WO2007097323A1

WO2007097323A1 - 感染症起因菌の迅速同定方法

Info

Publication number: WO2007097323A1
Application number: PCT/JP2007/053078
Authority: WO
Inventors: Hideki Niimi; Isao Kitajima
Original assignee: National University Corporation University Of Toyama
Priority date: 2006-02-21
Filing date: 2007-02-20
Publication date: 2007-08-30
Also published as: JPWO2007097323A1; EP1997886B1; EP1997886A4; JP4590573B2; ES2426038T3; US8323898B2; US20090061446A1; EP1997886A1

Abstract

【課題】　感染症起因菌、とりわけ敗血症の起因菌を迅速に検出・同定し、適切な抗菌薬を選択するシステムを提供すること。【解決手段】　本発明は、リアルタイムＰＣＲなどの遺伝子増幅を行い、遺伝子増幅産物の融解曲線分析により求めた融解温度（Ｔｍ値）の組合せ、或いは各Ｔｍ値間の差の組合せを解析することにより起因菌の検出・同定を迅速に行う方法である。　具体的には細菌の１６ＳリボソームＲＮＡに１～７つ、真菌の１８ＳリボソームＲＮＡに１～６つ、ＭＲＳＡ特異的なｓｐａ遺伝子およびｍｅｃＡ遺伝子に各１つ、計４～１６つのプライマーセットを使用してリアルタイムＰＣＲを行い、その増幅物のＴｍ値の組合せ、或いは各Ｔｍ値間の差の組合せをデータベースと照合し、敗血症起因菌の同定を行う。　本発明の方法により、感染症起因菌、とりわけ敗血症の起因菌を迅速に検出・同定することができ、敗血症の迅速診断法と敗血症治療におけるＥｖｉｄｅｎｃｅ－ｂａｓｅｄ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅが可能となる。

Description

明細書

感染症起因菌の迅速同定方法

技術分野

[0001] 本発明は、感染症、特に敗血症の早期治療実現のため、起因菌を迅速に検出'同定する方法に関する。

背景技術

[0002] 敗血症は重篤な全身感染症で、確定診断には血液中の起因微生物の検出'同定が必須である。

近年、癌治療や臓器移植など医療の高度化に伴い、敗血症発症のリスクの高い重症患者が増えている。

また、院内感染の観点からメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（MRSA)をはじめとする多剤耐性菌が敗血症の起因菌となることも多ぐ適切な抗菌薬を選択し患者を救命するためには、血液中の起因菌を可能な限り迅速に検出'同定することが臨床上重要である。

し力し現在の細菌学的検出法では、血液培養ボトルの提出から細菌の同定までに少なくとも 18時間はかかるため、結果が判明するまでの間は経験に基づく治療 (emp iric therapy)を施行せざるを得なぐ盲目的に抗菌薬の選択を余儀なくされていることが臨床的現状である。

その結果、広域スペクトルの抗菌薬使用による多剤耐性菌の出現や、不適切な抗菌薬選択により敗血症患者を救命できな、事態が生じて、る。

一方、敗血症起因菌 DNAの痕跡を PCR (polymerase chain reaction)〖こより増幅し、増幅された起因菌 DNAを、経験的に想定した菌に標的を定めた菌種固有のヌクレオチドプローブとハイブリッド形成させ、起因菌を検出 ·同定する試みがなされた (特許文献 1)。

さらに、検出'同定の迅速性を求めて、リアルタイム PCRによる技術が開発されている (非特許文献 1)。

[0003] 特許文献 1 :特開平 6— 90799号公報非特許文献 1 :生物試料分析， Vol. 28, No5. (2005) , 400—404 発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0004] 非特許文献 1の敗血症検査法は、ハイブリダィゼーシヨンプローブを用いたリアルタィム PCRを基本原理として、る。

しかし、該方法では、菌種それぞれに特異的なハイブリダィゼーシヨンプローブを作製する必要があり、数多くの起因菌を同定するためには際限なくハイブリダィゼーションプローブを用意しなければならな、。

つまり、検出する菌種の数は用意するプローブの数に依存するため、広範な菌種の同定は現実的に不可能である。

課題を解決するための手段

[0005] 本発明者らは、最近接塩基法の「融解温度 (melting temperature： Tm値）は塩基配列で決まる」という理論的根拠を元に、菌種毎の Tm値の違いを起因菌同定に応用することにつ、て鋭意研究した結果、本発明を完成するに至つた。

本発明は、微生物の DNAを抽出し、これを铸型として、特定のプライマーセットを使用して PCRなどで遺伝子増幅を行い、次いで、微生物に特異的な融解温度 (Tm 値)の組合せ、或いは各 Tm値間の差を解析することにより起因菌の検出 ·同定を迅速に行う方法である。

以下、本発明を詳細に説明する。

(1)細菌の 16SrRNAは、ほぼ全ての細菌に共通の塩基配列領域（20〜40塩基）を 7〜8ケ所もつことが知られて!/、る。

その全て或いは一部の箇所にフォワードとリバースのプライマーをそれぞれ設定すること〖こより、 1〜7つの遺伝子増幅領域を作製する。

(2)遺伝子増幅領域は、約 150〜200塩基であり、プライマーを設定した共通保存領域以外は、それぞれの細菌に固有の塩基配列を持つ。

従って、 Tm値も塩基配列の違いを反映して固有の値を示し、細菌毎に 1〜7種類の特徴的な Tm値を持つことが推定される。

それ故、細菌の種類に応じた 1〜7つの Tm値を調べ、データベース化する。このデータベースを利用して未知の細菌を同定することができる。

(3)さらに、真菌に固有のプライマーを 1〜6つ、 MRSA同定の為の spa、 mecAのプライマーを併用することで、未知の起因菌に対し、細菌感染とその種類 (MRSA含む）、或いは真菌感染とその種類を同定出来る。

(4)非特異的な遺伝子産物が生じ、目的の Tm値に近い値を示す場合、擬陽性のリスクが生じる。

そのような場合、遺伝子増幅後の増幅産物をァガロース'ゲルに流してバンドの大きさを確認することで、結果を二重にチェックすることが出来る。

すなわち、従来の遺伝子増幅による検出法で二重チェックするシステムを採用することで検査精度の向上が図れる。

(5)遺伝子増幅方法としてリアルタイム PCRを採用した場合、その定量性を利用して、菌量を治療前後で相対定量することで、治療効果のモニタリングの向上を図ることが出来る。

(6)リアルタイム PCR機器には、ヒートブロックで温度制御するブロック型と、空気を介して温度制御するエアバス型の 2種類ある力試行回毎にヒートブロック型で ±0. 1〜0. 3°C (メーカーで異なる）、エアバス型で ±0. 4の Tm値測定誤差が生じる（同じ試行回ではサンプル間誤差は ±0. 2°C程)。

この測定誤差で菌種同定が妨げられないように、同じ試行回の各 Tm値間の差異ノターンを判定に利用する方法を採用することが好ましい。

本発明に使用されるプライマー以下のとおりである。

<組み合わせグループ 1 >

全ての細菌の 16SrRNA遺伝子に共通な配列部位から 5力所を選び、フォワードプライマーとリバースプライマーを設定する。

具体的には以下のプライマーの塩基配列の全部または一部を含むプライマー、（B 1)大腸菌（E. coli)の 16SrRNA遺伝子（配列番号 1)の 809番目から 905番目に相当する 97塩基の DNAを増幅するプライマーセット（bacteria primer l : Bac. 1

) o

配列番号 2. GATTAGATACCCTGGTAGTCCACG (24mer)フォワード配列番号 3. CCCGTCAATTCCTTTGAGTTT (21mer) リバース

(B2)大腸菌（E. coli)の 16SrRNA遺伝子の 927番目から 1092番目に相当する 166塩基の DNAを増幅するプライマーセット（bacteria primer 2 : Bac. 2)。配列番号 4. AAACTCAAAGGAATTGACGGG (21mer)フォワード配列番号 5. CGCTCGTTGCGGGAC (15mer) リバース

(B3)大腸菌（E. 。₀1 の163 !^^\遺伝子の1108番目力ら 1218番目に相当する 111塩基の DNAを増幅するプライマーセット（bacteria primer 3 : Bac. 3)。配列番号 6. GTCCCGCAACGAGCG (15mer)フォワード

配列番号 7. ATTGTAGCACGTGTGTAGCCC (21mer) リバース (B4)大腸菌（E. coli)の 16SrRNA遺伝子の 1240番目力ら 1369番目に相当する 130塩基の DNAを増幅するプライマーセット（bacteria primer 4 : Bac. 4)。配列番号 8. GGGCTACACACGTGCTACAAT (21mer)フォワード配列番号 9. CCGGGAACGTATTCACC (17mer) リバース

[0007] 全ての真菌の 18SrRNA遺伝子に共通な配列部位を選び 1組の由来するフォヮ一ドプライマ一とリバースプライマーを設定する。

具体的には以下のプライマーの塩基配列の全部または一部を含むプライマー、 (F1)真菌の 18SrRNA遺伝子のプライマーセット（fungi primer： Fungi) 配列番号 10. GAATGAGTACAATGTAAATACCTTAACG (28mer) フォワード

配列番号 11. TAACTGCAACAACTTTAATATACGC (25mer) リバース [0008] MRSAの Spa遺伝子および mecA遺伝子のプライマーは、 LightCycler Probe Design 2 ソフトウェアを用い、最もスコアが高いプライマーデザインを選定する。具体的には、

(Ml) MRSAの Spa遺伝子のプライマーセット（spa primer: spa)。

配列番号 12. TGAACGAAGAACAACGCAAT (20mer)フォワード配列番号 13. TTTGCTCACTGAAGGATCGTC (21mer) リバース (M2) MRSAの mecA遺伝子のプライマーセット (mecA primer： mecA) 配列番号 14. ATTATAAAGCAATCGCTAAAGAACTAAGTA (30mer) フォワード

配列番号 15. CCAATAACTGCATCATCTTTATAGCC (26mer) リバ一ス

<組み合わせグループ 2 >

全ての細菌の 16SrRNA遺伝子に共通な配列部位から 10力所を選び、フォワードプライマーとリバースプライマーを設定する。

具体的には以下のプライマーの塩基配列の全部または一部を含むプライマー、 (B5)大腸菌（E. coli)の 16SrRNA遺伝子の 8番目力 345番目に相当する 33 8塩基の DNAを増幅するプライマーセット（bacteria primer 5 : Bac. 5)。

配列番号 17. AGAGTTTGATCATGGCTCAG (20mer)フォワード配列番号 18. CGTAGGAGTCTGGACCGT (18mer) リバース

(B6)大腸菌（E. coli)の 16SrRNA遺伝子の 336番目力ら 534番目に相当する 199塩基の DNAを増幅するプライマーセット（bacteria primer 6 : Bac. 6)。配列番号 19. GACTCCTACGGGAGGCA (17mer)フォワード

配列番号 20. TATTACCGCGGCTGCTG (17mer) リバース

(B7)大腸菌（E. coli)の 16SrRNA遺伝子の 519番目力 805番目に相当する 287塩基の DNAを増幅するプライマーセット（bacteria primer 7 : Bac. 7)。配列番号 21. AGCAGCCGCGGTAATA (16mer)フォワード

配列番号 22. GGACTACCAGGGTATCTAATCCT (23mer) リバース (B8)大腸菌（E. coli)の 16SrRNA遺伝子の 780番目力ら 960番目に相当する 181塩基の DNAを増幅するプライマーセット（bacteria primer 8 : Bac. 8)。配列番号 23. AACAGGATTAGATACCCTGGTAG (23mer)フォワード配列番号 24. AATTAAACCACATGCTCCACC (21mer) リバース (B9)大腸菌（E. coli)の 16SrRNA遺伝子の 951番目から 1070番目に相当する 120塩基の DNAを増幅するプライマーセット（bacteria primer 9 : Bac. 9)。配列番号 25. TGGTTTAATTCGATGCAACGC (21mer)フォワード配列番号 26. GAGCTGACGACAGCCAT (17mer) リバース

(B10)大腸菌（E. coli)の 16SrRNA遺伝子の 1084番目力ら 1192番目に相当する 109塩基の DNAを増幅するプライマーセット（bacteria primer 10 : Bac. 10)。配列番号 27. TTGGGTTAAGTCCCGC (16mer)フォワード

配列番号 28. CGTCATCCCCACCTTC (16mer) リバース

(B11)大腸菌（E. coli)の 16SrRNA遺伝子の 1220番目力ら 1385番目に相当する 166塩基の DNAを増幅するプライマーセット（bacteria primer l l : Bac. 11)。配列番号 29. GGCTACACACGTGCTACAAT (20mer)フォワード配列番号 30. CCGGGAACGTATTCACC (17mer) リバース

真菌の 18SrRNA遺伝子に共通な配列部位から 7ケ所を選び、フォワードプライマ一とリバースプライマーを設定する。

具体的には以下のプライマーの塩基配列の全部または一部を含むプライマー、 (F2)カンジダ菌（C. Albicans)の 18SrRNA遺伝子（配列番号 16)の 149番目力ら 407番目に相当する 259塩基の DNAを増幅するプライマーセット（fungi prim er 2： Fungi 2)

配列番号 31. GTGGTAATTCTAGAGCTAATACATGC (26mer) フォヮード

配列番号 32. GGTAGCCGTTTCTCAGG (17mer) リバース

(F3)カンジダ菌（C. Albicans)の 18SrRNA遺伝子の 390番目から 551番目に相当する 162塩基の DNAを増幅するプライマーセット（fungi primer 3 : Fungi 3

)

配列番号 33. GCCTGAGAAACGGCTACCA (19mer) フォワード配列番号 34. CCTCCAATTGTTCCTCGTTAAG (22mer) リバース (F4)カンジダ菌（C. Albicans)の 18SrRNA遺伝子の 531番目から 762番目に相当する 232塩基の DNAを増幅するプライマーセット（fungi primer 4 : Fungi 4

)

配列番号 35. TTAACGAGGAACAATTGGAGGG (22mer) フォワード配列番号 36. GCCTGCTTTGAACACTCTAATTT (23mer) リバース (F5)カンジダ菌（C. Albicans)の 18SrRNA遺伝子の 989番目力 1134番目に相当する 146塩基の DNAを増幅するプライマーセット（fungi primer 5： Fungi 5)

配列番号 37. ATACCGTCGTAGTCTTAACCA (21mer) フォワード配列番号 38. GTCAATTCCTTTAAGTTTCAGCCT (24mer) リバース (F6)カンジダ菌（C. Albicans)の 18SrRNA遺伝子の 1260番目力 1428番目に相当する 169塩基の DNAを増幅するプライマーセット（fungi primer 6 : Fun gi 6)

配列番号 39. CATGGCCGTTCTTAGTTGG (19mer) フォワード配列番号 40. GGGCATCACAGACCTGTT (18mer) リバース

(F7)カンジダ菌（C. 八11) &115)の183 1^^\遺伝子の1414番目力 1630番目に相当する 217塩基の DNAを増幅するプライマーセット（fungi primer 7 : Fungi 7)

配列番号 41. AGGTCTGTGATGCCCTTAG (19mer) フォワード配列番号 42. CGGGCGGTGTGTACAAA (17mer) リバース

[0011] MRSAの Spa遺伝子および mecA遺伝子のプライマーは、 LightCycler Probe Design 2 ソフトウェアを用い、最もスコアが高いプライマーデザインを選定する。具体的には、

(M3) MRSAの Spa遺伝子のプライマーセット（spa primer 2 : spa2)。配列番号 43. TAAACGATGCTCAAGCACCAA (21mer)フォワード配列番号 44. GGTTTAACGACATGTACTCCG (21mer) リバース (M4) MRSAの mecA遺伝子のプライマーセット（mecA primer 2 :mecA2) 配列番号 45. CAAACTACGGTAACATTGATCGC (23mer) フォワード配列番号 46. ATGTATGCTTTGGTCTTTCTGC (22mer) リバース

[0012] 本発明の遺伝子増幅の方法として、 PCR法が好ましぐさらにリアルタイム PCR法が好ましい。

本発明に使用されるリアルタイム PCRは、二本鎖 DNAに結合することで蛍光を発する試薬 (インターカレーター）を PCR反応系に加えるインターカレーター法である。インターカレーターとして、ェジチジゥムブロマイド、サイバ一'グリーン I (SYBR G reen I)などが挙げられる。好ましいインターカレーターは、サイバ一 ·グリーン Iである。

尚、本発明で使用するプライマーは全てのバクテリア DNAに反応する為、使用すべきサイバー 'グリーン： [は、組換えホスト由来のバクテリア DNA混入を最小限に抑えた高純度のサイバーグリーン Iを使用すべきである。

[0013] 本発明において、 Tm値とは、 PCR産物の 50%がその相補鎖と解離する時の温度である。

また、最近接塩基法による Tm値計算式の「Tm値は塩基配列で決まる」ヽぅ理論的根拠を元に、菌種ごとの塩基配列の違いを Tm値の違いとして起因菌同定に応用することができる。

従って、「Tm値力も測定誤差の影響を排除する」ことが正確に同定する上で最も重要となる。このため、以下の方法で測定誤差の影響を排除する。

先ず、 Tm値は緩衝液の組成などが異なる実験条件下では変化するため、塩ィ匕マグネシゥム濃度の固定されたサイバー 'グリーン Iを反応用緩衝液として使用することで、反応液の組成による測定誤差を生じな、ようにする。

次に、リアルタイム PCR機器自体が試行回毎に測定誤差を生じるため、コントロールとしての標準 Tm値を設定すると共に、同じ試行回での各 Tm値間の差異パターンを判定に利用する。

[0014] 本発明におヽて、測定機器の試行間誤差を補正する目的で、基準 Tm値を使用することがでさる。

具体的には、テンプレートとして一定濃度の大腸菌標準株の DNAを用い、細菌の 16SrRN A遺伝子の一領域を増幅する 1つのプライマーセットを使用して毎回 Tm値を測定し、試行回毎の Tm値のズレを補正する。

すなわち、同じテンプレートに同じプライマーの組み合わせであれば、理論的には毎回同じ Tm値となる。

しかし、実際に得られた Tm測定値がズレた場合、それは試行間誤差となるので、そのズレ分だけ補正を行えばよ、。

[0015] 本発明の方法の手順は以下のとおりである。

(1)微生物の DNAを抽出する。 (2)抽出した未知の微生物 DNAに対し、以下の細菌、 MRSA、および真菌のプライマ一セットを用いて遺伝子増幅後、それぞれの Tm値を一時に測定し、細菌、 MR SA、および真菌の Tm値の組合せを得る。

(3)真菌であるか否か。

[上記（2)の Tm値の組合せの中で、全ての真菌の 18SrRNA遺伝子の一領域〜複数領域を増幅できるプライマーセットを用いて得た真菌に特異的な Tm値を先ず解析することで、真菌であるか否か、或いは真菌の種類を判定する。 ]

(4) MRSAであるか否か。

[上記（2)の Tm値の組合せの中で、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（MRSA)の Sp a遺伝子および mecA遺伝子を特異的に増幅するプライマーセットを用いて得た MR S Aに固有の遺伝子増幅を解析することで、 MRSAであるか否かを判定する。 ]

(5)どの細菌であるか絞り込む

[上記（2)の Tm値の組合せの中で、全ての細菌の 16SrRNA遺伝子の複数領域を増幅できるプライマーセットを用いて得た細菌に特異的な Tm値を解析することで、細菌の種類を同定する。 ]

細菌の絞り込みは、具体的には、細菌の Tm値の一つに注目して（場合によっては、標準 Tm値で先ず補正する）、その Tm値に値の近い菌種に範囲を狭め、順次 Tm 値の差を取って絞り込む、または、直接、標準 Tm値を含む、各 Tm値間の差をとつて、その差の組み合わせをフィンガープリントとして同定する。

また、起因菌が細菌か、真菌か、あるいは MRSAであるかを迅速、簡便に同定する方法としては、 Tm値を利用しなくても未知の微生物 DNAを抽出し、これを铸型として、 [1]真菌の 18SrRNA遺伝子の全ての真菌に共通、且つ真菌特異的に検出するプライマー 1つ、 [2]メチシリン耐性黄色ブドウ球菌の Spa遺伝子および mecA遺伝子を特異的に検出するプライマー各々 1つずつ、 [3]細菌の 16SrRNA遺伝子の全ての細菌に共通、且つ細菌特異的に検出するプライマー 1つ、の計 4つのプライマーで PCRを行い、ァガロース'ゲルに電気泳動して目的サイズのバンドを確認する方法がある。

発明の効果 [0016] (1) 4〜18個、好ましくは 4〜16個のプライマーセットを元にリアルタイム PCRなどの遺伝子増幅を実施し、得られる Tm値をデータベースと照合することにより、抗菌薬選択に必要な起因菌の菌種同定が出来る。

(2)血液検体の場合、 DNA抽出から Tm値の解析、そして同定までに要する時間は約 2時間であり、迅速診断が可能となる。

(3) DNAを抽出する血液検体の量を一定とした場合、菌量の相対量を定量でき、抗菌薬投与後の治療効果のモニタリングが可能となる。

図面の簡単な説明

[0017] [図 1]ァガロース ·ゲル上の泳動バンドを示す。

発明を実施するための最良の形態

[0018] 以下、本発明を実施例および試験例によってより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

以下の実施例では、細菌のプライマー 7つ（bacteria primer 5〜11)、MRSA の Spa、 mecA遺伝子のプライマーそれぞれ 1つずつ (spa primer 2, mecA pr imer 2)、そして真菌のプライマー 1つ（Fungi primer 5)、標準 Tm値測定用プライマ一 1つ（bacteria primer 3)の計 11のプライマーで実施した。

[実験材料と DNA抽出]

使用菌株は、 2004年 4月 1日から 2005年 3月 31日までの 1年間に、富山大学附属病院検査部細菌検査室に提出された 1323検体中陽性となった 160株 (保存菌株 )を使用した。

通常の分離培養法は、全自動血液培養検査装置パクテアラート (BactZAlert:日本ビオメリュー）を用いて培養した。

使用ボトルは専用の SA培養ボトル (好気性菌用）、 SN培養ボトル (嫌気性菌用）、 P F培養ボトル (重篤な小児疾患病原菌検出用）を組み合わせた。分離同定は、定法に従つに。

DNAの抽出は、保存菌株をミュラ一.ヒントン（Mueller— Hinton)寒天培地（日本ベタトン'ディッキンソン）、羊血液寒天培地（日水製薬)およびサブロー寒天培地（日本べタトン 'ディッキンソン)で分離培養後、その 1コロニーを滅菌生食水 lmlの入ったマイクロチューブに浮遊させ、 12, 000 rpmで 2分間遠心し上清を捨て菌のペレットを残し、次に、インスタジーンマトリクス（Insta Gene Matrix:日本バイオ'ラッドラボラ卜リーズ）を 200 μ 1カロえ、 56°Cで 15〜30分間カロ温する。

その後、マイクロチューブを激しくボルテックスして、 100°Cのヒートブロックで 8分間ボイルする。

最後に、 12, 000 rpmで 2分間遠心しその上清を DNA抽出液とした。

[リアルタイム PCR法]

リアルタイム PCR機器としてライトサイクラ一 1. 5 (LightCyclerl. 5 :ロシュ ·ダィァグノスティックス）を使用した。

リアルタイム PCR用試薬は、パワーサイバーグリーン PCRマスターミックス（Power SYBR Green PCR Master Mix:アプライド 'バイオシステムズ）を用いた。 PCRの成分構成は、ゲノム DNAテンプレート量 2 μ 1、 PCRプライマー 10倍濃縮 2 μ 1 (最終濃度は 250ηΜ)、リアルタイム PCR用試薬 2倍濃縮 10 1、 BSA (500 μ g/ml) 2 1、超純水 4 μ 1で、計 20 μ 1の系で行った。

リアルタイム PCRのプログラム設定を表 1に示す。

なお、伸長反応時間は、 300塩基長までの増幅を可能にする最短時間である 12秒に ¾¾疋 'した。

表 1にリアルタイム PCRのプログラム設定を示す。

[表 1]

[融解曲線分析による Tm値のデータ解析]

リアルタイム PCRを施行後の、 Tm値の解析は、先ず、定量曲線をチェックし、それぞれのプライマーが量的に立ち上がっているかどうかを確認した。他のプライマーの立ち上がりサイクル数に比較し、極端にサイクル数の低!、立ち上力 Sりはプライマーが掛カつて、な、と判断した。

次に、融解曲線の形状をチェックした。

急激に PCR産物が一本鎖に解離し始める"崖"の形状 (急激な F1値の低下所見）が確認できなければ、その Tm値は採用しなかった。

上記 2項目を確認した後、 Tm値を融解ピーク曲線 (melting peak)の"山"から計昇した。

[プライマーの検出感度]

各プライマーの検出感度を事前に測定した。結果を表 2に示した。

[表 2]

検出感度を評価するため、菌株から取り出したゲノム DNAを順次希釈し、リアルタィム PCRにて検出の有無を確認した。

それぞれのプライマーの検出感度には差が生じた力システムとして評価するには検出感度の最も低いプライマー（bacteria primer 5, 10 と mecA primer 2 )を基準に決め、システムとしての感度をゲノム DNA lng/ μ 1と設定した。 [起因菌 Tm値データベースの作成]

未知の敗血症起因菌を同定するシステムを構築するために、先ず頻度の高い起因菌に関する Tm値データベースの作成を行った。

データベースに登録する起因菌を決定するため、富山大学医学部附属病院検査部にて 2004年 4月 1日力も 2005年 3月 31日までの 1年間、血液培養検査で陽性となった有効株 160株についての検出菌頻度を調べ、計 34種の起因菌についてデータベースを作成した（表 3〜7)。

表はグラム陽性 '陰性、球菌'桿菌に分けて分類し、検出頻度の高い順に並べたものである。

この表では、菌から Tm値を探すツールとして利用できる。尚、大腸菌標準株 DNA と bac. 7プライマーの組合せで得られるコントロール Tm値は 84. 43度とした。表【こお!、て、

( )中の Tm値は、検出される可能性も、されない可能性もあることを示す。

(一）と Tm値との併記は、検出されないか、或いは検出された場合の Tm値を示す

"—"は、検出されないことを示す,

グラム陽性球菌を表 3に示す。

[表 3]

[0024] グラム陽性桿菌を表 4に示す。

[表 4]

[0025] グラム陰性球菌を表 5に示す。

[表 5]

[0026] グラム陰性桿菌を表 6に示す, [表 6] name Fungi.5 bac.5 bac.6 bac.7 bac.8 bac.9 bac.lO bac.ll Spa.2 mecA.2

Escherichia coli 84.62 83.T6 S4.6 S5.06 81.5 83.03 82.64

Klebsiella pneumoniae 85.02 84.48 84.85 84.29 81.2 81.84 81.14

Klebsiella oxytoca S4.S4 83. 6 84.43 83.84 81.08 81.42 81.21

Pseudomonas aeruginosa 84.59 82.49 83.53 83.94 81.52 82.96

Enterobact er cloacae 84.85 84.39 84.84 84.27 81.41 81.81 81.15

Enterobact er aerogenes 84.71 83.36 84.78 84.74 80.74 82.46 81.16

Haemophilus influenzae 84.01 82.34 82.85 83.36 80.65 81.58 81.81

Citrobacter freundii 85.03 84.14 84.96 84.91 81.12 82.32 81.75

M organella mor anii 84.42 83.38 83.94 84.54 80.9 82.8 81.46

Sphingomanas paucimobilis 83.06 83.47 83.56 81.87 81.6T 83.58

Serratia marcescens 84.76 83.82 84.27 84.01 80.92 82.48 81.65

Klu vera a or bat a S3.7 82.41 83.27 83.89 80.85 81.84 80.67

[0027] 真菌を表 7に示す。

[表 7]

[0028] [起因菌同定早見表の作成]

未知の敗血症起因菌を解析した場合、得られるデータは 1つのコントロール Tm値と、 10の PCR増幅産物 Tm値の組合せである力表 3〜7のデータベースでは Tm値力起因菌を同定するには不便である。

従って Tm値力起因菌を容易に同定するために、起因菌同定早見表を作成した ( 表 8)。

[0029] [表 8]

79.79

79

―

l

l l

丄

83.96 83.96 81.36 83.06 .93

0.55 o.ee

o.es

0.13 0.08 -3.9

*コントロール Tm値 =84. 43°C

カツコ（）中の Tm値は、検出される可能性も、されない可能性もあることを示す, (一）と Tm値との併記は、検出されないか、或いは検出された場合の Tm値を示す "—"は、検出されないことを示す。

各 Tm値に下記した数値は、左隣の Tm値に比較した、大小の差を示す。

[0030] 表は左の項目力も順にチェックするものとする。横の並びは先ず、 Fungi primer が陽性となる真菌を見極めの最優先事項として最上段に並べた。

次に spaが陽性となる菌が少ないことを考慮して、 2番目の優先次項においた。優先順位の最後には mecAをお、たが、この理由はメチシリン耐性遺伝子の有無は同一菌種でも異なるからである。

Staphylococcus epidermidisや他の； staphylococcus種の一部は mecAを持つ可能性があるが、陰性であった場合の同定が煩雑にならないよう、敢えて優先順位の最後においた。上記の優先次項を除いた同定法については、 bacteria prime r 7種による Tm値の組合せを解析する。

そこで先ず、最初のプライマー（bac. 5)では Tm値の高い方力順に並べることにした。

このように並べることで、容易な検索が可能となった。

さらに、早見表の bacteriaの Tm値に差異のパターンが分力るよう、差異の数値を下記した。左隣の Tm値に対する変動幅の大小間系を土の数値で表わした。これにより、リアルタイム PCR機器自体の試行回毎の測定誤差に影響されること無ぐ bacteria の 7つの Tm値の差異パターンにより判別することが可能となる。

[0031] [ブラインドテストによる検証]

[試験 1]

本発明システムを評価するため、菌名を隠して本発明の 11のプライマーセットでリアルタイム PCRを行い、 Tm値の組合せをデータベースと照合し、菌種の同定を試みた。

得られた Tm値の組合せを表 9に示す。

[0032] [表 9]

[0033] Fungi5, spa2, mecA2 はそれぞれ陰性であり、 bacteria primerのみで PC R産物の Tm値が得られた。

コントロール Tm値力 ¾4. 02を示したので、本来の値である 84. 43力らー 0. 41全体に施行間誤差を生じていると判断し、 Bac. 5の Tm値に + 0. 41加えて補正を行つた o

すると bac. 5の Tm値が 84. 58であったので、機器の施行内誤差 ±0. 2°Cを考慮し、起因菌早見表の 84. 78~84. 28の部分に注目した（表 10の Bac. 5の列）。次に Bac. 6力 Bac. 5と比較して Tm値差が 2. 12°Cなので、施行内誤差 ±0. 2 °Cを考慮して一 1. 92〜一 2. 32の範囲の差〖こ注目すると、 3つの候補、すなわち En terococcus laecalis, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus laeciu mが残る結果となった。

次に Bac. 7への Tm値差は + 1. 04なので、 + 1. 24 + 0. 84の範囲に注目すると Pseudomonas aeruginosaのみに！ ¾られ7こ。

その後の bac. 8, 9, 10, 11への Tm値差は全て Pseudomonas aeruginos aのデータベース値と合致し、結果も Pseudomonas aeruginosaで正解であった。計 12回のブラインドテストを行った結果、全ての同定に正解を得ることが出来た。

[0034] [表 10]

[Tm値を利用しな簡便な代替方法にっ、て]

本発明のプライマーを使用して、リアルタイム PCR等の Tm値測定機器を使うことなぐ起因菌が細菌か、真菌か、 MRSAか、の簡便 ·迅速同定が可能となる。

具体的には、一般の PCR用サーマルサイクラを用い、本発明のバクテリアプライマー 1つ、真菌プライマー 1つ、 spa, mecAプライマーそれぞれ 1つずつの計 4種類のプライマーで未知の起因菌 DNAをテンプレートとした PCRを行!、、増幅産物をァガロース.ゲルで泳動する。その結果、既存のサイズのバンドが確認されれば、細菌、真菌、 MRSAいずれかの感染を区別出来ることになる（図 1)。

その結果、リアルタイム PCRの様な機器の無い施設においても、簡便'迅速に細菌 •真菌 · MRSA感染の区別を行うことが出来、早期の適切な抗菌薬の選択に役立つ尚、本発明で使用するバクテリアプライマーは全てのバクテリア DNAに反応する為、使用すべき DNAポリメラーゼは、組換えホスト由来のバクテリア DNA混入を最小限に抑えた高純度のポリメラーゼを使用すべきである。

[0036] 簡便な代替方法を用いて確認された、ァガロース ·ゲル上の泳動バンドを図 1に示す。

使用したプライマー； bac. 6, fungi. 5, spa, mecA, の計 4つ。使用した DNAポリメラーゼ； AmpliTaq Gold DNA Polymerase, LD (ァプライド'バイオシステムズ）

産業上の利用分野

[0037] 本発明の方法により、感染症起因菌、とりわけ敗血症の起因菌を迅速に検出'同定することができ、敗血症の迅速診断法が実現する。

即ち、本発明により起因菌を 2時間以内に同定するシステム構築が可能となるため、敗血症早期に最適な抗菌薬選択が可能となる。

また、抗菌薬投与後の治療効果のモニタリングも可能となる。

Claims

請求の範囲

[1] 微生物の DNAを抽出し、これを铸型として、以下の（B)、 (F)、（M)のプライマーセットで遺伝子増幅を行い、次いで、微生物に特異的な融解温度 (Tm値)の組み合わせを解析することを特徴とする感染症起因菌の同定方法。

(B)全ての細菌の 16SrRNA遺伝子の複数領域を増幅できるプライマーセット、および各プライマー塩基配列の全部または一部を含むプライマー。

(F)全ての真菌の 18SrRNA遺伝子の複数領域を増幅できるプライマーセット、および各プライマー塩基配列の全部または一部を含むプライマー。

(M)メチシリン耐性黄色ブドウ球菌の Spa遺伝子および mecA遺伝子を特異的に増幅するプライマーセット。

[2] 遺伝子増幅が PCRである請求の範囲 1記載の感染症起因菌の同定方法。

[3] PCRカ^アルタイム PCRである請求の範囲 2記載の感染症起因菌の同定方法。

[4] 細菌の 16SrRNA遺伝子の増幅領域が 1〜7つである請求の範囲 1〜3のいずれかに記載の感染症起因菌の同定方法。

[5] 真菌の 18SrRNA遺伝子の増幅領域が 1〜6つである請求の範囲 1〜4のいずれかに記載の感染症起因菌の同定方法。

[6] 標準コントロールとして、一定濃度の大腸菌標準株 DNAをテンプレートとし、

(B)全ての細菌の 16SrRNA遺伝子の複数領域を増幅できるプライマーセット、および各プライマー塩基配列の全部または一部を含むプライマーセットのいずれか 1つを用いて標準 Tm値を毎回測定することにより、測定機器による Tm値の誤差を補正する方法が付加された請求の範囲 1〜5のいずれかに記載の感染症起因菌の同定方法。

[7] 感染症起因菌同定のアルゴリズムとして、 Tm値そのものの組合せだけでなぐ各 T m値間の差の組合せを利用して同定することで、測定誤差の影響を最小限とする方法が付加された請求の範囲 1〜6のいずれかに記載の感染症起因菌の同定方法。

[8] 微生物が敗血症の起因菌である請求の範囲 1〜7のいずれかに記載の感染症起因菌の同定方法。

[9] 未知の微生物 DNAを抽出し、これを铸型として、 [1]真菌の 18SrRNA遺伝子の複数領域を増幅できるプライマーセットで遺伝子増幅を行い、真菌に特異的な融解温度 (Tm値)を解析し、次いで、 [2]メチシリン耐性黄色ブドウ球菌の Spa遺伝子および mecA遺伝子を特異的に検出するプライマーセットで遺伝子増幅を行ヽ、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌に特異的な融解温度 (Tm値)を解析し、次いで、 [3]細菌の 16SrRNA遺伝子の複数領域を増幅できるプライマーセットで遺伝子増幅を行い、細菌に特異的な融解温度 (Tm値)を解析して、それぞれの Tm値の組合せ、或いは標準 Tm値を含めた各 Tm値間の差の組合せを解析することを特徴とする感染症起因菌の同定方法。