JP2020089339A

JP2020089339A - プライマーセット、並びにプライマーセットを用いた核酸増幅方法、細菌の同定方法、及び罹患ブタの細菌感染診断方法

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Publication number: JP2020089339A
Application number: JP2018230059A
Authority: JP
Inventors: 信幸堤; Nobuyuki Tsutsumi; ホートー; Hoo Too; 香保手島; Kaho Tejima; 長井　伸也; Shinya Nagai; 伸也長井
Original assignee: Nippon Institute For Biolog Science; NITSUSEIKEN KK
Current assignee: Nippon Institute For Biolog Science; NITSUSEIKEN KK
Priority date: 2018-12-07
Filing date: 2018-12-07
Publication date: 2020-06-11
Anticipated expiration: 2038-12-07
Also published as: JP7267001B2

Abstract

【課題】１６ＳｒＲＮＡ遺伝子をターゲットとしたＰＣＲ、又は細菌の同定方法に使用でき、これらを従来の方法と比較して簡易、迅速、かつ高精度とするプライマーセットなどの提供。【解決手段】特定のアミノ酸配列を含むプライマー対からなるプライマーセット、ならびに、該プライマーセットを使用してＰＣＲを行う核酸増幅方法、細菌同定方法およびブタの細菌感染診断方法。【選択図】なし

Description

本発明は、プライマーセット、並びにプライマーセットを用いた核酸増幅方法、細菌の同定方法、及び罹患ブタの細菌感染診断方法に関する。

従来、細菌の同定は、増殖培養、分離培養を経て菌を単離した後、単離した菌を増殖させ、形態観察、グラム染色性、カタラーゼ試験、糖資化性など多くの性状試験の結果に基づき行なわれてきた。この同定方法は、少なくとも数日間を要し、多岐にわたる試験は煩雑であり、費用もかかっていた。
また、単離した細菌からＤＮＡを抽出し、それを膜状あるいは他の支持体上に固定し、標準菌のＤＮＡをプローブとしてハイブリダイゼーション試験を行うことにより細菌を同定する方法がある。しかし、この同定方法も数日間を要し、さらに十分な検出感度、及び選択性を得るのが困難であった。

近年、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子をターゲットとした細菌の同定方法が報告されている。例えば、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の全長（１５００ｂｐ）をターゲットとしたＰＣＲ及びダイレクトシークエンス法を用いた同定方法（非特許文献１）、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の部分的な塩基配列部分（約８００ｂｐ）をターゲットとしたＰＣＲ及びダイレクトシークエンス法を用いた同定方法（非特許文献２及び３）が報告されている。

しかし、これらの方法はシークエンスの回数が多く、多数の試料を同定するには時間を要し、迅速性の向上が困難であるという問題があり、細菌に罹患した生物の診断に時間を要することから、適切な治療の開始が遅延し、特に、細菌に罹患した生物が畜産動物である場合には甚大な被害をもたらすことも問題となっていた。

したがって、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子をターゲットとしたＰＣＲ、又は細菌の同定方法に使用でき、これらを従来の方法と比較して簡易、迅速、かつ高精度とするプライマーセット、並びにプライマーセットを用いた核酸増幅方法、細菌の同定方法、及び罹患ブタの細菌感染診断方法の開発が求められている。

Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９９１１７３：６９７−７０３Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２００３４１：４１３４−４１４０Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２００４４２：２０６５−２０７３

本発明は、前記従来における諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子をターゲットとしたＰＣＲ、又は細菌の同定方法に使用でき、これらを従来の方法と比較して簡易、迅速、かつ高精度とするプライマーセット、並びにプライマーセットを用いた核酸増幅方法、細菌の同定方法、及び罹患ブタの細菌感染診断方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、前記目的を達成すべく鋭意検討を行なった結果、本発明のプライマーセットを用いることにより、従来の方法と比較して、簡易、迅速、かつ高精度な核酸増幅方法、細菌の同定方法、及び罹患ブタの細菌感染診断方法が提供できることを見出した。

本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては以下の通りである。即ち、
＜１＞（１）配列番号：１で表される塩基配列のうち少なくとも１０塩基以上の連続する配列を含むプライマーと、配列番号：２で表される塩基配列のうち少なくとも１０塩基以上の連続する配列を含むプライマーとからなるプライマーセット、及び
（２）配列番号：１で表される塩基配列に相補的な塩基配列のうち少なくとも１０塩基以上の連続する配列を含むプライマーと、配列番号：２で表される塩基配列に相補的な塩基配列のうち少なくとも１０塩基以上の連続する配列を含むプライマーとからなるプライマーセットの少なくともいずれかを含むことを特徴とするプライマーセットである。
＜２＞検体中のＤＮＡを抽出する抽出工程と、
前記ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うＰＣＲ工程とを含み、
前記ＰＣＲ工程で、前記＜１＞に記載のプライマーセットを使用してＰＣＲを行うことを特徴とする核酸増幅方法である。
＜３＞検体中のＤＮＡを抽出する抽出工程と、
前記ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うＰＣＲ工程と、
前記ＰＣＲ工程で得られた産物の塩基配列解析を行う解析工程とを含み、
前記ＰＣＲ工程で、前記＜１＞に記載のプライマーセットを使用してＰＣＲを行うことを特徴とする細菌の同定方法である。
＜４＞前記ＰＣＲ工程におけるＰＣＲ産物の長さが７５０ｂｐ以下である前記＜２＞又は＜３＞に記載の方法である。
＜５＞前記ＤＮＡが細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を含む前記＜２＞又は＜３＞に記載の方法である。
＜６＞前記細菌が罹患生物由来である前記＜５＞に記載の方法である。
＜７＞罹患ブタ由来の検体中のＤＮＡを抽出する抽出工程と、
前記ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うＰＣＲ工程と、
前記ＰＣＲ工程で得られた産物の塩基配列解析を行う解析工程と、
前記塩基配列解析に基づき、罹患ブタ由来の検体中に含まれる細菌を同定する工程とを含み、
前記ＰＣＲ工程で、前記＜１＞に記載のプライマーセットを使用してＰＣＲを行うことを特徴とする罹患ブタの細菌感染診断方法である。

本発明によると、従来における前記諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子をターゲットとしたＰＣＲ、又は細菌の同定方法に使用でき、従来の方法と比較して簡易、迅速、かつ高精度なプライマーセット、並びにプライマーセットを用いた核酸増幅方法、細菌の同定方法、及び罹患ブタの細菌感染診断方法を提供することができる。

図１は、実施例１−１及び１−２の電気泳動の結果を示す図である。図２は、実施例４の電気泳動の結果を示す図である。

（プライマーセット）
本発明のプライマーセットは、
（１）配列番号：１で表される塩基配列のうち少なくとも１０塩基以上の連続する配列を含むプライマーと、配列番号：２で表される塩基配列のうち少なくとも１０塩基以上の連続する配列を含むプライマーとからなるプライマーセット、及び
（２）配列番号：１で表される塩基配列に相補的な塩基配列のうち少なくとも１０塩基以上の連続する配列を含むプライマーと、配列番号：２で表される塩基配列に相補的な塩基配列のうち少なくとも１０塩基以上の連続する配列を含むプライマーとからなるプライマーセットの少なくともいずれかを含み、必要に応じて更にその他の成分を含む。

＜配列番号：１で表される塩基配列のうち少なくとも１０塩基以上の連続する配列を含むプライマー＞
配列番号：１で表される塩基配列からなるプライマーは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）１６ＳｒＲＮＡ遺伝子（ＡＹ８０４０１４）をコードする塩基配列の１番目から２０番目に対応するものであり、その配列は、以下のとおりである。
５’−ａｇａｇｔｔｔｇａｔｃｍｔｇｇｃｔｃａｇ−３’（配列番号：１）

前記配列番号：１で表される塩基配列のうち少なくとも１０塩基以上の連続する配列を含むプライマーは、前記配列番号：１で表される塩基配列からなるプライマーのうち、少なくとも１０塩基以上の連続する配列を含む限り特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、簡易、迅速、かつ高精度の点から、１２塩基以上が好ましく、１５塩基以上がより好ましく、１８塩基以上がさらに好ましく、１９塩基以上が特に好ましく、配列番号：１で表される塩基配列からなるプライマーが最も好ましい。

前記少なくとも１０塩基以上の連続する配列は、３’末端側の１０塩基以上の連続する配列であっても、５’末端側の１０塩基以上の連続する配列であってもよいが、簡易、迅速、かつ高精度の点から、３’末端側の１０塩基以上の連続する配列が好ましい。

また、前記配列番号：１で表される塩基配列のうち少なくとも１０塩基以上の連続する配列を含むプライマーは、さらに任意の塩基配列や、蛍光色素などの標識が付加されたものであってもよい。
前記配列番号：１で表される塩基配列のうち少なくとも１０塩基以上の連続する配列を含むプライマーの塩基数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、簡易、迅速、かつ高精度の点から、３５塩基以下が好ましく、３０塩基以下がより好ましく、２２塩基以下が更に好ましく、２１塩基以下が特に好ましい。

前記配列番号：１で表される塩基配列のうち少なくとも１０塩基以上の連続する配列を含むプライマーのＧＣ含量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、簡易、迅速、かつ高精度の点から、５０〜６０％が好ましい。
前記配列番号：１で表される塩基配列のうち少なくとも１０塩基以上の連続する配列を含むプライマーのＴｍ値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、簡易、迅速、かつ高精度の点から、５０〜６０℃が好ましい。

＜配列番号：２で表される塩基配列のうち少なくとも１０塩基以上の連続する配列を含むプライマー＞
配列番号：２で表される塩基配列からなるプライマーは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）１６ＳｒＲＮＡ遺伝子（ＡＹ８０４０１４）をコードする塩基配列の５０８番目から５２７番目に対応するものであり、その配列は、以下のとおりである。
５’−ｔｂｔｔａｃｃｇｃｇｇｃｔｇｃｔｇｇｃａ−３’（配列番号：２）

前記配列番号：２で表される塩基配列のうち少なくとも１０塩基以上の連続する配列を含むプライマーは、前記配列番号：２で表される塩基配列からなるプライマーのうち、少なくとも１０塩基以上の連続する配列を含む限り特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、簡易、迅速、かつ高精度の点から、１２塩基以上が好ましく、１５塩基以上がより好ましく、１８塩基以上がさらに好ましく、１９塩基以上が特に好ましく、配列番号：１で表される塩基配列からなるプライマーが最も好ましい。

また、前記配列番号：２で表される塩基配列のうち少なくとも１０塩基以上の連続する配列を含むプライマーは、さらに任意の塩基配列や、蛍光色素などの標識が付加されたものであってもよい。
前記配列番号：２で表される塩基配列のうち少なくとも１０塩基以上の連続する配列を含むプライマーの塩基数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、簡易、迅速、かつ高精度の点から、３５塩基以下が好ましく、３０塩基以下がより好ましく、２２塩基以下が更に好ましく、２１塩基以下が特に好ましい。

前記配列番号：２で表される塩基配列のうち少なくとも１０塩基以上の連続する配列を含むプライマーのＧＣ含量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、簡易、迅速、かつ高精度の点から、５０〜６０％が好ましい。
前記配列番号：２で表される塩基配列のうち少なくとも１０塩基以上の連続する配列を含むプライマーのＴｍ値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、簡易、迅速、かつ高精度の点から、５０〜６０℃が好ましい。

＜配列番号：１で表される塩基配列に相補的な塩基配列のうち少なくとも１０塩基以上の連続する配列を含むプライマー＞
配列番号：１で表される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプライマーは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）１６ＳｒＲＮＡ遺伝子（ＡＹ８０４０１４）をコードする塩基配列の１番目から２０番目の塩基配列に相補的な塩基配列に対応するものである。

配列番号：１で表される塩基配列に相補的な塩基配列のうち少なくとも１０塩基以上の連続する配列を含むプライマーは、前記配列番号：１で表される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプライマーのうち、少なくとも１０塩基以上の連続する配列を含む限り特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、簡易、迅速、かつ高精度の点から、１２塩基以上が好ましく、１５塩基以上がより好ましく、１８塩基以上がさらに好ましく、１９塩基以上が特に好ましく、配列番号：１で表される塩基配列からなるプライマーが最も好ましい。

また、前記配列番号：１で表されるに相補的な塩基配列のうち少なくとも１０塩基以上の連続する配列を含むプライマーは、さらに任意の塩基配列や、蛍光色素などの標識が付加されたものであってもよい。
前記配列番号：１で表されるに相補的な塩基配列のうち少なくとも１０塩基以上の連続する配列を含むプライマーの塩基数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、簡易、迅速、かつ高精度の点から、３５塩基以下が好ましく、３０塩基以下がより好ましく、２２塩基以下が更に好ましく、２１塩基以下が特に好ましい。

前記配列番号：１で表されるに相補的な塩基配列のうち少なくとも１０塩基以上の連続する配列を含むプライマーのＧＣ含量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、簡易、迅速、かつ高精度の点から、５０〜６０％が好ましい。
前記配列番号：１で表されるに相補的な塩基配列のうち少なくとも１０塩基以上の連続する配列を含むプライマーのＴｍ値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、簡易、迅速、かつ高精度の点から、５０〜６０℃が好ましい。

＜配列番号：２で表される塩基配列に相補的な塩基配列のうち少なくとも１０塩基以上の連続する配列を含むプライマー＞
配列番号：２で表される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプライマーは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）１６ＳｒＲＮＡ遺伝子（ＡＹ８０４０１４）をコードする塩基配列の５０８番目から５２７番目の塩基配列に相補的な塩基配列に対応するものである。

配列番号：２で表される塩基配列に相補的な塩基配列のうち少なくとも１０塩基以上の連続する配列を含むプライマーは、前記配列番号：２で表される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプライマーのうち、少なくとも１０塩基以上の連続する配列を含む限り特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、簡易、迅速、かつ高精度の点から、１２塩基以上が好ましく、１５塩基以上がより好ましく、１８塩基以上がさらに好ましく、１９塩基以上が特に好ましく、配列番号：２で表される塩基配列からなるプライマーが最も好ましい。

また、前記配列番号：２で表されるに相補的な塩基配列のうち少なくとも１０塩基以上の連続する配列を含むプライマーは、さらに任意の塩基配列や、蛍光色素などの標識が付加されたものであってもよい。
前記配列番号：２で表されるに相補的な塩基配列のうち少なくとも１０塩基以上の連続する配列を含むプライマーの塩基数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、簡易、迅速、かつ高精度の点から、３５塩基以下が好ましく、３０塩基以下がより好ましく、２２塩基以下が更に好ましく、２１塩基以下が特に好ましい。

前記配列番号：２で表されるに相補的な塩基配列のうち少なくとも１０塩基以上の連続する配列を含むプライマーのＧＣ含量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、簡易、迅速、かつ高精度の点から、５０〜６０％が好ましい。
前記配列番号：２で表されるに相補的な塩基配列のうち少なくとも１０塩基以上の連続する配列を含むプライマーのＴｍ値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、簡易、迅速、かつ高精度の点から、５０〜６０℃が好ましい。

−プライマーの製造方法−
前記プライマーの製造方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、ＤＮＡ自動合成機を用いた合成、プライマー合成メーカーからの購入などが挙げられる。

＜その他の成分＞
前記その他の成分としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＴＥ（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭＥＤＴＡ）等のバッファー、ＤＮＡ、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、及び酵素等のＰＣＲに用いる試薬などが挙げられる。

本発明のプライマーセットは、組成物、又は核酸増幅用キット、細菌の同定用キット、若しくは細菌感染診断用キットとして存在させることもできる。

（核酸増幅方法）
本発明の核酸増幅方法は、検体中のＤＮＡを抽出する抽出工程と、前記ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うＰＣＲ工程とを少なくとも含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。

＜抽出工程＞
前記抽出工程は、検体中のＤＮＡを抽出する工程である。

−検体−
前記検体としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、細菌感染を検査される生物の血液、尿、糞便、臓器、若しくは組織、又は種を同定される生物などが挙げられる。

前記細菌感染を検査される生物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、病原性細菌、又は非病原性細菌等に罹患した脊椎動物、無脊椎動物などが挙げられる。
前記脊椎動物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、ブタ、ウシ、トリ、イヌ、ネコ、魚などが挙げられる。

前記細菌感染を検査される生物から血液、組織などを採取する方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができる。

前記種を同定される生物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有する真核生物、原核生物などが挙げられる。
前記原核生物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、球菌、桿菌、ラセン菌などの細菌が挙げられる。前記細菌は、罹患生物由来の同定株、未同定株であってもよい。

−ＤＮＡの抽出−
前記ＤＮＡの抽出方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、熱抽出法、フェノール・クロロホルム抽出法、アルカリ熱抽出法、市販のＤＮＡ抽出キットを用いた抽出法などが挙げられる。

前記熱抽出法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、検体に滅菌蒸留水を添加し、遠心分離により得られたペレットを滅菌蒸留水で洗浄し、９５℃で５分間加熱後、氷中で冷却し、遠心分離により得られた上清をＤＮＡ溶液とする方法、検体を滅菌蒸留水で洗浄し、１００℃で５分間加熱後、氷中で冷却し、遠心分離により得られた上清をＤＮＡ溶液とする方法などが挙げられる。

前記フェノール・クロロホルム抽出法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、ＴＥバッファーで懸濁した検体に、１０％ＳＤＳ及びプロテイナーゼＫ（１０ｍｇ／ｍｌ）を添加し、３７℃で１時間ゆるやかに振盪した後、フェノール・クロロホルム溶液を添加し激しく振盪した後、水層にクロロホルム溶液を添加し激しく振盪した後、水層に１００％エタノールを添加する方法などが挙げられる。

＜ＰＣＲ工程＞
前記ＰＣＲ工程は、前記抽出工程で得られた前記ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行う工程である。

−ＰＣＲ−
前記ＰＣＲとしては、プライマーとして本発明のプライマーセットを使用する限り、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、ＤＮＡ、プライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、及び酵素を含むＰＣＲ反応液をＰＣＲサイクル処理する方法などが挙げられる。

−−ＰＣＲサイクル処理−−
前記ＰＣＲサイクル処理としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、初期変性を９４℃〜９５℃で１分間〜３分間行なった後、９４℃〜９５℃で３０秒間、４０℃〜６０℃で３０秒間、及び７２℃で４５秒間を１サイクルとして、これを複数サイクル行い、最後に７２℃で５分間〜１０分間の伸長反応を行なう処理などが挙げられる。
前記サイクル数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、簡易、迅速、かつ高精度の点から、２０サイクル以上が好ましく、２５サイクル以上がより好ましく、３０サイクル以上がさらに好ましく、３５サイクル以上が特に好ましい。

前記ＰＣＲにより得られるＰＣＲ産物の長さとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、簡易、迅速、かつ高精度の点から、７５０ｂｐ以下が好ましく、７００ｂｐ以下がより好ましく、６００ｂｐ以下がさらに好ましく、５５０ｂｐ以下が特に好ましく、５３０ｂｐ以下が最も好ましい。

＜その他の工程＞
前記その他の工程としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記細菌感染を検査される生物から血液、組織などを採取する採取工程、前記種を同定される生物を増殖培養、分離培養などを経て単離する単離工程、前記ＰＣＲ産物を電気泳動により確認する電気泳動工程、前記ＰＣＲ産物を精製する精製工程などが挙げられる。

＜＜精製工程＞＞
前記精製方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、市販のキットを用いた方法などが挙げられる。
前記市販のキットとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＧｅｎｅＣｌｅａｎＳｐｉｎＫｉｔ（Ｂｉｏ１０１，Ｉｎｃ．）などが挙げられる。

（細菌の同定方法）
本発明の細菌の同定方法は、検体中のＤＮＡを抽出する抽出工程と、前記ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うＰＣＲ工程と、前記ＰＣＲ工程で得られた産物の塩基配列解析を行う解析工程とを含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。
前記抽出工程、及びＰＣＲ工程は、前述のとおりである。

＜解析工程＞
前記解析工程は、前記ＰＣＲ工程で得られた産物の塩基配列解析を行う工程である。

−塩基配列解析−
前記塩基配列解析方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、シークエンサーを用いたＤＮＡシークエンス法により塩基配列を決定する方法などが挙げられる。

前記ＤＮＡシークエンス法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、大腸菌などを用いてクローニングを行なった後、シークエンス反応を行う方法、又はダイレクトシークエンスを行う方法などが挙げられる。これらの中でも、簡易、迅速、かつ高精度の点から、ダイレクトシークエンスを行う方法が好ましい。

前記ＤＮＡシークエンス法において使用するプライマーとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、本発明のプライマーセットのうちのいずれかのプライマーを使用することができる。

＜その他の工程＞
前記その他の工程としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記解析工程の塩基配列解析に基づき検体の種を同定する同定工程、生化学的手法により検体の種を同定する同定工程などが挙げられる。

＜＜塩基配列解析に基づき検体の種を同定する同定工程＞＞
塩基配列解析に基づき検体の種を同定する方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、前記塩基配列解析により得られた塩基配列について、データベースを利用して、公知の配列との相同性を算出することにより同定する方法などが挙げられる。
前記データベースとしては、特に制限はなく、公知のものを適宜選択することができ、例えば、日本ＤＮＡデータバンク、ＥＢＩ／ＥＭＢＬ（ＣＬＵＳＴＡＬ．Ｗ）、ＮＣＢＩ／ＧｅｎＢａｎｋ（ＢＬＡＳＴ）などのデータベースが挙げられる。
前記塩基配列解析により得られた塩基配列と、公知の配列との相同性が９７％以上の場合は、検体の種が公知の配列に基づく種であると同定できる。

＜＜生化学的手法により検体の種を同定する同定工程＞＞
生化学的手法により検体の種を同定する方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、市販のキットを用いた方法などが挙げられる。
前記市販のキットとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＡＰＩ２０（ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘＳ．Ａ．）などが挙げられる。

前記細菌の同定方法において、前記ＰＣＲ工程及び前記解析工程の合計所要時間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、簡易、迅速、かつ高精度の点から、１２時間以下が好ましく、１０時間以下がより好ましく、７時間以下が更に好ましく、５時間以下が特に好ましい。

（細菌感染診断方法）
本発明の細菌感染診断方法は、罹患ブタ由来の検体中のＤＮＡを抽出する抽出工程と、前記ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うＰＣＲ工程と、前記ＰＣＲ工程で得られた産物の塩基配列解析を行う解析工程と、前記塩基配列解析に基づき、罹患ブタ由来の検体中に含まれる細菌を同定する同定工程とを含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。

前記罹患ブタ由来の検体中のＤＮＡを抽出する抽出工程は、前記核酸増幅方法における前記抽出工程に対応し、前記ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うＰＣＲ工程は、前記核酸増幅方法における前記ＰＣＲ工程に対応し、前記ＰＣＲ工程で得られた産物の塩基配列解析を行う解析工程は、前記細菌の同定方法における前記解析工程に対応し、前記罹患ブタ由来の検体中に含まれる細菌を同定する同定工程は、前記細菌の同定方法における前記塩基配列解析に基づき検体の種を同定する同定工程に対応する。

＜その他の工程＞
前記その他の工程としては、その他の工程としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記同定工程における細菌の同定に基づき、罹患ブタの細菌感染を治療する治療工程などが挙げられる。

＜＜罹患ブタの細菌感染を治療する治療工程＞＞
前記罹患ブタの細菌感染を治療する方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、前記罹患ブタに、感染した細菌に適した薬物を投与する方法などが挙げられる。

前記細菌感染診断方法において、前記ＰＣＲ工、前記解析工程、及び前記同定工程の合計所要時間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、簡易、迅速、かつ高精度の点から、１４時間以下が好ましく、１２時間以下がより好ましく、９時間以下が更に好ましく、７時間以下が特に好ましい。

以下に製造例及び実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの製造例及び実施例に何ら限定されるものではない。

（製造例１）プライマーセット１の作製
日本ＤＮＡデータバンクのデータベース上に公開されている以下の７３菌株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列について、Ｇｅｎｅｔｙｘ−ＭａｘＶｅｒｓｉｏｎ９．０及びＶｅｒｓｉｏｎ１２を用いて、シークンスデータの処理及びアライメント解析を行い、菌株間で保存されている塩基配列、及び菌株間で相違する塩基配列を決定した。相同性検索は日本ＤＮＡデータバンクのウエブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｂｌａｓｔｎ？ｌａｎｇ＝ｅｎ）にてｂｌａｓｔｎ検索を用いて行った。

アライメント解析を行なった７３菌株は、以下のとおりである。
（１）Ｆｕ１．（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｎｅｃｒｏｐｈｏｒｕｍ（ＦｎＳ−４０））（Ｘ７４４０８）
（２）Ｆｕ２．（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｎｕｃｌｅａｔｕｍｓｕｂｓｐ．Ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）（Ｍ５８６８３）
（３）Ｃｌｏ１．（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｓｐ．）（ＡＹ９４９８５９）
（４）Ｃｌｏ２．（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓｓｔｒ．１３）（ＢＡ００００１６）
（５）Ｃｌｏ３．（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｎｏｖｙｉ）（Ｘ６８１８８）
（６）Ｃｌｏ４．（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｔｅｔａｎｉ）（Ｘ７４７７０）
（７）Ｓｔａ１．（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）（ＤＱ２６９４９８）
（８）Ｓｔａ２．（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｃｏｃｕｓｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）（ＡＹ６９９２８７）
（９）Ｋｕｇｉ．（Ｋｕｒｔｈｉａｇｉｂｓｏｎｉｉ）（ＮＣＩＭＢ９７５８）
（１０）Ｌｉｓｔｓｅｅ．（Ｌｉｓｔｅｒｉａｓｅｅｌｉｇｅｒｉ）（ＤＱ０６５８４３）
（１１）Ｓｔｒｅｐｂｏ１．（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｂｏｖｉｓ）（ＡＹ１７３０７９）
（１２）Ｓｔｒｅｐｄｙｓ２．（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ（ＡＢ１５９６７８）
（１３）Ｓｔｒｅｐｓｕｉｓ３．（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｓｕｉｓ）（ＡＦ２８４５７８）
（１４）Ｌａｃｇａｒ．（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｇａｒｖｉｅａｅ）（ＡＹ６９９２８９）
（１５）Ｅｒｙｓｉ１．（ＥｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅＡＴＣＣ１９４１４）（ＡＢ０５５９０５）
（１６）Ｅｒｙｔ．（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘｔｏｎｓｉｌｌａｒｕｍ（ＡＢ０５５９０６）
（１７）Ｍｐｌａ１．（ＭｙｃｏｐｌａｓｍａｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍｓｔｒａｉｎＡ５９６９）（Ｌ３５０４３）
（１８）Ｍｐｌａ２（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（Ｙ００１４９）
（１９）Ｍｐｌａ３．Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｈｙｏｓｙｎｏｖｉａｅ（Ｕ２６７３０）
（２０）Ｓｐｉｒｏｍｅ．（Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａｍｅｌｌｉｆｅｒｕｍ）（ＡＹ３２５３０４）
（２１）Ａｃｔ０．（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓｂｏｖｉｓ）（Ｘ８１０６１）
（２２）Ａｒｐｙｏ．（Ａｒｃａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｐｙｏｇｅｎｅｓ）（Ｍ２９５５２）
（２３）Ｍｙｃｏ１．（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐ．）（ＡＹ９４５８０３）
（２４）Ｍｙｃｏ２．（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍａｖｉｕｍｓｕｂｓｐ．ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓｓｔｒ．ｋ１０）（ＡＥ０１７２３６）
（２５）Ｍｙｃｏ３．（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｂｏｖｉｓｓｕｂｓｐ．ｂｏｖｉｓＡＦ２１２２／９７）（ＢＸ２４８３３８）
（２６）Ｎｏｃａｓｅｒｉ．（Ｎｏｃａｒｄｉａｓｅｒｉｏｌａｅ）（ＡＹ８４６８４１）
（２７）Ｒｈｏｅｑｕｉ．（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｅｑｕｉ）（Ｘ８０６１４）
（２８）Ｓｔｂｉ．（ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｂｉｋｉｎｉｅｎｓｉｓｓｔｒａｉｎＤＳＭ４０５８１）（Ｘ７９８５１）
（２９）Ｂｒｕ１．（ＢｒｕｃｅｌｌａｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓｂｉｏｖａｒＡｂｏｒｔｕｓ）（ＡＭ０４０２６５）
（３０）Ｂｒｕ２．（Ｂｒｕｃｅｌｌａｓｕｉｓ）（ＡＥ０１４２９２）
（３１）Ｅｒ１．（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａｓｐ．Ｔｉｂｅｔ）（ＡＦ４１４３９９）
（３２）Ｅｒ２．（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａｃａｎｉｓｓｔｒ．Ｊａｋｅ）（ＣＰ０００１０７）
（３３）Ｅｒ３．（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ）（Ｘ６１６５９）
（３４）Ａｎａ１．（Ａｎａｐｌａｓｍａｍａｒｇｉｎａｌｅ）（ＤＱ３４１３７０）
（３５）Ａｎａ２．（Ａｎａｐｌａｓｍａｏｖｉｓ）（ＡＦ３０９８６５）
（３６）Ａｎａ３．（Ａｎａｐｌａｓｍａｂｏｖｉｓ）（Ｕ０３７７５）
（３７）Ｒｉｃｒｉｃ．（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ）（Ｕ１１０２１）
（３８）Ｐｓｅｕ１．（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ．ＢＥ４ｄｉｌ）（ＡＹ２６３４７３）
（３９）Ｐｓｅｕ２．（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｂｏｒｅａｌｉｓ）（ＰＢ００１２７１２）
（４０）Ｐｓｅｕ３．（Ｐｓｅｕｇｏｍｏｎａｓｌｉｎｉ）（ＡＹ０３５９９６）
（４１）Ｌｅｇｐａｒ．（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａｐａｒｉｓｉｅｎｓｉｓ）（Ｕ５９６９７）
（４２）Ｅｎｔａｅｒｏ．（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒａｅｒｏｇｅｎｅｓ）（ＡＹ８２５０３６）
（４３）Ｃｉｆｒｅｕ．（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒｆｒｅｕｎｄｉｉ）（ＡＦ０２５３６５）
（４４）Ｋｌｐｎｅｕ．（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（ＤＱ１８５６０４）
（４５）Ｓｅｒｍａ．（Ｓｅｒｒａｔｉａｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）（ＡＢ０６１６８５）
（４６）Ｓａｌ１．（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｅｎｔｅｒｉｃａｓｕｂｓｐ．ｅｎｔｅｒｉｃａｓｅｒｏｖａｒＣｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ）（ＡＥ０１７２２０）
（４７）Ｓａｌ２．（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｅｎｔｅｒｉｃａｓｕｂｓｐ．ｅｎｔｅｒｉｃａｓｅｒｏｖａｒＤｕｂｌｉｎ）（ＡＦ２２７８６８）
（４８）Ｓａｌ３．（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉ）（ＡＬ６２７２６６）
（４９）Ｅｃｏｌｉ．（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）（ＡＹ８０４０１４）
（５０）Ｅｒｗｐｅｒ．（Ｅｒｗｉｎｉａｐｅｒｓｉｃｉｎｕｓ）（ＡＭ１８４０９８）
（５１）Ｙｅｒｐｓｅｕ．（ＹｅｒｓｉｎｉａｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓＩＰ３２９５３）（ＢＸ９３６３９８）
（５２）Ｖｉｐａｒａ．（Ｖｉｂｒｉｏｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）（Ｘ７４７２１）
（５３）Ｐｈｏｔｏｄａｍ．（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｄａｍｓｅｌａｅｓｕｂｓｐ．Ｄａｍｓｅｌａｅ）（ＡＹ１４７８６１）
（５４）Ａｅｒｈｙ．（ＡｅｒｏｍｏｎａｓｈｙｄｒｏｐｈｉｌａＡＴＣＣ３５６５４）（Ｘ７４６７６）
（５５）Ｈａｅｍｏ．（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｐａｒａｓｕｉｓ）（ＡＢ００４０３９）
（５６）Ｈｉｓｔｏ．（Ｈｉｓｔｏｐｈｉｌｕｓｓｏｍｎｉ）（Ｍ７５０４６）
（５７）Ｐａｓ．（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｍｕｌｔｏｃｉｄａ）（Ｍ３５０１８）
（５８）Ａｃｔ１．（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｉｓ）（Ｍ７５０７１）
（５９）Ａｃｔ２．（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓｅｑｕｕｌｉ）（Ｍ７５０７２）
（６０）Ａｃｔ３．（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（Ｄ３００３２）
（６１）Ａｃｔ４．（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｇｎｉｅｒｅｓｉｉ）（Ｍ７５０６８）
（６２）Ｍａｎｖａｒ．（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａｖａｒｉｇｅｎａ）（ＤＱ３０１９２７）
（６３）Ｎｅｉｇｏ．（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）（Ｘ０７７１４）
（６４）Ｂｂ．（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）（ＢＸ６４０４４９）
（６５）Ｃａｍ．（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉｓｕｂｓｐ．ｊｅｊｕｎｉＮＣＴＣ１１１６８）（ＡＬ１３９０７４）
（６６）Ｈｅｌｉ．（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉ）（ＡＹ３６６４２４）
（６７）Ｌａｗｉｎ．（Ｌａｗｓｏｎｉａｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）（Ｕ０６４２３）
（６８）Ｂｏｒｂｕｒ．（Ｂｏｒｒｅｌｉａｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）（ＡＦ４７７９８９）
（６９）Ｓｐｉｒｏ．（Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔａａｕｒａｎｔｉａ）（ＡＹ５９９０１９）
（７０）Ｔｒｅｖｉ．（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａｖｉｎｃｅｎｔｉｉ）（ＡＦ０３３３０９）
（７１）Ｂｒａｈｙｏ．（Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）（Ｍ５７７４１）
（７２）Ｌｅｐ．（ＬｅｐｔｏｓｐｉｒａｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓｓｅｒｏｖａｒＣｏｐｅｎｈａｇｅｎｉｓｔｒ．ＦｉｏｃｒｕｚＬ１−１３０）（ＡＥ０１７２９３）
（７３）Ｐｏｒｐ．（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）（Ｌ１６４９２）

上記アライメント解析に基づき、フォワードプライマー領域及びリバースプライマー領域の配列は、菌株間で保存されているが、フォワードプライマー領域とリバースプライマー領域の間の配列は、菌株間により相違する配列となること、及び増幅産物の塩基配列が、１回のシークエンスにより決定され得る長さとなることを条件に、フォワードプライマー領域及びリバースプライマー領域を選択した。

選択したフォワードプライマー領域及び選択したリバースプライマー領域に対応するプライマー１６Ｓ−Ｆ１及びプライマー１６Ｓ−Ｒ２を作製した。
プライマー１６Ｓ−Ｆ１の塩基配列は、（５’−ａｇａｇｔｔｔｇａｔｃｍｔｇｇｃｔｃａｇ−３’）（配列番号：１）であり、プライマー１６Ｓ−Ｒ２の塩基配列は（５’−ｔｂｔｔａｃｃｇｃｇｇｃｔｇｃｔｇｇｃａ−３’）（配列番号：２）である。

選択したフォワードプライマー領域は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）１６ＳｒＲＮＡ遺伝子（ＡＹ８０４０１４）の１番目から２０番目の塩基配列に相当し、選択したリバースプライマー領域は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）１６ＳｒＲＮＡ遺伝子（ＡＹ８０４０１４）の５０８番目から５２７番目の塩基配列に相当する。

（製造例２）プライマーセット２の作製
フォワードプライマー１６Ｓ−Ｆ１の５’末端側の１５塩基に対応するフォワードプライマー１６Ｓ１５ａＦ１、及びリバースプライマー１６Ｓ−Ｒ２の５’末端側の１５塩基に対応するリバースプライマー１６Ｓ１５ａＲ２を作製した。
プライマー１６Ｓ１５ａＦ１の塩基配列は、（５’−ａｇａｇｔｔｔｇａｔｃｍｔｇｇ−３’）（配列番号：３）であり、プライマー１６Ｓ１５ａＲ２の塩基配列は（５’−ｔｂｔｔａｃｃｇｃｇｇｃｔｇｃ−３’）（配列番号：４）である。

（製造例３）プライマーセット３の作製
フォワードプライマー１６Ｓ−Ｆ１の３’末端側の１５塩基に対応するフォワードプライマー１６Ｓ１５ｂＦ１、及びリバースプライマー１６Ｓ−Ｒ２の３’末端側の１５塩基に対応するリバースプライマー１６Ｓ１５ｂＲ２を作製した。
プライマー１６Ｓ１５ｂＦ１の塩基配列は、（５’−ｔｔｇａｔｃｍｔｇｇｃｔｃａｇ−３’）（配列番号：５）であり、プライマー１６Ｓ１５ｂＲ２の塩基配列は（５’−ｃｃｇｃｇｇｃｔｇｃｔｇｇｃａ−３’）（配列番号：６）である。

（製造例４）プライマーセット４の作製
フォワードプライマー１６Ｓ−Ｆ１の３’末端側の１０塩基に対応するフォワードプライマー１６Ｓ１５ｄＦ１、及びリバースプライマー１６Ｓ−Ｒ２の３’末端側の１０塩基に対応するリバースプライマー１６Ｓ１５ｄＲ２を作製した。
プライマー１６Ｓ１５ｄＦ１の塩基配列は、（５’−ｃｍｔｇｇｃｔｃａｇ−３’）（配列番号：７）であり、プライマー１６Ｓ１５ｄＲ２の塩基配列は（５’−ｇｃｔｇｃｔｇｇｃａ−３’）（配列番号：８）である。

（実施例１−１）ＰＣＲ（同定株）
表１に記載の同定株である、罹患動物由来の３９菌株（番号Ａ−１からＡ−３９）について、以下のとおり、ＤＮＡを抽出し、抽出したＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行なった。
各菌株の培養液、又は大きめのコロニーをマイクロチューブにとった。菌体に滅菌蒸留水１００μＬを添加して懸濁した。懸濁液を遠心分離（１０，０００ｒｐｍで２分間）した。遠心分離により得られたペレットを滅菌蒸留水で洗浄し、９５℃で５分間加熱した。加熱後、氷中で冷却し、遠心分離（１０，０００ｒｐｍで２分間）した。上清を鋳型ＤＮＡ溶液として、製造例１で作製した、プライマー１６Ｓ−Ｆ１、及びプライマー１６Ｓ−Ｒ２を用いてＰＣＲを行い、上記各菌株が有する１６ＳｒＲＮＡ遺伝子核酸を増幅した。ＰＣＲはＴａＫａｒａＥｘＴａｑ（宝酒造）を用いて行なった。

ＰＣＲ反応液の組成は、鋳型ＤＮＡ溶液５．０μＬ、１０×ｒｅａｃｔｉｏｎｂｕｆｆｅｒ５．０μＬ、ｄＮＴＰｍｉｘｔｕｒｅ４．０μＬ、プライマー１６Ｓ−Ｆ１１．０μＬ（２０ｐｍｏｌ／μＬ）、１６Ｓ−Ｒ２１．０μＬ（２０ｐｍｏｌ／μＬ）、Ｈ_２Ｏ３３．９μＬ、及びＥｘＴａｑ（Ｔａｋａｒａ）０．１μＬで、総容量は５０．０μＬである。なお、１０×ｒｅａｃｔｉｏｎｂｕｆｆｅｒ及びｄＮＴＰｍｉｘｔｕｒｅは、ＥｘＴａｑ（Ｔａｋａｒａ）のキットに添付されているものを使用した。

ＰＣＲは、ＧｅｎｅＡｍｐＰＣＲＳｙｓｔｅｍ９７００ＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ−ＥｌｍｅｒＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて次のように行なった。すなわち、初期変性を９５℃で３分間行なった後、９５℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、及び７２℃で４５秒間を１サイクルとして、これを３５サイクル行い、最後に７２℃で１０分間の伸長反応を行なった。ＰＣＲ後、Ｍｕｐｉｄミニゲル泳動槽（ＡＤＶＡＮＣＥＣｏ．，Ｌｔｄ）を用いて１．５％アガロースゲルによる電気泳動を行い、エチジウムブロマイド溶液でゲルを染色して、目的バンドの増幅の有無を確認した。
電気泳動の結果の一部を図１のレーン２から１０及び１７に示す。レーン２から１０及び１７において、約５２７ｂｐのバンドが確認できた。他のサンプルについても同様であった。

図１中、レーン１は分子量マーカーを表し、レーン２から１０及び１７は、以下のとおりである。
レーン２番号Ａ−３：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｓｕｉｓ（ｓｅｒｏｔｙｐｅ１０）
レーン３番号Ａ−７：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ
レーン４番号Ａ−１１：ＥｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅＡＴＣＣ１９４１４
レーン５番号Ａ−１８：Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘｔｏｎｓｉｌｌａｒｕｍ（ｓｅｒｏｔｙｐｅ７）
レーン６番号Ａ−８：Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ
レーン７番号Ａ−２：Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｇａｒｖｉｅａｅ
レーン８番号Ａ−３０：Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｐａｒａｓｕｉｓ（ｓｅｒｏｔｙｐｅ２）
レーン９番号Ａ−３６：Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｍｕｌｔｏｃｉｄａ（ｐｍｔ非保有株）
レーン１０番号Ａ−３２：Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ｓｅｒｏｔｙｐｅ５）
レーン１７番号Ａ−２０：Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘｓｐ．（ｓｅｒｏｔｙｐｅ１３）

（実施例１−２）ＰＣＲ（未同定株）
表１に記載の未同定株である、罹患動物由来の２８菌株（番号Ｂ−１からＢ−２８）について、実施例１−１と同様の方法で、ＤＮＡを抽出し、抽出したＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行なった。
電気泳動の結果の一部を図１のレーン１１から１６に示す。レーン１１から１６において、約５２７ｂｐのバンドが確認できた。他のサンプルについても同様であった。

図１中、レーン１は分子量マーカーを表し、レーン１１から１６は、以下のとおりである。
レーン１１番号Ｂ−２２
レーン１２番号Ｂ−２４
レーン１３番号Ｂ−１４
レーン１４番号Ｂ−１８
レーン１５番号Ｂ−１９
レーン１６番号Ｂ−１５

（実施例２−１）配列決定（同定株）
実施例１−１のＰＣＲにより増幅が確認されたサンプルをスピンカラム（ＧｅｎｅＣｌｅａｎＳｐｉｎＫｉｔ、Ｂｉｏ１０１，Ｉｎｃ．）によって精製し、ダイレクトシークエンス反応に供した。シークエンス反応は、ＢｉｇＤｙｅｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｃｙｃｌｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ−ＥｌｍｅｒＪａｐａｎ，ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＤｉｖｉｓｉｏｎ，Ｃｈｉｂａ，Ｊａｐａｎ）を用いて添付のプロトコールにしたがって行い、プライマーは、製造例１で作製したプライマー１６Ｓ−Ｆ１又は１６Ｓ−Ｒ２を使用した。塩基配列解析はＡＢＩＰＲＩＳＭ３１０ＧｅｎｅｔｉｃＡｎａｌｙｚｅｒを用いて行なった。
番号Ａ−１からＡ−３９の塩基配列は、それぞれ配列番号：３〜４１に示す塩基配列であった。

塩基配列解析により得られた塩基配列について、日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ）のデータベースを利用して細菌を同定した。同定した種名、及びデータベース上の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列の当該部分との相同性（％）を表１に示した。

（実施例２−２）配列決定（未同定株）
実施例１−２のＰＣＲにより増幅が確認されたサンプルについて、実施例２−１と同様の方法で塩基配列解析及び菌株の同定を行なった。
番号Ｂ−１からＢ−２８の塩基配列は、それぞれ配列番号：４２〜６９に示す塩基配列であった。
同定した種名、及びデータベース上の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列の当該部分との相同性（％）を表１に示した。

（実施例３−１）生化学的手法による同定（同定株）
表１に記載の同定株である、罹患動物由来の２菌株（番号Ａ−３４及びＡ−３５）について、生化学的手法により細菌の同定を行なった。
生化学的手法による細菌の同定は、２１種類の生化学試験からなる、ＡＰＩ２０（ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘＳ．Ａ．）を用いて行なった。生化学的手法により同定した種名を表１に示した。表１のＮＴは、生化学的手法による同定を行なっていないことを意味する。

（実施例３−２）生化学的手法による同定（未同定株）
表１に記載の未同定株である、罹患動物由来の２８菌株（番号Ｂ−１からＢ−２８）について、実施例３−１と同様の方法で細菌の同定を行なった。
生化学的手法により同定した種名を表１に示した。

表１から、本発明のプライマーを用いた配列決定による細菌の同定は、１回のダイレクトシークエンスにより９９％以上の高い相同性で細菌を同定できるものであることが分かる。
また、番号Ｂ−１７からＢ−１９及びＢ−２４では、生化学的手法により同定した種名が、９９％以上の相同性で塩基配列解析により同定した種名と異なっており、本発明のプライマーを用いた配列決定による細菌の同定は、生化学的手法による細菌の同定と比較して、簡易、迅速かつ高精度に同定できるものであることが分かる。

（実施例４）ＰＣＲ
感染ブタより分離し、Ａｃｔ．ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅと同定された菌株（Ｎｏ．１、Ｎｏ．２、Ｎｏ．３、又はＮｏ．４）の培養液、又は大きめのコロニーをマイクロチューブにとり、滅菌蒸留水で洗浄後、１００℃で５分間加熱した。加熱後、氷中で冷却し、遠心分離（１３，５００ｒｐｍで１分間）した。上清を鋳型ＤＮＡ溶液として、製造例１から４に記載のプライマーセット１から４を用いてＰＣＲを行なった。ＰＣＲはＴａＫａｒａＥｘＴａｑ（宝酒造）を用いて行なった。

ＰＣＲ反応液の組成は、鋳型ＤＮＡ１．０μＬ、１０×ＥｘＴａｑｂｕｆｆｅｒ２．５μＬ、ｄＮＴＰｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）２．０μＬ、フォワードプライマー２．５μＬ（１０ｍＭ）、リバースプライマー２．５μＬ（１０ｍＭ）、Ｈ_２Ｏ１４．４μＬ、及びＥｘＴａｑ（Ｔａｋａｒａ）０．１μＬで、総容量は２５．０μＬである。なお、１０×ＥｘＴａｑｂｕｆｆｅｒ及びｄＮＴＰｍｉｘｔｕｒｅは、ＥｘＴａｑ（Ｔａｋａｒａ）のキットに添付されているものを使用した。

ＰＣＲは、ＧｅｎｅＡｍｐＰＣＲＳｙｓｔｅｍ９７００ＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ−ＥｌｍｅｒＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて次のように行なった。すなわち、初期変性を９４℃で１分間行なった後、９４℃で３０秒間、４４℃で３０秒間、及び７２℃で４５秒間を１サイクルとして、これを２５サイクル行い、最後に７２℃で７分間の伸長反応を行なった。ＰＣＲ後、Ｍｕｐｉｄミニゲル泳動槽（ＡＤＶＡＮＣＥＣｏ．，Ｌｔｄ）を用いて１．５％アガロースゲルによる電気泳動を行い、エチジウムブロマイド溶液でゲルを染色して、目的バンドの増幅の有無を確認した。
電気泳動の結果を図２に示す。レーン２から５、７から１０、及び１２から１９において、約５２７ｂｐのバンドが確認できた。

図２中、レーン１、６、１１及び２０は分子量マーカーを表し、レーン２から５、７から１０、及び１２から１９は以下のとおりである。
レーン２製造例１のプライマーセット（鋳型ＤＮＡはＮｏ．１）
レーン３製造例２のプライマーセット（鋳型ＤＮＡはＮｏ．１）
レーン４製造例３のプライマーセット（鋳型ＤＮＡはＮｏ．１）
レーン５製造例４のプライマーセット（鋳型ＤＮＡはＮｏ．１）
レーン７製造例１のプライマーセット（鋳型ＤＮＡはＮｏ．２）
レーン８製造例２のプライマーセット（鋳型ＤＮＡはＮｏ．２）
レーン９製造例３のプライマーセット（鋳型ＤＮＡはＮｏ．２）
レーン１０製造例４のプライマーセット（鋳型ＤＮＡはＮｏ．２）
レーン１２製造例１のプライマーセット（鋳型ＤＮＡはＮｏ．３）
レーン１３製造例２のプライマーセット（鋳型ＤＮＡはＮｏ．３）
レーン１４製造例３のプライマーセット（鋳型ＤＮＡはＮｏ．３）
レーン１５製造例４のプライマーセット（鋳型ＤＮＡはＮｏ．３）
レーン１６製造例１のプライマーセット（鋳型ＤＮＡはＮｏ．４）
レーン１７製造例２のプライマーセット（鋳型ＤＮＡはＮｏ．４）
レーン１８製造例３のプライマーセット（鋳型ＤＮＡはＮｏ．４）
レーン１９製造例４のプライマーセット（鋳型ＤＮＡはＮｏ．４）

図２から、本発明のプライマーを用いた配列決定による細菌の同定は、（１）配列番号：１で表される塩基配列のうち少なくとも１０塩基以上の連続する配列を含むプライマーと、配列番号：２で表される塩基配列のうち少なくとも１０塩基以上の連続する配列を含むプライマーとからなるプライマーセット、及び（２）配列番号：１で表される塩基配列に相補的な塩基配列のうち少なくとも１０塩基以上の連続する配列を含むプライマーと、配列番号：２で表される塩基配列に相補的な塩基配列のうち少なくとも１０塩基以上の連続する配列を含むプライマーとからなるプライマーセットの少なくともいずれかのプライマーセットにより、１回のダイレクトシークエンスにより９９％以上の高い相同性で細菌を同定できるものであることが分かる。

Claims

（１）配列番号：１で表される塩基配列のうち少なくとも１０塩基以上の連続する配列を含むプライマーと、配列番号：２で表される塩基配列のうち少なくとも１０塩基以上の連続する配列を含むプライマーとからなるプライマーセット、及び
（２）配列番号：１で表される塩基配列に相補的な塩基配列のうち少なくとも１０塩基以上の連続する配列を含むプライマーと、配列番号：２で表される塩基配列に相補的な塩基配列のうち少なくとも１０塩基以上の連続する配列を含むプライマーとからなるプライマーセットの少なくともいずれかを含むことを特徴とするプライマーセット。
検体中のＤＮＡを抽出する抽出工程と、
前記ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うＰＣＲ工程とを含み、
前記ＰＣＲ工程で、請求項１に記載のプライマーセットを使用してＰＣＲを行うことを特徴とする核酸増幅方法。
検体中のＤＮＡを抽出する抽出工程と、
前記ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うＰＣＲ工程と、
前記ＰＣＲ工程で得られた産物の塩基配列解析を行う解析工程とを含み、
前記ＰＣＲ工程で、請求項１に記載のプライマーセットを使用してＰＣＲを行うことを特徴とする細菌の同定方法。
前記ＰＣＲ工程におけるＰＣＲ産物の長さが７５０ｂｐ以下である請求項２又は３に記載の方法。
前記ＤＮＡが細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を含む請求項２又は３に記載の方法。
前記細菌が罹患生物由来である請求項５に記載の方法。
罹患ブタ由来の検体中のＤＮＡを抽出する抽出工程と、
前記ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うＰＣＲ工程と、
前記ＰＣＲ工程で得られた産物の塩基配列解析を行う解析工程と、
前記塩基配列解析に基づき、罹患ブタ由来の検体中に含まれる細菌を同定する同定工程とを含み、
前記ＰＣＲ工程で、請求項１に記載のプライマーセットを使用してＰＣＲを行うことを特徴とする罹患ブタの細菌感染診断方法。