WO2007097468A1 - 金属の比色測定方法及び測定試薬 - Google Patents

金属の比色測定方法及び測定試薬 Download PDF

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WO2007097468A1
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iron
metal
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PCT/JP2007/053852
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Kazuhiko Higurashi
Naomi Iizuka
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Shino-Test Corporation
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    • G01N21/77—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator
    • G01N21/78—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator producing a change of colour

Definitions

  • the present invention relates to a metal measuring method and a measuring reagent.
  • the present invention is particularly useful in fields such as chemistry, life science, analytical chemistry, and clinical testing. Background art
  • metals in the living body there are various kinds of metals in the living body, and they perform various functions. For this reason, the measurement of metals in biological samples is recognized as important.
  • zinc is one of the metal elements that are widely distributed in the living body and is essential for sustaining life. When deficiency occurs, it is known that symptoms such as growth disorders and taste disorders occur. Therefore, the measurement of zinc in samples is an indispensable test for diagnosis and treatment of these diseases.
  • the Kirei color former used in the colorimetric measurement method is, for example, 2- (5-Promo-2-Pyrylylazo) -15 (N-Propyl-N-Sulfopropylamino) phenol sodium (Hereafter, 5 _ B r — PAPS may be abbreviated.), 2 — (5 — Two-necked mouth — 2 — Vigilylazo) 1 5 (N-propyl- N-sulwood propylamino) Phenols ⁇ (hereinafter, Nitro) Abbreviated as PAPS).
  • nematic color formers are generally known to react with multiple metals. For this reason, when measuring a specific metal, a metal other than the metal to be measured is mixed into the measurement reaction solution from a biological sample, measurement reagent, instrument, etc. , Measurement There was a problem of giving a positive error to the measured value of the target metal. For this reason, it was necessary to use a masking agent for masking metals other than the metal to be measured in the measurement of metals using chelate color formers.
  • this 5-Br-PAPS when measuring zinc using 5-Br-PAPS, this 5-Br-PAPS also reacts with metals other than zinc, such as iron, copper, and nickel. It is necessary to use a masking agent for masking nickel (for example, Japanese Patent Application Laid-Open No. 60-120 029).
  • iron masking agents for example, citrate, sodium fluoride, nitric acid acetic acid, etc.
  • copper masking agents for example, salicylaldoxy, Diti-aged carboxyglycine, di-aged carboxysarcosine, and the like are known as nickel masking agents, for example, dimethyldaroxy candy.
  • an object of the present invention is to coexist or contain a masking agent of iron, copper and / or nickel which is a metal other than the metal to be measured. Therefore, it is to provide a measuring method and a measuring reagent capable of accurately measuring the metal concentration in the sample.
  • the subject of this invention is providing the masking agent of iron, copper, and / or nickel, and is providing the method of suppressing the positive error by iron, copper, or nickel contained in a sample.
  • an object of the present invention is to provide a measurement method and a measurement reagent that do not require a sample deproteinization operation in measuring a metal in a sample.
  • the present inventor found that, in a method and a reagent for colorimetric measurement of metals in a sample using a neat color developer, iron, copper and nickel or nickel The present inventors have found that the concentration of the metal in the sample can be accurately measured by coexisting or including the above-mentioned masking agent. Thus, the present invention has been completed.
  • the present invention provides the following inventions.
  • the chelating color former is 2- (5-bromo-1-pyridylazo) -5 (N-propyl-N-3-sulfopropylamino) phenol or a salt thereof, 1) Colorimetric measurement method for metals in the sample.
  • nepheline color former is 2- (5_nitro-2-pyridylazo) -5 (N-propyl-1-N-3-sulfopropylamino) phenol or a salt thereof.
  • the masking agent for iron, copper and nickel is In the sample according to any one of (1) to (5) above, which is one or more masking agents selected from propane, TAPS, TAPSO, TES, ⁇ lysine, ⁇ rishydroxymethylamino methane or bicine Colorimetric measurement method for metals.
  • the masking agent of iron, copper and Z or nickel is represented by the following general formula (I) (wherein 1 to 6 are hydrogen atoms, unsubstituted or substituted, hydroxyl groups, carboxyl groups
  • the metal in the sample to be colorimetrically measured is zinc, (1) to (1)
  • the above-mentioned color former is a 2— (5-Promo 2—pyridylazo) 5 (N-propyl-N-3-sulfopropylamino) phenol or a salt thereof.
  • Metals in the listed samples A colorimetric reagent.
  • the colorimetric reagent for measuring the color of a metal in a sample according to any one of (viii) to (13), further comprising a surfactant.
  • the masking agent for iron, copper and / or nickel is selected from bis-trispropane, TAPS, TAPSO, TES, tricine, bis-hydroxymethylaminomethane or bicine.
  • a masking agent of iron, copper and Z or nickel is represented by the following general formula (I) (wherein X1 to X6 are hydrogen atoms, unsubstituted or substituted, hydroxyl groups Or a carboxyl group, an SH group or an amino group).
  • the colorimetric reagent for measuring a metal in a sample according to any one of (11) to (15).
  • the clear color former is 2- (5-nitro-2-pyridylazo) -5 (N-propyl-N-3-sulfopropylamino) phenol or a salt thereof (2 1 ) A method for suppressing positive errors caused by iron, copper or nickel contained in the sample described.
  • the iron, copper and / or nickel masking agent is selected from bis-trispropane, TAPS, TAPSO, Ding ES, ⁇ lysine, ⁇ lyshydryl oxymethylamino methane or bicine.
  • (2 1) A method for suppressing positive errors caused by iron, copper or nickel contained in the sample according to any one of (2 3).
  • the masking agent of iron, copper and Z or nickel is represented by the following general formula (I) (wherein X1 to X6 are hydrogen atoms, unsubstituted or substituted, hydroxyl groups Which is a compound represented by any one of (2 1) to (2 4), characterized in that it is a compound represented by the following formula: A method to suppress positive errors caused by nickel.
  • a masking agent of iron, copper and Z or nickel, which is a metal other than the metal to be measured is present or contained. Even if iron, copper, or nickel is mixed in the sample, the concentration of the target metal can be measured accurately.
  • the present invention relates to a method for measuring a colorimetric color of a metal in a sample using a nepheline color former, and a method for measuring a metal characterized by the coexistence of an iron, copper or nickel masking agent.
  • a colorimetric reagent for measuring metal in a sample to be measured a metal measuring reagent characterized by containing a masking agent for iron, copper or nickel, and a masking agent for iron, copper and / or nickel, and in the sample This is a method to suppress positive errors caused by iron, copper or nickel contained.
  • the sharp color former is a reagent that can be used for colorimetric measurement of metals, and when measuring a metal other than iron, copper, or nickel (measuring metal), it contacts with the measuring metal. , A substance that changes in color tone or absorption wavelength when combined.
  • the present invention is suitable for chelate color formers that react with iron, copper, or nickel mixed in a sample and may give a positive error to the measured value of the measurement target metal.
  • the concentration of the neat color developer depends on the concentration of the metal to be measured. If the concentration of the metal to be measured is high, it must be increased according to the concentration. Usually, in the measurement reaction liquid after mixing the sample and the measurement reagent, it is preferably in the range of 10 to 50 AM, particularly preferably in the range of 10 to 50 M.
  • a colorimetric measurement of a metal in a sample is performed by coexisting or containing a masking agent of iron, copper and / or nickel.
  • a masking agent for iron, copper and / or nickel for example, bis-risk propane, bis-squirrel, TAPS, TAPSO, TES, lysine, ris-hydroxymethylamino methane, BES or Bicine and the like can be mentioned.
  • bis-—rispropane, TAPS, TAPS0, TES, lysine, trishydroxymethylaminomethane or bicine as a masking agent for iron, copper, and nickel or nickel.
  • iron, copper and nickel can be masked, and the following general formula (I) (wherein X 1 to X 6 are hydrogen atoms, unsubstituted or substituted). Which is a hydroxyl group, a carboxyl group, an SH group or an amino group).
  • the concentration of the masking agent for iron, copper and / or nickel depends on the concentration of iron, copper or nickel in the sample. If the concentration of iron, copper or nickel is high, it must be increased according to the concentration. There is. Usually, for example, in the measurement reaction solution after mixing the sample and the measurement reagent, it is preferably in the range of 5 to 150 mM, and particularly preferably in the range of 5 to 50 mM. That's right. Further, there is no problem if the concentration of the masking agent exceeds 1550 mM, but a sufficient effect can be obtained with that amount.
  • the concentration of the masking agent may be in the above range, and the two-step method (two reagent system).
  • the sample and the first reagent are mixed in the ratio of the amount added when measuring the metal in the sample, and the sample, the first reagent, and the second reagent are measured for the metal in the sample.
  • the concentration of the masking agent in the measurement reaction liquid after mixing is within the above range, so that the masking agent is either the first reagent or the second reagent. It should be included.
  • the masking agent may be included in both the first reagent and the second reagent.
  • measuring method and measuring reagent are multi-step methods (3 or more reagents).
  • the color of the metal in the sample may be determined by coexisting or containing a surfactant.
  • a surfactant 3 ⁇ 4
  • the type of surfactant to be coexisted or contained in the invention is not particularly limited.
  • any of a nonionic surfactant, an anionic surfactant, a cationic surfactant, or an amphoteric surfactant Can also be used.
  • a nonionic surfactant it is preferable to use a nonionic surfactant.
  • examples of the nonionic surfactant include the following.
  • Polyoxyalkylene such as polyoxyethylene alkyl ether, polyoxypropylene alkyl ether, polyoxypropylene alkylphenyl ether, polyoxyethylene polystyryl phenyl ether, or polyoxyethylene polyoxypropylene glycol Lukylene ether compounds.
  • a polyhydric alcohol partial ester compound such as a glycerin fatty acid partial ester, a sorbyl fatty acid partial ester, a pentaerythritol fatty acid partial ester, a propylene glycol monofatty acid ester, or a sucrose fatty acid partial ester.
  • Amide or amine compound such as fatty acid diethanolamide, N 2, N-bis-2-hydroxyalkylamine, polyoxyethylene alkylamine, ⁇ rienoranolamine fatty acid ester, or ⁇ alkylamineoxide.
  • surfactant only one type of surfactant may be used, or two or more types of surfactants may be used in combination.
  • the concentration of the surfactant is preferably in the range of 0.1 to 10% in the measurement reaction liquid after mixing the sample and the measurement reagent, and in the range of 0.1 to 5%. It is particularly preferred.
  • the surfactant concentration may be within the above range, and the two-step method (two-reagent method) If the sample and the second reagent are mixed in the ratio of the respective addition amounts when measuring the metal in the sample, and the sample, the first reagent and the second reagent are mixed in the metal in the sample.
  • the surfactant is mixed with the first reagent or the second reagent so that the concentration of the surfactant in the measurement reaction liquid after mixing is in the above range when mixing at the ratio of each addition amount when measuring It can be included in either of the two reagents.
  • the concentration of the surfactant in the measurement reaction solution after mixing is within the above concentration range. If present, the surfactant is preferably included in both the first reagent and the second reagent.
  • measuring method and measuring reagent are multi-step methods (3 or more reagents).
  • the metal in the sample may be colorimetrically measured by coexisting or containing a protein denaturant.
  • Examples of the protein denaturant coexisting or contained in the present invention include surfactants such as sodium dodecyl sulfate (SDS), and known ones such as urea and guanidine hydrochloride.
  • surfactants such as sodium dodecyl sulfate (SDS), and known ones such as urea and guanidine hydrochloride.
  • the concentration of the protein denaturant is preferably in the range of 0.2 to 6 M, particularly preferably in the range of 0.4 to 3 M in the measurement reaction solution after mixing the sample and the measurement reagent. There is no problem if the concentration of the protein denaturing agent exceeds 6 M, but a sufficient effect can be obtained up to that amount.
  • protein denaturant only one type of protein denaturant may be used, or two or more types of protein denaturants may be used in combination.
  • the concentration of the protein denaturant may be within the above range, and the two-step method (two-reagent system).
  • the sample and 1 reagent are mixed in the ratio of each added amount when measuring the metal in the sample, and the sample, 1st reagent and 2nd reagent are measured for the metal in the sample.
  • the protein denaturing agent is added to the first reagent or the second reagent so that the concentration of the protein denaturing agent in the measurement reaction solution after mixing is within the above range when mixing at the ratio of the respective addition amounts. It may be included in either.
  • the protein denaturing agent is preferably contained in both the first reagent and the second reagent.
  • the pH at the time of measuring a metal in a sample varies depending on the clay color former used for the measurement, and therefore may be appropriately set to the pH at the time of measuring a metal. Usually, it is preferably in the range of pH 5 to l 1.
  • pH 7 or more is preferable, and the range of pH 8 to: I 0 is particularly preferable.
  • the conventionally well-known buffer solution which has a buffer capacity in the said PH range can be used suitably.
  • buffers examples include carbonic acid, boric acid, phosphoric acid, ⁇ rishydroxymethylamino methane, imidazole, glycylglycine, MES, bis squirrel, ADA, ACES, bis ⁇
  • Each buffer such as Lispropane, PIPES, MOPSO, MOPS, BES, HEPES, TES, DIPSO, TAPSO, POPSO, HEPPS, HEPPS 0, ⁇ lysine, bicine, TAPS, CHES, CAPSO, or CAPS or their salts Can be mentioned.
  • the measuring method and measuring reagent of the present invention may be implemented and configured by a one-step method (one-reagent system), or a multi-step method (multi-reagent system) such as a two-step method (two-reagent system). It may be configured.
  • the concentration of each component described above, PH, and the like may be within the above ranges, and the multi-step method ( In the case of a multi-reagent system), when each of the measurement reagents is mixed in the ratio of the respective addition amounts when measuring the metal
  • the concentration of each component of each reagent may be determined so as to be in the concentration range of each component, the pH range, and the like.
  • the sample for measuring the metal is not particularly limited.
  • samples include biological samples, food, beverages, drinking water, drugs, reagents, river water, lake water, seawater, soil, and the like.
  • the biological sample is not particularly limited.
  • baboon or animal blood serum, plasma, urine, stool, semen, spinal fluid, saliva, sweat, tears, ascites, amniotic fluid, brain and other organs such as hair and skin
  • tissues and cells such as nails, muscles or nerves.
  • the food is not particularly limited, and examples thereof include meat, vegetables, grains, fruits, seafood, and processed foods.
  • Beverages are not particularly limited, and examples include juice, tea, coffee, alcohol, and milk.
  • the drug is not particularly limited, and examples thereof include infusion solutions, injection solutions, powders, and tablets.
  • the form of the sample is preferably a liquid, but if it is not a liquid, it is preferable to perform a pretreatment such as extraction or solubilization according to a known method to obtain a liquid sample.
  • the metal colorimetric measuring method and the colorimetric measuring reagent in the sample using the nephew color developing agent of the present invention will be specifically described.
  • the sample When measuring the metal in a sample, for example, the sample is mixed with a reagent containing a masking agent of iron, copper and nickel. The mixture of the sample and the reagent is mixed with a reagent containing a chelate color former, and the metal in the sample and the Kirei color developer are caused to undergo color reaction.
  • the concentration of the metal in the sample can be measured by measuring the absorbance of the measurement reaction solution before and after the color development and determining the change in the absorbance due to the coloration of the Kirei.
  • bis-tri as a masking agent for iron, copper and / or nickel.
  • a specific explanation will be given, taking as an example the case of colorimetric measurement of zinc in a sample in the presence of propane. .
  • the sample When measuring zinc in a sample, for example, the sample is mixed with a first reagent containing a screw and a spice pan. The mixture of this sample and the first reagent is mixed with the second reagent containing a sharp color former (for example, 5-Br-PAPS), and the zinc in the sample and the neat color developer are colored.
  • a sharp color former for example, 5-Br-PAPS
  • the measurement of the metal in this invention can be performed by any method of an end point method or a laser assembly method, in this invention, it is preferable to measure a metal by the end-boin method.
  • the method for suppressing the error due to iron, copper, or nickel contained in a sample is a colorimetric measurement method and a colorimetric measurement reagent for measuring a metal using a neat color developer. This is because the measurement is performed with or without a masking agent of nickel or nickel.
  • the components, samples, conditions, and the like of the reagents used in the method for suppressing positive errors due to iron, copper, or nickel in the present invention are as described above.
  • TAPS is dissolved in pure water to a concentration of 5 OmM and adjusted to pH 7.5, 8.6, or 9.5 (all at 20 ° C). D was prepared.
  • ⁇ Lysine was dissolved in pure water to a concentration of 50 mM and adjusted to pH 8.0, 8.7, or 9.4 (all at 20 ° C). Reagent E was prepared.
  • the present invention 'first reagent F was prepared by adjusting to 8. 8, or 9.5 (both at 20 ° C).
  • the second reagent was prepared by dissolving the following reagent components in pure water so that each concentration was as described.
  • Sample D was prepared by diluting a 1 gZL nickel standard solution (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd., for atomic absorption analysis) with 0.0 ⁇ N hydrochloric acid so that the nickel concentration was 200 ACgZd L.
  • the concentration of zinc in the two samples A to D was measured using the first zinc measurement reagent and the second zinc measurement reagent prepared in 1 above.
  • the measurement of zinc in the measuring reagent of the present invention was performed with a 7 1 80 type automatic analyzer manufactured by Hitachi, Ltd., and each 1 ⁇ ⁇ ⁇ _ of samples A to D prepared in the above 2
  • the first reagent A 1550 tL of the present invention prepared in (1) above was added, and after mixing, the mixture was reacted at 37 ° C for 5 minutes.
  • 50 nL of the second reagent prepared in (7) of 1 was added and reacted at 37 ° C for 5 minutes. 4 minutes 30 seconds (16th point) after addition of the first reagent and 5 minutes 8 seconds (34th point) after addition of the second reagent.
  • the absorbance was measured and the difference was determined.
  • the measurement was performed in the same manner by changing the first reagent to the first reagent for zinc measurement (B to F) prepared in (1) (2) to (6).
  • Table 1 shows the measurement results of the sample.
  • the first reagent B for zinc measurement containing TES the first reagent C for zinc measurement containing ⁇ -hydroxymethylaminomethane
  • TA the reaction to iron and copper, which are metals other than the metal to be measured
  • first reagent E for zinc measurement containing lysine and the first reagent F for zinc measurement containing bicine are used as a masking agent for iron, copper and / or nickel in the first reagent Shows that the reaction to iron and nickel, which are metals other than the metal to be measured (zinc), is suppressed, but it reacts to copper.
  • the concentration of the metal to be measured (zinc) can be accurately measured even in a sample containing a metal other than the metal to be measured (iron, copper and / or nickel).
  • the following reagent components were dissolved in pure water so as to have the stated concentrations, respectively, to prepare a second reagent for zinc measurement.
  • Samples A to D prepared in 2 (1) to (4) of Example 1 were used as they were.
  • the concentration of zinc in the two samples A to D was measured in the same manner as in Example 1-3 using the first zinc measurement reagent and the second zinc measurement reagent prepared in 1 above.
  • the first reagent B for zinc measurement containing TES, and the first reagent for zinc measurement containing bis-hydroxymethylaminomethane When C is used, reaction to iron and copper, which are metals other than the target metal (zinc), is suppressed, but it can be seen that it reacts with nickel.
  • the colorimetric measurement method of the present invention containing bis- ⁇ rispropane, TES, or ⁇ rishydroxymethylaminomethane.
  • the method and colorimetric reagent are applied to iron, copper and nickel or nickel contained in the sample.
  • there was an effect of suppressing the color development of the two-row PAPS it was confirmed that the concentration of the metal to be measured (zinc) can be accurately measured even for samples containing metals other than the measurement target metals (iron, copper, and / or nickel).
  • the following reagent components were dissolved in pure water so as to have the stated concentrations, respectively, to prepare a second reagent for zinc measurement.
  • Sample B was prepared by diluting a 1 gZL zinc standard solution (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd., for atomic absorption analysis) with 0.0 1 N hydrochloric acid to a zinc concentration of 1 000 g / d L. .
  • Sample C was prepared by diluting a 1 g / L iron standard solution (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd., for atomic absorption analysis) with 0.0 1 N hydrochloric acid to an iron concentration of 200 g / dL. It was.
  • Sample D was prepared by diluting a 1 gZL copper standard solution (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd., for atomic absorption analysis) with 0.0 ⁇ N hydrochloric acid to a copper concentration of 200 ⁇ / dL. .
  • Sample E was prepared by diluting a 1 gZL nickel standard solution (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd., for atomic absorption analysis) with 0.0 1 N hydrochloric acid to a nickel concentration of 200 gZd L.
  • the concentration of zinc in the two samples A to E was measured in the same manner as 3 in Example 1 using the eight types of the first zinc measurement reagent and the second zinc measurement reagent prepared in 1 above. went.
  • the first reagent for zinc measurement does not contain probe 35, it does not react with iron or copper, which is a metal other than the metal to be measured (zinc). Shows that it is reacting. However, it can be seen that the reaction to nickel can be suppressed by including bridge 1 35 in the first reagent.
  • the present invention containing bis-phosphoruspropane as a masking agent for iron, copper or nickel If the first reagent for zinc measurement further contains a nonionic surfactant, it will be 5 — Br for the nickel contained in the sample, compared to when the nonionic surfactant is not included. — It was confirmed that it has the effect of further suppressing the coloration of PAPS.
  • the concentration of the metal to be measured can be accurately measured even for a sample containing a metal other than the metal to be measured (zinc) (iron, copper and / or nickel).
  • the following reagent components are dissolved in pure water to the indicated concentrations, and ⁇ ⁇ is adjusted to 9 ⁇ 5 (20 ° C), and seven kinds of the present invention with different bis-risk propane concentrations ⁇ for zinc measurement A first reagent was prepared.
  • a control / zinc measurement first reagent was prepared in the same manner as in (1) except that the bis-phosphoruspropane of the present invention / zinc measurement first reagent of (1) was not included.
  • the second reagent for zinc measurement prepared in (2) of 1 of Example 3 was used as it was.
  • Samples A to E prepared in (1) to (5) of Example 3-2 were used as they were.
  • the concentration of zinc in the two samples A to E was measured in the same manner as 3 in Example 1 using the first zinc measurement reagent and the second zinc measurement reagent prepared in 1 above.
  • the present invention containing bis-trispropane as a masking agent for iron, copper and Z or nickel as the first reagent is the metal to be measured when the first reagent for zinc measurement is used. It can be seen that it reacts only with zinc and not with iron, copper and nickel.
  • the present invention zinc containing bis-monolithic propane as a masking agent for iron, copper and Z or nickel
  • the iron, copper and / or nickel masking agent-free control compared with the case where the first reagent for zinc measurement is used, iron, copper and / or It was confirmed that it has the effect of suppressing the color development of 5-Br-PAPS against nickel.
  • the concentration of the metal to be measured can be accurately measured even in a sample in which a metal other than the metal to be measured (zinc) (iron, copper and / or niger) is mixed.
  • the zinc concentration in the sample 2 was measured in the same manner as in Example 1-3 using the first zinc measurement reagent and the second zinc measurement reagent prepared in 1 above. Subsequently, the additive recovery rate was obtained by dividing the value obtained by subtracting the zinc concentration in the blood serum sample before addition of the zinc standard solution by the amount of zinc standard solution added from the measured value of zinc obtained. It was.
  • the sample is not deproteinized.
  • the zinc concentration can be accurately measured without being affected by blood components such as proteins without performing a deproteinization operation on a serum sample.
  • the zinc measurement reagent of the present invention does not require the deproteinization operation of the sample and can accurately measure the zinc concentration in the sample.
  • the concentration of zinc in the same sample was measured using the conventional ICP emission spectrometry and the present invention, and the measured values were compared.
  • the following reagent components were dissolved in pure water so as to have the indicated concentrations to prepare the first reagent for zinc measurement of the present invention.
  • the second reagent prepared in (2) of Example 1-1 was used as it was.
  • the present invention The zinc concentration in each of the 2 serum samples of chick serum was measured in the same manner as in Example 1-3 using the first zinc measurement reagent and the second zinc measurement reagent prepared in 1 above.
  • the sample is not deproteinized.
  • the zinc concentration in each of the two rabbit serum samples was measured with ICPPS-8100 (ICP emission spectrometer) manufactured by Shimadzu Corporation.
  • ICPPS-8100 ICP emission spectrometer
  • nitric acid was added to the sample, and then protein removal was performed by removing the protein by centrifugation.
  • Table 6 shows the measurement results of the samples.
  • the values shown in Table 6 are the average values obtained by measuring each sample twice for the measurement values according to the present invention measurement method and measurement reagent, and the measurement values obtained by ICP emission spectrometry are measured once for each sample. This shows the volume replacement correction value.

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Abstract

本発明は、キレート発色剤を使用する試料中の金属の比色測定方法において、鉄、銅又はニッケルのマスキング剤を共存させることを特徴とする金属の測定方法である。また、本発明は、キレート発色剤を使用する試料中の金属の比色測定試薬において、鉄、銅又はニッケルのマスキング剤を含有することを特徴とする金属の測定試薬である。更に、本発明は、鉄、銅及び／又はニッケルのマスキング剤、並びに試料中に含まれる鉄、銅又はニッケルによる正誤差を抑制する方法である。

Description

明 細 書 金属の比色測定方法及び測定試薬 技術分野
本発明は、 金属の測定方法及び測定試薬に関するものである。
本発明は、 特に、 化学、 生命科学、 分析化学及び臨床検査等の分野 において有用なものである。 背景技術
生体内には、 様々な種類の金属が存在しており、 多種多様な機能を 発揮している。 このため、 生体試料中の金属の測定は、 重要であると 認識されている。 例えば、 亜鉛は、 生体内に広く分布している生命維 持に不可欠な金属元素の一つであり、 欠乏症になると、 発育障害、 味 覚障害などの症状が起こることが知られている。 このため、 試料中の 亜鉛の測定は、 これらの疾患の診断や治療等に欠くことのできない検 査となっている。
この金属の測定方法としては、 原子吸光法、 I C P発光分析法、 比 色測定法等が用いられている。 これらのうち、 比色測定法に使用され るキレー卜発色剤としては、 例えば、 2— （5—プロモ— 2—ピジリ ルァゾ） 一 5 ( N —プロピル一 N—スルホプロピルァミノ） フエノー ルナトリウム （以下、 5 _ B r — P A P Sと略すこともある） 、 2 — ( 5 —二卜口— 2 —ビジリルァゾ） 一 5 ( N—プロピル— N—スル木 プロピルァミノ） フエノールナ卜リウ厶 （以下、 ニトロ一 P A P Sと 略すこともある） 等が挙げられる。
これらのキレー卜発色剤は、 通常、 複数の金属と反応することが知 られている。 このため、 ある特定の金属を測定する場合、 生体試料、 測定試薬、 器具等から測定対象金属以外の金属が測定反応液中に混入 し、 この混入した金属にキレー卜発色剤が反応することにより、 測定 対象金属の測定値に正誤差を与えてしまうという問題があった。 この ため、 キレート発色剤を使用した金属の測定においては、 測定対象金 属以外の金属をマスキングするための、 マスキング剤を使用する必要 があった。
例えば、 5— B r— P A P Sを使用して亜鉛の測定を行う場合、 こ の 5— B r - P A P Sが亜鉛以外の金属である鉄、 銅、 ニッケルにも 反応してしまうため、 鉄、 銅、 ニッケルをマスキングするマスキング 剤を使用する必要がある（例えば、特開昭 6 0— 1 2 0 2 4 9号公報）。 従来、鉄のマスキング剤として使用されているものとしては、例えば、 クェン酸、 フッ化ナトリウム、 二トリ口酢酸等が、 銅のマスキング剤 として使用されるものとしては、 例えば、 サリチルアルドキシ厶、 ジ チ才カルボキシグリシン、 ジチ才カルボキシザルコシン等が、 ニッケ ルのマスキング剤としては、 例えば、 ジメチルダルォキシ厶等が知ら れている。
しかしながら、 これらのマスキング剤の中には、 測定対象金属であ る亜鉛をもマスキングしてしまうものや、 安定性が悪いものもあった。
ところで、 多くの金属は、 生体内で蛋白質等の生体高分子と結合す る事によって存在しており、 種々の機能を発揮している。 このため、 生体試料中の金属を測定する場合、 蛋白質から金属を遊離させ、 蛋白 質を除去する前処理が必要であった。 また、 従来の前処理では、 試料 に卜リクロロ酢酸等の除蛋白剤を添加し、 蛋白質から金属を遊離させ、 沈殿した蛋白質を遠心分離を行って分離除去する除蛋白操作を行う 必要があった。
しかしながら、 この除蛋白操作は煩雑で時間がかかることや、 試料 の回収や再現性に問題があった。 発明の開示
したがって、 本発明の課題は、 測定対象金属以外の金属である鉄、 銅及び/又はニッケルのマスキング剤を共存又は含有させることに よリ、 試料中の金属の濃度を正確に測定することが出来る測定方法及 び測定試薬を提供することである。
また、 本発明の課題は、 鉄、 銅及び/又はニッケルのマスキング剤 を提供することであり、 試料中に含まれる鉄、 銅又はニッケルによる 正誤差を抑制する方法を提供することである。
更に、 本発明の課題は、 試料中の金属の測定において、 試料の除蛋 白操作が不要な測定方法及び測定試薬を提供することである。
本発明者は、 上記の課題の解決を目指して銳意検討を行った結果、 キレー卜発色剤を使用して試料中の金属を比色測定する方法及び試 薬において、 鉄、 銅及びノ又はニッケルのマスキング剤を共存又は含 有させることにより、 試料中の金属の濃度を正確に測定できることを 見出し、 本発明を完成するに至った。
すなわち、 本発明は、 以下の発明を提供する。
( 1 ) キレー卜発色剤を使用する試料中の金属の比色測定方法にお いて、 鉄、 銅及びノ又はニッケルのマスキング剤を共存させることを 特徴とする、 試料中の金属の比色測定方法。
( 2 ) キレート発色剤が、 2 - ( 5—ブロモ一 2—ピリジルァゾ) - 5 (N—プロピル— N— 3—スルホプロピルァミノ） フエノール又 はその塩であることを特徴とする、 前記 （ 1 ) 記載の試料中の金属の 比色測定方法。
( 3 ) キレー卜発色剤が、 2 - ( 5 _ニトロ— 2—ピリジルァゾ） - 5 (N—プロピル一 N— 3—スルホプロピルァミノ） フエノール又 はその塩であることを特徵とする、 前記 （〗） 記載の試料中の金属の 比色測定方法。
( 4 ) 界面活性剤を使用する、 前記 （ 1 ) 〜 （3 ) のいずれかに記 載の試料中の金属の比色測定試薬。
( 5 ) 試料の除蛋白操作が不要である、 前記 （2 ) 〜 （4 ) のいず れかに記載の試料中の金属の比色測定方法。
( 6 ) 鉄、 銅及び 又はニッケルのマスキング剤が、 ビス一卜リス プロパン、 T A P S、 T A P S O、 T E S、 卜リシン、 卜リスヒドロ キシメチルァミノメタン又はビシンから選択された 1 種以上のマス キング剤である、 前記 （ 1 ) 〜 （5 ) のいずれかに記載の試料中の金 属の比色測定方法。
( 7 ) 鉄、 銅及び Z又はニッケルのマスキング剤が、 下記の一般式 ( I ) (式中、 ズ 1〜乂 6は水素原子、 置換されていないか若しくは 置換されている、 水酸基、 カルボキシル基、 S H基又はアミノ基であ る） で表される化合物である、 前記 （ 1 ) 〜 （5 ) のいずれかに記載 の試料中の金属の比色測定方法。
Figure imgf000005_0001
( 8 ) 比色測定を行う試料中の金属が、 亜鉛である、 前記 （ 1 ) 〜
( ) のいずれかに記載の試料中の金属の比色測定方法。
( 9 ) 試料中に含まれる鉄、 銅又はニッケルによる正誤差を抑制で きる比色測定方法である、 前記 （ 1 ) 〜 （8 ) のいずれかに記載の試 料中の金属の比色測定方法。
( 1 0 ) 試料の除蛋白操作が不要である、 2— （5 —プロモ— 2 — ピリジルァゾ） — 5 (N—プロピル— N— 3—スルホプロピルァミノ） フエノール又はその塩を使用する試料中の亜鉛の比色測定方法。
( 1 1 ) キレー卜発色剤を使用する試料中の金属の比色測定試薬に おいて、 鉄、 銅及び/又はニッケルのマスキング剤を含有することを 特徴とする試料中の金属の比色測定試薬。
( 1 2 ) キレー卜発色剤が、 2 — ( 5—プロモー 2 —ピリジルァゾ） 5 (N—プロピル— N— 3—スルホプロピルァミノ） フエノール又 はその塩であることを特徴とする、 前記 （ 1 1 ) 記載の試料中の金属 の比色測定試薬。
( 1 3 ) キレー卜発色剤が、 2— ( 5—二卜ロー 2—ピリジルァゾ) — 5 ( N—プロピル _ N _ 3—スルホプロピルァミノ） フエノール又 はその塩であることを特徴とする、 前記 （ 1 1 ) 記載の試料中の金属 の比色測定試薬。
( 1 4 ) 更に、 界面活性剤を含む、 前記 （〗 1 ) 〜 （ 1 3 ) のいず れかに記載の試料中の金属の比色測定試薬。
( 1 5 ) 試料の除蛋白操作が不要である、 前記 （ 1 2 ) 〜 （ 1 4 ) のいずれかに記載の試料中の金属の比色測定試薬。
( 1 6 ) 鉄、 銅及び 又はニッケルのマスキング剤が、 ビス—トリ スプロパン、 T A P S、 T A P S O、 T E S、 トリシン、 卜リスヒド 口キシメチルァミノメタン又はビシンから選択されるものである、 前 記 （ 1 1 ) 〜 （ 1 5 ) のいずれかに記載の試料中の金属の比色測定試 薬。
( 1 7 ) 鉄、 銅及び Z又はニッケルのマスキング剤が、 下記の一般 式 （ I ) (式中、 X 1 ~X 6は水素原子、 置換されていないか若しく は置換されている、 水酸基、 カルボキシル基、 S H基又はアミノ基で ある) で表される化合物である、 前記 （ 1 1 ) 〜 （ 1 5 ) のいずれか に記載の試料中の金属の比色測定試薬。
X1 X4
Figure imgf000006_0001
( 1 8 ) 試料中に含まれる鉄、 銅又はニッケルによる正誤差を抑制 できる比色測定試薬である、 前記 （ 1 1 ) 〜 （ 1 7 ) のいずれかに記 載の試料中の金属の比色測定試薬。
( Ί 9 ) ビス一卜リスプロパン、 T A P S、 T A P S O、 T E S、 トリシン、 卜リスヒドロキシメチルァミノメタン又はビシンよりなる、 鉄、 銅及びノ又はニッケルのマスキング剤。
( 2 0 ) 下記の一般式 （ I ) (式中、 X 1 〜X 6は水素原子、 置換 されていないか若しくは置換されている、 水酸基、 カルボキシル基、 S H基又はアミノ基である） で表される化合物よりなる、 鉄、 銅及び / /又はニッケルのマスキング剤。
Figure imgf000007_0001
( 2 1 ) キレー卜発色剤を使用する試料中の金属の比色測定方法に おいて、 鉄、 銅及び/又はニッケルのマスキング剤を共存させること により、 試料中に含まれる鉄、 銅又はニッケルによる正誤差を抑制す る方法。
( 2 2 ) キレー卜発色剤が、 2 _ ( 5—プロモー 2 _ピリジルァゾ） 一 5 (N—プロピル— N— 3—スルホプロピルァミノ） フエノール又 はその塩である、 前記 （2 〗） 記載の試料中に含まれる鉄、 銅又は二 ッケルによる正誤差を抑制する方法。
( 2 3 ) キレ一卜発色剤が、 2 - ( 5—ニトロ— 2—ピリジルァゾ） - 5 (N—プロピル— N— 3—スルホプロピルァミノ） フエノール又 はその塩である、 前記 （2 1 ) 記載の試料中に含まれる鉄、 銅又は二 ッケルによる正誤差を抑制する方法。
( 2 4 ) 鉄、 銅及び 又はニッケルのマスキング剤が、 ビス— トリ スプロパン、 T A P S , T A P S O、 丁 E S、 卜リシン、 卜リスヒド 口キシメチルァミノメタン又はビシンから選択されるものである、 前 記 （2 1 ) 〜 （2 3 ) のいずれかに記載の試料中に含まれる鉄、 銅又 はニッケルによる正誤差を抑制する方法。 ( 2 5 ) 鉄、 銅及び Z又はニッケルのマスキング剤が、 下記の一般 式 （ I ) (式中、 X 1 〜X 6は水素原子、 置換されていないか若しく は置換されている、 水酸基、 カルボキシル基、 S H基又はアミノ基で ある） で表される化合物であることを特徴とする、 前記（2 1 ) 〜 （2 4 ) のいずれかに記載の試料中に含まれる鉄、 銅又はニッケルによる 正誤差を抑制する方法。
Figure imgf000008_0001
本発明によれば、 キレー卜発色剤を使用する試料中の金属の比色測 定において、 測定対象金属以外の金属である鉄、 銅及び Z又はニッケ ルのマスキング剤を共存又は含有させることによリ、 試料中に鉄、 銅 又はニッケルが混在していても、 測定対象金属の濃度を正確に測定す ることができるものである。
また、 本発明によれば、 キレート発色剤を使用する試料中の金属の 測定において、 試料の除蛋白操作が不要となる。 発明を実施するための最良の形態
本発明は、 キレー卜発色剤を使用する試料中の金属の比色測定方法 において、 鉄、 銅又はニッケルのマスキング剤を共存させることを特 徴とする金属の測定方法、 キレー卜発色剤を使用する試料中の金属の 比色測定試薬において、 鉄、 銅又はニッケルのマスキング剤を含有す ることを特徴とする金属の測定試薬、 並びに鉄、 銅及び 又はニッケ ルのマスキング剤、 並びに試料中に含まれる鉄、 銅又はニッケルによ る正誤差を抑制する方法である。
( 1 ) キレート発色剤 本発明においては、 キレー卜発色剤を使用して、 試料中の金属の比 色測定を行う。
ここで、 キレ一卜発色剤とは、 金属の比色測定に使用されうる試薬 であり、 かつ鉄、 銅又はニッケル以外の金属 （測定対象金属） を測定 する場合に、 測定対象金属と接触し、 結合することにより、 色調又は 吸収波長に変化が生じるものをいう。
また、 本発明は、 試料中に混在する、 鉄、 銅又はニッケルにも反応 してしまい、 測定対象金属の測定値に正誤差を与える可能性のあるキ レート発色剤において好適である。
例えば、 2— （5 —プロモー 2—ピリジルァゾ） ^ 5 (N -プロピ ル一 N— 3—スルホプロピルァミノ） フエノール （以下、 5— B r _ P A P Sと略すこともある） 、 2— ( 5—二卜口一 2 —ピリジルァゾ） — 5 (N—プロピル一 N— 3—スルホプロピルァミノ）フエノール（以 下、 ニトロ一 P A P Sと略すこともある） 、 2 — ( 5—プロモー 2— ピリジルァゾ） - 5 ( N—プロピル— - 3一スルホプロピルァミノ） ァニリン （以下、 5 — B r — P S A Aと略すこともある） 、 ビス厶チ オール I I 、 B P A、 カルセィン、 カルセィンブルー、 クロモ卜ロピ ック · アンッ卜 、C h r o m o t r o p i c a c i d； 、 C u — P A N、 D i a n t i p y r y l m e t h a n e、 厶レキシド ( M u r e x i d e )、二卜ロソー P S A P、 o —フエナント口リン、 P A N、 P A R , P D T S、 P R、 S A T P、 T i r o n、 T P P S、 T P T Z、 X O又はジンコン ( Z i n e o n ) 等を挙げることができる。 なお、 本発明においては、 キレー卜発色剤が 5— B r — P A P S又 は二卜ロー P A P Sであることが好ましい。
また、 キレー卜発色剤の濃度は、 測定対象金属の濃度に依存し、 そ の測定対象金属の濃度が高い場合には、 その濃度に応じて高くする必 要がある。 通常は、 試料と測定試薬を混合した後の測定反応液中にお いて、 1 0〜 5 0 0 A Mの範囲にあることが好ましく、 1 0〜 5 0 Mの範囲が特に好ましい。 ( 2 ) 鉄、 銅及び Z又はニッケルのマスキング剤
本発明においては、 鉄、. 銅及び 又はニッケルのマスキング剤を共 存又は含有させることによリ、 試料中の金属の比色測定を行う。
ここで、 鉄、 銅及び/又はニッケルのマスキング剤としては、 例え ば、 ビス一 卜リスプロパン、 ビス一 卜リス、 T A P S、 T A P S O、 T E S、 卜リシン、 卜リスヒドロキシメチルァミノメタン、 B E S又 はビシン等を挙げることができる。 また、 本発明においては、 鉄、 銅 及びノ又はニッケルのマスキング剤として、 ビス— 卜リスプロパン、 T A P S , T A P S 0、 T E S、 卜リシン、 トリスヒドロキシメチル ァミノメタン又はビシンを使用することが好ましい。
なお、 本発明においては、 鉄、 銅及びニッケルをマスキングするこ とが可能である、下記の一般式（ I ) (式中、 X 1 〜X 6は水素原子、 置換されていないか若しくは置換されている、 水酸基、 カルボキシル 基、 S H基又はアミノ基である） で表される化合物を使用することが 好ましい。
Figure imgf000010_0001
ここで、 前記の一般式 （ I ) で表される化合物としては、 例えば、 ビス一卜リスプロパンを挙げることができる。
また、 鉄、 銅及び 又はニッケルのマスキング剤の濃度は、 試料中 の鉄、 銅又はニッケルの濃度に依存し、 鉄、 銅又はニッケルの濃度が 高い場合には、 その濃度に応じて高くする必要がある。 通常は、 例え ば、 試料と測定試薬を混合した後の測定反応液中において、 5〜 1 5 0 m Mの範囲にあることが好ましく、 5〜 5 0 m Mの範囲が特に好ま しい。 また、 マスキング剤の濃度は、 1 5 0 m Mを超えて含有させて も問題はないが、 その量 でで充分な効果が得られる。
また、 本発明の測定方法及び測定試薬が、 1 ステップ法 （ 1試薬系） である場合には、 マスキング剤の濃度は、 上記の範囲のものとすれば よく、 2ステップ法 （2試薬系） である場合には、 試料と第 1試薬を 試料中の金属を測定する際の各々の添加量の比で混合した際、 及び試 料と第 1 試薬及び第 2試薬を試料中の金属を測定する際の各々の添 加量の比で混合した際に、 この混合後の測定反応液中のマスキング剤 の濃度が上記の範囲となるように、 マスキング剤を第 1試薬又は第 2 試薬のいずれかに含ませればよい。
また、 混合後の測定反応液中のマスキング剤の濃度が上記濃度範囲 に入るのであれば、 マスキング剤は第 1試薬と第 2試薬の両方に含ま せてもよい。
これは、 測定方法及び測定試薬が多ステップ法 （3試薬以上） の場 合も同様である。
( 3 ) 界面活性剤 .
本発明においては、 界面活性剤を共存又は含有させることにより、 試料中の金属を比色 1定しても良い。 ¾発明において共存又は含有さ せる界面活性剤の種類は特に限定されず、 例えば、 非イオン性界面活 性剤、 陰イオン性界面活性剤、 陽イオン性界面活性剤、 又は両性界面 活性剤のいずれも使用することができる。
また、 本発明においては、 非イオン性界面活性剤を使用することが 好ましい。
ここで、 非イオン性界面活性剤としては、 例えば、 以下のもの等を 挙げることができる。
( a ) ポリ才キシエチレンアルキルエーテル、 ポリオキシプロピレ ンアルキルエーテル、 ポリ才キシプロピレンアルキルフエニルエーテ ル、 ポリオキシエチレンポリスチリルフエニルエーテル、 又はポリオ キシエチレンポリオキシプロピレングリコールなどのポリオキシァ ルキレンエーテル化合物。
( b ) グリセリン脂肪酸部分エステル、 ソルビ夕ン脂肪酸部分エス テル、 ペンタエリスリ トール脂肪酸部分エステル、 プロピレングリコ ールモノ脂肪酸エステル、 又はショ糖脂肪酸部分エステルなどの多価 アルコール部分エステル化合物。
( C ) ポリ才キシエチレンソルビタン脂肪酸部分エステル、 ポリオ キシエチレンソルビ卜ール脂肪酸部分エステル、 ポリオキシエチレン グリセリン脂肪酸部分エステル、ポリエチレンダリコール脂肪酸エス テル、 ポリグリセリン脂肪酸部分エステル、 又はポリオキシエチレン 化ひまし油などのポリ才キシエチレン化多価アルコール脂肪酸エス テル。
( d ) 脂肪酸ジエタノールアミ ド、 N , N —ビス一 2—ヒドロキシ アルキルァミン、 ポリ才キシエチレンアルキルァミン、 卜リエ夕ノー ルァミン脂肪酸エステル、 又は卜リアルキルアミンォキシドなどのァ ミ ド若しくはァミン化合物。
本発明においては、 1 種類の界面活性剤のみを用いてもよく、 又は 2種類以上の界面活性剤を組み合わせて用いてもよい。
また、 界面活性剤の濃度は、 試料と測定試薬を混合した後の測定反 応液中において、 0 . 0 1 〜 1 0 %の範囲にあることが好ましく、 0 . 1 〜 5 %の範囲にあることが特に好ましい。
また、 本発明の測定方法及び測定試薬が、 1 ステップ法 （ 1試薬系） である場合には、 界面活性剤の濃度は、 上記の範囲のものとすればよ く、 2ステップ法 （2試薬系） である場合には、 試料と第〗試薬を試 料中の金属を測定する際の各々の添加量の比で混合した際、 及び試料 と第 1試薬及び第 2試薬を試料中の金属を測定する際の各々の添加 量の比で混合した際に、 この混合後の測定反応液中の界面活性剤の濃 度が上記の範囲となるように、 界面活性剤を第 1試薬又は第 2試薬の いずれかに含ませればよい。
また、 混合後の測定反応液中の界面活性剤の濃度が上記濃度範囲に 入るのであれば、 界面活性剤は第 1試薬と第 2試薬の両方に含ませる のが好ましい。
これは、 測定方法及び測定試薬が多ステップ法 （3試薬以上） の場 合も同様である。
( 4 ) 蛋白質変性剤
本発明においては、 蛋白質変性剤を共存又は含有させることによリ、 試料中の金属を比色測定してもよい。
本発明で共存又は含有させる、 蛋白質変性剤としては、 例えば、 ド デシル硫酸ナトリウム （S D S ) 等の界面活性剤や、 尿素、 塩酸グァ 二ジン等の公知のものを挙げることができる。
また、 蛋白質変性剤の濃度は、 試料と測定試薬を混合した後の測定 反応液中において、 0 . 2〜 6 Mの範囲にあることが好ましく、 0 . 4〜 3 Mの範囲が特に好ましい。 また、 蛋白質変性剤の濃度は、 6 M を超えて含有させても問題はないが、 その量までで充分な効果が得ら れる。
本発明においては、 1種類の蛋白質変性剤のみを用いてもよく、 又 は 2種類以上の蛋白質変性剤を組み合わせて用いてもよい。
また、 本発明の測定方法及び測定試薬が、 1 ステップ法 （ 1試薬系） である場合には、 蛋白質変性剤の濃度は、 上記の範囲のものとすれば よく、 2ステップ法 （ 2試薬系） である場合には、 試料と 1試薬を 試料中の金属を測定する際の各々の添加量の比で混合した際、 及び試 料と第 1 試薬及び第 2試薬を試料中の金属を測定する際の各々の添 加量の比で混合した際に、 この混合後の測定反応液中の蛋白質変性剤 の濃度が上記の範囲となるように、 蛋白質変性剤を第 1試薬又は第 2 試薬のいずれかに含ませればよい。
また、 混合後の測定反応液中の蛋白質変性剤の濃度が上記濃度範囲 に入るのであれば、 蛋白質変性剤は第 1試薬と第 2試薬の両方に含ま せるのが好ましい。
これは、 測定方法及び測定試薬が多ステップ法 （3試薬以上） の場 合も同様である。
( 5 ) 測定における他 構成成分
本発明においては、 前記の成分の他に、 公知の防腐剤、 又は安定化 剤等を必要に応じて適宜共存又は含有させることができる。
( 6 ) 金属測定時の p H
本発明において、 試料中の金属測定時の p Hは、 測定に使用するキ レー卜発色剤によって異なるので、 金属を測定する時の P Hに適宜設 定すればよい。 通常は、 p H 5〜 l 1 の範囲にあることが好ましい。
また、 試料中の亜鉛を測定する場合には、 p H 7以上が好ましく、 p H 8〜： I 0の範囲が特に好ましい。
また、 前記の p H範囲となるように使用する緩衝液としては、 前記 の P H範囲に緩衝能がある従来公知の緩衝液を適宜使用することが できる。
このような緩衝液として使用できるものとしては、 例えば、 炭酸、 ホウ酸、 リン酸、 卜リスヒドロキシメチルァミノメタン、 イミダゾー ル、 グリシルグリシン、 M E S、 ビス一卜リス、 A D A, A C E S , ビス一 卜リスプロパン、 P I P E S、 M O P S O、 M O P S、 B E S、 H E P E S、 T E S、 D I P S O、 T A P S O、 P O P S O、 H E P P S、 H E P P S 0、 卜リシン、 ビシン、 T A P S , C H E S、 C A P S O、 若しくは C A P S又はこれらの塩等の各緩衝剤を挙げること ができる。
( 7 ) 試薬等の構成、 及び構成成分の濃度等
本発明の測定方法及び測定試薬は、 1ステップ法 （ 1試薬系） で実 施、 構成してもよく、 又は 2ステップ法 ( 2試薬系) 等の多ステップ 法 （多試薬系） で実施、 構成してもよい。
また、 本発明の測定方法及び測定試薬が 1 ステップ法 （ 1試薬系） である場合は、 前記した各構成成分の濃度、 及び P H等は前記の範囲 のものとすればよく、 多ステップ法 (多試薬系) である場合には、 前 記各測定試薬を金属を測定する際の各々の添加量の比で混合した時 に、 前記した各構成成分の濃度範囲、 及び p H範囲等となるように各 試薬の構成成分の濃度等を定めればよい。
( 8 ) 試料
本発明において、 金属の測定を行う試料は特に限定されない。
このような試料としては、 例えば、 生体試料、 食物、 飲料、飲料水、 薬剤、 試薬、 河川水、 湖沼水、 海水、 土壌等が挙げられる。
生体試料は特に限定されず、 例えば、 ヒ卜又は動物の血液、 血清、 血漿、 尿、 大便、 精液、 髄液、 唾液、 汗、 涙、 腹水、 羊水、 脳等の臓 器、 毛髪や皮膚や爪や筋肉若しくは神経等の組織及び細胞等が挙げら れる。
食物は特に限定されず、 例えば、 食肉、 野菜、 穀物、 果物、 水産物、 加工食品等が挙げられる。
飲料は特に限定されず、 例えば、 ジュース、 お茶、 コーヒー、 アル コール、 牛乳等が挙げられる。
薬剤は特に限定されず、 例えば、 輸液、 注射液、 散剤、 錠剤等が挙 げられる。
なお、 試料の形態は、 液体であることが好ましいが、 液体でない場 合には、 抽出処理又は可溶化処理などの前処理を既知の方法に従って 行い、 液体試料とすることが好ましい。
( 9 ) 金属の比色測定方法及び比色測定試薬
本発明のキレー卜発色剤を使用した試料中の金属の比色測定方法 及び比色測定試薬について、 具体的に説明する。
試料中の金属を測定する場合には、 例えば、 試料と鉄、 銅及び 又 はニッケルのマスキング剤を含有する試薬とを混合する。 この試料と 試薬との混合物を、 キレート発色剤を含有する試薬と混合し、 試料中 の金属とキレー卜発色剤を発色反応させる。 この発色前後の測定反応 液の吸光度を測定し、 キレー卜発色による吸光度の変化を求めること 等により、 試料中の金属の濃度を測定することができる。
更に、 鉄、 銅及び/又はニッケルのマスキング剤としてビス—トリ スプロパンを共存させて、 試料中の亜鉛を比色測定する場合を例にと リ、 具体的に説明する。 .
試料中の亜鉛を測定する場合には、 例えば、 試料とビス一卜リスプ 口パンを含有する第 1試薬とを混合する。 この試料と第 1試薬との混 合物を、 キレ一卜発色剤 （例えば、 5— B r— P A P S ) を含有する 第 2試薬と混合し、 試料中の亜鉛とキレー卜発色剤を発色反応させる。 この発色前後の測定反応液の吸光度を測定し、 キレ一卜発色による吸 光度の変化を求めること等により、 試料中の亜鉛の濃度を測定するこ とができる。
なお、 本発明における金属の測定は、 エンドポイント法又はレー卜 アツセィ法のいずれの方法でも行うことができるが、 本発明において は、 金属の測定をェンドボイン卜法で行うことが好ましい。
( 1 0 ) 試料中に含まれる鉄、 銅又はニッケルによる正誤差を抑制 する方法
本発明における、 試料中に含まれる鉄、 銅又はニッケルによる正誤 差を抑制する方法は、 キレー卜発色剤を用いて金属を測定する比色測 定方法及び比色測定試薬において、 鉄、 銅及びノ又はニッケルのマス キング剤を共存又は含有させて測定を行うことによるものである。
このキレー卜発色剤を用いて金属を測定する比色測定方法又は比 色測定試薬において、 鉄、 銅及びノ又はニッケルのマスキング剤を共 存又は含有させて金属の測定を行うことにより、 試料中に測定対象金 属以外の金属である鉄、 銅又はニッケルが混在している場合であって も、 測定対象金属の測定値にこの鉄、 銅又はニッケルによる正誤差が 生じることを抑制でき、 精度が高い金属の測定値を得ることができる。
また、 本発明における鉄、 銅又はニッケルによる正誤差を抑制する 方法を実施する際の試薬の構成成分や試料や条件等は、 前記した通り である。
以下、 本発明を実施例により具体的に説明するが、 本発明はこれら の実施例により限定されるものではない。 〔実施例 1 〕
(鉄、 銅及びノ又はニッケルに対するマスキング効果の確認一 1 ) 鉄、 銅及び/又はニッケルに対するマスキング剤として、 ビス—卜 リスプロパン、 T A P S、 T A P S O、 T E S、 卜リシン、 卜リスヒ ドロキシメチルァミノメタン又はビシンを用いて、 鉄、 銅及び/又は ニッケルに対するマスキング効果を確かめた。
1 . 試薬の調製
( 1 ) 亜鉛測定用第 1試薬 Aの調製
ビス一 卜リスプロパンを濃度が 5 O m Mとなるように純水に溶解 し、 p H 7. 0、 8. 6、 又は 9. 3 (いずれも 2 0 °C) に調整し、 本発明 ·第 1試薬 Aを調製した。
( 2 ) 亜鉛測定用第 1試薬 Bの調製
T E Sを濃度が 5 O m Mとなるように純水に溶解し、 p H 7. 0、 8. 2、 又は 9. 4 (いずれも 2 0 °C) に調整し、 本発明 ·第 1試薬 Bを調製した。
( 3 ) 亜鉛測定用第 1試薬 Cの調製
卜リスヒドロキシメチルァミノメタンを濃度が 5 O m Mとなるよ うに純水に溶解し、 p H 7. 0、 8. 4、又は 9. 8 (いずれも 2 0 °C) に調整し、 本発明 ·第 1試薬 Cを調製した。
( 4 ) 亜鉛測定用第 1試薬 Dの調製
T A P Sを濃度が 5 O m Mとなるように純水に溶解し、 p H 7. 5、 8. 6、 又は 9. 5 (いずれも 2 0 °C) に調整し、 本発明 ·第 1試薬 Dを調製した。
( 5 ) 亜鉛測定用第 1試薬 Eの調製
卜リシンを濃度が 5 0 m Mとなるように純水に溶解し、 p H 8. 0、 8. 7、 又は 9. 4 (いずれも 2 0 °C) に調整し、 本発明 ■第 1試薬 Eを調製した。
( 6 ) 亜鉛測定用第 1試薬 Fの調製
ビシンを濃度が 5 0 m Mとなるように純水に溶解し、 p H 8. 4、 8. 8、 又は 9. 5 (いずれも 2 0 °C) に調整し、 本発明 '第 1試薬 Fを調製した。
( 7 ) 亜鉛測定用第 2試薬の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、 第 2試薬を調製した。
5— B r — P A P S 0. 2 m M
卜リ 卜ン X— 1 0 0 0. 0 5 %
2. 試料の調製
( 1 ) 試料 Aの調製
1 gZLの亜鉛標準液 （和光純薬工業社製、 原子吸光分析用） を、 0. 0 1 N塩酸で亜鉛濃度が 2 0 0 At g/d Lになるように希釈した ものを試料 Aとした。
( 2 ) 試料 Bの調製
1 gZLの鉄標準液（和光純薬工業社製、原子吸光分析用）を、 0. 0 1 N塩酸で鉄濃度が 2 0 0 At g / d Lになるように希釈したもの を試料 Bとした。
( 3 ) 試料 Cの調製
1 gZLの銅標準液（和光純薬工業社製、原子吸光分析用）を、 0. 0 1 N塩酸で銅濃度が 2 0 0 / d Lになるように希釈したもの を試料。とした。
( 4 ) 試料 Dの調製
1 gZLのニッケル標準液 （和光純薬工業社製、 原子吸光分析用） を、 0. 0 Ί N塩酸でニッケル濃度が 2 0 0 AC gZd Lになるように 希釈したものを試料 Dとした。
3. 試料の測定
前記 2の試料 A〜 D中の亜鉛の濃度を、 前記 1 で調製した亜鉛測定 用第 1試薬及び亜鉛測定用第 2試薬にて測定した。
本発明の測定試薬における亜鉛の測定は、 日立製作所社製 7 1 8 0 形自動分析装置にて行い、 前記 2で調製した試料 A〜 Dの各 1 Ο μ Ι_ に各々前記 1 の （ 1 ) で調製した本発明 '第 1試薬 A 1 5 0 t Lを添 加して、 混和後 3 7 °Cで 5分間反応させた後、 第 1試薬添加後、 前記 1の （7 ) で調製した第 2試薬 5 0 n Lを添加し、 3 7 °Cで 5分間反 応させた。 第 1 試薬添加後 4分 3 0秒目 （ 1 6ポイント目） と第 2試 薬添加後 5分 8秒目 （3 4ポイント目） の主波長 5 4 6 n m及び副波 長 7 0 0 n mにおける吸光度を測定し、 その差を求めた。
そして、亜鉛の濃度が既知の試料について、前記の通り測定を行い、 この測定値と前記の 4種類の試料の測定値を比較することにより、 前 記 4種類の試料中の亜鉛の濃度を求めた。
また、 第 1試薬を前記 1の （2 ) 〜 （6 ). で調製した亜鉛測定用第 1試薬 （B〜 F ) に変えて同様に測定を行った。
4 . 測定結果
試料の測定結果を表 1 に示した。
表 1
亜鉛測定用第 1試薬 A 亜鉛測定用第 1試薬 B
Figure imgf000020_0001
亜鉛測定用第 1試薬 c 亜鉛測定用第 1試薬 D
Figure imgf000020_0002
亜鉛測定用第 1試薬 E 亜鉛測定用第 1試薬 F
Figure imgf000020_0003
表 1から明らかなように、 第 1試薬に鉄、 銅及び 又はニッケルに 対するマスキング剤として、 ビス—トリスプロパンを含有させた亜鉛 測定用第 1試薬 Aを用いた場合は、 測定対象金属 （亜鉛） 以外の金属 である、 鉄及び銅とは反応していないことが分かる。 また、 ニッケル についても、 p H 7 . 0の場合には反応が抑制されていることが分か る。
更に、 第 1試薬に鉄、 銅及び/又はニッケルに対するマスキング剤 として、 T E Sを含有させた亜鉛測定用第 1試薬 B、 卜リスヒドロキ シメチルァミノメタンを含有させた亜鉛測定用第 1試薬 C、 及び T A P Sを含有させた亜鉛測定用第 1試薬 Dを用いた場合は、 測定対象金 属（亜鉛）以外の金属である、鉄及び銅への反応は抑制されているが、 ニッケルには反応しているがことが分かる。 更に、 第 1試薬に鉄、 銅 及び/又はニッケルに対するマスキング剤として、 卜リシンを含有さ せた亜鉛測定用第 1試薬 E、 及びビシンを含有させた亜鉛測定用第 1 試薬 Fを用いた場合は、 測定対象金属 （亜鉛） 以外の金属である、 鉄 及びニッケルへの反応は抑制されているが、 銅には反応していること が分かる。
これらのことより、 キレー卜発色剤として 5 — B r — P A P Sを用 いた試料中の亜鉛を測定する方法において < ビス一 卜リスプロパン、 T A P S , T E S、 卜リシン、 卜リスヒドロキシメチルァミノメタン 又はビシンを含有させた本発明の測定方法及び測定試薬は、 試料に含 まれる鉄、 銅及び 又はニッケルに対する 5— B r - P A P Sの発色 を抑制する効果のあることが確かめられた。
すなわち、 測定対象金属以外の金属 （鉄、 銅及び 又はニッケル） が混在する試料であっても正確に測定対象金属 （亜鉛） 濃度を測定で きることが確かめられた。
また、 これらの結果から、 ビス—卜リスプロパンは、 P Hを適宜調 整することによって、 鉄、 銅及びニッケルの全てをマスキングするこ とが可能であることが確かめられた。
〔実施例 2〕
(鉄、 銅及びノ又はニッケルに対するマスキング効果の確認一 2 ) 鉄、 銅及び/又はニッケルに対するマスキング剤として、 ビス—卜 リスプロパン、 T E S又は卜リスヒドロキシメチルァミノメタンを用 いて、 鉄、 銅又はニッケルに対するマスキング効果を確かめた。
1 . 試薬の調製
( 1 ) 亜鉛測定用第 1試薬 Aの調製
ビス一 卜リスプロパンを濃度が 5 0 m Mとなるように純水に溶解 し、 p H 7 . 0、 8 . 6、 又は 9 . 3 (いずれも 2 0 °C ) に調整し、 亜鉛測定用第 1試薬 Aを調製した。
( 2 ) 亜鉛測定用第 Ί試藥 Bの調製
T E Sを濃度が 5 O mMとなるように純水に溶解し、 p H 7. 0、 7. 8、 又は 8. 2 (いずれも 2 0 °C) に調整し、 亜鉛測定用第 1試 薬 Bを調製した。
( 3 ) 亜鉛測定用第 1試薬 Cの調製
卜リスヒ ドロキシメチルァミノメタンを濃度が 5 0 m Mとなるよ うに純水に溶解し、 p H 7. 0、 8. 4、 又は 9. 8 (いずれも 2 0°C) に調整し、 亜鉛測定用第 1試薬 Cを調製した。
( 4 ) 亜鉛測定用第 2試薬の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、 亜鉛測定用第 2試薬を調製した。
二卜口— P A P S 0. 2 m M
卜リ 卜ン X— 1 0 0 0. 0 5 %
2. 試料の調製
実施例 1 の 2の （ 1 ) 〜 （4 ) で調製した試料 A~ Dをそのまま使 用した。
3. 試料の測定
前記 2の試料 A〜D中の亜鉛の濃度を、 前記 1で調製した亜鉛測定 用第 1 試薬及び亜鉛測定用第 2試薬にて実施例 1 の 3と同様にして 測定を行った。
4. 測定結果
試料の測定結果を表 2に示した。 表 2
亜鉛測定用第 1試薬 A 亜鉛測定用第 1試薬 B
Figure imgf000023_0001
亜鉛測定用第 1試薬 c
Figure imgf000023_0002
表 2から明らかなように、 第 1試薬に鉄、 銅及び //又はニッケルに 対するマスキング剤として、 ビス—卜リスプロパンを含有させた亜鉛 測定用第 1試薬 Aを用いた場合は、 測定対象金属 （亜鉛） 以外の金属 である、 鉄及び銅とは反応していない.ことが分かる。 また、 ニッケル についても、 p H 7 . 0の場合には反応が抑制されていることが分か る。
更に、 第 1 試薬に鉄、 銅及び Z又はニッケルに対するマスキング剤 として、 T E Sを含有させた亜鉛測定用第 1試薬 B、 及び卜リスヒド 口キシメチルァミノメタンを含有させた亜鉛測定用第 1 試薬 Cを用 いた場合は、 測定対象金属 （亜鉛） 以外の金属である鉄及び銅への反 応は抑制されているが、 ニッケルには反応していることが分かる。
これらのことより、 ニトロ一 P A P Sを用いた試料中の亜鉛を測定 する方法及び試薬において、 ビス—卜リスプロパン、 T E S又は卜リ スヒドロキシメチルァミノメタンを含有させた本発明の比色測定方 法及び比色測定試薬は、 試料に含まれる鉄、 銅及びノ又はニッケルに 対する二卜ロー P A P Sの発色を抑制する効果のあることが確かめ られた。 すなわち、 測定 象金属以外の金属 (鉄、 銅及び/又はニッ ケル） が混在する試料であっても正確に測定対象金属 （亜鉛） 濃度を 測定できることが確かめられた。
また、 これらの結果から、 ビス一卜リスプロパンは、 p Hを適宜調 整することによって、 鉄、 銅及びニッケルの全てをマスキングするこ とが可能であることが確かめられた。
〔実施例 3〕
(鉄、 銅及びノ又はニッケルに対するマスキング効果の確認一 3 ) 鉄、 銅及びノ又はニッケルに対するマスキング剤として、 ビス一卜 リスプロパンを用い、 鉄、 銅又はニッケルに対するマスキング効果を 確かめた。
1 . 測定試薬の調製
( 1 ) 亜鉛測定用第 1試薬の調製
下記の試薬成分を記載の濃度になるように純水に溶解し、 p Hを 9. 5 ( 2 0 °C) に調整し、 ブリッジ— 3 5 (非イオン性界面活性剤） 濃 度の異なる 8種類の亜鉛測定用第 1試薬を調製した。
ブリッジ一 3 5 0 %、 0. 1 %、 0. 1 %、 1 . 1 %、 1 . 3 %、 1 . 6 %、 2. 0 %又は 6. 7 %
ビス—卜リスプロパン 3 0 m M
( 2 ) 亜鉛測定用第 2試薬の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、 亜鉛測定用第 2試薬を調製した。
5— B r— P A P S 0. Ί 3 m M
卜リ 卜ン X— 1 0 0 0. 0 5 %
2. 試料の調製
( 1 ) 試料 Aの調製
Ί gZ Lの亜鉛標準液 （和光純薬工業社製、 原子吸光分析用） を、 0. 0 1 N塩酸で亜鉛濃度が 5 0 0 At g /d Lになるように希釈した ものを試料 Aとした。
(2) 試料 Bの調製
1 gZLの亜鉛標準液 （和光純薬工業社製、 原子吸光分析用） を、 0. 0 1 N塩酸で亜鉛濃度が 1 000 g/d Lになるように希釈し たものを試料 Bとした。
(3) 試料 Cの調製
1 g/Lの鉄標準液（和光純薬工業社製、原子吸光分析用）を、 0. 0 1 N塩酸で鉄濃度が 2 0 0 g / d Lになるように希釈したもの を試料 Cとした。
( 4 ) 試料 Dの調製
1 gZLの銅標準液（和光純薬工業社製、原子吸光分析用）を、 0. 0 Ί N塩酸で銅濃度が 2 0 0 μ / d Lになるように希釈したもの を試料 Dとした。
(5) 試料 Eの調製
1 gZLのニッケル標準液 （和光純薬工業社製、 原子吸光分析用） を、 0. 0 1 N塩酸でニッケル濃度が 200 gZd Lになるように 希釈したものを試料 Eとした。
3. 試料の測定
前記 2の試料 A〜E中の亜鉛の濃度を、 前記 1 で調製した 8種類の 亜鉛測定用第 1試薬、 及び亜鉛測定用第 2試薬にて実施例 1 の 3と同 様にして測定を行った。
4. 測定結果
試料の測定結果を表 3に示した。 表 3
Figure imgf000026_0001
表 3から明らかなように、 亜鉛測定用第 1試薬にプリッジー 3 5を 含有させていない場合は、 測定対象金属 （亜鉛） 以外の金属である、 鉄及び銅には反応していないが、 ニッケルには反応していることが分 かる。 ところが、 第 1試薬にブリッジ一 3 5を含有させることで、 二 ッケルへの反応が抑制できていることが分かる。
これらのことより、 5— B r— P A P Sを用いた試料中の亜鉛を測 定する方法及び方法において、 鉄、 銅又はニッケルのマスキング剤と してビス—卜リスプロパンを含有させた本発明 ·亜鉛測定用第 1試薬 に、 更に非イオン性界面活性剤を含有させた場合には、 非イオン性界 面活性剤を含有させない場合に比べて、 試料に含まれるニッケルに対 する 5 — B r — P A P Sの発色を更に抑制する効果のあることが確 かめられた。
すなわち、 測定対象金属 （亜鉛） 以外の金属 （鉄、 銅及び/又は二 ッケル） が混在する試料であっても、 正確に測定対象金属 （亜鉛） 濃 度を測定できることが確かめられた。
〔実施例 4〕
(鉄、 銅及び Z又はニッケルに対するマスキング効果の確認— 4 ) 鉄、 銅及び Z又はニッケルに対するマスキング剤として、 ビス—卜 リスプロパンを用いて、 鉄、 銅及び/又はニッケルに対するマスキン グ効果を確かめた。
1 . 測定試薬の調製 ( Ί ) 本発明 ·亜鉛測定用第 1試薬の調製
下記の試薬成分を記載 濃度になるように純水に溶解し、 Ρ Ηを 9 · 5 ( 2 0°C) に調整し、 ビス一卜リスプロパン濃度の異なる 7種類の 本発明 ·亜鉛測定用第 1試薬を調製した。
ビス一 卜リスプロパン 3 mM、 1 5 mM、 2 4 mM、 3 0 m M、
3 6 mM、 4 5 mM又は 1 5 0 mM
ブリッジ— 3 5 1 . 3 3 %
( 2 ) 対照 ·亜鉛測定用第 1試薬の調製
前記 （ 1 ) の本発明 ·亜鉛測定用第 1試薬のビス—卜リスプロパン を含有させないこと以外は、 前記 （ 1 ) と同様にして対照 ·亜鉛測定 用第 1試薬の調製を行った。
( 3 ) 亜鉛測定用第 2試薬の調製
実施例 3の 1 の （2 ) で調製した亜鉛測定用第 2試薬をそのまま使 用した。
2. 試料の調製
実施例 3の 2の （ 1 ) 〜 （5 ) で調製した試料 A〜 Eをそのまま使 用した。
3. 試料の測定
前記 2の試料 A〜 E中の亜鉛の濃 を、 前記 1 で調製した亜鉛測定 用第 1 試薬及び亜鉛測定用第 2試薬にて実施例 1 の 3と同様にして 測定を行った。
4. 測定結果
試料の測定結果を表 4に示した。 表 4
Figure imgf000028_0001
表 4から明らかなように、 第 1試薬に鉄、 銅及び 又はニッケルに 対するマスキング剤として、 ビス—卜リスプロパンを含有させていな い対照 ·亜鉛測定用第 1試薬を用いた場合は、 亜鉛、 鉄、 銅及びニッ ケルのいずれの金属にも反応していることが分かる。
これに対し、 第 1試薬に鉄、 銅及び Z又はニッケルに対するマスキ ング剤として、 ビス—卜リスプロパンを含有させた本発明 ·亜鉛測定 用第 1試薬を用いた場合は、 測定対象金属である亜鉛のみに反応し、 鉄、 銅及びニッケルには反応していないことが分かる。
これらのことより、 5— B r— P A P Sを用いた試料中の亜鉛を測 定する方法において、 鉄、 銅及び Z又はニッケルのマスキング剤とし てビス一卜リスプロパンを含有させた本発明 ·亜鉛測定用第 1試薬を 用いた場合には、 鉄、 銅及び/又はニッケルのマスキング剤無添加の 対照，亜鉛測定用第 1試薬を用いた場合に比べて、試料に含まれる鉄、 銅及び 又はニッケルに対する 5— B r - P A P Sの発色を抑制す る効果のあることが確かめられた。
すなわち、 測定対象金属 （亜鉛） 以外の金属 （鉄、 銅及び/又は二 ッゲル) が混在する試料であっても、 正確に測定対象金属 （亜鉛） 濃 度を測定できることが確かめられた。
〔実施例 5〕
(添加回収試験）
本発明の亜鉛比色測定方法及び比色測定試薬における、 血清試料で の添加回収試験について検討を行った。
1 . 測定試薬の調製 ，
( 1 ) 亜鉛測定用第 1試薬の調製
実施例 3の 1 の （ 1 ) で調製した第 1試薬をそのまま使用した。 ( 2 ) 亜鉛測定用第 2試薬の調製
実施例 3の 1 の （2 ) で調製した第 2試薬をそのまま使用した。 2. 試料
1 g / Lの亜鉛標準液 （和光純薬工業社製、 原子吸光分析用） を、 0. 0 Ί N塩酸で希釈し、 亜鉛濃度として 1 0 0 At g /d Lになるよ うにヒ卜血清試料に添加したものを試料とした。
3. 試料の測定
前記 2の試料中の亜鉛濃度を、 前記 1で調製した亜鉛測定用第 1試 薬及び亜鉛測定用第 2試薬にて実施例 1 の 3と同様にして測定を行 つた。 続いて、 得られた亜鉛の測定値から亜鉛標準液添加前のヒ卜血 清試料中の亜鉛濃度を差し引いた値を、 亜鉛標準液を添加した量で割 ることにより、 添加回収率を求めた。
なお、 本発明による測定においては、 試料の除蛋白操作は行ってい ない。
試料の測定結果を表 5に示した。
表 5
Figure imgf000029_0001
表 5から明らかなように、 第 1試薬にブリッジ一 3 5を含有させて いない場合は、 添加回収率が 8 6. 8 %にとどまっているが、 第 1試 薬にプリッジー 3 5を含有させることで、 添加回収率が向上している ことが分かる。
これらのことより、 5 — B r — P A P Sを用いた試料中の亜鉛を測 定する方法及び試薬において、 鉄、 銅及び/又はニッケルのマスキン グ剤としてビス— 卜リスプロパンを含有させた亜鉛測定用第 1 試薬 に、 更に非イオン性界面活性剤を含有させた場合には、 非イオン性界 面活性剤を含有させない場合に比べて、 平均添加回収率 9 7 . 9 %の 良好な添加回収率が得られていることが確かめられた。
すなわち、 本発明においては、 血清試料の除蛋白操作を行わなくて も、 蛋白質等の血中成分の影響を受けることなく、 正確に亜鉛濃度を 測定できることが確かめられた。
これらのことより、 本発明の亜鉛測定試薬は、 試料の除蛋白操作を 必要とせず、 かつ試料中の亜鉛濃度を正確に測定できることが確かめ られた。
〔実施例 6〕
(従来法との比較）
従来法である I C P発光分析法及び本発明で、 同一試料中の亜鉛の 濃度を測定し、 測定値の比較を行った。
1 . 測定試薬の調製
( 1 ) 亜鉛測定用第 1試薬の調製
下記の試薬成分を記載の濃度になるように純水に溶解し、 本発明 · 亜鉛測定用第 1試薬を調製した。
ビス一卜リスプロパン 3 0 m M
ブリッジ— 3 5 1 . 3 3 %
( 2 ) 亜鉛測定用第 2試薬の調製
実施例 3の 1 の （2 ) で調製した第 2試薬をそのまま使用した。
2 . 試料
4 3種類のヒ卜血清試料 （試料番号： 〜 4 3 ) を用意した。
3 . 試料の測定
( 1 ) 本発明 ·測定試薬による測定 前記 2の各ヒ卜血清試料中の亜鉛濃度を、 前記 1で調製した亜鉛測 定用第 1 試薬及び亜鉛測定用第 2試薬にて実施例 1 の 3と同様にし て測定を行った。
なお、 本発明による測定においては、 試料の除蛋白操作は行ってい ない。
(2) 従来法 （ I C P発光分析法） による測定
前記 2の各ヒ卜血清試料中の亜鉛濃度を、 島津製作所社製 I C P S - 8 1 0 0 ( I C P発光分析装置） にて測定した。 なお、 I C P発光 分析法による測定においては、 試料に硝酸を添加後、 遠心分離によつ て蛋白質を除去する、 除蛋白操作を行った。
4. 測定結果
試料の測定結果を表 6に示した。 また、表 6に示した値は、本発明 · 測定方法及び測定試薬による測定値は各試料を各々 2回測定した平 均値を、 I C P発光分析法による測定値は各試料を各々 1 回測定した 値の容積置換補正値を示している。
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Figure imgf000032_0001
表 6から明らかなように、 本発明，亜鉛測定用試薬は、 従来法であ る I C P発光分析法による測定結果とよく一致していることが分か る。
これらのことより、 本発明の 5— B r - P A P Sを用いた試料中の 亜鉛を測定する方法及び試薬において、 鉄、 銅及び 又はニッケルの マスキング剤としてビス一 卜リスプロパンを共存又は含有させた亜 鉛測定試薬は、 試料の除蛋白操作を必要とせず、 かつ試料中の亜鉛濃 度を正確に測定できることが確かめられた。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . キレ一卜発色剤を使用する試料中の金属の比色測定方法において、 鉄、 銅及び 又はニッケルのマスキング剤を共存させることを特徴と する、 試料中の金属の比色測定方法。
2. キレー卜発色剤が、 2— （5—プロモー 2—ピリジルァゾ） 一 5 (N—プロピル一 N— 3—スルホプロピルァミノ） フエノール又はそ の塩であることを特徴とする、 請求の範囲第 1項記載の試料中の金属 の比色測定方法。
3. キレー卜発色剤が、 2— （ 5—ニトロ— 2—ピリジルァゾ） — 5 (N—プロピル— N— 3—スルホプロピルァミノ） フエノール又はそ の塩であることを特徴とする、 請求の範囲第 1項記載の試料中の金属 の比色測定方法。
4. 界面活性剤を使用する、 請求の範囲第 1項〜第 3項のいずれか一 項に記載の試料中の金属の比色測定方法。
5. 試料の除蛋白操作が不要である、 請求の範囲第 2項〜第 4項のい ずれか一項に記載の試料中の金属の比色測定方法。
6. 鉄、 銅及び Z又はニッケルのマスキング剤が、 ビス一卜リスプ口 パン、 ビス一卜リス、 T A P S , T A P S O、 T E S、 卜リシン、 卜 リスヒドロキシメチルァミノメタン、 B E S又は B i c i n eから選 択された 1種以上のマスキング剤である、 請求の範囲第 1項〜第 5項 のいずれか一項に記載の試料中の金属の比色測定方法。
7. 鉄、 銅及び 又はニッケルのマスキング剤が、 下記の一般式 （ I ) (式中、 X 1 〜X 6は水素原子、 置換されていないか若しくは置換さ れている、 水酸基、 カルボキシル基、 S H基又はアミノ基である） で 表される化合物である、 請求の範囲第 1項〜第 5項のいずれか一項に 記載の試料中の金属の比色測定方法。
Figure imgf000035_0001
8 . 比色測定を行う試料中の金属が、 亜鉛である、 請求の範囲第 1項
〜第 7項のいずれか一項に記載の試料中の金属の比色測定方法。
9 . 試料.中に含まれる鉄、 銅又はニッケルによる正誤差が抑制された 比色測定方法である、 請求の範囲第 1項〜第 8項のいずれか一項に記 載の試料中の金属の比色測定方法。
1 0 . 試料の除蛋白操作が不要である、 2— ( 5—ブロモ— 2 —ピリ ジルァゾ） _ 5 ( N —プロピル— N— 3—スルホプロピルアミノ） フ ェノール又はその塩を使用する試料中の亜鉛の比色測定方法。
1 1 . キレー卜発色剤を使用する試料中の金属の比色測定試薬におい て、 鉄、 銅及び Z又はニッケルのマスキング剤を含有することを特徴 とする試料中の金属の比色測定試薬。
1 2 . キレー卜発色剤が、 2 - ( 5 —ブロモ一 2 —ピリジルァゾ) ― 5 ( N —プロピル一 N— 3—スルホプロピルァミノ） フエノール又は その塩であることを特徴とする、 請求の範囲第 1 1項記載の試料中の 金属の比色測定試薬。
1 3 . キレー卜発色剤が、 2 - ( 5—ニトロ一 2 —ピリジルァゾ) ― 5 ( N —プロピル— N— 3—スルホプロピルァミノ） フエノール又は その塩であることを特徴とする、 請求の範囲第 1 1項記載の試料中の 金属の比色測定試薬。
1 4 . 更に、 界面活性剤を含む、 請求の範囲第 1 1 項〜第 1 3項のい ずれか一項に記載の試料中の金属の比色測定試薬。
1 5 . 試料の除蛋白操作が不要である、 請求の範囲第 1 2項〜第 1 4 項のいずれか一項に記載の試料中の金属の比色測定試薬。
1 6. 鉄、 銅及び/又はニッケルのマスキング剤が、 ビス—卜リスプ 口パン、 T A P S , T A P S O、 T E S、 卜リシン、 卜リスヒドロキ シメチルァミノメタン又はビシンから選択されるものである、 請求の 範囲第 1 1 項〜第 1 5項のいずれか一項に記載の試料中の金属の比 色測定試薬。
1 7.鉄、銅及びノ又はニッケルのマスキング剤が、下記の一般式（ I ) (式中、 X 1 〜X 6は水素原子、 置換されていないか若しくは置換さ れている、 水酸基、 カルボキシル基、 S H基又はアミノ基である） で 表される化合物である、 請求の範囲第 1 1項〜第 1 5項のいずれか一 項に記載の試料中の金属の比色測定試薬。 .
X1 X4
Figure imgf000036_0001
1 8. 試料中に含まれる鉄、 銅又はニッケルによる正誤差が抑制され た比色測定試薬である、 請求の範囲第 1 1項〜第 1 7項のいずれか一 項に記載の試料中の金属の比色測定試薬。
1 9. ビス—卜リスプロパン、 T A P S、 T A P S O、 T E S、 トリ シン、 卜リスヒドロキシメチルァミノメタン又はビシンよりなる、鉄、 銅及び/又はニッケルのマスキング剤。
2 0. 下記の一般式 （ I ) (式中、 X 1 〜X 6は水素原子、 置換され ていないか若しくは置換されている、 水酸基、 カルボキシル基、 S H 基又はアミノ基である) で表される化合物よりなる、 鉄、 銅及び Z又 はニッケルのマスキング剤。
Figure imgf000037_0001
2 1 . キレー卜発色剤を使用する試料中の金属の比色測定方法におい て、 鉄、 銅及び Z又はニッケルのマスキング剤を共存させることによ リ、 試料中に含まれる鉄、 銅又はニッケルによる正誤差を抑制する方 法。
2 2. キレー卜発色剤が、 2― ( 5—プロモー 2—ピリジルァゾ) ― 5 ( N—プロピル一 N— 3—スルホプロピルァミノ） フエノール又は その塩である、 請求の範囲第 2 1項記載の試料中に含まれる鉄、 銅又 はニッケルによる正誤差を抑制する方法。
2 3. キレー卜発色剤が、 2— ( 5—二卜ロー 2—ピリジルァゾ） ― 5 (N—プロピル一 N— 3—スルホプロピルァミノ） フエノール又は , その塩である、 請求の範囲第 2 1項記載の試料中に含まれる鉄、 銅又 はニッケルによる正誤差を抑制する方法。
2 4 · 鉄、 銅及び Z又はニッケルのマスキング剤が、 ビス一卜リスプ 口パン、 T A P S、 T A P S O、 T E S、 卜リシン、 卜リスヒドロキ シメチルァミノメタン又はビシンから選択されるものである、 請求の 範囲第 2 1 項〜第 2 3項のいずれか一項に記載の試料中に含まれる 鉄、 銅又はニッケルによる正誤差を抑制する方法。
2 5.鉄、銅及びノ又はニッケルのマスキング剤が、下記の一般式（ I ) (式中、 X 1 〜X 6は水素原子、 置換されていないか若しくは置換さ れている、 水酸基、 カルボキシル基、 S H基又はアミノ基である） で 表される化合物であることを特徴とする、 請求の範囲第 2 Ί項〜第 2 4項のいずれか一項に記載の試料中に含まれる鉄、 銅又はニッケル I： よる正誤差を抑制する方法。
Figure imgf000038_0001
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