및 표피세포의 이동에 있어서 뿐만 아니라 표피의 형태형성 단계에 있어서 중요한 역할을 수행한다.
형질전환 성장인자 베타(TGF-β)는 대부분의 세포에서 증식, 세포 분화 및 기타 기능들을 조절한다. 이는 면역 및 암에 있어서 역할을 수행한다.
일부 세포들은 TGF-β를 분비하며, 또한 TGF-β에 대한 수용체이다. SMAD는 TGF-β에 대해 신호 경로를 구성한다. 이는 TGF-β가 막 수용체에 결합할 때 신호 변환을 가능하게 한다. 상기 경로에 의해 유도되는 세포 반응들은 세포의 측면에 따라 특정 세포 유형에 대해 달라질 수 있다. 이는 고도의 동적인 신호 시스템이다.
정규 경로에서, TGF-β는 두번째 제I형 수용체와 바이다이머 복합체(bidimeric complex)를 형성하는 제II형 막 수용체에 결합한다. 제III형 수용체(베타글리칸)는 TGF-β를 포획하고 이를 바이다이머 수용체 복합체에 표출함으로써 상기 결합 과정을 보조한다. TGF-β에 결합되는 제II형 수용체는 제I형 수용체를 인산화시키고, 이는 순차적으로 세포질 단백질, 즉 SMAD 패밀리(SMAD 2 및 3)를 인산화시킴으로써 신호를 전파한다. 그 후, 제I형 수용체를 통해 조절되는 SMAD 패밀리(R-SMAD)는 공통의 SMAD인 SMAD 4에 결합하여, 활성화된 복합체를 형성한다. 이어서, 상기 복합체는 세포 핵에 진입하여, 복수의 유전자들을 위한 전사인자로서 작용하고 활성화 또는 억제 반응을 유발한다.
다양한 BMP(골형성단백질)와 같이 다른 리간드에 의해 활성화되는 특이적 제I형 수용체는 다른 SMAD(1, 5, 8)를 통해 신호 경로를 활성화시킨다.
일반적으로, 경로의 활성화는 또한 SMAD 6 및 7과 같은 SMAD의 억제를 자극시키고, 이는 네거티브 역-조절(negative retro-control)을 제공한다.
TGF-β 경로의 표적 유전자들 중에는, 주로 구조적 역할을 하는 콜라겐, 엘라스틴, 피브로넥틴, 트롬보스폰딘을 포함하는 세포외 매트릭스의 분자를 코딩하고, 이와 함께 매트릭스의 분자의 갱신 및 분해에 참여하는 매트릭스 재구축 단백질을 코딩하는, 다수의 유전자들이 있다.
또한, 상기 경로는 진피 세포에 의한 다수의 성장인자 및 사이토킨의 생성에 있어서 자극 또는 억제 작용을 갖는다.
본 발명자들에 의해, 세포외 매트릭스에 연관되거나 진피표피 접합부에 연관되는 특정 유전자들, 특히 TGF-β-SMAD 신호 경로에 연관되는 특정 유전자들이 건강한 피부와 색소 반점에서 획득한 피부 사이에서 유의적으로 다른 전사 수준을 갖는다는 점이 처음으로 입증되었으며, 이에 따라 세포외 매트릭스 및 진피표피 접합부 내의 탈조절, 특히 TGF-β-SMAD 신호의 탈조절과 (특히 색소 반점의 출현을 유도하는) 색소침착의 조정(modulation) 사이의 연관성이 증명되었다.
TGF-β 또는 BMP에 의존적으로 상기 다양한 경로에 관여하는 특정 단백질을 증가시키거나 감소시키는 것은, 진피, 접합부의 항상성을 교란시킬 수 있는 신호의 이상 및/또는 신호의 증가를 야기할 수 있으며, 표피상에서 연쇄 반응을 나타낼 수 있는 것으로 고려될 수 있다.
특정 이론에 얽매이기를 원하지 않으면서, 상기 세포외 매트릭스에 연관되고 진피표피 접합부에 연관되는 다양한 유전자의 발현의 변형은, 본 발명자들로 하여금, 매트릭스 및 진피표피 접합부의 단백질에 의해 수행되는 역할 때문에, 전체 진피 구획의 변형을 나타내는 징후인 상기 유전자의 탈조절이 표피의 항상성을 교란시키고 (특히, 색소 반점에서 표피의 조직학적 구축에 있어서) 실질적인 변형을 생성한다(예를 들어, 진피에서 표피의 능선의 신장)는 점을 믿을 수 있도록 하였다. 그 결과, 표피의 멜라닌 적재는 증가되고, 이는 색소 반점들을 발생시킨다.
본 발명은 색소 반점에서 획득한 피부와 인접한 건강한 피부 사이에 존재하는 유전자 발현의 차이를 나타내는 분자 지표에 관한 것이며, 본 발명은 특히 색소 반점의 화장학적 처치에 있어서 피부의 색소침착을 조정하거나, 또는 안색을 안정화시키거나, 또는 피부의 색을 균질화시키기 위하여, 상기 분자 지표의 지식을 활용한 다양한 적용들과 방법들에 관한 것이다. 상기 지표는 다음과 같은 유전자들로 구성된다: TGFBR2(transforming growth factor beta receptor 2: 형질전환 성장인자 베타 수용체 2 [70/80kDa]), TGFBI(transforming growth factor beta induced: 형질전환 성장인자 베타 유도체, 68kDa), BMP2(bone morphogenic protein 2: 골형성단백질 2), SMAD3(SMAD family member 3: SMAD 패밀리 멤버 3), THBS2(thrombospondin 2: 트롬보스폰딘 2), TGFBR3(transforming growth factor beta receptor III: 형질전환 성장인자 베타 수용체 III), SEMA5A(sema domain, 7 thrombospondin repeats, semaphorin 5A: 세마 도메인, 7 트롬보스폰딘 반복체, 세마포린 5A), SMAD7(SMAD family member 7: SMAD 패밀리 멤버 7), SOSTDC1(sclerostin domain-containing protein 1: 스클레로스틴 도메인-함유 단백질 1), FRAS1(Fraser syndrome 1: 프레이저 증후군 1), LEPREL1(leprecan-like 1: 레프레칸-형 1), MATN2(matrilin 2: 마트릴린 2), DST(dystonin: 디스토닌, 이는 또한 BPAG1이라고 알려짐), PLOD2(procollagen-lysine, 2-oxoglutarate 5-dioxygenase 2: 프로콜라겐-리신, 2-옥소글루타레이트 5-디옥시게나아제 2), ITGA2(integrin alpha 2: 인테그린 알파 2(CD49B, VLA-2 수용체의 서브유닛 알파 2)), COL6A3(collagen type 6, alpha 3: 콜라겐 제6형, 알파 3), CRTAP(cartilage associated protein: 연골 연관 단백질, 이는 또한 LEPREL3이라고 알려짐), LAMC1(laminin gamma 1: 라미닌 감마 1, 이전에는 LAMB2), LAMB3(laminin beta 3: 라미닌 베타 3), LAMA3(laminin alpha 3: 라미닌 알파 3), ITGAV(integrin alpha V: 인테그린 알파 V(비트로넥틴 수용체)), ITGB1(integrin beta 1: 인테그린 베타 1) 및 ACTN1(actinin alpha 1: 액티닌 알파 1). ITGB1 유전자는 상기 리스트에서 제외될 수 있다. SEMA5A 유전자 및/또는 ITGB1 유전자는 상기 리스트에서 제외될 수 있다.
상기 유전자는 하기와 같이 기능적으로 그룹지워질 수 있다:
- 리스트 A: TGF-베타 - SMAD 신호 경로의 활성화에 관여하는 인자들을 코딩하는 유전자: TGFBR2, TGFBI, BMP2, SMAD3, THBS2, TGFBR3, SEMA5A, SMAD7 및 SOSTDC1, 다만 유전자 SEMA5A는 선택적으로 리스트 A에서 제외될 수 있음; 및
- 리스트 B: 유전자 FRAS1, LEPREL1, MATN2, DST, PLOD2, ITGA2, COL6A3, CRTAP, LAMC1, LAMB3, LAMA3, ITGAV, ITGB1 및 ACTN1을 포함함. 유전자 ITGB1은 선택적으로 리스트 B에서 제외될 수 있음. 리스트 B에서, 하기의 기능적 그룹이 분별될 수 있다:
- 세포외 매트릭스의 성분인 콜라겐, 특히 스트로마의 사상(filamentous) 콜라겐, 생합성 및 콜라겐 어셈블리와 연관되는 분자들을 코딩하는 유전자: LEPREL1, PLOD2, COL6A3 및 CRTAP;
- 세포외 매트릭스의 접착 단백질인 라미닌을 코딩하는 유전자: LAMC1, LAMB3 및 LAMA3;
- 기저막 영역과 연관되는 매트릭스 단백질을 코딩하는 유전자: FRAS1, MATN2 및 DST;
- 세포외 매트릭스에 대한 세포의 결합에 관여하는 인테그린을 코딩하는 유전자: ITGA2 및 ITGAV, 선택적으로 ITGB1; 및
- 세포외 매트릭스의 성분인 액틴을 코딩하는 유전자: ACTN1.
리스트 A를 구성하는 진피 유전자 TGFBR2, TGFBI, BMP2, SMAD3, THBS2, TGFBR3, SEMA5A, SMAD7 및 SOSTDC1에서 바람직한 유전자는 유전자 TGFBR2, TGFBI, BMP2, SMAD3, THBS2 및 TGFBR3이다.
리스트 B를 구성하는 진피 유전자 FRAS1, LEPREL1, MATN2, DST, PLOD2, ITGA2, COL6A3, CRTAP, LAMC1, LAMB3, LAMA3, ITGAV, ITGB1 및 ACTN1에서 바람직한 유전자는 유전자 FRAS1, LEPREL1, MATN2, DST, PLOD2 및 ITGA2이다.
"상기 유전자"는 여기서 언급되는 인간 유전자들을 의미한다.
또한, 유전자 리스트 A 및 B는 상기 리스트를 구성하는 다양한 유전자들 사이에 알려진 상호작용들의 수에 의해 연관된다. 특히, 이러한 연관성은 예를 들어 IPA(Ingenuity pathway analysis) 소프트웨어를 이용하여 생성될 때 상호작용의 네트워크에 의해 입증될 수 있으며, 이는 서지적 데이터로부터 출발하여 유전자들 또는 단백질들 사이에 존재하는 다양한 직접적 또는 간접적 연관성을 보여주는데 사용될 수 있다. 실제로, 상기 IPA 소프트웨어에 의해 생성되는 상호작용 네트워크는 유전자 및/또는 단백질 TGFBR2, TGFBR3, SMAD3, SMAD7, BMP2, THBS2(리스트 A) 및 MATN2, DST, ITGA2, COL6A3, LAMC1, LAMB3, ITGAV, ITGB1, ACTN1(리스트 B) 사이에서 직접적 또는 간접적 연관성을 입증하였다.
또한, 다양한 서지 문헌들은 리스트 A에서 언급되는 유전자와 리스트 B에서 언급되는 유전자 사이에서, 특히 일례로서 유전자 SMAD3 및 COL6A3 사이에서(Verrecchia et al, 2001), 유전자 TGFBR2, THBS2 및 COL6A3 사이에서(Berking et al, 2001), SMAD3 및 LAMC1 사이에서(Kawata et al, 2002), 직접적인 상호작용들을 나타내며, 이에 따라 상기 2개의 패밀리를 통합시키는 기능적 연관성에 대한 신빙성을 제공해준다.
실제로, 본 발명자들은 색소 반점에서 획득한 피부와 이에 상응하는 건강한 피부 사이에서 리스트 A 및 B의 유전자의 발현 수준의 유의적이고 재현가능한 조정(modulation)을 입증하였다.
또한, 과다색소 반점 내에서 TGF-β 신호 경로에 관여하는 리스트 A의 유전자를 조정하는 것은 TGF-β - SMAD 신호를 증가시키는 경향이 있다. 따라서, 본 발명의 실시예 4에서 본 발명자들이 입증한 바와 같이, 리스트 A의 유전자에 대해 관찰되는 조정들은 TGF-β-SMAD 신호 경로의 활성화/자극과 색소침착의 증가 사이의 연관성을 증명한다.
제1측면에서, 본 발명은 특히 피부 색소 반점을 특징화하는 방법에 관한 것이다. 특히, 이러한 방법은 색소 반점이 이미 출현한 경우, 예를 들어 육안에 의해 시각적으로 보이는 경우, 색소 반점의 성질을 확인하는데 사용될 수 있다. 또한, 상기 방법은 반점이 아직 관찰되지는 않고 단지 의심되는 경우에 반점의 출현을 예측하는데 사용될 수 있으며, 또는 인간의 피부가 피부 반점을 형성하는 성향을 갖는다거나, 예를 들어 어떠한 반점도 아직 발견되지 않을 때 색소침착 결핍증의 경향이 있다고 결론을 내리는데 사용될 수 있다.
관련되는 피부 색소 반점은 색소의 과잉에 상응하는 과다색소침착된 반점 또는 과다색소 반점, 또는 색소침착 결핍에 상응하는 과소색소침착된 반점 또는 저색소 반점이다. 본 발명의 측면에서 고려될 수 있는 특정 저색소침착은 백반증 및 백색증이다. 멜라닌의 이상 축적(태닝과는 구별됨)을 특징으로 하는, 본 발명의 측면에서 고려될 수 있는 양성 과다색소침착 장애의 예는, 화학선 흑색점, 흑피증, 여드름-연관 색소침착, 염증후 색소침착, 라임병, 옻중독(poison ivy) 관련 색소침착 또는 양성 안면 색소이상이다. 본 발명에서 "색소 반점"에는 또한 안색을 불균등하게 만들거나 피부색을 비균질하게 만드는 색소침착의 결함, 불완전 또는 불규칙이 포함된다.
문제되는 색소 반점은 바람직하게는 인간 피부상의 색소 반점이다. 그러나, 본 발명자들에 의해 입증된 진피에서의 세포외 매트릭스 및 TGF-β-SMAD 신호 경로의 장애는 전적으로 일반적인 것이므로, 유사한 방법들이 색소 반점에 의해 고통받는 다른 동물 종들에 대해서도 고려될 수 있다. 이 경우, 본 발명의 다양한 방법, 용도 또는 조성물은 본 발명의 인간 유전자와 이종상동적인 방식으로, 문제되는 종들의 유전자와 함께 이용될 것이다.
상기 방법은 유전자 TGFBR2, TGFBI, BMP2, SMAD3, THBS2, TGFBR3, SEMA5A, SMAD7, SOSTDC1, FRAS1, LEPREL1, MATN2, DST, PLOD2, ITGA2, COL6A3, CRTAP, LAMC1, LAMB3, LAMA3, ITGAV, ITGB1 및 ACTN1로 구성되는 리스트에서 선택되는 세포외 매트릭스에 연관되는 하나 이상의 진피 유전자의 발현 수준을, 상기 반점에서 획득한 피부와 손상되지 않은 피부(바람직하게는, 동일한 개체에서 반점에 인접한 비손상 피부)에서 비교하는 단계를 포함한다. 선택적으로, 상기 진피 유전자는 TGF-β-SMAD 신호 경로와 연관된 유전자로 구성된 리스트 A로부터 선택되거나; 또는 유전자 FRAS1, LEPREL1, MATN2, DST, PLOD2, ITGA2, COL6A3, CRTAP, LAMC1, LAMB3, LAMA3, ITGAV 및 ACTN1로 구성된 리스트 B로부터 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, SEMA5A는 상기 리스트에서 제외된다. 선택적으로 또는 부가적으로, 이는 유전자 ITGB1에 대해 마찬가지일 수 있다.
유전자 TGFBR2, TGFBI, BMP2, SMAD3, THBS2, TGFBR3, SEMA5A, SMAD7, SOSTDC1, FRAS1, LEPREL1, MATN2, DST, PLOD2, ITGA2, COL6A3, CRTAP, LAMC1, LAMB3, LAMA3, ITGAV, ITGB1 및 ACTN1은 본 발명의 유전자들이다. 이는 세포외 매트릭스의 구조 또는 갱신에 있어서 역할을 수행하며; 특히, 이는 TGF-β-SMAD 신호 경로의 활성화에 관여하는 유전자이거나, 세포외 매트릭스의 성분을 코딩하는 유전자이거나, 상기 매트릭스의 성분의 합성에 관여하거나 또는 사실상 상기 결합 매트릭스의 갱신에 연관되는 단백질을 코딩하는 유전자이거나, 진피표피 접합부 및 기저막 영역에 연관되는 매트릭스 단백질을 코딩하는 유전자이다. 본 발명의 유전자와 세포외 매트릭스 사이의 연관성은 상기 언급된 역할들 중 하나에 관련된다.
또한, "본 발명의 유전자"라는 용어는 리스트 A의 진피 유전자, 또는 사실상 또한 리스트 B의 진피 유전자를 의미한다.
유전자 SEMA5A 및/또는 유전자 ITGB1은 상기 리스트에서 제외될 수 있다.
또한, 본 발명의 상기 유전자는 진피(dermal) 유전자로서 알려져 있는데, 그 이유는 이들이 주로 진피에서 발현되는 유전자이고, 진피면과 관련하여 진피표피 접합부의 또는 진피 구획의 특징적 단백질을 발생시키기 때문이며; 이것은 예를 들어 케라티노사이트 단백질, 세포내 단백질, 또는 특히 표피(epidermal) 단백질, 예컨대 각질층에서 우선적으로 발현되는 단백질과는 대조적이다.
본 발명의 하나 이상의 유전자의 발현 수준은 의심되거나 알려진 반점에서 획득한 피부와 인접한 비손상 피부에서 측정된다. 바람직하게는, 상기 발현 수준은 반점에서 제거한 피부의 샘플과 인접한 비손상 영역에서 제거한 피부의 샘플에서 측정된다. 상기 샘플은 예를 들어 피부 생검이다. 직경이 수 밀리미터인 생검으로 충분하며, 2mm 또는 3mm 직경 생검을 예로 들 수 있다. 병변의 완전한 절제가 또한 고려될 수 있다.
본 발명의 유전자의 "발현 수준"이라는 용어는 피부 진피의 세포 또는 연구되는 샘플의 세포 내에서 발현의 정도를 의미한다.
바람직하게는, 상기 비손상 영역은, 반점과 가능한한 밀접하게 있지만, 색소 반점에 속할 수 있는 어떠한 세포도 함유하지 않는 영역 또는 샘플을 위해 충분한 거리에 있는, 인접 영역이다. 바람직하게는, 상기 인접한 비손상 영역은 색소 반점 영역과 비교될 수 있는 방식으로 빛과 태양에 노출되어온 영역이다. 선택적으로, 상기 비손상 영역은 동일한 위치에서 대상체의 반대쪽의 대칭 영역으로부터 유래된 것일 수 있으며; 일례로서, 왼쪽 손 위의 반점의 경우, 비손상 영역은 오른쪽 손 위에서 상응하는 영역일 수 있다. 이 경우, 상기 비손상 영역은 엄격하게 인접한 영역을 일컫는 것은 아니다. "비손상"이라는 용어는 임의의 색소 반점 또는 색소 불규칙성을 갖지 않는 영역, 바람직하게는 색소침착의 측면에서 균질한 영역을 의미한다.
비손상 영역은 참조로서 작용하기 때문에, 모든 경우에 있어서 반점의 영역과 가능한한 비교될 수 있어야 하되, 색소 결함은 없어야 한다.
본 명세서에서 사용되는 "유전자의 발현 수준"이라는 용어는 바람직하게는 상기 유전자의 전사의 정도를 의미한다. 그러나, 이의 발현 수준은 번역의 정도를 의미하는 것으로서 옮겨질 수도 있으며, 이는 단백질을 코딩하는 유전자를 상정한 경우이다. 이것은 본 발명의 유전자에 대한 경우이다.
선택된 유전자의 전사의 정도를 평가하는 것과 관련하여, 이는 통상의 기술자에게 친숙한 다양한 방식들로, 직접적이거나 또는 사실상 역전사 후에, 수행될 수 있다. 전사의 전도는 특히 상기 목적을 위해 상업적으로 이용가능한 RNA 또는 DNA 어레이를 이용함으로써 평가될 수 있다. 가능한 평가 방법 중 하나는 실시예 섹션에 기재되어 있다.
본 발명의 방법이 본 발명의 하나 이상의 유전자의 발현 수준, 또는 리스트 A 또는 리스트 B의 하나 이상의 유전자의 발현 수준을 비교하는 것을 포함한다는 점이 또한 숙지되어야 한다. 이러한 이유로 인해, 발현 수준 각각을 개별적으로 평가하고 정량하지 않으면서도, 2개의 발현 수준 사이의 차이점을 정량적으로 또는 정성적으로 평가하는 것이 충분할 수 있다.
본 발명의 하나 이상의 유전자의 발현 수준은, 반점과 선택된 비손상 피부 영역에서 발현 수준이 실질적으로 동일한 것으로 추정되는 다른 유전자의 발현 수준으로 정규화시킨 후에, 또는 이러한 다른 유전자의 발현 수준을 참조하여 평가될 수 있다. 정규화를 위한 상기 유전자는 통상의 기술자에게 잘 알려져 있으며, 반점이 위치하는 신체의 영역에 의존할 수 있다. 일례로서, 하기를 코딩하는 유전자들은 본 발명의 유전자의 발현 수준을 정규화시키기 위한 사용에 민감한 것으로서 인용될 수 있다:
리보좀 단백질 L13a(Ribosomal protein L13a: RPL13A), 베타-2-마이크로글로불린(beta-2-microglobulin: B2M), 리보좀 단백질 S9(ribosomal protein S9: RPS9), 리보좀 단백질 S28(ribosomal protein S28: RPS28) 및 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나아제(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase: GAPDH).
본 발명의 방법은 바람직하게는 시험관내에서 수행되거나, 또는 사실상 생체외에서 수행된다.
본 발명의 방법의 일구현예에서, 색소 반점은 특히 병리학적 병변과는 달리 양성인 비-병리학적 반점, 예컨대 모반(nevi)이며; 이는 피부의 색소침착의 불규칙성일 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 방법은 본 발명의 유전자들로부터 선택된 둘 이상의 개별 유전자, 바람직하게는 셋 이상의 개별 유전자, 또는 다섯 이상의 개별 유전자의 발현 수준을 비교하는 단계를 포함한다. 또한, 본 발명의 유전자들 중 6개 이상의 유전자, 또는 8개 이상의 개별 유전자, 또는 10개, 12개, 15개, 20개, 또는 심지어 모든 유전자들의 발현 수준을 비교하는 것도 가능하다.
일구현예에서, 상기 개별 유전자는 유전자 TGFBR2, TGFBI, BMP2, SMAD3, THBS2, TGFBR3, SEMA5A, SMAD7 및 SOSTDC1로부터, 또는 사실상 TGFBR2, TGFBI, BMP2, SMAD3, THBS2, TGFBR3, SMAD7 및 SOSTDC1로부터 선택된다.
2개의 유전자가 선택되는 경우, 바람직하게는 6개의 바람직한 유전자로 구성된 다음의 리스트에서 선택된다: TGFBR2, TGFBI, BMP2, SMAD3, THBS2 및 TGFBR3. 일례로서, 선택되는 유전자는 TGFBR2 및 TGFBI, 또는 TGFBR2 및 BMP2, 또는 TGFBI 및 BMP2, 또는 TGFBR2 및 TGFBR3일 수 있다. 상기 6개의 바람직한 유전자의 임의의 짝지어진 조합들은 본 발명을 수행하기 위한 바람직한 조합이다. 마찬가지로, 상기 6개의 바람직한 유전자 중 하나와 리스트 A의 다른 유전자들 중 하나를 포함하는 임의의 조합이 특히 바람직하다.
3개의 유전자의 조합에 대해 다음과 같은 조합들이 고려된다: TGFBR2, TGFBI 및 BMP2; TGFBR2, TGFBI 및 SMAD3; TGFBR2, TGFBI 및 TGFBR3; SMAD3, SEMA5A 및 SMAD7; TGFBR2, BMP2 및 SOSTDC1; 및 TGFBI, BMP2 및 SMAD3.
본 발명의 5개의 유전자의 조합에 대해 다음과 같은 조합들이 고려된다: TGFBR2, TGFBI, BMP2, SMAD3 및 THBS2; TGFBR2, TGFBI, BMP2, SMAD3 및 TGFBR3; 및 TGFBR2, TGFBI, BMP2, THBS2 및 TGFBR3.
특정 조합은 유전자 TGFBR2, TGFBI, BMP2, SMAD3, THBS2, TGFBR3, SEMA5A 및 SMAD7을 포함하는 것이며, 이러한 유전자들은 동일한 방식으로 조정된다는 사실(특히, 과다색소 반점에서 과발현됨) 및 TGF-베타 - SMAD 신호 경로에 관여한다는 사실을 공통적으로 갖는다. 다른 조합들이 본 발명의 측면에서 또한 고려될 수 있으며, 특히 TGFBR2, TGFBI, THBS2 및 TGFBR3으로부터 선택된 하나 이상의 유전자; 및 SMAD3, SEMA5A 및 SMAD7로부터 선택된 하나 이상의 유전자를 포함하는 조합들이 고려될 수 있다.
유전자 TGFBR2, TGFBI, BMP2, SMAD3, THBS2, TGFBR3, SEMA5A, SMAD7 및 SOSTDC1은 TGF-β - SMAD 신호 경로에 속하고 색소 반점에서 협력 방식으로 조정된다는 사실을 공통적으로 가진다. 즉, 상기 신호 경로에 퍼지티브하게 관여하는 유전자 TGFBR2, TGFBI, BMP2, SMAD3, THBS2, TGFBR3, SEMA5A 및 SMAD7은 모두 동일한 센스에서 조정되며, 이들은 유전자 SOSTDC1(이는 BMP 안타고니스트이므로, 상기 신호 경로에 네거티브하게 관여함)에 대해 역 센스에서 조정된다.
또다른 구현예에서, 개별 유전자는 리스트 B의 유전자에서 선택되거나, 또는 다음과 같은 6개의 바람직한 유전자에서 선택된다: FRAS1, LEPREL1, MATN2, DST, PLOD2 및 ITGA2. 일례로서, 선택되는 유전자는 FRAS1 및 LEPREL1, 또는 사실상 FRAS1 및 MATN2, 또는 사실상 LEPREL 및 MATN2, 또는 사실상 DST 및 PLOD2일 수 있다. 6개의 바람직한 유전자 FRAS1, LEPREL1, MATN2, DST, PLOD2 및 ITGA2의 임의의 짝지어진 조합들은 본 발명을 수행하기 위한 바람직한 조합이다. 마찬가지로, 상기 6개의 바람직한 유전자 중 하나와 리스트 B의 다른 유전자들 중 하나를 포함하는 임의의 조합이 특히 바람직하다.
3개의 유전자의 조합에 대해 다음과 같은 조합들이 고려된다: FRAS1, LEPREL1 및 MATN2; FRAS1, LEPREL1 및 DST; FRAS1, LEPREL1 및 PLOD2; FRAS1, MATN2, 및 PLOD2; LEPREL1, MATN2 및 PLOD2.
5개의 유전자의 조합에 대해 본 발명에서 다음과 같은 조합들이 고려된다: FRAS1, LEPREL1, MATN2, DST 및 PLOD2; FRAS1, LEPREL1, MATN2, DST 및 ITGA2; FRAS1, LEPREL1, MATN2, PLOD2 및 ITGA2.
특정 조합은 유전자 FRAS1, LEPREL1, MATN2, DST, ITGA2, COL6A3, CRTAP, LAMC1, LAMB3, LAMA3, ITGAV 및 ACTN1로 구성되는 것이며, 이러한 유전자들은 동일한 방식으로 조정된다는 사실(특히, 과다색소 반점에서 과발현됨)을 공통적으로 갖는다.
다른 조합들이 본 발명의 측면에서 또한 고려될 수 있으며, 특히 콜라겐 패밀리에 속하는 유전자들, 즉 LEPREL1, PLOD2, COL6A3 및 CRTAP로부터 선택된 하나 이상의 유전자; 라미닌 패밀리에 속하는 유전자들, 즉 LAMC1, LAMB3 및 LAMA3으로부터 선택된 하나 이상의 유전자; 기저막 영역과 연관되는 매트릭스 단백질을 코딩하는 유전자들, 즉 FRAS1, MATN2 및 DST로부터 선택된 하나 이상의 유전자; 인테그린 패밀리에 속하는 유전자들, 즉 ITGA2 및 ITGAV, 선택적으로 ITGB1로부터 선택된 하나 이상의 유전자; 및 유전자 ACTN1을 포함하는 조합들이 고려될 수 있다.
선택적으로, 본 발명의 바람직한 구현예에서, 손상된 피부와 건강한 피부(바람직하게는, 인접한 피부) 사이에서 발현 수준이 비교되는 유전자는 유전자 LEPREL1, PLOD2, COL6A3 및 CRTAP로 구성된 하위그룹으로부터 선택된다. 실제로, 이러한 유전자는 콜라겐 패밀리에 속한다는 사실, 특히 스트로마 콜라겐 피브릴 패밀리에 속한다는 사실을 공통적으로 갖는다.
다른 조합들이 본 발명의 측면에서 고려될 수 있으며, 특히 FRAS1, LEPREL1, MATN2, DST, ITGA2, COL6A3, CRTAP, LAMC1, LAMB3, LAMA3, ITGAV 및 ACTN1로부터 선택된 하나 이상의 유전자; 및 유전자 PLOD2를 포함하는 조합들이 고려될 수 있다.
본 발명의 또다른 구현예에 따르면, 다른 조합들, 특히 TGF-베타 - SMAD 신호 경로에 관여하는 유전자들, 즉 리스트 A로부터 선택된 하나 이상의 유전자, 및 리스트 B로부터 선택된 하나 이상의 유전자, 바람직하게는 FRAS1, LEPREL1, MATN2, DST, PLOD2 및 ITGA2로부터 선택된 하나 이상의 유전자를 포함하는 조합들이 고려된다. 일례로서, 고려되는 하나의 조합은 과다색소 반점에서 과발현되는 사실을 공통적으로 갖는 TGFBR2, TGFBI, BMP2, SMAD3, THBS2, TGFBR3, SEMA5A, SMAD7, FRAS1, LEPREL1, MATN2, DST, ITGA2, COL6A3, CRTAP, LAMC1, LAMB3, LAMA3, ITGAV 및 ACTN1 중에서 둘 이상의 유전자로 구성되는 것이다.
다른 특정 조합들은 2개 유전자의 조합(여기서, 하나는 리스트 A에서 선택된 것이고, 다른 하나는 리스트 B에서 선택된 것임), 3개 유전자의 조합(여기서, 2개는 리스트 A에서 선택되고 1개는 리스트 B에서 선택된 것이거나, 또는 그 반대임), 4개 유전자의 조합(여기서, 2개는 리스트 각각에서 선택된 것이거나, 또는 사실상 3개는 리스트 A에서 선택되고 1개는 리스트 B에서 선택된 것이거나, 또는 그 반대임)이다.
2개의 유전자의 특히 바람직한 조합은 유전자 TGFBR2 및 MATN2의 조합이다. 3개의 유전자의 특히 바람직한 조합은 TGFBR2, BMP2 및 MATN2의 조합과 TGFBR2, MATN2 및 LEPREL1의 조합이다. 4개의 유전자의 바람직한 특정 조합은 TGFBR2, BMP2, SMAD3 및 MATN2의 조합; TGFBR2, MATN2, LEPREL1 및 PLOD2의 조합; 및 TGFBR2, BMP2, MATN2 및 LEPREL1의 조합이다.
본 발명의 상기 측면과 관련하여 바람직한 특정 유전자들의 모든 조합들과 하위그룹들은 또한 본 발명의 다른 측면들에 대해 바람직하다.
본 발명의 방법이 수행될 때, 하기의 경우에는 의심되거나 관찰되는 반점이 과다색소 반점이라는 결론이 도출된다:
- 유전자가 TGFBR2, TGFBI, BMP2, SMAD3, THBS2, TGFBR3, SEMA5A, SMAD7, FRAS1, LEPREL1, MATN2, DST, ITGA2, COL6A3, CRTAP, LAMC1, LAMB3, LAMA3, ITGAV, ITGB1 및 ACTN1로부터 선택된다면, 인접한 비손상 피부의 발현 수준 또는 인접한 비손상 피부의 샘플의 발현 수준과 비교하여, 반점에서 획득한 피부의 발현 수준 또는 반점에서 획득한 피부 샘플의 발현 수준이 더 높은 경우; 및
- 유전자가 SOSTDC1 및 PLOD2로부터 선택된다면, 인접한 비손상 피부의 발현 수준 또는 인접한 비손상 피부의 샘플의 발현 수준과 비교하여, 반점에서 획득한 피부의 발현 수준 또는 반점에서 획득한 피부 샘플의 발현 수준이 더 낮은 경우.
실제로, 본 발명자들은 인접한 비손상 피부의 발현 수준에 비해, 과다색소 반점, 특히 화학선 흑색점에서 획득한 피부에서 유전자 TGFBR2, TGFBI, BMP2, SMAD3, THBS2, TGFBR3, SEMA5A, SMAD7, FRAS1, LEPREL1, MATN2, DST, ITGA2, COL6A3, CRTAP, LAMC1, LAMB3, LAMA3, ITGAV, ITGB1 및 ACTN1의 과-발현을 입증하였다. 또한, 본 발명자들은 인접한 비손상 피부의 발현 수준에 비해, 과다색소 반점, 특히 화학선 흑색점에서 획득한 피부에서 유전자 SOSTDC1 및 PLOD2의 저발현을 입증하였다.
반면, 본 발명의 방법이 수행될 때, 하기의 경우에는 의심되거나 관찰되는 반점이 저색소 반점이라는 결론이 도출된다:
- 유전자가 TGFBR2, TGFBI, BMP2, SMAD3, THBS2, TGFBR3, SEMA5A, SMAD7, FRAS1, LEPREL1, MATN2, DST, ITGA2, COL6A3, CRTAP, LAMC1, LAMB3, LAMA3, ITGAV, ITGB1 및 ACTN1로부터 선택된다면, 인접한 비손상 피부의 발현 수준 또는 인접한 비손상 피부의 샘플의 발현 수준과 비교하여, 반점에서 획득한 피부의 발현 수준 또는 반점에서 획득한 피부 샘플의 발현 수준이 더 낮은 경우; 및
- 유전자가 SOSTDC1 및 PLOD2로부터 선택된다면, 인접한 비손상 피부의 발현 수준 또는 인접한 비손상 피부의 샘플의 발현 수준과 비교하여, 반점에서 획득한 피부의 발현 수준 또는 반점에서 획득한 피부 샘플의 발현 수준이 더 높은 경우.
"더 높은" 또는 "더 낮은"이라는 용어들은 발현 수준의 차이가 통계상 유의적이고, 백그라운드 노이즈보다 더 크고, 재현가능하다는 것을 의미한다. 일례로서, 상기 발현 수준의 차이가 적어도 10%인 경우, 즉 비손상 피부에서 본 발명의 유전자의 발현 수준이 1로 고정된다면, 병변 피부에서 과발현되는 유전자에 대해 조정의 정도는 1.1 이상이고, 병변 피부에서 저발현되는 유전자에 대해 조정의 정도는 0.9 이하이다.
바람직하게는, 본 발명의 방법은 둘 이상의 유전자와 함께 수행되며, 여기서 하나는 과다색소 반점에서 과발현되고 저색소 반점에서 저발현되는 유전자의 카테고리에 속하는 것이며, 다른 하나는 색소 반점에서 첫번째 유전자에 대해 역 방식으로 조정되는 유전자의 카테고리에 속하는 것이다. 바람직하게는, 상기 방법은 셋 이상의 유전자와 함께 수행되는데, 여기서 2개의 유전자는 TGFBR2, TGFBI, BMP2, SMAD3, THBS2, TGFBR3, SEMA5A, SMAD7, FRAS1, LEPREL1, MATN2, DST, ITGA2, COL6A3, CRTAP, LAMC1, LAMB3, LAMA3, ITGAV, ITGB1 및 ACTN1로부터 선택되고, 색소 반점에서 상기 2개의 유전자에 대해 역 방식으로 조정되는 1개의 유전자는 SOSTDC1 및 PLOD2로부터 선택되거나; 또는 사실상 2개의 유전자는 TGFBR2, TGFBI, BMP2, SMAD3, THBS2, TGFBR3, SEMA5A 및 SMAD7로부터 선택되고, 1개의 유전자는 SOSTDC1이거나; 또는 사실상 2개의 유전자는 FRAS1, LEPREL1, MATN2, DST, ITGA2, COL6A3, CRTAP, LAMC1, LAMB3, LAMA3, ITGAV, ITGB1 및 ACTN1로부터 선택되고, 1개의 유전자는 PLOD2로서 색소 반점에 있어서 상기 2개의 유전자에 대해 역 방식으로 조정되는 것이다.
바람직하게는, 상기 특징화 방법의 측면에서, 본 발명의 유전자들 중 하나의 발현 수준은 코카서스 인종 개체의 피부에서 비교된다. 바람직하게는, 상기 개체의 연령은 40세 이상, 바람직하게는 50세 이상, 또는 심지어 60세 이상이다. 본 발명의 측면에서 고려되는 개체는 바람직하게는 암컷이다. 전술한 바와 같이, 본 발명의 하나 이상의 유전자의 발현 수준은 상기 개체의 피부 샘플 내에서 비교될 수 있다.
또한, 본 발명자들은 색소 반점에서 획득한 피부와 비손상 피부(바람직하게는, 인접한 피부) 사이에서 다른 진피 유전자들의 차등 조정을 또한 입증하였다. 특히, 본 발명자들은 세포외 매트릭스에 연관되는 하기의 진피 유전자의 조정을 입증하였다:
- 세포외 프로테오글리칸 및 당단백질의 패밀리의 단백질을 코딩하는 유전자 EFEMP1, ECM1, ASPN, HS3ST6, PAPLN, CHSY1 및 FLRT2;
- 매트릭스 재구축에 연관되는 단백질을 코딩하는 유전자 MXRA5, LYZ, CTSL2, PLAU 및 TIMP1.
그 결과, 본 발명에 따른 특징화 방법은 또한 유전자 TGFBR2, TGFBI, BMP2, SMAD3, THBS2, TGFBR3, SEMA5A, SMAD7, SOSTDC1, FRAS1, LEPREL1, MATN2, DST, PLOD2, ITGA2, COL6A3, CRTAP, LAMC1, LAMB3, LAMA3, ITGAV, ITGB1 및 ACTN1로 구성되는 리스트에서 선택된 하나 이상의 진피 유전자, 및 유전자 EFEMP1, ECM1, ASPN, HS3ST6, PAPLN, CHSY1, FLRT2, MXRA5, LYZ, CTSL2, PLAU 및 TIMP1의 리스트에서 선택된 하나 이상의 제2유전자에 대해, 상기 반점에서 획득한 피부의 발현 수준과 비손상 피부(바람직하게는, 인접한 피부)의 발현 수준을 비교하는 단계를 포함하며; 상기 제2유전자는 예를 들어 유전자 EFEMP1, ECM1, ASPN, HS3ST6, PAPLN, CHSY1, FLRT2의 리스트에서 선택되거나, 또는 사실상 유전자 MXRA5, LYZ, CTSL2, PLAU 및 TIMP1의 리스트에서 선택된다.
진피 유전자 EFEMP1, ECM1, ASPN, HS3ST6, PAPLN, CHSY1, FLRT2의 리스트 중에서 바람직한 유전자는 유전자 EFEMP1, ECM1, ASPN, HS3ST6, PAPLN 및 CHSY1이며; MXRA5, LYZ, CTSL2, PLAU 및 TIMP1이 또한 바람직한 유전자이다.
바람직하게는, 상기 제2유전자는 유전자 EFEMP1, ECM1, ASPN, HS3ST6, PAPLN, CHSY1 및 FLRT2로부터 선택되고, 바람직하게는 유전자 EFEMP1, ECM1, ASPN, HS3ST6, PAPLN 및 CHSY1로부터 선택된다. 선택적으로, 상기 제2유전자는 유전자 MXRA5, LYZ, CTSL2, PLAU 및 TIMP1로부터 선택된다.
또다른 구현예에서, 제1유전자는 TGF-β-SMAD　신호 경로에 관여하는 진피 유전자의 리스트 A에서 선택되고; 제2유전자는 상기에서와 같이 선택된다. 또다른 구현예에 따르면, 제1유전자는 리스트 B에서 선택되고; 제2유전자는 상기에서와 같이 선택된다.
특정 일구현예에서, 상기 방법은 셋 이상의 개별 유전자의 발현 수준을 비교하는 단계를 포함하며, 여기서 제1유전자는 유전자 TGFBR2, TGFBI, BMP2, SMAD3, THBS2, TGFBR3, SEMA5A, SMAD7 및 SOSTDC1에서 선택되고, 제2유전자는 유전자 EFEMP1, ECM1, ASPN, HS3ST6, PAPLN, CHSY1 및 FLRT2에서 선택되고, 제3유전자는 유전자 MXRA5, LYZ, CTSL2, PLAU 및 TIMP1에서 선택된다. 선택적으로, 3개의 개별 유전자가 선택되는 경우, 제1유전자는 리스트 B의 유전자에서 선택되고, 제2유전자 및 제3유전자는 전술한 바와 같이 선택될 수 있다. 또다른 구현예에 따르면, 제1유전자는 TGFBR2, TGFBI, BMP2, SMAD3, THBS2, TGFBR3, SEMA5A, SMAD7, SOSTDC1, FRAS1, LEPREL1, MATN2, DST, PLOD2, ITGA2, COL6A3, CRTAP, LAMC1, LAMB3, LAMA3, ITGAV, ITGB1 및 ACTN1을 포함하는 유전자의 리스트에서 선택되며; 다만, SEMA5A는 제외될 수 있다.
또다른 구현예에 따르면, 상기 방법은 넷 이상의 개별 유전자의 발현 수준을 비교하는 단계를 포함하며, 제1유전자 내지 제3유전자는 전술한 바와 같이 선택되고, 제4유전자는 FRAS1, LEPREL1, MATN2, DST, PLOD2, ITGA2, COL6A3, CRTAP, LAMC1, LAMB3, LAMA3, ITGAV, ITGB1 및 ACTN1로 구성되는 리스트에서 선택된다.
전술한 유전자의 모든 조합들은 본 발명의 다른 측면에서 또한 바람직한 조합들이다.
하나 이상의 추가 유전자가 유전자 EFEMP1, ECM1, ASPN, HS3ST6, PAPLN, CHSY1, FLRT2, MXRA5, LYZ, CTSL2, PLAU 및 TIMP1에서 선택된다면, 특징화 방법은 하기의 경우에 과다색소 반점의 존재를 확인하는 결과를 제시할 수 있다:
- 유전자가 EFEMP1, ASPN, PAPLN, CHSY1, MXRA5, LYZ, PLAU 및 TIMP1로부터 선택된다면, 인접한 비손상 피부의 발현 수준 또는 인접한 비손상 피부의 샘플의 발현 수준과 비교하여, 반점에서 획득한 피부의 발현 수준 또는 반점에서 획득한 피부 샘플의 발현 수준이 더 높은 경우; 및
- 유전자가 HS3ST6, FLRT2, ECM1 및 CTSL2로부터 선택된다면, 인접한 비손상 피부의 발현 수준 또는 인접한 비손상 피부의 샘플의 발현 수준과 비교하여, 반점에서 획득한 피부의 발현 수준 또는 반점에서 획득한 피부 샘플의 발현 수준이 더 낮은 경우.
반면, 본 발명의 방법은 하기의 경우에 저색소 반점의 존재를 확인시켜줄 수 있다:
- 유전자가 EFEMP1, ASPN, PAPLN, CHSY1, MXRA5, LYZ, PLAU 및 TIMP1로부터 선택된다면, 인접한 비손상 피부의 발현 수준 또는 인접한 비손상 피부의 샘플의 발현 수준과 비교하여, 반점에서 획득한 피부의 발현 수준 또는 반점에서 획득한 피부 샘플의 발현 수준이 더 낮은 경우; 및
- 유전자가 HS3ST6, FLRT2, ECM1 및 CTSL2로부터 선택된다면, 인접한 비손상 피부의 발현 수준 또는 인접한 비손상 피부의 샘플의 발현 수준과 비교하여, 반점에서 획득한 피부의 발현 수준 또는 반점에서 획득한 피부 샘플의 발현 수준이 더 높은 경우.
본 발명의 방법은 또한 대상체에서 피부 반점의 형성을 예측하기 위한 시험 방법이다. 본 구현예에서, 본 발명의 하나 이상의, 바람직하게는 수개의 유전자의 발현 수준은 피부 샘플에서 정상 피부의 발현 수준과 비교된다. 정상 피부와 비교되는 발현 수준에 대한 유의적인 개질은, 시험 대상체의 피부가 피부 반점을 형성하는 성향을 갖는다는 것을 의미한다.
"정상 피부"라는 용어는 반점이 없는 것으로 알려진 신체의 영역, 예를 들어 태양에 노출되지 않는 영역, 또는 색소 반점을 형성하는 경향이 낮은 영역에서 특정 대상체의 피부를 의미할 수 있다. 이는 또한 반점이 없는, 바람직하게는 시험 대상체와 동일한 유형의 피부를 갖는, 인간의 피부에서 상기 유전자의 평균 발현 수준을 의미할 수도 있다. 전술한 정규화 유전자들은 본 발명의 유전자의 발현 수준을 정규화시키는데 사용될 수 있다.
제2측면에서, 본 발명은 또한 본 발명자들이 입증한 지표를 사용하여 반점 또는 색소 불규칙성의 처치 효능을 평가하기 위한 방법에 관한 것이다. 상기 평가되는 처치는, 색소 반점 또는 임의의 다른 색소침착 조정을 감쇠시키거나, 특히 안색을 안정화시키거나, 또는 피부의 색을 균질화시키거나, 또는 색소이상을 방지하기 위한 목적의 처치일 수 있다. 첫번째 구현예에서, 상기 평가 방법은 본 발명의 유전자, 즉 TGFBR2, TGFBI, BMP2, SMAD3, THBS2, TGFBR3, SEMA5A, SMAD7, SOSTDC1, FRAS1, LEPREL1, MATN2, DST, PLOD2, ITGA2, COL6A3, CRTAP, LAMC1, LAMB3, LAMA3, ITGAV, ITGB1 및 ACTN1에서 선택되는 하나 이상의 진피 유전자의 색소 반점에서 획득한 피부에서의 발현 수준을 처치 전과 후에 비교하는 단계를 포함한다.
일구현예에서, 상기 유전자는 TGFBR2, TGFBI, BMP2, SMAD3, THBS2, TGFBR3, SEMA5A, SMAD7 및 SOSTDC1에서 선택되거나, 또는 사실상 TGFBR2, TGFBI, BMP2, SMAD3, THBS2, TGFBR3, SMAD7 및 SOSTDC1에서 선택된다. 또다른 구현예에 따르면, 상기 유전자는 FRAS1, LEPREL1, MATN2, DST, PLOD2, ITGA2, COL6A3, CRTAP, LAMC1, LAMB3, LAMA3, ITGAV, ITGB1 및 ACTN1에서 선택된다. SEMA5A 및/또는 ITGB1은 상기 리스트에서 제외될 수 있다.
상기 평가 방법에 있어서, 선택된 유전자 또는 유전자들의 발현 수준은 처치 전과 후에 색소 반점에서 획득한 피부에서 또는 이에 상응하는 샘플에서 비교된다. 따라서, 건강한 비손상 피부의 발현 수준과의 비교는 없다.
본 발명의 제1측면에 따른 특징화 방법에 대한 경우와 같이, 발현 수준은 유리하게는 리보좀 단백질 L13a(RPL13A), 베타-2-마이크로글로불린(B2M), 리보좀 단백질 S9(RPS9), 리보좀 단백질 S28(RPS28) 및 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나아제(GAPDH)를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 이용하여 정규화된다.
전술한 평가 방법을 이용할 때, 특정 처치는 하기의 경우에 과다색소 반점의 처치에 효과적인 것으로 고려된다:
- 유전자가 TGFBR2, TGFBI, BMP2, SMAD3, THBS2, TGFBR3, SEMA5A, SMAD7, FRAS1, LEPREL1, MATN2, DST, ITGA2, COL6A3, CRTAP, LAMC1, LAMB3, LAMA3, ITGAV, ITGB1 및 ACTN1로부터 선택된다면, 처치 이전의 발현 수준과 비교하여 처치 이후의 발현 수준이 더 낮은 경우; 및
- 유전자가 SOSTDC1 및 PLOD2로부터 선택된다면, 처치 이전의 발현 수준과 비교하여 처치 이후의 발현 수준이 더 높은 경우.
반면, 본 발명의 평가 방법을 이용할 때, 특정 처치는 하기의 경우에 저색소 반점의 처치에 효과적인 것으로 고려된다:
- 유전자가 TGFBR2, TGFBI, BMP2, SMAD3, THBS2, TGFBR3, SEMA5A, SMAD7, FRAS1, LEPREL1, MATN2, DST, ITGA2, COL6A3, CRTAP, LAMC1, LAMB3, LAMA3, ITGAV, ITGB1 및 ACTN1로부터 선택된다면, 처치 이전의 발현 수준과 비교하여 처치 이후의 발현 수준이 더 높은 경우; 및
- 유전자가 SOSTDC1 및 PLOD2로부터 선택된다면, 처치 이전의 발현 수준과 비교하여 처치 이후의 발현 수준이 더 낮은 경우.
처치 전과 후에 선택된 유전자의 발현 수준이 실질적으로 동일하다면, 또는 사실상 관찰되는 차이가 유의적이지 않다면, 처치는 효과가 없는 것으로 고려될 것이다.
1개보다 많은 유전자의 발현 수준이 비교될 경우, 시험되는 유전자들의 다수에 대해, 바람직하게는 개별적으로 선택된 시험되는 유전자들 모두에 대해, 처치법이 효과적인 것으로 여겨진다면, 처치법은 반점 또는 색소 불규칙성을 처치하는데 효과적인 것으로 고려된다. 다른 선택된 유전자들에 대해, 처치법은 바람직하게는 효과가 없어야 하지만, 역효과를 가져서는 안 된다.
또다른 구현예에 따르면, 피부 색소 반점의 처치 효능을 평가하기 위한 방법은, 처치 전과 후에 본 발명의 방법을 이용하여 색소 반점 또는 불규칙성을 특징화시키는 단계, 및 색소 반점 또는 불규칙성의 손상 피부와 건강한 피부 사이에서 관찰되는 발현 수준의 차이를 비교하는 단계를 포함한다.
처치 효능을 평가하는 상기 구현예에 따르면, 건강한 피부(바람직하게는, 인접한 피부)와 비교하여 반점에서 획득한 손상 피부에서 선택된 유전자 또는 유전자들의 발현 수준 사이의 차이가 처치 이전에 비해 처치 이후에 더 적다면, 그 처치는 효과적인 것으로 고려된다.
1개보다 많은 유전자의 발현 수준이 비교될 경우, 개별적으로 다루어지는 선택된 유전자들의 다수에 대해, 바람직하게는 선택된 유전자들 모두에 대해, 처치가 효과적이라는 결론이 내려진다면, 그 처치는 바람직하게는 효과적인 것으로 고려된다.
바람직하게는, 선택된 유전자 또는 유전자들의 발현 수준의 비교는 색소 반점에서 제거된 피부의 샘플에서 수행된다.
본 발명의 방법을 이용하여 평가되는 처치로서 고려될 수 있는 것은 하나의 특정 유형의 처치에 한정되지 않는다. 이는 화학 분자, 활성성분, 천연 추출물, 특히 정유, 핵산, 특히 간섭 RNA, 단백질 복합체 또는 임의의 다른 분자 또는 분자들의 조합을 이용하는 처치일 수 있다. 이는 또한 물리적 수단 또는 파장, 특히 전자파를 이용하는 처치일 수 있다. 이는 바람직하게는 국부 처치이지만, 경구 투여되거나, 주사 투여되거나, 또는 임의의 다른 투여 수단에 의해 투여되는 처치의 효능을 평가하는 것도 포함할 수 있다.
시험되는 처치는 피부 반점을 감쇠(attenuate)시키거나, 피부 반점을 소실시키거나, 피부 색소침착을 조정하거나, 안색을 안정화시키거나, 피부의 색을 균질화시키거나, 또는 색소이상을 감쇠시키기 위한 것일 수 있다.
본 발명의 측면에서 특히 바람직한 처치는 화장학적 처치이고, 더욱 특히 국부 화장학적 처치이다. 이 경우, 고려되는 색소 반점은 비-병리학적 색소 반점 또는 불규칙성, 예를 들어 화학선, 일광성 또는 노인성 흑색점이다.
본 발명의 방법을 이용하여, 여러 처치들의 조합의 효능을 평가하는 것도 역시 가능하다. 실제로, 리스트 A에서 선택되는지 또는 리스트 B에서 선택되는지와 무관하게, 본 발명의 유전자들 중 하나, 일부 또는 전부의 발현 수준을 비손상 피부에서 발현되는 것처럼 회복시키는데 있어서 최선의 조합을 평가하는 것이 가능하다.
전술한 평가 방법을 이용하여, 새롭게 고려되는 처치의 효능을 평가할 수 있거나, 또는 색소 반점이 과다색소침착인지 저색소침착인지와 무관하게 그에 대한 현존하는 처치의 효능을 정량화 또는 정성화할 수도 있다. 이러한 방법에 의해, 특히 효율적이거나, 시너지 효과를 나타내거나, 또는 상보적일 수 있는 처치들의 조합을 고려하는 것도 가능하다.
본 발명의 제1측면에 따른 특징화 방법에서 설명된 바와 같이, 바람직하게는 1개보다 많은 유전자의 발현 수준이 비교되며, 바람직하게는 본 발명의 유전자들 또는 리스트 A의 유전자들 또는 리스트 B의 유전자들 중에서 적어도 2, 3, 5, 6, 8, 10, 12, 15, 18 개 또는 전부의 발현 수준이 비교된다.
특히 바람직한 유전자 또는 유전자들의 조합은 본 발명의 제1측면과 관련하여 이미 기재되었으며, 동일한 유전자 또는 조합이 본 측면에서 바람직하다. 특히, 선택되는 유전자는 유전자 TGFBR2, TGFBI, BMP2, SMAD3, THBS2, TGFBR3, SEMA5A, SMAD7 및 SOSTDC1에서 선택된 것이며, 유전자 TGFBR2, TGFBI, BMP2, SMAD3, THBS2 및 TGFBR3에서 선택되는 것이 가장 바람직하며, 상기 리스트에서 임의의 2×2 또는 3×3 조합들이 특히 바람직하다. 또다른 구현예에 따르면, 상기 유전자는 리스트 B의 유전자에서 선택되며, 특히 유전자 FRAS1, LEPREL1, MATN2, DST, PLOD2 및 ITGA2의 리스트에서 선택되며, 상기 리스트에서 임의의 2×2 또는 3×3 조합들이 특히 바람직하다.
또한, 발현 수준이 색소 반점에서 조정되는 다른 진피 유전자들과 관련하여 본 발명자들에 의해 획득된 상보적 결과들 때문에, 전술한 평가 방법은 바람직하게는 하기를 이용하여 수행된다:
- 유전자 TGFBR2, TGFBI, BMP2, SMAD3, THBS2, TGFBR3, SEMA5A, SMAD7, SOSTDC1, FRAS1, LEPREL1, MATN2, DST, PLOD2, ITGA2, COL6A3, CRTAP, LAMC1, LAMB3, LAMA3, ITGAV, ITGB1 및 ACTN1에서, 더 바람직하게는 리스트 A의 유전자에서, 또는 유전자 TGFBR2, TGFBI, BMP2, SMAD3, THBS2 및 TGFBR3에서, 또는 리스트 B의 유전자에서, 또는 유전자 FRAS1, LEPREL1, MATN2, DST, PLOD2 및 ITGA2에서, 선택된 하나 이상의 유전자; 및
- 유전자 EFEMP1, ECM1, ASPN, HS3ST6, PAPLN, CHSY1, FLRT2, MXRA5, LYZ, CTSL2, PLAU 및 TIMP1에서 선택된 하나 이상의 제2유전자. 선택적으로, 제2유전자는 유전자 EFEMP1, ECM1, ASPN, HS3ST6, PAPLN, CHSY1, FLRT2에서 선택되거나, 또는 사실상 유전자 MXRA5, LYZ, CTSL2, PLAU 및 TIMP1에서 선택될 수 있음.
진피 유전자 EFEMP1, ECM1, ASPN, HS3ST6, PAPLN, CHSY1, FLRT2 중에서 바람직한 유전자는 유전자 EFEMP1, ECM1, ASPN, HS3ST6, PAPLN 및 CHSY1이다.
하나 이상의 추가 유전자가 유전자 EFEMP1, ECM1, ASPN, HS3ST6, PAPLN, CHSY1, FLRT2, MXRA5, LYZ, CTSL2, PLAU 및 TIMP1에서 선택된다면, 평가 방법은 하기의 경우에 과다색소 반점을 처치하는데 효과적인 처치로 고려될 것이다:
- 유전자가 EFEMP1, ASPN, PAPLN, CHSY1, MXRA5, LYZ, PLAU 및 TIMP1로부터 선택된다면, 처치 이전의 발현 수준과 비교하여 처치 이후의 발현 수준이 더 낮은 경우; 및
- 유전자가 HS3ST6, FLRT2, ECM1 및 CTSL2로부터 선택된다면, 처치 이전의 발현 수준과 비교하여 처치 이후의 발현 수준이 더 높은 경우.
반면, 평가 방법은 하기의 경우에 저색소 반점을 처치하는데 효과적인 처치로 고려될 것이다:
- 유전자가 EFEMP1, ASPN, PAPLN, CHSY1, MXRA5, LYZ, PLAU 및 TIMP1로부터 선택된다면, 처치 이전의 발현 수준과 비교하여 처치 이후의 발현 수준이 더 높은 경우; 및
- 유전자가 HS3ST6, FLRT2, ECM1 및 CTSL2로부터 선택된다면, 처치 이전의 발현 수준과 비교하여 처치 이후의 발현 수준이 더 낮은 경우.
피부 샘플은 바람직하게는 코카서스 인종, 바람직하게는 연령이 40세 이상인 인간, 바람직하게는 연령이 50세 이상인 인간, 또는 심지어 연령이 60세 이상인 인간에서 유래된다.
바람직하게는, 본 발명의 측면에서, 특히 전술한 평가에 있어서, 이는 과다색소 반점, 매우 바람직하게는 화학선, 일광성 또는 노인성 흑색점의 처치이다.
본 발명의 처치 효능을 평가하기 위한 방법은 바람직하게는 시험관내 또는 생체외에서 수행된다. 이는 또한 생체내에서 수행될 수도 있다. 바람직하게는, 상기 피부 샘플은 처치 전과 후에 동일한 색소 반점으로부터 제거되어야 하거나, 또는 반점의 크기가 치료 전과 후에 샘플이 쉽게 수득될 수 없다는 것을 의미한다면 그곳에 매우 가까운 색소 반점으로부터 제거되어야 한다.
또한, 본 발명은 색소 반점의 처치 효능을 평가하기 위한 시험관내 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 피부를 대표하는 세포 모델에서 유전자 TGFBR2, TGFBI, BMP2, SMAD3, THBS2, TGFBR3, SEMA5A, SMAD7, SOSTDC1, FRAS1, LEPREL1, MATN2, DST, PLOD2, ITGA2, COL6A3, CRTAP, LAMC1, LAMB3, LAMA3, ITGAV, ITGB1 및 ACTN1로 구성되는 리스트에서 선택된 하나 이상의 진피 유전자의 발현 수준을, 또는 상기 선택된 유전자의 발현 산물의 발현 또는 활성 수준을, 치료 전과 후에 비교하는 단계를 포함한다. 선택적으로, 상기 유전자는 SEMA5A가 포함되거나 포함되지 않은 TGF-베타 - SMAD 신호 경로에 연관된 진피 유전자의 리스트 A에서 선택되거나, 또는 사실상 리스트 B에서 선택되거나, 또는 사실상 리스트 B의 다양한 하위그룹들, 즉 LEPREL1, PLOD2, COL6A3 및 CRTAP, 또는 LAMC1, LAMB3 및 LAMA3, 또는 FRAS1, MATN2 및 DST, 또는 ITGA2, ITGAV 및 ITGB1, 또는 ITGA2 및 ITGAV에서 선택될 수 있다.
상기 세포 모델은 통상의 기술자에게 적절한 것으로 고려되는 임의의 유형일 수 있다. 특히, 이는 단배양 또는 공배양 세포 모델, 또는 재구축된 피부의 삼차원 모델, 또는 사실상 생체외에서 배양된 피부일 수 있다. 본 발명의 방법의 측면에서 사용될 수 있는 색소 반점, 특히 화학선 흑색점을 대표하는 세포 모델이 또한 존재한다. 이러한 세포 모델들은 색소 반점(또는, 흑색점)을 완전하게 모방할 필요는 없지만, 색소 반점, 특히 흑색점에서 관찰되는 생물학적 사건, 형태학적 특징 또는 색소 특징은 모방하여야 한다. 이러한 시험관내 모델은 통상의 기술자에게 잘 알려져 있다.
전술한 시험관내 방법의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 다른 평가 방법들에서 설명된 바와 같이, 본 발명의 둘 이상의 유전자, 바람직하게는 셋 이상, 다섯 이상 또는 여섯 이상의 유전자의 발현 수준을 비교하는 단계를 포함하며, 상기 유전자는 본 발명의 유전자들로부터 선택되거나, 또는 사실상 SEMA5A가 포함되거나 포함되지 않은 리스트 A의 유전자로부터 선택되거나, 또는 사실상 ITGB1이 포함되거나 포함되지 않은 리스트 B의 유전자로부터 선택된다. 특히 가장 바람직한 유전자는 유전자 TGFBR2, TGFBI, BMP2, SMAD3, THBS2 및 TGFBR3 뿐만 아니라 유전자 FRAS1, LEPREL1, MATN2, DST, PLOD2 및 ITGA2이다.
마찬가지로, 다른 평가 방법들에서 설명된 바와 같이, 상기 방법은 바람직하게는 하기와 같은 둘 이상의 유전자를 이용하여 수행된다:
- 유전자 TGFBR2, TGFBI, BMP2, SMAD3, THBS2, TGFBR3, SEMA5A, SMAD7 및 SOSTDC1에서, 또는 사실상 리스트 B의 유전자에서, 또는 TGFBR2, TGFBI, BMP2, SMAD3, THBS2, TGFBR3, SEMA5A, SMAD7, SOSTDC1, FRAS1, LEPREL1, MATN2, DST, PLOD2, ITGA2, COL6A3, CRTAP, LAMC1, LAMB3, LAMA3, ITGAV, ITGB1 및 ACTN1에서, 선택된 제1유전자; 및
- 유전자 EFEMP1, ECM1, ASPN, HS3ST6, PAPLN, CHSY1, FLRT2, MXRA5, LYZ, CTSL2, PLAU 및 TIMP1에서, 바람직하게는 유전자 EFEMP1, ECM1, ASPN, HS3ST6, PAPLN, CHSY1 및 FLRT2에서, 또는 사실상 유전자 MXRA5, LYZ, CTSL2, PLAU 및 TIMP1에서, 선택된 제2유전자.
특히 바람직하게는, 상기 제1유전자는 TGFBR2, TGFBI, BMP2, SMAD3, THBS2 및 TGFBR3에서 선택되거나, 또는 사실상 FRAS1, LEPREL1, MATN2, DST, PLOD2 및 ITGA2에서 선택된다.
본 발명의 평가 방법과 관련하여, 바람직한 일구현예에서, 제1유전자는 콜라겐 패밀리, 특히 스트로마 콜라겐 피브릴 패밀리에 속하는, 유전자 LEPREL1, PLOD2, COL6A3 및 CRTAP로 구성되는 하위그룹에서 선택된다.
또다른 구현예에 따르면, 제1유전자는 유전자 LAMC1, LAMB3 및 LAMA3으로 구성되고, 라미닌을 코딩하고, 과다색소 반점에서 과발현되는 그룹에서 선택된다.
또다른 구현예에 따르면, 제1유전자는 유전자 FRAS1, MATN2 및 DST로 구성되고, 기저막 영역과 연관되는 매트릭스 단백질을 코딩하고, 과다색소 반점에서 과발현되는 그룹에서 선택된다.
또다른 구현예에 따르면, 제1유전자는 유전자 ITGA2, ITGAV 및 ITGB1로 구성되고, 인테그린을 코딩하고, 과다색소 반점에서 과발현되는 그룹에서 선택된다.
선택적으로, 상기 방법은 액틴을 코딩하는 유전자 ACTN1과 함께 수행될 수 있다.
본 발명의 다른 측면들과 관련하여 기재된 특정 유전자들의 모든 조합들은 또한 본 발명의 상기 측면에서 바람직하다.
또한, 상기 평가 방법들을 이용하여, 본 발명에 기재된 효능 평가 방법에서 처치에 대해 획득한 결과들을 강조함으로써 소비자에게 상기 처치를 촉진시킬 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 전술한 효능 평가 방법으로 구성되는 시험 프로토콜에서 그 효과를 나타냄으로써 제품을 추천하는데 사용될 수 있는 방법을 제공한다. 따라서, 본 발명은 또한 화장제품 또는 화장학적 처치를 촉진하는 방법에 관한 것으로서, 이는 전술한 바에 따라 실시되는 하나 이상의 방법에 의해 입증된 상기 제품 또는 처치의 효능, 작용 또는 특질을 강조하는 단계를 포함한다.
상기 제품의 촉진(promotion)은 임의의 커뮤니케이션 채널을 이용하여 수행될 수 있다. 특히, 이는 판매원에 의해, 매장에서 직접, 라디오 및 텔레비젼을 통해, 특히 광고를 통해 수행될 수 있다. 또한, 이는 인쇄 신문을 통해, 또는 임의의 다른 문헌에 의해, 특히 홍보 목적을 위한 문헌(안내서)에 의해 촉진될 수 있다. 또한, 이는 인터넷 또는 임의의 다른 적절한 데이터 네트워크를 통해 촉진될 수 있다. 또한, 이는 제품상에서, 특히 제품의 패키징상에서, 또는 제품과 결부될 수 있는 임의의 다른 설명 전단지에서, 직접적으로 촉진될 수 있다. 또한, 본 발명은 피부 색소 반점의 처치용 분자를 스크리닝하는 방법에 관한 것으로서, 상기 분자에 기초한 처치의 효능을 측정하기 위하여 전술한 평가 방법들 중 하나를 수행하는 단계를 포함한다.
추가 측면에서, 본 발명은 또한 인간 피부의 비-병리학적 피부 색소 반점 또는 불규칙성을 처치 또는 예방하기 위한 화장학적 방법(cosmetic method)에 관한 것으로서, 상기 방법은 진피 유전자의 활성 또는 발현 수준을 조정하는 단계를 포함하며, 상기 유전자는 유전자 TGFBR2, TGFBI, BMP2, SMAD3, THBS2, TGFBR3, SEMA5A, SMAD7, SOSTDC1, FRAS1, LEPREL1, MATN2, DST, PLOD2, ITGA2, COL6A3, CRTAP, LAMC1, LAMB3, LAMA3, ITGAV 및 ACTN1로 구성되는 리스트에서 선택된다. 선택적으로, 상기 유전자는 TGF-베타 - SMAD 신호 경로에 연관되는 진피 유전자의 리스트 A(바람직하게는, SEMA5A가 제외됨)에서 선택되거나, 또는 사실상 진피 유전자의 리스트 B(바람직하게는, ITGB1이 제외됨)에서 선택되거나, 또는 사실상 리스트 B의 다양한 하위그룹들, 즉 LEPREL1, PLOD2, COL6A3 및 CRTAP, 또는 사실상 LAMC1, LAMB3 및 LAMA3, 또는 사실상 FRAS1, MATN2 및 DST, 또는 ITGA2, ITGAV 및 ITGB1, 또는 ITGA2 및 ITGAV에서 선택될 수 있다.
"비-병리학적 피부 색소 반점"이라는 용어에는, 치료적인 이유를 위한 것이 아니라 단지 심미적인 이유만을 위해 제거하기를 원하는 양성 반점이 포함된다. 색소침착 불규칙성에는, 안색을 불균등하게 만들거나 피부색을 비균질하게 만드는 색소침착 불완전성이 포함된다.
본 발명자들에 의해, 색소 반점의 진피에서 본 발명의 유전자의 중요한 역할, 특히 색소 반점의 출현과 상기 유전자의 발현 수준의 탈조절 사이의 연관관계가 입증되었다. 이러한 이유로 인해, 상기 유전자의 조정을 유예시키거나 감소시키는 것은 관찰되는 탈조절이 감소되거나 없어질 수 있다는 것을 의미하므로, 색소 반점이 없고 이에 따라 균등한 안색과 균질한 피부색을 갖는 것에 합치될 수 있는 상황이 세포외 매트릭스에서 회복될 수 있다.
본 발명의 다른 측면에서 주어진 이유들로 인해, 바람직하게는 1개보다 많은 유전자, 예를 들어 2개 이상의 유전자, 또는 3, 5, 6 또는 8 개 이상의 유전자가 본 발명의 유전자에서 선택된다. 일구현예에서, 화장학적 방법은 본 발명의 유전자 전부, 또는 SEMA5A가 포함되거나 포함되지 않은 리스트 A의 유전자 전부, 또는 사실상 리스트 B의 유전자 전부의 발현 수준을 조정하기 위한 것이다. 바람직하게는, 유전자 ITGB1이 리스트 B에서 제외된다. 본 발명의 화장학적 방법은 건강한 피부, 예를 들어 색소 반점에 인접한 피부에서 관찰되는 것에 가깝도록 발현 수준을 회복시키기 위한 것이다. 특히 바람직한 유전자는 유전자 TGFBR2, TGFBI, BMP2, SMAD3, THBS2 및 TGFBR3 뿐만 아니라 유전자 FRAS1, LEPREL1, MATN2, DST, PLOD2 및 ITGA2이다.
바람직한 일구현예에서, 상기 색소 반점은 과다색소 반점, 예를 들어 화학선, 노인성 또는 일광성 흑색점이다. 이러한 경우, 본 발명의 화장학적 방법에서 원하는 조정은 다음과 같다:
- 유전자 TGFBR2, TGFBI, BMP2, SMAD3, THBS2, TGFBR3, SEMA5A 및 SMAD7에서 선택되거나, 또는 사실상 유전자 FRAS1, LEPREL1, MATN2, DST, ITGA2, COL6A3, CRTAP, LAMC1, LAMB3, LAMA3, ITGAV, ITGB1 및 ACTN1에서 선택되거나, 또는 사실상 유전자 TGFBR2, TGFBI, BMP2, SMAD3, THBS2, TGFBR3, SEMA5A, SMAD7, FRAS1, LEPREL1, MATN2, DST, ITGA2, COL6A3, CRTAP, LAMC1, LAMB3, LAMA3, ITGAV, ITGB1 및 ACTN1에서 선택된, 하나 이상의 유전자의 발현의 전체적, 부분적 또는 일시적 억제; 또는
- 유전자 SOSTDC1 또는 유전자 PLOD2의 발현의 (일시적일 수 있는) 증가.
바람직하게는, 상기 억제는 전체적 억제가 아니라, 발현을 완전히 억제하지 않고 선택된 유전자의 발현 수준을 감소시키는 경향의 부분적 억제이다.
또다른 구현예에 따르면, 상기 색소 반점은 저색소 반점이다. 이러한 경우, 원하는 조정은 전술한 상황의 역에 해당하며; 특히, 이러한 방법은 유전자 TGFBR2, TGFBI, BMP2, SMAD3, THBS2, TGFBR3, SEMA5A 및 SMAD7에서, 또는 사실상 유전자 FRAS1, LEPREL1, MATN2, DST, ITGA2, COL6A3, CRTAP, LAMC1, LAMB3, LAMA3, ITGAV, ITGB1 및 ACTN1에서, 또는 사실상 유전자 TGFBR2, TGFBI, BMP2, SMAD3, THBS2, TGFBR3, SEMA5A, SMAD7, FRAS1, LEPREL1, MATN2, DST, ITGA2, COL6A3, CRTAP, LAMC1, LAMB3, LAMA3, ITGAV, ITGB1 및 ACTN1에서, 선택된 하나 이상의 유전자의 발현을 증가시키는 것을 목적으로 하거나, 또는 사실상 유전자 SOSTDC1 또는 유전자 PLOD2의 발현 수준을 억제하거나 감소시키는 것을 목적으로 한다.
"발현 수준의 증가 또는 감소"라는 용어에는, 상기 유전자의 전사 정도를 증가 또는 감소시키는 것, 상기 유전자의 번역 정도를 증가 또는 감소시키는 것, 뿐만 아니라 상기 유전자에 의해 인코딩된 단백질의 활성을 증가 또는 감소시키는 것이 포함된다.
바람직하게는, 본 발명의 유전자들 중 하나에 대해 원하는 발현 수준을 조정하는 것과 동시에, 본 발명의 화장학적 방법은 바람직하게는 유전자 EFEMP1, ECM1, ASPN, HS3ST6, PAPLN, CHSY1, FLRT2, MXRA5, LYZ, CTSL2 및 PLAU 및 TIMP1에서 선택된 하나 이상의 다른 진피 유전자를 조정하는 단계를 또한 포함한다. 상기 두번째 리스트의 진피 유전자에서 바람직한 유전자는 유전자 EFEMP1, ECM1, ASPN, HS3ST6, PAPLN 및 CHSY1과 유전자 MXRA5, LYZ, CTSL2, PLAU 및 TIMP1이다.
과다색소 반점을 처치하는 경우에 적용되는 조정은, 유전자 EFEMP1, ASPN, PAPLN, CHSY1, MXRA5, LYZ, PLAU 및 TIMP1에 대한 발현 수준의 감소, 및 유전자 ECM1, HS3ST6, FLRT2 및 CTSL2에 대한 발현 수준의 증가이다. 저색소 반점을 처치하는 경우, 반대의 조정이 적용된다.
따라서, 본 발명에 따른 화장학적 방법은 제품, 특히 화학 분자, 천연 추출물, 핵산, 펩티드를 적용하는 단계, 또는 본 발명의 하나 이상의 진피 유전자의 발현 산물의 활성 또는 발현 수준을 조정시키는 처치를 적용하는 단계를 포함한다.
바람직하게는, 상기 조정은 본 발명의 하나 이상의 유전자에 대한 것이고 상기 유전자의 발현을 억제하는 안티센스, microRNA 또는 siRNA를 이용하여 달성된다.
제품의 경우에는, 바람직하게는 국부 적용된다.
바람직하게는, 상기 조정은 본 발명의 유전자들 중 하나의 조정인자(modulator)를 사용하여 수행된다. 이러한 조정인자는 실시예 3 및 표 3에 기재되어 있다.
일례로서, 본 발명의 화장학적 방법은 탈미네랄 골분(demineralized bone powder: DBP), 피오글리타존, GW0742, 크리스타타 L 플라보노이드, 페노피브레이트, 옥시마트린, 살비아놀산 B, SB-431542, Wen-pi-tang-Hab-Wu-ling-san 추출물, 테트란드린 및 N-아세틸-세릴-아스파르틸-리실-프롤린(N-acetyl-seryl-aspartyl-lysyl-proline: Ac-SDKP), 비타민 K2 메나퀴논, 베타-아미노프로피온니트릴(beta-aminopropionitrile: bAPN) 및 반데타니브(ZD6474 5)에서 선택된 화합물을 적용하는 단계, 또는 사실상 저강도 초음파의 적용, 또는 상기 조정인자들 중 둘 이상의 조합을 포함하는 것이 유리할 것이다.
또한, 본 발명의 화장학적 방법은 유리하게는 제1측면에 따른 방법을 이용하여 처리되는 색소 반점의 특징화 후에 수행된다. 실제로, 상기 제1단계는 반점을 특징화시키고, 이에 따라 반점의 영역과 비손상 영역(바람직하게는, 인접한 영역) 사이에서 발현 수준이 강하게 조정되는 유전자를 검출하는데 사용될 수 있다. 이어서, 본 발명의 유전자 또는 유전자들에 대해 조정인자를 특이적으로 적용함으로써, 상기 반점에서 차등 조정되는 상기 유전자에 대해 작용하는데 이용될 수 있는 처치를 개조하는 것이 가능하다.
고려되는 처치와 무관하게, 본 발명의 화장학적 방법은 원하는 효과들을 보강하기 위한 하나 이상의 부가 활성 화합물, 예를 들어 탈색소, 각질용해제(keratolytic agent) 및/또는 박리제, 항산화제, 화학적 또는 물리적 UV 차단제, 항-염증제 및/또는 완화제(soothing agent), 또는 데옥시리보핵산 및 이의 유도체로서 개시된 임의의 물질을 적용하는 단계를 또한 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 화장학적 방법은 안색 또는 피부색에서 색소 반점 또는 다른 불규칙성, 특히 화학선 흑색점과 같은 과다색소 반점의 출현을 예방하는 경우에도 적용가능하다.
실제로, 본 실시예 섹션에서 수행되고 본 발명자들에 의해 획득된 데이터에 따르면, 본 발명자들에 의해 밝혀진 유전자에 의해 세포외 매트릭스, 특히 TGF-β-SMAD 신호 경로를 다루는 것은 반점이 출현하기 전에 쉽다는 점이 보여진다. 과다색소 반점에서 생물학적 사건의 배열은 하기와 같은 것으로 고려될 수 있다: 1) 진피에 대한 변형(본 적용에서 식별되는 유전자의 발현의 조정에 기인함); 그 후에 2) 진피에서 표피 능선의 형성과 함께 표피에 대한 개질; 그 후에 3) 진피표피 접합부의 길이 증가 및 복합체 네트워크의 형성; 후에 4) 멜라닌 적재의 증가.
또한, 본 발명은 비-병리학적 피부 색소 반점의 처치에 있어서, 또는 더 일반적으로 피부 색소침착의 조정에 있어서, 화장학적 적용을 위한, 유전자 TGFBR2, TGFBI, BMP2, SMAD3, THBS2, TGFBR3, SEMA5A, SMAD7, SOSTDC1, FRAS1, LEPREL1, MATN2, DST, PLOD2, ITGA2, COL6A3, CRTAP, LAMC1, LAMB3, LAMA3, ITGAV, ITGB1 및 ACTN1로 구성되는 리스트에서 선택된 하나 이상의 진피 유전자의 발현 산물의 활성 또는 발현 수준의 조정인자의 용도에 관한 것이다. 선택적으로, 상기 유전자는 SEMA5A가 포함되거나 포함되지 않은 TGF-베타 - SMAD 신호 경로에 연관되는 진피 유전자의 리스트 A에서 선택되거나, 또는 사실상 진피 유전자의 리스트 B에서 선택되거나, 또는 사실상 리스트 B의 다양한 하위그룹들, 즉 LEPREL1, PLOD2, COL6A3 및 CRTAP, 또는 LAMC1, LAMB3 및 LAMA3, 또는 FRAS1, MATN2 및 DST, 또는 ITGA2, ITGAV 및 ITGB1, 또는 ITGA2 및 ITGAV에서 선택될 수 있다. ITGB1은 상기 다양한 리스트에서 제외될 수 있다.
과다색소 반점의 처치에 대해, 사용되는 조정인자는 TGFBR2, TGFBI, BMP2, SMAD3, THBS2, TGFBR3, SEMA5A, SMAD7, FRAS1, LEPREL1, MATN2, DST, ITGA2, COL6A3, CRTAP, LAMC1, LAMB3, LAMA3, ITGAV, ITGB1 및 ACTN1에서 선택된 하나 이상의 유전자의 억제제이거나, 또는 유전자 SOSTDC1 또는 유전자 PLOD2의 활성화제이다. 바람직하게는, 상기 억제제는 상기 유전자의 발현 또는 활성을 완전히 중지시키지 않고, 상기 유전자의 발현 수준을 감소시키거나 상기 유전자의 발현 산물의 활성을 감소시키는, 부분적 억제제이다. 일측면에서, 상기 조정인자는 TGFBR2, TGFBI, BMP2, SMAD3, THBS2, TGFBR3, SEMA5A 및 SMAD7에서 선택되는 하나 이상의 유전자(또는 SEMA5A가 제외됨)의 억제제, 또는 SOSTDC1의 활성화제이다. 또다른 측면에서, 상기 조정인자는 FRAS1, LEPREL1, MATN2, DST, ITGA2, COL6A3, CRTAP, LAMC1, LAMB3, LAMA3, ITGAV 및 ACTN1에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 억제제, 또는 PLOD2의 활성화제이다.
반면, 저색소 반점의 처치에 대해, 사용되는 조정인자는 TGFBR2, TGFBI, BMP2, SMAD3, THBS2, TGFBR3, SEMA5A, SMAD7, FRAS1, LEPREL1, MATN2, DST, ITGA2, COL6A3, CRTAP, LAMC1, LAMB3, LAMA3, ITGAV, ITGB1 및 ACTN1에서 선택된 하나 이상의 유전자의 활성화제이거나, 또는 유전자 SOSTDC1 또는 유전자 PLOD2의 억제제이다. 일구현예에서, 상기 조정인자는 TGFBR2, TGFBI, BMP2, SMAD3, THBS2, TGFBR3, SEMA5A 및 SMAD7에서 선택되는 하나 이상의 유전자(또는 SEMA5A가 제외됨)의 활성화제, 또는 SOSTDC1의 억제제이다. 또다른 측면에서, 상기 조정인자는 FRAS1, LEPREL1, MATN2, DST, ITGA2, COL6A3, CRTAP, LAMC1, LAMB3, LAMA3, ITGAV 및 ACTN1에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 활성화제, 또는 PLOD2의 억제제이다.
억제제 또는 활성화제의 알려지고 특징화된 예들은 실시예 3에 기재되어 있다. 과다색소 반점의 화장학적 처치에 사용하기 위한 조정인자는 특히 살비아놀산 B, Wen-pi-tang-Hab-Wu-ling-san 추출물 또는 저강도 초음파일 수 있다.
잘 알려진 조정인자는 또한 안티센스 분자, siRNA, 및 microRNA이다. 조정인자로서, 본 발명의 하나 이상의 유전자에 대한 것이고 상기 유전자의 발현을 억제하는 안티센스 분자, microRNA 및 siRNA가 특히 고려된다.
본 발명의 측면에서 특히 바람직한 조정인자는 탈미네랄 골분(DBP), 피오글리타존, GW0742, 크리스타타 L 플라보노이드, 페노피브레이트, 옥시마트린, 살비아놀산 B, SB-431542, Wen-pi-tang-Hab-Wu-ling-san 추출물, 테트란드린, N-아세틸-세릴-아스파르틸-리실-프롤린(Ac-SDKP), 비타민 K2 메나퀴논, 베타-아미노프로피온니트릴(bAPN) 및 반데타니브(ZD6474 5)이거나, 또는 사실상 저강도 초음파의 적용이다. 또한, 상기 조정인자들 중 둘 이상의 조합의 사용도 고려될 수 있다.
조정인자의 유효량은 원하는 결과 및 사용되는 조정인자의 유형과 개수에 따라 변화되어야 하며; 이는 0.001 중량% 내지 30 중량%의 범위일 수 있다.
전술한 바와 같은 조정인자들은, 본 발명의 화장학적 방법에서 유전자 EFEMP1, ECM1, ASPN, HS3ST6, PAPLN, CHSY1 및 FLRT2의 조정인자, 또는 유전자 MXRA5, LYZ, CTSL2, PLAU 및 TIMP1의 조정인자와 함께 사용될 수 있다.
유전자들의 바람직한 조합들은 이미 기재되었다.
상기 조정인자는 다른 생성물, 활성성분 또는 부형제와 함께 사용될 수 있다. 바람직하게는, 이들은 국부 적용에 적합한 형태로, 예를 들어 도포제, 크림 또는 연고의 형태로, 또는 피부관리에 적합한 임의의 형태, 예컨대 로션, 세럼, 비누 등으로 패키징된다.
본 발명의 화장학적 방법과 관련된 섹션에서 기재되는 다양한 구현예들은 전술한 화장학적 적용을 위한 용도에 적용할 수 있다.
본 발명의 조정인자는 특히 안색의 안정화, 피부색의 균질화 또는 색소이상의 방지의 관점에서 화장학적 적용에 사용될 수 있다.
또한, 또다른 측면에서 본 발명은 피부 색소 반점의 처치에서, 예를 들어 치료적 처치의 측면에서 적용하기 위한, 유전자 TGFBR2, TGFBI, BMP2, SMAD3, THBS2, TGFBR3, SEMA5A, SMAD7, SOSTDC1, FRAS1, LEPREL1, MATN2, DST, PLOD2, ITGA2, COL6A3, CRTAP, LAMC1, LAMB3, LAMA3, ITGAV 및 ACTN1에서 선택된 하나 이상의 진피 유전자의 발현 산물의 활성 또는 발현 수준의 조정인자에 관한 것이다. 상기 반점은 과다색소 반점 또는 저색소 반점일 수 있다. 선택적으로, 상기 유전자는 TGF-베타 - SMAD 신호 경로에 연관되는 진피 유전자의 리스트 A에서 선택되거나, 또는 사실상 진피 유전자의 리스트 B에서 선택되거나, 또는 사실상 리스트 B의 다양한 하위그룹들, 즉 LEPREL1, PLOD2, COL6A3 및 CRTAP, 또는 LAMC1, LAMB3 및 LAMA3, 또는 FRAS1, MATN2 및 DST, 또는 ITGA2, ITGAV 및 ITGB1, 또는 ITGA2 및 ITGAV에서 선택될 수 있다.
바람직한 조정인자는 본 발명의 다른 측면들과 관련하여 이미 기재되었다.
상기 조정인자는 다른 생성물, 활성성분 또는 부형제와 함께 조합될 수 있다. 바람직하게는, 이들은 국부 적용에 적합한 형태로, 예를 들어 도포제, 크림 또는 연고의 형태로, 또는 피부관리에 적합한 임의의 형태, 예컨대 로션, 세럼, 비누 등으로 패키징된다.
본 발명에 따른 다양한 방법들과 적용들에서, 고려되는 색소 반점은 바람직하게는 과다색소 반점이고, 더 바람직하게는 화학선, 일광성 또는 노인성 흑점이다. 본 발명의 방법들과 적용들은 상기 색소 반점에 대한 지표의 본 발명자들의 입증에 기초한 것이다.
이러한 지표는 전체 리스트 또는 인용된 유전자들의 일부로 구성될 수 있다는 사실에 의해 특징지어진다.
또한, 본 발명은 생물학적 기능의 결함을 통해 화학선 흑색점을 선택하고 예측하기 위한 새로운 방법으로서의 상기 지표의 용도에 관한 것이다. 이와 같은 새로운 방법은 인접한 비손상 피부와 대조적으로 과색소침착 병변에서 본 발명에 따른 유전자의 전부 또는 일부의 발현 수준의 연구에 기초한 것이다.
또한, 본 발명은 병변과 인접한 건강한 피부 사이에 존재하는 유전자 발현의 차이의 분자 지표로서 상기 유전자를 사용하여 화학선 흑색점을 처치하는 발명의 범위 내에 있다. 상기 지표는 또한 적합한 처치의 선택을 결정함에 있어서, 그리고 피부에 대해 이로운 것으로 추정되는 제품(활성성분, 분자, 천연 추출물) 및 방법(빛, 주사, 경구)의 효과를 측정하는데 있어서 분명한 장점을 제공한다. 실제로, 본 발명은 전술한 유전자들의 전부 또는 일부의 병변에서 발현 수준을 이들의 발현 프로파일이 건강한 피부에 가깝도록 조정함으로써, 화학선 흑색점을 처치하기 위한 제품 또는 방법의 효능을 평가하는데 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 화학선 흑색점에 대한 억제 또는 예방 인자를 스크리닝하는 방법으로 구성된다. 상기 방법은 상기 인용된 유전자의 발현 및/또는 상기 유전자의 단백질 산물의 발현 또는 활성을 억제하거나 증가시키는 화합물들의 능력을 평가하고, 화학선 흑색점을 예방 또는 처치할 수 있는 인자를 선택하는 것으로 구성된다. 화합물의 효능의 검증은 단배양 또는 공배양 모델, 또는 재구축된 피부의 삼차원 모델, 또는 생체외 피부 또는 생체내 피부에서 수행될 수 있다.
또한, 본 발명은 피부를 정상 상태로 회복시키기 위하여, 즉 건강한 비손상 피부의 발현에 근접하도록 발현을 회복시키기 위하여, 병변의 예방 또는 보정을 위해 화학선 흑색점의 바이오마커로부터 식별된 유전자의 발현을 조정하는 화합물의 용도에 관한 것이다. 특히, 색소침착의 색소이상(과다색소침착 또는 저색소침착)을 예방 또는 처치하기 위해 식별된 단백질에 대해 작용하는 화합물은 종래에 전혀 제안된 적이 없었다. 상기 화합물은 실시예 3의 표 3에 기재된다.
특히 선택되는 제제는, 세포외 매트릭스에 관해 과발현되는 단백질, 특히 TGF-β-SMAD 신호 경로의 단백질의 네거티브 조정인자, 또는 저발현된 단백질의 퍼지티브 조정인자이다.
세포외 매트릭스에, 및 특히 TGF-β-SMAD 신호 경로에 연관되는 단백질의 특정 네거티브 조정인자로서 언급될 수 있는 것에는, 흑색점에서 과발현되는 것으로 발견된 단백질의 합성 및/또는 분비의 억제제 및/또는 상기 단백질의 분해의 활성화제가 포함된다.
반면, 퍼지티브 조정인자로서 언급될 수 있는 것은 흑색점에서 저발현되는 단백질의 합성 자극제, 분비 유도제 또는 분해 억제제이다.
도 1: 도 1은 TGF-β를 이용한 재구축된 색소 피부(Reconstructed Pigmented Skin: RPS) 처치 프로토콜을 도시한다. 다이어그램에서, T는 담체로서 1mg/mL의 BSA 및 4mM의 HCl과 함께 200pg/mL의 농도로 "TGF-β에 의한 처치"를 의미한다. 매질은 2% FBS를 갖는 MEM 3F'였다. 등가(equivalent) 진피가 연속 3일 동안 처치되었다. D0i에서, 상기 등가 진피는 케라티노사이트 및 멜라노사이트(그래프상에서 K+M)에 의해 파종되었으며, 7일 동안 침지된 채로 유지되었다. 이어서 2주 동안 배양이 나타났다.
도 2: 도 2는 실시예 4에 기재되어 있는 프로토콜을 이용하여 대조군(2% SVF HCl/BSA) 또는 TGF베타(200pg/mL)로 처치한 후에 재구축된 색소 피부의 사진을 나타낸다. 2개의 상단부 사진은 분리된 표피상에서 도파 반응(Dopa reaction)에 대응한다. 2개의 하단부 사진은 폰타나 마손 염색(Fontana Masson staining)에 대응한다.
도 3: 도 3은 실시예 4에 기재되어 있는 프로토콜에 따라 처치된 재구축된 색소 피부에 대해, 루미넌스(luminance) 결과(그래프 A 및 C) 및 멜라닌 정량화(그래프 B 및 D)를 도시한다. 대조군은 2% SVF HCl/BSA에 의한 처치에 대응하며, TGFB는 200pg/mL의 농도로 TGF-베타에 의한 처치에 대응한다. 2개의 상단부 그래프와 2개의 하단부 그래프는 2회의 동일하고 독립적인 실험에 대응한다.
실시예 1: 전사 연구
화학선 흑색점(LS) 병변에서 획득한 피부 및 인접한 비손상 피부(US)의 유전자 발현 프로파일을 비교하는 연구가 수행되었다.
본 연구의 목적은, 유효한 처치에 대한 표적으로서 사용하거나 또는 특정 치료의 효능을 분석하는 바이오마커로서 사용하기 위하여, 화학선 흑색점의 형성과 연관되는 변화를 반영하는 마커로서 적합하고 재현가능하고 유의적인 마커를 식별하기 위한 것이다.
요약하면, 15명의 여성 지원자들이 "전체 게놈" 전사체 연구(Affymetrix 어레이)에 참가하기 위해 모집되었다. 각 지원자들에 대해, 화학선 흑색점 유형의 병변이 손등에서 진단되었으며, 화학선 흑색점 진단은 에피루미네센스(epiluminescence)에 의해 확인되었다. 이러한 조사는 하기를 위한 것이다:
1) 주근깨(균질한 색소침착, 좀먹은 가장자리 영역 및 지문형 구조의 부재) 및 편평 지루성각화증(복수 비립종-형 낭포 또는 위낭포 및 좀먹은 가장자리 영역, 가여포성 틈 및 지문형 패턴)과 구별되는 진피표피 접합부 패턴 기준("지문형(fingerprint-like) 구조")을 이용하여 병변(오직, 화학선 흑색점)의 임상 진단을 검증하기 위함[Menzies et al; Stolz et al; Carli et al];
2) 피부 생검이 수행되는 상기 병변 내부에서 구조/패턴이 균질한 영역을 규명하기 위함;
3) Matlab®에서 개발된 특정 소프트웨어(SQA 소프트웨어, CMLA, ENS Cachan, UMR CNRS 8536)를 이용한 정량적 이미지 분석에 기초하여, 표현형 스코어를 구축하기 위함.
병변을 중심으로 하는 3mm 생검이 채취되었으며, 또한 인접한 비손상 피부 영역에서 크기가 동일한 생검이 채취되었다. 상기 샘플의 전체 RNA가 추출되고 증폭되었다. Affymetrix 어레이에서 하이브리드화를 위해 프로브가 제조되었다. 유전자 발현 프로파일은 30개의 생검(지원자당 2개의 생검) 각각에 대해 제조되었으며, 비교 분석은 모든 지원자들에 걸쳐 지원자들마다 US와 LS 사이에서 수행되었다. 통계상 차등 발현된 유전자들(환자들의 기하 평균)은 리스트들로 편집되었으며, 기능적 패밀리들로 그룹지어졌다.
놀랍게도, 본 발명자들은 US와 LS 사이에서 수백개의 유전자의 차등 발현을 예상외로 발견하였다. 437개 유전자의 리스트가 작성되었으며, 이는 화학선 흑색점 병변의 전반적인 분자 지표를 나타낸다. 437개의 식별된 유전자들 중에서, 169개 유전자들은 건강한 피부에 비해 화학선 흑색점 병변에서 퍼지티브하게 조절되는 것(상향조절됨)으로 나타난 반면, 269개 유전자들은 화학선 흑색점에서 네거티브한 방식으로 조절되었다(하향조절됨).
이러한 유전자 그룹은 복수개의 기능적 패밀리들로 하위분류되었다.
식별된 기능적 패밀리들 또는 생물학적 과정들 중에서, 본 발명자들은 놀랍게도 화학선 흑색점에서 세포외 매트릭스 및 진피표피 접합부에서 기능이상을 분자적 수준에서 반영하는 유전자들의 패밀리를 발견하였다. "세포외 매트릭스"로서 알려진 상기 기능적 패밀리로 수집된 상기 유전자들은 화학선 흑색점과 연관되는 것으로서 종래에 전혀 개시된 적이 없었으며, 이들은 표 1 및 2에 그리고 하기에 기재된다:
건강한 피부에 비해 화학선 흑색점에서 과발현되는 유전자들 TGFBR2, TGFBI, BMP2, SMAD3, THBS2, TGFBR3, SEMA5A, SMAD7, EFEMP1, ASPN, PAPLN, CHSY1, MXRA5, LYZ, PLAU, TIMP1, FRAS1, LEPREL1, MATN2, DST, ITGA2, COL6A3, CRTAP, LAMC1, LAMB3, LAMA3, ITGAV, ITGB1 및 ACTN1.
건강한 피부에 비해 화학선 흑색점에서 저발현되는 유전자들 SOSTDC1, ECM1, HS3ST6, FLRT2, CTSL2 및 PLOD2.
상기 유전자들은 진피의 성분들을 코딩하거나, 또는 세포외 매트릭스의 갱신 또는 재구축에 연관되는 상기 결합 매트릭스의 성분들의 합성에 관여하는 단백질을 코딩하는 것이거나, 진피표피 접합부 및 기저막 영역과 연관되는 매트릭스 단백질을 코딩하는 유전자이다. 상기 패밀리는 또한 TGF-β 경로에 연관되는 유전자를 포함하며, 이는 세포외 매트릭스의 성분의 합성에 관여한다. 상기 패밀리의 유전자들은 주로 화학선 흑색점에서 과발현된다. 이러한 패밀리의 유전자들은 색소 장애에서 전적으로 근복적이며, 화학선 흑색점에서 스트로마에 대해 중대한 역할을 나타낸다.
화학선 흑색점에서 과발현되는 것으로 발견된 "세포외 매트릭스" 패밀리의 유전자 리스트
하위-패밀리
경로/기능		 명칭 접근 번호(accession number) 전체 이름 조정(modulation)의 정도






TGFb / SMAD





 THBS2 NM_003247 트롬보스폰딘 2 3.41
TGFBI NM_000358 형질전환 성장인자, 베타-유도체, 68kDa 2.22
BMP2 NM_001200 골형성단백질 2 2.03
SMAD3 NM_005902 SMAD 패밀리 멤버 3 1.76
TGFBR3 NM_003243 형질전환 성장인자, 베타 수용체 III 1.68

TGFBR2		 D50683
NM_001024847
NM_003242		 형질전환 성장인자, 베타 수용체 II (70/80kDa)
1.61
SEMA5A NM_003966 세마 도메인, 7개 트롬보스폰딘 반복체 (세마포린)
(세마포린 5A, 세마포린 F)		 1.56
SMAD7 NM_005904 SMAD 패밀리 멤버 7 1.52

콜라겐		 LEPREL1 NM_018192 레프레칸-형 1 2.64
COL6A3 NM_004369 콜라겐, 제VI형, 알파 3 1.90
CRTAP NM_006371 연골 연관 단백질 (LEPREL3) 1.60
라미닌 LAMC1 NM_002293 라미닌, 감마 1 (이전에는 LAMB2) 1.96


라미닌
LAMB3		 L25541
NM_000228
NM_001017402
NM_001127641
라미닌, 베타 3
1.94
LAMA3 NM_000227 라미닌, 알파 3 1.64


인테그린		 ITGA2 NM_002203 인테그린, 알파 2 (CD49B, VLA-2 수용체의 알파 2 서브유닛) 1.62

ITGAV		 NM_001145000
NM_001144999
NM_002210		 인테그린, 알파 V (비트로넥틴 수용체)
1.62
ITGB1 NM_133376 인테그린, 베타 1 1.55

매트릭스 재구축
 MXRA5 NM_015419 매트릭스-재구축 연관 5 2.40
LYZ NM_000239 리소자임 (신장 아밀로이드증) 2.33
TIMP1 NM_003254 TIMP 메탈로펩티다제 억제제 1 2.26
PLAU NM_002658 플라스미노겐 활성화제, 우로키나제 1.81


프로테오글리칸 및 세포외 당단백질		 EFEMP1 NM_001039348
NM_001039349
NM_004105		 EGF-함유 피불린-형 세포외 매트릭스 단백질 1
(피불린 3)
3.86
ASPN NM_017680 아스포린 2.77
PAPLN NM_173462 파필린, 프로테오글리칸-형 황화 당단백질 2.51
CHSY1 NM_014918 탄수화물 (콘드로이틴) 신타아제 1 1.50

기저막
 FRAS1 NM_025074 프레이저 증후군 1 4.59
MATN2 NM_002380 마트릴린 2 2.61
DST NM_001723
NM_015548		 디스토닌 = BPAG1 2.24

액틴
ACTN1		 NM_001130005
NM_001130004
NM_001102
액티닌, 알파 1		 1.58
화학선 흑색점에서 저발현되는 것으로 발견된 "세포외 매트릭스" 패밀리의 유전자 리스트
하위-패밀리
경로/기능		 명칭 접근 번호 전체 이름 조정의 정도
프로테오글리칸 HS3ST6 NM_001009606 헤파란 설페이트 (글루코사민) 3-O-설포트랜스페라아제 6 0.44
콜라겐 PLOD2 NM_000935
NM_182943		 프로콜라겐-리신, 2-옥소글루타레이트 5-디옥시게나아제 2 0.45
프로테오글리칸 FLRT2 NM_013231 피브로넥틴 류신 풍부 막관통 단백질 2 0.47
매트릭스 재구축 CTSL2 NM_001333 카텝신 L2 (펩티다제 MEC 분해) 0.54
프로테오글리칸 ECM1 U65932
NM_004425
NM_022664		 세포외 매트릭스 단백질 1 0.54
TGFb / SMAD SOSTDC1 NM_015464 스클레로스틴 도메인 함유 1 (엑토딘, BMP 안타고니스트) 0.62
실시예 2: 재료 및 방법
연령이 50 내지 70세이고 포토타입(phototype) II 내지 IV를 갖는 15명의 여성 지원자들이 선택되었다. 손등에서 최소 치수가 3 mm인 화학선 흑색점이 선택되었다. 이들은 에피루미네센스에 의해 특징화되었다. 에피루미네센스에 의한 특징화의 다양한 이점들이 실시예 1에 기재되었다.
2개의 3mm 직경 생검들이 각 환자의 한 손에서 채취되었다. 지원자들 각각에 대해, 생검들 중 하나는 화학선 흑색점 병변(LS)에 상응하였으며, 다른 하나는 피부의 인접한 비손상 영역(US)에 상응하였다(이는 또한 에피루미네센스에 의해 검증됨).
3mm 생검들은 4℃에서 16 내지 24시간 동안 RNAlater(Qiagen reference 76106)에 샘플링 때부터 위치되었다. 다음날, 샘플은 균질화 및 추출 단계를 기다리면서 -20℃에 놓여졌다. 해동시에, 상기 샘플은 용균 버퍼 내로 이동하기 전에 균질화를 촉진시키기 위하여 메스로 절단되었다.
1.5 mL Eppendorf 튜브에서 직접적인 균질화가 가능하도록 RNase 프리 폴리프로필렌 플런저(Fisher Labosi ref A1419753)와 함께 Potter 균질기(Fisher Labosi ref A6391000)를 이용하여 균질화가 수행되었다.
RNA는 제조사의 지시에 따라 RNeasy 마이크로 키트(Qiagen ref: 74004)를 이용하여 추출되었다. RNA 정량화는 리보그린(ribogreen) 어세이(Molecular 프로브s ref R11490)에 의해 수행되었다. Agilent 2100 생분석기에 의해 성질이 확인되었으며, 이는 28S 대 18S 리보좀 RNA의 세기 비율 뿐만 아니라 RIN(RNA Integrity Number)을 제공하였으며, RNA 분해를 고려한다. 성질이 우수한 RNA는 비율 > 1.5 이고 RIN > 7 이다.
역전사효소(RT) 반응이 수행되어, 상응하는 cDNA가 획득되었다. 샘플당 2개의 프로브가 증폭 단계와 함께 50ng의 RNA로부터 합성되었다. cDNA는 플루오로크롬으로 표지되고, Affymetrix® DNA 칩으로 하이브리드화되어, 인간 게놈의 유전자들 전부의 발현 수준을 나타내었다. (Affymetrix U133A 2.0 U133A 2.0 유형 DNA 바이오어레이, 이는 54000개의 프로브들을 함유함, 이는 47000개의 전사물들의 발현이 연구될 수 있도록 함, 이는 38500개의 특징화된 유전자들을 포함함). Affymetrix Microarray suite(Mas 5.0)가 사용되어, 전사물 각각에 대해 검출 신호가 획득되었다. 특이적 하이브리드화의 표출 및 원 데이터의 가공(추출, 백그라운드 노이즈의 삭제, 정규화) 이후에, 유전자 발현이 건강한 피부와 손상된 피부 사이에서 비교되었다.
샘플당 2개의 Affymetrix HG_U133 Plus 2 어레이들이 하이브리드화되었다.
하이브리드화의 성질은 AffyPLM 방법(Bolstad et al., 2005) 및 PCA(principal component analysis) 방법을 이용하여 확인되었다.
2개의 Affymetrix 어레이들이 정확한 하이브리드화 성질을 가졌다면, 환자들은 나머지 분석에 대해서는 보유되기만 하였다. 본 연구를 위해, 처음 15명의 환자들 중 13명이 분석될 수 있었다.
건강한 피부와 화학선 흑색점에 상응하는 피부의 전사체 프로파일을 수행하는 것은, 2개의 상황에서 차등 발현되는 유전자의 리스트가 만들어질 수 있고 화학선 흑색점에 대한 바이오마커가 식별될 수 있다는 것을 의미하였다. 리스트는 LS(병변 피부) 대 US(비손상 피부) 사이의 발현 비율의 형태로 만들어졌다. 13명 환자들의 기하 평균을 나타내는 비율이 보유되었다.
손상 피부와 건강한 피부 사이에 차등 발현된 유전자 리스트의 제조.
단계:
- Affymetrix 식별자(프로브 세트)에 대한 필터: 하나 이상의 생검의 2회 반복검증에서 나타나는 프로브 세트만 보유되었다. 이러한 필터 후에, 23968개의 프로브 세트가 보유되었다.
- 환자 효과의 억제 : 차등 분석(differential analysis)의 결과에서 관찰되는 환자 효과를 억제하기 위하여, 각 프로브 세트의 발현이 4개 어레이들에 상응하는 프로브 세트의 4개 값의 기하 평균에 의해 나누어졌다.
- 차등 분석: 이는 다음과 같은 2개의 방법에 의해 획득한 리스트를 조합함으로써 제조되었다: cNMF 분석(consensus Non Negative Matrix Factorisation)(Lee and Seung (1999), Brunet et al. (2004), Fogel et al. (2007), Fogel et al. (2008)), 이는 식별된 2638개의 프로브 세트(1521개의 유도된 것과 1117개의 억제된 것을 포함함)를 가졌음; 및 PLS(Partial Least Squares Regression)　방법, 이는 식별된 610개의 조정된 프로브 세트를 가졌음. 2개 리스트의 조합은 3248개 프로브 세트의 리스트를 제조하였다.
- 조정( modulation)에 대한 필터 : 유도된(induced) 유전자에 대해, 13개의 CF(corrected fold)의 기하 평균 ≥ 1.5인 프로브 세트의 선택: 562개의 유도된 프로브 세트의 리스트. 억제된(repressed) 유전자에 대해, 13개의 CF(corrected fold)의 기하 평균 ≤ 0.67인 프로브 세트의 선택: 807개의 억제된 프로브 세트의 리스트. 전체: 562 + 807 = 1369개의 조정된 프로브 세트, 즉 중복을 제거한 후에는 1007개의 프로브 세트(1002 cNMF 접근 + 5 PLS 접근).
- 13명 환자들에 대한 필터: 히스토그램의 형태로 1007개 프로브 세트의 조정의 가시화, 및 13명 환자들에게서 동일한 센스로 조정되는 프로브 세트의 선택. 비손상 생검으로부터 병변 생검을 구별하고, 연구의 13명 환자들에게서 동일한 센스로 조정되는, 132개 프로브 세트의 마지막 리스트.
- 1007개 프로브 세트의 리스트의 분석
○ P-값에 대한 필터(≤ 0.00001)
가장 구별되는 유전자들만 보유하기 위하여, 본 발명자들은 1002개 프로브 세트의 리스트에 P-값에 대한 필터를 적용하였다, P ≤ 0.00001. 이와 같은 새로운 필터는 827개의 프로브 세트를 생성하였으며, 여기에 PLS에서 획득된 5개의 프로브 세트가 추가되었다 ⇒ 832개 프로브 세트의 리스트.
주석(annotation) 검색, 주석이 달리지 않은 유전자들의 제거, 및 중복의 제거 이후에, LS와 US 사이에 차등 발현된 437개 유전자의 리스트가 구축되었다. 169개의 유전자들이 AL에서 과발현되었으며, 269개는 저발현되었다.
Gene Ontology, PubMed 및 Scopus 툴을 이용하여, 유전자들의 기능이 조사되었으며, 유전자들은 기능적 패밀리들로 분류되었다.
실시예 3: 조정인자(modulator)
원하는 센스로 흑색점에서 탈조절되는 단백질을 조정하기 위한 알려져 있는 화합물들이 존재한다. 세포외 매트릭스의 유전자/단백질 패밀리에 대해 하기의 것들이 인용될 수 있다:
- 페노피브레이트를 포함하는 피브레이트, 예를 들어 이는 SMAD3의 발현을 감소시킴,
- 옥시마트린을 포함하는 알칼로이드, 이는 SMAD3을 감소시킴, 또는 폴리페놀, 예를 들어 살비아놀산 B, 이는 SMAD3 및 TGFBR2를 감소시킴,
- 천연 추출물, 특히 약초, 예컨대 Wen-pi-tang-hab-wu-ling-san, 이는 SMAD3을 감소시킴,
- 이미다졸 패밀리의 화합물, 이는 TGF-βR1의 안타고니스트임, 예컨대 SB-431542, 이는 SMAD3을 감소시킴,
- 특정 miRNA, 특히 miR183 및 miR29b, 이는 ITGB1을 감소시킴,
- 우로키나제-유형 플라스미노겐 활성화제(uPA)의 억제제, 예컨대 p-아미노벤즈아미딘 또는 B428 4-치환 벤조[b]티오펜-2-카르복사미딘, 이는 PLAU의 활성을 감소시킴,
- 페닐아세테이트 패밀리의 화합물, 예컨대 NaPA, 이는 PLAU의 발현을 감소시킴,
- 티아졸리딘디온 화학적 패밀리의 화합물, 이는 피오글리타존을 포함함, 이는 BMP2 및 COL6A3을 감소시킴,
- 티아졸 화학적 패밀리의 화합물, 이는 예를 들어 GW-0742를 포함함, 이는 BMP2의 발현을 감소시킴,
- 테트라졸 패밀리의 화합물, 예컨대 발사르탄, 이는 TIMP1을 감소시킴.
흑색점에서 저발현되는 세포외 패밀리의 효소적 단백질 PLOD2와 관련하여, 다음과 같은 화합물들이 그 수준을 회복시키기 위해 이용될 수 있다:
- 퀴나졸린 패밀리의 화합물, 예컨대 반데타니브(ZD64745 5), 이는 PLOD2를 증가시킴.
다른 유형의 조정인자들은 또한 탈조절된 단백질의 발현/양 또는 활성을 보정하기 위해 이용될 수 있다. 인용될 수 있는 것들은 다음과 같다:
- 핵산(바람직하게는, 안티센스 RNA 또는 RNAi), 중화 항체,
- 전기적, 빛, 기계적 또는 열적 수단. 일례로서, 저강도 펄스 초음파(low intensity pulsed ultrasound: LIPUS)가 PLOD2의 양 또는 활성을 증가시키기 위해 사용될 수 있다.
반면, 저색소 반점의 경우, 바람직한 조정인자는, 유전자 TGFBR2, TGFBI, BMP2, SMAD3, THBS2, TGFBR3, SEMA5A, SMAD7, EFEMP1, ASPN, PAPLN, CHSY1, MXRA5, LYZ, PLAU, TIMP1, FRAS1, LEPREL1, MATN2, DST, ITGA2, COL6A3, CRTAP, LAMC1, LAMB3, LAMA3, ITGAV, ITGB1 및 ACTN1로부터 획득한 단백질의 활성 또는 발현 수준을 증가시키는 것, 및 유전자 SOSTDC1, ECM1, HS3ST6, FLRT2, CTSL2 및 PLOD2로부터 획득한 단백질의 활성 또는 발현 수준을 감소시키는 것이다.
이러한 조정인자의 예는 또한 표 3에 기재된다.
화학선 흑색점에 관여하는 유전자 조정인자의 리스트
하위-패밀리/기능 명칭 유전자/단백질 조정인자 조정의 센스
TGFB/
SMAD		 TGFBI, 형질전환 성장인자 β-유도체, 68kDa 탈미네랄 골분(DBP) 발현 증가
TGFB/
SMAD
 BMP2, 골형성단백질 2 피오글리타존 발현 감소
GW0742 발현 감소
크리스타타 L 플라보노이드 발현 증가


TGFB/
SMAD

SMAD3, SMAD 패밀리 멤버 3
 페노피브레이트 발현 감소





인산화 감소
옥시마트린
살비아놀산 B (Sal B), Danshen의 성분 (만성 신장 질환에 사용되는 전통 중국 약초), 항산화제 및 세포 보호.
SB-431542 (TβR-I 키나제의 특이적 억제제)
Wen-pi-tang-Hab-Wu-ling-san (WHW) 추출물
TGFB/
SMAD		 TGFBR2, 형질전환 성장인자,
β 수용체 II (70/80kDa)		 살비아놀산 B (SA-B) 발현 감소

TGFB/
SMAD
SMAD7, SMAD 패밀리 멤버 7
 옥시마트린 발현 증가
3-데옥시글루코손 (진행성 당화 최종 산물 전구체)
테트란드린
N-아세틸-세릴-아스파르틸-리실-프롤린 (Ac-SDKP)
콜라겐 COL6A3, 콜라겐, 제VI형, 알파 3 피오글리타존 발현 감소
인테그린 ITGB1, 인테그린, 베타 miR-183, miR-29b 발현 감소
매트릭스 재구축 LYZ, 리소자임
(신장 아밀로이드증)		 뇌하수체 아데닐레이트 시클라아제-활성화 폴리펩티드 (PACAP)
PACAP38		 발현 증가
매트릭스 재구축 TIMP1,
메탈로펩티다제 억제제 1		 발사르탄, (안지오텐신 제II형 1 수용체 차단제 ARB)
루피누스 알부스의 식물 추출물 LU10		 발현 감소
탈미네랄 골분 (DBP) 발현 증가



매트릭스 재구축


PLAU, 플라스미노겐 활성화제, 우로키나제		 소듐 페닐아세테이트 (NaPA) 발현 감소
P-아미노벤즈아미딘 (우로키나제-유형 플라스미노겐 활성화제(uPA) 억제제): B428 4, B392
-치환 벤조[b]티오펜-2-카르복사미딘 (우로키나제-유형 플라스미노겐 활성화제(uPA) 억제제		 활성 감소
티에노피리딘 SR 25989 (혈관형성 억제제) 티클로피딘의 에스테르화된 유도체,
노토진세노사이드 R1 (PANAX 노토진셍에서 획득함)		 발현 증가
동화된 프로테오글리칸 ASPN, 아스포린 레트로졸, 아나스트로졸 발현 증가
기저막 MATN2, 마트릴린 2 비타민 K2 메나퀴논
 발현 증가
콜라겐

 PLOD2 ,
프로콜라겐-리신, 2-옥소글루타레이트 5-디옥시게나아제 2		 베타-아미노프로피온니트릴 (bAPN) 발현 감소
저강도 펄스 초음파 (LIPUS) 발현/활성 증가
반데타니브 (ZD6474 5)
매트릭스 재구축 CTSL2, 카텝신 L2 페닐알라닌 유도체 활성 감소
실시예 4: TGF-베타의 처치에 의한 재구축된 색소 피부의 색소침착의 자극
1) 처치 프로토콜.
TGF-β에 의한 재구축된 색소 피부(RPS)의 처치 프로토콜은 도 1에 도시되어 있다. 이는 하기와 같다:
콜라겐 매트릭스 내 살아있는 섬유아세포를 함유하는 등가 진피(격자)가 페트리 접시의 아래에 부착되었으며(D-4), 3일 동안(도 1에서 D-3, D-2 및 D-1) 200pg/mL의 농도로 TGF-β1(도 1에서 T)에 의해 처치되었다(담체: 4mM의 HCl 및 1mg/mL의 BSA; 매질: 2% FBS를 갖는 MEM 3F'). 다음으로, 색소 표피가 케라티노사이트 및 멜라노사이트의 파종에 의해 상기 등가 진피상에서 재구축되었다(D0). 배양은 1주 동안 침지된 상태로 유지되었으며, 2주 동안 출현되었다(도 1).
샘플이 제거되어 색소침착이 분석되었다:
- 멜라노사이트의 통합 및 형태학은 분리된 표피상에서 도파 반응 이후에 관찰되었음;
- 비색 루미넌스 측정은 샘플의 선명도와 관련된 정보를 제공하였음(L*이 낮을수록, 샘플은 더 어두워짐);
- 멜라닌의 존재는 피부 절편을 폰타나 마손 염색한 이후에 관찰되었음; 및
- 표피 내 존재하는 멜라닌의 양은 이미지 분석에 의해 측정되었음.
2) 결과:
상기 결과는 200pg/mL의 TGF-β1에 의한 처치 및 대조군과의 비교 이후에 하기를 보여준다(도 2 및 3):
- 멜라노사이트는 여전히 표피 내에 존재하며, 정확한 수지상조직 형태를 보유함;
- 멜라닌 증착은 표피에서 더 높음;
- 샘플의 루미넌스는 감소되었음(처치된 재구축된 색소 피부의 갈변(browning));
- 멜라닌의 함량은 폰타나 마손 염색된 절편의 관찰에 의해 시각적으로 증가되었으며, 이미지 분석을 이용한 멜라닌의 정량화에 의해 객관화되었음.
실험은 재차 수행되었으며, 획득한 결과가 확인되었다(도 3).
상기 결과에 의해, TGF-β 신호 경로의 활성화는 TGF-β 신호 경로의 활성화의 부재와 비교할 때 피부의 더 큰 색소침착의 원인이라는 점이 입증된다.
참고문헌 목록
Figure 112013106702082-pct00001

Claims (15)

  1. 알려지거나 의심되는 인간의 피부 색소 반점을 특징화하는 방법으로서,
    상기 반점에서 획득한 피부 샘플 및 인접한 비손상 피부에서 획득한 피부 샘플에서, 하기 리스트 A 또는 B에서 선택되는 세포외 매트릭스에 연관된 하나 이상의 진피 유전자의 진피 세포 내 발현 수준을 비교하는 단계를 포함하는 방법:
    A: 유전자 TGFBR2, TGFBI, BMP2, SMAD3, THBS2, TGFBR3, SEMA5A, SMAD7 및 SOSTDC1로 구성되는 리스트; 또는
    B: 유전자 FRAS1, LEPREL1, MATN2, DST, PLOD2, ITGA2, COL6A3, CRTAP, LAMC1, LAMB3, LAMA3, ITGAV, ITGB1 및 ACTN1로 구성되는 리스트,
    상기에서, 피부 색소 반점은 화학선 흑색점(actinic lentigo)임.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 리스트 A 및 B 중 어느 하나 또는 둘 다에서 선택되는 2개 이상의 개별 유전자의 발현 수준을 비교하는 단계를 포함하는 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 유전자는 유전자 TGFBR2, TGFBI, BMP2, SMAD3, THBS2 및 TGFBR3으로 구성되는 리스트에서 선택된 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 반점은 하기의 경우에 화학선 흑색점으로서 확인되는 것인 방법:
    - 상기 유전자가 TGFBR2, TGFBI, BMP2, SMAD3, THBS2, TGFBR3, SEMA5A, SMAD7, FRAS1, LEPREL1, MATN2, DST, ITGA2, COL6A3, CRTAP, LAMC1, LAMB3, LAMA3, ITGAV, ITGB1 및 ACTN1에서 선택될 때, 인접한 비손상 피부의 샘플의 발현 수준과 비교하여 반점에서 획득한 피부 샘플의 발현 수준이 더 높은 경우; 및
    - 상기 유전자가 SOSTDC1 및 PLOD2에서 선택될 때, 인접한 비손상 피부의 샘플의 발현 수준과 비교하여 반점에서 획득한 피부 샘플의 발현 수준이 더 낮은 경우.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 리스트 A 및 B 중 어느 하나 또는 둘 다에서 선택되는 5개 이상의 개별 유전자의 발현 수준을 비교하는 단계를 포함하는 방법.
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
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