JP2012513591A - 敗血症の検出のための方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、敗血症及びこの重症度の診断、検出、又は、予後のための方法に関する。より具体的には、この方法は、敗血症のためのマーカーとして、敗血症を有している、あるいは、有している疑いのある個体の血小板中のグランザイムＢの存在、又は、量を用いる。（バックグラウンドレベルを超えた）グランザイムＢの存在は、敗血症の存在を示し、また、グランザイムＢの量は、この病気の重症度と直接的に相関する（濃度がより高いほど、この病気がより重篤である）。
【選択図】 図２

Description

本願は、２００８年１２月２２日出願の米国仮特許出願第６１／１３９，９３６号に対する優先権を主張するものであり、これは、参照により本明細書に盛り込まれる。

本発明は、敗血症及びこの重症度の診断、検出、又は、予後のための方法に関する。より具体的には、本発明は、敗血症のためのマーカーとして、血小板中のグランザイムＢの存在、及び、量を用いる。

抗生物質、救命医療、及び、器官サポートモダリティにおける、数十年間の価値ある進歩にもかかわらず（ホッチキスら（Ｈｏｔｃｈｋｉｓｓ ｅｔ ａｌ．），Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ，３４８：１３８−１５０，２００３、及び、ラッセル（Ｒｕｓｓｅｌｌ），Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３５５：１６９９−１７１３，２００６）、敗血症による死亡率は、約４０％と概ね変わらなかった（アンガスら（Ａｎｇｕｓ ｅｔ ａｌ．），Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ ２９：１３０３−１３１０，２００１）。事実、敗血症は、米国において毎年２１５，０００人の死亡原因である。これは、急性心筋梗塞による死亡率と類似しており（アンガスら（Ａｎｇｕｓ ｅｔ ａｌ．），２００１）、これを１０番目の主要な死亡原因にしている（コチャネックら（Ｋｏｃｈａｎｅｋ ｅｔ ａｌ．），Ｎａｔｌ Ｖｉｔａｌ Ｓｔａｔ Ｒｅｐ５２：１−４７，２００４）。最近のパラダイムシフトは、敗血症関連の死亡が、深刻なリンパ球アポトーシスに付随して起こる免疫不全に一部起因することを示す（ホッチキスら（Ｈｏｔｃｈｋｉｓｓ ｅｔ ａｌ．），Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ６：８１３−８２２，２００６）。実際、このアポトーシスは、進行性の敗血症、及び、多臓器機能不全の診断上の特徴と考えられる。しかしながら、アポトーシスの病因は不明である。

敗血症は、感染症によって引き起こされた全身の炎症性の状態によって特徴づけられる。全身性の炎症では、敗血症の場合で見られるように、炎症特異反応カスケードが、無制御な方法で全身に広がり、過度の免疫反応を背景に生死にかかわるようになる。敗血症のための最新の定義は、レヴィーら（Ｌｅｖｙ ｅｔ ａｌ．）（Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｃａｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３１（４）：１２５０−１２５６，２００３）が発表した。

炎症過程は、多くの物質（これらは、主にタンパク質性、あるいは、ペプチド性である）によって制御される、もしくは、一定の生体分子の発生を伴う。炎症反応に関与する内因性の物質は、特に、サイトカイン、メディエータ、血管刺激物質、急性期タンパク質、及び／又は、ホルモン調整物質を含む。炎症反応は、炎症過程を活性化する内因性の物質（例えば、ＴＮＦ−α）、及び、非活性化する物質（例えば、インターロイキン１０）の両方を含む複雑な生理的反応である。内因性の炎症特異的物質の個々のグループの発生、及び、可能性のある役割についての現在の知識は、例えば、ベイスハイゼンら（Ｂｅｉｓｈｕｉｚｅｎ ｅｔ ａｌ．）（Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３：５５−１３１，１９９９）、及び、ギャベイら（Ｇａｂａｙ ｅｔ ａｌ．）（Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３４０（６）：４４８−４５４，１９９９，４４８−４５４）中に開示される。最近の文献は、敗血症関連の免疫不全が、深刻なリンパ球アポトーシスの原因であることを示す（ホッチキスら（Ｈｏｔｃｈｋｉｓｓ ｅｔ ａｌ．） ２００３、ラッセル（Ｒｕｓｓｅｌｌ） ２００６、ホッチキスら（Ｈｏｔｃｈｋｉｓｓ ｅｔ ａｌ．），Ｓｃａｎｄ Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ．３５（９）：５８５−５９２，２００３、グローズドンクら（Ｇｒｏｅｓｄｏｎｋ ｅｔ ａｌ．），Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １７９（１２）：８０８３−８０８９，２００７、ホッチキスら（Ｈｏｔｃｈｋｉｓｓ ｅｔ ａｌ．），Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １７４（８）：５１１０−５１１８，２００５、及び、ウェッシュら（Ｗｅｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．），Ｊ Ｌｅｕｋｏｃ Ｂｉｏｌ． ７８（２）：３２５−３７，２００５）。また、脾臓、肺、及び、腸のような他の末端器官において、アポトーシスがよく見られる(クラウサーら（Ｃｒｏｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．），Ａｍ． Ｊ． Ｒｅｓｐｉｒ． Ｃｒｉｔ． Ｃａｒｅ Ｍｅｄ． １６１（５）：１７０５−１７１２，２０００）。実際、このアポトーシスは、進行性の敗血症の診断上の特徴と考えられる。

診断目的のためには、炎症過程に関連する内因性の物質の複雑なカスケードにおいて、この役割を知る必要がない、各バイオマーカーと疾患との信頼できる相関関係が、最重要である。ボュオン（Ｂｏｈｕｏｎ）の米国特許第５，６３９，６１７号は、敗血症のマーカーとして、ペプチドであるプロカルシトニンを開示する。ベルクマンら（Ｂｅｒｇｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．）の米国特許第６，７５６，４８３号は、炎症過程そして敗血症に積極的に関与する形態として、完全プロカルシトニンペプチドのアミノ酸３−１１６を含む、短くされたプロカルシトニンを開示する。

敗血症のための他のマーカーは、カルバモイルリン酸シンターゼ１（ＣＰＳ１）又はそのＮ末端フラグメント（米国特許第７，４１３，８５０号）と、ＣＤ２５、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ３３、及び、ＣＤ６６ｂの白血球（米国特許第５，８３０，６７９号）と、３−クロロチロシン又は３−ブロモチロシン（米国特許第６，９３９，７１６号）と、そして、Ｃ５ａＲ（米国特許第７，４５５，８３７号）とを含む。

敗血症、あるいは、敗血症疑いのある多くの患者が、２４〜４８時間の期間にわたる急速な衰えを示す。従って、診断、及び、治療送達の迅速な方法が、効果的な患者のケアにとって不可欠である。敗血症と診断し、かつ、治療することができる薬剤の必要性が依然としてあることは疑いもない。

敗血症の研究は、脾臓、及び、他の末端器官における血小板の蓄積を実証している（シバザキら（Ｓｈｉｂａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．），Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ６４：５２９０−５２９４，１９９６、及び、ドレークら（Ｄｒａｋｅ ｅｔ ａｌ．），Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １４２：１４５８−１４７０，１９９３）。さらに、活性化された血小板に由来する微粒子には、血管内皮（アゼヴェードら（Ａｚｅｖｅｄｏ ｅｔ ａｌ．），Ｅｎｄｏｃｒ Ｍｅｔａｂ Ｉｍｍｕｎｅ Ｄｉｓｏｒｄ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ ６：１５９−１６４，２００６、ガンビンら（Ｇａｍｂｉｍ ｅｔ ａｌ．），Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ １１：Ｒ１０７，２００７、及び、ヤニシェフスキーら（Ｊａｎｉｓｚｅｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．），Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ ３２：８１８−８２５，２００４）、及び、平滑筋（ヤニシェフスキーら（Ｊａｎｉｓｚｅｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．），２００４）への細胞傷害活性を有する。しかしながら、血小板は無核で、骨髄に存在する巨核球によって与えられた細胞質成分のみを有し、デノボ遺伝子転写をする能力がない。従って、これらの従来の研究は、血小板機能の変化が転写後のレベルであると仮定した。血小板は、確かにｍＲＮＡの蓄積を含む。また、多くの研究は、ｍＲＮＡプロファイリングを用いて、ヒト血小板のトランスクリプトームを報告している（ラグハバチャリら（Ｒａｇｈａｖａｃｈａｒｉ ｅｔ ａｌ．），Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １１５：１５５１−１５６２，２００７、ディットリッヒら（Ｄｉｔｔｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ．），Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ ９５：６４３−６５１， ２００６、ヒルマンら（Ｈｉｌｌｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．），Ｊ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ ４：３４９−３５６，２００６、及び、アウエハントら（Ｏｕｗｅｈａｎｄ ｅｔ ａｌ．），Ｊ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ ５ Ｓｕｐｐｌ １：１８８−１９５，２００７）。また、血小板が、外部刺激に応じて、これらのトランスクリプトームの翻訳を調節することも確立されている（ウェイリッチら（Ｗｅｙｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ．），Ｂｌｏｏｄ １０９：１９７５−１９８３，２００７、ウェイリッチら（Ｗｅｙｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ．），Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ９５：５５５６−５５６１，１９９８、及び、ジマーマンら（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．），Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ ２８：ｓ１７−２４，２００８）。しかしながら、実験的敗血症、又は、臨床的敗血症のような、全身性の刺激の機能に応じて、血小板のｍＲＮＡプールで急激な変化を示す研究はない。

ゲノム規模でのｍＲＮＡ分析を通じて、本発明者は、グランザイムＢが敗血症を有する対象の血小板において上方制御され、また、血小板中のグランザイムＢの量が、直接敗血症の重症度に対応することを発見した。従って、本出願は、敗血症の診断、検出、又は、予後のための方法に関する。これは、先行技術の試験より高感度で、かつ、より信頼性がある。

本発明は、敗血症の進行を検出、診断、又は、モニターする方法を提供する。この方法は、敗血症を有している、あるいは、有している疑いのある個体の血小板中のグランザイムＢの存在、又は、量を決定することを含む。（バックグラウンドレベルを超えた）グランザイムＢの存在は、敗血症の存在を示し、また、グランザイムＢの量は、この病気の重症度と直接的に相関する（濃度がより高いほど、この病気がより重篤である）。

本発明は、敗血症を有している個体の治療をモニターする方法をさらに提供する。この方法は、敗血症で苦しむ個体に薬剤組成物を投与すること、及び、この個体の血小板中のグランザイムＢの存在、又は、量を決定することを含む。グランザイムＢの量が治療に渡って減少する場合、この治療は、良好であると考えられる。しかしながら、治療は、グランザイムＢの量がバックグラウンドレベルまで減少する、又は、不検出になるまで、継続するべきである。

本発明は、敗血症の発症又は進行を調整することができる薬剤のためのスクリーニング方法をさらに提供する。この方法は、敗血症で苦しむ個体をこの薬剤に曝露すること、及び、この個体の血小板中のグランザイムＢの存在、又は、量を決定することを含む。この薬剤は、薬剤の投与の際、グランザイムＢの量が治療に渡って減少する、もしくは、バックグラウンドレベルにまで低下すれば、敗血症の発症又は進行を調整する能力があると考えられる。

本発明の実施形態において、グランザイムＢの量は、免疫測定法、核酸分析（好ましくはｍＲＮＡ）、又は、基質分解を用いて、血小板中のグランザイムＢ遺伝子産物を検出するによって決定される。本明細書で列挙されるような遺伝子産物は、核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）、及び／もしくは、タンパク質であり得る。ＤＮＡ及びＲＮＡの場合では、例えば、オリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションを通じて、検出できる。タンパク質の場合には、例えば、特異的結合反応（例えば、免疫測定法）、及び、基質分解のような様々なタンパク質相互作用を通じて、検出できる。

グランザイムＢの決定用の試料は、個体から血液を採取することにより得ることができる。一実施形態において、血液試料中の血小板を溶解し、血小板から放出されたグランザイムＢを分析することができる。あるいは、例えば、グランザイムＢを標的とする免疫染色を用いて血小板を染色し、例えば、この技術分野において公知である血球計算法技術を用いて、染色した細胞を観察することができる。別の実施形態において、グランザイムＢは、試料から直接検出することができる。

本発明の血清試験は、単独で、もしくは、本発明の背景技術において先に開示されたマーカーのような、この技術分野において公知の他の診断法と連動して用いることができる。

図１は、包括的な臨床的データ及び検査データの監視なしクラスタ化を介した敗血症重症度の分類を示す。我々の三次治療の小児ＩＣＵに入院した、敗血症と推定診断された小児及び青年（ｎ＝１７）から、７２時間にわたって集められたデータを、Ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ （ＨＣＥ）に入力した。変数入力は、０、２４、４８、及び、７２時間において、以下を含んだ。温度、心拍数、呼吸数、収縮期動脈血圧、拡張期動脈血圧、及び、平均動脈血圧；グラスゴー昏睡スコア；血液ｐＨ、ｐＣＯ_２、Ｏ_２、及び、塩基過剰；白血球数；絶対的好中球数、絶対的リンパ球数、及び、絶対的単球数；血液ヘモグロビン、及び、血小板数；プロトロンビン、及び、活性化部分トロンボプラスチン時間；血清ナトリウム、カリウム、塩化物、グルコース、クレアチニン；並びに、血液尿素窒素。これらの表現型間の類似は、クラスタ（これは、より多くの類似を表す、より短い棒で示される）に反映されている。これらの結果は、囲われた枠によって示されたように、敗血症の参加者を重度（ｎ＝６）、及び、中程度（ｎ＝７）に分類するために用いられた。

図２は、血小板グランザイムＢのｍＲＮＡ発現が、敗血症のマウスにおける巨核球発現を反映することを示す。血小板は転写の機構を有していない。従って、敗血症のマウス（ｎ＝１２）における血小板グランザイムＢのｍＲＮＡ発現の変化は、自己由来の巨核球において同時に測定した。このｑＲＴ−ＰＣＲ分析の結果は、増加する巨核球、及び、血小板グランザイムＢのｍＲＮＡ発現の間で経時的に良好な相関を示す。

図３は、敗血症の小児、及び、健康な小児からの血小板中の細胞内のグランザイムＢの発現のフローサイトメトリーによる測定を示す。クエン酸全血はＣＤ６１^＋血小板でゲート制御された。健康な小児（ｎ＝１０）、並びに、入院の後１日及び３日において、我々が重篤（ｎ＝１）、及び、中程度（ｎ＝３）と分類した敗血症の小児において、細胞内のグランザイムＢを測定した。示されるのは、重篤な疾患を有する小児からの結果であり、アイソタイプコントロールと比較して、１日目（４９．７％）、及び、３日目（４４．３％）の両方で、血小板グランザイムＢの発現を示す。中程度の敗血症の対象のうちの１つだけがいくらかのグランザイムＢを発現し、なおかつ、３日目（２４．０％）にのみであった。対照小児からの血小板中には、測定可能な細胞内のグランザイムＢはなかった。

図４は、敗血症のマウスから採取された血小板は、グランザイムＢの欠如を除き、対照となるＣＤ４^＋脾細胞におけるアポプトーシスを誘導することを示す。パーセントアポプトーシスは、健康かつ野生型のマウス、及び、血小板のない脾細胞からの血小板でよりも、敗血症かつ野生型の（すなわち、Ｃ５７ＢＬ６）マウスから採取された血小板で共培養された脾細胞において大幅により高かった。敗血症のグランザイムＢヌル（−／−）マウス（すなわち、Ｂ６．１２９Ｓ２−Ｇｚｍｂ^{ｔｍ１Ｌｅｙ}）からの血小板を用いた反復実験は、誘導された脾細胞アポプトーシスの完全な欠如を示した。これらのいかなる状態下で、組み換えＴＮＦαを用いてさらに血小板を活性化しても、リンパ球毒性の能力は変わらなかった。

多くの生物学的機能が、転写制御を通じて（例えば、開始の制御、ＲＮＡ前駆体の提供、ＲＮＡプロセシング等を通じて）、及び／又は、翻訳制御を通じて、様々な遺伝子の発現を改変することにより達成される。例えば、細胞周期、細胞分化、及び、細胞死のような基本的な生物学的プロセスは、多くの場合、個々の遺伝子の発現レベル、又は、一群の遺伝子の発現レベルの変動が特徴である。

遺伝子発現における変化は、病因にも関連付けられる。例えば、機能性腫瘍抑圧遺伝子の十分な発現の欠如、及び／又は、癌遺伝子／癌原遺伝子の過発現は、細胞の腫瘍化、又は、過形成の増殖に導くことができた（マーシャル（Ｍａｒｓｈａｌｌ） （１９９１） Ｃｅｌｌ ６４：３１３−３２６、ヴァイルベルク（Ｗｅｉｒｌｂｅｒｇ） （１９９１），Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１１３８−１１４６）。従って、個別の遺伝子、又は、グループの遺伝子（例えば、癌遺伝子、又は、腫瘍抑制因子）の発現レベルの変化は、さまざまな疾患の存在及び進行のための指標として役立つ。

また、遺伝子発現の変化をモニタリングすることで、薬物スクリーニングの開発中に一定の利点を提供し得る。多くの場合、薬物は、これらの薬物が細胞に対して有するに他の効果に関係なく、主要な標的と相互作用する能力に対してスクリーニング、もしくは、プレスクリーニングされる。多くの場合、このような他の効果は、全身動物中の毒性を引き起こし、これが、可能性のある薬物の開発及び使用を妨げる。

本発明者は、敗血症に関連付けられるマーカーとして、血小板中のグランザイムＢを同定している。また、血小板中のグランザイムＢの変化は、疾患状態、疾患進行、薬物毒性、薬物効果、及び、薬物代謝をモニターするために用いることができるマーカーと同様に、診断上の使用のための有用なマーカーを提供することができる。具体的には、本発明者は、血小板中のグランザイムＢの上方制御、及び、敗血症の存在の間の直接の相関を発見した。存在するグランザイムＢの量は、敗血症の重症度と直接相関する。

診断法としての血小板中のグランザイムＢの使用
本明細書で記述されるように、血小板中のグランザイムＢは、敗血症の検出、診断、又は、予後のための診断上のマーカーとして用いることができる。例えば、患者からの試料は、本明細書に記載された方法のうち任意の方法によって、又は、当業者に知られる他の方法によって、分析されてもよい。また、血小板中のグランザイムＢの発現レベルは、正常な血小板（敗血症を有しない個体の血小板）において発見された発現レベルと、もしくは、グランザイムＢのバックグラウンドレベルと、比較されてもよい。正常な個体、又は、病気の個体の血清からの発現レベルに実質上似ている血小板中のグランザイムＢの発現レベルは、例えば、疾患診断、及び／又は、予後を助けるために用いられてもよい。血小板中のグランザイムＢのレベルの比較は、研究者又は診断医によって行われてもよく、また、コンピュータ及びデータベースを活用して行われてもよい。

一般的に、血小板中のグランザイムＢのバックグラウンド量は検出できない。それ故、好ましくは、少しでもグランザイムＢレベルが検出できれば常に、敗血症の存在が指摘される。しかしながら、用いられるアッセイに応じて、診断を適切に行なうために、バックグラウンドのグランザイムＢレベルを決定することは重要である。一般的に、血小板の約４０％以上がグランザイムＢを発現する場合に、重症の敗血症が指摘される。血小板の約２０〜４０％がグランザイムＢを発現する場合に、中程度の敗血症が存在する。

薬物スクリーニングのための血小板中のグランザイムＢの使用
本発明によれば、敗血性の患者の治療に対する候補薬物又は候補薬剤の効果を評価するために、血小板中のグランザイムＢのレベルをマーカーとして用いることができる。

薬物候補を用いて敗血症で苦しむ患者を治療し、この疾患の進行を経時的にモニターする。この方法は、患者を薬剤で治療すること、この患者からの試料周期的に得ること、これらの試料から血小板中のグランザイムＢのレベル、又は、量を決定すること、経時的にグランザイムＢのレベルを比較して、敗血症の進行に対するこの薬剤の効果を決定することを含む。

本発明の候補薬物又は候補薬剤は、炭水化物だけでなく、ペプチド、小分子、ビタミン誘導体であり得るが、これらに限定されない。陰性の主要タンパク質、これらのタンパク質をコード化するＤＮＡ、これらのタンパク質の抗体、これらのタンパク質のペプチドフラグメント、又は、これらのタンパク質の模倣体を、機能に影響を与えるために患者へ導入してもよい。本明細書で用いられるような「模倣体」は、化学的に親ペプチドと異なるが、組織分布的に、及び、機能的に親ペプチドと類似する構造を提供するための、ペプチド分子の１つの領域、又は、いくつかの領域の変更を表す（グラント（Ｇｒａｎｔ） （１９９５），ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，マイヤーズ編（Ｍｅｙｅｒｓ （ｅｄｉｔｏｒ） ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓを参照）。当業者は、本発明の候補薬物又は候補薬剤の構造的な性質に関して、限定がないことを容易に認識することができる。

疾患進行をモニターするための血小板中のグランザイムＢの使用
また、上述のように、疾患進行（例えば、敗血症の発生）のモニタリングのために、血小板中のグランザイムＢの発現をマーカーとして用いることができる。例えば、患者からの試料は、本明細書で記述された任意の方法で分析してもよく、また、血小板中のグランザイムＢの発現レベルを、感染していない個体で発見された発現レベルと比較してもよい。この疾患の進行を追跡するため、血小板中のグランザイムＢのレベルを経時的にモニターすることができる。本方法は、疾患進行をモニターするのに特に有用である。なぜなら、血小板中のグランザイムＢの発現が、この疾患の重症度に比例するためである。グランザイムＢの発現レベルの比較は、研究者又は診断医によって行われてもよく、また、コンピュータ及びデータベースを活用して行われてもよい。

アッセイフォーマット
血小板中のグランザイムＢの上方制御は、メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ）及びタンパク質の両レベルにおいて一目瞭然である。血小板中のグランザイムＢは、ｍＲＮＡレベルによって、もしくは、タンパク質レベルの生化学的測定値によってのいずれかで決定されるが、これは、敗血症に関連付けられることが分かっている。

本発明の一実施形態において、グランザイムＢのレベルは、免疫測定法によって検出される。一般的に、免疫測定法は、グランザイムＢ、及び、ａｎｔｉ−グランザイムＢ抗体の結合を伴う。結合の存在、及び、量は、試料中に存在するグランザイムＢの存在、及び、量を示す。免疫測定法の例は、ＥＬＩＳＡ、放射免疫検定、免疫ブロット法、及び、免疫染色（これらは、この技術分野において周知である）を含むが、これらに制限されない。この抗体は、ポリクローナル又はモノクローナルであり得る。また、好ましくは、容易な検出のために標識化される。この標識は、ビオチン、蛍光性の分子、放射性の分子、色素形成基質、化学発光、及び、酵素であり得るが、これらに制限されない。

一実施形態において、ＥＬＩＳＡは、固定されたモノクローナルａｎｔｉ−グランザイムＢ抗体によりグランザイムＢを捕捉し、その後、ビオチン化されたポリクローナルａｎｔｉ−グランザイムＢ抗体を用いて検出することに基づくが、これは、血清グランザイムＢを検出するために用いられる。このシステムでは、マルチウェルプレートのウェルを、モノクローナル抗体でコーティングし、例えば、ミルク又はアルブミンでブロックする。その後、試料をウェルに加え、モノクローナル抗体によりグランザイムＢを捕捉するために培養する。その後、プレートはポリクローナル抗体、及び、ストレプトアビジンアルカリホスファターゼの共役体を用いて検出されてもよい。

別の実施形態において、グランザイムＢのレベルは、血清中の核酸レベル、好ましくは、グランザイムＢのｍＲＮＡを測定することにより検出することができる。これは、グランザイムＢのｍＲＮＡに対して特異的なオリゴヌクレオチドプローブを有する試料中において、好ましくは厳しい条件で、核酸をハイブリダイズすることにより達成される。本発明の方法、及び、アッセイにおいて用いられる核酸試料は、任意の利用可能な方法又はプロセスによって用意されていてもよい。また、全ＲＮＡを分離する方法は、この技術分野における知識を有する者に周知である。例えば、核酸の分離方法、及び、精製方法は、以下の第３章に詳細に記載されている。Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｐａｒｔ Ｉ−Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ，ティッセン（Ｔｉｊｓｓｅｎ），（１９９３） 編者（ｅｄｉｔｏｒ） Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｐｒｅｓｓ。このような試料は、ＲＮＡ試料を含むだけでなく、興味のある細胞又は組織から分離されたｍＲＮＡ試料から合成されたｃＤＮＡ（相補的ＤＮＡ）を含む。また、このような試料は、ｃＤＮＡから増幅されたＤＮＡ、及び、増幅されたＤＮＡから転写されたＲＮＡを含む。この技術分野における知識を有する者であれば、ホモジネートを用い得る前に、ホモジネート中に存在するＲＮａｓｅ（リボヌクレアーゼ）を阻害、又は、破壊することが望ましいことを認識するだろう。

核酸ハイブリダイゼーションは、プローブ及び標的の核酸と接触することを単純に伴う。この状態の下で、このプローブ、及び、この相補の標的は、相補的塩基対を通じて安定したハイブリッド二本鎖を形成することができる（ロックハートら（Ｌｏｃｋｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．）の米国特許第６，３３３，１５５号、これは参照により本明細書に盛り込まれる）。核酸ハイブリダイゼーションの方法は、この技術分野において周知である。好ましい実施形態において、このプローブは、ビーズ、マイクロアレイ、又は、遺伝子チップのような固体担体上に固定される。

このハイブリダイズされた核酸は、試料である核酸、又は、プローブに付着した１又は複数の標識の検出することにより通常は検出する。この標識は、この技術分野における知識を有する者に周知の多くの任意の方法によって組込まれでもよい（ロックハートら（Ｌｏｃｋｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．）の米国特許第６，３３３，１５５号、これは参照により本明細書に盛り込まれる）。一般的に使用される標識は、ビオチン、蛍光性の分子、放射性の分子、色素形成基質、化学発光の標識、酵素、及び、同種のものを含むが、これらに制限されない。核酸をビオチン化する方法は、蛍光性の分子及び放射性の分子をオリゴヌクレオチド及びヌクレオチドへ導入する方法と同様にこの技術分野において周知である。

抗体プローブ及び核酸プローブは、具体的には本明細書で開示されるが、グランザイムＢのタンパク質、又は、ｍＲＮＡを特異的に結合する任意の分子は、抗体プローブ又は核酸プローブのものと同様の方法でグランザイムＢ上方制御を検出するために用いることができる。特異的結合反応は、例えば、ＷＯ 第２００８／０２１０５５号、米国特許第７，３２１，８２９号、米国特許第７，２６７，９９２号、米国特許第７，２１４，３４６号、米国特許第７，１３８，２３２号、米国特許第７，１５３，６８１号、米国特許第７，０２６，００２号、米国特許第６，８９１，０５７号、米国特許第６，５８９，７９８号、米国特許第５，９３９，０２１号、米国特許第５，７２３，３４５号、及び、米国特許第５，７１０，００６号に教示され、これらは、参照により本明細書に盛り込まれる。

特異的結合反応のための検出方法、特に免疫測定法及び核酸アッセイのための検出方法は、蛍光性の標識、放射性の標識、化学発光の標識、色原体の標識、その他、一般的に用いられる標識と同様に周知である。簡潔に言えば、蛍光性の標識は、これらの吸収波長、及び、蛍光放出波長、並びに、強度によって、最も直接的に同定、かつ、定量することができる。適切な波長の光源を用いる顕微鏡／カメラの設定は、蛍光性の標識を検出するための便利な方法である。放射性の標識は、標準的なオートラジオグラフィ、リン光体画像解析、又は、ＣＣＤ検出器によって、視覚化されてもよい。他の検出システムが利用可能で、かつ、この技術分野において公知である。

別の実施形態において、グランザイムＢは酵素であるため、この検出は、基質分解を通じて達成できる。この実施形態において、試料は、グランザイムＢの基質に接触するようにする。基質の分解を測定して、グランザイムＢのレベルを間接的に得る。この場合、分解速度が高ければ高いほど、存在するグランザイムＢのレベルも高い。グランザイムＢのための基質は、例えば、ＯｎｃｏＩｍｍｕｎｉｎ，Ｉｎｃ．（ゲーサーズバーグ、メリーランド州）、ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ（サンディエゴ、カリフォルニア州）、及び、Ａ．Ｇ．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．（サンディエゴ、カリフォルニア州）を通じて、市販で入手可能である。グランザイムＢのための基質、及び、これらの方法は、例えば、以下で開示される。ケップリンガーら（Ｋｏｅｐｌｉｎｇｅｒ， ｅｔ ａｌ．），Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐ． Ｐｕｒｉｆ． １８：３７８，２０００、カラハシら（Ｋａｒａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．），Ｂｉｏｌ． Ｐｈａｒｍ． Ｂｕｌｌ． ２３：１４０，２０００、ハリスら（Ｈａｒｒｉｓ， ｅｔ ａｌ．），Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３：２７３６４，１９９８、ソーンベリーら（Ｔｈｏｒｎｂｅｒｒｙ ｅｔ ａｌ．），Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２：１７９０７，１９９７、ハリスら（Ｈａｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．），Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３：２７３６４，１９９８、及び、ソーンベリーら（Ｔｈｏｒｎｂｅｒｒｙ ｅｔ ａｌ．），Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２：１７９０７，１９９７。これらは参照により本明細書に盛り込まれる。これらの基質、又は、その酵素の産物は、蛍光分析で、又は、比色分析で検出することができる。

さらなる記述がなくとも、この技術分野における通常の知識を有する者であれば、先の記述、及び、以下に説明する実施例を用いることで、本発明の化合物を製造及び利用し、また、クレームされた方法を実施することができると考えられる。以下の実施例は本発明を説明するために挙げられる。本発明がこの実施例に記載された具体的な条件、又は、詳細に制限されるものではないことが理解されるべきである。

方法
動物
マウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（バーハーバー，メイン州，ＵＳＡ）から購入し、通常の動物施設において飼育、繁殖させた。すべての実験は、我々の動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）によって承認された。以前に述べられたように（ウィチターマンら（Ｗｉｃｈｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．），Ｊ Ｓｕｒｇ Ｒｅｓ ２９：１８９−２０１，１９８０）、盲腸の結紮及び穿刺は、８〜１２週の老年雄マウスにおいて、時間＝０時間で行なわれた。簡潔に言えば、自然換気でのイソフルラン麻酔の下で、長さ１ｃｍの中線腹部切開を通じて盲腸を摘出して、４−０の絹糸（Ｅｔｈｉｃｏｎ，コーニーリア，ジョージア州，ＵＳＡ）で緩く結紮し、１８のゲージ針で近接して２度穿刺した。腹において糞便物質を絞り出した。また、腸は、元の場所へ戻した。この切開は４−０のナイロン縫合糸で閉鎖した。マウスは、４ｍｌ／体重１００ｇの皮下の生理食塩水で蘇生させた。

血小板分離
心内血液は、クエン酸ナトリウム（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，フランクリンレイクス，ニュージャージー州，ＵＳＡ）中へ直接引き込み、直ちに、２５℃、７７０ｒｐｍで１０分間、遠心分離機にかけた。血小板は、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（商標） Ｐｌｕｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ピスカタウェイ，ニュージャージー州，ＵＳＡ）を通じて、単一の高速遠心分離によって、多血小板血漿から分離した。血小板分離物の塗抹標本の顕微鏡検査は、＞９０％の血小板純度を示した。ｍＲＮＡ研究を意図した血小板は、Ｔｒｉｚｏｌ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カールスバード，カリフォルニア州，ＵＳＡ）中に直ちに播種した。機能的な研究を意図した血小板は、フォルマールら（Ｖｏｌｌｍａｒ ｅｔ ａｌ．）（Ｍｉｃｒｏｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １０：１４３−１５２，２００３）が記載したように、無関係のタンパク質を除去するために、１０ｍＬのセファロース２Ｂゲルカラムを通してろ過した。血小板濃度は、手動の血球計を用いて測定した。また、ＰＢＳで希釈することにより試料間の濃度を均等にした。

巨核球分離
マウス巨核球は、Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＩＭＤＭ）で洗い流すことにより、マウスの脛骨及び大腿骨から分離した。結果として生じる骨髄の懸濁液を処理し、メーカーのプロトコルに従い、正の選択のためにビオチンで標識化したａｎｔｉ−ＣＤ４２ｄ抗体を用いて、ＳｔｅｍＳｅｐ（登録商標）磁性重力カラム（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，バンクーバー，ブリティッシュコロンビア州，カナダ）に通した。純度は、Ｗｒｉｇｈｔ’ｓ ｓｔａｉｎ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，セントルイス，ミズーリ州，ＵＳＡ）を用いて光顕微鏡検査で確認した。血小板の際に記述したように、ｍＲＮＡを分離した。

脾臓摘出
健康な対照の脾臓を除去して、４０μｍのメッシュの細胞ストレーナを通して、直ちにすりつぶした。脾細胞は遠心分離機にかけ、洗浄して、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（商標） Ｐｌｕｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を通して相にした。ＣＤ４^＋細胞は、メーカーのプロトコルに従って、ＳｔｅｍＳｅｐ（登録商標）の磁性重力カラム（ＳｔｅｍＣｅｌｌ）を用いて分離した。

発現プロファイリング
発現量は、ｄＣｈｉｐ差分モデル・プローブセット・アルゴリズム（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｓｕｎ１．ｈａｒｖａｒｄ．ｅｄｕ／ｃｏｍｐｌａｂ／ｄｃｈｉｐ／）、及び、Ｐｒｏｂｅ Ｌｏｇａｒｉｔｈｍｉｃ Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ Ｅｒｒｏｒ Ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ（ＰＬＩＥＲ）（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，サンタクララ，カリフォルニア州）アルゴリズムを用いて計算した。ｄＣｈｉｐ及びＰＬＩＥＲの信号は、Ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ（ＨＣＥ）（ソら（Ｓｅｏ ｅｔ ａｌ．），Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２０：２５３４−２５４４，２００４）へ取り込んだ。また、プロファイルの適切なグループ化のため、結果として生じる監視なしクラスタを視覚的に検討した。最も適切なプロファイルのグループ化を有するアルゴリズムからの信号を、各種（すなわち、マウス＝ｄＣｈｉｐ、ヒト＝ＰＬＩＥＲ）の範囲内で、その後の分析のために用いて、ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ ＧＸ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、サンタクララ，カリフォルニア州，ＵＳＡ）へ取り込んだ。マウスのデータセット（ＮＣＢＩ ＧＥＯ Ｒｅｃｏｒｄ ＃ＧＳＥ１０３４３）、及び、ヒトのデータセット（ＮＣＢＩ ＧＥＯ Ｒｅｃｏｒｄ ＃ＧＳＥ １０３６１）を、各チップ内で５０パーセンタイルに標準化し、また、チップを制御するために１遺伝子ごとに標準化した。ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ（一元配置分散分析）（ｐ≦０．００１）は、ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｔｅｓｔｉｎｇ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎｓではなく、ｃｒｏｓｓ−ｇｅｎｅ ｅｒｒｏｒ ｍｏｄｅｌを用いて、特異的に発現したプローブセットのリストを経時的に生成した。

ｑＲＴ−ＰＣＲ
ｃＤＮＡは、メーカーのプロトコルによってＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標） ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて合成した。ＤＮＡプライマー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）は、既知の遺伝子配列に従って以下のように設計した。グランザイムＡ（順方向）５’−ＧＡＡ ＣＣＡ ＣＴＧ ＣＴＡ ＣＴＣ ＧＧＣ ＡＴＣ ＴＧＧ ［ＦＡＭ］ＴＣ−３’、グランザイムＡ（逆方向）５’−ＣＡＧ ＡＡＡ ＴＧＴ ＧＧＣ ＴＡＴ ＣＣＴ ＴＣＡ ＣＣ−３’、グランザイムＢ（順方向）５’−ＧＡＣ ＧＡＴ ＣＣＴ ＧＣＴ ＣＴＧ ＡＴＴ ＡＣＣ ＣＡＴ ＣＧ［ＦＡＭ］Ｃ−３、グランザイムＢ（逆方向）５’−ＴＣＡ ＧＡＴ ＣＣＴ ＧＣＣ ＡＣＣ ＴＧＴ ＣＣＴ Ａ−３’。ＧＡＰＤＨを含有したウェルは、陽性対照として役立ち、また、ポリメラーゼなしのウェルは、陰性対照として役立った。反応は、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標） ７９００ＨＴ ＰＣＲ装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，フォスターシティー，カリフォルニア州，ＵＳＡ）を用いて行った。また、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ２．２ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて計算した。発現量は、試料のＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ発現に対して標準化された。

アポプトーシスの検出
健康な対照マウスからのＣＤ４^＋脾細胞は、１０ｎｇ／ｍＬの組み換えのＴＮＦα（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で９０分間前処理した血小板を用いて、もしくは、用いずに、３７℃及び５％のＣＯ_２で、対照又は敗血性のマウスから分離した血小板と９０分間共培養した。脾細胞アポプトーシスは、ＤＮＡ切断の原位置での検出のための定量的な比色測定法である、ＴｉｔｅｒＴＡＣＳ（商標）（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ，ゲーサーズバーグ，メリーランド州，ＵＳＡ）により評価した。全試料は、メーカーのプロトコルに従い、陰性対照、及び、ヌクレアーゼに誘導された陽性対照で標準化したデータを用いて３回繰り返して行われた。

統計的分析
データは、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ ２００７（レドモンド，ワシントン州，ＵＳＡ）で管理した。統計的有意性は、対応のある、もしくは、対応のないＴ検定を用いて、ＳＰＳＳ １５（ＳＰＳＳ，シカゴ，イリノイ州，ＵＳＡ）で試験した。結果は、別段の定めがない限り、平均±標準誤差（ＳＥＭ）として報告する。

結果
敗血症は血小板細胞死遺伝子発現を誘導する。
盲腸結紮穿孔（ＣＬＰ）を受けたすべてのマウスでは、犠死時において、毛づくろいの減少、嗜眠、及び、肉眼的・病理学的な腹膜炎を含む、腹膜の敗血症と一致する徴候及び症状が進行した。これらのマウスでは、４８時間にわたって重篤な体重減少が進行した（平均±ＳＥＭ_{０ｈ対４８ｈ}：−１４．８±１．６％，ｐ＜０．０００１）。研究された９６匹のマウスのうちの１４匹のマウス（１４．６％）は、ＣＬＰの後状態で６〜４８時間の間で死亡したため、最終分析には含まれなかった。

各時点（ＣＬＰ後状態で０（未治療）、２４、及び、４８時間）において、５匹のマウスからプールした血小板ｍＲＮＡの発現プロファイル［Ｍｏｕｓｅ ４３０ ｐｌｕｓ ２．０ ＧｅｎｅＣｈｉｐｓ（登録商標）（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，サンタクララ，カリフォルニア州，ＵＳＡ）］は、５９のプローブセットを示し、５６の固有の遺伝子を表した（表１に示す）。これは、研究された時間間隔にわたって別個に調節された。これらの遺伝子は、主として敗血症への対応で従来よく記載されていた、遺伝子オントロジーの生物学的プロセスのグループ（細胞粘着、細胞増殖調節、走化性、炎症性及び免疫反応、タンパク質分解、並びに、情報伝達）に関する。これらのうち、６つのプローブセットは、細胞死用遺伝子オントロジーの分子機能グループ（ＧＯ：０００８２１９）に属した。特に、０〜４８時間の間では、グランザイムＡ及びグランザイムＢ（強力な細胞傷害性セリンプロテアーゼ）は、＞１００倍に上方制御された（倍率変化＝５４９．６、及び、１４１．３（各々））。

我々は、治験審査委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄ）が承認した、１歳から１８歳の間（８．８±１．３）の敗血性の小児（ｎ＝１７）に関する研究において、ヒト敗血症におけるこれらの細胞死遺伝子の発現を調査した。９名の参加者（５３％）が男性だった。敗血症の診断は、敗血症のためのコンセンサス定義から小児科学に適した基準を用いてなされた（ボーンら（Ｂｏｎｅ ｅｔ ａｌ．），Ｃｈｅｓｔ １０１：１４８１−１４８３，１９９２、プルーら（Ｐｒｏｕｌｘ ｅｔ ａｌ．），Ｃｈｅｓｔ １０９：１０３３−１０３７，１９９６、及び、プルーら（Ｐｒｏｕｌｘ ｅｔ ａｌ．），Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ ２２：１０２５−１０３１，１９９４）。我々は、臨床データ及び検査データ（すなわち、前の２４時間で最多の極値）を７２時間にわたって集めた。相対的な臨床重症度は、Ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ（ＨＣＥ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｓ．ｕｍｄ．ｅｄｕ／ｈｃｉｌ／ｈｃｅ／）における、すべての生の臨床データ及び検査データの監視なしクラスタ化により決定した（図１）。臨床的な変数及び検査の変数によって、参加者らを２つのグループに明確にクラスタ化した。グループ１（ｎ＝６）は、「重篤」と指定された。なぜなら、これが、他と比べて著しく高い重症度の疾病スコア［すなわち、平均のＰｅｄｉａｔｒｉｃ Ｒｉｓｋ ｏｆ Ｍｏｒｔａｌｉｔｙ （ＰＲＩＳＭ） ＩＩＩ （ポラックら（Ｐｏｌｌａｃｋ ｅｔ ａｌ．），Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ ２４：７４３−７５２，１９９６）スコア（１７．０±２．７対４．５±１．１，ｐ＜０．００１）］、及び、より長期の入院期間（４５．５±１０．６日、対、１３．７±２．８日，ｐ＝０．０２９）を有するためである。グループ２（ｎ＝１１）は、「中程度」と指定された。また、死亡率、及び、ショックの存在を含む、他の分析された結果変数に関して、重篤なグループと著しく異なっていなかった。

マウスデータの予備検証として、Ｈｕｍａｎ Ｕ１３３Ａ ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を用いて、１名の例示された重篤な敗血性のヒト対象、及び、１名の例示された中程度の敗血性のヒト対象からの血小板ｍＲＮＡをプロファイリングし、３名の健康な若年成人層の対照における血小板遺伝子発現と比較した。この小グループの試料に対して、統計的に強健なゲノム規模での事前評価を行なう意図はなく、むしろ、我々は、マウス研究で同定された６つの細胞死遺伝子のための異種間のスクリーニングに対して注目した。これらのうち、グランザイムＢのみが、重篤な対象において、７２時間（倍率増加＝２．９）にわたって特異的に調節された。いずれのグループにおいても、研究された他の細胞死遺伝子は、差異的発現を示さなかった。

巨核球血小板の転写軸における敗血症に誘導された変化の検証
定量的な逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）は、マイクロアレイによって検出されたマウス血小板のグランザイムＡ及びグランザイムＢの上方制御を検証するために用いられた。我々は、敗血症の誘導後、最初の２４時間のみを調査した。なぜなら、グランザイムの大部分の上方制御は、この期間中に起こるマイクロアレイによって見られるからである。敗血性のマウス（ｎ＝１２（１時点当たり３匹のマウス、プールせず））の独立したコホートにおいて、グランザイムＢのｍＲＮＡ発現が、０〜２４時間の間に著しく増加した（ｍｅａｎ±ＳＥ_{０ｈ対２４ｈ}：０．７７±０．６１対１１．９４±３．６５，ｐ＝０．０４）（図２）。グランザイムＡのｍＲＮＡの発現は、これと同じ時間にわたって著しくは増加しなかった（ｍｅａｎ±ＳＥ_{０ｈ対２４ｈ}：１．５７±２．７３対２．６１±４．５３，ｐ＝０．１１）。

血小板は、無核で、かつ、転写の機構を欠くため、我々は、自己由来の巨核球の同時測定によって、敗血症における増加した血小板グランザイムＢのｍＲＮＡ発現をさらに検証できると仮定した。ｑＲＴ−ＰＣＲを用いて、我々は、血小板ｑＲＴ−ＰＣＲ検証ステップにおいて用いた同じマウスから同時に得た骨髄巨核球における血小板グランザイムＢのｍＲＮＡ発現を測定した。巨核球グランザイムＢのｍＲＮＡの相対的な発現は、２４時間で、著しく増加した（ｍｅａｎ±ＳＥ_{０ｈ対２４ｈ}：２．８８±０．２７対８．２５±０．５２，ｐ＝０．０５）。血小板グランザイムＢのｍＲＮＡ発現は、巨核球のそれのすぐ後に経時的に続いた（図２）。巨核球グランザイムＡのｍＲＮＡ発現は変化しなかった（ｍｅａｎ±ＳＥＭ_{０ｈ対２４ｈ}：３．１８±０．５４対２．９９±０．１２，ｐ＝０．４２）。

敗血症は血小板グランザイムＢのタンパク質発現を誘導する。
グランザイムＢのｍＲＮＡの上方制御が、グランザイムＢのタンパク質発現の増加を説明するかどうかを決定するため、敗血性のマウス、及び、対照のマウスからクエン酸全血をさらに採集した。これを１％のパラホルムアルデヒドで固定し、透過処理して、適切なアイソタイプ対照、及び、陰性の（未標識の）対照を用いて、ａｎｔｉ−グランザイムＢ（ｃｌｏｎｅ １６Ｇ６（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，サンディエゴ，カリフォルニア州，ＵＳＡ））で細胞内染色した。フローサイトメトリーのデータは、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標）Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，サンホセ，カリフォルニア州，ＵＳＡ）で生成して、ＣＤ６１^＋（ｃｌｏｎｅ ２Ｃ９．Ｇ２（ＢＤ））の血小板でゲーティングし、ＦｌｏｗＪｏ ７．２（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ，Ｉｎｃ．，アシュランド，オレゴン州，ＵＳＡ）を用いて分析した。敗血性のマウス（ｎ＝９）からの血小板は、２４時間の後に、細胞内のグランザイムＢのタンパク質発現における増加を示した（ｍｅａｎ±ＳＥＭ_{０ｈ対２４ｈ}：４．４±１．３対１９．６±６．３％，ｐ＝０．０３９）。腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）αで血小板をさらに活性化しても、細胞内のグランザイムＢは変化しなかった（データ示さず）。

異種間の検証ステップにおいて、敗血性の小児、及び、健康な小児からのクエン酸全血を同様の方法で調査した。この場合、フローサイトメトリーのデータは、細胞内のグランザイムＢ（クローンＧＢ１１（ＢＤ））用に染色されたＣＤ６１^＋（クローンＶＩ−ＰＬ２（ＢＤ））血小板で生成した。「重篤」な１名の敗血症の対象、及び、「中程度」の３名の敗血症の対象に対して、入院の１日後、及び、３日後にグランザイムＢを測定し、定期検査用に血液を採取した、同様の年齢の健康な対照小児（ｎ＝１０）と比較した。重篤な対象からの血小板は、１日目（４９．７％）及び３日目（４４．３％）の両方において、細胞内のグランザイムＢを発現した（図３）。中程度の敗血性の対象のうちの１名のみが、グランザイムＢをいくらか発現した。また、３日目（２４．０％）にのみであった。対照小児からの血小板中には、測定可能な細胞内のグランザイムＢはなかった。さらに、血小板活性化状態（すなわち、ＣＤ６２Ｐ^＋）は、グランザイムＢの発現に作用しなかった。さらに、敗血性の小児からの血小板において、我々は、タンパク質［すなわち、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）、インターロイキン（ＩＬ）１β、ＴＮＦα、及び、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）］を誘導する他のアポプトーシスの表面発現を検出しなかった。

血小板は、グランザイムＢを介する敗血症におけるリンパ球毒性のあるエフェクターである。
敗血性のマウス、及び、敗血性のヒトからの血小板中のグランザイムＢの我々の発見の結果、血小板がこのシナリオではリンパ球毒性があり得ると我々は仮定した。この問題を調査するために、ＣＬＰの後状態で１８時間のマウスからの血小板を健康な対照マウスから分離されたＣＤ４^＋脾細胞と共培養した。敗血性かつ野生型の（すなわち、Ｃ５７ＢＬ６）マウスからの血小板は、疑似野生型マウスからの血小板と比較して、際立った脾細胞アポプトーシスを誘導した（アポプトーシス速度＝２６．０±３．４対３．９±３．４％，ｐ＝０．００７）（図４）。この共培養実験を、敗血性のグランザイムＢヌル（−／−）マウス（すなわち、Ｂ６．１２９Ｓ２−Ｇｚｍｂ^{ｔｍ１Ｌｅｙ}）からの血小板で繰り返した。この場合、敗血性の血小板による誘導された脾細胞アポプトーシスの完全な欠如があった。注目すべきことに、活性化されていない対照の血小板が、リンパ球毒性を有しなかったのと同様に、ＴＮＦαによりさらに活性化された野生型の血小板も、リンパ球毒性を有しなかった（４．５±１．３％，ｐ＝０．８８）（図４）。

考察
敗血症関連の死亡率は、深刻なリンパ球アポトーシスに付随して起こる免疫不全に一部起因する（ホッチキスら（Ｈｏｔｃｈｋｉｓｓ ｅｔ ａｌ．） ２００３、ラッセル（Ｒｕｓｓｅｌｌ） ２００６、ホッチキスら（Ｈｏｔｃｈｋｉｓｓ ｅｔ ａｌ．），Ｓｃａｎｄ Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ ３５：５８５−５９２，２００３、グローズドンクら（Ｇｒｏｅｓｄｏｎｋ ｅｔ ａｌ．），Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７９：８０８３−８０８９，２００７、ホッチキスら（Ｈｏｔｃｈｋｉｓｓ ｅｔ ａｌ．），Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７４：５１１０−５１１８，２００５、及び、ウェッシュら（Ｗｅｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．），Ｊ Ｌｅｕｋｏｃ Ｂｉｏｌ ７８：３２５−３３７，２００５）。この広範囲なリンパ球細胞死亡に関与する生物学的機構は分からないが、この機構は、Ｔｏｌｌ様受容体、及び、ＭｙＤ８８（ペック−パーマーら（Ｐｅｃｋ−Ｐａｌｍｅｒ ｅｔ ａｌ．） Ｊ Ｌｅｕｋｏｃ Ｂｉｏｌ ２００８：ｊｌｂ．０８０７５２８，２００８）を通じた直接の病原体シグナル伝達に一部寄与している。しかしながら、これらの研究において、我々は、敗血症のマウス実験モデルでの時系列研究を行なうことにより、このプロセスにおいて血小板が直接の役割を果たす可能性を探った。敗血症における全身性の撹乱に対する血小板の反応が、細胞死に関連する遺伝子のｍＲＮＡ発現の変化の原因となり得ると仮定するため、第１のスクリーニングツールとしてマイクロアレイを用いた。その後、一連のマウス及びヒトの研究を通じて、このモデルを試験した。我々の実験により、我々は、巨核球−血小板の転写軸における敗血症に誘導された変化を特徴づけ、結果として生じる血小板に強いリンパ球毒性があるという斬新な発見を提示するに至った。第２に、敗血症に誘導されたマウスモデルからの血小板を用いて、我々は、セリンプロテアーゼである、グランザイムＢが、このリンパ球毒性の原因であると同定した。グランザイムは、ナチュラルキラー（ＮＫ）リンパ球、及び、細胞傷害性Ｔリンパ球が、細胞傷害性果粒内で最も一般的に分泌する細胞傷害性セリンプロテアーゼのグループの１つである（マソンら（Ｍａｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．），Ｃｅｌｌ ４９：６７９−６８５，１９８７）。グランザイムＢは、これらのプロテアーゼ（他のヒトグランザイムは、グランザイムＡ、グランザイムＨ、グランザイムＫ、及び、グランザイムＭを含む）の中で最もよく特徴づけられ、また、複数の既知のカスパーゼ標的、及び、カスパーゼ非依存性基質の増え続けるリストを有している。これらは、ポリＡＤＰリボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）（フローリッチら（Ｆｒｏｅｌｉｃｈ ｅｔ ａｌ．），Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２２７：６５８−６６５，１９９６）、及び、繊維芽細胞増殖因子受容体−１（ＦＧＦＲ１）（ローブら（Ｌｏｅｂ ｅｔ ａｌ．），Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８１：２８３２６−２８３３５，２００６）を含む。グランザイムＢは、通常は、共放出されたパーフォリンのチャネルを通じて標的細胞に入るだけでなく（トラパニら（Ｔｒａｐａｎｉ ｅｔ ａｌ．），Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７３：２７９３４−２７９３８，１９９８）、独立して入ることができる（チョイら（Ｃｈｏｙ ｅｔ ａｌ．），Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ ２４：２２４５−２２５０，２００４、フロリアンら（Ｆｌｏｒｉａｎ ｅｔ ａｌ．），ＦＥＢＳ ｌｅｔｔｅｒｓ ５６２：８７−９２，２００４、及び、ゴンデックら（Ｇｏｎｄｅｋ ｅｔ ａｌ．），Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７４：１７８３−１７８６，２００５）。いったん、標的細胞に入ると、細胞質のグランザイムＢは、いくつかの細胞内のアポトーシス促進性システインプロテアーゼ（最も著名で、かつ、最も研究されたものは、カスパーゼ３である）を開裂する（トラパニら（Ｔｒａｐａｎｉ ｅｔ ａｌ．） １９９８）。あるいは、グランザイムＢは、Ｂｉｄに誘導されたミトコンドリアの損傷を介してアポトーシスを誘導することが示されている（ウォーターハウスら（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ ｅｔ ａｌ．），Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８０：４４７６−４４８２，２００５、ウォーターハウスら（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ ｅｔ ａｌ．），Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ １３：６０７−６１８，２００６、及び、ウォーターハウスら（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ ｅｔ ａｌ．），Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ８４：７２−７８，２００６）。グランザイムＢがカスパーゼ媒介性の機序、及び、カスパーゼ非媒介性の機序によって同時に細胞死を誘導することが示されていることに注目することは重要である（ローブら（Ｌｏｅｂ ｅｔ ａｌ．） ２００６、及び、ブレーデマイヤーら（Ｂｒｅｄｅｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．），Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８１：３７１３０−３７１４１，２００６）。さらに、ウォンら（Ｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ．）は、グランザイムＢが、小児の敗血症性ショック非生存者からの全血において、生存者と比較して上方制御された転写物の一つあることを示した（ウォンら（Ｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ．），Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ３０：１４６−１５５，２００７）。

我々の実験は、血小板が、敗血症におけるグランザイムＢが原因で、実際に強いリンパ球毒性があることを示した。我々の結果は、様々な炎症性疾患状態、特に適応免疫に関するものにおける血小板及びリンパ球の間の相互調節性の重要な相互作用を実証する従来の研究に基礎として確立している。例えば、血小板ＣＤ４０は、Ｔリンパ球ＣＤ４０リガンドに結合し、ＣＣＬ５（これは、さらにＴリンパ球を活性化して、それ故、免疫反応を増幅する）の血小板放出を誘導することが示されている（ダネーゼら（Ｄａｎｅｓｅ ｅｔ ａｌ．），Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７２：２０１１−２０１５，２００４）。特に敗血症において、血小板に由来する微粒子は、血管内皮（アゼヴェードら（Ａｚｅｖｅｄｏ ｅｔ ａｌ．） ２００６、ガンビンら（Ｇａｍｂｉｍ ｅｔ ａｌ．） ２００７、及び、ヤニシェフスキーら（Ｊａｎｉｓｚｅｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．） ２００４、並びに、平滑筋（ヤニシェフスキーら（Ｊａｎｉｓｚｅｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．） ２００４）に対して細胞傷害性があることが示されている。しかしながら、我々の知っている限りでは、我々のものは、疾患損傷に応じて血小板トランスクリプトームの急激な変化を検討する最初の研究である。我々は、骨髄における巨核球が全身性の敗血症に応答し、グランザイムＢを含めるために血小板のトランスクリプトームを変化させることを発見した。

敗血症における血小板中のグランザイムＢの存在は、血小板活性化が、この発現に影響を与えるようには見えないという事実を特に踏まえると、興味深い問題を提起する、つまり、転写後調節がないことを示唆する。まず、グランザイムＢが、巨核球カスパーゼ活性化（これは、正常な血小板形成には必須である）の役割を果たし得る（クラークら（Ｃｌａｒｋｅ ｅｔ ａｌ．），Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １６０：５７７−５８７，２００３）。そうならば、敗血症での血小板の過剰新生において、その巨核球がグランザイムＢのｍＲＮＡを上方制御することで、結果として、血小板中にこの転写物を含ませ得る。もう一つとしては、血小板グランザイムＢが、ある点において、進化の利点を表わしたということである。多種多様の機序を通じてアポトーシスを誘導するグランザイムＢの能力により、細胞内の病原体での免疫回避戦略の迂回が有望な機序となる。実際、細胞傷害性Ｔ細胞からのグランザイムＢが、トキソプラズマ種及びマラリア原虫種に対する防御の役割を果たす可能性があるという証拠がある（ハードら（Ｈｕｒｄ ｅｔ ａｌ．），Ｉｎｔ Ｊ Ｐａｒａｓｉｔｏｌ ２００４；３４：１４５９−１４７２，２００４、及び、ギャブリレッシュら（Ｇａｖｒｉｌｅｓｃｕ ｅｔ ａｌ．），Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ７１：６１０９−６１１５，２００３）。

まとめると、我々は、血小板が、マウス敗血症、及び、ヒト敗血症におけるグランザイムＢを上方制御すると結論付ける。我々は、敗血性のマウスからの血小板が、グランザイムＢの作用を介して、生体外において、健康な脾細胞で際立ったアポトーシスを誘導することをさらに示した。我々の発見は、敗血症における概念的な進歩を確立する：敗血性の巨核球は、急性的に変化したｍＲＮＡプロファイルを用いて血小板を産生し、これらの血小板は、グランザイムＢを介してリンパ球毒性を媒介する。リンパ球アポトーシスが敗血症関連の死亡率に寄与すると仮定すると、血小板グランザイムＢの調節が、検討及び治療の重要な新しい目標になる。

本発明の一定の現在好ましい実施形態が本明細書で具体的に記述されているが、本明細書で示され記述された様々な実施形態の変形及び修正が、本発明の精神及び範囲を逸脱することなく、行なわれてもよいことは、この分野における知識を有する者にとって明らかだろう。従って、添付されたクレーム、及び、適用可能な法規によって必要とされる程度にのみ本発明が制限されるべきことが意図される。

Claims (43)

1. 個体における敗血症の進行を検出、診断、又は、モニターする方法であって、該個体の血小板中のグランザイムＢの存在を決定するステップを備えることを特徴とする敗血症の進行を検出、分析、又は、モニターする方法。
2. 該決定するステップは、免疫測定法によって達成されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. 該免疫測定法は、ＥＬＩＳＡであることを特徴とする請求項２に記載の方法。
4. 該免疫測定法は、免疫ブロット法であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
5. 該決定するステップは、核酸レベルの測定により達成されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
6. 該核酸は、ｍＲＮＡであることを特徴とする請求項４に記載の方法。
7. 該ｍＲＮＡは、グランザイムＢをコード化することを特徴とする請求項６に記載の方法。
8. 該核酸レベルは、ノーザンブロット法によって測定されることを特徴とする請求項６に記載の方法。
9. 該核酸レベルは、マイクロアレイ分析によって測定されることを特徴とする請求項６に記載の方法。
10. 該決定するステップは、
    グランザイムＢと特異的に結合する分子と、該個体からの試料を接触させるステップと、
    該グランザイムＢ及び該分子の間の結合の存在を検出するステップと、
    を備えることを特徴とする請求項１に記載の方法。
11. 該分子は、抗体であることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
12. 該抗体は、モノクローナル抗体、及び、ポリクローナル抗体よりなる群から選ばれることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
13. 該分子は、標識化されていることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
14. 該標識は、ビオチン、蛍光性の分子、放射性の分子、色素形成基質、化学発光、及び、酵素よりなる群から選ばれることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
15. 該決定するステップは、
    該個体の血小板からｍＲＮＡを分離するステップと、
    該グランザイムＢのｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズするプローブと、該分離されたｍＲＮＡを接触させるステップと、
    該プローブ、及び、該ｍＲＮＡの間の結合の存在を検出するステップと、
    を備えることを特徴とする請求項１に記載の方法。
16. 該プローブは、核酸プローブであることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
17. 該プローブは、オリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
18. 該プローブは、標識化されていることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
19. 該標識は、ビオチン、蛍光性の分子、放射性の分子、色素形成基質、化学発光、及び、酵素よりなる群から選ばれることを特徴とする請求項１８に記載の方法。
20. 該プローブは、固体の基質に付着していることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
21. 該プローブは、マイクロアレイ上にあることを特徴とする請求項１５の方法。
22. 敗血症の個体の治療をモニターする方法であって、
    敗血症を治療するための組成物を該個体に投与するステップと、
    該個体の血小板中のグランザイムＢの存在を決定するステップと、
    を備えることを特徴とする敗血症の個体の治療をモニターする方法。
23. 該決定するステップは、免疫測定法によって達成されることを特徴とする請求項２２に記載の方法。
24. 該免疫測定法は、ＥＬＩＳＡであることを特徴とする請求項２３に記載の方法。
25. 該免疫測定法は、免疫ブロット法であることを特徴とする請求項２４に記載の方法。
26. 該決定するステップは、核酸レベルの測定により達成されることを特徴とする請求項２２に記載の方法。
27. 該核酸は、ｍＲＮＡであることを特徴とする請求項２６に記載の方法。
28. 該ｍＲＮＡは、グランザイムＢをコード化することを特徴とする請求項２７の方法。
29. 該核酸レベルは、ノーザンブロット法によって測定されることを特徴とする請求項２５に記載の方法。
30. 該核酸レベルは、マイクロアレイ分析によって測定されることを特徴とする請求項２５に記載の方法。
31. 該決定するステップは、
    特異的にグランザイムＢを結合する分子と、個体の血清を接触させるステップと、
    該グランザイムＢ及び該分子の間の結合の存在を検出するステップと、
    を備えることを特徴とする請求項２４に記載の方法。
32. 該分子は、抗体であることを特徴とする請求項３１に記載の方法。
33. 該抗体は、モノクローナル抗体、及び、ポリクローナル抗体よりなる群から選ばれることを特徴とする請求項３２に記載の方法。
34. 該分子は、標識化されていることを特徴とする請求項３１に記載の方法。
35. 該標識は、ビオチン、蛍光性の分子、放射性の分子、色素形成基質、化学発光、及び、酵素よりなる群から選ばれることを特徴とする請求項３４に記載の方法。
36. 該決定するステップは、
    該血小板からｍＲＮＡを分離するステップと、
    該グランザイムＢのｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズするプローブと、該分離されたｍＲＮＡを接触させるステップと、
    該プローブ、及び、該ｍＲＮＡの間の結合の存在を検出するステップと、
    を備えることを特徴とする請求項２２に記載の方法。
37. 該プローブは、核酸プローブであることを特徴とする請求項３６に記載の方法。
38. 該プローブは、オリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項３７に記載の方法。
39. 該プローブは、標識化されていることを特徴とする請求項３７に記載の方法。
40. 該標識は、ビオチン、蛍光性の分子、放射性の分子、色素形成基質、化学発光、及び、酵素よりなる群から選ばれることを特徴とする請求項３９に記載の方法。
41. 該プローブは、固体の基質に付着していることを特徴とする請求項３８に記載の方法。
42. 該プローブは、マイクロアレイ上にあることを特徴とする請求項３８に記載の方法。
43. 該敗血症の進行に対する該組成物への効果を決定するために該個体のグランザイムＢの存在を経時的に比較するステップをさらに備えることを特徴とする請求項２２に記載の方法。

Images