ES2624671T3 - Firma molecular de manchas pigmentarias cutáneas, asociada a la matriz extracelular - Google Patents

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ES2624671T3 ES12722443.4T ES12722443T ES2624671T3 ES 2624671 T3 ES2624671 T3 ES 2624671T3 ES 12722443 T ES12722443 T ES 12722443T ES 2624671 T3 ES2624671 T3 ES 2624671T3
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Françoise Bernerd
Christine Duval
Olivier De Lacharriere
Stéphanie Nouveau
Xavier Marat
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Abstract

Método de caracterización de una mancha pigmentaria cutánea aparente o supuesta en un ser humano, que comprende la comparación de los niveles de expresión, en las muestras de piel proveniente de la dicha mancha y de la piel adyacente no lesionada, dentro de las células de la dermis, de al menos un gen dérmico unido a la matriz extracelular seleccionado entre: A. la lista constituida por los genes TGFBR2, TGFBI, BMP2, SMAD3, THBS2, TGFBR3, SEMA5A, SMAD7 y SOSTDC1, o bien entre B. la lista constituida por los genes FRAS1, LEPREL1, MATN2, DST, PLOD2, ITGA2, COL6A3, CRTAP, LAMC1, LAMB3, LAMA3, ITGAV, ITGB1 y ACTN1, en el que la dicha mancha pigmentaria cutánea es un lentigo actínico.

Description

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DESCRIPCION
Firma molecular de manchas pigmentarias cutaneas, asociada a la matriz extracelular
La presente invencion es en el campo cosmetico, y es relativa a la piel. Esta inscrita mas generalmente en el marco de la caracterizacion de las machas pigmentarias de la piel y del tratamiento de estas manchas.
El color de la piel es debido principalmente a la presencia de un pigmento, la melanina en la epidermis. La melanina es sintetizada por celulas dendriticas espedficas localizadas en la capa basal de la epidermis, los melanocitos. La melanogenesis toma lugar en los organelos, los melanosomas, que, cargados de melanina, son transferidos a las celulas vecinas epidermicas, los queratinocitos, a traves de las dendritas. El color de la piel, o pigmentacion constitutiva vana segun los individuos en funcion de la cantidad de melanina producida asf como de la naturaleza qmmica de las melaninas. Las melaninas son macromoleculas formadas a partir de tirosina (eumelanina) o de tirosina y de cistema (feomelanina). Los mecanismos de smtesis ponen en juego enzimas de las cuales las principales son la tirosinasa y la protema asociada a la tirosinasa (Tyrp-1). Naturalmente, la pigmentacion de la piel es estimulada por la exposicion al sol, esto es, el fenomeno de bronceado.
Existen sin embargo situaciones en donde el proceso de pigmentacion es alterado, y que pueden llegar a defectos de pigmentacion, hipopigmentaciones, (vitiligo, albinismo) o a la inversa de un exceso de pigmentacion, hiperpigmentaciones. Entre los desordenes hiperpigmentarios benignos, caracterizados por una acumulacion anormal (aparte del bronceado) de melanina, se puede citar el lentigo actinico, el melasma, las secuelas pigmentarias de acne, la pigmentacion postinflamatoria, la dermatitis de los prados, la pigmentacion relacionada con la planta venenosa hiedra o aun las discroirnas benignas del rostro.
El lentigo actinico, igualmente denominado lentigo senil o solar, mancha senil, mancha de envejecimiento, o aun comunmente denominado “oscurecimiento senil ", "margaritas de cementerio" o "flores de cementerio", es de lejos la mas frecuente de las lesiones pigmentarias. Este tipo de lesiones aparece en zonas de la piel que han sido fotoexpuestas, tales como el rostro, el dorso de las manos, los miembros superiores y particularmente la cara dorsal de los antebrazos, la espalda, y en particular la parte alta de la espalda. Afectan en general a los individuos a partir de 40 anos. Macroscopicamente, los lentigos actinicos son representados por maculas pigmentadas benignas de color marron mas o menos oscurecido, de las cuales los bordes son netos pero irregulares. De tamano muy variable, pueden extenderse de algunos milfmetros a mas de dos centimetros. A pesar de su gran frecuencia, han sido publicados pocos estudios sobre la fisiologfa y la patogenesis de los lentigos actinicos. Sobre la base de los escasos estudios histologicos existentes, se sabe que existe un aumento de la carga melanica epidermica global y mas particularmente a nivel de la capa basal. Existe igualmente un alargamiento de las crestas epidermicas que pueden tomar un aspecto contundente en la dermis papilar. [Montagna 1980, ber Rahman 1996, Andersen 1997, Cario- Andre 2004]. Finalmente, se puede tener anastomosis entre dos crestas adyacentes que dan un aspecto en punto o en red.
Puede existir igualmente en la dermis una incontinencia pigmentaria con presencia de melanina y de melanofagos. Los tratamientos actuales:
Los problemas pigmentarios cutaneos benignos son generalmente considerados como antiesteticos.
Debido a la asociacion probada entre la aparicion de lentigos actinicos y la exposicion cronica al sol, la prevencion de su aparicion pasa en general por la aplicacion topica de productos llamados fotoprotectores como las pantallas solares. En el caso de tratamientos “curativos”, se han desarrollado por lo tanto numerosos procedimientos, principalmente con fines cosmeticos, con el fin de intentar eliminarlos o reducir su presencia. La eliminacion o la reduccion de la presencia de estos problemas se basa, normalmente, en la aplicacion de tratamientos despigmentantes, basados en la reduccion de la actividad de smtesis de la melanina en los melanocitos. Las moleculas despigmentantes interfieren con uno o mas de las etapas de la melanogenesis. Una de las formas de los principales productos utilizados hasta ahora se basa en la inhibicion de la tirosinasa, una de las enzimas claves de los procesos de la melanogenesis. El objeto de estos tratamientos es disminuir, incluso detener, la smtesis de pigmento.
Las principales sustancias despigmentantes conocidas son la hidroquinona y sus derivados, el acido koyico, la arbutina, los iminofenoles, el acido ascorbico y sus derivados, la asociacion de carnitina y de quinona, los derivados de aminofenol, y los derivados de benzotiazol, extractos naturales, corticoides. Se encuentran a menudo tambien asociados a estos ingredientes activos exfoliantes que permiten aumentar la descamacion, y asf eliminar mas facilmente la melanina presente en el stratum corneum.
Otro metodo de tratamiento no cosmetico consiste en destruir las lesiones por medios tisicos o qmmicos utilizando laseres o descamadores. Sin embargo, estos son procedimientos demasiado rudos que no atacan la etiologfa del desorden. En la mayona de los casos los lentigos actinicos reaparecen algun tiempo despues del tratamiento.
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Por otro lado, existen inconvenientes mayores a los tratamientos existentes. Las sustancias despigmentantes pueden presentar particularmente una cierta inestabilidad, una baja eficacia con baja concentracion, una actividad biologica que afecta otras funciones, propiedades toxicas o alergizantes.
Ademas debido a que no se dirigen a la causa profunda que ha ocasionado el desarreglo de la pigmentacion, existe una gran heterogeneidad de respuesta a los diferentes tratamientos despigmentantes. Asf, para un tratamiento dado, administrado por ejemplo de manera topica, un problema pigmentario cutaneo benigno dado, como un lentigo actmico o un melasma, puede atenuarse o desaparecer, mientras que otro no evolucionara. Esta variabilidad puede ser observada entre lesiones en individuos diferentes pero tambien en un mismo individuo, entre diferentes lesiones. Existen por lo tanto problemas pigmentarios cutaneos benignos para los cuales ningun tratamiento topico es eficaz hasta ahora.
Existe por lo tanto una necesidad de encontrar tratamientos mas eficaces y mas inofensivos para este tipo de lesion.
Por esto, es necesario identificar las desregulaciones moleculares y las disfunciones funcionales que pueden existir en este tipo de desorden pigmentario con el fin de poder identificar nuevos objetivos y seleccionar los principios activos que corrigen estos defectos.
En el arte anterior, concerniente al tratamiento de las manchas pigmentarias y mas particularmente los lentigos actmicos, se describe la estimulacion a nivel genomico o protemico de moleculas que estan estrechamente asociadas a los melanocitos y a la melanogenesis (enzimas de la melanogenesis, protema del melanosoma, factores paracrinos claves de la melanogenesis). Se encuentra en la epidermis o la dermis para las siguientes protemas: Tirosinasa, TRP1, DCT, Pmel-17, POMC, ET1, ETBR, SCF, c-KIT, KGF, KGFR, Factor de Crecimiento de Hepatocitos (HGF), MIA, TRPM1, Melan-A, Dilucion de Ojo Rosa, P53 e IL1a.
Por otra parte, otros estudios describen modificaciones moleculares o celulares en el lentigo solar o senil por analisis de la expresion de los genes o de las protemas. Sin embargo, estos diferentes estudios no desprenden ningun mecanismo o disfuncion funcional general que sustente la aparicion de las manchas pigmentarias.
Ningun documento del arte anterior ha permitido poner en evidencia de manera fiable las desregulaciones moleculares o de las disfunciones funcionales que puedan existir en este tipo de desorden despigmentario, o mas alla de las moleculas estrechamente asociadas a los melanocitos y la melanogenesis.
Los presentes inventores han puesto en evidencia por primera vez la implicacion de los genes dermicos unidos a la matriz extracelular y a la union dermoepidermica en los desarreglos pigmentarios que se traducen en manchas pigmentarias de la piel, y particularmente la implicacion de los genes ligados a la ruta de senalizacion TGF-beta- SMAD.
La matriz extracelular asegura a nivel de la piel un papel estructural gracias a su capacidad para asegurar el soporte y la cohesion de los tejidos y las celulas y gracias a sus propiedades mecanicas que le permiten hacer resistencia a la traccion (particularmente debido a la presencia de colagenos), a la compresion (particularmente debido a la presencia de proteoglicanos).
La misma juega un papel biologico importante pues es tambien un actor principal de la regulacion de la homeostasis epidermica y dermica. Gracias, entre otras, a sus propiedades de deposito de factores de crecimiento y de citoquinas, esta implicada en la morfogenesis, la proliferacion, la diferenciacion celular, y la reparacion de los tejidos.
La union dermoepidermica (JDE) en cuanto a sf misma es realizada por la membrana basal que esta constituida de una hoja de matriz extracelular y que separa la epidermis de la dermis. Constituye una barrera de permeabilidad y regula los intercambios de moleculas, en particular de nutrientes, entre los dos tejidos. La misma asegura una funcion de adhesion y de anclaje de la epidermis a la matriz subyacente y de cohesion estructural del epitelio. La misma juega tambien un papel importante en la regulacion de la diferenciacion, y de la migracion de las celulas epidermicas asf como de las etapas de morfogenesis de la epidermis.
El factor de crecimiento transformante beta (TGF-p) controla la proliferacion, la diferenciacion celular, y otras funciones en la mayor parte de las celulas. La misma juega un papel en la inmunidad, el cancer.
Algunas celulas secretan los TGF-p, y tienen tambien receptores para el TGF-p. Los Smad comprenden la ruta de senalizacion de TGF-p. Permiten la transduccion de la senal cuando el TGF-p se une a los receptores de membrana. Las respuestas celulares inducidas por esta ruta pueden variar para un mismo tipo celular segun el contexto celular. Es un sistema de senalizacion muy dinamico.
En la ruta canonica, el TGF-p se une a un receptor de membrana de tipo II que forma un complejo bidermico con un segundo receptor de tipo I. Un receptor de tipo III (betaglicano) ayuda a este proceso de union captando TGF-p y presentandolo al complejo receptor bidermico. El receptor de tipo II, unido a TGF-p, fosforila el receptor de tipo I que propaga la senal fosforilando a su vez las protemas citosolicas, los Smad (Smad 2 y 3). Los Smad regulados por el
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receptor de tipo I (R-Smad) se unen entonces a un Smad comun, Smad 4 para componer un complejo activado. Este complejo entra en el nucleo celular en donde actua como factor de transcripcion de multiples genes, y conduce a una respuesta de activacion o de represion.
Los receptores de tipo I espedficos, activados por otros ligandos tales como diversas BMP (protemas morfogenicas oseas) activan la ruta de senalizacion por medio de otros Smad (1, 5, 8).
De una manera general, la activacion de la ruta conduce tambien a la estimulacion de Smad inhibidores tales como los Smad 6 y 7 que aseguran un retrocontrol negativo.
Entre los genes diana de la ruta TGF-beta, figuran numerosos genes que codifican para moleculas de la matriz extracelular, entre ellos, por ejemplo los colagenos, elastina, fibronectina, las trombospondinas que aseguran principalmente un papel de estructura, y simultaneamente, para protemas de remodelacion de matrices que participan en la renovacion y en la degradacion de las moleculas de la matriz.
Esta ruta tiene tambien una accion estimuladora o inhibidora en la produccion de numerosos factores de crecimiento y de citoquinas por las celulas dermicas.
Por primera vez, se ha mostrado por los presentes inventores que algunos genes unidos a la matriz extracelular o a la union dermoepidermica y particularmente a la ruta de senalizacion TGF-p-SMAD, tienen niveles de transcripcion significativamente diferentes entre la piel sana y la piel proveniente de una macha pigmentaria, poniendo asf en evidencia la union entre la desregularizacion en el interior de la matriz extracelular y de la union dermoepidermica, particularmente la desregulacion de la senalizacion de TGF-p-SMAD, y la modulacion de la pigmentacion que inducen particularmente la aparicion de manchas pigmentarias.
Se puede pensar que el aumento y la disminucion de ciertas protemas implicadas en estas diferentes rutas, sean dependientes de TGF-p, sean de los BMP, pueden conducir a una senalizacion acrecentada y/o aberrante que pueden perturbar la homeostasis termica, de las uniones y repercutir globalmente a nivel epidermico.
Sin limitarse por lo tanto por una teona cualquiera, las modificaciones de expresion de diferentes genes unidos a esta matriz extracelular y a la union dermoepidermica han conducido a los inventores a pensar que, debido al papel jugado por las protemas de la matriz y de la union dermoepidermica, la desregulacion de estos genes, signo de una modificacion de todo el compartimiento dermico, perturba la homeostasis de la epidermis y genera modificaciones importantes en particular de la arquitectura histologica de la epidermis en las manchas pigmentarias (elongacion de las crestas epidermicas en la dermis por ejemplo). En consecuencia, la carga melanica epidermica se aumenta y da lugar a las manchas pigmentarias.
Se describe una firma molecular representativa de las diferencias de expresion genica existente entre la piel proveniente de mancha pigmentaria y la piel sana adyacente, y a las diferentes aplicaciones y metodos que hacen uso del conocimiento de esta firma, particularmente para modular la pigmentacion de la piel, en el tratamiento cosmetico de las machas pigmentarias o para uniformizar la tez u homogenizar el color de la piel.
Esta firma esta constituida de los siguientes genes: TGFBR2 (receptor II del factor de crecimiento transformante beta [70/80 kDa]), TGFBI (factor de crecimiento transformante beta inducido, 68 kDa), BMP2 (protema morfogenica osea 2), SMAD3 (miembro 3 de la familia SMAD), THBS2 (trombospondina 2), TGFBR3 (receptor III del factor de crecimiento transformante), SEMA5A (dominio sema, 7 repeticiones trombospondina, semaforina 5A), SMAD7 (miembro 7 de la familia SMAD), SOSTDC1 (protema 1 que contiene un dominio para esclerostina), FRAS1 (smdrome 1 de Fraser), LEPREL1 (1 similar a leprecan), MATN2 (matrilina 2), DST (Distonina, conocida igualmente bajo el nombre de BPAG1 PLOD2 (procolageno-lisina, 2-oxoglutarato 5-dioxigenasa 2), ITGA2 (integrina alfa 2 (CD49B, subunidad alfa 2 del receptor VLA-2)), COL6A3 (colageno de tipo 6, alfa 3), CRTAP (protema asociada al cartflago igualmente conocida bajo el nombre de LEPREL3), LAMC1 (laminina gamma 1, antiguamente LAMB2), LAMB3 (laminina beta 3), LAMA3 (laminina alfa 3), ITGAV (integrina alfa V (receptor vitronectina)), ITGB1 (integrina beta 1) y ACTN1 (actinina alfa 1). El gen ITGB1 puede ser excluido de esta lista. El gen SEMA5A y/o el gen ITGB1 pueden ser excluidos de esta lista.
Estos genes pueden ser reagrupados funcionalmente de la siguiente manera:
- Lista A: Genes que codifican para los factores implicados en la activacion de la ruta de senalizacion TGF-beta- SMAD: TGFBR2, TGFBI, BMP2, SMAD3, THBS2, TGFBR3, SEMA5A, SMAD7 y SOSTDC1, el gen SEMA5A que puede sin embargo ser excluido de esta lista A, y
- Lista B, que reagrupa los genes FRAS1, LEPREL1, MATN2, DST, PLOD2, ITGA2, COL6A3, CRTAP, LAMC1, LAMB3, LAMA3, ITgAv, ITGB1 y ACTN1. El gen ITGB1 esta eventualmente excluido de esta lista B. Entre la lista B, en los agrupamientos funcionales siguientes pueden ser efectuados:
- genes que codifican para colagenos, compuestos de la matriz extracelular, y mas particularmente los colagenos
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filamentosos del estroma o para moleculas asociadas a la biosmtesis y al ensamblaje de los colagenos: LEPREL1, PLOD2, COL6A3 y CRTAP;
- genes que codifican para lamininas, protemas adhesivas de la matriz extracelular: LAMC1, LAMB3 y LAMA3;
- genes que codifican para protemas de matriz asociadas a la zona de la membrana basal: FRAS1, MATN2 y DST;
- genes que codifican para las integrinas implicadas en la union de las celulas a la matriz extracelular: ITGA2 e ITGAV, con eventualmente ITGB1; y
- gen que codifica para una actina, compuesto de la matriz extracelular: ACTN1.
Los genes preferidos del interior de los genes dermicos TGFBR2, TGFBI, BMP2, SMAD3, THBS2, TGFBR3, SEMA5A, SMAD7 y SOSTDC1, que constituyen la lista A, son los genes TGFBR2, TGFBI, BMP2, SMAD3, THBS2 y TGFBR3.
Los genes preferidos al interior de los genes dermicos FRAS1, LEPREL1, MATN2, DST, PLOD2, ITGA2, OL6A3, CRTAP, LAMC1, LAMB3, LAMA3, ITGAV, ITGB1 y ACTN1, que constituyen la lista B, son los genes FRAS1, LEPREL1, MATN2, DST, PLOD2 y ITGA2.
Los dichos genes se extienden a partir de los genes humanos denominados asr
La lista de los genes A y B estan por otro lado ligadas por el numero de interacciones conocidos entre los diversos genes que constituyen estas listas. Estas uniones pueden particularmente ser puestas en evidencia por una red de interacciones tal como generadas por ejemplo por el programa informativo IPA (Analisis de Ruta de Ingenuidad) que, a partir de datos bibliograficos, permite mostrar las diferentes uniones directas o indirectas existentes entre genes o protemas. Una red de interaccion generada por este programa informatico IPA ha mostrado en efecto una union, directa o indirecta, entre los genes y/o protemas TgFbR2, TGFBR3, SMAD3, SMAD7, BMP2, THBS2 (lista A) y MATN2, DST, ITGA2, COL6A3, LAMC1, LAMB3, ITGAV, ITGB1, ACTN1 (lista B).
Por otro lado, diferentes referencias bibliograficas ilustran igualmente las interacciones directas entre los genes mencionados en la lista A y los mencionados en la lista B, que concretizan asf la union funcional uniendo estas dos familias, particularmente entre los genes SMAD3 y COL6A3 (Verrecchia et al, 2001), entre los genes TGFBR2, THBS2 y COL6A3 (Berking et al, 2001) y entre SMAD3 y LAMC1 (Kawata et al, 2002), a tftulo ilustrativo.
Los inventores han puesto en efecto en evidencia la modulacion significativa y reproductible del nivel de expresion de los genes de las listas A y B entre la piel proveniente de la mancha pigmentaria y de la piel sana correspondiente.
Por otro lado, la modulacion de los genes de la lista A, implicados en la ruta de senalizacion TGF-p al interior de manchas hiperpigmentarias tiende al aumento de la senalizacion TGF-p-SMAD. Las modulaciones observadas para los genes de la lista A ponen por lo tanto en evidencia la union entre la activacion/estimulacion de la ruta de senalizacion TGF-p-SMAD y aumento de la pigmentacion, como es verificado por los inventores en el presente ejemplo 4.
Segun un primer aspecto se describe un metodo de caracterizacion de una mancha pigmentaria cutanea. La presente invencion se relaciona con un metodo de caracterizacion de una mancha pigmentaria de tipo lentigo actmico tal como se define en la reivindicacion 1.
Un tal metodo permite entre otros confirmar la naturaleza de la mancha pigmentaria en el caso en donde esta ultima es ya evidente, por ejemplo visualmente a simple vista. El metodo permite igualmente predecir la aparicion de una mancha, cuando esta ultima no es aun observada sino unicamente supuesta, o bien concluir que una piel se inclina a la formacion de manchas cutaneas o esta sujeta a defectos de pigmentacion, por ejemplo cuando ninguna mancha es aun evidente.
Las manchas pigmentarias cutaneas concernientes son manchas hiperpigmentarias, o aun llamadas hiperpigmentadas, correspondientes a un exceso de pigmento, o bien manchas hipopigmentarias, o aun hipopigmentadas, correspondientes a los defectos de pigmentacion. Las hipopigmentaciones son particularmente el vitiligo y el albinismo. Estos desordenes hiperpigmentarios benignos caracterizados por una acumulacion anormal (aparte del bronceado) de melanina, son por ejemplo el lentigo actmico, el melasma, las secuelas pigmentarias de acne, la pigmentacion postinflamatoria, la dermatitis de los prados, la pigmentacion ligada a la planta venenosa hiedra e incluso las discroirnas benignas del rostro. Las manchas pigmentarias engloban igualmente los defectos, imperfecciones o irregularidades de pigmentacion que hacen la tincion no uniforme, o el color de la piel no homogeneo.
Las manchas pigmentarias en cuestion son preferencialmente manchas pigmentarias de la piel humana. Sin embargo, siendo totalmente generales los desordenes a nivel de la matriz extracelular y de la ruta de senalizacion
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TGF-p-SMAD en la dermis puesta en evidencia por los presentes inventores, pueden preverse metodos similares para otras especies animales afectadas igualmente por las manchas pigmentarias. En este caso, los diferentes metodos, utilizaciones o composiciones seran utilizados con los genes de la especie considerada, ortologos a los genes humanos mencionados anteriormente.
Los metodos comprenden la comparacion de los niveles de expresion en el interior de la piel proveniente de la dicha mancha y el interior de la piel no lesionada, preferiblemente adyacente, del mismo individuo, de al menos un gen dermico unido a la matriz extracelular escogida entre la lista constituida de los genes TGFBR2, TGFBI, BMP2, SMAD3, THBS2, TGFBR3, SEMA5A, SMAD7, SOSTDC1, FRAS1, LEPREL1, MATN2, DST, PLOD2, ITGA2, COL6A3, CRTAP, LAMC1, LAMB3, LAMA3, ITGAV, ITGB1 y ACTN1. Alternativamente, el gen dermico puede ser escogido entre la lista A constituido de genes unidos a la ruta de senalizacion TGF-p-SMAD; o bien entre la lista B constituida de los genes FRAS1, LEPREL1, MATN2, DST, PLOD2, ITGA2, COL6A3, CRTAP, LAMC1, LAMB3, LAMA3, ITGAV y ACTN1. Segun algunas utilizaciones SEMA5A es excluida de estas listas. Puede alternativa o adicionalmente ser el mismo para el gen ITGB1. Los genes TGFBR2, TGFBI, BMP2, SMAD3, THBS2, TGFBR3, SEMA5A, SMAD7, SOSTDC1, FRAS1, LEPREL1, MATN2, DST, PLOD2, ITGA2, COL6A3, CRTAP, LAMC1, LAMB3, LAMA3, ITGAV, ITGB1 y ACTN1 que comparten un rol en la estructura ITGAV, ITGB1 y ACTN1 que comparten un rol en la estructura o la renovacion de la matriz extracelular, particularmente se trata de genes implicados en la activacion de la ruta de senalizacion TGF-p-SMAD, o genes que codifican para los compuestos de la matriz extracelular o genes que codifican para las protemas implicadas en la smtesis de los compuestos de esta matriz, o bien unidos a la renovacion de esta matriz conjuntiva o aun de genes que codifican para protemas de matriz asociadas a la union dermoepidermica y a la zona de la membrana basal.
Por otro lado, los dichos genes son llamados genes dermicos debido a que se trata de genes expresados principalmente en la dermis y que dan lugar a protemas caractensticas del compartimiento dermico o bien de la union dermoepidermica en cuanto a su cara dermica; y esto por oposicion por ejemplo a las protemas queratinocitarias, protemas intracelulares o protemas epidermicas particularmente, tales como las protemas expresadas preferentemente en el stratum corneum.
Los niveles de expresion de uno al menos de los genes son medidos a nivel de la piel proveniente de la mancha probada o supuesta, y a nivel de la piel adyacente no lesionada. Preferiblemente, los niveles son medidos en muestras de piel prelavadas al interior de la mancha y al interior de una zona adyacente no lesionada. Las muestras son por ejemplo de biopsias de piel. Son suficientes biopsias de algunos milfmetros de diametro, por ejemplo una biopsia de 2 mm, o bien 3 mm de diametro. Se puede considerar igualmente la escision total de una lesion.
Los niveles de expresion de los genes de la invencion se extienden desde los niveles de expresion al interior de las celulas de la dermis de la piel o de la muestra en estudio.
La zona no lesionada es preferiblemente una zona adyacente tan cercana como sea posible de la mancha pero con una distancia suficiente para que la zona o la muestra recogida no contenga ninguna celula susceptible de pertenecer a la mancha pigmentaria. Preferiblemente, la zona adyacente no lesionada es una zona que tiene una exposicion a la luz y al sol comparable a la zona de la mancha pigmentaria. Alternativamente, la zona no lesionada puede provenir de una zona simetrica sobre la otra parte del sujeto, que tiene un emplazamiento perfectamente identico; por ejemplo en el caso de una mancha en la mano izquierda, la zona no lesionada puede ser la zona correspondiente en la mano derecha. En este caso, la zona no lesionada no es una zona adyacente propiamente dicha. Por no lesionada, se entiende una zona que no posee mancha pigmentaria, ni irregularidad pigmentaria, preferiblemente una zona homogenea en terminos de pigmentacion.
Debido a que la zona no lesionada sirve de referencia, en todos los casos tambien debe ser comparable tanto como sea posible a la zona de la mancha, pero desprovista de defecto pigmentario.
Por nivel de expresion de un gen, se entiende preferiblemente, en la presente descripcion, el nivel de transcripcion del dicho gen. Sin embargo, su nivel de expresion puede igualmente traducirse por su nivel de traduccion, al suponer sin embargo que se trata de un gen que codifica para una protema. Tal es el caso para los genes de la invencion.
Con relacion a la evaluacion del nivel de transcripcion del gen seleccionado, puede ser realizada por diferentes maneras bien conocidas del experto en el arte, directamente o bien despues de la transcripcion inversa. El nivel de transcripcion puede ser evaluado particularmente por la utilizacion de kits de ARN o chips de ADN vendidos en el comercio para este efecto. Un metodo de evaluacion posible se describe en la parte experimental.
Es importante resaltar igualmente que el metodo segun la invencion implica la comparacion de los niveles de expresion de al menos uno de los genes de la lista A o de la lista B. Por este hecho, puede ser suficiente evaluar cuantitativamente o cualitativamente la diferencia entre los dos niveles de expresion, sin por lo tanto evaluar y cuantificar individualmente cada uno de los niveles de expresion.
Los niveles de expresion de al menos uno de los dichos genes pueden ser evaluados por referencia o despues de la normalizacion con el nivel de expresion de otros genes, de los cuales el nivel de expresion se supone sensiblemente
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identico al interior de la mancha y en la zona escogida de piel no lesionada. Tales genes para la normalizacion son bien conocidos del experto en el arte y pueden depender de la zona del cuerpo en donde se encuentra la mancha. A tftulo de ejemplo, los siguientes genes pueden ser citados como susceptibles de servir a la normalizacion de los niveles de expresion de los genes descritos, que codifican para:
La protema ribosomica L13a (RPL13A), la beta-2-microglobulina (B2M), la protema ribosomica S9 (RPS9), la protema ribosomica S28 (RPS28) y la gliceraldetndo-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH).
El metodo segun la invencion se practica in vitro o bien ex vivo.
Segun un modo de realizacion del metodo de la invencion, la mancha pigmentaria es una mancha no patologica, benigna, particularmente por oposicion a las lesiones patologicas tales como los nevus; puede tratarse de una irregularidad en la pigmentacion de la piel.
Preferiblemente, un metodo tal como se describe comprende la comparacion de los niveles de expresion de al menos dos genes distintos entre los genes descritos, preferiblemente de al menos tres genes distintos, incluso cinco genes distintos. Es igualmente considerable comparar los niveles de expresion de al menos 6 genes, incluso de al menos 8 genes distintos o bien de 10, 12, 15, 20 o bien de todos los genes descritos.
Segun una utilizacion, los genes distintos se escogen en entre de los genes TGFBR2, TGFBI, BMP2, SMAD3, THBS2, TGFBR3, SEMA5A, SMAD7 y SOSTDC1, o bien entre TGFBR2, TGFBI, BMP2, SMAD3, THBS2, TGFBR3, SMAD7 y SOSTDC1.
Cuando se seleccionan dos genes, son seleccionados preferiblemente entre las listas de los 6 genes preferidos siguientes: TGFBR2, TGFBI, BMP2, SMAD3, THBS2 y TGFBR3. Por ejemplo, los genes seleccionados pueden ser TGFBR2 y TGFBI, o bien TGFBR2 y BMP2, o bien TGFBI y BMP2, o bien TGFBR2 y TGFBR3. Todas las combinaciones dos a dos, entre los 6 genes preferidos, son combinaciones preferenciales para la utilizacion de la invencion. Incluso todas las combinaciones implican uno de los 6 genes preferidos y uno de los otros genes de la lista A, son preferidas particularmente.
Para las combinaciones de 3 genes, estan particularmente previstas las siguientes combinaciones: TGFBR2, TGFBI y BMP2; TGFBR2, TGFBI y SMAD3; TGFBR2, TGFBI y TGFBR3; SMAD3, SEMA5A y SMAD7; TGFBR2, MP2 y SOSTDC1; y TGFBI, BMP2 y SMAD3. Las combinaciones de 5 genes previsibles segun la presente invencion son particularmente las siguientes combinaciones: TGFBR2, TGFBI, BMP2, SMAD3 y THBS2; TGFBR2, TGFBI, BMP2, SMAD3 y TGFBR3; y TGFBR2, TGFBI, BMP2, THBS2 y TGFBR3.
Una combinacion particular es la que comprende los genes TGFBR2, TGFBI, BMP2, SMAD3, THBS2, TGFBR3, SEMA5A y SMAD7, que tienen como punto comun ser modulados de la misma manera, particularmente de ser sobreexpresados en el interior de manchas hiperpigmentarias, y de estar implicados en la ruta de senalizacion TGF- beta-SMAD. Otras combinaciones son igualmente previsibles en el interior de la presente invencion, particularmente las combinaciones que comprenden al menos un gen entre TGFBR2, TGFBI, THBS2 y TGFBR3; y al menos un gen entre SMAD3, SEMA5A y SMAD7.
Los genes TGFBR2, TGFBI, BMP2, SMAD3, THBS2, TGFBR3, SEMA5A, SMAD7 y SOSTDC1 tienen como punto comun pertenecer a la ruta de senalizacion TGF-p-SMAD y ser modulados de manera cooperativa a nivel de manchas pigmentarias, es decir que los genes TGFBR2, tGfBI, BMP2, SMAD3, THBS2, tGfBR3, SEMA5A y SMAD7, que estan positivamente implicados en esta ruta de senalizacion estan todos modulados en el mismo sentido y estan modulados en el sentido inverso de los genes SOSTDC1 que es un antagonista de BMP y por lo tanto negativamente implicado en esta ruta de senalizacion.
Segun otro empleo, los distintos genes son seleccionados en el interior de los genes de la lista B, o bien entre la lista de 6 genes preferidos siguientes: FRAS1, LEPREL1, MATN2, DST, PLOD2 y ITGA2. Por ejemplo, los genes seleccionados pueden ser FRAS1 y LEPREL1, o bien FRAS1 y MATN2, o bien LEPREL y MaTn2, o bien DST y PLOD2. Todas las combinaciones dos a dos, entre los 6 genes preferidos FRAS1, LEPREL1, MATN2, DST, PLOd2 e ITGA2, son combinaciones preferenciales para el empleo de la invencion.
Igualmente, todas las combinaciones que implican uno de los 6 genes preferidos y uno de los otros genes de la lista B son preferidas particularmente.
Para las combinaciones de 3 genes, estan particularmente previstas las siguientes combinaciones: FRAS1, LEPREL1 y MATN2; FRAS1, LEPREL1 y DST; FRAS1, LEPREL1 y PLOD2; FRAS1, MATN2, y PLOD2; LEPREL1, MATN2 y PLOD2.
Las combinaciones de 5 genes previsibles segun la presente invencion son particularmente las combinaciones siguientes: FRAS1, LEPREL1, MATN2, DST y PLOD2; FRAS1, LEPREL1, MATN2, DST y ITGA2; FRAS1, LEPREL1, MATN2, PLOD2 e ITGA2.
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Una combinacion particular es la constituida con los genes FRAS1, LEPREL1, MATN2, DST, ITGA2, COL6A3, CRTAP, LAMC1, LaMB3, LAMA3, ITGAV y ACTN1, que tienen como punto comun, ser modulados de la misma manera, particularmente ser sobreexpresados en el interior de manchas hiperpigmentarias.
Otras combinaciones son igualmente previsibles, particularmente combinaciones que comprenden al menos un gen entre los que pertenecen a la familia de los colagenos, es decir entre LEPREL1, PLOD2, COL6A3 y CRTAP; al menos un gen entre los que pertenecen a la familia de las lamininas, es decir entre LAMC1, LAMB3 y LAMA3; al menos un gen entre los que codifican para protemas de matriz asociadas a la zona de la membrana basal, es decir entre FRAS1, MATN2 y DST; al menos un gen de la familia de las integrinas, es decir entre ITGA2 y ITGAV, y eventualmente ITGB1; y el gen ACTN1.
Alternativamente, segun un empleo preferido de la invencion, el gen cuyo nivel de expresion es comparado entre la piel lesionada y la piel sana, preferiblemente adyacente, se selecciona entre el subgrupo constituido de los genes LEPREL1, PLOD2, COL6A3 y CRTAP. En efecto, estos genes tienen como punto comun, pertenecer a la familia de los colagenos, particularmente a la familia de los colagenos fibrilares del estroma.
Otras combinaciones son igualmente previsibles dentro de la presente invencion, particularmente las combinaciones que comprenden al menos un gen entre FRAS1, LEPREL1, MATN2, DST, ITGA2, COL6A3, CRTAP, LAMC1, LAMB3, LAMA3, ITGAV y ACTN1; y el gen PLOD2.
Se preven otras combinaciones, particularmente combinaciones que comprenden al menos un gen entre los implicados en la ruta de senalizacion TGF-beta-SMAD, es decir entre la lista A y al menos un gen entre la lista B, y preferiblemente entre FRAS1, LEPREL1, MATN2, DST, PLOD2 e ITGA2. Por ejemplo, una combinacion prevista es la constituida de al menos dos genes entre TGFBR2, TGFBI, BMP2, SMAD3, THBS2, TGFBR3, SEMA5A, SMAD7, FRAS1, LEPREL1, MATN2, DST, ITGA2, COL6A3, CRTAP, LAMC1, LAMB3, LAMA3, ITGAV y ACTN1 que tiene como punto comun ser expresado dentro de manchas hiperpigmentarias.
Otras combinaciones son particularmente combinaciones de 2 genes, uno proveniente de la lista A, y el otro proveniente de la lista B, combinaciones de 3 genes de los cuales dos en la lista A y uno en la lista B, o a la inversa; las combinaciones de 4 genes con 2 en cada una de las listas, o bien tres en la lista A y en la lista B o a la inversa.
Una combinacion de 2 genes particularmente preferida es la combinacion de genes TGFBR2 y MATN2. Las combinaciones de 3 genes preferidos son particularmente la combinacion TGFBR2, BMP2 y MATN2 y la combinacion TGFBR2, MATN2 y LEPREL1. Las combinaciones de 4 genes preferidos son particularmente la combinacion TGFBR2, BMP2, SMAD3 y MATN2; la combinacion TGFBR2, MATN2, LEPREL1 y PLOD2; y la combinacion TGFBR2, BMP2, MATN2 y LEPREL1.
Todas las combinaciones o subgrupos de genes espedficos preferidas en relacion con este aspecto de la descripcion son igualmente preferidas para los otros aspectos de la descripcion.
La utilizacion del metodo descrito conduce a la conclusion que la mancha supuesta u observada es una mancha hiperpigmentaria si el nivel de expresion es
- superior en la piel proveniente de la mancha, o en la muestra de piel proveniente de la macha, con respecto al nivel en la piel adyacente no lesionada, o en la muestra de piel adyacente no lesionada, si el gen se escoge entre TGFBR2, TGFBI, BMP2, SMAD3, THBS2, TGFBR3, SEMA5A, SMAD7, FRAS1, LEPREL1, MATN2, DST, ITGA2, COL6A3, CRTAP, LAMC1, LAMB3, LAMA3, ITGAV, ITGB1 y ACTN1, y
- inferior en la piel proveniente de la mancha o en la muestra de la piel proveniente de la macha, con respecto al nivel en la piel adyacente no lesionada, o en la muestra de piel adyacente no lesionada, si el gen se escoge entre OSTDC1 y PLOD2.
En efecto, los presentes inventores han puesto en evidencia la sobreexpresion de los genes TGFBR2, TGFBI, BMP2, SMAD3, THBS2, TGFBR3, SEMA5A, SMAD7, FRAS1, LEPREL1, MATN2, DST, ITGA2, COL6A3, CRTAP, LAMC1, LAMB3, LAMA3, ITGAV, ITGB1 y ACTN1 en la piel proveniente de la macha hiperpigmentaria, particularmente de lentigo actmico, con relacion al nivel de expresion en la piel adyacente no lesionada. Han puesto igualmente en evidencia la sobreexpresion de los genes SOSTDC1 y PLOD2 en la piel proveniente de mancha hiperpigmentaria, particularmente de lentigo actmico, con respecto al nivel de expresion en la piel adyacente no lesionada.
A la inversa, la utilizacion del metodo descrito conduce a la conclusion de que la muestra supuesta u observada es una macha hiperpigmentaria si el nivel de expresion es:
- inferior en la piel proveniente de la mancha, o en la muestra de piel proveniente de la mancha, con respecto al nivel en la piel adyacente no lesionada, o en la muestra de piel adyacente no lesionada, si el gen se escoge entre
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TGFBR2, TGFBI, BMP2, SMAD3, THBS2, TGFBR3, SEMA5A, SMAD7, FRAS1, LEPREL1, MATN2, DST, ITGA2, COL6A3, CRTAP, LAMC1, LAMB3, LAMA3, ITGAV, ITGB1 y ACTN1, y
- superior en la piel proveniente de la mancha, o en la muestra de piel proveniente de la mancha, con respecto al nivel en la piel adyacente no lesionada o en la muestra de piel adyacente no lesionada si el gen se escoge entre SOSTDC1 y PLOD2.
Por superior o inferior, se entiende una diferencia de nivel de expresion que es estadfsticamente significativo, superior al ruido y reproducible. Por ejemplo, la diferencia del nivel de expresion es de al menos 10%, es decir que si el nivel de expresion de un gen de la invencion en la piel no lesionada se fija en 1, la tasa de modulacion es de al menos 1,1 para un gen sobreexpresado en la piel lesionada y de al menos 0.9 para un gen sobreexpresado en la piel de la lesion.
Preferiblemente, el metodo descrito se emplea con al menos dos genes, el uno pertenece a la categona de los genes sobreexpresados en las machas hiperpigmentarias, y subexpresado en las manchas hipopigmentarias, y el otro pertenece a la categona de los genes modulados a la inversa del primero en las manchas pigmentarias. Preferiblemente el metodo se emplea con al menos tres genes: dos genes escogidos entre TGFBR2, TGFBI, BMP2, SMAD3, THBS2, TGFBR3, SEMA5A, SMAD7, FRAS1, LEPREL1, MATN2, DST, ITGA2, COL6A3, CRTAP, LAMC1, LAMB3, LAMA3, ITGAV, ITGB1 y ACTN1, y un gen escogido entre SOSTDC1 y PLOD2, modulado a la inversa de los dos primeros en las manchas pigmentarias, o bien dos genes seleccionados entre TGFBR2, TGFBI, BMP2, SMAD3, THBS2, TGFBR3, SEMA5A y SMAD7, y el gen SOSTDC1; o bien dos genes escogidos entre FRAS1, LEPREL1, MATN2, DST, ITGA2, COL6A3, CRTAP, LAMC1, LAMB3, LAMA3, ITGAV, ITGB1 y ACTN1 y el gen PLOD2, modulado a la inversa de los dos primeros en las manchas pigmentarias.
Preferiblemente, en el marco de este metodo de caracterizacion, el nivel de expresion de uno de los genes descritos es comparado dentro de la piel de un individuo de tipo caucasico. Preferiblemente el dicho individuo es de una edad de al menos cuarenta anos, preferiblemente de al menos cincuenta anos, incluso de sesenta anos. El individuo considerado, en el marco de la presente invencion, es preferiblemente de sexo femenino. Como se detallo precedentemente, el nivel de expresion de uno o de varios genes descritos puede ser comparado dentro de la muestra de piel del dicho individuo.
Por otro lado, los presentes inventores han puesto igualmente en evidencia la modulacion diferencial de otros dermicos entre de la piel proveniente de una mancha pigmentaria y de la piel no lesionada, preferiblemente adyacente. Los inventores han puesto en evidencia particularmente la modulacion de los genes dermicos siguientes, unidos a la matriz extracelular:
- genes EFEMP1, ECM1, ASPN, HS3ST6, PAPLN, CHSY1 y FLRT2 que codifican para protemas de la familia de los proteoglicanos y glicoprotemas extracelulares;
- los genes MXRA5, LYZ, CTSL2, PLAU y TIMP1 que codifican para protemas unidas al remodelaje de matriz.
Por consiguiente, el metodo de caracterizacion tal como se describe comprende igualmente la comparacion de los niveles de expresion dentro de la piel proveniente de la dicha mancha y dentro de la piel no lesionada, preferiblemente adyacente, de al menos un gen dermico seleccionado entre la lista constituida de los genes TGFBR2, TGFBI, BMP2, SMAD3, THBS2, TGFBR3, SEMA5A, SMAD7, SOSTDC1, FRAS1, LEPREL1, MATN2, DST, PLOD2, ITGA2, COL6A3, CRTAP, LAMC1, LAMB3, LAMA3, ITGAV, ITGB1 y ACTN1 y de al menos un segundo gen seleccionado entre la lista de los siguientes genes: EFEMP1, ECM1, ASPN, HS3ST6, PAPLN, CHSY1, FLRT2, MXRA5, LYZ, CTSL2, PLAU y TIMP1; por ejemplo el segundo gen se selecciona entre la lista de los siguientes genes EFEMP1, ECM1, AsPn, HS3sT6, pApLN, CHSY1, FLRT2 o bien entre la lista de los siguientes genes: MXRA5, LYZ, CTSL2, PLAU y TIMP1.
Los genes preferidos dentro de la lista de los genes dermicos EFEMP1, ECM1, ASPN, HS3ST6, PAPLN, CHSY1, FLRT2 son los genes EFEMP1, ECM1, ASPN, HS3ST6, PAPLN y CHSY1; genes preferidos son tambien los genes MXRA5, LYZ, CTSL2, PLAU y TIMP1.
Preferiblemente el segundo gen se selecciona entre los genes EFEMP1, ECM1, ASPN, HS3ST6, PAPLN, CHSY1 y FLRT2, y preferiblemente entre los genes EFEMP1, ECM1, ASPN, HS3ST6, PAPLN y CHSY1. Alternativamente, el segundo gen se escoge entre los genes MXRA5, LYZ, CTSL2, PLAU y TIMP1.
Segun otro empleo, el primer gen se selecciona entre la lista A de genes dermicos implicados en la ruta de senalizacion TGF-p-SMAD; el segundo gen se selecciona como se preciso mas arriba. Segun aun otra utilizacion, el primer gen se selecciona entre la lista B; siendo seleccionado el segundo gen como se preciso anteriormente.
Segun una utilizacion particular, el metodo comprende la comparacion de los niveles de expresion de al menos 3 genes distintos, uno seleccionado entre los genes TGFBR2, TgFBI, BMP2, SMAD3, THBS2, TGFBR3, SEMA5A, SMAD7 y SOSTDC1, un segundo seleccionado entre los genes EFEMP1, ECM1, ASPN, HS3ST6, PAPLN, CHSY1
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y FLRT2 y un tercero seleccionado entre los genes MXRA5, LYZ, CTSL2, PLAU y TIMP1. Alternativamente, cuando se seleccionan 3 genes distintos, el primero puede ser seleccionado entre los genes de la lista B, siendo seleccionado el segundo y el tercero como se describe anteriormente. Segun aun otra alternativa, el primer gen se escoge entre la lista de los genes que comprenden TGFBR2, TGFBI, BMP2, SMAD3, THBS2, TGFBR3, SEMA5A, SMAD7, SOSTDC1, FRAS1, LEPREL1, MATN2, DST, PLOD2, ITGA2, COL6A3, CRTAP, LAMC1, LAMB3, LAMA3, ITGAV, ITGB1 y ACTN1; eventualmente SEMA5A es sin embargo excluido.
Segun aun otra utilizacion, el metodo comprende la comparacion de los niveles de expresion de al menos 4 genes distintos, siendo escogidos los tres primeros como se describe precedentemente y el 4° en la lista constitutiva de FRAS1, LEPREL1, MATN2, DST, PLOD2, ITGA2, COL6A3, CRTAP, LAMC1, LAMB3, LAMA3, ITGAV, ITGB1 y ACTN1.
Todas las asociaciones de genes descritas anteriormente son igualmente asociaciones preferidas en el marco de otros aspectos de la descripcion.
Si un gen suplementario, o varios, se escogen entre los genes EFEMP1, ECM1, ASPN, HS3ST6, PAPLN, CHSY1, FLRT2, MXRA5, LYZ, CTSL2, PLAU y TIMP1, entonces el metodo de caracterizacion conduce a confirmar una mancha hiperpigmentaria si el nivel de expresion es
- superior en la piel proveniente de la mancha, o en la muestra de piel proveniente de la mancha, con respecto al nivel en la piel adyacente no lesionada, o en la muestra de piel adyacente no lesionada, si el gen se escoge entre EFEMP1, ASPN, PAPLN, CHSY1, MXRA5, LYZ, PLAU y TIMP1, e
- inferior en la piel proveniente de la mancha, o en la muestra de piel proveniente de la mancha, con respecto al nivel en la piel adyacente no lesionada, o en la muestra de piel adyacente no lesionada, si el gen se escoge entre HS3ST6, FLRT2, ECM1 y CTSL2.
A la inversa, el metodo de evaluacion conduce a confirmar una mancha hipopigmentaria si el nivel de expresion es:
- inferior en la piel proveniente de la mancha, o en la muestra de piel proveniente de la mancha, con respecto al nivel en la piel adyacente no lesionada, o en la muestra de piel adyacente no lesionada, si el gen se selecciona entre EFEMP1, ASPN, PAPLN, CHSY1, MXRA5, LYZ, PLAU y TIMP1, y
- superior en la piel proveniente de la mancha, o en la muestra de piel proveniente de la mancha, con respecto al nivel en la piel adyacente no lesionada, o en la muestra de piel adyacente no lesionada, si el gen se selecciona entre HS3ST6, FLRT2, ECM1 y CTSL2.
El metodo descrito es igualmente un metodo de prueba para la prediccion de la formacion de manchas cutaneas en un sujeto. Segun esta utilizacion, el nivel de expresion de al menos uno, y preferiblemente varios, genes de la invencion se compara en una muestra de piel, con su nivel de expresion en la piel normal. Una modulacion significativa del nivel de expresion con respecto a la piel normal permite concluir que a la piel del sujeto probada se inclina la formacion de manchas cutaneas.
Por piel normal, puede tratarse o bien de la piel del mismo sujeto, en una zona corporal notoriamente desprovista de manchas, por ejemplo de zonas no expuestas a la radiacion solar, o bien de zonas poco inclinadas a la formacion de manchas pigmentarias. Puede igualmente tratarse del nivel de expresion medio de los dichos genes, en la piel de personas desprovistas de manchas y que tienen preferiblemente el mismo tipo de piel que en sujeto probado. Los genes de normalizacion descritos mas arriba podran ser utilizados para normalizar las tasas de expresion de los genes de la invencion.
La presente invencion se relaciona igualmente, segun un segundo aspecto, un metodo de evaluacion de la eficacia de un tratamiento de lentigos actmicos segun la reivindicacion 5, que utilizan la firma puesta en evidencia por los inventores. El tratamiento evaluado puede ser un tratamiento que se dirige a la atenuacion de mancha pigmentaria o cualquier otra modulacion de la pigmentacion, para particularmente uniformizar la tez, homogenizar el color de la piel o luchar contra las discroirnas. Segun una primera utilizacion, este metodo de evaluacion comprende una etapa de comparacion de los niveles de expresion en la piel proveniente de una macha pigmentaria, antes y despues del tratamiento, de al menos un gen dermico seleccionado entre los genes TGFBR2, TGFBI, BMP2, SMAD3, THBS2, TGFBR3, SEMA5A, SMAD7, SOSTDC1, FRAS1, LEPREL1, MATN2, DST, PLOD2, ITGA2, COL6A3, CRTAP, LAMC1, LAMB3, LAMA3, ITGAV, ITGB1 y ACTN1.
Segun una utilizacion, el gen se escoge entre TGFBR2, TGFBI, BMP2, SMAD3, THBS2, TGFBR3, SEMA5A, SMAD7 y SOSTDC1, o bien entre TGFBR2, TGFBI, BMP2, SMAD3, THBS2, TGFBR3, SMAD7 y SOSTDC1. Segun otra utilizacion, el gen se selecciona entre FRAS1, LEPREL1, MATN2, DST, PLOD2, ITGA2, COL6A3, CRTAP, LAMC1, LAMB3, LAMA3, ITGAV, ITGB1 y ACTN1. SEMA5A y/o ITGB1 son eventualmente excluidos de la lista.
Segun este metodo de evaluacion, la comparacion de los niveles de expresion de uno de los genes seleccionados
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se realiza dentro de la piel proveniente de una mancha de envejecimiento, o bien dentro de una muestra correspondiente, antes y despues del tratamiento. No hay por lo tanto comparacion en un nivel de expresion dentro de la piel sana no lesionada.
Como sucede para el metodo de caracterizacion segun el primer aspecto de la invencion, los niveles de expresion son ventajosamente normalizados con la ayuda de los niveles de expresion de los genes que codifican para la protema ribosomica L13a (RPL13A), la beta-2-microglobulina (B2M), la protema ribosomica S9 (RPS9), la protema ribosomica S28 (RPS28) y la gliceraldetndo-3-fosfato deshidrogenasa (gApDH).
Por el metodo de evaluacion tal como se describe, un tratamiento dado se considera como eficaz para el tratamiento de una macha hiperpigmentaria si el nivel de expresion es:
- inferior despues del tratamiento con respecto al nivel de expresion antes del tratamiento, si el gen se selecciona entre TGFBR2, TGFBI, BMP2, SMAD3, THBS2, TGFBR3, SEMA5A, SMAD7, FRAS1, LEPREL1, MATN2, DST, ITGA2, COL6A3, CRTAP, LAMC1, LAMB3, LAMA3, ITGAV, ITGB1 y ACTN1, y
- superior despues del tratamiento con respecto al nivel de expresion antes del tratamiento, si el gen se escoge entre SOSTDC1 y PLOD2.
Por el contrario por el metodo de evaluacion de la invencion, un tratamiento dado se considera como eficaz para el tratamiento de machas hipopigmentarias cuando el nivel de expresion es:
- superior despues del tratamiento con respecto al nivel de expresion antes del tratamiento, si el gen se escoge entre TGFBR2, TGFBI, BMP2, SMAD3, THBS2, TGFBR3, SEMA5A, SMAD7, FRAS1, LEPREL1, MATN2, DST, ITGA2, COL6A3, CRTAP, LAMC1, LAMB3, LAMA3, ITGAV, ITGB1 y ACTN1, e
- inferior despues del tratamiento con respecto al nivel de expresion antes del tratamiento, si el gen se selecciona entre SOSTDC1 y PLOD2.
Un tratamiento sera considerado como sin efecto si los niveles de expresion del gen seleccionado, antes y despues del tratamiento son sensiblemente identicos, o bien si las diferencias observadas no son significativas.
Cuando se comparan los niveles de expresion de mas de un gen, el tratamiento se considera como eficaz para el tratamiento de una mancha o de una irregularidad pigmentaria sf, para la mayona de los genes probados, y preferiblemente para el conjunto de los genes probados, se toma individualmente, el tratamiento se considera como eficaz. Para los otros genes seleccionados, el tratamiento debe ser preferiblemente sin efecto, pero sin tener el efecto contrario.
Segun otra utilizacion, el metodo de evaluacion de la eficacia y un tratamiento de las manchas pigmentarias cutaneas comprende la caracterizacion de una mancha o irregularidad pigmentaria segun el metodo descrito, antes y despues del tratamiento, y la comparacion de las diferencias de los niveles de expresion observadas entre la piel lesionada y la mancha o irregularidad pigmentaria y la piel sana.
Segun esta utilizacion de la evaluacion de la eficacia de un tratamiento, el tratamiento se considera como eficaz y la diferencia entre los niveles de expresion del o de los genes seleccionados en la piel lesionada proveniente de la mancha con respecto a la piel sana, preferiblemente adyacente, es menor despues del tratamiento con respecto a lo que habfa antes del tratamiento.
Cuando se comparan los niveles de expresion de mas de un gen, es preferible concluir con la eficacia del tratamiento cuando para la mayona de los genes seleccionados, y preferiblemente para el conjunto de los genes seleccionados, tomados individualmente, se puede concluir en un tratamiento eficaz.
Preferiblemente la comparacion de los niveles de expresion o de los genes seleccionados se realiza sobre muestras de piel tomadas a partir de la mancha pigmentaria.
El tratamiento considerado, evaluado por el metodo de la invencion, no esta limitado a un tipo particular de tratamiento.
Puede tratarse de un tratamiento por una molecula qmmica, un activo, un extracto natural, particularmente un aceite esencial, un acido nucleico, particularmente un ARNi, un complejo proteico o cualquier otra molecula o combinacion de moleculas. Puede igualmente tratarse de un tratamiento por un medio ffsico de ondas, particularmente electromagneticas. Se trata preferiblemente de un tratamiento topico, pero es igualmente previsible evaluar la eficacia de tratamientos administrados por via oral, por inyeccion, o por cualquier otro medio de administracion.
El tratamiento probado puede dirigirse en atenuar o hacer disparar una mancha cutanea, en modular la pigmentacion de la piel, en uniformizar la tez, en homogenizar el color de la piel o en atenuar las discroirnas.
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Los tratamientos particularmente preferidos en el marco de esta invencion son tratamientos cosmeticos, mas particularmente tratamientos topicos cosmeticos. En este caso, la mancha pigmentaria considerada es un lentigo actmico, solar o senil.
Por los metodos de la invencion, es igualmente posible evaluar la eficacia de la combinacion de varios tratamientos, es en efecto posible evaluar combinaciones que permitan por medio de la restauracion de los niveles de expresion de uno, varios o de todos los genes de la invencion, o de la lista A o de la lista B, de tal forma que son expresados dentro de la piel no lesionada.
Por los metodos de evaluacion descritos anteriormente, es posible evaluar la eficacia de un nuevo tratamiento previsto o bien igualmente cuantificar o cualificar la eficacia de tratamientos ya existentes contra las machas pigmentarias, que sean hiperpigmentarias o bien hipopigmentarias. Por esta via, puede tambien preverse combinaciones de tratamiento susceptibles de ser particularmente eficaces, sinergicos o complementarios. Como ha sido explicado por los metodos de caracterizacion segun el primer aspecto de la invencion, es preferible comparar los niveles de expresion de mas de un gen, preferiblemente de al menos dos, tres, cinco, seis, siete, diez, doce, quince, dieciocho o bien de todos los genes de la invencion o bien de los genes de la lista A o bien de los genes de la lista B.
Los genes o combinaciones de genes particularmente preferidos han sido ya explicados con respecto al primer aspecto de la invencion; los mismos genes o combinaciones son preferidos en este aspecto. Es particularmente preferido que el gen seleccionado este entre los genes TGFBR2, TGFBI, BMP2, SMAD3, THBS2, TGFBR3, SEMA5A, SMAD7 y SOSTDC1, muy particularmente entre los genes TGFBR2, TGFBI, BMP2, SMAD3, THBS2 y TGFBR3, y todas las combinaciones dos a dos o tres a tres de los genes de estas listas son particularmente preferidos. Segun otra utilizacion, el gen se selecciona entre los genes de la lista B, y particularmente entre la lista de los genes FRAS1, LEPREL1, MATN2, DST, PLOD2 e ITGA2, y todas las combinaciones dos a dos o tres a tres de los genes de esta lista son particularmente preferidos.
Por otro lado, debido a los resultados complementarios obtenidos por los inventores relacionados de otros genes dermicos cuyo nivel de expresion es modulado dentro de la mancha pigmentaria, los metodos de evaluacion tales como los descritos son utilizados preferiblemente con:
- al menos un gen seleccionado entre los genes TGFBR2, TGFBI, BMP2, SMAD3, THBS2, TGFBR3, SEMA5A, SMAD7, SOSTDC1, FRAS1, LEPREL1, MATN2, DST, PLOD2, ITGA2, COL6A3, CRTAP, LAMC1, LAMB3, LAMA3, ITGAV, ITGB1 y ACTN1, e incluso preferiblemente entre los genes de la lista A o entre los genes TGFBR2, TGFBI, BMP2, SMAD3, THBS2 y TGFBR3, o entre los genes de la lista B, o aun entre los genes FRAS1, LEPREL1, MATN2, DST, PLOD2 y ITGA2 y
- al menos un segundo gen seleccionado entre los genes EFEMP1, ECM1, ASPN, HS3ST6, PAPLN, CHSY1, FLRT2, MXRA5, LYZ, CTSL2, PLAU y TIMP1. Alternativamente, el segundo gen puede ser escogido entre los genes EFEMP1, ECM1, ASPN, HS3ST6,
PAPLN, CHSY1, FLRT2 o bien entre los genes MXRA5, LYZ, CTSL2, PLAU y TIMP1. Los genes preferidos en los genes dermicos EFEMP1, ECM1, ASPN, HS3ST6, PAPLN, CHSY1, FLRT2 son los genes EFEMP1, ECM1, ASPN, HS3ST6, PAPLN y CHSY1.
Si un gen suplementario, o varios se escogen entre los genes EFEMP1, ECM1, ASPN, HS3ST6, PAPLN, CHSY1, FLRT2, MxRa5, LYZ, CTSL2, PLAU y TIMP1, mientras el metodo de evaluacion conduce a considerar un tratamiento eficaz para el tratamiento de manchas hiperpigmentarias y el nivel de expresion es
- inferior despues del tratamiento con respecto al nivel de expresion antes del tratamiento, si el gen se escoge entre EFEMP1, ASPN, PAPLN, CHSY1, MXRA5, LYZ, PLAU y TIMP1, y
- superior despues del tratamiento con respecto al nivel de expresion antes del tratamiento, si el gen se escoge entre HS3ST6, FLRT2, ECM1 y CTSL2.
Al contrario, el metodo de evaluacion conduce a considerar un tratamiento eficaz para el tratamiento de manchas hipopigmentarias y el nivel de expresion es:
- superior despues del tratamiento con respecto al nivel de expresion antes el tratamiento, si el gen es seleccionado entre FEMP1, ASPN, PAPLN, CHSY1, MXRA5, LYZ, PLAU y TIMP1, e
- inferior despues del tratamiento con respecto al nivel de expresion antes del tratamiento, si el gen se selecciona entre HS3ST6, FLRT2, ECM1 y CTSL2.
La muestra de piel proviene preferiblemente de un ser humano de tipo caucasico preferiblemente de una edad de al
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menos cuarenta anos, preferiblemente de al menos cincuenta anos, incluso al menos sesenta anos.
Preferiblemente, en el marco de la presente invencion y particularmente para el metodo de evaluacion descrito, se trata de un tratamiento de manchas hiperpigmentarias de tipo lentigos actmicos solares o seniles.
El metodo de evaluacion de la eficacia de un tratamiento segun la presente invencion se emplea de nuevo in vitro o ex vivo.
Es deseable que la muestra de piel antes de tratamiento y despues del tratamiento sea tomada a partir de la misma mancha pigmentaria, o bien de una mancha pigmentaria muy cercana si el tamano de la mancha no permite obtener facilmente muestras antes y despues del tratamiento.
La presente invencion se relaciona igualmente con un metodo in vitro de evaluacion de la eficacia de un tratamiento de lentigos actmicos; un tal metodo comprende la comparacion, antes y despues del tratamiento, del nivel de expresion en un modelo celular representativo de la piel, de al menos un gen dermico escogido entre la lista constituida de los genes TGFBR2, TGFBI, BMP2, SMAD3, THBS2, TGFBR3, SEMA5A, SMAD7, SOSTDC1, FRAS1, LEPREL1, MATN2, DST, PLOD2, ITGA2, COL6A3, CRTAP, LAMC1, LAMB3, LAMA3, ITGAV, ITGB1 y ACTN1, o bien del nivel de expresion o de actividad del producto de expresion del dicho gen seleccionado. Alternativamente, el gen puede ser seleccionado entre la lista A de genes dermicos unidos a la ruta de senalizacion TGF-beta-SMAD, con o sin SEMA5A, o bien entre la lista B, o bien entre los diferentes subgrupos de esta ultima lista, a saber entre LEPREL1, PLOD2, COL6A3 y CRTAP, o bien entre LAMC1, LAMB3 y LAMA3, o bien entre FRAS1, MATN2 y DST, o bien entre ITGA2, ITGAV y ITGBL, o entre ITGA2 y ITGAV.
El modelo celular puede ser de cualquier tipo considerado como apropiado por el experto en el arte. Puede tratarse particularmente de modelos celulares mono o cocultivos, o bien modelos tridimensionales de piel reconstruida, o bien de piel cultivada ex vivo. Existen igualmente modelos celulares representativos de manchas pigmentarias, mas particularmente de lentigos actmicos, que pueden ser utilizados en el marco de este metodo. Tales modelos celulares no tienen necesidad de imitar las manchas pigmentarias (o el lentigo) en su globalidad pero deben imitar eventos biologicos, caractensticas morfologicas o pigmentarias observadas en las manchas pigmentarias, particularmente el lentigo. Tales modelos in vitro son bien conocidos del experto en el arte.
Segun una utilizacion preferida del metodo in vitro descrito anteriormente, comprende la comparacion de los niveles de expresion de al menos dos genes, preferiblemente del menos tres, cinco o seis genes de la invencion, como se ha explicado para los otros metodos de evaluacion segun la invencion, siendo escogidos los dicho genes entre los genes de la invencion, o bien entre los genes de la lista A, con o sin SEMA5A, o bien entre los genes de la lista B, con o sin ITGB1. Los genes particularmente preferidos son los genes TGFBR2, TGFBI, BMP2, SMAD3, THBS2 y TGFBR3, asf como los genes FRAS1, LEPREL1, MATN2, DST, PLOD2 y ITGA2.
Incluso como se ha explicado para los otros metodos de evaluacion, son utilizados preferiblemente con al menos dos genes,
- se escogen entre los genes TGFBR2, TGFBI, BMP2, SMAD3, THBS2, TGFBR3, SEMA5A, SMAD7 y SOSTDC1, o bien entre los genes de la lista B, o bien aun entre TGFBR2, TGFBI, BMP2, SMAD3, THBS2, TGfBr3, SEMA5A, SMAD7, SOSTDC1, FRAS1, LEPREL1, MATN2, DST, PLOD2, ITGA2, COL6A3, CRTAP, LAMC1, LAMB3, LAMA3, ITGAV, ITGB1 y ACTN1, y
- se escoge el segundo entre los genes EFEMP1, ECM1, ASPN, HS3ST6, PAPLN, CHSY1, FLRT2, MXRA5, LYZ, CTSL2, PLAU y TIMP1, preferiblemente entre los genes EFEMP1, ECM1, ASPN, HS3ST6, PAPLN, CHSY1 y FLRT2 o bien entre los genes MXRA5, LYZ, CTSL2, PLAU y TIMP1.
De una manera particularmente preferida, se escoge el primer gen entre TGFBR2, TGFBI, BMP2, SMAD3, THBS2 y TGFBR3 o bien entre FRAS1, LEPREL1, MATN2, DST, PLOD2 y ITGA2.
Con relacion a los metodos de evaluacion segun la invencion, segun una utilizacion preferida, el primer gen se escoge entre el subgrupo constituido de los genes LEPREL1, PLOD2, COL6A3 y CRTAP, que pertenecen a la familia de los colagenos, particularmente a la familia de colagenos fibrilares del estroma.
Segun otra utilizacion, el primer gen se escoge entre el grupo constituido de los genes LAMC1, LAMB3 y LAMA3, que codifica para laminas y se sobreexpresa a nivel de manchas hiperpigmentarias.
Segun otra utilizacion, el primer gen se escoge entre el grupo constituido de los genes FRAS1, MATN2 y DST, que codifican para protemas de matriz asociadas a la zona de la membrana basal y son subexpresados a nivel de manchas hiperpigmentarias.
Segun aun otra utilizacion, el primer gen se escoge entre el grupo constituido de los genes ITGA2, ITGAV e ITGB1, que codifican para las integrinas y son subexpresados a nivel de manchas hiperpigmentarias.
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Alternativamente, el metodo puede ser utilizado con el gen ACTN1, que codifica para una actina.
Todas las combinaciones de genes espedficos descritos con relacion a otros aspectos de la descripcion son igualmente preferidas en el marco de este aspecto.
Por otro lado, por medio de estos metodos de evaluacion es posible promover un tratamiento ante los consumidores, poniendo antes los resultados obtenidos con su tratamiento los metodos de evaluacion de la eficacia descrita en la presente invencion.
Se describe igualmente un metodo que permite recomendar un producto senalando su efecto en un protocolo de prueba constituido por un metodo de evaluacion de la eficacia tal como se describe precedentemente, por ejemplo un metodo para la promocion de un producto cosmetico o tratamiento cosmetico que consiste en reportar una eficacia, accion o propiedad del dicho producto o tratamiento, demostrado por al menos un metodo operado tal como se describe precedentemente.
Una tal promocion del producto podra hacerse por cualquier canal de comunicacion. Podra ser realizado particularmente por el vendedor o la vendedora, directamente sobre el punto de venta, por la radio y la television, particularmente en el marco de puntos publicitarios. Podra ser hecho igualmente por el canal de la prensa escrita o bien por medio de cualquier otro documento, en particular con fines publicitarios (prospectos). Podra hacerse igualmente por internet o por cualquier otra red informatica adecuada. Podra ser hecho igualmente de forma directa sobre el producto, particularmente en su empaque o sobre cualquier nota explicativa que pueda serle asociada.
La presente descripcion se relaciona igualmente con un metodo de cribado de moleculas para el tratamiento de manchas pigmentarias cutaneas que comprenden la utilizacion de uno de los metodos de evaluacion descritos precedentemente para determinar la eficacia de un tratamiento a base de esta molecula.
Segun otro aspecto, la presente invencion se relaciona igualmente con un metodo cosmetico de tratamiento o de prevencion de lentigo actmico no patologico de la piel humana, que comprende la modulacion del nivel de expresion o de la actividad de un gen dermico, en donde el dicho gen se escoge entre la lista constituida de los genes TGFBR2, TGFBI, BMP2, SMAD3, THBS2, TGFBR3, SEMA5A, SMAD7, SOSTDC1, FRAS1, LEPREL1, MATN2, DST, PLOD2, ITGA2, COL6A3, CRTAP, LAMC1, LAMB3, LAMA3, ITGAV y ACTN1. Alternativamente, el gen puede ser seleccionado entre la lista A de genes dermicos unidos a la ruta de senalizacion TGF-beta-SMAD, preferiblemente sin SEMA5A, o bien entre la lista de los genes dermicos B, preferiblemente sin ITGB1, o bien entre los diferentes subgrupos de esta ultima lista, a saber entre LEPREL1, PLOD2, COL6A3 y CRTAP, o bien entre LAMC1, LAMB3 y LAMA3, o bien entre FRAS1, MATN2 y DST, o bien aun entre ITGA2, ITGAV y ITGB1, o entre ITGA2 y ITGAV.
Los lentigos actmicos no patologicos se consideran como manchas benignas, cuya eliminacion es mas que deseable por razones esteticas y en ningun modo por razones terapeuticas.
Los presentes inventores han mostrado el papel importante de los genes de la invencion dentro de la dermis a nivel de las manchas pigmentarias, y particularmente unido entre desregulacion del nivel de expresion de esos genes y aparicion de manchas pigmentarias. Debido a esto suspender o disminuir la modulacion de esos genes puede permitir disminuir o abolir las desregulaciones observadas y asf permitir restaurar una situacion a nivel de la matriz extracelular compatible con la ausencia de mancha pigmentaria, por lo tanto un tinte uniforme y un color de piel homogeneo.
Por las mismas razones explicadas en relacion con otros aspectos de la invencion, se selecciona preferiblemente mas de un gen dentro de los genes de la invencion, por ejemplo al menos dos genes, al menes tres, cinco, seis, ocho. Segun una utilizacion, el metodo cosmetico tiene por objeto modular el nivel de expresion de la integridad de los genes de la invencion, o bien de la integridad de los genes de la lista A, con o sin SEMA5A, o bien de la integridad de los genes de la lista B. Preferiblemente, el gen ITGB1 es entonces excluido de la lista B. El metodo cosmetico segun la invencion tiene por objeto restaurar los niveles de expresion proximos a los que son observados dentro de la piel sana, por ejemplo, adyacente de una mancha pigmentaria. Los genes particularmente preferidos son los genes TGFBR2, TGFBI, BMP2, SMAD3, THBS2 y TGFBR3, asf como los genes FRAS1, LEPREL1, MATN2, DST, PLOD2 e ITGA2. En el caso de un lentigo actmico, senil o solar, la modulacion buscada en los metodos cosmeticos segun la invencion es:
- una inhibicion total, parcial o temporal, de la expresion de al menos un gen escogido entre los genes TGFBR2, TGFBI, BMP2, SMAD3, THBS2, TGFBR3, SEMA5A y SMAD7, o bien entre los genes FRAS1, LEPREL1, MATN2, DST, ITGA2, COL6A3, CRTAP, LAMC1, LAMB3, LAMA3, ITGAV, ITGB1 y ACTN1, o bien entre los genes TGFBR2, TGFBI, BMP2, SMAD3, THBS2, TGFBR3, SEMA5A, SMAD7, FRAS1, LEPREL1, MATN2, DST, ITGA2, COL6A3, CRTAP, LAMC1, LAMB3, LAMA3, ITGAV, ITGB1 y ACTN1 o bien
- un aumento, eventualmente temporal de la expresion del gen SOSTDC1, o del gen PLOD2.
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Preferiblemente, la inhibicion no es una inhibicion total sino parcial, que tiende a disminuir el nivel de expresion del gen seleccionado sin por ello inhibir enteramente su expresion.
Descrito igualmente es el caso de una mancha hipopigmentaria. En un caso tal, la modulacion buscada es inversa con respecto a la situacion precedente, particularmente un tal metodo que apunta a aumentar la expresion de al menos un gen seleccionado entre los genes TGFBR2, TGFBI, BMP2, SMAD3, THBS2, TGFBR3, SEMA5A y SMAD7, o bien entre los genes FRAS1, LEPREL1, MATN2, DST, ITGA2, COL6A3, CRTAP, LAMC1, LAMB3, LAMA3, ITGAV, ITGB1 y ACTN1, o bien entre los genes TGFBR2, TGFBI, BMP2, SMAD3, THBS2, TGFBR3, SEMA5A, SMAD7, FRAS1, LEPREL1, MATN2, DST, ITGA2, COL6A3, CRTAP, LAMC1, LAMB3, LAMA3, ITGAV, ITGB1 y ACTN1, o bien en inhibir o disminuir el nivel de expresion del gen SOSTDC1 o del gen PLOD2.
Por aumento o disminucion del nivel de expresion, se incluye el aumento o la disminucion del nivel de transcripcion de los dichos genes, y el aumento o la disminucion del nivel de traduccion de los dichos genes, asf como el aumento o la disminucion de la actividad de protemas codificadas para estos genes.
Preferiblemente, concomitantemente a la modulacion del nivel de expresion buscado para uno de los genes de la invencion, un metodo cosmetico segun la invencion comprende preferiblemente de manera igual la modulacion de al menos otro gen dermico, seleccionado entre los genes EFEMP1, ECM1, ASPN, HS3ST6, PAPLN, CHSY1, FLRT2, MXRA5, LYZ, CTSL2 y PLAU y TIMP1. Los genes preferidos dentro de esta segunda lista de genes dermicos son los genes EFEMP1, ECM1, ASPN, HS3ST6, PAPLN y CHSY1 y los genes MXRA5, LYZ, CTSL2, PLAU y TIMP1.
Las modulaciones aplicadas tratandose del tratamiento de una mancha hiperpigmentaria son la disminucion del nivel de expresion para los genes EFEMP1, ASPN, PAPLN, CHSY1, MXRA5, LyZ, PLAU y TIMP1, y el aumento del nivel de expresion para los genes ECM1, HS3ST6, FLRT2 y CTSL2. En el caso de tratamiento de mancha hipopigmentaria, las modulaciones aplicadas son inversas.
Un metodo cosmetico segun la presente invencion comprende por lo tanto la aplicacion de un producto, particularmente molecula qmmica, extracto natural, activo, acidos nucleicos, peptidos, o de un tratamiento que modula el nivel de expresion o la actividad del producto de expresion de al menos uno de los genes dermicos de la invencion.
Las modulaciones son preferiblemente obtenidas gracias a la utilizacion de un antisentido, de un microARN o de ARNs dirigido contra al menos uno de los genes de la invencion y que inhiben su expresion.
Tratandose de un producto, se aplica preferiblemente de manera topica.
Preferiblemente, la modulacion se efectua gracias a la utilizacion de un modulador de uno de los genes de la invencion. Tales moduladores se describen en el ejemplo 3 de la Tabla 3. Por ejemplo, un metodo cosmetico tal como se describe comprendera ventajosamente la aplicacion de un compuesto seleccionado entre polvo oseo desmineralizado o “Demineralized bone powder (DBP)”, Pioglitazona, GW0742, Cristata L flavonoide, Fenofibrado, oximatrina, acido salvianolico B, SB-431542, un extracto de Wen-pi-tang-Hab-Wu-ling-san, tetrandrina y N-acetil- serilaspartil-lisil-prolina (Ac-SDKP), vitamina K2 menaquinona, beta-aminopropionitrila (bAPN) y Vandetanib (ZD6474 5), o bien la aplicacion de ultrasonidos pulsados de baja intensidad, o bien aun asociaciones de al menos dos de esos moduladores. Por otro lado, un metodo cosmetico es ventajosamente utilizado despues de la caracterizacion de la macha pigmentaria que se desea tratar por un metodo segun el primer aspecto. En efecto, esta primera etapa permite caracterizar la mancha y por lo tanto detectar los genes cuyo nivel de expresion es fuertemente modulado entre la zona de la mancha y una zona no lesionada, preferiblemente adyacente. Es posible a continuacion adaptar un tratamiento que permita tratar sobre la o los genes de la invencion que son modulados diferencialmente dentro de esta mancha, aplicando espedficamente moduladores para los dichos genes.
Cualquiera que sea el tratamiento considerado, el metodo cosmetico puede igualmente comprender la aplicacion de uno o varios compuestos activos adicionales que se dirigen a reforzar los efectos buscados por ejemplo, de cualquier sustancia descrita como despigmentantes, agentes queratolfticos y/o descamantes, antioxidantes, filtros solares qmmicos o ffsicos UV, agentes antiinflamatorios y/o calmantes, acidos desoxirribonucleicos y sus derivados.
El metodo cosmetico es igualmente aplicable en el caso de la prevencion de la aparicion de manchas pigmentarias o de otras irregularidades del tono o del color de la piel, y particularmente de manchas hiperpigmentadas tales como el lentigo actmico.
En efecto, los diferentes datos obtenidos por los inventores y detallados en la parte experimental revelan que los alcances a la matriz extracelular y particularmente a la ruta de senalizacion TGF-p-SMAD, a traves de los genes puestos en evidencia por los inventores son susceptibles de sobrevenir corriente arriba, antes de la aparicion de las manchas. Se puede pensar que la secuencia de eventos biologicos en las manchas hiperpigmentarias pueda ser la siguiente: 1) alteracion de la dermis (debido a la modulacion de la expresion de los genes identificados en esta solicitud) que conduce a 2) modificacion de la epidermis con formacion de cresta epidermica en la dermis que lleva a
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3) que lleva a un aumento de la longitud de la union dermoepidermica y la formacion de redes completas que conducen a 4) un aumento de la carga melanica.
La presente invencion se relaciona igualmente con la utilizacion de un modulador de nivel de expresion o de la actividad de producto de expresion de al menos un gen dermico seleccionado entre la lista constituida de los genes TGFBR2, TGFBI, BMP2, SMAD3, THBS2, TGFBR3, SEMA5A, SMAD7, SOSTDC1, FRAS1, LEPREL1, MATN2, DST, PLOD2, ITGA2, COL6A3, CRTAP, LAMC1, LAMB3, LAMA3, ITGAV, ITGB1 y ACTN1, para una aplicacion cosmetica en el tratamiento de lentigos actmicos no patogenicos, estando el dicho modulador en antisentido, un microARN o un ARNsi dirigido contra el gen dermico seleccionado y que inhibe la expresion del dicho gen.
Alternativamente, el gen puede ser seleccionado entre la lista A de genes dermicos unidos a la ruta de senalizacion TGF-beta-SMAD, con o sin SEMA5A, o bien entre la lista B de genes dermicos, o bien entre los diferentes subgrupos de esta ultima lista, a saber entre LEPREL1, PLOD2, COL6A3 y CRTAP, o bien entre LAMC1, LAMB3 y LAMA3, o bien entre FRAS1, MATN2 y DST, o bien aun entre ITGA2, ITGAV e ITGB1, o entre ITGA2 e ITGAV. El ITGB1 puede ser excluido de las diferentes listas.
Para el tratamiento de manchas hiperpigmentarias, el modulador el cual se usa de hecho usado, es un inhibidor de al menos un gen seleccionado entre TGFBR2, TGFBI, BMP2, SMAD3, THBS2, TGFBR3, SEMA5A, SMAD7, FRAS1, LEPREL1, MATN2, DST, ITGA2, COL6A3, CRTAP, LAMC1, LAMB3, LAMA3, ITGAV, ITGB1 y ACTN1 o bien un activador del gen SOSTDC1 o de gen PLOD2. Preferiblemente, el inhibidor es un inhibidor parcial que conduce a la disminucion del nivel de expresion o a la disminucion de la actividad del producto de expresion del dicho gen, sin por lo tanto abolir enteramente la expresion o la actividad de este gen. El modulador es un inhibidor de al menos un gen seleccionado entre TGFBR2, TGFBI, BMP2, SMAD3, THBS2, TGFBR3, SEMA5A y SMAD7, o sin SEMA5A, o bien un activador de SOSTDC1. El modulador puede tambien ser un inhibidor de al menos un gen seleccionado de entre FRAS1, LEPREL1, MATN2, DST, ITGA2, COL6A3, CRTAP, LAMC1, LAMB3, LAMA3, ITGAV y ACTN1, o bien un activador de PLOD2.
Al contrario, para el tratamiento de manchas hipopigmentarias, el modulador se ha usado como un activador de al menos un gen seleccionado entre TGFBR2, TGFBI, BMP2, SMAD3, THBS2, TGFBR3, SEMA5A, SMAD7, FRAS1, LEPREL1, MATN2, DST, ITGA2, COL6A3, CRTAP, LAMC1, LAMB3, LAMA3, ITGAV, ITGB1 y ACTN1, o bien un inhibidor del gen SOSTDC1 o gen PLOD2. El modulador es un activador de al menos un gen seleccionado entre TGFBR2, TGFBI, BMP2, SMAD3, THBS2, TGFBR3, SEMA5A y SMAD7, o sin SEMA5A, o bien un inhibidor de SOSTDC1. En otro caso, el modulador es un activador de al menos un gen seleccionado entre FRAS1, LEPREL1, MATN2, DST, ITGA2, COL6A3, CRTAP, LAMC1, LAMB3, LAMA3, ITGAV y ACTN1, o bien un inhibidor de PLOD2.
Los ejemplos de inhibidores o de activadores ya conocidos y caracterizados se divulgan en el ejemplo 3 de la parte experimental. Tales moduladores pueden particularmente ser el acido salvianolico B, el extracto Wen-pi-tang-Hab- Wu-ling-san o los ultrasonidos pulsados de baja intensidad para uso en el tratamiento cosmetico de manchas hiperpigmentarias.
Los moduladores bien conocidos son igualmente moleculas antisentido, de los ARNsi, y los microARNs. Los moduladores previstos son particularmente los antisentidos, los microARNs o los ARNsi dirigidos contra al menos uno de los genes de la invencion e inhiben su expresion.
Los moduladores son particularmente el polvo oseo desmineralizado o “Demineralized bone powder (DBP)”, Pioglitazona, GW0742, Cristata L flavonoide, Fenofibrato, oximatrina, acido salvianolico B, SB-431542, un extracto de Wen-pi-tang-Hab-Wu-ling-san, tetrandrina, N-acetil-seril-aspartil-lisil-prolina (Ac-SDKP), vitamina K2 menaquinona, beta-aminopropionitrilo (bAPN) y Vandetanib (ZD6474 5), o bien la aplicacion de ultrasonidos pulsados de baja intensidad. Es igualmente previsible utilizar una asociacion de al menos dos de estos moduladores.
Las cantidades eficaces de los moduladores son para adaptar en funcion del resultado buscado y del tipo y del numero de moduladores utilizados; pueden estar comprendidos entre 0.001% y 30% en peso.
Los moduladores tal como se describen pueden ser utilizados en los metodos cosmeticos descritos en asociacion con los moduladores de los genes EFEMP1, ECM1, ASPN, HS3ST6, PAPLN, CHSY1 y FLRT2, o bien de los moduladores de los genes MXRA5, LYZ, CTSL2, PLAU y TIMP1.
Ya se han descrito las combinaciones de los genes preferidos.
Los moduladores pueden ser utilizados en asociacion con otros productos, ingredientes activos o excipientes. Preferiblemente, estan condicionados bajo una forma adaptada a una aplicacion topica, por ejemplo bajo forma de pomada, crema o unguento, o bajo cualquier forma adaptada para el cuidado tal como locion, serum, jabon etc.
Las diversas utilizaciones detalladas en la seccion relativa a los metodos cosmeticos son aplicables a las utilizaciones para las aplicaciones cosmeticas descritas anteriormente.
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Los moduladores descritos anteriormente pueden ser utilizados particularmente en aplicaciones cosmeticas con el fin de uniformizar la tez, homogenizar el color de la piel o luchar contra las discroirnas.
Por otro lado, la presente descripcion describe moduladores del nivel de expresion o de la actividad del producto de expresion de al menos un gen dermico seleccionado entre los genes TGFBR2, TGFBI, BMP2, SMAD3, THBS2, TGFBR3, SEMA5A, SMAD7, SOSTDC1, FRAS1, LEPREL1, MATN2, DST, PLOD2, ITGA2, COL6A3, CRTAP, LAMC1, LAMB3, LAMA3, ITGAV y ACTN1 para una aplicacion en el tratamiento de manchas pigmentarias cutaneas, por ejemplo en el marco de tratamientos terapeuticos. Las dichas manchas pueden ser manchas hiperpigmentarias, o bien manchas hipopigmentarias. Alternativamente, el gen puede ser seleccionado entre la lista A de genes dermicos ligados a la ruta de senalizacion TGF-beta-SMAD, o bien entre la lista de genes dermicos B, o bien entre los diferentes subgrupos de esta ultima lista, a saber entre LEPREL1, PLOD2, COL6A3 et CRTAP, o bien entre LAMC1, LAMB3 y LAMA3, o bien entre FRAS1, MATN2 y DST, o bien aun entre ITGA2, ITGAV e ITGB1, o entre ITGA2 y ITGAV.
Los moduladores preferidos han sido ya descritos anteriormente.
Pueden ser asociados de otros productos, ingredientes activos o excipientes. Preferiblemente estan condicionados bajo una forma adaptada a una aplicacion topica, por ejemplo bajo forma de pomada, crema o unguento, o bajo cualquier forma adaptada para el cuidado tal como locion, serum, jabon, etc.
En los diferentes metodos y aplicaciones descritas, las manchas pigmentarias consideradas son preferiblemente manchas hiperpigmentarias y preferiblemente de lentigos actmicos, solares o seniles. Los metodos y aplicaciones descritas se basan en la puesta en evidencia por los inventores de una firma de tales manchas pigmentarias.
Esta firma se caracteriza por el hecho que puede estar constituida por el conjunto de la lista o una parte de los genes citados.
Igualmente se describe la utilizacion de esta firma como nuevo procedimiento de seleccion y prediccion del lentigo actmico a traves de las deficiencias de sus funciones biologicas. Este nuevo procedimiento se basa en el estudio del nivel de expresion de todo o parte de los genes descritos en una lesion hiperpigmentada versus una piel no lesionada adyacente.
Esta divulgacion se describe igualmente en el marco del tratamiento del lentigo actmico, gracias a la utilizacion de estos genes como firma molecular de las diferencias de expresion genica existente entre una lesion y la piel sana adyacente. Esta firma constituye igualmente un avance evidente para determinar la seleccion del tratamiento apropiado y medir el efecto de un producto (ingrediente activo, molecula, extracto natural), pero tambien de un procedimiento (luminosidad luz, inyeccion, via oral) que sea benefico para la piel. La presente invencion permite en efecto la evaluacion de la eficacia de un producto o procedimiento destinado para tratar el lentigo actmico modulando a nivel de la lesion la expresion de todo o parte de los genes descritos de manera que su perfil de expresion se aproxime al de la piel sana.
La descripcion consiste tambien en un metodo de criba de factores de inhibicion o prevencion de los lentigos actmicos. Consiste en evaluar compuestos sobre su poder de inhibicion o de aumento de la expresion de los genes citados y/o de la expresion o la actividad de los productos proteicos de los dichos genes y para seleccionar en tanto que factores que permiten prevenir o tratar el lentigo actmico. La verificacion de la eficacia de los compuestos puede ser realizada sobre modelos celulares mono o cocultivos, o modelos tridimensionales de piel reconstruida o de la piel ex vivo, o in vivo.
La divulgacion tiene tambien por objeto la utilizacion de compuestos que modulan la expresion de genes identificados entre los biomarcadores del lentigo actmico, para prevenir o corregir la lesion con el fin de reencontrar un estado normal de la piel, es decir reencontrar una expresion que se aproxima a la expresion de la piel sana no lesionada. En particular, no se han propuesto jamas compuestos que actuan sobre las protemas identificadas para prevenir o tratar las discroirnas pigmentarias (hiperpigmentacion o hipopigmentacion). Tales compuestos existen y estan reportados en la Tabla 3 del ejemplo 3.
Los agentes seleccionados son particularmente moduladores negativos de protemas subexpresadas en relacion con la matriz extracelular, particularmente protemas de la ruta de senalizacion TGF-p-SMAD o de los moduladores positivos de protemas subexpresadas.
Entre los moduladores negativos de las protemas unidas a la matriz extracelular y particularmente a la ruta de senalizacion TGF-p-SMAD se podra citar particularmente los inhibidores de smtesis, y/o de la secrecion y/o activadores de la degradacion de protemas reencontradas sobreexpresadas en el lentigo.
Al contrario, entre los moduladores positivos, se podran citar estimulantes de smtesis, inductores de secrecion, o inhibidores de la degradacion de protemas subexpresadas en el lentigo.
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Leyenda de las figuras:
Figura 1: Esta figura ilustra el protocolo de tratamiento de las Pieles Reconstruidas Pigmentadas (PRP) por el TGFbeta. En la grafica, T significa tratamiento al TGFbeta', a 200 pg/mL, teniendo por vehmulo HCl 4 mM y 1 mg/mL de BSA. El medio es el MEM 3F' con 2% de FBS. Las dermis equivalentes se trataron durante 3 dfas consecutivos. A J0i, la dermis equivalente es sembrada con queratinocitos y melanocitos (K+M en la grafica) y mantenida en inmersion durante 7 dfas. El cultivo se mantiene a continuacion en inmersion, durante 2 semanas.
Figura 2: Esta figura representa fotos de las pieles reconstruidas pigmentadas despues del tratamiento con un control (2% SVF HCI/BSA) o con TGFbeta (200 pg/mL) segun el protocolo descrito en el ejemplo 4. Las dos fotos superiores corresponden a la reaccion Dopa, en la epidermis separada. Las dos fotos inferiores corresponden a una coloracion Fontana Masson.
Figura 3: Esta figura ilustra los resultados de luminancia (graficas A y C) y la cuantificacion de melanina (graficas B y D), para pieles reconstituidas pigmentadas tratadas conforme al protocolo descrito en el ejemplo 4. El control corresponde a un tratamiento con 2% de SVF HCI/BSA, TGFB corresponde a un tratamiento con TGF-beta de 200 pg/mL. Las 2 graficas superiores y las 2 graficas inferiores corresponden a dos experimentos identicos e independientes.
Parte experimental:
Ejemplo 1: Estudio transcripcional
Se realizo un estudio comparativo del perfil de expresion genico de la piel proveniente de una lesion de lentigo actmico (PL) y de piel adyacente no lesionada (PN).
El objeto de este estudio es identificar marcadores pertinentes, reproductibles y significativos que reflejan las alteraciones asociadas con la formacion del lentigo actmico, con el fin de utilizarlos como objetivos para tratamientos eficaces, o como biomarcadores para analizar la eficacia de un tratamiento dado.
En resumen, se reclutaron 15 voluntarias femeninas sanas con el fin de participar en un estudio transcriptomico “genoma completo" (chips Afimetrix). Para cada voluntaria, se diagnostico una lesion de tipo lentigo actmico en el dorso de la mano y el diagnostico del lentigo actmico se verifico por epiluminiscencia. Este examen permite
1°) verificar el diagnostico clmico de la lesion (lentigo actmico exclusivamente) segun los criterios patron de la union dermoepidermicas) estructura pigmentada en red, “estructura similar a huellas dactilares”) a diferencia de las efelides (ausencia de estructura pigmentada en red, pigmentacion homogenea en zonas de “bordes de polilla”) y queratosis seborreica planas (quistes o pseudoquistes multiples tipo miliar, zonas de “bordes de polilla”, aberturas pseudofoliculares y patron tipo huella dactilar) [Menzies et al; Stolz et al; Carli et al].
2°) limitar las zonas homogeneas en terminos de estructura/patron en el inferior de esas lesiones en donde seran hechas las biopsias cutaneas,
3°) establecer un valor fenotfpico basado en un analisis de imagenes cuantitativo con el programa informatico que se ha desarrollado sobre Matlab® (programa SQA, CMLA, ENS Cachan, UMR CNRS 8536).
Se realizo una biopsia de 3 mm centrada en la lesion asf como una biopsia de tamano identico en una zona de piel adyacente no lesionada. Los ARN totales de esta toma se extrajeron y amplificaron. Los sondeos se generaron por hibridacion sobre los chips Afimetrix, los perfiles de expresion de los genes se generaron para cada uno de las 30 biopsias (2 biopsias por voluntario), y se realizo un analisis comparativo entre PN o PL por voluntaria y sobre el conjunto de las voluntarias. Los genes estadfsticamente expresados de manera diferencial (media geometrica de las pacientes) se compilaron en listas y reagruparon por familias funcionales.
De manera sorprendente e inesperada, los inventores encontraron una expresion diferencial para varias centenas de genes entre el PN y el PL. Se constituyo una lista de 437 genes y represento una firma molecular grande de la lesion lentigo actmico. Entre los 437 genes identificados, 169 genes se revelaron regulares de manera positiva (“sobrerregulados”) en la lesion “lentigo actmico” comparada con la piel la sana mientras que 269 genes eran regulares de manera negativa en el lentigo actmico (“subregulados”).
El conjunto de estos genes se subdividio en varias familias funcionales.
Entre los genes funcionales o los procesos biologicos identificados, los inventores han encontrado de manera sorprendente una familia de genes que reflejan a nivel molecular un disfuncionamiento de la matriz extracelular y de la union dermoepidermica en el lentigo actmico. Estos genes reagrupados en esta familia funcional nominada “matriz extracelular” no han sido descritos jamas anteriormente, asociados con el lentigo actmico y estan listados mas abajo en las Tablas 1 y 2:
Genes subexpresados en el lentigo actmico con respecto a la piel sana TGFBR2, TGFBI, BMP2, SMAD3, THBS2, TGFBR3, SEMA5A, SMAD7, EFEMP1, ASPN, PAPLN, CHSY1, MXRA5, LYZ, PLAU, TIMP1, FRAS1, LEPREL1, MATN2, DST, ITGA2, COL6A3, CRTAP, LAMC1, LAMB3, LAMA3, ITGAV, ITGB1 y ACTN1.
Genes subexpresados en el lentigo actmico con respecto a la piel sana SOSTDC1, ECM1, HS3ST6, FLRT2, CTSL2 y PLOD2.
Estos genes codifican para los componentes de la dermis o de las protemas implicadas en la smtesis de los 10 componentes de la matriz extracelular, relacionados con la renovacion o a la remodelacion de esta matriz conjuntiva, asf como los genes que codifican para las protemas de matriz asociadas a la union dermoepidermica y la zona de la membrana basal. Esta familia contiene tambien genes unidos a la ruta del TGFbeta, implicada en la smtesis de los componentes de la matriz extracelular. Los genes de esta familia son sobreexpresados principalmente en el lentigo actmico.
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Esta familia de genes es totalmente original en un desorden pigmentario e implica un papel preponderante del estroma en el lentigo actmico.
Tabla 1: Lista de los genes de la familia “matriz extracelular” encontrados sobreexpresados en el lentigo actmico
Subfamilia ruta/funcion
Denominacion Numero de acceso Nombre completo Tasa de modulacion
TGFb/SMAD
THBS2 NM 003247 Trombosfondina 2 3.41
TGFBI
NM_000358 Factor de crecimiento de transformacion beta inducido, 68 kDa 2.22
BMP2
NM_001200 Hueso morfogenico protema 2 2.03
SMAD3
NM_005902 SMAD miembro de familia 3 1.76
TGFBR3
NM_003243 Factor de crecimiento de transformacion, beta receptor III 1.68
TGFBR2
D50683 NM_001024847 NM 003242 Factor de crecimiento de transformacion, beta receptor II (70/80kDa) 1.61
SEMA5A
NM_003966 Sema dominio, siete trombosfondina repite (semaforina) (semaforina 5A, semaforina F) 1.56
SMAD7
NM_005904 SMAD miembro familia 7 1.52
Colagenos
LEPREL1 NM 018192 Leprecan como 1 2.64
COL6A3
NM_004369 Colageno tipo VI, alfa 3 1.90
CRTAP
NM_006371 cartflago asociado a protema (LEPREL3) 1.60
Lamininas
LAMC1 NM_002293 laminina, gama 1 (antiguamente LAMB2) 1.96
Lamininas
LAMB3 L25541 NM_000228 NM_001017402 NM 001127641 laminina, beta 3 1.94
LAMA3
NM_000227 laminina, alfa 3 1.64
Subfamilia ruta/funcion
Denominacion Numero de acceso Nombre completo Tasa de modulacion
Integrinas
ITGA2 NM_002203 integrina, alfa 2 (CD49B, alfa 2 subunidad de VLA-2 receptor) 1.62
ITGAV
NM_001145000 NM_001144999 NM 002210 integrina, alfa V (vitronectina receptor,) 1.62
ITGB1
NM 133376 integrina, beta 1 1.55
Remodelacion de matriz
MXRA5 NM_015419 Matriz remodelante asociada 5 2.40
LYZ
NM_000239 lisozima (renal amiloidosis) 2.33
TIMP1
NM_003254 TIMP metalopeptidasa inhibidor 1 2.26
PLAU
NM_002658 Plasminogeno activador, uroquinasa 1.81
Proteoglicanos y glicoprotemas extracelulares
EFEMP1 NM_001039348 NM_001039349 NM 004105 EGF que contiene fibulina como protema 1 matriz extracelular (FIBULINE 3) 3.86
ASPN
NM 017680 Asporina 2.77
PAPLN
NM_173462 papilina, proteoglicano como glicoprotema sulfatada 2.51
CHSY1
NM_014918 carbohidrato (condroitina) sintasa 1 1.50
Membrana basal
FRAS1 NM 025074 Fraser smdrome 1 4.59
MATN2
NM 002380 Matrilina 2 2.61
DST
NM_001723 NM 015548 Distonina = BPAG1 2.24
Actina
ACTN1 NM_001130005 NM_001130004 NM_001102 Actinina, alfa 1 1.58
Tabla 2: Lista de los genes de la familia “matriz extracelular” encontrados subexpresados en el lentigo actinico
Subfamilia ruta/funcion
Denominacion Numero de acceso Nombre completo Tasa de modulacion
Proteoglicanos
HS3ST6 NM_001009606 Heparan sulfato (glucosamina) 3-O- sulfotransferasa 6 0.44
Colagenos
PLOD2 NM_000935 NM_182943 procolageno-lisina, 2-oxoglutarato 5- dioxigenasa 2 0.45
Proteoglicanos
FLRT2 NM_013231 Protema 2 transmembrana rica en fibronectina leucina 0.47
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Subfamilia ruta/funcion
Denominacion Numero de acceso Nombre completo Tasa de modulacion
Remodelacion de matriz
CTSL2 NM_001333 catepsina L2 (degradacion por peptidasa MEC ) 0.54
Proteoglicanos
ECM1 U65932 NM_004425 NM 022664 Matriz extracelular protema 1 0.54
TGFb/SMAD
SOSTDC1 NM_015464 Esclerostina campo que contiene 1 (ectodina, BMP antagonista) 0.62
Ejemplo 2: Materiales y metodos
Se han seleccionado 15 voluntarias, mujeres, fototipos II a IV, edades de 50 a 70 anos.
Los lentigos actmicos se escogen del dorso de la mano, de tamano mmimo de 3 mm. Se caracterizan por epiluminiscencia. Los diferentes avances de la caracterizacion por epiluminiscencia se presentan en el ejemplo 1.
Se realizaron dos biopsias de 3 mm de diametro en una de las manos de cada paciente. Para cada voluntario, una de las biopsias corresponde a la lesion del lentigo actmico (PL) y otra a una zona adyacente de piel no lesionada (PN) verificada igualmente en epiluminiscencia).
Las biopsias de 3 mm se colocan, desde la toma, en el RNAlater (Quiagen referencia 76106), de 16 a 24 horas a 4°C. Al dfa siguiente las muestras se colocaron a -20°C hasta las etapas de homogenizacion y extraccion. Para la descongelacion, las muestras se cortaron con escalpelo para facilitar la homogenizacion, antes de transferirlas en el regulador de lisis. La homogenizacion se realizo con un torno (Fisher Labosi ref A6391000) con pistones en polipropileno libre de RNasa (Fisher Labosi ref A1419753) permitiendo la homogenizacion directa en los tubos Eppendorf 1.5 mL.
El ARN se extrajo con los kits RNeasy micro (Qiagen ref: 74004) siguiendo las instrucciones del proveedor. La cuantificacion de los ARNs se realiza por una dosificacion Ribogreen (Molecular Probes ref: R11490). La calidad se valido con un bioanalizador Agilent 2100 que da la relacion de las intensidades de los ARNs ribosomica es 28S en 18S asf como un Numero de Integridad de ARN (RIN) que tiene en cuenta la degradacion de los ARNs. Un ARN de buena calidad tiene una relacion >1.5 y un RIN >7.
Se realiza una reaccion de transcriptasa reversa (RT) para obtener los ADNc correspondientes.
Se sintetizaron dos sondas para muestras a partir de 50 ng de ARNs con una etapa de amplificacion. Los ADNc son marcados por fluorocromos e hibridados sobre chips de ADN Affymetrix® que permiten revelar el nivel de expresion del conjunto de los genes del genoma humano. (Biochips de ADN de tipo Affymetrix U133A 2.0 U133A 2.0 que contienen 54.000 sondas, que permiten hacer el estudio de la expresion de 47.000 transcriptos, que incluyen 38.500 genes caracterizados). Affymetrix Microarray Suite (Mas 5.0) permite obtener, para cada transcripto, una senal de deteccion. Despues de la revelacion de las hibridaciones especificas y el tratamiento de los datos brutos (extraccion, sustraccion del ruido de fondo, normalizacion), la expresion de los genes se comparo entre la piel sana y la piel lesionada. Se han hibridado 2 chips Affymetrix HG_U133 mas por las muestras.
La calidad de hibridacion se efectuo por el metodo AffyPLM (Bolstad et coll., 2005) y por el metodo ACP (Analisis en Componentes Principales).
Los pacientes no son retenidos para la continuacion del analisis sf los 2 chips de Affymetrix tienen una calidad de hibridacion correcta. Para el presente estudio, han podido ser analizados 13 pacientes de los 15 iniciales.
La realizacion de un perfil transcriptomico de la piel sana y de la piel correspondiente al lentigo actmico ha permitido generar listas de genes diferencialmente expresados en las dos situaciones, e identificar biomarcadores del lentigo actmico. Las listas son generadas bajo forma de relacion de expresion entre PL (piel lesionada) versus PN (piel normal). Se retiene la relacion que representa la media geometrica de los 13 pacientes.
Generacion de las listas de los genes diferencialmente expresados entre piel lesionada y piel sana. Etapas:
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- Filtros de los que identifican Affymetrix (ProbeSets): solo se retienen las ProbeSets que se presentan en las dos replicas de al menos una biopsia. Despues este filtro se retienen 23968 ProbeSets.
- Supresion del efecto paciente: Con el fin de suprimir el efecto paciente observado en los resultados de los analisis diferenciales, la expresion de cada ProbeSet se dividio por la media geometrica de 4 valores de ProbeSets correspondientes a los 4 chips.
- Analisis diferencial: Se ha generado un reagrupamiento de las listas obtenidas por 2 metodos, el analisis cNMF (consensos No Negativos Matriz de Factorizacion (Lee et Seung (1999), Brunet et coll. (2004), Fogel et coll. (2007), Fogel et coll. (2008)).) que ha identificado 2638 ProbeSets (de las cuales 1521 inducidos y 1117 reprimidos) y el metodo PLS (Regresion Parcial por Mmimos Cuadrados) que ha identificado 610 modulos ProbeSets. La union de 2 listas ha permitido obtener una lista de 3248 ProbeSets.
- Filtro en la modulacion: Para los genes inducidos, seleccion de las ProbeSets que tienen una media geometrica de 13 veces corregida (FC) >1.5: lista de 562 ProbeSets inducidas. Para los genes reprimidos, seleccion de las ProbeSets que tienen una media geometrica de 13 veces corregidas FC <0.67: lista de 807 ProbeSets reprimidos. Para un total: 562 + 807 = 1369 ProbeSets modulados, sean 1007 ProbeSets despues de la eliminacion de las duplicaciones (1002 se aproxima cNMF + 5 aproximaciones PLS)
- Filtro en los 13 pacientes: Visualizacion de las modulaciones de 1007 ProbeSets bajo la forma de histogramas y seleccion de modulos ProbeSets en el mismo sentido en los 13 pacientes. Lista final de 132 ProbeSets que diferencian las biopsias lesionadas de las biopsias no lesionadas y que son moduladas en los mismos sentidos de los 13 pacientes del estudio.
- Analisis de la lista de 1007 ProbeSets
o Se ha aplicado un filtro en el valor P (< 0.00001) con el fin de no retener mas que los genes mas discriminantes, a la lista de 1002 ProbeSets un filtro sobre el valor P, P < 0.00001. Despues de este nuevo filtro 827 ProbeSets a los cuales se han agregado las 5 ProbeSets provenientes de la aproximacion PLS^ lista de 832 ProbeSets
Despues de la busqueda de anotaciones, eliminacion de los genes no anotados y eliminacion de los doblones, se ha establecido una lista de 437 genes diferencialmente expresados entre PL y PN. 169 genes son sobreexpresados en el LA y 269 son subexpresados.
Con la ayuda de las herramientas, Gene ontology, PubMed, Scopus se buscan las funciones de los genes y los genes son clasificados por familias funcionales.
Ejemplo 3: Moduladores:
Existen compuestos conocidos para modular en el sentido de busqueda de las protemas desreguladas en el lentigo. Para la familia de los genes/protema de la matriz celular, se podran citar:
- fibratos de los cuales por ejemplo el fenofibrato que elimina la expresion de SMAD3,
- alcaloides de los cuales la oximatrina que disminuye SMAD3, o los polifenoles como por ejemplo el acido salvianolico B que disminuye SMAD3 y TGFBR2,
- extractos naturales particularmente hierbas medicinales como la Wen-pi-tang-hab-wu-ling-san que disminuye SMAD3,
- compuestos de la familia de los imidazoles antagonistas de TGF-pR1 como el SB-431542 que disminuye SMAD3,
- ciertos ARNmi, particularmente los miR183 y miR29b que disminuyen ITGB1,
- los inhibidores de uroquinasa tipo plasminogeno activador (uPA) como la p-aminobenzamidina o la B428 benzo[b]tiofeno-2-carboxamodina sustituida en 4 que disminuye la actividad de PLAU,
- compuestos de la familia de los fenilacetatos como el NaPA que disminuye la expresion de PLAU,
- compuestos de la familia qmmica de las tiazolidinodionas de las cuales por ejemplo la pioglitazona que disminuye BMP2 y COL6A3,
- compuestos de la familia qmmica de los tiazoles de los cuales por ejemplo el GW-0742 que disminuye la expresion de BMP2,
- compuestos de la familia de los tetrazoles como el Valsartan que disminuye TIMP1.
Con relacion a la protema enzimatica PLOD2 de la familia extracelular subexpresada en el lentigo, se podran emplear los compuestos siguientes para restaurar su tasa:
5 - compuestos de la familia de las quinazolinas como el Vandetanib (ZD64745 5) que aumenta PLOD2.
Pueden emplearse igualmente otros tipos de moduladores para permitir la correccion de expresion/cantidad o actividad de las protemas desreguladas. Se pueden citar:
10 - acidos nucleicos (preferiblemente ARN antisentido o ARNi), anticuerpos neutralizantes,
- medios electricos, luminoso, mecanico o termico. A tttulo de ejemplo, podran utilizarse ultrasonidos pulsados de baja intensidad (LIPUS) para aumentar la cantidad o la actividad de PLOD2.
15 Al contrario en caso de mancha hipopigmentaria, los modulos preferidos seran aquellos que aumentan la tasa de expresion o de actividad de las protemas provenientes de los genes TGFBR2, TGFBI, BMP2, SMAD3, THBS2, TGFBR3, SEMA5A, SMAD7, EFEMP1, ASPN, PAPLN, CHSY1, MXRA5, LYZ, PLAU, TIMP1, FRAS1, LEPREL1, MATN2, DST, ITGA2, COL6A3, CRTAP, LAMC1, LAMB3, LAMA3, ITGAV, ITGB1 y ACTN1 y aquellos que disminuyen la tasa de expresion o de actividad de las protemas provenientes de los genes SOSTDC1, ECMl, 20 HS3ST6, FLRT2, CTSL2 y PLOD2.
En la Tabla 3 se reportan igualmente ejemplos de tales moduladores.
Tabla 3. Lista de moduladores de genes implicados en el lentigo actmico
Subfamilia/
Nombre Modulador gen/protema Sentido de la
Funcion
modulacion
TGFBI, Polvo oseo desmineralizado Aumenta
TGFB/ SMAD
Factor p de crecimiento transformante, 68kDa (Demineralized bone powder, DBP) expresion
BMP2, protema 2 Pioglitazona Disminuye expresion
morfogenica de hueso GW0742 Disminuye expresion
Cristata L flavonoide Aumenta expresion
Fenofibrato Disminuye
Oximatrina expresion
Acido Salvianolico B (Sal B),
TGFB/SMAD
SMAD3, miembro 3 de la componente de Danshen (una hierba tradicional china utilizada para las enfermedades
familia SMAD renales cronicas) antioxidante y de proteccion celular.
SB-431542 (un inhibidor espedfico de TpR-I quinasa)
Extracto de Wen-pi-tang-Hab-Wu- ling-san (WHW) Disminuye fosforilacion
TGFB/ SMAD
TGFBR2, Factor de crecimiento transformante, p receptor II (70/80kDa) Acido salvianolico B (SA-B) Disminuye expresion
Oximatrina
TGFB/ SMAD
SMAD7, miembro 7 de la familia SMAD 3-desoxiglucosona (Precursor de producto final de glicacion avanzada) Aumenta expresion
Tetrandrina
N-acetil-seril-aspartil-lisil- prolina(Ac-SDKP)
Colageno
COL6A3, colageno, tipo VI, alfa 3 Pioglitazona Disminuye expresion
Integrina
ITGB1, integrina, beta miR-183 , miR-29b Disminuye expresion
Remodelacion de matriz
LYZ, lisozima (amiloidosis renal) Polipeptido activador de la adenilato ciclasa de pituitaria (PACAP) PACAP38 Aumenta expresion
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Subfamilia/ Funcion
Nombre Modulador gen/protema Sentido de la modulacion
Remodelacion de matriz
TIMP1, Inhibidor 1 de Valsartan, (bloqueador del receptor de angiotensina II tipo 1 ARB) Extracto vegetal de Lupinus albus LU10 Disminuye expresion.
metalopeptidasa
Polvo oseo desmineralizado (Demineralized bone powder, DBP) Aumenta expresion.
Fenilacetato de sodio (NaPA) Disminuye expresion
Remodelacion de matriz
PLAU, activador de plasminogeno, uroquinasa P-aminobenzamidina (Inhibidor del activador de plasminogeno tipo Uroquinasa (uPA)):B428 4, B392 benzo[b]tiofen-2-carboxamidinas sustituidas. (Inhibidor del activador de plasminogeno tipo Uroquinasa (uPA) Disminuye actividad
Tienopiridina SR 25989 (Inhibidor de angiogenesis derivado esterificado de ticlopidina), Notoginsenosido R1 (procedente de PANAX notoginseng) Aumenta expresion
Asimilado Proteoglicano
ASPN, Asporina letrozol, anastrozol Aumenta expresion
Membrana basal
MATN2, matrilina 2 Vitamina K2 menoquinona Aumenta expresion
beta-aminopropionitrilo (bAPN) Disminuye expresion
Colageno
PLOD2 , procolagenolisina, 2-oxoglutarato 5-dioxigenasa 2 Ultrasonido pulsado de baja intensidad Low-intensity pulsed ultrasound (LIPUS) Aumenta expresion/actividad
Vandetanib (ZD6474 5)
Remodelacion de matriz
CTSL2 ,catepsina L2 Derivados de fenilalanina Disminuye actividad
Ejemplo 4: Estimulacion de la pigmentacion de las pieles reconstruidas pigmentadas por tratamiento al TGFbeta 1) Protocolo de tratamiento.
El protocolo de tratamiento de las pieles reconstruidas pigmentadas (PRP) a TGFBETA se ilustra en la figura 1 y es el siguiente:
Las dermis equivalentes (redes) que contienen fibroblastos que viven en una matriz de colageno son adheridas en el fondo de una caja de petri (J-4) y son tratadas con TGFbetal (T en la figura 1) en la concentracion de 200 pg/mL (vehnculo: HCl 4 mM y 1 mg/mL de BSA; medio: MEM 3F'con 2% de FBS), durante 3 dfas (J-3; J-2 y J-1 en la figura 1). Luego la epidermis pigmentada se reconstruye sobre la dermis equivalente sembrando los queratinocitos y los melanocitos (J-0). El cultivo se mantiene en inmersion durante 1 semana y en emergencia durante 2 semanas (figura 1).
Se toman muestras para analisis de la pigmentacion:
- la integracion y la morfologfa de los melanocitos se observan despues de la reaccion Dopa sobre la epidermis desprendida;
- la medida colorimetrica de la luminancia informa sobre el grado de claridad de las muestras (cuanto mas baja es L* mas oscurecidas son las muestras);
- la presencia de melanina se observa despues de la coloracion Fontana Masson de los cortes de piel; y
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- la cantidad de melanina presente en la epidermis se mide por analisis de imagenes.
2) Resultados:
Los resultados muestran que despues de un tratamiento con el TGFbeta 1 a 200 pg/mL y comparativamente al control (figuras 2 y 3):
- los melanocitos estan siempre presentes en la epidermis y conservan una morfolog^a correcta dendntica;
- los depositos de melanina son mas importantes en la epidermis;
- la luminancia de las muestras disminuye (oscurecimiento de las pieles reconstruidas tratadas);
- el contenido de melanina se aumenta, visiblemente por observacion de los cortes coloreados con Fontana Masson y es objetivado por la cuantificacion de la melanina por analisis de imagenes.
El experimento se renueva una segunda vez y confirma los resultados obtenidos (figura 3).
Los resultados demuestran que una activacion de la ruta de senalizacion del TGF-beta es responsable de una pigmentacion mas importante de la piel en comparacion con la ausencia de activacion de esta ruta de senalizacion.
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Claims (10)

  1. 5
    10
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    40
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    55
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    65
    REIVINDICACIONES
    1. Metodo de caracterizacion de una mancha pigmentaria cutanea aparente o supuesta en un ser humano, que comprende la comparacion de los niveles de expresion, en las muestras de piel proveniente de la dicha mancha y de la piel adyacente no lesionada, dentro de las celulas de la dermis, de al menos un gen dermico unido a la matriz extracelular seleccionado entre:
    A. la lista constituida por los genes TGFBR2, TGFBI, BMP2, SMAD3, THBS2, TGFBR3, SEMA5A, SMAD7 y SOSTDC1, o bien entre
    B. la lista constituida por los genes FRAS1, LEPREL1, MATN2, DST, PLOD2, ITGA2, COL6A3, CRTAP, LAMC1, LAMB3, LAMA3, ITGAV, ITGB1 y ACTN1,
    en el que la dicha mancha pigmentaria cutanea es un lentigo actmico.
  2. 2. Metodo segun la reivindicacion 1, que comprende la comparacion de los niveles de expresion y al menos dos genes distintos preferiblemente de al menos cinco genes distintos seleccionados entre uno y/u otro de las listas A y B.
  3. 3. Metodo segun la reivindicacion 1, en donde el dicho gen se selecciona entre la lista constituida de los genes TGFBR2, TGFBI, BMP2, SMAD3, THBS2 y TGFBR3.
  4. 4. Metodo segun la reivindicacion 1, en donde la dicha mancha se confirma como lentigo actmico cuando el nivel de expresion es
    - superior en la muestra proveniente de la mancha con respecto al nivel en la muestra de piel adyacente no lesionada, si el gen es seleccionado entre TGFBR2, TGFBI, BMP2, SMAD3, THBS2, TGFBR3, SEMA5A, SMAD7, FRAS1, LEPREL1, MATN2, DST, ITGA2, COL6A3, CRTAP, LAMC1, LAMB3, LAMA3, ITGAV, ITGB1 y ACTN1, e
    - inferior en la muestra de piel proveniente de la mancha con respecto al nivel en la muestra de piel adyacente no lesionada, si el gen se escoge entre SOSTDC1 y PLOD2.
  5. 5. Metodo in vitro de evaluacion de la eficacia de un tratamiento de los lentigos actmicos, que comprende la comparacion de los niveles de expresion dentro de las celulas de la dermis en una muestra de piel proveniente de un tal lentigo, antes y despues del tratamiento, de al menos un gen dermico unido a la matriz extracelular seleccionado entre la lista constituida por los genes TGFBR2, TGFBI, BMP2, SMAD3, THBS2, TGFBR3, SEMA5A, SMAD7 y SOSTDC1, o bien entre la lista constituida de los genes FRAS1, LEPREL1, MATN2, DST, PLOD2, ITGA2, COL6A3, CRTAP, LAMC1, LAMB3, LAMA3, ITGAV, ITGB1 y ACTN1.
  6. 6. Metodo segun la reivindicacion 5, en donde el dicho tratamiento se considera como eficaz para el tratamiento de lentigos actmicos cuando el nivel de expresion es:
    - inferior despues del tratamiento con respecto al nivel de expresion antes del tratamiento, si el gen se selecciona entre TGFBR2, TGFBI, BMP2, SMAD3, THBS2, TGFBR3, SEMA5A, SMAD7, FRAS1, LEPREL1, MATN2, DST, ITGA2, COL6A3, CRTAP, LAMC1, LAMB3, LAMA3, ITGAV, ITGB1 yACTN1, y
    - superior despues del tratamiento con respecto al nivel de expresion antes del tratamiento si el gen se selecciona entre SOSTDC1 y PLOD2.
  7. 7. Metodo in vitro de evaluacion de la eficacia de un tratamiento de los lentigos actmicos, que comprende la comparacion, antes y despues del tratamiento, del nivel de expresion en las celulas de la dermis en un modelo celular representativo de la piel de al menos un gen dermico unido a la matriz extracelular seleccionado entre la lista constituida por los genes TGFBR2, TGFBI, BMP2, SMAD3, THBS2, TGFBR3, SEMA5A, SMAD7 y SOSTDC1, o bien entre la lista constituida de los genes FRAS1, LEPREL1, MATN2, DST, PLOD2, ITGA2, COL6A3, CRTAP, LAMC1, LAMB3, LAMA3, ITGAV, ITGB1 y ACTN1, o bien del nivel de expresion o de actividad del producto de expresion del dicho gen seleccionado.
  8. 8. Metodo cosmetico de tratamiento o de prevencion del lentigo actmico no patogenico de la piel humana, que comprende la modulacion del nivel de expresion o de la actividad de un gen dermico unido a la matriz extracelular, en donde el dicho gen se selecciona entre la lista constituida por los genes TGFBR2, TGFBI, BMP2, SMAD3, THBS2, TGFBR3, SEMA5A, SMAD7 y SOSTDC1 o bien entre la lista constituida de los genes FRAS1, LEPREL1, MATN2, DST, PLOD2, ITGA2, COL6A3, CRTAP, LAMC1, LAMB3, LAMA3, ITGAV y ACTN1.
  9. 9. Metodo segun la reivindicacion 8, en donde el dicho metodo comprende la modulacion de al menos dos genes, preferiblemente de al menos cinco genes distintos, seleccionados entre la lista constituida por los genes TGFBR2, TGFBI, BMP2, SMAD3, THBS2, TGFBR3, SEMA5A, SMAD7 y SOSTDC1 y/o entre la lista constituida de los genes
    FRAS1, LEPREL1, MATN2, DST, PLOD2, ITGA2, COL6A3, CRTAP, LAMC1, LAMB3, LAMA3, ITGAV y ACTN1, en donde la dicha modulacion es una inhibicion si el gen es seleccionado entre TGFBR2, TGFBI, BMP2, SMAD3, THBS2, TGFBR3, SEMA5A, SMAD7, FRAS1, LEPREL1, MATN2, DST, ITGA2, COL6A3, CRTAP, LAMC1, LAMB3, LAMA3, ITGAV y ACTN1, y un aumento del nivel de expresion o de la actividad si el gen se selecciona entre 5 SOSTDC1 y PLOD2.
  10. 10. Utilizacion de un modulador del nivel de expresion o de la actividad del producto de expresion de al menos un gen dermico seleccionado entre la lista constituida por los genes TGFBR2, TGFBI, BMP2, SMAD3, THBS2, TGFBR3, SEMA5A, SMAD7 y SOSTDC1, o bien entre la lista constituida de los genes FRAS1, LEPREL1, MATN2, 10 DST, PLOD2, ITGA2, COL6A3, CRTAP, LAMC1, LAMB3, LAMA3, ITGAV y ACTN1, para una aplicacion cosmetica en el tratamiento de lentigos actmicos no patogenicos, siendo el dicho modulador un antisentido, un microARN o un ARNsi dirigido contra el gen dermico seleccionado y que inhibe la expresion del dicho gen.
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