WO2006129672A1 - 歯の製造方法、歯の集合体及び組織の製造方法 - Google Patents

歯の製造方法、歯の集合体及び組織の製造方法 Download PDF

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Takashi Tsuji
Kazuhisa Nakao
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Definitions

  • the present invention relates to a tooth manufacturing method, a tooth assembly, and a tissue manufacturing method, and more particularly, to a tooth manufacturing method, a tooth assembly, and a tissue manufacturing method using cells.
  • Teeth have a hard tissue of enamel on the outermost layer and dentine on the inner layer, and further have odontoblasts that produce dentin on the inner side, and a pulp in the center for caries and periodontium. It is an organ that can be lost due to illness. In general, tooth loss is thought to be less life threatening, so it is often compensated mainly by dentures and implants. However, the presence or absence of teeth greatly affects the appearance and taste of food, and the viewpoint power of maintaining health and maintaining a high quality of life has increased interest in developing tooth regeneration technology.
  • Teeth are functional units that are formed by induction of developmental processes in the fetal period and are constructed by multiple cell types, and are thought to be the same as organs and organs. For this reason, teeth are not generated by stem cell systems that generate stem cell force cell types such as hematopoietic stem cells and mesenchymal stem cells in adults, but only stem cell transfer currently being promoted by regenerative medicine (stem cell transfer therapy) ) Cannot regenerate teeth. In addition, by identifying genes that are specifically expressed during the tooth development process and identifying a force gene that is thought to be able to regenerate teeth by artificially inducing tooth germs, complete tooth regeneration is achieved. Cannot be guided to.
  • Non-Patent Document 1 discloses that cells such as epithelial cells and mesenchymal dental follicle cells isolated from tooth germ power are transplanted into a rat abdominal cavity together with a bioabsorbable carrier. It is disclosed that tooth-like tissue is regenerated.
  • Non-Patent Document 2 epithelial-mesenchymal interaction is realized by subcultured cultured cells. As a possible system, it is described that co-culture with collagen gel is effective.
  • Patent Document 1 describes culturing tooth germ cells in the presence of a physiologically active substance such as a fibroblast growth factor.
  • tooth germ cells and cells separable into these cells is cultured together with a carrier containing fibrin, where the carrier containing fibrin is It is described that a “tooth” having a specific shape is formed using a tooth germ having a target shape.
  • Patent Documents 3 and 4 a cell mixture of a dental germ containing mesenchymal cells derived from dental pulp that forms dentin and epithelial cells that contribute to enamel formation from the mandible of pigs of 6 months, A method for forming a tooth by disseminating a biodegradable polymer (glycolic acid, polyacetic acid copolymer) on a solidified carrier (S cafford), implanting it in an animal body, and the like is disclosed.
  • a carrier having a target shape of a tooth germ is used to form a “tooth” having a specific shape.
  • Patent Document 5 discloses a tooth regeneration method for treating a patient having a bone defect or damage. According to this method, bones are formed by seeding mesenchymal cells on a polyglycolic acid mesh carrier and then overlaying epithelial cells with collagen or wrapping them with an epithelial cell sheet. In Patent Document 5, a carrier is used to construct a bone shape.
  • Non-Patent Document 1 J. Dent. Res., 2002, Vol. 81 (10), pp. 695-700
  • Non-Patent Document 2 "Regenerative Medicine Using Teeth and Tooth Embryo-Derived Cells and Its Possibility", Regenerative Medicine Journal of Japanese Society for Regenerative Medicine, 2005, Vol.4 (l), pp.79-83
  • Patent Document 1 JP 2004-331557 A
  • Patent Document 2 JP 2004-357567 A
  • Patent Document 3 US Patent Application Publication No. 2002Z0119180
  • Patent Document 4 US Patent Application Publication No. 2004Z0219489
  • Patent Document 5 International Publication No. 2005Z014070 Pamphlet
  • An organization for example, a tooth, is an “organ” or “organ” that is generated by the interaction of epithelial cells derived from tooth germ and mesenchymal cells derived from head neural crest cells during the process of differentiation. It is possible to generate normal teeth by transplanting the tooth germ as it is, but if the tooth germ cells composed of multiple types of cells are simply separated and cultured, they can serve as functional units called teeth. It is not possible to regenerate teeth with characteristic cell arrangement and orientation.
  • the above-mentioned technique is used to reconstruct tooth germs using cells, cellular factors, etc.! /, However, it has a characteristic cell arrangement and directionality that can express sufficient functions as a tooth. It is not a reproduction.
  • the method for producing a tooth of the present invention includes a first carrier substantially consisting of only one of a mesenchymal cell and an epithelial cell, at least one of which is derived from a tooth germ, inside the support carrier. Placing the cell aggregate in contact with a second cell aggregate consisting essentially of only one of the other, culturing the first and second cell aggregates inside the support carrier, It is characterized by including.
  • the method for producing periodontal tissue of the present invention consists essentially of only one of mesenchymal cells and epithelial cells, at least one of which is derived from a tooth germ, in the support carrier. And the second cell aggregate in which only one of the other force is substantially in contact is disposed, and the first and second cell aggregates are arranged in a tooth and a continuous tooth. And culturing until a periodontal tissue is obtained, and isolating periodontal tissue obtained by the culture. [0010] In the support carrier, at least one of the mesenchymal cells and the epidermis cells, each of which is derived from a tooth germ, is substantially the first cell aggregate and only one of the other. A dental aggregate obtained by placing the first and second cell aggregates in contact with a second cell aggregate consisting essentially of, and culturing the first and second cell aggregates inside the support carrier. It is characterized by being.
  • the first cell aggregate and the second cell aggregate are both derived from a tooth germ.
  • both the first cell aggregate and the second cell aggregate may be a single cell aggregate.
  • the tissue production method of the present invention is a tissue production method constructed by the interaction between mesenchymal cells and epithelial cells, wherein the mesenchymal cells and epithelium are placed inside the support carrier. Placing the first cell aggregate substantially consisting of only one of the system cells in contact with the second cell aggregate consisting essentially of only the other, the first and Culturing the second cell aggregate inside the support carrier, characterized in that! Speak.
  • the tissue manufacturing method it is preferable that at least one of the mesenchymal cells and epithelial cells is derived from a target tissue.
  • the tissue is selected from the group consisting of teeth, hair, kidneys, lungs, and liver power.
  • cell aggregates substantially consisting only of mesenchymal cells or epithelial cells are placed in contact with each other and cultured inside the support carrier, the cell aggregates are in the other direction. It grows while maintaining contact with each other in a support carrier that does not mix with the cells constituting the cell assembly. Thereby, it is possible to effectively reproduce the favorable interaction between the mesenchymal cells and the epithelial cells necessary for forming the tissue.
  • a tissue having a cell arrangement peculiar to the target tissue can be produced.
  • mesenchymal cells and epithelial cells derived from tooth germ teeth and tooth aggregates having a specific cell arrangement of having enamel on the outside and dentin on the inside Can be produced.
  • the invention's effect it is possible to provide a method for producing a tooth having a specific cell arrangement, a tooth assembly produced by this method, and a method for producing a periodontal tissue.
  • a method for producing a tissue having a cell arrangement peculiar to the tissue can be provided.
  • FIG. 1 is a conceptual diagram schematically showing the formation of a tooth germ.
  • FIG. 2 (A) to (D) are diagrams conceptually showing a procedure of tooth germ reconstruction using tooth germ-derived mesenchymal cells and epithelial cells according to an example of the present invention. .
  • FIG. 3 shows a phase contrast microscopic image and a stained image of a normal tooth germ tissue according to Comparative Example 1 of the present invention, and a time-stained stained image of a tooth generated by transplanting the normal tooth germ under the renal capsule. .
  • FIG. 4 Phase contrast microscopic image of reconstructed tooth germ by tooth germ-derived epithelial tissue and tooth germ-derived mesenchymal cells according to Example 1 of the present invention, and the regenerated tooth germ transplanted under the renal capsule It is a stained image over time of the prepared teeth.
  • FIG. 5 is a phase contrast microscopic image of a reconstructed tooth germ by tooth germ-derived epithelial tissue and GFP mouse-derived tooth germ-derived mesenchymal cells according to Example 1 of the present invention, and the reconstructed tooth germ is transplanted under the renal capsule It is a stained image on the 14th day of the generated tooth.
  • FIG. 6 is a phase contrast microscopic image of a reconstructed tooth germ by a GFP mouse-derived tooth germ-derived epithelial cell and a tooth germ-derived mesenchymal tissue according to Example 2 of the present invention, and the reconstructed tooth germ is transplanted under the renal capsule It is a stained image on the 14th day of the generated tooth.
  • FIG. 7 is a phase contrast microscopic image of a reconstructed tooth germ composed of tooth germ-derived epithelial cells and tooth germ-derived mesenchymal cells according to Example 3 of the present invention, and the reconstructed tooth germ is transplanted under the renal capsule. It is a stained image of the generated tooth on the 14th day.
  • FIG. 8 is a phase contrast microscopic image of tooth germ-derived epithelial tissue and tooth germ-derived mesenchymal tissue according to Comparative Example 2 of the present invention, and a stained image on day 14 when each of them is transplanted under the renal capsule alone. is there.
  • FIG. 9 is a phase contrast microscopic image of a low-density reconstructed tooth germ using tooth germ-derived epithelial tissue and tooth germ-derived mesenchymal cells according to Comparative Example 3 of the present invention, and the low-density reconstructed tooth germ is represented by a kidney. This is a stained image on the 20th day when transplanted under the skin.
  • Phase contrast microscopic image of reconstructed tooth germ when tooth germ-derived epithelial tissue and tooth germ-derived mesenchymal cells according to Comparative Example 4 of the present invention are reconstituted with high density without being differentiated
  • FIG. 11 is a stained image of alveolar bone and periodontal ligament, which are periodontal tissues formed around teeth generated from reconstructed tooth germs according to Examples 1 to 3 of the present invention.
  • the tooth root which is a periodontal tissue around the tooth generated from the reconstructed tooth embryo in Example 2 (17 days after transplantation) and Comparative Example 1 (14 days after transplantation) of the present invention This is a stained image in which periostin mRNA specific to the membrane was detected.
  • FIG. 15 (A) is a stained image 14 days after tooth extraction of a non-transplanted mouse according to Comparative Example 6 of the present invention, and (B) is an enlarged view in the frame in (A).
  • the method for producing a tooth of the present invention includes a first carrier substantially consisting of only one of a mesenchymal cell and an epithelial cell, at least one of which is derived from a tooth germ, inside the support carrier. Placing the cell aggregate in contact with the second cell aggregate consisting essentially of only one of the other (arrangement step), placing the first and second cell aggregates inside the support carrier Culturing (culturing step).
  • mesenchymal cells and epithelial cells are grown as a cell aggregate in contact with each other inside the support carrier.
  • the interaction between cells can be effectively reproduced, and a tooth having a cell arrangement peculiar to a tooth having dentin on the inside and enamel on the outside can be manufactured.
  • the "tooth” refers to a tissue having a dentin layer on the inner side and an enamel layer on the outer side, and preferably has such a layer structure and a crown or A tissue with directionality having roots.
  • Dentin and enamel can be easily identified morphologically by those skilled in the art, such as by tissue staining. Enamel can be identified by the presence of enamel blasts, and the presence of enamel blasts can be confirmed by the presence or absence of amelogenin. On the other hand, dentin can be identified by the presence of odontoblasts, and the presence of dentin blasts can be confirmed by the presence or absence of dentin shear protein. Confirmation of amelogenin and dentin shear protein can be easily carried out by methods known in the art, and examples thereof include in situ hybridization and antibody staining.
  • the directionality of teeth can be specified by the arrangement of crowns and roots.
  • the crown and root can be visually confirmed based on the shape and tissue staining.
  • peripheral tissue refers to alveolar bone and periodontal ligament in which an outer layer of a tooth is mainly formed.
  • the alveolar bone and periodontal ligament can be easily identified by those skilled in the art by histological staining or the like.
  • mesenchymal cell means a cell derived from mesenchymal tissue
  • epithelial cell means a cell derived from epithelial tissue
  • teeth germ and “tooth germ” are distinguished from each other based on the developmental stage to be described later! It is an expression used when specifically referring to things.
  • the “tooth germ” in this case is an early embryo of a tooth that has been determined to become a future tooth, and is commonly used in the tooth development stage (Bud stage) Bell stage), and is a tissue that does not show the accumulation of dentin and enamel, which is a characteristic of the hard tissue of the tooth, and ⁇ dental bud '' is the ⁇ dental germ '' used in the present invention.
  • the stage force at which the accumulation of dentin and enamel, which is a characteristic of the hard tissue of the stage, has started.
  • the tissue at the stage before the tooth sprouting from the gingiva and generally manifests its function as a tooth. .
  • the tooth germ is performed through each stage of the rod-like, cap-like, bell-like, and late stages in the ontogeny process.
  • epithelial cells invaginate so as to wrap mesenchymal cells (see Fig. 1 (A) and (B)).
  • mesenchymal cell part forms dentin inside (see Fig. 1 (C) and (D)). Therefore, a tooth germ is formed by cell-cell interaction between epithelial cells and mesenchymal cells.
  • the mesenchymal cells and epithelial cells in the present invention are those from the above-mentioned rod-like stage to the bell-like stage that form or possibly form tooth germs (hereinafter simply referred to as “tooth germs!”). If it is, it is preferable that the power is from the viewpoint of the juvenileity and homogeneity of the cell division stage.
  • the "cell aggregate” is a state in which cells are densely packed, and may be a tissue state or a single cell state. “Substantially” means containing as little as possible other than the target cells. Since each cell aggregate can be a tissue itself or a part thereof, or an aggregate of a single cell, either one can be a cell aggregate composed of a single cell or both. A cell aggregate composed of one cell may be used, but in order to efficiently achieve tissue reconstitution according to the present invention, it is preferable that both be composed of a single cell.
  • the second cell aggregate is V
  • the deviation may be epithelial cells and mesenchymal cells
  • the number of cells constituting this cell aggregate depends on the type of animal and the support Depending on the type, hardness, and size of the carrier, the number of cells per cell aggregate is generally 8 cells, preferably 10 3 to 10 8 cells.
  • the first and second cell aggregates are arranged inside a support carrier capable of maintaining the contact state of the cells, so that the cells constituting each cell aggregate are It does not mix with the cells that make up the other cell assembly.
  • the cell aggregates are arranged without mixing, so that a boundary line is formed between the cell aggregates.
  • partitioning is appropriately expressed as “partitioning” in this specification.
  • first cell assembly and the second cell assembly are separated from each other so as to be substantially composed of mesenchymal cells and epithelial cells (first cell preparation step). And a second cell preparation step).
  • At least one of the mesenchymal cells and epithelial cells used in this production method is required to reproduce the cell arrangement in the living body and effectively form a tooth having a specific structure and direction.
  • both mesenchymal cells and epithelial cells are derived from tooth germ in order to reliably form teeth.
  • the mesenchymal cells derived from other than the tooth germ are cells derived from other mesenchymal tissues in the living body, preferably bone marrow cells or mesenchymal stem cells that do not contain blood cells, and more preferably. Or mesenchymal cells in the oral cavity, bone marrow cells in the jawbone, mesenchymal cells derived from the cranial neural crest cells, mesenchymal progenitor cells that can produce the mesenchymal cells, and stem cells thereof. It is out.
  • the epithelial cells derived from other than the tooth germ are cells derived from other epithelial tissues in the living body, preferably the epithelial cells of the skin, the mucous membrane of the oral cavity or the gingiva, more preferably the skin.
  • immature epithelial progenitor cells that can produce differentiated, eg, keratinized or complexed epithelial cells, such as non-keratinized epithelial cells and stem cells thereof.
  • Tooth germs and other tissues include mammalian primates such as humans and monkeys, ungulates such as pigs, cows and horses, and small mammal rodents such as mice, rats and rabbits. Various movements The jaw force of the object can also be collected.
  • the conditions used for tissue collection are usually applied as they are, and they can be removed in a sterile state and stored in an appropriate preservation solution.
  • human tooth germs include third molars, so-called wisdom tooth germs, and fetal tooth germs. From the viewpoint of use of autologous tissues, it is preferable to use wisdom tooth germs.
  • the preparation of mesenchymal cells and epithelial cells with tooth germ power is performed by first dividing the isolated tooth germ into tooth germ mesenchymal tissue and tooth germ epithelial tissue according to the shape. Is called.
  • tooth germ tissue can be structurally distinguished under a microscope, it can be easily separated by cutting or peeling with a scissors for dissection. Separation of tooth germ mesenchymal tissue and tooth germ epithelial tissue from tooth germ tissue can be easily performed by cutting or peeling with a needle, tungsten-dollar, tweezers, etc. according to the shape. it can.
  • enzymes may be used to easily separate tooth germ cells from surrounding tissue and to separate epithelial and mesenchymal tissue from Z or tooth germ tissue.
  • enzymes used for such applications include dispase, collagenase, and trypsin.
  • the mesenchymal cells and the epithelial cells may be prepared in a single cell state from mesenchymal and woven and epithelial and woven fabrics, respectively.
  • an enzyme may be used in order to make it easily dispersible in a single cell.
  • examples of such an enzyme include dispase, collagenase, trypsin and the like.
  • trypsin treatment and DNase treatment after collagenase treatment.
  • mesenchymal cells from the mesenchymal tissue it is preferable to simultaneously treat with collagenase and trypsin and finally treat with DNase.
  • the DNase treatment at this time is that some cells are damaged by the enzyme treatment, and the cells are aggregated by the DNA released into the solution when the cell membrane is dissolved, resulting in a decrease in the amount of cells recovered. Is to prevent.
  • mesenchymal cells and epithelial cells may have been subjected to preliminary culture prior to the placement step to obtain a sufficient number of cells! / ⁇ .
  • the conditions such as temperature generally used for culturing animal cells may be used as they are. Togashi.
  • a medium used for culturing a medium generally used for culturing animal cells, such as Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM), can be used, and the ability to add serum to promote cell growth, or serum Alternatively, known serum components such as cell growth factors such as FGF, EGF, PDGF, and transferrin may be added.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle medium
  • known serum components such as cell growth factors such as FGF, EGF, PDGF, and transferrin may be added.
  • the concentration in the case of adding serum can be appropriately changed depending on the culture state at that time, but can usually be 10%.
  • normal culture conditions for example, culture in an incubator with a temperature of 37 ° C and a concentration of 5% CO are applied.
  • antibiotic such as streptomycin
  • the support carrier used in the present invention may be any support carrier capable of culturing cells therein, and is preferably a mixture with the above medium.
  • Such support carriers include collagen, fibrin, laminin, extracellular matrix mixture, polyglycolic acid (PGA), polylactic acid (PLA), lactic acid Z glycolic acid copolymer (PLGA), cell matrix (trade name) , Meviol gel (trade name), Matrigel (trade name) and the like.
  • These support carriers may be in the form of gels, fibers, or solids as long as they have a hardness that can maintain the position when the cells are placed inside. .
  • the hardness that can maintain the position of the cells is usually a hardness that is applied as a three-dimensional culture, that is, a hardness that can maintain the arrangement of the cells and does not inhibit enlargement due to proliferation. It can be easily determined. For example, in the case of collagen, use at a final concentration of 2.4 mgZml provides adequate hardness.
  • the support carrier can be appropriately set depending on the size of the target tissue and the like as long as the first and second cell aggregates are thick enough to grow inside the carrier. .
  • the support carrier may be capable of maintaining the contact state of cells! /, But here, the "contact state” is surely defined in each cell assembly and between cell assemblies. It is preferable to be in a high density state to allow cell interaction.
  • the high density state means that the density is equivalent to the density at the time of composing the tissue.
  • the density is preferably 1 ⁇ 10 8 to 1 ⁇ 10 9 cells Zml, and most preferably 2 ⁇ 10 8 to 8 ⁇ 10 8 cells / ml.
  • centrifugation may be performed for 3 to 10 minutes at a rotational speed corresponding to a centrifugal force of 300 to 1200 X g, preferably 500 to 1000 X g, which does not impair cell survival. Centrifugation below 300 X g may result in poor cell sedimentation and low cell density, while centrifugation above 1200 X g may damage cells, It is not preferable.
  • a single cell suspension is usually prepared in a tube or the like used for cell centrifugation, and then centrifuged. Remove the supernatant as much as possible, leaving the cells as.
  • the container such as a tube used at this time is preferably a silicone-coated one from the viewpoint of completely removing the supernatant.
  • the precipitate When the precipitate is obtained by centrifugation, the precipitate may be placed as it is inside the support carrier.
  • components other than the target cells for example, a culture solution, a buffer solution, a support carrier, etc.
  • the second cell aggregate may be arranged so as to be pressed against the first cell aggregate, which is preferably the closer the contact between the first cell aggregate and the second cell aggregate is. Particularly preferred.
  • wrapping the surroundings of the first cell aggregate and the second cell aggregate with a culture medium and a solid material that does not inhibit oxygen permeation is also effective for close contact between the cell aggregates. It is also preferable to place a high-density cell suspension in a solution with different viscosities and set the solution as it is because the solution can be solidified as it is easy to maintain cell contact.
  • the first Is a single cell aggregate of tooth germ mesenchymal cells
  • the second cell aggregate is a tooth germ epithelium
  • the enamel nodules of the tooth germ epithelium are the first cell aggregate. It is preferred to place it in contact with, but not limited to.
  • a solidification step for solidifying the support carrier may be provided after the arranging step.
  • the cells arranged inside the support carrier are fixed inside the support carrier.
  • generally used solidification conditions for the support carrier may be applied as they are.
  • a solidifiable compound such as collagen is used for the support carrier, it can be solidified by allowing it to stand for several minutes to several tens of minutes under the conditions usually applied, for example. As a result, the connection between cells inside the support carrier can be fixed and made strong.
  • the first cell aggregate and the second cell aggregate are cultured inside the support carrier.
  • cell-cell interaction is effectively performed by the first cell aggregate and the second cell aggregate in intimate contact with each other, and the tissue, that is, the tooth is reconstructed.
  • the culture step is carried out with the support carrier alone having the first and second cell aggregates as long as the contact state between the first cell aggregate and the second cell aggregate is maintained by the support carrier. Or even in the presence of other animal cells.
  • the culture period varies depending on the number of cells arranged inside the support carrier and the state of the cell aggregate, and also the conditions of the culture process.
  • the enamel is on the outside for 1 to 300 days.
  • it is preferably 1 to 120 days, and preferably 1 to 60 days from the viewpoint of enabling rapid provision.
  • it can be generally 1 to 300 days, preferably 1 to 60 days.
  • the culturing can be performed under normal conditions used for culturing animal cells.
  • the above-described conditions can be applied as they are, as long as the culture conditions in animal cells are generally applied as they are.
  • serum derived from mammals may be added, or various cellular factors known to be effective for the growth and differentiation of these cells may be added.
  • cellular factors include F GF, BMP, etc. can be mentioned.
  • organ culture in general, a porous membrane is floated on a medium suitable for the growth of animal cells, and a cell aggregate embedded with a support carrier is placed on the membrane and cultured.
  • the porous membrane used here is preferably a membrane having a large number of pores of about 0.3 to 5 m.
  • cell culture insert trade name
  • lysopore filter product
  • teeth and Z or periodontal tissue at an early stage by transplanting a support carrier having the first and second cell aggregates into a living body and culturing in vivo. Therefore, it is particularly preferable.
  • the first and second cell aggregates are transplanted into the living body together with the support carrier.
  • animals that can be used for this purpose include mammals such as humans, pigs, mice, and the like, and it is more preferable that they are derived from the same species as the tooth germ tissue.
  • mammals such as humans, pigs, mice, and the like
  • transplanting human dental germ tissue it is preferable to use humans or mammals other than humans modified to immunodeficiency.
  • a biological part suitable for in vivo growth in order to generate animal cell organs and tissues as normally as possible, subrenal capsule, mesentery, subdermal transplantation and the like are preferable.
  • the growth period by transplantation varies depending on the size at the time of transplantation and the size of the teeth to be generated, but can generally be 3 to 400 days.
  • the period of transplantation under the kidney capsule depends on the size of the culture to be transplanted and the size of the tooth to be regenerated, but it takes 7 to 60 days from the viewpoint of tooth regeneration and the size of the tooth generated at the transplant destination. Preferably there is.
  • preculture Prior to transplantation into a living body, in vitro culture (preculture) may be performed! This pre-culture is preferable because the binding between cells and the binding between the first and second cell aggregates can be strengthened and the interaction between cells can be further strengthened. As a result, the overall growth period Can be shortened.
  • the preculture period may be short or long.
  • the period is long, for example, 3 days or more, preferably 7 days or more, tooth germ power can be generated in the tooth bud, so it is possible to shorten the period until teeth are formed after transplantation.
  • the period of the pre-culture is preferably 1 to 7 days for organ culture when transplanting under the kidney capsule, for example, in order to efficiently regenerate the teeth.
  • the tooth manufactured by the manufacturing method of the present invention has a specific cell arrangement (structure) as a dentin inside and an enamel outside, and preferably further, the tip of the tooth (Tooth crown) and root direction are also provided.
  • a specific cell arrangement preferably cell arrangement
  • the function as a tooth can be exhibited. Therefore, it can be widely used as a substitute for teeth.
  • mesenchymal cells and epithelial cells derived from autologous tooth germs are used, they can be used while avoiding problems due to rejection reactions. In general, problems caused by rejection can also be avoided when using cells derived from another person's tooth germ that are compatible with the transplantation antigen.
  • periodontal tissues such as alveolar bone and periodontal ligament can be formed to support and fix the teeth on the jaw bone. .
  • periodontal tissues such as alveolar bone and periodontal ligament
  • the above culturing step is performed inside the support carrier until the first and second cell aggregates are obtained and the teeth and the periodontal tissue continuous therewith are obtained.
  • periodontal tissue only the periodontal tissue can be obtained by forming the periodontal tissue continuously from the tooth and separating it from the tooth during the extended culture period until the periodontal tissue is obtained.
  • Isolation of periodontal tissue includes separation by tweezers etc. that can be performed by any method that can separate periodontal tissue and teeth formed during the culture process, partial digestion by enzyme, etc. be able to.
  • the tooth and periodontal tissue obtained by the above-described method for producing teeth and periodontal tissue of the present invention are used as a graft and also preferred for research to elucidate the developmental process of teeth. And can be used as an effective research tool for future tooth-related tissue development.
  • the culture process in the production method is an organ that can be prepared in vitro without any contact with other animal cells. It is preferable to be a culture.
  • the tooth assembly of the present invention is a tooth assembly having a tooth-specific cell arrangement obtained by the above-described tooth manufacturing method.
  • Such a tooth assembly is composed of a plurality of teeth having a tooth-specific cell arrangement, and therefore, individual teeth are separated from the assembly and, as described below, as a single dental implant. Can be used.
  • the tooth manufacturing method of the present invention can also provide teeth as an aggregate of teeth composed of a plurality of teeth. As a result, teeth as an implant can be produced efficiently.
  • the tooth assembly can be easily obtained by applying the above-described method for manufacturing a tooth as it is.
  • the first and second cell aggregates are prepared in the first and second cell preparation steps, respectively, and are placed in contact with each other in the placement step.
  • a plurality of teeth can be easily formed from a group of cells forming one tooth.
  • the first and second cell assemblies are both composed of a single cell to facilitate reinduction of a tooth germ for the generation of a plurality of teeth, It is preferable.
  • the culture process may be organ culture or culture under the kidney capsule, as described above. However, when the obtained tooth is used as a graft, it is used with other animal cells. It is preferred to have an organ culture that can be prepared in vitro without contact and for the entire process.
  • the present invention also includes a method for implanting teeth.
  • a transplantation method a step of obtaining the above-mentioned tooth assembly, a step of separating individual teeth from the tooth assembly, and a separated tooth are transplanted. And implanting them so as to be in the same direction as the other teeth at the site.
  • tooth transplantation can be performed efficiently by simultaneously obtaining a plurality of teeth having specific cell arrangement and directionality.
  • the tooth according to the present invention has various symptoms accompanied by tooth loss and damage, such as dental caries, marginal periodontitis (alveolar pyorrhea), tooth loss due to periodontal disease, breakage due to accidents, It can also be applied to treatment or treatment such as dropout.
  • the treatment method of the present invention includes transplanting the tooth and Z or periodontal tissue obtained by the production method according to the present invention to the defect and the Z or damaged site. This can treat and Z or alleviate the above symptoms at the defect and Z or injury site.
  • Another treatment method of the present invention includes carrying out only the culturing step in the present invention, or the placement step and the culturing step at the defect and / or damaged site. in this case
  • the tissue surrounding the defect and Z or the damaged site itself may be applied as the support carrier.
  • the defect, Z, or damaged site can be treated more rapidly by site force in from surrounding tissues in the living body.
  • the tissue can be effectively reconstituted based on the cell-cell interaction between mesenchymal cells and epithelial cells.
  • a method for producing a tissue constructed by interaction can also be provided.
  • the method for producing a tissue of the present invention is a method for producing a tissue constructed by the interaction between mesenchymal cells and epithelial cells, and contains mesenchymal cells and epithelial cells inside a support carrier.
  • any of the matters described in the tooth manufacturing method can be similarly applied to the method of manufacturing the present tissue.
  • the tissue produced by the method for producing this tissue corresponds to a tissue constructed by cell-cell interaction of mesenchymal cells and epithelial cells.
  • mesenchymal cells and epithelial cells.
  • tissues used to prepare cell aggregates composed of mesenchymal cells and epithelial cells include tooth germ pulp cells, periodontal ligament cells, oral epithelium
  • mesenchymal cells and hair the developing follicular organ primordium and adult follicular tissue, in the case of the kidney, the developing kidney organ primordia and adult kidney tissue, and in the case of the lung,
  • mesenchymal cells and hair the developing follicular organ primordium and adult follicular tissue
  • the developing kidney organ primordia and adult kidney tissue in the case of the lung
  • the lung organ primordium, adult lung tissue, and liver mention may be made of developing liver organ primordium and adult liver tissue.
  • tissue force Mesenchymal cells and epithelial cells are separated, and first and second cell aggregates are prepared in the same manner as described above. In this way, it may be placed inside the support carrier and cultured and Z or transplanted.
  • C57BLZ6N mouse purchased from Clea Japan
  • Green Fluorescence Protein (EGF P) transgenic mouse C57BLZ6— TgN (act— EGFP) OsbC14— Y01— FM1 31 (GFP mouse: Riken BioResource Center) 14.5 days
  • the incisor tooth germ tissue of the lower jaw was removed by a conventional method under a microscope.
  • Mandibular incisor tooth germ tissue was washed with Ca 2+ , Mg 2+ -free phosphate buffer (PBS (-)), and the final concentration of 1.2 UZml Dispase II (Roc heme, Mannheim, Germany) for 12.5 minutes at room temperature, followed by DMEM (Sigma, St.
  • tooth germ epithelial cells For tooth germ epithelial cells, the tooth germ epithelial tissue obtained above was washed 3 times with PBS (—), and the final concentration of lOOUZml Collagenase I (Worthington, Lakewood, NJ) was added to PBS (—). The treatment with the dissolved enzyme solution at 37 ° C for 20 minutes was repeated twice. The cells collected by sedimentation by centrifugation were further treated with 0.25% Trypsin (Sigma) —PBS (—) at 37 ° C. for 5 minutes.
  • tooth germ mesenchymal tissue was washed 3 times with PBS (—) and PBS (—) containing 0.25% Tryps in (Sigma), 50UZml Collagenase I (Worthington). Processed. 7 OUZml DNase I (Takara) was added, and single tooth germ mesenchymal cells were obtained by pipetting.
  • tooth germ reconstruction was performed using the tooth germ epithelial cells and tooth germ mesenchymal cells prepared above.
  • the cells were collected as a precipitate by centrifugation (580 X g). Remove as much of the supernatant of the culture broth after centrifugation as possible, perform centrifugation again, and observe the culture broth around the cell sediment while observing with a stereomicroscope.
  • GELoader Tip 0, 5-20 ⁇ L (eppendorf) was completely removed, and cells used for preparation of reconstructed tooth germs were prepared.
  • the cell aggregate 12 previously placed in the gel drop 10 with the pipette tip 16 forms a sphere in the gel drop 10 (see FIG. 2 (B)).
  • the cell aggregate 12 of the sphere is often crushed and wraps around the other cell aggregate 14 (see FIG. 2 (C)).
  • the gel drop 10 is solidified to strengthen the bond between cells (see FIG. 2 (D)).
  • a cell aggregate a cell aggregate composed of a single cell of epithelial cells or mesenchymal cells, and a partial tissue and mesenchymal cells that have epithelial cell power among tooth germs.
  • Each of the powerful partial tissues was prepared and used.
  • tooth germ epidermis cells were applied by the same method to produce cell aggregates, and reconstructed tooth germs were prepared so that they were in close contact with each other.
  • Cellmatrix type A (Nitta Gelatin) is solidified, and cell culture insert (PET membrane with a pore size of 0.4 microns; BD, Frankl in Lakes, NJ) is in contact with DMEM (Sigma) with 10% FCS (JRH)
  • cell culture insert PET membrane with a pore size of 0.4 microns; BD, Frankl in Lakes, NJ
  • DMEM Sigma
  • FCS FCS
  • the cell aggregates were transferred onto the membrane of the cell culture insert of the culture container set in this way together with the surrounding gel as a support carrier, and cultured for 18-24 hours.
  • the surrounding gel was transplanted under the renal capsule of 8-week-old C57BLZ6 to promote ectopic tooth development, or organ culture on cell culture inserts was continued to analyze tooth development.
  • Comparative Example 4 the mixture of epithelial cells and mesenchymal cells was gently mixed at a ratio of 1: 1, respectively, and then 1 cell used for preparation of reconstructed tooth germ in the same manner as in Examples 1 to 3. Prepared as agglomerates.
  • FIG. 3 The results of culturing the tooth germ tissue are shown in FIG. 3, and the results of culturing according to the production method of the present invention are shown in FIGS.
  • Comparative Example 1 in which the excised tooth germ was transplanted under the renal capsule, as shown in Fig. 3, the intercellular relationship between the mesenchymal cells and epithelial cells constituting the tooth germ was shown. Since the action is not impaired, enamel derived from epithelial cells and dentin and pulp derived from mesenchymal cells are formed, and the enamel and dentin are placed in place and the tip of the tooth A tooth with a root and a root was formed.
  • FIGS. 4 to 6 when a single cell form prepared from a tooth germ is used according to the present invention, that is, a tooth germ mesenchymal cell is combined with a tooth germ epithelial tissue. Reconfigure (See Example 1, FIG. 4 and FIG. 5) and when reconstructed by combining tooth germ epithelial cells with tooth germ mesenchymal tissue (see Example 2 and FIG. 6), respectively. Teeth with a specific cell arrangement with dentin on the inside and enamel on the outside could be generated by subrenal transplantation over a period of 11-14 days. It was shown that the teeth obtained here can reconstruct the same teeth as those in normal development obtained by directly cultivating the tooth germ (Fig. 3).
  • the present reconstitution and subrenal transplantation resulted in an outer enamel, enamel blast, enamel blast, dentin, odontoblast on the 11th day after transplantation.
  • the root part was not changed from normal, and alveolar bone was also observed around the root part.
  • dentin and odontoblasts were easily recognized on the third day after transplantation, and the formation of a characteristic tooth structure was started in terms of tissue arrangement.
  • dentine accumulation, odontoblasts, and enamel blasts were also present, after which tooth development progressed (data not shown).
  • mesenchymal cells derived from GFP mice were used, they were localized in pulp cells and odontoblasts derived from the inner mesenchymal cells (Fig. 5), whereas they were derived from GFP mice.
  • epithelial cells When epithelial cells were used, it was shown to be localized in the outer enamel blasts, and the cell type used and fluorescence were inconsistent (Fig. 6). Therefore, it was clear that cell interaction was performed in the same manner as normal development, and tissue reconstitution was performed without impairing the directionality of the cells in development.
  • tooth germ epithelial cells and tooth germ mesenchymal cells When tooth germ epithelial cells and tooth germ mesenchymal cells are used, it is often observed that one reconstructed tooth germ generates teeth with multiple directions and structures. It was suggested that multiple teeth could be generated by separating the tooth buds. In particular, when the tooth germ mesenchymal cells were placed in the gel drop first, and then the tooth germ epithelial cells were pressed and placed, the enamel and dentin were placed on the outside and inside, respectively. It was shown that the characteristic structure can be constructed more clearly, and it is possible to take the shape of the tooth more quickly, which is advantageous for tooth formation (data not shown).
  • the teeth formed by this method had periodontal tissue.
  • the periodontal tissue was confirmed by using the following in situ hybridization in addition to the above-mentioned observation with the HE-stained image.
  • the reconstructed tooth germ transplanted under the kidney capsule was excised on the 14th day of transplantation, embedded in paraffin by a conventional method, and sectioned to a thickness of 10 m. Paraffin was removed by immersing the sections in xylene and ethanol dilution series. The cells were treated with 10 ⁇ g / ml Protease K (Nacalai tesque, Kyoto, Japan) in PBS ( ⁇ ) for 3 minutes and fixed with 4% paraformaldehyde (Nacalai tesque) phosphate buffer for 15 minutes. 0.1. Treated with 1% (v / v) TritonX-100 (Sigma) in PBS ( ⁇ ) for 3 minutes and washed with PBS ( ⁇ ) for 3 minutes. 0.
  • tooth germ produced in Examples 1 to 3 can form periodontal tissues such as alveolar bone and periodontal ligament.
  • Example 4 The combination of tooth germ-derived epithelial tissue and mesenchymal cells was taken as Example 4, and the combination of tooth germ-derived epithelial cells and mesenchymal cells was taken as Example 5.
  • An example of organ culture using normal tooth germ was referred to as Comparative Example 5. The results are shown in FIG.
  • the teeth obtained by organ culture were aggregates composed of a plurality of teeth (for example, 6 using mesenchymal cells and epithelial cells; FIG. 1). 3 bottom tier).
  • Example 5 a tooth obtained from a reconstructed tooth germ was reinduced to multiple teeth despite the preparation of mesenchymal and epithelial cells from one reconstructed tooth germ. . In this way, we analyzed whether each tooth re-induced simultaneously in the reconstructed tooth germ can grow as a single tooth.
  • the reconstructed tooth germ obtained in the same manner as in Example 3 was organ-cultured for 2 to 5 days, and a plurality of tooth germs were generated from one reconstructed tooth germ. Thereafter, the reconstructed tooth germ in which multiple tooth germs were developed was surgically separated into one tooth germ using an injection needle and tweezers under a stereomicroscope on the 2nd to 5th day of organ culture.
  • Example 2 In the same manner as in Example 1, 30 ⁇ L of Cellmatrix type pe I-A (Nitta gelatin, Osaka, Japan) was dropped on a Petri dish coated with silicon grease to prepare a gel drop. This Place the individual isolated tooth germ in a gel drop and leave it in a CO incubator for 10 minutes.
  • Cellmatrix type pe I-A Nita gelatin, Osaka, Japan
  • Cellmatrix type I-A (Nitta Gelatin) was solidified, and 10% FCS (JRH) added DMEM (Si gma) with cell culture insert (PET membrane with a pore size of 0.4 micron; BD, Franklin Lakes, NJ) On the membrane of the cell culture insert of the culture container set so as to come into contact, the individual separated tooth germ was transferred together with the surrounding gel as a support carrier, and the organ was opened for 18 to 24 hours.
  • the surrounding gel was transplanted under the renal capsule of 8-week-old C57BLZ6, and individual isolated tooth germs were removed from the surrounding kidney tissue on the 14th day.
  • the tissue was fixed with 4% noraformaldehyde-phosphate buffer for 6 hours, and then embedded in paraffin by a conventional method to prepare 10 m sections.
  • hematoxylin-eosin staining was performed according to a conventional method.
  • Fig. 14 shows the results of histological analysis after the separated tooth germ was transplanted under the kidney capsule and developed for 14 days.
  • the transplanted isolated tooth germs developed in a single "tooth", each of which has the characteristics of enamel and dentin, pulp, crown and root.
  • enamel and dentin are present in the crown part of the obtained tooth (see a in the middle and lower stages of FIG. 14), and a root opening is present in the root part (b in the middle part of FIG. 14). (See below).
  • enamel blasts and odontoblasts are present in the crown as well as normal teeth, and have the same morphology as normal teeth. It was shown that the individual teeth generated at the same time were identical in cell arrangement and orientation to those of normal teeth.
  • Cellmatrix type I-A (Nitta gelatin, Osaka, Japan) prepared in the above culture solution was dropped at a concentration of 4 mg / ml to prepare a gel drop. Place the individual isolated tooth germ in this gel drop and leave it in a CO incubator for 10 minutes.
  • Cellmatrix type I-A (Nitta gelatin, Osaka, Japan)
  • the cell culture insert of the culture vessel set so that the cell culture insert (PET membrane with a pore size of 0.4 micron; BD, Franklin Lakes, NJ) was in contact with DMEM (Sigma) with 10% FCS (JRH). Individual separated tooth germs were transferred onto the membrane together with the surrounding gel as a support carrier and cultured for 18-24 hours. After culturing, the surrounding gel was surgically removed with an injection needle and tweezers, and transplanted into an 8-week-old C57BLZ6 mandibular incisor extraction hole.
  • a scalpel Using a scalpel, drill a hole with a diameter of lmm for an individual separated tooth germ and a diameter of 2mm for an individual separated tooth in the mandible covering the root area of the extraction hole, and remove the individual separated tooth germ and individual separated tooth from there. Implanted in the root area of the foramen. The orientation of the individual isolated tooth embryos and the individual isolated teeth to be transplanted was matched with the direction of normal teeth, and the direction of enamel and periodontal ligament found in adult mouse mandibular incisors was also matched. Cut the muscle layer and skin Sutured. Eight-week-old C57BLZ6 transplanted intraorally was fed daily for breeding food.
  • Comparative Example 6 was a mouse that had been transplanted after incisor extraction.
  • FIG. 15 shows the image of the thread and texture 14 days after the extraction of the mouse of Comparative Example 6 which had been transplanted after the incisor was extracted.
  • FIGS. 16 and 17 show the tissue images 14 days after transplantation into the incisor extraction hole, respectively.
  • teeth having enamel on the outside and dentine on the inside were generated at the site where the individually separated tooth germ was transplanted as Example 6.
  • the generated tooth had the same structure as the normal tooth, with the tip and root of the tooth being recognized, the directionality of the tooth was present.
  • D Nase I solution (Takara, Siga, Japan) to a final concentration of 70 UZml to disperse the follicular tissue, and surgically use a 25G injection needle (Terumo, Tokyo, Japan) to surgically treat the follicular epithelial tissue. And isolated follicular mesenchymal tissue.
  • follicular epithelial cells For follicular epithelial cells, the follicular epithelial tissue obtained above was washed three times with PBS (—), and Collagenase I (Worthington, Lakewood, NJ) with a final concentration of lOOUZml was added to PBS (—). Treatment with the dissolved enzyme solution at 37 ° C for 20 minutes was repeated twice. The cells collected by precipitation by centrifugation were further treated with 0.25% Trypsin (Sigma) —PBS (—) at 37 ° C. for 5 minutes.
  • Example 2 In the same manner as in Example 1 except that the follicular epithelial cells and follicular mesenchymal cells prepared above were used, cells used for the preparation of reconstructed follicles were prepared, and collagen gel droplets were prepared. Then, 0.2-0.3; zL was applied to prepare each cell aggregate, and reconstituted follicles were prepared so that they were in close contact with each other.
  • the reconstructed follicles prepared in the gel were transferred to the cell culture cartridge insert membrane of the culture vessel in the same manner as in Example 1, and the cell mass was transferred together with the surrounding gel as a support carrier for 18 to 48 hours. Cultured. After culturing, the surrounding gel was transplanted under the renal capsule of 8-week-old C57BLZ6 to promote ectopic hair development, and the hair development was analyzed.
  • Comparative Example 7 was the same as Comparative Example 4 except that follicular epithelial cells and follicular mesenchymal cells were used. This was prepared and transplanted under the renal capsule in the same manner as in Example 8.
  • the reconstructed follicles were removed along with the surrounding kidney tissue 14 days after transplantation.
  • cell aggregates were collected after the same number of days of culture.
  • the tissue or cell aggregate was fixed with 4% paraformaldehyde-phosphate buffer for 6 hours, and then embedded in paraffin by a conventional method to prepare 10 m sections.
  • hematoxylin-eosin staining was performed according to a conventional method.
  • FIG. 18 shows the result of transplanting the follicle according to Example 8 under the kidney capsule of a syngeneic mouse.
  • FIG. 18 shows the result of transplanting the follicle according to Example 8 under the kidney capsule of a syngeneic mouse.
  • the hair was dissolved at the time of tissue staining, but the hair was not completely dissolved.
  • section B cell arrangements such as inner and outer root sheaths were observed so that the epithelial cells surrounded the pores. Since the hair dissolves at the time of tissue staining, residual hair dissolution was observed. In addition, as shown in FIG. 19, hairs with follicular strength were observed in the grafts that were excised 14 days after transplanting the reconstructed follicles under the kidney capsule.
  • follicular tissue forceps could be produced in the same manner as in the case of producing teeth using the tooth germs of Examples 1-7.
  • various single cell tissues can be reconstructed without impairing the cell-cell interaction, so that a tissue constructed by the cell interaction can be artificially produced.

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Abstract

　間葉系細胞及び上皮系細胞のいずれか一方のみから実質的になる第１の細胞集合体と、いずれか他方のみから実質的になる第２の細胞集合体とを、細胞の接触状態を保持可能な支持担体の内部に接触させて配置し、培養して、特有の細胞配置を有する歯を得る。好ましくは、それぞれの細胞集合体を有する支持担体を、培養後に、腎臓細胞と共に培養する。

Description

明 細 書
歯の製造方法、歯の集合体及び組織の製造方法
技術分野
[0001] 本発明は、歯の製造方法、歯の集合体及び組織の製造方法に関し、特に細胞を 用いた歯の製造方法、歯の集合体及び組織の製造方法に関する。
背景技術
[0002] 歯は、最外層にエナメル質、その内層に象牙質という硬組織を有し、さらにその内 側に象牙質を産生する象牙芽細胞、中心部に歯髄を有し、齲蝕や歯周病等によつ て失われることがある器官である。一般に歯の損失については、生命に対する危惧 が少ないと考えられているため、現在は主として入れ歯やインプラントにより補うことが 多い。しかしながら、歯の有無は外見や食べ物の味覚に大きく影響し、また健康維持 や質の高い生活を維持するという観点力 歯の再生技術の開発への関心が高まって こ ο
歯は、胎児期の発生過程の誘導によって形成され、複数の細胞種によって構築さ れた機能単位であり、器官や臓器と同じであると考えられている。そのため歯は、成 体内の造血幹細胞や間葉系幹細胞のような幹細胞力 細胞種が発生する幹細胞シ ステムによって発生するのではなぐ現在、再生医療によって進められている幹細胞 の移入のみ (幹細胞移入療法)では歯を再生することができない。また、歯の発生過 程で特異的に発現する遺伝子を同定し、歯胚を人為的に誘導することによる歯の再 生も考えられている力 遺伝子を特定しただけでは、歯の再生を完全に誘導すること ができない。
そこで、近年、単離された歯胚細胞を用いた歯胚を再構成させて、この再構成歯胚 を移植することによる歯の再生を中心とした検討が行われている。
[0003] 例えば、非特許文献 1には、歯胚力 単離された上皮系細胞や間葉系の歯嚢細胞 などの細胞を、生体吸収性の担体と共にラットの腹腔内に移植することで歯様の組織 が再生されることが開示されて 、る。
また、非特許文献 2には、継代された培養細胞による上皮-間葉相互作用が実現 可能な系とし、コラーゲンゲルによる共培養が有効であると記載されている。
歯胚の再生方法としては、例えば、特許文献 1には、歯胚細胞を、線維芽細胞増殖 因子等の生理活性物質の存在下で培養することが記載されている。また、特許文献
2には、歯胚細胞及びこれらの細胞に分ィ匕可能な細胞のうち少なくとも 1種類を、フィ ブリンを含む担体と一緒に培養することが提案されており、ここでフイブリンを含む担 体は、歯胚の目的形状のものを使用して、特有の形態を有する「歯」を形成すると記 載されている。
特許文献 3及び 4には、 6ヶ月のブタの下顎骨から、象牙質を形成する歯髄由来の 間葉系細胞とエナメル形成に寄与する上皮系細胞とを含む歯胚との細胞混合物を、 ポリグリコール酸 ポリ酢酸共重合体力 なる生分解性ポリマーを固化させた担体 (S cafford)に播種して、動物の体内へ移植し、歯を形成する方法が開示されている。こ こで担体は、歯胚の目的形状のものを使用して、特有の形態を有する「歯」を形成す ると記載されている。
一方、特許文献 5には、骨の欠損又は損傷を有する患者を治療するための歯の再 生方法を開示している。この方法によれば、ポリグリコール酸メッシュ担体に間葉系細 胞を播種した後に、上皮系細胞をコラーゲンと共に重層する又は上皮細胞シートで 包むことによって、骨が形成される。なお、特許文献 5では、骨の形状を構築するた めに担体を用いている。
非特許文献 1 :J. Dent. Res., 2002, Vol.81(10), pp.695- 700
非特許文献 2 :「歯および歯胚由来細胞を用いた再生医療とその可能性」、再生医療 日本再生医療学会雑誌、 2005年、 Vol.4(l), pp.79- 83
特許文献 1 :特開 2004— 331557号公報
特許文献 2：特開 2004— 357567号公報
特許文献 3 :米国特許出願公開第 2002Z0119180号公報
特許文献 4 :米国特許出願公開第 2004Z0219489号公報
特許文献 5：国際公開第 2005Z014070号パンフレット
発明の開示
発明が解決しょうとする課題 [0005] しカゝしながら、組織として機能するには、組織を構成する複数種の細胞が適切な相 対位置に配置 (細胞配置）され、組織としての方向性を有することが必須である。組 織、例えば歯は、歯胚に由来する上皮系細胞と頭部神経堤細胞に由来する間葉系 細胞が分ィヒ発生過程で相互作用して発生するひとつの「臓器」や「器官」であり、歯 胚をそのまま移植すれば正常の歯を発生可能であるが、複数種類の細胞で構成さ れている歯胚細胞を、単に分離して培養しただけでは、歯という機能単位としての特 徴的な細胞配置及び方向性を有する歯を再生することができない。
[0006] 上記技術は 、ずれも細胞や細胞因子等を用いて歯胚の再構築を行って!/、るが、歯 としての充分な機能を発現しうる特徴的な細胞配置や方向性を再現するものではな い。
また、組織を構成している複数の細胞を単に単離して培養しただけでは、特有の細 胞配置を備えた組織を再構築することが困難であった。
[0007] 従って、本発明の目的は、特有の細胞配置を保持した歯の製造方法及びこの方法 によって製造された歯の集合体並びに歯周組織の製造方法を提供することである。 また、本発明の他の目的は、組織特有の細胞配置を保持した組織の製造方法を提 供することである。
課題を解決するための手段
[0008] 本発明の歯の製造方法は、支持担体の内部に、少なくともいずれか一方が歯胚由 来である間葉系細胞及び上皮系細胞のいずれか一方のみから実質的になる第 1の 細胞集合体と、いずれか他方のみから実質的になる第 2の細胞集合体とを接触させ て配置すること、前記第 1及び第 2の細胞集合体を前記支持担体の内部で培養する こと、を含むことを特徴としている。
[0009] 本発明の歯周組織の製造方法は、支持担体の内部に、少なくともいずれか一方が 歯胚由来である間葉系細胞及び上皮系細胞のいずれか一方のみから実質的になる 第 1の細胞集合体と、いずれか他方のみ力 実質的になる第 2の細胞集合体とを接 触させて配置すること、前記第 1及び第 2の細胞集合体を、歯とこれに連続した歯周 組織とを得るまで培養すること、前記培養によって得られた歯周組織を単離すること、 を含むことを特徴として 、る。 [0010] 支持担体の内部に、少なくともいずれか一方が歯胚由来である間葉系細胞及び上 皮系細胞のいずれか一方のみ力 実質的になる第 1の細胞集合体と、いずれか他方 のみから実質的になる第 2の細胞集合体とを接触させて配置すること、前記第 1及び 第 2の細胞集合体を前記支持担体の内部で培養すること、によって得られた歯の集 合体であることを特徴として 、る。
[0011] 前記両製造方法又は歯の集合体では、前記第 1の細胞集合体及び第 2の細胞集 合体が、共に歯胚由来であることが好ましい。
またここで、前記第 1の細胞集合体及び第 2の細胞集合体が、共に単一細胞集合 物であってもよい。
[0012] また本発明の組織の製造方法は、間葉系細胞と上皮系細胞との相互作用により構 築される組織の製造方法であって、支持担体の内部に、間葉系細胞及び上皮系細 胞のいずれか一方のみ力 実質的になる第 1の細胞集合体と、いずれか他方のみか ら実質的になる第 2の細胞集合体とを接触させて配置すること、前記第 1及び第 2の 細胞集合体を前記支持担体の内部で培養すること、を含むことを特徴として！ヽる。
[0013] 上記組織の製造方法において、前記間葉系細胞及び上皮系細胞の少なくとも一 方が目的となる組織に由来するものであることが好ましい。
また、上記組織は、歯、毛髪、腎臓、肺、肝臓力もなる群より選択されたものであるこ とを特徴としている。
[0014] 本発明では、間葉系細胞又は上皮系細胞のみから実質的になる細胞集合体を、 互いに接触させて支持担体の内部に配置し、培養するので、細胞集合体同士が、他 方の細胞集合体を構成する細胞と混じり合うことなぐ支持担体中で互いに接触した 状態を維持しながら成育する。これにより、組織を形成する際に必要な間葉系細胞と 上皮系細胞との良好な相互作用を効果的に再現することができる。
この結果、目的とする組織に特有の細胞配置を有する組織を作製することができる 。また、間葉系細胞及び上皮系細胞の少なくとも一方を歯胚由来とすることにより、外 側にエナメル質を有し内側に象牙質を有するという特有の細胞配置を備えた歯及び 歯の集合体を作製することができる。
発明の効果 [0015] 本発明によれば、特有の細胞配置を保持した歯の製造方法及びこの方法によって 製造された歯の集合体並びに歯周組織の製造方法を提供することができる。
また、本発明によれば、組織特有の細胞配置を保持した組織の製造方法を提供す るがでさる。
図面の簡単な説明
[0016] [図 1]歯胚の形成を模式的に表した概念図である。
[図 2] (A)〜(D)は、本発明の実施例にかかる、歯胚由来間葉系細胞と上皮系細胞 を用いた歯胚再構築の手順を概念的に示した図である。
[図 3]本発明の比較例 1にかかる正常歯胚組織の位相差顕微鏡像及び染色像と、そ の正常歯胚を腎皮膜下移植して発生させた歯の経時的な染色像である。
[図 4]本発明の実施例 1にかかる歯胚由来上皮組織と歯胚由来間葉系細胞による再 構成歯胚の位相差顕微鏡像と、その再構成歯胚を腎皮膜下移植して発生させた歯 の経時的な染色像である。
[図 5]本発明の実施例 1にかかる歯胚由来上皮組織と GFPマウス由来歯胚由来間葉 系細胞による再構成歯胚の位相差顕微鏡像と、その再構成歯胚を腎皮膜下移植し て発生させた歯の 14日目の染色像である。
[図 6]本発明の実施例 2にかかる GFPマウス由来歯胚由来上皮系細胞と歯胚由来間 葉組織による再構成歯胚の位相差顕微鏡像と、その再構成歯胚を腎皮膜下移植し て発生させた歯の 14日目の染色像である。
[図 7]本発明の実施例 3にかかる歯胚由来上皮系細胞と歯胚由来間葉系細胞による 再構成歯胚の位相差顕微鏡像と、その再構成歯胚を腎皮膜下移植して発生させた 歯の 14日目の染色像である。
[図 8]本発明の比較例 2にかかる歯胚由来上皮組織及び歯胚由来間葉組織の位相 差顕微鏡像と、そのそれぞれを単独で腎皮膜下移植したときの 14日目の染色像で ある。
[図 9]本発明の比較例 3にかかる歯胚由来上皮組織と歯胚由来間葉系細胞を用いた 低密度再構成歯胚の位相差顕微鏡像と、その低密度再構成歯胚を腎皮膜下移植し たときの 20日目の染色像である。 圆 10]本発明の比較例 4にかかる歯胚由来上皮組織と歯胚由来間葉系細胞とを区 画ィ匕することなく高密度に再構成したときの再構成歯胚の位相差顕微鏡像と、その 低密度再構成歯胚を腎皮膜下移植したときの 20日目の染色像である。
[図 11]本発明の実施例 1〜3にかかる再構成歯胚より発生させた歯の周囲にできた 歯周組織である歯槽骨と歯根膜の染色像である。
圆 12]本発明の実施例 2 (移植後 17日目）と比較例 1 (移植後 14日目）にかかる再構 成歯胚より発生させた歯の周囲にできた歯周組織である歯根膜に特異的なぺリオス チン mRNAを検出した染色像である。
圆 13]本発明の実施例 4及び 5と比較例 5にかかる再構成歯胚作製後に培養工程を 延長して、器官培養により発生させた歯の位相差顕微鏡像と染色像である。
圆 14]本発明の実施例 6にかかる歯胚由来上皮系細胞と歯胚由来間葉系細胞によ る再構成歯胚の位相差顕微鏡像と、その再構成歯胚を腎皮膜下移植して発生させ た歯の 14日目の染色像である。
[図 15] (A)は本発明の比較例 6にかかる非移植マウスの抜歯後 14日目の染色像、 ( B)は (A)中の枠内拡大図である。
圆 16]本発明の実施例 6にかかる個別分離した歯胚の口腔内移植後 14日目の染色 像である。
圆 17]本発明の実施例 7にかかる個別分離した歯の口腔内移植後 14日目の染色像 である
圆 18]本発明の実施例 8にかかる毛胞組織由来上皮系細胞と毛胞組織由来間葉系 細胞による再構成毛胞の位相差顕微鏡像と、その再構成毛胞を腎皮膜下移植して 発生させた毛の 14日目の染色像である。
圆 19]本発明の実施例 8にかかる毛胞組織由来上皮系細胞と毛胞組織由来間葉系 細胞による再構成毛胞を腎皮膜下移植して発生させた毛胞の 14日目の実態顕微鏡 写真像である。
圆 20]本発明の比較例 7にかかる毛胞組織由来上皮系細胞と毛胞組織由来間葉系 細胞による再構成毛胞の位相差顕微鏡像と、その再構成毛胞を腎皮膜下移植して 発生させた毛胞の 14日目の染色像である。 発明を実施するための最良の形態
[0017] 本発明の歯の製造方法は、支持担体の内部に、少なくともいずれか一方が歯胚由 来である間葉系細胞及び上皮系細胞のいずれか一方のみから実質的になる第 1の 細胞集合体と、いずれか他方のみから実質的になる第 2の細胞集合体とを接触させ て配置すること (配置工程)、前記第 1及び第 2の細胞集合体を前記支持担体の内部 で培養すること (培養工程)、を含むものである。
[0018] 本製造方法では、少なくともいずれか一方が歯胚由来である間葉系細胞と上皮系 細胞とを細胞集合体として、支持担体の内部で接触させて成育させるので、緊密な 接触状態によって細胞間相互作用を効果的に再現することができ、内側に象牙質、 外側にエナメル質という歯に特有の細胞配置を有する歯を製造することができる。
[0019] 本発明にお ヽて、「歯」とは、内側に象牙質及び外側にエナメル質の層を連続して 備えた組織をいい、好ましくは、これらの層構造を備え且つ歯冠や歯根を有する方向 性を備えた組織をいう。象牙質及びエナメル質は、当業者には、組織染色などによつ て形態的に容易に特定することができる。また、エナメル質は、エナメル芽細胞の存 在によって特定することができ、エナメル芽細胞の存在は、ァメロジェニンの有無によ つて確認することができる。一方、象牙質は、象牙芽細胞の存在によって特定するこ とができ、象牙質芽細胞の存在は、デンチンシァ口プロテインの有無によって確認す ることができる。ァメロジェニン及びデンチンシァ口プロテインの確認はこの分野で周 知の方法によって容易に実施することができ、例えば、 in situハイブリダィゼーシヨン 、抗体染色等をあげることができる。
また、歯の方向性は、歯冠や歯根の配置によって特定することができる。歯冠や歯 根は、形状や組織染色などに基づ 、て目視にて確認することができる。
[0020] また本発明にお ヽて「歯周組織」とは、歯の主として外層の形成された歯槽骨及び 歯根膜をいう。歯槽骨及び歯根膜は、当業者には、組織染色などによって形態的に 容易に特定することができる。
なお、本発明において「間葉系細胞」とは、間葉組織由来の細胞を意味し、「上皮 系細胞」とは上皮組織由来の細胞を意味する。
[0021] 本発明にお 、て「歯胚」及び「歯芽」は、後述する発生段階に基づ!/、て区別された ものに特に言及する場合に用いられる表現である。この場合の「歯胚」とは、将来歯 になることが決定付けられた歯の初期胚であり、歯の発生ステージで一般的に用いら れる蕾状期（Bud stage)力 鐘状期（Bell stage)までの段階であり、特に歯の硬組織 としての特徴である象牙質、エナメル質の蓄積が認められない組織であり、「歯芽」と は本発明で用いられる「歯胚」の段階移行の、歯の硬組織の特徴である象牙質、ェ ナメル質の蓄積が始まった段階力 歯が歯肉から萌芽して一般的に歯としての機能 を発現する前の段階の組織を 、う。
[0022] 歯胚は、図 1に示されるように個体発生の過程で、蕾状期、帽状期、鐘状前期及び 後期の各ステージを経て行われる。ここで、蕾状期では、上皮系細胞が間葉系細胞 を包むように陥入し（図 1 (A)及び (B)参照）、鐘状前期及び鐘状後期に至ると、上皮 系細胞部分が外側のエナメル質となり、間葉系細胞部分が内部に象牙質を形成する ようになる（図 1 (C)及び (D)参照)。従って、上皮系細胞と間葉系細胞との細胞間相 互作用によって歯胚が形成する。
本発明における間葉系細胞及び上皮系細胞は、歯胚を形成する又は形成する可 能性がある上記蕾状期から鐘状後期までのもの（以下、単に「歯胚」と!、う）であれば よぐ細胞の分ィ匕段階の幼若性と均質性の観点力 蕾状期から帽状期力 のもので あることが好ましい。
[0023] また、「細胞集合体」とは、細胞が密集した状態を! 、、組織の状態であっても、単 一細胞の状態であってもよい。また「実質的になる」とは、対象となる細胞以外のもの をできるだけ含まないことを意味する。各々の細胞集合体は、組織自体若しくはその 一部、又は単一細胞の集合体とすることができるため、いずれか一方が単一細胞で 構成された細胞集合体であってもよぐ共に単一細胞で構成された細胞集合体であ つてもよいが、本発明によって組織の再構成を効率よく達成するためには、共に単一 細胞で構成されて ヽることが好ま ヽ。
第 1の細胞集合体第 2の細胞集合体は、 V、ずれが上皮系細胞及び間葉系細胞で あってもよぐこの細胞集合体を構成する細胞の数は、動物の種類や、支持担体の 種類、硬さ及び大きさによって異なるが、細胞集合体 1個あたり、一般に ΙΟ^ΙΟ8個 、好ましくは 103〜108個とすることができる。 [0024] 配置工程では、支持担体の内部に、第 1の細胞集合体と第 2の細胞集合体とを接 触させて配置する。
本発明の製造方法における配置工程では、上記第 1及び第 2の細胞集合体を、細 胞の接触状態を保持可能な支持担体の内部に配置するので、それぞれの細胞集合 体を構成する細胞が、他方の細胞集合体を構成する細胞と混じり合うことがない。こ のように配置工程では、各細胞集合体を混合することなく配置するので、細胞集合体 の間に境界線が形成される。このような配置形態を、本明細書中では適宜「区画化」 と表現する。
[0025] ここで、第 1の細胞集合体と第 2の細胞集合体は、間葉系細胞及び上皮系細胞から 実質的に構成されるように、別個の調製工程 (第 1の細胞調製工程及び第 2の細胞 調製工程）によって調製される。
本製造方法で用いられる間葉系細胞及び上皮系細胞は、生体内での細胞配置を 再現して特有の構造及び方向性を有する歯を効果的に形成するために、少なくとも Vヽずれか一方が歯胚に由来するものであればょ 、が、確実に歯を形成させるために は、間葉系細胞及び上皮系細胞のいずれもが共に歯胚由来であることが最も好まし い。
[0026] 歯胚以外に由来する間葉系細胞としては、生体内の他の間葉系組織に由来する 細胞であり、好ましくは、血液細胞を含まない骨髄細胞や間葉系幹細胞、さらに好ま しくは口腔内間葉系細胞や顎骨の内部の骨髄細胞、頭部神経堤細胞に由来する間 葉系細胞、前記間葉系細胞を生み出しうる間葉系前駆細胞やその幹細胞等を挙げ ることがでさる。
また、歯胚以外に由来する上皮系細胞としては、生体内の他の上皮系組織に由来 する細胞であり、好ましくは、皮膚や口腔内の粘膜や歯肉の上皮系細胞、さらに好ま しくは皮膚や粘膜などの分ィ匕した、例えば角化した、あるいは錯角化した上皮系細胞 を生み出しうる未熟な上皮系前駆細胞、たとえば非角化上皮系細胞やその幹細胞 等を挙げることができる。
[0027] 歯胚及び他の組織は、哺乳動物の霊長類、例えばヒト、サルなど、有蹄類、例えば 豚、牛、馬など、小型哺乳類の齧歯類、例えばマウス、ラット、ゥサギなどの種々の動 物の顎骨等力も採取することができる。歯胚及び組織の採取は、通常、組織の採取 で用いられる条件をそのまま適用すればよぐ無菌状態で取り出し、適当な保存液に 保存すればよい。なお、ヒトの歯胚としては、第 3大臼歯いわゆる親知らずの歯胚の 他、胎児歯胚を挙げることができるが、自家組織の利用との観点から、親知らず歯胚 を用いることが好ましい。
[0028] この歯胚力 の間葉系細胞及び上皮系細胞の調製は、まず周囲の組織力 単離さ れた歯胚を、形状に従って歯胚間葉組織及び歯胚上皮組織に分けることによって行 われる。このとき、歯胚組織は顕微鏡下で構造的に見分けることが可能であるため、 解剖用ハサミゃピンセット等で切断、あるいは引き剥がすことによって容易に分離す ることができる。また、歯胚組織からの歯胚間葉組織及び歯胚上皮組織の分離は、そ の形状に従って注射針、タングステン-一ドル、ピンセット等で切断、あるいは引き剥 がすことにより容易に行うことができる。
好ましくは、周囲組織から歯胚細胞を容易に分離するため及び Z又は歯胚組織か ら上皮組織及び間葉組織を分離するために、酵素を用いてもよい。このような用途に 用いられる酵素としては、デイスパーゼ、コラーゲナーゼ、トリプシン等を挙げることが できる。
[0029] 間葉系細胞及び上皮系細胞は、それぞれ間葉糸且織及び上皮糸且織から単一細胞の 状態に調製してもよい。調製工程では、単一の細胞に容易に分散可能とするために 、酵素を用いてもよい。このような酵素としては、デイスパーゼ、コラーゲナーゼ、トリプ シン等を挙げることができる。このとき、上皮組織からの上皮系細胞の分離にはコラー ゲナーゼ処理後にトリプシン処理と DNase処理をすることが好ましい。他方、間葉組 織からの間葉系細胞の分離には、コラーゲナーゼとトリプシンで同時に処理し、最終 的に DNase処理をすることが好ましい。このとき DNase処理を行うのは、酵素処理に より一部の細胞がダメージをうけ、細胞膜が溶解したときに溶液中に放出される DNA によって細胞が凝集し細胞の回収量が低下することすることを防ぐためである。
[0030] なお、間葉系細胞及び上皮系細胞は、それぞれ充分な細胞数を得るために、配置 工程に先立って予備的な培養を経たものであってもよ!/ヽ。間葉系細胞及び上皮系細 胞の培養は、一般に動物細胞の培養に用いられる温度等の条件をそのまま用いるこ とがでさる。
培養に用いられる培地としては、一般に動物細胞の培養に用いられる培地、例え ばダルベッコ改変イーグル培地（DMEM)等を用いることができ、細胞の増殖を促進 するための血清を添加する力、あるいは血清に代替するものとして、例えば FGF、 E GF、 PDGF等の細胞増殖因子やトランスフェリン等の既知血清成分を添加してもよ い。なお、血清を添加する場合の濃度は、そのときの培養状態によって適宜変更す ることができるが、通常 10%とすることができる。細胞の培養には、通常の培養条件、 例えば 37°Cの温度で 5%CO濃度のインキュベーター内での培養が適用される。ま
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た、適宜、ストレプトマイシン等の抗生物質を添加したものであってもよい。
[0031] 本発明で用いられる支持担体としては、細胞を内部で培養可能なものであればよく 、好ましくは、上記培地との混合物である。このような支持担体としては、コラーゲン、 フイブリン、ラミニン、細胞外マトリクス混合物、ポリグリコール酸 (PGA)、ポリ乳酸 (PL A)、乳酸 Zグリコール酸共重合体 (PLGA)、セルマトリクス（商品名）、メビオールゲ ル (商品名）、マトリゲル (商品名）等を挙げることができる。これらの支持担体は、細 胞を内部に配置したときに配置した位置をほぼ維持可能な程度な硬さを有するもの であればよぐゲル状、繊維状、固体状のものを挙げることができる。ここで、細胞の 位置を維持可能な硬さとは、通常、三次元培養として適用される硬さ、即ち、細胞の 配置を保持できると共に増殖による肥大化を阻害しな 、硬さであればよく、容易に決 定することができる。例えば、コラーゲンの場合、最終濃度 2. 4mgZmlの濃度での 使用が適切な硬さを提供する。
なお、ここで支持担体は、第 1及び第 2の細胞集合体が担体内部で成育することが できる程度の厚みを有すればよぐ目的とする組織の大きさ等によって適宜設定する ことができる。
[0032] また、支持担体は、細胞の接触状態を保持可能であればよ!/、が、ここで 、う「接触 状態」とは、各細胞集合体において、また細胞集合体間において、確実に細胞相互 作用させるために高密度の状態であることが好ま 、。
高密度の状態とは、組織を構成する際の密度と同等程度であることをいい、例えば 、細胞集合体の場合、細胞配置時で 5 X 107〜1 X 109個/ ml、細胞の活性を損な わずに確実に細胞相互作用させるため好ましくは 1 X 108〜1 X 109個 Zml、最も好 ましくは 2 X 108〜8 X 108個/ mlの密度をいう。このような細胞密度に細胞集合体を 調製するには、細胞を遠心によって凝集させ沈殿ィ匕することが細胞の活性を損なわ ずに簡便に高密度化できるため好ましい。このような遠心は、細胞の生存を損ねない 300〜 1200 X g、好ましくは 500〜 1000 X gの遠心力に該当する回転数で 3〜 10 分間おこなえばよい。 300 X gよりも低い遠心では、細胞の沈殿が不十分となって細 胞密度が低くなる場合があり、一方、 1200 X gよりも高い遠心では細胞が損傷を受け る場合があるため、それぞれ好ましくない。
[0033] 遠心分離によって高密度の細胞を調製する場合には、通常、細胞遠心分離するた めに用いられるチューブ等の容器に単一細胞の懸濁液を調製した後に遠心分離し、 沈殿物としての細胞を残して上清をできるだけ取り除けばよ 、。このときに使用される チューブ等の容器は、上清を完全に除去する観点から、シリコーンコートされたもの であることが好ましい。
[0034] 遠心分離による沈殿物とした場合には、沈殿物をそのまま支持担体の内部に配置 すればよい。このとき、目的とする細胞以外の成分 (例えば、培養液、緩衝液、支持 担体等）は、細胞の容量と等量以下であることが好ましぐ目的とする細胞以外の成 分を含まないことを最も好ましい。このような高密度の細胞集合体では、細胞が緊密 に接触しており、細胞間相互作用が効果的に発揮される。
[0035] 組織の状態で使用する場合には、酵素処理等を行って、対象となる細胞以外の結 合組織等を除去することが好ましい。目的とする細胞以外の成分が多い場合、例え ば細胞の容量と等量以上になると、細胞間相互作用が充分に発揮されないため、好 ましくない。
[0036] また、第 1の細胞集合体と第 2の細胞集合体の接触は密接であるほど好ましぐ第 1 の細胞集合体に対して第 2の細胞集合体を押し付けて配置することが特に好ましい。 また、第 1の細胞集合体と第 2の細胞集合体との周囲を培養液、酸素透過を阻害しな い固形物で包み込むことも、細胞集合体同士の接触を密接にするのに有効であり、 粘度の異なる溶液に密度の高 ヽ細胞懸濁液を入れて配置させ、溶液をそのまま固 ィ匕することも、細胞の接触の保持を容易に達成できるため、好ましい。このとき、第 1 の細胞集合体を歯胚間葉系細胞の単一細胞集合物とし、第 2の細胞集合体を歯胚 上皮組織とした場合には、歯胚上皮組織のエナメル結節が第 1の細胞集合体に接触 するように配置することが好ま 、が、これに限定されな 、。
[0037] 支持担体がゲル状、あるいは溶液状等の場合には、配置工程の後に支持担体を 固化する固化工程を設けてもよい。固化工程によって、支持担体内部に配置された 細胞が支持担体内部に固定化される。支持担体の固化には、一般に用いた支持担 体の固化条件をそのまま適用すればよい。例えば支持担体にコラーゲン等の固化可 能な化合物を用いた場合には、通常適用される条件で、例えば培養温度下で数分 〜数十分間静置させることにより、固化することができる。これにより、支持担体内部 における細胞間の結合を固定ィ匕できると共に、強固なものにすることができる。
[0038] 本発明の製造方法における培養工程では、第 1の細胞集合体及び第 2の細胞集 合体を支持担体内部で培養する。この培養工程では、互いに緊密に接触された第 1 の細胞集合体及び第 2の細胞集合体によって細胞間相互作用が効果的に行われて 、組織、即ち歯が再構成される。
培養工程は、支持担体によって第 1の細胞集合体と第 2の細胞集合体との接触状 態が維持されて行われればよぐ第 1及び第 2の細胞集合体を有する支持担体単独 による培養であっても、他の動物細胞の存在下での培養であってもよ 、。
培養期間としては、支持担体内部に配置された細胞数及び細胞集合体の状態、更 には培養工程の実施条件によって異なる力 一般に、 1〜300日、エナメル質を外側 に有し、象牙質を内側に有する歯を形成するためには、好ましくは 1〜120日、迅速 に提供可能とする観点からは、好ましくは 1〜60日とすることができる。更に歯周組織 を備えた歯とするためには、一般に 1〜300日、好ましくは 1〜60日とすることができ る。
[0039] 支持担体のみによる培養とした場合には、動物細胞の培養に用いられる通常の条 件下での培養とすることができる。ここでの培養は、一般に動物細胞での培養条件を そのまま適用すればよぐ前述した条件をそのまま適用することができる。また培養に は、哺乳動物由来の血清を添加してもよぐまたこれらの細胞の増殖や分化に有効 であることが既知の各種細胞因子を添カ卩してもよい。このような細胞因子としては、 F GF、 BMP等を挙げることができる。
また、組織や細胞集合体のガス交換や栄養供給の観点から器官培養を用いること が好ましい。器官培養では、一般に、動物細胞の増殖に適した培地上に多孔性の膜 をフロートさせ、その膜上に支持担体で包埋された細胞集合体を置 1ヽて培養を行う。 ここで用いられる多孔性の膜には、 0. 3〜5 m程度の孔を多数有した膜であること が好ましぐ具体的にはセルカルチャーインサート（商品名）、ァイソポアフィルター（ 商品名）を挙げることができる。
[0040] 他の動物細胞の存在下での培養の場合には、動物細胞力 の各種サイト力イン等 の作用を受けて、早期に特有の細胞配置を有する歯を形成することができるので、好 ましい。このような他の動物細胞の存在下での培養は、単離細胞や培養細胞を用い て生体外での培養によって行ってもょ 、。
[0041] また、第 1及び第 2の細胞集合体を有する支持担体を生体へ移植して生体内で培 養を行うことが、歯及び Z又は歯周組織の形成を早期に行うことができるため、特に 好ましい。この場合、支持担体と共に第 1及び第 2の細胞集合体が生体内へ移植さ れる。
この用途に利用可能な動物は、哺乳動物、例えばヒト、豚、マウス等を好ましく挙げ ることができ、歯胚組織と同一の種に由来するものであることが更に好ましい。ヒト歯 胚組織を移植する場合には、ヒト、又は免疫不全に改変したヒト以外の他の哺乳動物 を用いることが好ましい。このような生体内成育に好適な生体部位としては、動物細 胞の器官や組織をできる限り正常に発生させるためには、腎臓皮膜下、腸間膜、皮 下移植等が好ましい。
移植による成育期間としては、移植時の大きさと発生させる歯の大きさによって異な るが、一般に、 3〜400日とすることができる。例えば、腎臓皮膜下への移植期間は 移植する培養物の大きさと再生させる歯の大きさによっても異なるが、歯の再生と移 植先で発生させる歯の大きさの観点から 7〜60日間であることが好ましい。
[0042] 生体への移植を行う前に、生体外での培養 (前培養)を行ってもよ!ヽ。この前培養 によって細胞間の結合と第 1及び第 2の細胞集合体同士の結合を強固にして、細胞 間相互作用をより強固にすることができるため好ましい。その結果、全体の成育期間 を短縮することができる。
前培養の期間は短期であっても長期であってもよい。長期間、例えば 3日以上、好 ましくは 7日以上とした場合には、歯胚力 歯芽に発生させることができるので、移植 後に歯ができるまでの期間を短縮することもできるため好ましい。前培養の期間として は、例えば腎臓皮膜下へ移植を行う場合の器官培養として、好ましくは 1〜7日とする ことが効率よく歯を再生するために好まし 、。
[0043] 本発明の製造方法によって製造された歯は、内側に象牙質、外側にエナメル質と いう歯としての特有の細胞配置 (構造)を有するものであり、また好ましくは、更に歯の 先端 (歯冠)と歯根という方向性も備えているものである。少なくともこのような特有の 細胞配置、好ましくは細胞配置に加えて方向性を有することによって、歯としての機 能も発揮できるものである。このため、歯の代替物として広く利用することが可能であ る。特に、自家の歯胚に由来した間葉系細胞及び上皮系細胞を用いた場合には、拒 絶反応による問題を回避しつつ使用することができる。また一般に移植抗原が適合し た他人の歯胚に由来する細胞を用いる場合にも拒絶反応による問題を回避すること が可能である。
[0044] さらに本発明では、培養期間を延長させることによって、歯そのものに加えて、歯を 顎骨上で支持し、固定化する歯槽骨や歯根膜などの歯周組織も形成させることがで きる。この結果、移植後に実用可能な歯を提供することが可能である。
即ち、本発明の歯周組織の製造方法は、上記培養工程を、支持担体に内部で、前 記第 1及び第 2の細胞集合体を、歯とこれに連続する歯周組織とを得るまで培養する 工程 (培養工程)とし、更に、前記培養によって得られた歯周組織を単離する工程と、 を含むことを特徴として 、る。
この方法では、歯周組織が得られるまで延長された培養期間によって、歯に連続し て歯周組織を形成させ、歯から分離することにより、歯周組織のみを得ることができる 。歯周組織の単離は、培養工程の過程で形成された歯周組織と歯とを分離すること ができる如何なる方法によって行ってもよぐピンセット等による分離や、酵素による部 分消化等を挙げることができる。
なお上記歯の製造方法において説明した事項は、培養期間を制限しない限り、い ずれも本歯周組織の製造方法にも適用することができる。
[0045] 本発明の上記歯の製造方法及び歯周組織の製造方法によって得られた歯及び歯 周組織は、移植片として用いられる他、歯の発生過程を解明するための研究にも好 ましく利用することができ、今後の歯に関連する組織発生のために有効なリサーチッ ールとして利用することができる。
なお、得られた歯又は歯周組織を移植片として用いる場合には、製造方法におけ る培養工程を、他の動物細胞との接触がなく且つ全行程 in vitroで調製することがで きる器官培養としたものであることが好まし 、。
[0046] 本発明の歯の集合体は、上記歯の製造方法によって得られた歯特有の細胞配置 を有する歯の集合体である。
このような歯の集合体は、歯特有の細胞配置を有する複数の歯で構成されて 、る ため、個々の歯を集合体から分離して、以下に述べるように 1つの歯の移植片として 用いることができる。このように本発明の歯の製造方法は、複数の歯を同時に作製し た場合には、複数の歯で構成された歯の集合体としても歯を提供することができる。 この結果、移植片としての歯を効率よく作製することができる。
[0047] 歯の集合体は、上記歯の製造方法をそのまま適用することにより、容易に得ること ができる。特に、上記第 1及び第 2の細胞調製工程において第 1及び第 2の細胞集合 体をそれぞれ調製し、配置工程において互いに接触させて支持担体内部に配置さ せるため、支持担体内部に、本来 1つの歯を形成する細胞群から複数の歯を容易に 形成することができる。
歯の集合体の製造方法において、第 1及び第 2の細胞集合体は、複数本の歯が発 生するための歯胚の再誘導を容易にするために共に単一細胞により構成されて 、る ことが好ましい。なお、培養工程は、前記と同様に、器官培養であっても腎臓皮膜下 での培養であってもよいが、得られた歯を移植片として用いる場合には、他の動物細 胞との接触がなく且つ全行程 in vitroで調製することができる器官培養とすることが好 ましい。
[0048] また、本発明には、歯の移植方法が含まれる。この移植方法では、上記歯の集合 体を得る工程と、歯の集合体から個々の歯を分離する工程と、分離された歯を、移植 部位での他の歯と同一の方向性となるように揃えて移植する工程とを含む。
これにより、歯の移植を、特有の細胞配置と方向性を備えた複数の歯を同時に得て 、効率よく実施することができる。
[0049] 本発明〖こよる歯は、歯の欠損及び損傷を伴う各種症状、例えば、齲蝕、辺縁性歯 周炎 (歯槽膿漏)、歯周病による歯の欠損、事故などによる折損や脱落等の治療又 は処置に適用することもできる。
即ち、本発明の治療方法は、本発明による製造方法によって得られた歯及び Z又 は歯周組織を、欠損及び Z又は損傷部位へ移植することを含む。これにより、欠損 及び Z又は損傷部位の上記症状を治療及び Z又は緩和することができる。
本発明の他の治療方法は、本発明における培養工程のみ、或いは、配置工程及 び培養工程を、欠損及び/又は損傷部位において実施させることを含む。この場合
、支持担体としては、上述したものに加えて、欠損及び Z又は損傷部位の周囲組織 そのものを支持担体として適用してもよい。これにより、生体内での周辺組織からのサ イト力イン等によって、より迅速に欠損及び Z又は損傷部位の治療等を行うことができ る。
[0050] 本発明では、間葉系細胞及び上皮系細胞の細胞間相互作用に基づ!/、て効果的に 組織を再構成させることができるので、間葉系細胞と上皮系細胞との相互作用により 構築される組織の製造方法も提供することができる。
即ち、本発明の組織の製造方法は、間葉系細胞と上皮系細胞との相互作用により 構築される組織の製造方法であって、支持担体内部に、間葉系細胞及び上皮系細 胞のいずれか一方のみ力 実質的になる第 1の細胞集合体と、いずれか他方のみか ら実質的になる第 2の細胞集合体とを接触させて配置すること、前記第 1及び第 2の 細胞集合体を前記支持担体の内部で培養すること、を含む。
なお上記歯の製造方法において説明した事項は、特記しない限り、いずれも本組 織の製造方法にも同様に適用することができる。
[0051] 本組織の製造方法によって製造される組織としては、間葉系細胞及び上皮系細胞 の細胞間相互作用により構築される組織が該当し、上述した歯に加えて、毛髪、腎 臓、肺、肝臓等を挙げることができ、これらの組織全体であってもその一部であっても よい。
このとき、間葉系細胞と上皮系細胞の少なくとも一方は、目的とする組織に由来す るものであることが好ましい。これにより、目的とする組織へ方向付けが既に行われて いる細胞を用いて容易に組織を形成することができる。また、より確実に目的とする組 織を製造するには、共に目的とする組織に由来することが最も好ましい。
[0052] 間葉系細胞及び上皮系細胞からそれぞれ構成される細胞集合体を調製するため に用いられる組織としては、歯の場合には、歯胚ゃ歯髄細胞、歯根膜細胞、口腔内 上皮 ·間葉細胞、毛髪の場合には、発生過程の毛胞器官原基や成体の毛胞組織、 腎臓の場合には、発生過程の腎臓器官原基や成体の腎臓組織、肺の場合には、発 生過程の肺器官原基や成体の肺組織、肝臓の場合には、発生過程の肝臓器官原 基や成体の肝臓組織を挙げることができる。
これらから各細胞集合体を調製するには、前述したように、組織力 間葉系細胞と 上皮系細胞とを分離して前記同様にして第 1及び第 2細胞集合体を調製し、前記同 様にして、支持担体内部へ配置し、培養及び Z又は移植すればよい。
これにより、前述した歯と同様に、目的とする組織に特有の細胞配置を有する組織 を得ることができる。
[0053] 以下に本発明の実施例について説明する力 これに限定されるものではない。また 実施例中の％は、特に断らない限り、重量 (質量)基準である。
実施例
[0054] [実施例 1〜3及び比較例 1〜4]
(1)歯胚上皮系細胞と歯胚間葉系細胞の調製
歯の形成を行うために、歯胚の再構築を行った。この実験モデルとしてマウスを用 いた。
C57BLZ6Nマウス（日本クレアから購入）又は Green Fluorescence Protein (EGF P)トランスジエニックマウスである C57BLZ6— TgN (act— EGFP) OsbC14— Y01— FM1 31 (GFPマウス：理研バイオリソースセンター）の胎齢 14. 5日、胚仔から下顎切歯歯 胚組織を顕微鏡下で常法により摘出した。下顎切歯歯胚組織を Ca2+, Mg2+不含リン 酸緩衝液 (PBS (―) )で洗浄し、 PBS (―)に最終濃度 1. 2UZmlの Dispase II (Roc he, Mannheim, Germany)を添カ卩した酵素液で室温にて 12. 5分間処理した後、 10% FCS (JRH Biosciences, Lenexa, KS)を添カ卩した DMEM (Sigma, St. Louis, MO)で 3 回洗浄した。さらに DNase I溶液（Takara, Siga, Japan)を最終濃度 70UZmlになるよ う添カ卩し歯胚組織を分散させ、 25G注射針（Terumo, Tokyo, Japan)を用いて外科的 に歯胚上皮組織と歯胚間葉組織を分離した。
[0055] 歯胚上皮系細胞は、上記により得られた歯胚上皮組織を PBS (—）で 3回洗浄し、 P BS (—）に最終濃度 lOOUZmlの Collagenase I (Worthington, Lakewood, NJ)を溶 解した酵素液で 37°Cにて 20分間の処理を 2回繰り返した。遠心分離によって沈殿回 収した細胞を、さらに 0. 25% Trypsin (Sigma)— PBS (—）で 37°C、 5分間処理した。
10%FCS添カ卩 DMEMで、細胞を 3回洗浄した後、細胞に最終濃度 70UZmlの DN ase I溶液を添加して、ピペッティングにより単一の歯胚上皮系細胞を得た。
一方、歯胚間葉系細胞は、歯胚間葉組織を PBS (—）で 3回洗浄し、 0. 25%Tryps in (Sigma), 50UZmlの Collagenase I (Worthington)を含む PBS (—）で処理した。 7 OUZmlの DNase I (Takara)を添カ卩して、ピペッティングにより単一の歯胚間葉系細 胞を得た。
[0056] (2)再構成歯胚の作製
次に、上記で調製された歯胚上皮系細胞及び歯胚間葉系細胞を用いて、歯胚再 構築を行った。
シリコングリースを塗布した 1. 5mLマイクロチューブ（Eppendorf, Hamburg, Germa ny)に、 10%FCS (JRH Biosciences)添加 DMEM (Sigma)で懸濁した歯胚上皮系細 胞、あるいは歯胚間葉系細胞を入れ、遠心分離 (580 X g)により細胞を沈殿として回 収した。遠心後の培養液の上清をできる限り除去し、再度遠心操作を行い、実体顕 微鏡で観察しながら細胞の沈殿周囲に残存する培養液を GELoader Tip 0, 5 - 20 μ L (eppendorf)を用いて完全に除去し、再構成歯胚作製に用いる細胞を準備した。 シリコングリースを塗布したペトリディッシュに、 2. 4mg/mlの濃度に上記培養液で 調製した Cellmatrix type I— A (Nitta gelatin, Osaka, Japan)を 30 μ L滴下してコラー ゲンゲル溶液のドロップ (ゲルドロップ)を作製した。この溶液に、上記歯胚上皮系細 胞、あるいは歯胚間葉系細胞の遠心後の沈殿を、 0. 1 10 /z Lのピペットチップ（Q uality Scientific plastics)を用いて、 0. 2— 0. 3 μ Lアプライして、細胞集合体としての 細胞凝集塊を作製した。
[0057] これを、図 2を参照して説明する。
ピペットチップ 16で先にゲルドロップ 10内に配置された細胞凝集塊 12は、ゲルドロ ップ 10内で球体を構成する（図 2 (B)参照)。この後に他方の細胞凝集塊 14を押し 込むことによって、球体の細胞凝集塊 12がつぶされて、他方の細胞凝集塊 14を包 むようになることが多い（図 2 (C)参照)。その後にゲルドロップ 10を固化させることに より、細胞間の結合が強固になる（図 2 (D)参照)。
[0058] 本実施例では、細胞集合体として、上皮系細胞又は間葉系細胞の単一細胞からな る細胞凝集塊と、歯胚のうち、上皮系細胞力 なる部分組織及び間葉系細胞力 な る部分組織とを、それぞれ調製して用いた。
本実施例にぉ ヽて、細胞凝集塊と組織とによる再構成歯胚を組み合わせる場合 ( 実施例 1及び 2)には、歯胚上皮系細胞、あるいは間葉系細胞から作製した細胞凝 集塊に、上皮系細胞又は間葉系細胞力 なる部分組織をゲルドロップ中に移した後 、それぞれの組織の歯胚における組織境界面側を、タングステン針を用いて細胞凝 集塊に密着させて再構成歯胚を作製した。
一方、単一細胞にした歯胚上皮系細胞と歯胚間葉系細胞を用いた再構成歯胚 (実 施例 3)では、先に作製した歯胚間葉系細胞の細胞凝集塊に接するように、歯胚上 皮系細胞を同様の方法によりアプライして細胞凝集塊を作製し、両者が互いに密接 するようにして再構成歯胚を作製した。
[0059] ゲルドロップ中で作製した再構成歯胚は、 COインキュベーターに 10分間静置して
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Cellmatrix typeト A (Nitta Gelatin)を固化し、 10%FCS (JRH)添カ卩 DMEM (Sigma) にセルカルチャーインサート（ポアサイズが 0. 4ミクロンの PETメンブレン； BD, Frankl in Lakes, NJ)が接するようにセットした培養容器のセルカルチャーインサートの膜上 に、細胞凝集塊を支持担体である周囲のゲルと共に移して、 18— 24時間、器官培 養した。培養後、周囲のゲルごと 8週齢 C57BLZ6の腎皮膜下に移植して異所的な 歯の発生を進行させるか、セルカルチャーインサート上での器官培養を継続し、歯の 発生を解析した。 また比較例としては、歯胚組織をそのまま腎皮膜下に移植したもの（比較例 1)と、 歯胚から分離した上皮組織と間葉組織をそれぞれ単独で移植したもの (比較例 2)、 また細胞の容量と等量の培養液を含む低密度凝集塊を用いたもの（比較例 3)と、歯 胚から分離して上皮細胞と間葉細胞を混合して上皮細胞と間葉細胞を区画化するこ となく支持担体中で細胞凝集塊を形成させたもの (比較例 4)とを、それぞれ上記と同 様にして調製し、同様に解析した。なお、比較例 4において、上皮細胞と間葉細胞と の混合は、それぞれ 1対 1の比率で穏やか混合した後、実施例 1〜3と同様にして、 再構成歯胚作製に用いる 1の細胞凝集塊として調製した。
[0060] (3)組織学的解析
腎皮膜下に移植の場合には、移植後 7日目、あるいは 14日目に周囲の腎組織ごと 再構成歯胚を摘出し、 4%パラホルムアルデヒド—リン酸緩衝液で 6時間固定した後 、 4. 5%の EDTA (pH7. 2)で 24時間脱灰し、常法によりパラフィン包埋して、 10 mの切片を作製した。組織学的解析のためには常法に従い、へマトキシリン ェォジ ン染色を行った。
再構成歯胚に GFPマウス由来の歯胚を用いた場合は、 50% (wZv)スクロース一 4%パラホルムアルデヒド リン酸緩衝液で 18時間固定した後、 4. 5%の EDTA (p H7. 2)で 24時間脱灰し、 OCT compound (Miles Inc., Naperville, IL)に包埋して、ク リオスタツト（Leica, Wetzlar, Germany)で 10 mの切片を作製し、蛍光顕微鏡（Zeiss 社製)で観察した。
歯胚組織のまま培養した結果を図 3に、本発明の製造方法に従って培養した結果 を図 4〜7に示す。
[0061] 摘出された歯胚のまま腎皮膜下移植を行った比較例 1では、図 3に示されるように、 歯胚を構成している間葉系細胞と上皮系細胞との細胞間相互作用が損なわれない ため、上皮系細胞に由来するエナメル質、間葉系細胞に由来する象牙質と歯髄が形 成されており、エナメル質及び象牙質を所定の位置に配置すると共に、歯先端部と 歯根を有する歯が形成された。
[0062] 一方、図 4〜6に示されるように、本発明に従って、歯胚から調製された単一細胞形 態を用いた場合、即ち、歯胚上皮組織に歯胚間葉系細胞を組み合わせて再構成し た場合 (実施例 1、図 4及び図 5参照）と、歯胚上皮系細胞に歯胚間葉組織を組み合 わせて再構成した場合 (実施例 2、図 6参照）には、それぞれ、内側に象牙質及び外 側にエナメル質を有する特有の細胞配置を備えた歯を、 11〜14日の期間で腎皮膜 下移植により発生させることができた。ここで得られた歯は、歯胚をそのまま培養して 得られた正常発生のもの（図 3)と同様の歯を再構成できることが示された。
[0063] 更に、図 4に示されるように、本再構成と腎皮膜下移植によって、移植後 11日目に は、外側のエナメル質、エナメル芽細胞、エナメル芽細胞、象牙質、象牙芽細胞が容 易に認められた。歯根部分も、正常発生と変わらず、歯根部分の外周には歯槽骨も 認められた。また、経時観察によれば、移植後 3日目には象牙質、象牙芽細胞が容 易に認められ、組織配置上、歯の特徴的構造の形成が開始されていた。また 7日目 には象牙質の蓄積と、象牙芽細胞、エナメル芽細胞も存在しており、その後、歯の発 生が進行した (データ示さず)。
またゲルドロップ内に配置された直後には、細胞凝集塊を構成する細胞が顕微鏡 下で単独で存在することが認められる力 1日の短期の培養によって、摘出した正常 歯胚と同様に、細胞の結合が強固になり、ひとつのまとまりのある組織へと変化した。 このことから、移植前の短期の培養が歯の形成に有効であることが示された。
[0064] また、 GFPマウス由来の間葉系細胞を用いた場合には内側の間葉細胞由来の歯 髄細胞と象牙芽細胞に局在しており（図 5)、一方、 GFPマウス由来の上皮系細胞を 用いた場合には外側のエナメル芽細胞に局在していることが示され、使用した細胞 種と蛍光とがー致していた（図 6)。従って、正常発生と同様に細胞相互作用が行わ れて、発生における細胞の方向性が損なわれずに組織の再構成が行われたことが 明らかであった。
[0065] なお、腎皮膜下での移植を適用せず、器官培養を継続した場合であっても、培養 開始力ゝら経時的に培養した再構成歯胚は次第に大きくなり、移植後 16日目には、象 牙質、象牙芽細胞が容易に認められ、組織配置上、歯の特徴的構造の形成が認め られた (データ示さず)。このような器官培養による構築は、一方を組織として用いた 場合のみならず、上皮系細胞及び間葉系細胞双方を用いた場合であっても同様に 認められた。 [0066] また、歯胚上皮系細胞及び歯胚間葉系細胞を用いた場合 (実施例 3)では、図 7に 示されるように、いずれか一方を組織として用いた場合と同様に、象牙質及びェナメ ル質の存在を確認することができた。歯胚上皮系細胞及び歯胚間葉系細胞を用い た場合には、しばしば 1個の再構成歯胚より複数個の方向性と構造を有した歯が発 生することが認められ、発生後の歯芽を分離することにより複数個の歯を発生させら れる可能性が示唆された。特に、歯胚間葉系細胞を先にゲルドロップ内に配置して、 その後から歯胚上皮系細胞を押し当てて配置した場合には、エナメル質及び象牙質 がそれぞれ外側及び内側に配置された特徴的な構造をより明確に構築することがで き、より歯の形態をとりやすぐ歯の形成に有利である可能性が示された (データ示さ ず)。
[0067] なお本発明により上皮系細胞と間葉系細胞を配置し再構成した歯胚を器官培養す ることにより複数の歯胚及び/又は歯芽の形成がしばしば認められた。このことは、こ れらの複数の歯胚及び Z又は歯芽を外科的に分離することにより、ひとつの再構成 歯胚より複数の歯を発生させられる可能性が示唆された。
[0068] 一方、上皮組織のみ又は間葉組織のみで培養した比較例 2の場合では、図 8に示 されるように、上述したような特定構造の歯を構成することができな力 た。従って、本 発明の方法では、細胞相互作用が行われて特定構造を有する組織が再構成されて いることが示唆された。
また、低密度の細胞凝集塊を用いた比較例 3の場合では、図 9に示されるように、コ ラーゲンゲルドロップ中での培養において既に単一細胞が分散し、腎臓皮膜下に移 植しても、歯としての特定構造を再構成しな力つた。このことは、細胞相互作用によつ て歯を再構成するには、可能な限り高密度の細胞凝集塊を用いることが好ましいこと が示唆された。
更に、歯胚上皮系細胞と歯胚間葉系細胞とを事前に 1対 1で混合させ、高密度でこ れら細胞を区画化することなく細胞凝集塊を形成させた比較例 4の場合には、図 10 に示されるように、エナメル質や象牙質の硬組織は認められなカゝつた。このことは、歯 胚上皮系細胞の集合体と歯胚間葉系細胞の集合体とを別個に調製した後、区画ィ匕 して細胞凝集塊を形成させることが重要であることが示された。 [0069] (4)歯周組織の確認
次に、本方法によって形成された歯が歯周組織を備えているカゝ確認した。歯周組 織の確認は、上記の HE染色像による観察に加えて、下記のような in situハイブリダ ィゼーシヨンを用いた。
腎皮膜下移植した再構成歯胚を移植 14日目に摘出し、常法によりパラフィン包埋 して 10 m厚に切片化した。キシレンとエタノール希釈系列に切片を浸してパラフィ ンを除去した。 10 μ g/ml Protease K (Nacalai tesque, kyoto, Japan) in PBS (-)で 3分 間処理し、 4%パラホルムアルデヒド（Nacalai tesque)リン酸緩衝液で 15分間固定し た。 0. 1% (v/v) TritonX- 100 (Sigma) in PBS (-)で 3分間処理し、 PBS (―)で 3分間 洗浄した。 0. 2N HCl (Wako)で 10分間処理し、 PBS (―)と DEPC (ジェチルピロ カーボネート) waterでそれぞれ 5分間洗浄した。 1. 5% (v/v)トリエタノールァミン (na calai tesque), 0. 33N HCl (Wako), 0. 25% (v/v)無水酢酸（Nacalai tesque) in DE PC waterで 10分間処理した後、 2 X SSCで 10分間、 2回洗浄した。 Periostin (Genba nk accession no. NN W015784)プローブは、センスプライマー (—7; ggctgaagatggttcct etc,配列番号 1)とアンチセンスプライマー（573; gtacattgaaggaataacca、配列番号 2) を用いて PCRにより取得した cDNA断片を、 DIG標識して用いた。定法に従って in s ituハイブリダィゼーシヨンを行い、抗 DIG— AP Fabフラグメント（Roche)と NBT/BCI P Stock solution (Roche)で発色させ、 Axio Imager A.l (Zeiss)と AxioCam MRc5 (Zeis s)で解析を行なった。
[0070] 上記実施例における歯周組織を、歯周組織の有無について詳細に観察したところ 、実施例 1〜3のいずれにおいても、図 4から図 7に示したように、移植後 14日目の歯 の周囲には、正常な歯胚を移植した比較例 1 (図 3参照）と同様の歯槽骨が形成され ていた。
[0071] さらに図 11で示されるように、単一細胞と組織との組み合わせの別に拘らず、実施 例 1〜3のいずれにおいても、得られた歯の周囲には、正常な歯胚を移植した比較 例 1と同様の歯槽骨及び歯根膜が形成された。また実施例 2の歯において確認した ところ、図 12で示されるように、 HE染色により歯根膜形成が認められた領域には、歯 根膜特異的な遺伝子であるぺリオスチン mRNAの発現が認められた (実施例 1及び 3において同様)。
このことは、実施例 1〜3により作製した歯胚は、歯槽骨や歯根膜といった歯周組織 を形成することができることを示して 、る。
[0072] [実施例 4及び 5、比較例 5]
上記と同様にして配置工程を終了した後に、培養工程として、一般に用いられる器 官培養を 14日間にわたって継続して実施し、歯の発生を解析した。歯胚由来上皮組 織と間葉細胞との組み合わせを実施例 4とし、歯胚由来上皮細胞と間葉細胞との組 み合わせを実施例 5とした。なお、正常歯胚を用いて器官培養した例を比較例 5とし た。結果を図 13に示す。
図 13に示されるように、実施例 4及び 5のいずれも、培養期間が長くなるにつれて 歯胚の大きさが大きくなり、腎皮膜下移植を実施した場合とほぼ同様の特徴的な構 造を有した歯の発生が認められた。
また実施例 4及び 5のいずれにおいても、器官培養によって得られた歯は、複数の 歯で構成された集合体 (例えば、間葉細胞と上皮細胞とを用いた場合には 6個；図 1 3最下段）を形成していた。
[0073] [実施例 6及び 7、比較例 6]
実施例 5で示されるように、再構成歯胚から得られた歯は、 1個の再構成歯胚から 間葉細胞及び上皮細胞を調製したにも拘わらず、複数の歯へ再誘導された。このよ うに再構成歯胚で同時に再誘導された個々の歯が 1本の歯として成長しうるかどうか を解析した。
[0074] (1)再構成歯胚から発生する複数の歯胚の分離と歯への発生能力の解析
1)複数発生させた歯胚の個別分離と器官培養
実施例 3と同様にして得られた再構成歯胚を、 2〜5日間器官培養し、 1つの再構 成歯胚から複数の歯胚を発生させた。その後、歯胚が複数発生している再構成歯胚 を、器官培養 2〜5日目に実体顕微鏡下で注射針とピンセットを用いて外科的に 1個 の歯胚に分離した。
シリコングリースを塗布したペトリディッシュに、実施例 1と同様にして、 Cellmatrix ty pe I- A (Nitta gelatin, Osaka, Japan)を 30 μ L滴下してゲルドロップを作製した。この ゲルドロップに、上記個別分離歯胚を入れ、 COインキュベーターに 10分間静置し
2
て Cellmatrix type I- A (Nitta Gelatin)を固形化し、 10%FCS (JRH)添加 DMEM (Si gma)にセルカルチャーインサート（ポアサイズが 0. 4ミクロンの PETメンブレン； BD, F ranklin Lakes, NJ)が接するようにセットした培養容器のセルカルチャーインサートの 膜上に、個別分離歯胚を支持担体である周囲のゲルと共に移して、 18— 24時間、 器官 i口 した。
2)組織学的解析
培養後、周囲のゲルごと 8週齢 C57BLZ6の腎皮膜下に移植して 14日目に周囲 の腎組織ごと個別分離歯胚を摘出した。組織を、 4%ノラホルムアルデヒド—リン酸 緩衝液で 6時間固定した後、常法によりパラフィン包埋して、 10 mの切片を作製し た。組織学的解析のためには常法に従い、へマトキシリンーェォジン染色を行った。
[0075] 3)結果
分離した歯胚を腎臓皮膜下へ移植して 14日間発生させ、組織学的に解析した結 果を、図 14に示した。図 14に示されるように、移植した分離歯胚は、それぞれがェナ メル質と象牙質、歯髄、歯冠、歯根という特徴を有する 1本の「歯」に発生した。また、 得られた歯の歯冠部にはエナメル質と象牙質が存在すること（図 14中段及び下段に おける a参照)及び歯根部では歯根の開口部が存在すること（図 14中段における b参 照）がそれぞれ確認できた。
これらのことは、正常発生した歯と同様に、歯冠部においてエナメル芽細胞と象牙 芽細胞が存在し、また正常発生した歯と同一の形態を有することを示しており、歯の 集合体として同時に発生した個々の歯が、いずれも正常発生した歯と細胞配置及び 方向性において同一であることを示していた。
[0076] (2)再構成歯胚の口腔内移植による歯の発生
1)個別分離歯胚と個別分離歯牙の作製
上記と同様にして、器官培養 2〜5日目において歯胚が複数発生している再構成 歯胚から、個別に分離した歯胚を作製した。一方、腎皮膜下移植して 14日後に摘出 した、再構成歯胚より複数発生した歯を、実体顕微鏡下で注射針とピンセットを用い て外科的に個別に分離した。 個別分離歯胚の場合、前記同様に、シリコングリースを塗布したペトリディッシュに、
2. 4mg/mlの濃度に上記培養液で調製した Cellmatrix type I- A (Nitta gelatin, Osa ka, Japan)を 30 L滴下してゲルドロップを作製した。このゲルドロップに、上記個別 分離歯胚を入れ、 COインキュベーターに 10分間静置して Cellmatrix type I- A (Nitt
2
a Gelatin)を固化した。次いで、 10%FCS (JRH)添カ卩 DMEM (Sigma)にセルカルチ ヤーインサート（ポアサイズが 0. 4ミクロンの PETメンブレン； BD, Franklin Lakes, NJ) が接するようにセットした培養容器のセルカルチャーインサートの膜上に、支持担体 である周囲のゲルと共に個別分離歯胚を移して、 18— 24時間、器官培養した。 培養後、周囲のゲルを注射針とピンセットで外科的に除去し、 8週齢 C57BLZ6の 下顎切歯抜歯孔に移植し、実施例 6とした。一方、腎臓皮膜下へ移植した再構成歯 胚より個別に分離した歯の場合には、分離後ゲルに包まず、そのまま 8週齢 C57BL Z6の下顎切歯抜歯孔に移植し、実施例 7とした。
[0077] 2)切歯の抜歯と口腔内移植の方法
口腔内移植の 3日前に、ジェチルエーテルで吸引麻酔した 8週齢 C57BLZ6に、 5 mg/mlのペントバルビタールナトリウムを含む生理食塩水を、体重 20gに対して 20 0 1の割合で腹腔注射した。痛覚の麻痺したマウスの下顎切歯萌出部付近の下顎 骨をメスで剥離し、顎骨に埋まっている切歯先端部を露出させた。ピンセットを用いて 下顎から切歯を抜歯し、血液を脱脂綿で拭き取り止血した。食物摂取のために、抜 歯は片側の下顎切歯のみとし、粉末状に砕いた飼育用の餌を毎日与えた。
[0078] 上記方法により抜歯した 8週齢 C57BLZ6をジェチルエーテルで吸引麻酔し、 5m g/mlのペントバルビタールナトリウムを含む生理食塩水を、体重 20gに対して 200 1の割合で腹腔注射した。痛覚の麻痺したマウスを、抜歯した側の顎を上にして解 剖台に固定し、抜歯孔歯根部領域の頭部横面より皮膚と筋肉層を切開し、下顎骨を 露出させた。メスを用いて抜歯孔歯根部領域を覆う下顎骨に、個別分離歯胚の場合 は直径 lmm、個別分離歯牙の場合は直径 2mmの穴をあけ、そこから個別分離歯胚 と個別分離歯牙を抜歯孔歯根部領域に移植した。移植する個別分離歯胚と個別分 離歯の向きは、正常発生の歯の方向と一致させ、また成体マウス下顎切歯で見られ るエナメル質、歯根膜の方向性とも一致させた。切開した筋肉層と皮膚を常法により 縫合した。 口腔内移植した 8週齢 C57BLZ6には粉末状に砕いた飼育用の餌を毎 日与えた。
なお、切歯抜歯後に移植をしな力つたマウスを比較例 6とした。
[0079] 3)組織学的解析
口腔内移植して 14日目に、個別分離歯胚、並びに個別分離歯を移植した下顎骨 を摘出した。 4%パラホルムアルデヒド一リン酸緩衝液で 16時間固定した後、 22. 5 %のギ酸で 72時間脱灰し、常法によりパラフィン包埋して、 10 mの切片を作製した 。脱灰液は下顎骨 2つにつき 50mlとし、脱灰 48時間目に全量を交換した。組織学的 解析のためには常法に従 、、へマトキシリン—ェォジン染色を行った。
個別分離歯胚、並びに個別分離歯牙に C57BLZ6— TgN (act— EGFP) OsbCl 4-Y01-FM131マウス由来の歯胚を用いた場合は、 4%パラホルムアルデヒド—リン酸 緩衝液で 16時間固定した後、 22. 5%のギ酸で 72時間脱灰し、常法により OCT co mpound (Miles Inc., Naperville, IL)に包 ¾して、クリオスタツト (Leica, Wetzlar, Germa ny)で 10 μ mの切片を作製し、蛍光顕微鏡 (Zeiss社製)で観察した。
[0080] 4)結果
切歯抜歯後に移植をしな力つた比較例 6のマウスの抜歯後 14日後の糸且織像を図 1 5に、個別分離した歯胚 (実施例 6)、並びに歯 (実施例 7)を、切歯抜歯孔へ移植し て 14日後の組織像を、それぞれ図 16及び図 17に示した。
図 15に示すように、比較例 6の非移植マウスでは、切歯抜歯孔の移植部位に該当 する位置に浸潤した細胞と発生した骨のみが認められ、硬組織を有する歯は認めら れなかった。
これに対して、図 16に示すように、実施例 6として個別分離した歯胚を移植した当 該部位には、エナメル質を外側に、象牙質を内側に有する歯が発生した。発生した 歯は、歯の先端と歯根が認められ、歯の方向性が存在し、正常発生する歯と同一の 構造を有していた。
また、腎臓皮膜下へ移植して発生させた後に分離した歯を抜歯孔へ移植した実施 例 7のマウスでは、図 17に示すように、当該部位にエナメル質を外側に、象牙質を内 側に有する歯が発生した。発生した歯は、歯の先端と歯根を有しており、歯髄内部に は血管が認められると共に、歯の周囲には歯根膜と歯槽骨を有しており、正常発生 する歯と同一の構造を有して ヽた。
[0081] [実施例 8及び比較例 7]
(1)毛胞の再構成
本発明において開発した技術が、歯胚の発生に寄与するのみならず、他の器官形 成にも有用な技術であることを示すために、毛胞の再構成を実施した。この実験モデ ルとしてマウスを用いた。
1)細胞の分離方法
C57BLZ6Nマウス（日本クレアから購入）又は Green Fluorescence Protein (EGF P)トランスジエニックマウスである C57BLZ6— TgN (act— EGFP) OsbC14— Y01— FM1 31 (理研バイオリソースセンター）の胎齢 14. 5日、胚仔から上顎髭毛胞組織を顕微 鏡下で常法により摘出した。上顎髭毛胞組織を Ca2+, Mg2+不含リン酸緩衝液 (PBS ( 一））で洗浄し、 PBS (—）に最終濃度 1. 2UZmlの Dispase II (Roche, Mannheim, G ermany)を添カ卩した酵素液で室温にて 60分間処理した後、 10%FCS (JRH Bioscien ces, Lenexa, KS)を添カ卩した DMEM (Sigma, St. Louis, MO)で 3回洗浄した。さらに D Nase I溶液（Takara, Siga, Japan)を最終濃度 70UZmlになるよう添カ卩し毛胞組織を 分散させ、 25G注射針（Terumo, Tokyo, Japan)を用いて外科的に毛胞上皮組織と 毛胞間葉組織を分離した。
[0082] 毛胞上皮系細胞は、上記により得られた毛胞上皮組織を PBS (—）で 3回洗浄し、 P BS (—）に最終濃度 lOOUZmlの Collagenase I (Worthington, Lakewood, NJ)を溶 解した酵素液で、 37°Cにて 20分間の処理を 2回繰り返した。遠心分離によって沈殿 回収した細胞を、さらに 0. 25% Trypsin (Sigma)— PBS (—）で 37°C、 5分間処理し た。 10%FCS添加 DMEMで、細胞を 3回洗浄した後、細胞に最終濃度 70UZml の DNase I溶液を添カ卩して、ピペッティングにより単一の毛胞上皮系細胞を得た。 一方、毛胞間葉系細胞は、毛胞間葉組織を PBS (—）で 3回洗浄し、 0. 25%Tryps in (Sigma), 50UZmlの Collagenase I (Worthington)を含む PBS (—）で処理した。 7 OUZmlの DNase I (Takara)を添カ卩して、ピペッティングにより単一の毛胞間葉系細 胞を得た。 [0083] 2)再構成毛胞の作製方法
次に、上記で調製された毛胞上皮系細胞及び毛胞間葉系細胞を用いた以外は実 施例 1と同様にして、再構成毛胞作製に用いる細胞を準備し、コラーゲンゲルドロッ プにそれぞれ 0. 2-0. 3 ;z Lアプライしてそれぞれの細胞凝集塊を作製し、両者が 互 ヽに密接するようにして再構成毛胞を作製した。
3)腎皮膜下移植
ゲル中で作製した再構成毛胞は、実施例 1と同様にして、培養容器のセルカルチヤ 一インサートの膜上に、細胞塊を支持担体である周囲のゲルと共に移して、 18— 48 時間、器官培養した。培養後、周囲のゲルごと 8週齢 C57BLZ6の腎皮膜下に移植 して異所的な毛の発生を進行させ、毛の発生を解析した。
一方、比較例 7は、毛胞上皮系細胞及び毛胞間葉系細胞を用いた以外は、比較例 4と同様にして、生体外で 2種類の細胞を混合して 1つの細胞凝集体を作製し、実施 例 8と同様にして腎皮膜下に移植した。
[0084] 4)組織学的解析
腎皮膜下に移植の場合には、移植後 14日目に周囲の腎組織ごと再構成毛胞を摘 出した。器官培養の場合には、同様の日数の培養後、細胞凝集塊を回収した。組織 、あるいは細胞凝集塊を、 4%パラホルムアルデヒド—リン酸緩衝液で 6時間固定した 後、常法によりパラフィン包埋して、 10 mの切片を作製した。組織学的解析のため には常法に従い、へマトキシリンーェォジン染色を行った。
[0085] 5)結果
実施例 8に係る毛胞を、同系マウスの腎臓皮膜下へ移植した結果を図 18に示す。 図 18に示されるように、再構成毛胞を移植すると初期毛胞を構成する上皮細胞と間 葉細胞との細胞間相互作用が損なわれな!/、ため、毛胞の縦断面 (切片 A)では上皮 細胞に由来する毛包や内毛根鞘、外毛根鞘、並びに間葉細胞に由来する毛乳頭の 細胞が認められた。さらに切片 Aでは、毛は組織染色時に溶解するものの、完全に 溶解していない毛が認められた。横断面 (切片 B)では、上皮細胞が毛穴を取り囲む ように、内毛根鞘や外毛根鞘等の細胞配置が認められた。毛は組織染色時に溶解 するため、毛の溶解残存物が認められた。 また、図 19に示されるように、再構成毛胞を腎臓皮膜下へ移植して 14日後に摘出 した移植片には、毛胞力 生えた毛が認められた。
一方、上皮、並びに間葉細胞をあらかじめ混合して、支持担体中で再構成した比 較例 7の場合には、図 20に示されるように、毛胞組織は認められな力 た。
従って、実施例 8によれば、実施例 1〜7の歯胚を用いて歯を作製する場合と同様 に、毛胞組織力 毛を作製することができた。
[0086] このように本発明によれば、歯や毛に限らず、上皮系細胞と間葉系細胞との細胞間 相互作用が有効になされるように上皮組織 ·細胞及び間葉組織 ·細胞を別個に調製 し、これらを区画ィ匕して高密度に接触させて培養することによって、細胞の分ィ匕を効 果的に誘導することができ、組織に特有の細胞配置と方向性を備えた組織を作製す ることがでさることを示して!/ヽる。
従って、本発明によれば、細胞間相互作用を損なうことなく多種の単一細胞力 組 織を再構築できるので、細胞相互作用によって構築される組織を人為的に作製する ことができる。
符号の説明
[0087] 10 ゲルパック（支持担体）
12 細胞凝集塊 (第 1の細胞集合体）
14 細胞凝集塊 (第 2の細胞集合体）
16 ピペットチップ

Claims

請求の範囲
[1] 支持担体の内部に、少なくともいずれか一方が歯胚由来である間葉系細胞及び上 皮系細胞のいずれか一方のみ力 実質的になる第 1の細胞集合体と、いずれか他方 のみから実質的になる第 2の細胞集合体とを接触させて配置すること、
前記第 1及び第 2の細胞集合体を前記支持担体の内部で培養すること、 を含む歯の製造方法。
[2] 前記間葉系細胞及び上皮系細胞の!/、ずれもが共に歯胚由来である請求項 1記載 の歯の製造方法。
[3] 第 1の細胞集合体を調製する第 1の調製工程と、第 2の細胞集合体を調整する第 2 の調製工程とを、前記接触させて配置することの前に更に含む請求項 1又は 2記載 の歯の製造方法。
[4] 前記支持担体の内部での成育を他の動物細胞の存在下で行うことを含む請求項 1 〜3の！、ずれか 1項記載の歯の製造方法。
[5] 前記第 1の細胞集合体及び前記第 2の細胞集合体が共に単一細胞集合物である 請求項 1〜4のいずれか 1項記載の歯の製造方法。
[6] 前記培養を、歯周組織が形成されるまで継続することを特徴とする請求項 1〜5の V、ずれか 1項記載の歯の製造方法。
[7] 支持担体の内部に、少なくともいずれか一方が歯胚由来である間葉系細胞及び上 皮系細胞のいずれか一方のみ力 実質的になる第 1の細胞集合体と、いずれか他方 のみから実質的になる第 2の細胞集合体とを接触させて配置すること、
前記第 1及び第 2の細胞集合体を、前記支持担体の内部で、歯とこれに連続した 歯周組織とを得るまで培養すること、
前記培養によって得られた歯周組織を単離すること
を含む歯周組織の製造方法。
[8] 支持担体の内部に、少なくともいずれか一方が歯胚由来である間葉系細胞及び上 皮系細胞のいずれか一方のみ力 実質的になる第 1の細胞集合体と、いずれか他方 のみから実質的になる第 2の細胞集合体とを接触させて配置すること、前記第 1及び 第 2の細胞集合体を前記支持担体の内部で培養することによって得られた歯の集合 体。
[9] 前記間葉系細胞及び上皮系細胞の!/、ずれもが共に歯胚由来である請求項 8記載 の歯の集合体。
[10] 間葉系細胞と上皮系細胞との相互作用により構築される組織の製造方法であって 支持担体の内部に、間葉系細胞及び上皮系細胞のいずれか一方のみから実質的 になる第 1の細胞集合体と、いずれか他方のみから実質的になる第 2の細胞集合体 とを接触させて配置すること、
前記第 1及び第 2の細胞集合体を前記支持担体の内部で培養すること、 を含む組織の製造方法。
[11] 第 1の細胞集合体を調製する第 1の調製工程と、第 2の細胞集合体を調整する第 2 の調製工程とを、前記接触させて配置することの前に更に含む請求項 10記載の組 織の製造方法。
[12] 前記間葉系細胞及び上皮系細胞の少なくとも一方が、目的となる組織に由来する 細胞であることを特徴とする請求項 10又は 11記載の組織の製造方法。
[13] 前記組織が、歯、毛髪、腎臓、肺、肝臓力 なる群より選択されたものであることを 特徴とする請求項 10〜 12のいずれか 1項記載の組織の製造方法。
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AU2006253406A AU2006253406B2 (en) 2005-05-30 2006-05-30 Method of producing tooth and method of producing teeth and tissue
ES06756753.7T ES2599532T3 (es) 2005-05-30 2006-05-30 Método para producir un diente, conjunto de dientes, y método para producir un tejido
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Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008090826A1 (ja) 2007-01-22 2008-07-31 Organ Technologies Inc. 間葉系細胞の製造方法、歯の製造方法及び歯形成用間葉系細胞
JP2008206500A (ja) * 2007-02-28 2008-09-11 Tokyo Univ Of Science 歯の製造方法及びこれにより得られた歯
WO2010021340A1 (ja) 2008-08-20 2010-02-25 株式会社オーガンテクノロジーズ 歯欠損部の修復方法及び修復材料の製造方法
WO2010087118A1 (ja) * 2009-01-28 2010-08-05 株式会社オーガンテクノロジーズ 歯の製造方法
WO2011125425A1 (ja) * 2010-04-07 2011-10-13 株式会社オーガンテクノロジーズ 再生歯ユニットの製造方法
WO2011125426A1 (ja) * 2010-04-07 2011-10-13 株式会社オーガンテクノロジーズ 再生歯ユニットの移植による歯槽骨の回復方法
WO2012108069A1 (ja) 2011-02-09 2012-08-16 株式会社オーガンテクノロジーズ ガイドを有する移植用再生器官原基の製造方法、当該方法によって製造される、ガイドを有する移植用再生器官原基を含む組成物、およびガイドを有する移植用再生器官原基の移植方法
WO2012115079A1 (ja) 2011-02-24 2012-08-30 株式会社オーガンテクノロジーズ 毛色が制御された移植用再生毛包原基の製造方法、当該移植用再生毛包原基を含む組成物、およびその移植方法
WO2013047639A1 (ja) * 2011-09-27 2013-04-04 公立大学法人横浜市立大学 組織及び臓器の作製方法
WO2014126007A1 (ja) * 2013-02-13 2014-08-21 株式会社オーガンテクノロジーズ １つの単離された歯胚から複数の歯を製造する方法
WO2019220843A1 (ja) * 2018-05-16 2019-11-21 国立大学法人横浜国立大学 細胞含有ハイドロゲル体及びその製造方法
WO2019235375A1 (ja) 2018-06-04 2019-12-12 株式会社オーガンテクノロジーズ 再生毛包原基の製造方法

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EA018602B1 (ru) * 2008-08-25 2013-09-30 Лазер Абразив Техноложес, Ллс Способ и устройство для регенерации тканей полости рта
WO2014143014A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Triagenics, Llc Therapeutic tooth bud ablation
EP4338701A3 (en) * 2009-05-11 2024-06-05 TriAgenics, Inc. Method of volume scanning
US10022202B2 (en) 2013-03-15 2018-07-17 Triagenics, Llc Therapeutic tooth bud ablation
EP2622063A4 (en) * 2010-10-01 2014-03-26 Univ Columbia PRODUCTION OF DENTINE, CEMENT AND ENAMEL BY CELLS
SG11201404500SA (en) * 2012-02-01 2014-11-27 Organ Technologies Inc Dental implant and method for producing same
EP2633870B1 (en) 2012-02-29 2018-08-01 Technische Universität Berlin Method of preparing an artificial tooth primordium in vitro and artificial tooth primordium derived therefrom
WO2014039427A1 (en) * 2012-09-04 2014-03-13 Anthrogenesis Corporation Methods of tissue generation
KR101858648B1 (ko) * 2012-12-07 2018-05-16 한화파워시스템 주식회사 다단 압축 시스템의 서지 제어 방법
US9438264B1 (en) 2015-09-10 2016-09-06 Realtek Semiconductor Corp. High-speed capacitive digital-to-analog converter and method thereof
CN106170497A (zh) 2014-02-07 2016-11-30 免疫医疗有限责任公司 检测人类骨膜蛋白的新型测定
CN111197027A (zh) * 2018-11-16 2020-05-26 中国科学院广州生物医药与健康研究院 分离牙胚单细胞的方法及应用
RU2716485C1 (ru) * 2019-02-15 2020-03-11 федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный медико-стоматологический университет имени А.И. Евдокимова" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБОУ ВО МГМСУ им. А.И. Евдокимова Минздрава России) Способ выращивания эмали в эксперименте
EP4413935A2 (en) 2019-06-06 2024-08-14 TriAgenics, Inc. Ablation probe systems
KR20240036890A (ko) * 2022-09-14 2024-03-21 연세대학교 산학협력단 줄기세포의 경조직으로의 분화 방법

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3190145B2 (ja) 1992-10-30 2001-07-23 倭 窪田 動物組織培養用担体およびこれを用いる動物組織培養方法
SG47996A1 (en) 1993-12-30 1998-04-17 Nitta Gelatin Kk Method for culturing animal cells under embedded conditions
GB0003930D0 (en) 2000-02-18 2000-04-12 King S College London Cell
US6899915B2 (en) 2000-11-29 2005-05-31 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for culturing a biological tooth
WO2003043674A1 (en) 2001-11-16 2003-05-30 Children's Medical Center Corporation ¨ Augmentation of organ function
RU2217096C1 (ru) 2002-07-02 2003-11-27 Бондаренко Александр Николаевич Способ посттравматической аутореплантации зубов
JP2004331557A (ja) 2003-05-07 2004-11-25 Hitachi Medical Corp 歯胚の再生方法
WO2004101774A1 (ja) * 2003-05-14 2004-11-25 Japan Tissue Engineering Co. Ltd 細胞培養方法及び培養組織
JP2004357567A (ja) 2003-06-04 2004-12-24 Hitachi Medical Corp 歯胚の再生方法
TW200510011A (en) 2003-08-11 2005-03-16 Hitachi Medical Corp A method for regeneration of bone
FI20031724A0 (fi) 2003-11-25 2003-11-25 Timo Kalevi Korpela Menetelmä hammaselimen regeneroimiseksi
BRPI0402659A (pt) 2004-06-23 2006-01-31 Univ Fed Sao Paulo Unifesp Uso de células tronco, método de engenharia tecidual, usos de tecidos dentais e substituto biológico do dente
WO2006020240A2 (en) 2004-07-16 2006-02-23 The Forsyth Institute Methods and compositions for bioengineering a tooth

Non-Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HARADA H. ET AL.: "Ha to Shishu Soshiki Saisei no Senryaku -Johi-Kanyo Sogo Sayo no Jinkoteki Kochiku-", DE, no. 150, 2004, pages 23 - 26, XP003008009 *
HAVLICKOVA B. ET AL.: "Towards optimization of an organotypic assay system that imitates human hair follicle-like epithelial mesenchymal interactions", BRITISH JOURNAL OF DERMATOLOGY, vol. 151, no. 4, 2004, pages 753 - 765, XP003008012 *
HONDA M. ET AL.: "Ha no Saisei- Dogs Kagakukotsu eno Shihai Saibo Ishoku", SAISEI IRYO, vol. 4, no. 1, 1 February 2005 (2005-02-01), pages 85 - 89, XP003008011 *
INAMATSU M. ET AL.: "Establishment of rat dermal papilla cell lines that sustain the potency to induce hair follicles from afollicular skin", JOURNAL OF INVESTIGATIVE DERMATOLOGY, vol. 111, no. 5, 1998, pages 767 - 776, XP002272134 *
KAGAMI H. ET AL.: "Ha Oyobi Shihai Yurai Saibo o Mochiita Saisei Iryo to Sono Kanosei", SAISEI IRYO, vol. 4, no. 1, 1 February 2005 (2005-02-01), pages 79 - 83, XP003008008 *
MATSUMOTO K. ET AL.: "Emerging multipotent aspects of hepatocyte growth factor", JOURNAL OF BIOCHEMISTRY, vol. 119, no. 4, 1996, pages 591 - 600, XP003008013 *
OHAZAMA A. ET AL.: "Stem-cell-based tissue engineering of murine teeth", JOURNAL OF DENTAL RESEARCH, vol. 83, no. 7, 2004, pages 518 - 522, XP003008014 *
See also references of EP1905459A4 *
SUZUKI H. ET AL.: "Immunohistochemical localization of periostin in tooth and its surrounding tissues in mouse mandibles during development", ANATOMICAL RECORD PART A, DISCOVERIES IN MOLECULAR, CELLULAR, AND EVOLUTIONARY BIOLOGY, vol. 281, no. 2, 2004, pages 1264 - 1275, XP003008015 *
YAMAMOTO H. ET AL.: "Analysis of tooth formation by reaggregated dental mesenchyme from mouse embryo", JOURNAL OF ELECTRON MICROSCOPY, vol. 52, no. 6, 2003, pages 559 - 566, XP003008007 *
YOUNG C.S. ET AL.: "Tissue engineering of complex tooth structures on biodegradable polymer scaffolds", JOURNAL OF DENTAL RESEARCH, vol. 81, no. 10, 2002, pages 695 - 700, XP003008010 *

Cited By (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008090826A1 (ja) 2007-01-22 2008-07-31 Organ Technologies Inc. 間葉系細胞の製造方法、歯の製造方法及び歯形成用間葉系細胞
US8574904B2 (en) 2007-01-22 2013-11-05 Organ Technologies Inc. Method for production of mesenchymal cell, method for production of tooth, and mesenchymal cell for formation of tooth
JP2008206500A (ja) * 2007-02-28 2008-09-11 Tokyo Univ Of Science 歯の製造方法及びこれにより得られた歯
US8349608B2 (en) 2007-02-28 2013-01-08 Organ Technologies Inc. Method for production of tooth, and tooth produced by the method
JP5514110B2 (ja) * 2008-08-20 2014-06-04 株式会社オーガンテクノロジーズ 歯欠損部の修復方法及び修復材料の製造方法
WO2010021340A1 (ja) 2008-08-20 2010-02-25 株式会社オーガンテクノロジーズ 歯欠損部の修復方法及び修復材料の製造方法
CN102300592B (zh) * 2009-01-28 2014-03-12 株式会社器官再生工学 牙齿的制造方法
EP2392356A4 (en) * 2009-01-28 2014-03-26 Organ Technologies Inc METHOD FOR THE PRODUCTION OF A TOOTH
WO2010087118A1 (ja) * 2009-01-28 2010-08-05 株式会社オーガンテクノロジーズ 歯の製造方法
US8927284B2 (en) 2009-01-28 2015-01-06 Organ Technologies, Inc. Method for producing tooth
JP5492791B2 (ja) * 2009-01-28 2014-05-14 株式会社オーガンテクノロジーズ 歯の製造方法
AU2011236303B2 (en) * 2010-04-07 2014-06-12 Organ Technologies, Inc. Method for restoring alveolar bone via transplant of a regenerated tooth unit
WO2011125426A1 (ja) * 2010-04-07 2011-10-13 株式会社オーガンテクノロジーズ 再生歯ユニットの移植による歯槽骨の回復方法
AU2011236302B2 (en) * 2010-04-07 2014-05-01 Organ Technologies, Inc. Methods for manufacturing a regenerated tooth unit
JP5868844B2 (ja) * 2010-04-07 2016-02-24 株式会社オーガンテクノロジーズ 再生歯ユニットの製造方法
WO2011125425A1 (ja) * 2010-04-07 2011-10-13 株式会社オーガンテクノロジーズ 再生歯ユニットの製造方法
JP5868845B2 (ja) * 2010-04-07 2016-02-24 株式会社オーガンテクノロジーズ 再生歯ユニットの移植による歯槽骨の回復方法
WO2012108069A1 (ja) 2011-02-09 2012-08-16 株式会社オーガンテクノロジーズ ガイドを有する移植用再生器官原基の製造方法、当該方法によって製造される、ガイドを有する移植用再生器官原基を含む組成物、およびガイドを有する移植用再生器官原基の移植方法
JP5932671B2 (ja) * 2011-02-09 2016-06-08 株式会社オーガンテクノロジーズ ガイドを有する移植用再生器官原基の製造方法、当該方法によって製造される、ガイドを有する移植用再生器官原基を含む組成物、およびガイドを有する移植用再生器官原基の移植方法
US9982238B2 (en) 2011-02-09 2018-05-29 Organ Technologies, Inc. Method for producing regenerative organ primordium provided with guide for transplantation, composition containing regenerative organ primordium provided with guide for transplantation produced thereby, and method for transplanting regenerative organ primordium provided with guide for transplantation
WO2012115079A1 (ja) 2011-02-24 2012-08-30 株式会社オーガンテクノロジーズ 毛色が制御された移植用再生毛包原基の製造方法、当該移植用再生毛包原基を含む組成物、およびその移植方法
JP5887333B2 (ja) * 2011-02-24 2016-03-16 株式会社オーガンテクノロジーズ 毛色が制御された移植用再生毛包原基の製造方法、当該移植用再生毛包原基を含む組成物、およびその移植方法
US9321998B2 (en) 2011-02-24 2016-04-26 Organ Technologies Inc. Method of preparing regenerated hair follicle germ for transplantation in which hair color is controlled, composition including regenerated hair follicle germ for transplantation, and method of transplanting regenerated hair follicle germ
WO2013047639A1 (ja) * 2011-09-27 2013-04-04 公立大学法人横浜市立大学 組織及び臓器の作製方法
US11326150B2 (en) 2011-09-27 2022-05-10 Public University Corporation Yokohama City University Method for producing tissue and organ
WO2014126007A1 (ja) * 2013-02-13 2014-08-21 株式会社オーガンテクノロジーズ １つの単離された歯胚から複数の歯を製造する方法
WO2019220843A1 (ja) * 2018-05-16 2019-11-21 国立大学法人横浜国立大学 細胞含有ハイドロゲル体及びその製造方法
JP2019198267A (ja) * 2018-05-16 2019-11-21 国立大学法人横浜国立大学 細胞含有ハイドロゲル体及びその製造方法
JP7142840B2 (ja) 2018-05-16 2022-09-28 国立大学法人横浜国立大学 細胞含有ハイドロゲル体及びその製造方法
WO2019235375A1 (ja) 2018-06-04 2019-12-12 株式会社オーガンテクノロジーズ 再生毛包原基の製造方法

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