WO2006088248A1 - ポリオキシアルキレン誘導体 - Google Patents

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WO2006088248A1
WO2006088248A1 PCT/JP2006/303359 JP2006303359W WO2006088248A1 WO 2006088248 A1 WO2006088248 A1 WO 2006088248A1 JP 2006303359 W JP2006303359 W JP 2006303359W WO 2006088248 A1 WO2006088248 A1 WO 2006088248A1
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WO
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polyoxyalkylene
peptide
acid
bond
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PCT/JP2006/303359
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English (en)
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Kenji Sakanoue
Kenichiro Nakamoto
Yuji Yamamoto
Hiroki Yoshioka
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Nof Corporation
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Publication date
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
    • C07K1/1072—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups
    • C07K1/1077—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups by covalent attachment of residues other than amino acids or peptide residues, e.g. sugars, polyols, fatty acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61K47/65—Peptidic linkers, binders or spacers, e.g. peptidic enzyme-labile linkers

Definitions

  • the present invention relates to a polyoxyalkylene derivative that modifies a biological substance.
  • Polyethylene glycol has low interaction with other biological components due to its steric repulsion effect and retention of the hydration layer.
  • polypeptides such as proteins and enzymes modified with polyethylene dallicol are administered in vivo. In this case, it has the effect of avoiding biological reactions such as glomerular filtration and immune reaction in the kidney, and achieves a longer blood half-life than the unmodified one.
  • Modification with polyethylene glycol also reduces the toxicity and antigenicity of the substance to be modified, and further increases the solubility of highly hydrophobic, poorly water-soluble compounds.
  • Japanese Examined Patent Publication No. 6 1-4 2 5 5 8 proposes polyethylene glycolated L-asparaginase, and discloses a derivative in which two polyethylene dallicols are bonded to cyanuric chloride as reactive polyethylene glycol. Yes.
  • cyanuric chloride which is a raw material for reactive polyethylene glycol derivatives, has three reactive sites, and each has the same reactivity, two different polyethylene glycol chains are selectively introduced into them. It is difficult to synthesize high-purity polyethylene glycol L-Lasparaginase.
  • US Pat. No. 5 6 4 3 5 7 5 and US Pat. No. 5 9 3 2 4 6 2 propose branched polyalkylene dallicol derivatives with two or more polyalkylene glycol chains. However, specifically, only a bifurcated type having two polyalkylene glycol chains is disclosed. Further, International Publication No. 0 2/0 6 0 9 9 8 proposes branched derivatives having three or more polyalkylene darconol chains, but the polyalkylene glycol chains used are Has no functional group at the end, specifically, only compounds having one kind of functional group in which the same polyalkylene glycol chain is bonded to an equivalent group are disclosed. It is difficult to prepare various polyalkylene glycol chains and various functional groups in the production method.
  • An object of the present invention is to provide a polyoxyalkylene derivative capable of arbitrarily adjusting the type and number of polyalkylene glycol chains, the binding mode, and the type and number of functional groups.
  • the object of the present invention is to have a plurality of polyamines by binding a polyoxyalkylene compound to a functional group derived from the peptide having a peptide in its structure. It is an object of the present invention to provide a novel polyalkylene glycol derivative having a alkylene glycol chain and having a functional group capable of reacting with various physiologically active substances according to the purpose.
  • the functional group can react with various physiologically active substances due to the bonding force through the peptide chain or the bonding through the polyoxyalkylene chain. That is, the present invention is as follows.
  • Z is a peptide residue composed of 2 to 10 amino acids, and represents a peptide residue containing one or more amino acids having a side chain containing a functional group
  • OA represents an oxyalkylene group having 2 to 4 carbon atoms
  • R represents a hydrogen atom or a hydrocarbon group having 1 to 4 carbon atoms
  • X 1 and X 2 represent a group containing a succinimide group, a maleimide group, an amino group, a carboxyl group, a carbonate group, an aldehyde group, a sulfonyl group, a thiol group, a vinyl group, an aryl group, or a hydroxyl group,
  • Y and W are each independently one CONH-, one NHCO-, -OCONH one, one NHOCO-, — COO—, one OOC—, one COS—, one SOC—, one CH 2 NH—, one NHCH. . 1 and 1 S—CH ⁇ ,> CH—S—, 1 CH 2 — S—, 1 S—CH 2 —, —SS— and 1 O— represent a divalent group including a group selected from the group consisting of: ,
  • n is an integer from 5; L is an integer from 000, m is an integer from 5 to 800, j is an integer from ⁇ 0 to l 2, j 2 is an integer from 0 to 8, and k is from 0 to 1 Is an integer of 1 and 1 ⁇ j x + j 2 ⁇ 1 2, 2 ⁇ k + j ⁇ ⁇ 12 N 3 ⁇ k + j 1 + j 2 ⁇ 12 30 ⁇ (satisfy (n X k) + (mX j l ) ⁇ 2000)
  • Z is a peptide residue consisting of 2 to 10 amino acids, one amino acid having a side chain containing a functional group selected from the group consisting of an amino group, a carboxyl group, a thiol group and a hydroxyl group Described in [1] above, which indicates peptide residues having
  • Z represents a peptide residue consisting of 2 to 10 amino acids, and having at least one amino acid selected from the group consisting of lysine, aspartic acid, glutamic acid, cysteine and serine
  • j 1 is 2 to 1 2, polyoxyalkylene derivative conductor according to [7].
  • [1 2] Z is a peptide residue consisting of 3 to 8 amino acids, selected from the group consisting of glycine, lysine, glutamic acid, cysteine and aspartic acid
  • X 1 and X 2 are independently represented by the following formulas (a) to (p)
  • Q represents an alkyne group or an alkylene group having an ester bond, an amido bond, an ether bond, an urethane bond, a urea bond, a carbonate bond, a sulfide bond, an imine bond, or a secondary amino group.
  • V represents a hydrocarbon group having 1 to 10 carbon atoms which may contain a fluorine atom.
  • the polyoxyalkylene derivative of the present invention has the general formula (1)
  • Z is a peptide residue composed of 2 to 10 amino acids, and represents a peptide residue containing at least one amino acid having a side chain containing a functional group.
  • the peptide residue refers to a portion obtained by removing the terminal functional group and the side chain functional group from the peptide chain.
  • the terminal functional group include an amino group and a carboxyl group
  • examples of the side chain functional group include an amino group, a guanidino group, an imidazolyl group, a carboxyl group, a carbamide group, a hydroxyl group, and a thiol group.
  • the functional group may be protected.
  • amino acids having side chains containing functional groups include lysine, ornithine, arginine, histidine, aspartic acid, glutamic acid, ⁇ -carpoxyglutamic acid, serine, threonine, tyrosine, 4-hydroxyproline, cysteine, Cystine.
  • the peptide residue is not particularly limited as long as it is a peptide residue containing at least one amino acid having a side chain containing a functional group.
  • Lysine and ornithine residues having an amino group in the side chain, aspartic acid, glutamic acid and ⁇ -carboxyglutamic acid residue having a carboxyl group in the side chain, a serine residue having a hydroxyl group in the side chain, and in the side chain Peptide residues containing at least one cysteine residue having a thiol group are preferred, and peptide residues containing at least one lysine, aspartic acid, glutamic acid, cysteine, or serine are more preferred, Even more preferred are peptide residues containing at least one of lysine, aspartic acid, and glutamic acid.
  • ⁇ include peptides consisting of 3 to 8 amino acids selected from the group consisting of glycine, lysine, glutamic acid, cysteine, and aspartic acid. Residue.
  • OA is an oxyalkylene group having 2 to 4 carbon atoms, preferably an oxyethylene group.
  • (OA) n and (OA) m each independently represent a polyoxyalkylene group having the above-mentioned C 2-4 oxyalkylene group as a structural unit.
  • the polyoxyalkylene group may be linear or branched, and when the polyoxyalkylene group is composed of two or more types of oxyalkylene groups, the addition state of the alkylene oxide may be either block or random. Good.
  • Y represents a polyoxyalkylene compound having a group selected from the following formulas (a) to (k) at the end of a polyoxyalkylene chain represented by (OA) n , and an amino acid of a peptide residue represented by Z.
  • W is a linking group that bonds the functional group represented by X 1 and Z via a polyoxyalkylene chain represented by (OA) m .
  • Y and W are each independently, one CONH—, one NHCO—, one OCONH—, one NHOCO—, one COO—, one OOC—, one COS—, one S OC—, one CH. 2 NH—, 1 NHCH 2 —, 1 NHCONH—, 1 S— CH ⁇ ,> CH—S—, 1 CH 2 — S—, 1 S_CH 2 —, 1 S—S— and 1 O—
  • Y and W are preferably one CONH-, — NHCO—, one OCONH—, — NHOCO—, one COO—, one OOC—, one CH 2 NH—, one NHCH 2 —, one S— CH ⁇ ,>
  • a divalent group containing a group selected from the group consisting of CH—S— is shown.
  • Particularly preferred examples of Y and W include: 1 NHCO—, —CONH (CH 2 ) 3 O—, —NHCO (CH 2 ) 5 —, 1 NH (CH 2 ) 3 —, 1 CO (CH 2 ) 3 CO NH (CH 2 ) .
  • X 1 and X 2 are not particularly limited as long as they are functional groups capable of forming a chemical bond with a biological substance.
  • X 1 and X 2 include a succinic acid imide group, a maleimide group, an amino group, a carboxyl group, a carbonate group, an aldehyde group, a sulfonyl group, a thiol group, a vinyl group, a aryl group, or a group containing a hydroxyl group.
  • X 1 and X 2 include a succinic acid imide group, a maleimide group, an amino group, a carboxyl group, a carbonate group, an aldehyde group, a sulfonyl group, a thiol group, a vinyl group, a aryl group, or a group containing a hydroxyl group.
  • 1 and 2 are each independently a group selected from the following formulas (a) to (p): an amino group, a carboxyl group, an aldehyde group, It is a group that reacts with hydroxyl groups, thiol groups, and the like.
  • X 1 represents a functional group of the polylactic O alkoxy polyalkylene ⁇ end represented by (OA) m, yo also obtained by introducing a protecting group into a functional group as X 1 les.
  • X 2 represents a group bonded to the peptide without a polyoxyalkylene group or a polyoxyalkylene chain. When there are a plurality of X 1 and X 2 , each may be independently the same or different.
  • Q in (a), (c), (e), (f), (j), (1), (p) of X 1 and X 2 is a polyoxyalkylene chain represented by (OA) m or There is no particular limitation as long as it is a linker between the peptide residue represented by Z and a functional group and forms a covalent bond, but preferably an alkylene group, an ester bond, an amide Examples include a bond, an ether bond, a urethane bond, a urea bond, a carbonate bond, a sulfide bond, an imine bond, or an alkylene group containing a secondary amino group.
  • Preferred as the alkylene group are methylene group, ethylene group, propylene group, butylene group, An isopropylene group, an isoptylene group, etc. are mentioned, More preferably, an ethylene group and a propylene group are mentioned.
  • Preferred examples of the alkylene group containing an ester bond include the following structures (t 1).
  • Preferred examples of the alkylene group containing an amide bond include the following structure (t 2).
  • Preferred examples of the alkylene group containing an ether bond include the following structures (t 3) and (t 4).
  • Preferred examples of the alkylene group containing a urethane bond include the following structures (t 5).
  • Preferred examples of the alkylene group containing a urea bond include the following structure (t 6).
  • Preferred examples of the alkylene group containing a carbonate bond include the following structure (t7).
  • Preferred as the alkylene group containing a sulfido bond is
  • a structure like (t 8) is mentioned.
  • Preferred examples of the alkylene group containing an imine bond or a secondary amino group include the following structures (t 9).
  • q is an integer of 1 to 6, preferably an integer of 1 to 3, and more preferably 2 or 3.
  • t 2 is an integer of 1 to 6, preferably an integer of 1 to 3, and more preferably 2 or 3.
  • t 9 is a plurality of qs are included in the formula, but these may be the same or different. Also
  • r is an integer of 1 to 5, preferably 1 or 2.
  • V is a hydrocarbon group which may contain a fluorine atom having 1 to 10 carbon atoms. Specifically, a methyl group, an ethyl group, a propyl group, an isopropyl group, a ptyl group, a t-propyl group, a hexyl group. , Nonyl group, biell group, phenyl group, benzyl group, 4-methyl A phenyl group, a trifnoleolomethinole group, a 2, 2, 2—trifnoreo octyl group, 4—
  • a phenyl group and the like can be mentioned, and a methyl group, a bier group, a 4-methylphenyl group, and a 2,2,2_trifluoroethyl group are preferable.
  • X 2 is a functional group represented by (k), (m), (n), (o)
  • X 2 is a functional group derived from a peptide residue represented by Z, for example, amino An amino group derived from a side chain of a basic amino acid, a carboxyl terminal, a carboxyl group derived from a side chain of an acidic amino acid, a hydroxyl group such as a serine residue, or a thiol group such as a cysteine residue Can be mentioned.
  • R represents a hydrogen atom or a hydrocarbon group having 1 to 4 carbon atoms, preferably an alkyl group.
  • alkyl group examples include a methyl group, an ethyl group, a propyl group, and a ptyl group. Of these, a methyl group is preferred.
  • each polyoxyalkylene chain represented by (OA) n may be the same type of polyoxyalkylene chain or may be a different type of polyoxyalkylene chain.
  • each polyoxyalkylene chain represented by (OA) m may be the same type of polyoxyalkylene chain or different types of polyoxyalkylene chains.
  • the functional group represented by X 1 may be bonded to the end of each polyoxyalkylene chain.
  • j 2 represents the number of functional groups X 2 bonded to Z without a polyoxyalkylene chain, and is an integer of 0-8.
  • the functional groups represented by X 1 or X 2 may be the same or different from each other.
  • k + j 1 indicates the number of polyoxyalkylene chains in the compound and is an integer from 2 to 12. A number, preferably an integer of 3 to 8.
  • k is an integer from 2 to 11, preferably an integer from 2 to 8, more preferably an integer from 2 to 6, and j 2 is an integer from 1 to 8, preferably 1.
  • k is an integer from 0 to 11, preferably from 0 to 7; ⁇ is an integer from 1 to 12, preferably from 1 to 8, and k + j 1 is from 2 to It is an integer of 12, preferably 2-8.
  • k is preferably an integer of 2 to 8, more preferably an integer of 3 to 6, and j 2 is preferably 0.
  • k is preferably an integer of 1 to 8, more preferably an integer of 1 to 4, and j 2 is preferably 0.
  • k is preferably an integer of 0 to 4
  • j 1 is preferably an integer of 0 to 5.
  • k is an integer of 1 to 10, preferably an integer of 1 to 5.
  • j 1 + j 2 represents the number of functional groups in the polyoxyalkylene derivative of the present invention, and is an integer of 1 to 12, preferably an integer of 1 to 8.
  • n and m mean the average number of moles of an oxyalkylene group having 2 to 4 carbon atoms.
  • n is an integer of 5 to: an integer of L 000, preferably an integer of 20 to 800
  • m is an integer of 5 to 800, preferably an integer of 10 to 700
  • (nXk) + (mX j force S30 It is an integer satisfying ⁇ 2000, preferably 40-1200.
  • (OA) n or (OA) If the average number of added moles of the oxyalkylene group per polyoxyalkylene chain represented by (OA) m is less than 5, or the average number of moles of the entire oxyalkylene group (nX k ) + (mX j ') ⁇ If smaller than 30, the hydration layer for stabilizing the bio-related substance to be modified is not sufficiently maintained, and the stability is insufficient.
  • n is greater than 1000, or all If the average number of moles of oxyalkylene group added is greater than (nX k) + (mX j ⁇ ) 20000, it will become difficult to handle due to its high viscosity and poor workability when used in solution. If so, it tends to be difficult to excrete from the body.
  • (OA) If the average number of moles of oxyalkylene groups added per polyoxyalkylene chain represented by m is greater than 800, the solution will have high viscosity and a functional group represented by X 1 at the end. The reactivity at the time of introduction is poor and handling becomes difficult.
  • the average molecular weight of the polyoxyalkylene derivative of the present invention is preferably 1300 to 88000, more preferably 2000 to 55000, and further preferably 5000 to 50000.
  • the molecular weight is less than 1300, the hydration layer for stabilizing the biological substance to be modified is not sufficiently maintained, and the stability becomes insufficient.
  • it is greater than 88 000, not only is it viscous and difficult to handle when it is made into a solution, but it is difficult to handle, and when used as a pharmaceutical, it tends to be difficult to excrete from the body.
  • the compound has one or more functional groups directly bonded to peptide residues and no functional group at the end of the polyoxyalkylene chain.
  • j 1 is 0 and j 2 is 1 or more
  • the compound has one or more functional groups directly bonded to peptide residues and no functional group at the end of the polyoxyalkylene chain.
  • j 2 is 1, a plurality of polyoxyalkylene chains can be formed with a small number of bonding points.
  • the molecular weight of each polyoxyalkylene chain and the bond with the peptide chain can be appropriately changed.
  • k is an integer of 2 to 11, preferably an integer of 2 to 6.
  • j 2 is 2 or more, a plurality of the same or different biological substances (for example, a plurality of proteins or proteins and drugs) can be bound to the polyoxyalkylene derivative of the present invention. Therefore, it is possible to appropriately adjust the stability of the biological substance, and further, the stability in the body when a preparation is prepared.
  • biological substances for example, a plurality of proteins or proteins and drugs
  • j 2 When j 2 is 0 and j 1 is 1 or more, it has a functional group at the end of the polyoxyalkylene chain, The compound does not have a functional group that directly binds to a peptide.
  • the stability of the bio-related substance in the modification of the bio-related substance, not only can the stability of the bio-related substance, but also the stability in the body when it is formulated, not only the following can be achieved.
  • ⁇ 1, k is an integer from 2 to 11, preferably from 2 to 6, in order to achieve stabilization of biological materials.
  • j When 1 is 1, even if there is no binding site on the surface of the biological substance and the reaction with the functional group of X 2 is difficult, the functional group must exist at the end of the polyoxyalkylene chain.
  • the compound has a polyoxyalkylene chain having a functional group directly bonded to the peptide and further having a functional group at the terminal.
  • the functional group bonded to the peptide and the functional group bonded to the polyoxyalkylene chain end can be different from each other.
  • k + j 1 is 2 or more, it is possible to regulate the stability of the biologically related substance that is the modified substance, and also the stability in the body when it is used as a preparation. It becomes possible to bind substances.
  • j 1 is preferably 1 to 4, and X 2 may immobilize a small molecule or an object that is not affected by steric hindrance. For this reason, j 2 is preferably 2-6. J 1 2 For example, if ⁇ 2 is 1, the no less reactive antibody binding site surface bonded by through the X 1, further markers such as fluorescent substance through another of X 1 High performance microplate by bonding and bonding via X 2 on the substrate Etc. can be obtained.
  • a derivative in which an antibody or the like is bound via X 1 for the purpose of reaching the target site and a plurality of drugs are further bound via X 2 is used.
  • the polyoxyalkylene derivative of the present invention can be produced by a known method.
  • it can be produced by the following method.
  • the reaction between the peptide and the polyoxyalkylene compound can be performed by a known method. Specifically, for example, it can be carried out by the method described in the following production methods 1 to 18.
  • the peptide amino groups, carboxyl groups, and other functional groups can be found in the synthesis process in “Peptide Synthesis Fundamentals and Experiments” (Nobuo Izumiya et al., Published by Maruzen Co., Ltd., January 20, 1980). The synthesis can be carried out protected with protecting groups as described.
  • This terminal carboxyl group may be an acid anhydride or an activated ester using a dehydrating condensing agent.
  • Any dehydrating condensing agent can be used without particular limitation as long as it can dehydrate and condense the carboxyl groups of the polyoxyalkylene carboxylic acid compound.
  • Examples of such a dehydrating condensing agent include carbodiimide derivatives such as dicyclic hexyl carbodiimide, and dicyclohexyl carbodiimide (D C C) is particularly preferable.
  • the amount of the dehydrating condensing agent used is 1.0 to 5 times mol, preferably 1.5 to 2.5 times mol of the polyoxyalkylene carboxylic acid compound.
  • the activated ester can be obtained, for example, by reacting a polyoxyalkylene carboxylic acid compound with an activating agent in the presence of a dehydrating condensing agent.
  • the type of activator is not particularly limited.
  • N-hydroxysuccinic acid imide is preferred.
  • the amount of N-hydroxysuccinic acid imide used is 0.1 to 2 moles compared to the polyoxyalkylenecarboxylic acid compound. This may increase the yield.
  • the structure is not limited to the above method, and the structure represented by the above formula (a) can also be used.
  • Q is the same as described above.
  • Examples of the peptide include a peptide having an ⁇ -amino group at the N-terminus, or a peptide having an f-amino group, that is, a lysine residue.
  • a basic catalyst the above polyoxyalkylenecarboxylic acid compound and peptide in an organic solvent.
  • the polyoxyalkylene peptide compound containing the above divalent group can be produced with high purity by reacting with the above.
  • the amount of the polyoxyalkylene carboxylic acid compound to be used is not particularly limited, but the equivalent ratio of the polyoxyalkylene carboxylic acid compound to the peptide is preferably 5: 1 to 1: 5.
  • the organic solvent used for the reaction can be used without particular limitation as long as it does not have a reactive functional group such as a hydroxyl group.
  • organic solvents include acetonitrile, dimethylformamide, dimethyl sulfoxide, dioxane, and mixed solvents such as ethyl acetate, dichloromethane, chloroform, benzene, and toluene.
  • acetonitrile, dimethylformamide, and dioxane are preferred because they easily dissolve peptides. If the peptide is difficult to dissolve in an organic solvent, water or a mixture of a buffer and an organic solvent can be used.
  • the type of basic catalyst used in the reaction is not particularly limited.
  • nitrogen-containing substances such as triethylamine, pyridine, morpholine, ammonium acetate, sodium phosphate, sodium carbonate, sodium bicarbonate, sodium borate, sodium acetate Organic salts such as lithium can be mentioned.
  • the amount of the basic catalyst used is, for example, 1 to 10 times mol, preferably 1.2 to 5 times mol, of the polyoxyalkylene carboxylic acid compound.
  • the reaction temperature is generally 0 to 90 ° C, preferably 15 to 50 ° C, more preferably 20 to 45 ° C.
  • the reaction rate may be low at temperatures lower than 0 ° C, and side reactions may be generated at temperatures higher than 90 ° C.
  • the reaction time is 1 hour or more, preferably 2 to 24 hours.
  • the polyoxyalkylene peptide compound crystals can be obtained with high purity by a method such as concentrating the filtrate or introducing the filtrate into a poor solvent for crystallization.
  • the obtained crystals are dissolved, and a crystal of polyoxyalkylene monopeptide compound is precipitated by cooling or adding a poor solvent, so that free peptide, dehydration condensing agent, N-hydroxy succinic acid imide, disicyl hexyl carbo Purify by removing diimide etc. be able to.
  • Examples of the solvent used in this step include a solvent that can dissolve the obtained crystal and precipitate a polyoxyalkylene peptide compound crystal by cooling, for example, an alcohol such as ethyl acetate and isopropyl alcohol, or hexyl.
  • a solvent capable of crystallizing the polyoxyalkylene monopeptide compound by adding a poor solvent such as sun or ether is preferred.
  • Adsorbents include alkaline earth metal oxides (eg, aluminum oxide, magnesium oxide), alkaline earth metal hydroxides (eg, aluminum hydroxide, magnesium hydroxide), aluminum-um or silicon (eg, And adsorbents containing activated carbon and activated carbon.
  • Kiyo Ward 2 0 Kiyo Ward 3 0
  • Kiyo Ward 5 Kiyo Ward 6 0
  • Kiyo Ward 7 Kiyo Ward 1 0 0
  • Kiyo Ward 2 0 0 0 Kiyo Ward 1 0 0
  • Kiyo Ward 2 0 0 0 (Trademarks, manufactured by Kyowa Chemical Industry Co., Ltd.), Tomix One AD 3 0 0, Tomix One AD 5 0 0, Tomix One AD 7 0 0 (above, manufactured by Iwata Pharmaceutical Co., Ltd., trademark) and the like.
  • Adsorption IJ can be used alone or in combination of two or more.
  • the treatment temperature using the adsorbent is 10 to 85 ° C, preferably 40 to 70 ° C, and the treatment time is 10 minutes to 5 hours, preferably 30 minutes to 3 hours.
  • the treatment temperature is less than 10 ° C, polyoxyalkylene peptide compound crystals are precipitated, and when the adsorbent is removed, the polyoxyalkylene monopeptide compound is also removed and the yield decreases. There is a tendency. If the temperature exceeds 85 ° C, hydrolysis of the polyoxyalkylene monopeptide compound may occur during the adsorbent treatment due to the presence of a small amount of moisture.
  • the amount of the adsorbent used is 0.1 to 200 parts by weight, preferably 1 to 50 parts by weight, based on 100 parts by weight of the crystal to be treated.
  • the adsorbent can be removed by a method such as filtration and then cooled or crystallized using a poor solvent.
  • crystallization is performed by cooling to 10 ° C. or lower, crystals can be obtained in good yield.
  • the amount of the solvent used in the above step is 1 to 100 times (volume), preferably 2 to 50 times (volume) with respect to the crystal. After recrystallization, cool or crystallize using a poor solvent. Specific examples of the crystallization method include the following methods.
  • a polyoxyalkylene-peptide compound crystal is precipitated by adding ether or a solvent of an aliphatic hydrocarbon having 5 to 8 carbon atoms.
  • a method of adding hexane to crystallize after dissolution using ethyl acetate is preferable.
  • the aliphatic hydrocarbon having 5 to 8 carbon atoms is not particularly limited. For example, pentane, isopentane, neopentane, hexane, isohexane, 3-methylpentane, neohexane, 2,3-dimethylenolev.
  • polyoxyalkylene compound for example, a polyoxyalkylene amine compound in which the terminal of the aforementioned polyoxyalkylene chain is an amino group represented by the above formula (j) can be used.
  • Examples of peptides include peptides having a carboxyl group at the C-terminus, or glutamic acid residues or aspartic acid residues having a carboxyl group in the side chain. Can be used.
  • the carboxyl group of the peptide may be used as an activated ester using a dehydrating condensing agent and an activating agent.
  • examples of the dehydrating condensing agent and activating agent include the same compounds as those in Production Method 1 described above.
  • the peptide racemization inhibitor or activated esterifying agent 1-hydroxybenzotriazole is preferred.
  • the reaction may be carried out by dissolving the polyoxyalkylene compound and the peptide in a solvent or buffer solution or water and adding a dehydrating condensing agent.
  • a dehydrating condensing agent water-soluble carbodiimide such as 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) can be used.
  • EDC 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide
  • Other activation conditions, solvents, and the like are the same as in production method 1 described above.
  • the polyoxyalkyleneamine compound containing the above divalent group with high purity is obtained.
  • Peptide compounds can be produced.
  • the amount of the polyoxyalkyleneamine compound used is not particularly limited, but the equivalent ratio of the polyoxyalkyleneamine compound to the peptide is preferably 0.2: 1 to 1: 5.
  • the purification step after the reaction can be carried out by the same method as Production method 1 described above.
  • the above-mentioned polyoxyalkylene carbonate compound in which the end of the polyoxyalkylene chain is carbonated can be used.
  • the polyoxyalkylene carbonate compound include polyoxyalkylene mono (p--trophenyl carbonate).
  • the t- peptide include a peptide having a hyamino group at the N-terminus, or an ⁇ -amino group. Peptides having lysine residues can be used.
  • the amount of polyoxyalkylene carbonate compound used is not particularly limited. It is preferable that the equivalent ratio of the carbonate compound to the peptide is 5: 1 to 1: 5.
  • the reaction conditions and purification steps can be carried out by the same method as Production method 1 described above.
  • polyoxyalkylene compound examples include a polyoxyalkylene aldehyde compound in which the terminal of the polyoxyalkylene chain is an aldehyde group represented by the above formula (f), or a sulfonic acid group having a terminal represented by the above formula (b).
  • a polyoxyalkylene sulfonic acid compound can be used.
  • a peptide having an ⁇ -amino group at the N-terminus of the polyoxyalkylene group described above, or a peptide having a lysine residue having an ⁇ -amino group can be used.
  • the polyoxyalkylene peptide compound having the above divalent group can be produced with high purity. it can.
  • the amount of the polyoxyalkylene aldehyde compound used is not particularly limited.
  • the molar ratio of the polyoxyalkylene aldehyde compound to the peptide is preferably 5: 1 to 1: 5.
  • an acetate buffer solution, a phosphate buffer solution, a tris acid buffer solution, or the like is preferably used.
  • an organic solvent such as acetonitrile, dimethyl sulfoxide, dimethylformamide, dimethylacetamide and the like which are not involved in the reaction may be further added.
  • ⁇ during the reaction is ⁇ 2 to 8.5, preferably ⁇ ⁇ 3 to 7.
  • the reaction temperature is 0 to 90 ° C., and the reaction time is 0.5 to 20 hours, preferably 0.5 to 4 hours.
  • a Schiff base is formed. If a Schiff base is formed, it is reduced using a reducing agent such as sodium cyanoborohydride to form a secondary amino group.
  • purification means such as dialysis, salting out, ultrafiltration, ion exchange chromatography, electrophoresis, extraction, recrystallization, adsorption treatment, reprecipitation, and column chromatography.
  • the polyoxyalkylene compound for example, the above-described polyoxyalkylene compound in which the terminal of the polyoxyalkylene group is a hydroxyl group can be used.
  • the peptide for example, a peptide having a carboxyl group at the C-terminus, or a peptide having a glutamic acid residue or an aspartic acid residue having a carboxyl group in the side chain can be used.
  • the reaction conditions and purification conditions are the same as in production method 2 described above.
  • polyoxyalkylene compound for example, a polyoxyalkylene maleide compound in which the terminal of the above-mentioned polyoxyalkylene group is a maleimide group represented by the above formula (e) can be used.
  • Particularly preferred polyoxyalkylene maleide compounds include polyoxyalkylene maleide compounds having maleimide groups represented by the following formulas (y 1) to (y 3). In the following formula, a is 2 or 3, and b is 2-5.
  • a peptide having a thiol group derived from a cysteine residue, or a peptide having an amino acid residue into which a thiol group is introduced using iminothiolane or the like can be used.
  • Polyoxyalkylene maleimide conversion Sulfide bonds are formed by reacting the compound with the peptide in water or buffer.
  • the buffer for the reaction include buffers such as phosphate buffer, borate buffer, tris acid buffer, and acetate buffer.
  • An organic solvent may be added in the same manner as in Production Method 4.
  • the reaction temperature is not particularly limited but is preferably 0 to 80 ° C.
  • the reaction time is preferably 0.5 to 72 hours, more preferably 1 to 24 hours.
  • the terminal group is converted to the above formula (a) to (
  • the compound of the present invention can be produced by modifying to various reactive groups shown in k).
  • functional groups derived from amino acid residues of peptides such as amino-terminal and side-chain amino groups, or carboxy-terminal and side-chain carboxyl groups can be used as reactive groups as they are. Of these functional groups, groups that do not participate in the reaction may remain.
  • Z is a peptide residue consisting of 2 to 10 amino acids and having at least one amino acid having a functional group in the side chain
  • OA is an oxyalkylene group having 2 to 4 carbon atoms
  • R is a hydrogen atom.
  • a hydrocarbon group having 1 to 4 carbon atoms X p 1 and X p 2 are an amino group, a carboxyl group, a thiol group or a group containing a hydroxyl group, and Y and W are one CON H—, one NHCO—, one OCONH— , 1 NHOCO—, 1 COO—, 1 OOC 1, 1 COS—, 1 SOC—, 1 CH 2 NH—, 1 NHCH 2 —, _S— CH ⁇ > CH— S—, 1 CH 2 — S—, 1 A divalent group containing a group selected from the group consisting of S—CH 2 —, 1 S—S—, and 1 O—, and n and m are the average addition monoles number of oxyalkylene groups having 2 to 4 carbon atoms.
  • N is 5: L 0 ⁇ 0, m is 5-800, and (n X k) + (mX j 1 ) is an integer satisfying 30 to 2000, j 1 is 0 to 12, j 2 is 0 to 8, and 1 ⁇ j 1 + j 2 ⁇ 1 2 and k is 0 Indicates an integer satisfying ⁇ 1 1 and 2 ⁇ k + j 1 ⁇ 12, 3 ⁇ k + j x + j 2 ⁇ 1 2. )
  • a compound of the formula (2) and any one of the compounds represented by the following general formulas (b 1), (dl), (hi), (h 2), (i 1) are treated with triethylamine, pyridine, 4-dimethylamino
  • an organic base catalyst such as pyridine
  • an inorganic base catalyst such as sodium carbonate, sodium hydroxide, sodium hydrogen carbonate, sodium acetate, sodium carbonate, lithium hydroxide, etc.
  • no solvent, or toluene, benzene, Aprotic solvents such as xylene, acetonilinore, ethinole acetate, jetyl ether, tert-butyl methinoleatenole, tetrahydrofuran, black mouth form, methylene chloride, dimethyl sulfoxide, dimethyl formamide, dimethylacetamide, etc.
  • (B), (d), (h), (i) can be introduced by reacting in the reaction. Further, the above organic base and inorganic base may not be used.
  • the ratio of organic base and inorganic base used is not particularly limited, but is preferably equimolar or more with respect to the compound of formula (2).
  • An organic base such as pyridine may be used as a solvent.
  • T in (b 1), (d 1), (h 2) is a halogen atom selected from CI, Br, and I, preferably C 1.
  • the use ratio of the compound represented by the general formula (b 1), (dl), (hi), (h 2), (i 1) is not particularly limited, but is equal to the compound of the formula (2).
  • the reaction be carried out in the range of equimolar to 50 molar.
  • the reaction temperature is preferably 0 to 300 ° C, more preferably 20 to 100 ° C.
  • the reaction time is preferably 10 minutes to 48 hours, more preferably 30 minutes to 24 hours.
  • the resulting compound may be purified by a purification means such as extraction, recrystallization, adsorption treatment, reprecipitation, column chromatography, supercritical extraction or the like.
  • N-hydroxysuccinic acid imide 1-hydroxybenzotriazole, N-hydroxy-5-nonolebornenene 1,3-didecanolexiimide, N-hydroxyphthalanolimide, 4-h Droxyphenyl dimethyl sulfone 'methyl sulfate and the like can be used.
  • the reaction between the compound of formula (2) and the dicarboxylic acid anhydride is carried out in the above-mentioned aprotic solvent or without solvent.
  • the use ratio of the dicarboxylic acid anhydride is not particularly limited, but is preferably 1 equivalent or more, more preferably 1 to 5 equivalents, relative to the compound of the formula (2).
  • the reaction temperature is preferably 0 to 150 ° C, more preferably 20 to 130 ° C.
  • the reaction time is preferably 10 minutes to 48 hours, more preferably 30 minutes to 12 hours.
  • organic bases such as triethylamine, pyridine, dimethylaminopyridine, and inorganic bases such as sodium carbonate, sodium hydroxide, sodium bicarbonate, sodium acetate, carbonated lithium, and hydroxylated lithium are used as catalysts. May be.
  • the proportion of catalyst used is 0.1 to 50 weight. / 0 is preferable, and 0.5 to 20% by weight is more preferable.
  • the carboxyl body (1) thus produced may be purified by the above-described purification means, or may be used as it is in the next condensation reaction.
  • the subsequent condensation reaction is similarly carried out in the aprotic solvent or without solvent.
  • the condensing agent is not particularly limited, but is preferably DC C.
  • the proportion of DCC used is preferably at least 1 equivalent, more preferably 1 to 5 equivalents relative to the compound of formula (2).
  • the use ratio of N-hydroxysuccinimide is preferably 1 equivalent or more, more preferably 1 to 5 equivalents relative to the compound of formula (2).
  • the reaction temperature is preferably 0 to 100 ° C, more preferably 20 to 80 ° C.
  • the reaction time is preferably 10 minutes to 48 hours, more preferably 30 minutes to 12 hours.
  • the resulting compound may be purified by the aforementioned purification means.
  • an inorganic base such as sodium hydroxide or hydroxyammonium hydroxide is used as a catalyst, and atoril-tolyl is added to obtain a nitrile form, followed by autoclave.
  • the amine compound (j) can be obtained by hydrogenating the nitrile group in the presence of a nickel or palladium catalyst.
  • the proportion of the inorganic base used in obtaining the nitrile form is not particularly limited, but is preferably 0.01 to 50% by weight with respect to the compound of the formula (2).
  • the use ratio of atalonitrile or the like is not particularly limited, but is preferably equimolar or more with respect to the compound of the formula (2), and more preferably in the range of equimolar to 100 molar. Further, acrylonitrile may be used as a solvent.
  • the reaction temperature is preferably from 50 to 100 ° C, more preferably from 20 to 60 ° C.
  • the reaction time is preferably 1 ⁇ min to 48 hours, more preferably 30 minutes to 24 hours.
  • the reaction solvent in the subsequent nitrile hydrogenation reaction is not particularly limited as long as it does not participate in the reaction, but is preferably toluene.
  • the proportion of nickel or palladium catalyst used is not particularly limited, but is 0.05 to 30% by weight based on the nitrile form.
  • the reaction temperature is preferably 20 to 200 ° C, more preferably 50 to 150 ° C.
  • the reaction time is 10 Minutes to 48 hours are preferred, and 30 minutes to 24 hours are more preferred.
  • the hydrogen pressure is preferably 2 to 1 OMPa, more preferably 3 to 6 MPa.
  • Ammonia may be added to the reaction system to prevent dimerization.
  • the amount of ammonia used is not particularly limited, but is preferably 1 to 100% by weight, more preferably 5 to 50% by weight, based on the nitrile form.
  • the resulting compound may be purified by the aforementioned purification means.
  • the amine body (j) can be obtained by reacting (b) with aqueous ammonia.
  • the reaction is carried out in ammonia water, and the concentration of ammonia is not particularly limited, but is preferably in the range of 10 to 40%.
  • the amount of ammonia water used is not particularly limited as long as the ammonia content is equal to or greater than (b), but is preferably equimolar to 50000 times mol.
  • the reaction temperature is preferably 0 to 100 ° C, more preferably 20 to 80 ° C force S.
  • the reaction time is preferably 10 minutes to 48 hours, more preferably 30 minutes to 12 hours.
  • the resulting compound may be purified by the aforementioned purification means.
  • the maleimide body ( e ) can be obtained by reacting the following general formula (el) with the above-mentioned (j) or ammine in which 1 and 1) 2 in formula (2) are already (k). .
  • the reaction is carried out in the above-mentioned aprotic solvent or in the absence of a solvent, and the compound (e 1) is reacted with an equivalent equivalent or more equivalent to the amine of (j) or (k).
  • the use ratio of (e 1) is preferably 1 equivalent or more of (j) or (k), more preferably equimolar to 5 molar.
  • the reaction temperature is preferably 0 to 200 ° C, more preferably 20 to 80 ° C.
  • the reaction time is preferably 10 minutes to 48 hours, more preferably 30 minutes to 12 hours.
  • the resulting compound may be purified by the aforementioned purification means.
  • the maleimide compound is obtained by reacting the amine of (j) or (k) with maleic anhydride in the aforementioned aprotic solvent or without solvent to obtain a maleamide compound, and then using acetic anhydride and sodium acetate as catalysts.
  • the maleimide compound (e) can also be obtained by ring-closing reaction.
  • the proportion of maleic anhydride used in the maleamidation reaction is not particularly limited, but is preferably 1 equivalent or more with respect to the compound of formula (2), More preferred is the amount.
  • the reaction temperature is preferably 0 to 150 ° C, more preferably 20 to 130 ° C.
  • the reaction time is preferably 10 minutes to 48 hours, more preferably 30 minutes to 12 hours.
  • the formed maleamide may be purified by the above-described purification means, or may be used as it is in the next ring closure reaction.
  • the reaction solvent in the subsequent ring closure reaction is not particularly limited, but an aprotic solvent or acetic anhydride is preferable.
  • the proportion of acetic anhydride used is not particularly limited, but is preferably equimolar or more, more preferably equimolar to 50 molar relative to the maleamide.
  • the proportion of sodium acetate used is not particularly limited, but is 0.5 to 50% by weight based on the maleamide.
  • the reaction temperature is preferably 0 to 200 ° C, more preferably 20 to 150 ° C.
  • the reaction time is preferably 10 minutes to 48 hours, more preferably 30 minutes to 12 hours.
  • the resulting compound may be purified by the aforementioned purification means.
  • the aldehyde (f) can be obtained by reacting the compound (b) with the acetal compound of (f 1) to obtain an acetal, and then hydrolyzing it under acidic conditions.
  • the production of compound (b) is as described above.
  • the acetalization reaction can be obtained by reacting (b) with at least equimolar amount, preferably equimolar to 50 molar (f1), in the above-mentioned non-protonic solvent or without solvent.
  • (F 1) can be prepared using the corresponding alcoholic power, metal sodium, metal potassium, sodium hydride, potassium hydride, sodium methoxide, potassium t-butoxide and the like.
  • the reaction temperature is preferably 0 to 300 ° C, more preferably 20 to 150 ° C.
  • the reaction time is preferably 10 minutes to 48 hours, more preferably 30 minutes to 24 hours.
  • the acetal compound can be obtained by reacting 1 equivalent or more, preferably 1 to 100 equivalents of (f 2) in the above-mentioned non-protonic solvent or without solvent.
  • the reaction temperature is preferably 0 to 200 ° C, more preferably 20 to 130 ° C.
  • the reaction time is preferably 10 minutes to 48 hours, more preferably 30 minutes to 24 hours.
  • RR 2 is a hydrocarbon group having 1 to 3 carbon atoms, which may be the same or different, and may be mutually formed.
  • M is sodium or potassium
  • W is a halogen atom selected from Cl, Br, and I
  • t is an integer of 1 to 5.
  • the charge ratio of (f 3) to s (h), (i), (1) or (m) is preferably equal to or greater, more preferably 1 to 10 equivalents.
  • the reaction temperature is preferably 20 to 100 ° C, more preferably 0 to 100 ° C.
  • the reaction time is preferably 10 minutes to 48 hours, more preferably 30 minutes to 24 hours.
  • a condensing agent such as DCC or EDC may be used as appropriate.
  • the acetal thus obtained may be purified by the above-described purification means, or may be used for the next aldehyde reaction without purification.
  • Aldehydation involves the conversion of acetals with acids such as acetic acid, phosphoric acid, sulfuric acid, hydrochloric acid; HI It can be produced by hydrolysis in an aqueous solution adjusted to ⁇ 4.
  • the reaction temperature is preferably 0-80 ° C, more preferably 0-40 ° C.
  • the reaction time is preferably 10 minutes to 24 hours, more preferably 30 minutes to 10 hours.
  • the resulting compound may be purified by the aforementioned purification means.
  • the thiol (c) can be obtained by reacting the compound (j) or (k) with the following compound (c 1) and reducing it.
  • the reaction between (j) or (k) and (c l) is carried out in the above-mentioned aprotic solvent or without solvent.
  • the use ratio of (c 1) is preferably equal to or greater than the compound (j) or (k), and more preferably in the range of 1 to 50 equivalents.
  • the reaction temperature is preferably 0 to 100 ° C, more preferably 20 to 60 ° C.
  • the reaction time is preferably 10 minutes to 48 hours, more preferably 30 minutes to 24 hours.
  • the subsequent reduction is preferably performed using a reducing agent such as dithiothreitol.
  • the resulting compound may be purified by the aforementioned purification means.
  • the thiol can be obtained by reacting the compound (b) with a chelating agent such as thiourea.
  • the production of compound (b) is as described above.
  • the thioation reaction is carried out in a solvent such as water, alcohol, and acetonitrile, or without solvent.
  • the proportion of thiourea used is preferably 1 equivalent or more, more preferably in the range of 1 to 50 equivalents, relative to compound (b).
  • the reaction temperature is preferably 0 to 200 ° C, more preferably 20 to 150 ° C.
  • the reaction time is preferably 10 minutes to 48 hours, more preferably 30 minutes to 24 hours.
  • the thiazolium salt formed can be hydrolyzed with alkali to obtain thiol.
  • the resulting compound may be purified by the purification means described above.
  • Production method 13 Production method when X 1 is (b), (d), (h), (i)) One end is a reactive functional group with a peptide (j) or (a) or ( 1) is reacted with a peptide using a polyoxyalkylene derivative having a hydroxyl group at the other end, and the hydroxyl group at the end of the polyoxyalkylene chain of the obtained compound is converted to the method of production method (b) , (D), (h), (i) can be introduced.
  • the hydroxyl group at the end of the polyoxyalkylene chain may be protected with a benzyl group, t-butyl group or the like.
  • the carboxyl group derived from the peptide is converted to the activated ester of (a) or (g) according to the method of production method 8, and as shown below (j 1) (Ol) can be obtained by reacting with a polyoxyalkylene derivative of the above under the conditions of production method 2.
  • Z is a peptide residue having at least 1 residue of an amino acid having a functional group in the side chain consisting of 2 to 10 residues of amino acid
  • Q is an alkylene group, or an ether bond, an ester bond, a urethane An alkylene group containing a bond, amide bond, carbonate bond or secondary amino group.
  • the hydroxyl group at the other end is bonded to a protective group (o 2) or (o 3). It is preferable to deprotect after the peptide reaction.
  • the polyoxyalkylene derivative (o 4) is reacted under the conditions of production method 1, Hydrolysis can be carried out under acidic conditions to obtain (ol).
  • Q represents an alkylene group or an alkylene group containing an ether bond, an ester bond, a urethane bond, an amide bond, a carbonate bond or a secondary amino group.
  • Z is a residue of amino acid having a functional group in the side chain consisting of 2 to 10 residues of amino acid.
  • Peptide residues having the above, Q represents an alkylene group or an alkylene group including an ether bond, an ester bond, a urethane bond, an amide bond, a carbonate bond or a secondary amino group.
  • the elimination method of (o 2) and (o 3) is not particularly limited, but the benzyl group of (o 3) uses a palladium carbon catalyst, hydrogen or a hydrogen donor, and the following hydrogenation reaction Can be manufactured.
  • the amount of palladium is preferably 1 to 20% by weight.
  • the reaction solvent is not particularly limited, but preferably includes methanol, ethanol, 2-propanol, and more preferably methanol.
  • the hydrogen source is not particularly limited, and examples thereof include hydrogen gas, cyclohexene, and 2-propanol.
  • the reaction temperature is preferably 60 ° C or lower.
  • the reaction time is not particularly limited, and when the amount of catalyst is large, the reaction is completed in a short time.
  • the obtained compound (ol) may be purified by a purification means such as extraction, recrystallization, adsorption treatment, reprecipitation, column chromatography, or supercritical extraction.
  • Examples of the method for removing the t-butyl group in (o 2) include the following methods.
  • the reaction solvent is not particularly limited as long as it is stable under acidic conditions, but examples include water, acetonitrile, methanol, ethanol, 21-propanol, dioxane, dimethylformamide, toluene, and methylene chloride. There is no problem with mixed solvents such as organic solvents and water.
  • the acidic condition is pH 4 or less, preferably pH 2 or less.
  • Formic acid, acetic acid, hydrochloric acid, trifluoroacetic acid and the like can be used, and the reaction temperature is 0 to 150 ° C, preferably 20 to 100 °. C, and the reaction time is 10 minutes to 30 hours, preferably 0.5 to 8 hours.
  • obtained compound (o l) may be purified.
  • polyoxyalkylene of the resulting compound is obtained.
  • (A) can be introduced into (1) at the chain end according to the method of production method 8.
  • the peptide-derived carboxyl group is converted to the activated ester of (a) or (g) according to the method of production method 8, and then the polyoxyalkylene derivative of (1 1) is The reaction can be carried out under the conditions of production method 2 to give a terminal carboxylate (1 2).
  • the polyoxyalkylene derivative When the polyoxyalkylene derivative has one end (b), it can be converted to a terminal carboxyl form (13) by reacting with a peptide-derived amino group according to the method of Production Method 4. Further, when one end of the polyoxyalkylene derivative is (d), (h) or (i), the terminal carboxyl body (14) is obtained by reacting with the peptide-derived amino group according to the method of production method 8. I can do it.
  • the obtained (1 2), (1 3) and (14) can be obtained according to the method of production method 8 to obtain (a 1), (a 2) and (a 3) where X 1 is (a) .
  • An example of (a 3) is shown below.
  • Qi and Q 2 each independently represents an alkylene group or an alkylene group containing an etherol bond, an ester bond, a urethane bond, an amide bond, a carbonate bond or a secondary amino group.
  • Z is a peptide residue consisting of 2 to 10 amino acids and having at least one amino acid having a functional group in the side chain, and Q 2 is an alkylene group, or an ether bond, an ester bond, a urethane bond, an amid. A bond, a carbonate bond or a alkylene group containing a secondary amino group.
  • Z is a peptide residue consisting of 2 to 10 residues of amino acid and having 1 or more amino acids having functional groups in the side chain
  • Q is an alkylene group, or an ether bond, an ester bond, a urethane bond, an amide
  • a polyalkylene having (a) or (d), (h) or (i) which is a reactive functional group with a peptide at one end, and a protecting group attached to (j) at the other end and (j 2) (J) can be obtained by reacting with a peptide using a derivative, followed by deprotection.
  • one end of the polyoxyalkylene derivative When one end of the polyoxyalkylene derivative is (a), it reacts with the peptide-derived amino group according to the method of production method 1 using 3) having (j 2) at the other end.
  • one end of the polyoxyalkylene derivative is (d), (h) or (i) Reacts with peptide-derived amino groups according to the method of production method 8.
  • (j) can be obtained by catalytic reduction using a palladium catalyst, acid treatment, or hydrobromide using acetic acid or hydrogen fluoride in the same manner as in production method 13.
  • (D is benzyl group, t-butyl group, ⁇ -nitrobenzyl group, ⁇ -methoxybenzyl group, 2-phenylisopropyl group, 9-fluorenylmethyl group, methylsulfonyl group, 2,
  • Q represents an alkylene group, or an alkylene group containing an ether bond, an ester bond, a urethane bond, an amide bond, a carbonate bond or a secondary amino group.
  • a polyoxyalkylene derivative (e 2) having a reactive functional group with a peptide at one end and a polyoxyalkylene derivative (e 2) having (a) at the other end the peptide's amino group was prepared according to the method of Production Method 1.
  • a polyoxyalkylene derivative having (d), (h), (i) at the other end and reacting with the peptide amino group according to the method of production method 3 ( e) can be introduced.
  • an acetal group can be introduced by reacting with an amino group of a peptide according to the method of Production Method 3, using a polyoxyalkylene derivative having (d), (h), (i) at the other end.
  • (f) can be obtained by hydrolysis by the method described in Production Method 11.
  • the reaction between the amino acid and the polyoxyalkylene compound can be carried out by the same method as described in the method (i).
  • the amino group of one amino acid and the carboxyl group of the other amino acid are dehydrated.
  • the method is not particularly limited as long as it is a method for condensing to form an amide bond, and can be carried out by a known method.
  • the reaction between a peptide having two or more amino acids bonded thereto and amino acid can be carried out in the same manner as with amino acids.
  • amino groups, carboxyl groups and other functional groups on the side chain of amino acids are synthesized in the synthesis process by “Basics and Experiments of Peptide Synthesis” (Nobuo Izumiya et al., Published by Maruzen Co., Ltd., 1985) It can be used protected with a protecting group as described in January 203).
  • Glycine G 1 y
  • glutamic acid G 1 u
  • lysine L y s
  • cysteine C y s
  • Methyl polyoxyethylene strength Lubamil 1 G 1 y -L ys (1 Methyl polyoxyethylene canolevamil) 1 G 1 y— G 1 y— G 1 y— Estenole succinate MeO -PEG2000-G 1 y- Synthesis of Ly s (-PEG 2000-OMe) -G lv—G 1 y -G 1 y -NHS>
  • 1-methoxyphenyl glycol (SUNB RI GHT MENP— 20H, weight average molecular weight 2000, manufactured by Otsuka Oil Co., Ltd., formula (3)) 1 2 g (6 mmo 1) of aceto-tolyl 40 m
  • 0.5 g (0.5 mmo 1) of triethylamine was added, and the mixture was stirred at room temperature for 3 hours. End of reaction Thereafter, insoluble matters were removed by filtration, and then the solvent was removed under reduced pressure by an evaporator.
  • the crystals obtained in (1) were dissolved in 2 mL of chloroform and 0.2 g (1.7 mmo 1) of N-hydroxysuccinimide was added and stirred for 30 minutes. Further, 0.6 g (2.7 mmo 1) of dicyclohexyl carposimide (DCC) was added and stirred at room temperature for 2 hours. After the reaction, dicyclohexylurea (DCU) produced by filtration was removed, and the solvent was removed under reduced pressure using an evaporator. Next, 20 OmL of ethyl acetate was added and heated to dissolve. After cooling to room temperature, 200 mL of hexane was added to crystallize, and the crystals were collected by filtration.
  • DCC dicyclohexyl carposimide
  • the progress of the reaction and the identification of the product were performed by thin layer chromatography (TLC) using a silica gel plate.
  • TLC thin layer chromatography
  • a mixed solvent with a ratio (volume ratio) of 85:15 was used as a developing solvent, colored with iodine vapor, and qualitatively determined by comparing the R f value with that of a standard substance.
  • the end point of the reaction is detected in the vicinity of the methoxypolyethylene cornore 1 ⁇ -nitrophenyl carbonate detected in the vicinity of R f value of 0.7 to 0.8 by TLC and R fi! O.1.
  • the confirmation of the product is as follows: — From NMR, the terminal methyl group derived from methylpolyoxyethylene is in the vicinity of ⁇ : 3.3 ppm, the ethylene group of polyoxyethylene is in the vicinity of ⁇ : 3.5 ppm, and the peptide Methylene group derived from succinic acid imide ester is detected at around ⁇ : 1.5 p pm, and methyl polyoxyethylene chain, peptide chain and succinic acid are detected at around ⁇ : 2.8 p pm.
  • Example 1 In JH-NMR analysis, JNM-ECP400 manufactured by JEOL Ltd. was used. The same measurement was performed in the following. — NMR (CDC 1 a, internal standard TMS) The production scheme of Example 1 is shown below. Gly— Lys 1 Gly 1 Gly— Gly O- -NO
  • L-cystine (Ajinomoto Takara Corporation) 2.5 g (10.5 mm o 1) with 0.1 M, pH 9.5 borate buffer solution (50 mL) Stir until dissolved.
  • Methoxypolyethylene glycol p-Nitrophenyl carbonate (trade name: SUNBR I GHT ME NP— 50 H, average molecular weight 500 00, manufactured by Nippon Oil & Fats Co., Ltd.) 75 g (15 mmo 1) in 10 OmL water Dissolved, added to the previous L-cystine solution, kept at pH 9.5, and reacted at room temperature for 2 hours.
  • the pH was adjusted to 5.5 with dilute hydrochloric acid and cooled to 2 ° C.
  • Example 2 The progress of the reaction and the identification of the product were carried out in the same manner as in Example 1. According to the thin-layer chromatography, the methyl polyoxyethylene compound detected in the R f value of about 0.7 to 0.8 was detected. The spot and the peptide spot detected in the vicinity of R 0.1 were confirmed to have been converted into spots detected in the vicinity of the value 0.3 to 0.4. The product was confirmed by the presence of methyl polyoxyethylene chain, peptide chain and succinic acid imide ester by ⁇ -NMR. The molecular weight of polyoxyethylene in the product determined by iH-NMR was 72 30.
  • Example 2 The production scheme of Example 2 is shown below.
  • Methyl polyoxyethylene strength Lubamil—G 1 y -L ys (—Methyl polyoxyethylene canolebaminole) 1 G ly—G ly—amidopropinole polyoxyethylene 1 carbonyl imidazole Me O—PEG20000—G ly — Ly s (-P EG 20000-OMe) — Synthesis of G ly— G ly— PEG 2000— CI> (1) M 1 poly-ethylene ethylene Lubamil G 1 y—L ys (Methyl polyoxyethylene Lubamil) 1 G ly — G lyoku Me O— PEG20000— G 1 y— Lys (-P EG 20000-OMe) — Synthesis of G ly— G ly ⁇ Methoxypolyethyleneglycolol p-Nitrofenenolecarbonate (trade name: SUNBR I GHT ME NP _ 20 T, average molecular weight 20000, manufactured by NOF Corporation) 8 g (0.4
  • the product was dissolved in 2 OmL, and the carboxyl group at the carboxy terminus of the peptide was changed to succinic acid imide ester in the same manner as in Example 2 (3) to obtain a crystal.
  • the progress of the reaction and the identification of the product were carried out in the same manner as in Example 1, and the methyl polyoxyethylene compound detected in the R f value of about 0.7 to 0.8 by thin layer chromatography was used.
  • the spot and the peptide spot detected in the vicinity of the 0.1 value were converted to spots detected in the vicinity of R O.3 to 0.4.
  • the confirmation of the product is as follows: — From NMR, methylpolyoxyethylene chain, peptide chain and carbonylimidazole ( ⁇ : 7. lp pm, ⁇ : 7.4 ⁇ ⁇ m, near ⁇ 8. I p pm).
  • the molecular weight of polyoxyethylene in the product obtained from one NMR was 43400.
  • Example 3 The production scheme of Example 3 is shown below.
  • the crystal obtained in (1) was dissolved in black mouth form, and a crystal having a strong lupoxyl group as a succinimide ester was obtained by the same method as in Example 2 (3). Dissolved in 1 OmL, ⁇ -aminopropyl mono- ⁇ -3,3-diethoxypropyloxy, polyoxyethylene (weight average molecular weight 5000, following formula
  • the crystal obtained in (2) was dissolved in 5 OmL of water, adjusted to pH 2 by adding phosphoric acid, and stirred at room temperature for 2 hours. Thereafter, 10 g of sodium chloride was added for dissolution, pH was adjusted to 7.0 with 30% aqueous sodium hydroxide solution, and extraction was performed three times with black mouth form. The obtained black mouth form layer was dried over sodium sulfate and filtered, and then chloroform was distilled off and concentration was performed. To the concentrate, 5 mL of toluene and 5 mL of ethyl acetate were added and dissolved by heating. Then, 2 OmL of hexane was added to precipitate crystals, which were filtered.
  • the obtained crystals are dried and the terminal aldehyde is methylpolyoxyethylene-powered Lubamil 1 G 1 y -G 1 y—G 1 u (—propylaldehyde-polyoxyethylene oxy-pyramid) 1 G l y -(Propylaldehyde polyoxyethyleneoxypropylamide) 0.95 g was obtained.
  • the progress of the reaction and the identification of the product were carried out in the same manner as in Example 1, and the methyl polyoxyethylene compound detected in the R f value of about 0.7 to 0.8 by thin layer chromatography was used. This was confirmed by converting the spot and the spot of the peptide detected in the vicinity of a 0.1 value of 0.1 into a spot detected in the vicinity of the R f value of 0.3 to 0.4.
  • the presence of methylpolyoxyethylene chain, peptide chain and aldehyde ( ⁇ : around 9.8 ppm) was confirmed by iH-NMR.
  • the molecular weight of polyoxyethylene in the product determined from iH-NMR was 42 100.
  • Example 4 The production scheme of Example 4 is shown below. Gly-Gly— Glu— Gly
  • Gly-Ly s -Cy s -G ly 12 mg (0.033 mm o 1) was adjusted to 4 mg / mL with 0.1 N sodium phosphate buffer (pH 6.4).
  • Lg (0. 05 mm o 1) ⁇ - [3- (3-Maleimido 1-oxopropyl) amino] propizole ⁇ -methoxy, polyoxyethylene (SUN BR I GHT ME—200MA, weight average molecular weight 20000, manufactured by Nippon Oil & Fats Co., Ltd.) was added as powder and reacted at 4 ° C for 4 hours.
  • Example 5 The production scheme of Example 5 is shown below. Gly—Lys One Cys One Gly
  • t-Butyloxycarbonyl (Boc) -aminopropyl monopolyoxyethylene p-dinitrophenyl carbonate (weight average molecular weight 3400, the following formula (8)) 2 g (0.6 mmo 1) was dissolved in 10 ml of acetonitrile.
  • 0.1 g of triethylamine was added and stirred at room temperature for 5 hours.
  • the obtained crystals were dissolved by heating with 1 OmL of ethyl acetate, and then 2 OmL of hexane was added to precipitate the crystals again.
  • the crystals were collected by filtration and dried, and then maleimidepropylamide-polyoxyethylene strength rubamyl-l ⁇ lysine ( Maleimide propyl amide monopolyoxyethylene carbamyl) ⁇ 4 0.8 g was obtained.
  • the crystals obtained in (3) were dissolved in 10 mL of black mouth form, and maleimide propyl amide-polyoxyethylene carbamide was prepared in the same manner as in Example 2 (3). Lou ⁇ L ys (maleimidopropyl amide-polyoxyethylene strength rubamyl) ⁇ 4 — 0.7 g crystals of succinic acid imide ester were obtained.
  • the progress of the reaction and the identification of the product were carried out in the same manner as in Example 1, and the methyl polyoxyethylene compound detected in the R f value of about 0.7 to 0.8 by thin layer chromatography was used.
  • the spot and the peptide spot detected in the vicinity of R JH O. 1 were confirmed by conversion into spots detected in the vicinity of R 0.3 to 0.4.
  • Confirmation of the product — NMR confirmed the methylpolyoxyethylene chain, peptide chain, succinic acid imide ester, and maleimide group ( ⁇ : around 6.8 ppm).
  • the molecular weight of polyoxyethylene in the product determined by 1 H-NMR was 17700.
  • Example 6 The production scheme of Example 6 is shown below.
  • Benzyl polyoxyethyleneoxypropylamine (SUNBR I GHT BE—200 PA, molecular weight 20000) 40 g dissolved in 500 mL dichloromethane and heated to 40 ° C., dissolved in ⁇ -benzenole L-spartate ⁇ -carboxylic acid Anhydrous 3 g (6 equivalents) was added and reacted at 40 ° C. for 6 hours. After cooling to room temperature, a mixed solvent of 1 L of ethyl acetate and 1 L of hexane was added to the reaction solution for crystallization, and the crystals were washed with the same mixed solvent, dried and dried to obtain the target BE—PEG20000—BA 5 41.2 g of crystals were obtained.
  • SUNBR I GHT BE—200 PA molecular weight 20000
  • the product was confirmed by checking the methylpolyoxyethylene chain, peptide chain, and p-nitrofelcarbonate group ( ⁇ : around 8.2 ppm) from ifi-NMR.
  • the molecular weight of the product measured by GPC below was 32100.
  • GPC analysis was performed using LC-1 OA (Shimadzu) as a system. For angular analysis, GP C sof twa r e (Shi ma d z u) was used.
  • GPC measurement values include analysis values at the main peak obtained by removing high and low molecular weight impurities from the inflection point of the elution curve perpendicular to the base line, and from the elution start point to the elution end point. The analysis values for all the peaks up to are also shown.
  • Example 7 The production scheme of Example 7 is shown below.
  • the progress of the reaction and the identification of the product were carried out in the same manner as in Example 6.
  • the methyl polyoxyethylene compound detected in the vicinity of R f value of 0.7 to 0.8 The spot and the peptide spot detected in the vicinity of the R f value of 0.1 were converted into spots detected in the vicinity of the R f value of 0.3 to 0.4.
  • the confirmation of the product is as follows: (1) Methyl polyoxyethylene chain, The peptide chain and succinic acid imide ester were confirmed.
  • the molecular weight of the product polyoxyethylene determined by GPC was 6780.
  • Example 8 The production scheme of Example 8 is shown below.
  • the polyoxyalkylene derivative of the present invention can introduce polyoxyalkylene chains having different numbers or different molecular weights or the like in one bond in binding to a physiologically active substance such as protein. Not only can the stability be adjusted by changing the form of the bond.
  • a physiologically active substance such as protein.
  • Bioactive substances and the like can be accumulated at the target site. As a result, the selective delivery of the physiologically active substance to the target site is improved, and as a result, side effects due to overdosing can be reduced.

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Description

明細書
ポリオキシアルキレン誘導体
技術分野
本発明は、 生体関連物質を修飾するポリオキシアルキレン誘導体に関する。
背景技術
近年、 生理活性を有する、 タンパク質、 ポリペプチド、 合成化合物、 及び天然 資源より抽出された化合物等が数多く発見されており、 それらの医薬品への応用 が盛んに研究されている。 し力、し、 これらの生理活性物質は、 生体内に投与され た際の血中半減期が短く、 十分な薬理効果を得ることが困難であることが多い。 これは、 通常、 生体内へ投与された生理活性物質は、 腎臓における糸球体濾過や、 肝臓や脾臓などにおけるマクロファージによる取り込みによって、 生体内から消 失してしまう場合が多いためである。 このため、 これらの生理活性物質をリポソ ームゃポリマーミセル中へ封入したり、 両親媒性高分子であるポリエチレングリ コールを化学修飾させて分子量を増大させたりすること等で、 生体内挙動を改善 する試みがなされている。 ポリエチレングリコールは、 その立体反発効果及び水 和層の保持のために他の生体成分との相互作用が低く、 結果、 ポリエチレンダリ コールで修飾したタンパク質や酵素等のポリぺプチドは、 生体内へ投与された場 合、 腎臓における糸球体濾過や免疫反応等の生体反応を回避させる効果があり、 非修飾のものよりも長い血中半減期を達成する。 また、 ポリエチレングリコール による修飾は、 被修飾物質の毒性や抗原性も低下し、 さらには、 疎水性の高い難 水溶性の化合物の溶解性を高める効果もある。
従来、 生理活性物質をポリエチレングリコールで修飾する場合、 特に低分子薬 剤やペプチドを修飾する場合、 ポリエチレングリコールでの修飾に用いることが できる反応性官能基の種類が少ないという問題点があった。 さらには、 ポリェチ レンダリコールでの修飾の十分な効果を得るために、 数多くのポリエチレングリ コール分子で修飾した場合、 被修飾物質であるべプチドゃ薬剤の活性点を封鎖し てしまい、 被修飾物質自身が持つ機能や薬効を十分に発現できなくなったり、 あ るいは、 十分な水への溶解性が得られなくなったりするという問題点があった。 このような問題点を解決するために、 分岐型のポリエチレンダリコーノレ誘導体 を用い、 ポリエチレングリコールにより修飾される部位を減らし、 この問題点を 解決しょうとする試みがなされている。 特公昭 6 1—4 2 5 5 8号には、 ポリエ チレングリコール化 L—ァスパラギナーゼが提案されており、 反応性ポリエチレ ングリコールとして塩化シァヌルにポリエチレンダリコールが 2個結合した誘導 体が開示されている。 しかしながら、 反応性ポリエチレングリコール誘導体の原 料である塩化シァヌルには 3つの反応性部位があり、 それぞれの反応性は等価で あるので、 それらに異なる 2本のポリエチレングリコール鎖を選択的に導入して 純度の高いポリエチレングリコールィ匕 Lーァスパラギナーゼを合成するのは困難 である。
さらに、 米国特許第 5 6 4 3 5 7 5号及び米国特許第 5 9 3 2 4 6 2号には分 岐型のポリアルキレンダリコール誘導体が提案されており、 2本以上のポリアル キレングリコール鎖を有する誘導体が示唆されているが、 具体的には、 ポリアル キレングリコール鎖を 2本有する 2分岐型のみが開示されている。 またさらに国 際公開第 0 2 / 0 6 0 9 7 8号には 3本以上のポリアルキレンダリコーノレ鎖を有 する分岐型誘導体が提案されているが、 使用されているポリアルキレングリコー ノレ鎖は末端に官能基を有しておらず、 具体的には、 同一のポリアルキレングリコ 一ル鎖を等価な基に結合させた、 1種の官能基を有する化合物のみが開示されて おり、 これらに種々のポリアルキレングリコール鎖やさらに多種の官能基を導入 するのは製造法上困難である。
発明の開示
本発明の目的は、 ポリアルキレングリコール鎖の種類及び本数、 並びにその結 合様式、 さらには官能基の種類及び数を任意に調節することのできるポリォキシ アルキレン誘導体を提供することにある。
より詳細には、 本発明の目的は、 構造内にペプチドを有し、 ポリオキシアルキ レン化合物をそのぺプチド由来の官能基と結合させることにより、 複数のポリア ルキレングリコール鎖を有し、 その目的に応じて種々の生理活性物質と反応しう る官能基を有する新規なポリアルキレングリコール誘導体を提供することにある。 その官能基がペプチド鎖を介して結合している力、 又は、 ポリオキシアルキレン 鎖を介して結合していることより、 種々の生理活性物質と反応することができる。 即ち、 本発明は、 以下に示すものである。
[1] 下記一般式 （1)
Figure imgf000005_0001
(式中、
Zは、 2〜10残基のアミノ酸からなるペプチド残基であって、 官能基を含む 側鎖を有するアミノ酸を 1残基以上含むぺプチド残基を示し、
OAは、 炭素数 2〜4のォキシアルキレン基を示し、
Rは、 水素原子あるいは炭素数 1〜 4の炭化水素基を示し、
X1及び X2は、 コハク酸イミド基、 マレイミド基、 アミノ基、 カルボキシル 基、 カーボネート基、 アルデヒド基、 スルホニル基、 チオール基、 ビニル基、 ァ リル基又は水酸基を含む基を示し、
Y及び Wは、 それぞれ独立して、 一 CONH―、 一 NHCO—、 -OCONH 一、 一 NHOCO—、 — COO—、 一 OOC—、 一 COS—、 一 SOC—、 一 C H2NH―、 一 NHCH。一、 一 S— CH<、 >CH— S―、 一 CH2— S—、 一 S— CH2—、 -S-S—及び一 O—からなる群から選ばれる基を含む 2価の基 を示し、
nは 5〜； L 000の整数であり、 mは 5~800の整数であり、 j ±0〜l . 2の整数であり、 j 2は 0〜8の整数であり、 kは 0〜 1 1の整数であり、 かつ、 1≤ j x+ j 2≤ 1 2, 2≤k+ j α≤ 12N 3≤k+ j 1+ j 2≤ 12 30≤ (n X k) + (mX j l ) ≤ 2000を満たす)
で表されるポ i ン誘導体。
[2] Zが 2〜10残基のアミノ酸からなるペプチド残基であって、 アミノ基、 カルボキシル基、 チオール基及び水酸基からなる群から選ばれる官能基を含む側 鎖を有するアミノ酸を 1残基以上有するペプチド残基を示す、 上記 [1] に記載
Figure imgf000006_0001
[3] Zが 2〜10残基のアミノ酸からなるペプチド残基であって、 リジン、 ァスパラギン酸、 グルタミン酸、 システィン及ぴセリンからなる群から選ばれる アミノ酸を 1残基以上有するペプチド残基を示す、 上記 [2] に記載のポリオキ シアルキレン誘導体。
[4] Zがリジン、 ァスパラギン酸及びグルタミン酸からなる群から選ばれる アミノ酸 2〜10残基からなるペプチド残基を示す、 上記 [3] に記載のポリオ キシアルキレン誘導体。
[5] j 1が 0であり、 ；） 2が1〜8でぁり、 kが 2〜1 1である、 上記
[1] 〜 [4] のいずれかに記載のポリオキシアルキレン誘導体。
[6] j 2が 1である、 上記 [5] に記載のポリオキシアルキレン誘導体。
[7] ；^が丄〜 でぁる、 上記 [1] 〜 [4] のいずれかに記載のポリオ キシアルキレン誘導体。
[8] j 2が 0である、 上記 [7] に記載のポリオキシアルキレン誘導体。 .
[9] j 1が 1である、 上記 [7] 又は [8] に記載のポリオキシアルキレン 誘導体。
[10] j 1が 2〜1 2である、 上記 [7] に記載のポリオキシアルキレン誘 導体。
1] j 2が 1〜8である、 上記 [7] に記載のポリオキシアルキレン誘導 体,
[1 2] Zが、 3〜8残基のアミノ酸からなるペプチド残基であって、 グリシ ン、 リジン、 グルタミン酸、 システィン及びァスパラギン酸からなる群から選ば れるアミノ酸を 1残基以上有するペプチド残基を示し、 kが 3〜5である、 上記 [1] 〜 [11] のいずれかに記載のポリオキシアルキレン誘導体。
[13] Rがメチル基を示し、 OAがォキシエチレン基を示す、 上記 [1] 〜 [12] のいずれかに記載のポリオキシアルキレン誘導体。
[14] X1及ぴ X2が、 それぞれ独立して、 下記式 （a) 〜 (p)
Figure imgf000007_0001
-Q— NH2 (j) -NH2 (k) -Q— COOH (1)
-COOH (m) -SH (n) -OH (o)
-Q— CH=CH
(Qは、 アルキ ン基、 又は、 エステル結合、 アミ ド結合、 エーテル結合、 ウレ タン結合、 ゥレア結合、 カーボネート結合、 スルフイ ド結合、 ィミン結合もしく は 2級アミノ基を有するアルキレン基を示す。 Vはフッ素原子を含んでいてもよ い炭素数 1〜10の炭化水素基を示す。 ） からなる群から選択される基である、 上記 [1] 〜 [13] のいずれかに記載のポリオキシアルキレン誘導体。
発明の詳細な説明
本発明のポリオキシアルキレン誘導体は、 一般式 （1)
Figure imgf000008_0001
で表されるものである。 一般式 （1 ) における各記号の定義は以下のとおりであ る。
Zは、 2〜1 0残基のアミノ酸からなるペプチド残基であって、 官能基を含む 側鎖を有するアミノ酸を少なくとも 1残基含むぺプチド残基を示す。 ここでいう ぺプチド残基とは、 ぺプチド鎖から末端の官能基及び側鎖の官能基を除いた部分 をいう。 末端の官能基としては、 アミノ基及ぴカルボキシル基、 側鎖の官能基と しては、 アミノ基、 グァニジノ基、 イミダゾリル基、 カルボキシル基、 カルバミ ド基、 水酸基及ぴチオール基が挙げられる。 官能基は保護されていてもよい。 官 能基を含む側鎖を有するアミノ酸としては、 リジン、 オル二チン、 アルギニン、 ヒスチジン、 ァスパラギン酸、 グルタミン酸、 γ —カルポキシグルタミン酸、 セ リン、 スレオニン、 チロシン、 4ーヒ ドロキシプロリン、 システィン、 シスチン が挙げられる。 官能基を含む側鎖を有するアミノ酸を少なくとも 1残基含むぺプ チド残基であれば、 合成物でも天然物でも特に限定されるものではない。 側鎖に ァミノ基を有するリジン及びオル二チン残基、 側鎖にカルボキシル基を有するァ スパラギン酸、 グルタミン酸及び γ—カルボキシグルタミン酸残基、 側鎖に水酸 基を有するセリン残基、 側鎖にチオール基を有するシスティン残基のいずれかを 少なくとも 1残基含むペプチド残基が好ましく、 リジン、 ァスパラギン酸、 グル タミン酸、 システィン、 セリンのいずれかを少なくとも 1残基含むペプチド残基 がより好ましく、 リジン、 ァスパラギン酸、 グルタミン酸のいずれかを少なくと も 1残基含むペプチド残基がさらにより好ましい。
特に好ましい ζの例としては、 グリシン、 リジン、 グルタミン酸、 システィン、 ァスパラギン酸からなる群から選択される 3〜 8残基のアミノ酸からなるぺプチ ド残基が挙げられる。
OAは炭素数 2〜4のォキシアルキレン基であり、 好ましくはォキシエチレン 基である。
(OA) n、 (OA) mは、 それぞれ独立して、 上記炭素数 2〜4のォキシァ ルキレン基を構成単位とするポリオキシアルキレン基を示す。 ポリオキシアルキ レン基は直鎖状でも分岐状でもよく、 またポリオキシアルキレン基が 2種以上の ォキシアルキレン基から構成される場合には、 アルキレンォキシドの付加状態は プロック状でもランダム状でもよい。
Yは、 （OA) nで表わされるポリオキシアルキレン鎖末端に下記式 （a) 〜 (k) より選択される基を有するポリオキシアルキレン化合物と、 Zで表わされ るぺプチド残基のァミノ基、 グァニジノ基、 イミダゾリル基、 カルボキシル基、 カルバミド基、 水酸基又はチオール基との反応により形成される基であり、 Zと (OA) nとの結合基である。
Wは、 X1で表される官能基と Zとを、 （OA) mで表されるポリオキシアル キレン鎖を介して結合する結合基である。
Y及び Wは、 具体的には、 それぞれ独立して、 一CONH—、 一 NHCO—、 一 OCONH—、 一 NHOCO—、 一 COO—、 一 OOC—、 一 COS—、 一 S OC—、 一 CH2NH—、 一 NHCH2—、 一 NHCONH—、 一 S— CH<、 >CH—S—、 一 CH2— S―、 一 S_CH2—、 一 S— S—及び一 O—からな る群から選ばれる基を含む 2価の基を示す。
Y及び Wは、 好ましくは、 一 CONH―、 — NHCO—、 一OCONH―、 - NHOCO—、 一 COO—、 一 OOC―、 一 CH2NH—、 一 NHCH2—、 一 S— CH<、 >CH—S—からなる群から選ばれる基を含む 2価の基を示す。 特に好ましい Y及び Wの例としては、 一 NHCO—、 -CONH (CH2) 3 O—、 -NHCO (CH2) 5—、 一 NH (CH2) 3—、 一 CO (CH2) 3CO NH (CH2)
Figure imgf000010_0001
。
X 1及び X 2は、 生体関連物質と化学結合を形成し得る官能基であれば特に限 定されない。 例えば、 X1及び X2としては、 コハク酸イミ ド基、 マレイミ ド基、 アミノ基、 カルボキシル基、 カーボネート基、 アルデヒド基、 スルホニル基、 チ オール基、 ビニル基、 ァリル基又は水酸基を含む基が挙げられる。 好適な実施形 態においては、 1及び 2は、 それぞれ独立して、 下記式 （a) 〜 （p) より 選択される基であり、 生体関連物質が有するアミノ基、 カルボキシル基、 アルデ ヒド基、 水酸基、 チオール基等と反応する基である。 X1は、 （OA) mで表さ れるポリォキシアルキレン鎮末端の官能基を示し、 その官能基に保護基を導入し たものを X1としてもよレ、。 X 2はペプチドにポリオキシアルキレン基又はポリ ォキシアルキレン鎖を介さずに結合している基を示す。 X1及び X2が複数個存 在する場合、 それぞれが独立して、 同じものであってもよいし、 異なるものであ つてもよい。
Figure imgf000011_0001
—— Q— NH2 (j) —— NH2 (k) — Q— COOH (1)
—— COOH (m) —— SH (n) —— OH (o)
—— Q— CH=CH2 (p) '
生体関連物質のァミノ基と反応させる場合は、 （a) 、 (b) 、 (d) 、 (f ) 、 （g) 、 （h) 、 （ i) 、 （1) 、 （m) で示される基が好ましく、 生 体関連物質のチオール基と反応させる場合は、 （a) 、 (c) 、 (e) 、 （g) 、 ( 1 ) 、 （m) 、 （n) 、 (p) で示される基が好ましく、 生体関連物質の不飽 和結合と反応させる場合は、 （c) 、 (n) で示される基が好ましく、 生体関連 物質のカルボキシル基と反応させる場合は （c) 、 （j ) 、 （k) 、 （n) で示 される基が好ましい。
X1及び X2の （a) 、 （c) 、 (e) , (f ) 、 （j ) 、 （1) 、 （p) に おける Qは、 （OA) mで表わされるポリオキシアルキレン鎖又は Zで表わされ るぺプチド残基と官能基との間のリンカ一であり、 共有結合を形成していれば特 に限定はないが、 好ましくは、 アルキレン基、 及び、 エステル結合、 アミ ド結合、 エーテル結合、 ウレタン結合、 ゥレア結合、 カーボネート結合、 スルフイ ド結合、 ィミン結合又は 2級アミノ基を含んだアルキレン基等が挙げられる。 アルキレン 基として好ましいものは、 メチレン基、 エチレン基、 プロピレン基、 プチレン基、 イソプロピレン基、 イソプチレン基等が挙げられ、 さらに好ましくはエチレン基、 プロピレン基が挙げられる。 エステル結合を含んだアルキレン基として好ましい ものは、 下記 （t 1) のような構造が挙げられる。 アミド結合を含んだアルキレ ン基として好ましいものは下記 （t 2) のような構造が挙げられる。 エーテル結 合を含んだアルキレン基として好ましいものは、 下記 （t 3) 及び （t 4) のよ うな構造が挙げられる。 ウレタン結合を含んだアルキレン基として好ましいもの は、 下記 （t 5) のような構造が挙げられる。 ゥレア結合を含んだアルキレン基 として好ましいものは、 下記 （t 6) のような構造が挙げられる。 カーボネート 結合を含んだアルキレン基として好ましいものは、 下記 （t 7) のような構造が 挙げられる。 スルフイド結合を含んだアルキレン基として好ましいものは、 下記
(t 8) のような構造が挙げられる。 ィミン結合又は 2級アミノ基を含んだアル キレン基として好ましいものは、 下記 ( t 9) のような構造が挙げられる。 各式 において、 qは 1〜6の整数であり、 好ましくは 1〜3の整数であり、 さらに好 ましくは 2又は 3である。 （t 2) 、 （ t 6) 及び （ t 9) では qが式中に複数 含まれているが、 これらは同一であってもよいし、 異なっていてもよい。 また
( t 4) において、 rは 1〜5の整数であり、 好ましくは 1又は 2である。
Figure imgf000012_0001
—— (CH2)q-N-(CH2)q—— (t9)
Vは炭素数 1〜10のフッ素原子を含んでいてもよい炭化水素基であり、 具体 的にはメチル基、 ェチル基、 プロピル基、 イソプロピル基、 プチル基、 t一プチ ル基、 へキシル基、 ノニル基、 ビエル基、 フエニル基、 ベンジル基、 4—メチル フエニル基、 トリフノレオロメチノレ基、 2, 2, 2—トリフノレオ口ェチル基、 4—
(トリフノレオロメ トキシ） フエニル基等が挙げられるが、 好ましくはメチル基、 ビエル基、 4一メチルフエ-ル基、 2, 2, 2 _トリフルォロェチル基である。
X2が （k) 、 （m) 、 (n) 、 (o) で表される官能基である場合、 X2は Zで表されるペプチド残基に由来する官能基であり、 例えば、 ァミノ末端あるい は塩基性ァミノ酸の側鎖に由来するァミノ基、 カルボキシル末端ある 、は酸性ァ ミノ酸の側鎖に由来するカルボキシル基、 セリン残基等の水酸基、 システィン残 基等のチオール基が挙げられる。
Rは水素原子又は炭素数 1〜 4の炭化水素基を示し、 好ましくはアルキル基で ある。 アルキル基としては、 メチル基、 ェチル基、 プロピル基、 プチル基等が挙 げられる。 これらの中ではメチル基が好ましい。
kは官能基を持たないポリオキシアルキレン鎖の本数を表し、 0〜1 1の整数 である。 j 1が 0の場合、 2〜1 1の整数である。 kが 2以上の場合、 （OA) nで表されるそれぞれのポリオキシアルキレン鎖は、 同じ種類のポリオキシアル キレン鎖であってもよいし、 異なる種類のポリオキシアルキレン鎖であってもよ い。
j 1は官能基 X1を有するポリオキシアルキレン鎖の本数を表し、 0~1 2の 整数であり、 好ましくは 1〜1 2の整数である。 j 1が 2以上の場合、 （OA) mで表されるそれぞれのポリオキシアルキレン鎮は、 同じ種類のポリオキシアル キレン鎮であってもよいし、 異なる種類のポリオキシアルキレン鎖であってもよ く、 それぞれのポリォキシアルキレン鎖の末端に X 1で示される官能基が結合し ていればよい。
j 2はポリオキシアルキレン鎖を介さずに Zに結合している官能基 X2の数を 表し、 0〜 8の整数である。
j 1又は j 2が 2以上の場合は、 X1又は X2で示される官能基は、 それぞれが 独立して、 同じであってもよいし、 異なっていてもよい。
k + j 1は本化合物中のポリオキシアルキレン鎖の本数を示し、 2~12の整 数であり、 好ましくは 3~ 8の整数である。
j 1力 S 0の場合、 kは 2〜 1 1の整数、 好ましくは 2〜 8の整数、 より好まし くは 2〜 6の整数であり、 j 2は 1〜8の整数、 好ましくは 1〜6の整数、 より 好ましくは 1又は 2である。
：| 2が0の場合、 kは 0〜1 1の整数、 好ましくは 0〜7であり、 ；^はェ〜 12の整数、 好ましくは 1〜 8の整数であり、 k+ j 1は 2〜12の整数、 好ま しくは 2〜 8の整数である。
1が1の場合、 kは好ましくは 2〜 8の整数、 より好ましくは 3 ~ 6の整数 であり、 j 2は、 好ましくは 0である。
j 1が 2の場合、 kは好ましくは 1〜8の整数、 より好ましくは 1〜4の整数 であり、 j 2は、 好ましくは 0である。
j 2が 1の場合、 kは好ましくは 0〜4の整数であり、 j 1は、 好ましくは 0 〜 5の整数である。
j 1及び j 2がそれぞれ 1以上の場合、 kは 1〜 10の整数、 好ましくは 1〜 5の整数である。
j 1 + j 2は本発明のポリオキシアルキレン誘導体中の官能基の数を示し、 1 〜1 2の整数、 好ましくは 1〜8の整数である。
n及ぴ mは、 炭素数 2〜4のォキシアルキレン基の平均付加モル数を意味する。 nは 5〜： L 000の整数、 好ましくは 20〜 800の整数であり、 mは 5〜 80 0の整数、 好ましくは 10〜 700の整数であり、 かつ、 （nXk) + (mX j 力 S30~2000、 好ましくは 40〜 1200を満たす整数である。
(OA) n又は （OA) mで示されるポリオキシアルキレン鎖 1本当たりのォ キシアルキレン基の平均付加モル数が 5よりも小さい場合、 又は全体のォキシァ ルキレン基の平均付加モル数 （nX k) + (mX j ') ίΚ 30よりも小さい場 合、 修飾する生体関連物質を安定化するための水和層が充分に保たれず、 安定性. が不充分となる。 また、 （OA) nで示されるポリオキシアルキレン鎖 1本当た りのォキシアルキレン基の平均付カ卩モル数が 1000よりも大きい場合、 又は全 体のォキシアルキレン基の平均付加モル数 （nX k) + (mX j χ) 200 0よりも大きい場合、 溶液にした際に粘性が高く作業性が悪く取り扱いが困難に なり、 さらに医薬品として用いた場合、 体内からの排泄が困難になる傾向がある。 (OA) mで示されるポリオキシアルキレン鎖 1本当たりのォキシアルキレン基 の平均付加モル数が 800よりも大きいと溶液にした場合に粘性が高く、 さらに 末端に X1で示される官能基を導入する際の反応性も悪く、 取り扱いが困難にな る。
本発明のポリオキシァ キレン誘導体の平均分子量は、 1300〜 88000 が好ましく、 2000〜 55000がより好ましく、 5000〜 50000がさ らに好ましい。 分子量が 1 300より小さい場合には、 修飾する生体関連物質を 安定化するための水和層が充分に保たれず、 安定性が不充分となる。 また、 88 000よりも大きいと、 溶液にした際に粘性が高く作業性が悪く取り扱いが困難 でなるだけでなく、 医薬品として用いた場合、 体内からの排泄が困難になる傾向 がある。
j 1が 0で j 2が 1以上の場合、 ペプチド残基に直接結合する官能基を 1っ以 上有し、 ポリオキシアルキレン鎖末端に官能基を持たない化合物となる。 このよ うな場合、 生体関連物質の修飾において、 ペプチド残基に直接結合した官能基を 生体関連物質に結合させることにより、 j 2が 1の場合には少ない結合点で複数 のポリオキシアルキレン鎖を付与することができ、 さらにそれぞれのポリオキシ アルキレン鎖の分子量やペプチド鎖との結合を適宜変えることができる。 生体関 連物質の安定化を達成するためには、 kは 2〜1 1の整数、 好ましくは 2〜 6の 整数である。 また j 2が 2以上の場合、 複数の同一又は異なる生体関連物質 （例 えば複数のタンパク質又はタンパク質と薬剤等） を、 本発明のポリオキシアルキ レン誘導体に結合することができ、 それぞれの結合様式を適宜変えることもでき るため、 生体関連物質の安定性、 さらには製剤とした場合の体内での安定性を適. 宜調節することができる。
j 2が 0で j 1が 1以上の場合、 ポリオキシアルキレン鎖末端に官能基を有し、 ペプチドに直接結合する官能基を持たない化合物となる。 この場合生体関連物質 の修飾において、 生体関連物質の安定性、 さらには製剤とした場合の体内での安 定性を調節することができるだけでなく、 下記のことも可能になる。 ：^が1の 場合、 生体関連物質の安定化を達成するためには、 kは 2〜1 1の整数、 好まし くは 2〜6の整数である。 j 1が 1の場合、 生体関連物質の表面に結合部位が存 在せずに X 2の官能基では反応が困難な場合であつても、 ポリ才キシアルキレン 鎖末端に官能基が存在することにより、 生体関連物質と反応し易いという利点が 得られる。 また、 j 1が 2以上の場合、 1分子のポリオキシアルキレン誘導体に 複数の生体関連物質を結合させる場合、 ペプチド由来の官能基 X 2では、 官能基 同士が隣接していることにより、 分子量の大きいタンパク質等を複数結合させる ことが立体障害により困難なことがある。 その場合ポリオキシアルキレン鎖を介 して官能基を有することにより、 立体障害を緩和し、 分子量の大きいタンパク質 等を複数結合させることが容易になる。 同様にポリオキシアルキレン鎖末端に複 数の官能基が存在することにより、 立体障害が問題とならずに、 タンパク質を架 橋させて高分子化することが可能となる。
j 1及び j 2がともに 1以上の場合、 ペプチドに直接結合する官能基を有し、 さらに末端に官能基を有するポリォキシアルキレン鎖を有する化合物となる。 こ の場合、 ペプチドに結合する官能基とポリオキシアルキレン鎖末端に結合する官 能基を、 それぞれ異なるものにすることも可能である。 さらに k + j 1が 2以上 であることより、 被修飾物である生体関連物質の安定性、 さらには製剤とした場 合の体内での安定性を調節することができ、 また複数の生体関連物質を結合させ ることが可能となる。 X 1には高分子量のタンパク質等を結合することがあるた め、 j 1は好ましくは 1〜4であり、 X 2には低分子あるいは立体障害に左右さ れない対象物を固定する場合があるため、 j 2は好ましくは 2〜6である。 例え ば j 1が 2、 〗 2が1の場合、 結合部位が表面になく反応性が低い抗体を X 1を介 して結合し、 さらに蛍光物質等のマーカーをもう一つの X 1を介して結合し、 基 板上に X 2を介して結合させることにより、 高機能を付与したマイクロプレート 等を得ることができる。 また同様にして例えば j 1が 1、 j 2が 2以上の場合、 標的部位への到達を目的として抗体等を X 1を介して結合し、 さらに薬剤を X 2 を介して複数結合した誘導体を得ることができる。
以下、 本発明のポリオキシアルキレン誘導体の製造方法について説明する。 本 発明のポリォキシアルキレン誘導体は公知の方法により製造することができる。 例えば、 以下の方法により製造することができる。
( i ) ぺプチドとポリォキシアルキレン化合物とを反応させる方法、 また、 その 後さらに X 2又は X 1を変性し、 別の官能基を導入する方法。
( i i ) 一方の末端に式 （1 ) の X 1となりうる官能基を持ち、 もう一方の末端 にペプチドとの反応に関与する官能基を持ったポリオキシアルキレン化合物を、 ペプチドと結合させる方法。 この方法では、 ポリオキシアルキレン化合物の一方 の末端の式 ( 1 ) の X 1となりうる官能基に、 ペプチドとの結合に関与しないよ うに保護基を導入し、 その後、 ペプチドと反応させてもよい。 保護基は目的に応 じて除去し、 官能基 X 1としてもよい。
( i i i ) アミノ酸とポリオキシアルキレン化合物とを反応させた後に、 さらに 他のアミノ酸と縮合させてポリオキシアルキレン誘導体を合成する方法。 この方 法では、 得られた化合物に、 さらに、 ポリオキシアルキレン化合物を反応させて もよいし、 また、 X 2又は X 1を変性し、 別の官能基を導入してもよい。
上記 （i ) 〜 （ i i i ) のいずれかの方法を採用してもよいし、 それぞれの方 法を適宜組み合わせて行ってもよい。 なお、 ペプチドとポリオキシアルキレン化 合物との反応は、 公知の方法で行なうことができる。 具体的には、 例えば、 以下 の製法 1〜1 8に記載の方法により行うことができる。 なお、 ペプチドのァミノ 基、 カルボキシル基及びその他の官能基は、 合成工程において、 「ペプチド合成 の基礎と実験」 （泉屋信夫ら著、 丸善株式会社発行、 昭和 6 0年 1月 2 0日） に 記載されるような保護基で保護して合成を行うことができる。
( i ) の方法で製造する場合の製造例を以下に示す。
<ぺプチドとポリォキシアルキレン鎖の結合方法〉 (製法 1 ： W及び Yが— N H C O—を含む 2価の基である場合） ポリオキシアルキレン化合物として、 例えば、 (O A) n、 (O A) mで表さ れるポリオキシアルキレン鎖の末端が上記式 （ 1 ) で表されるカルボン酸である ポリオキシアルキレンカルボン酸化合物を使用することができる。
この末端のカルボキシル基は、 脱水縮合剤を用いて酸無水物としてもよく、 活 性化エステルとしてもよい。 脱水縮合剤としては、 ポリオキシアルキレンカルボ ン酸化合物のカルボキシル基同士を脱水縮合できるものであれば特に制限なく使 用できる。 このような脱水縮合剤としては、 ジシク口へキシルカルポジィミ ド等 のカルボジイミ ド誘導体が挙げられ、 特にジシクロへキシルカルポジイミ ド （D C C ) が好ましい。 脱水縮合剤の使用量としては、 ポリオキシアルキレンカルボ ン酸化合物の 1 . 0 5 ~ 5倍モル、 好ましくは 1 . 5〜2 . 5倍モルである。 活性化エステルは、 例えばポリオキシアルキレンカルボン酸化合物と活性化剤 とを脱水縮合剤の存在下で反応させることにより得ることができる。 活性化剤の 種類は特に限定されないが、 例えば、 N—ヒドロキシコハク酸イミド、 N , N ' —ジコハク酸イミ ドカーボネート、 1ーヒドロキシベンゾトリァゾール、 N—ヒ ドロキシー 5—ノノレボルネン一 2， 3—ジカノレボキシイミ ド、 N—ヒ ドロキシフ タノレイミ ド、 4ーヒ ドロキシフエニノレジメチノレスノレホニゥム ·メチ /レサノレフエ一 ト、 イソプチルクロロホルメート等が挙げられる。 これらの中では、 N—ヒ ドロ キシコハク酸イミ ドが好ましい。 N—ヒドロキシコハク酸イミ ドの使用量は、 ポ リオキシアルキレンカルボン酸化合物に対して 0 . 1〜 2倍モルである。 これに より、 収率を高めることができる場合がある。
ポリオキシアルキレン鎖末端を活性化エステル化合物として用いる場合、 上記 の方法に限定されず、 上記式 （a ) で示された構造も同様に使用することができ る。 この場合 Qについては前述と同一である。
ペプチドとしては、 例えば、 N末端に α—アミノ基を有するペプチド、 又は f ーァミノ基、 すなわちリジン残基を有するペプチドが挙げられる。 上記ポリオキ シアルキレンカルボン酸化合物とぺプチドとを塩基性触媒の存在下、 有機溶媒中 で反応させることにより高い純度で、 上記 2価の基を含むポリオキシアルキレン ーぺプチド化合物を製造することができる。 ポリォキシアルキレンカルボン酸化 合物の使用量は特に限定されるものではないが、 ポリオキシアルキレンカルボン 酸化合物とペプチドとの当量比が 5 ： 1 - 1 ： 5であることが好ましい。
反応に使用する有機溶媒としては、 水酸基等の反応性官能基を有さないもので あれば特に制限なく使用することができる。 そのような有機溶媒としては、 例え ば、 ァセトニトリル、 ジメチルホルムアミド、 ジメチルスルホキシド、 ジォキサ ン、 並びに、 これらを含有する酢酸ェチル、 ジクロロメタン、 クロ口ホルム、 ベ ンゼン及びトルエン等の混合溶媒が挙げられる。 これらの中では、 ペプチドを溶 解しやすい点で、 ァセトニトリル、 ジメチルホルムアミド、 ジォキサンが好まし い。 またペプチドが有機溶媒に溶け難い場合、 水又は緩衝液と有機溶媒との混合 物を使用することもできる。
反応に使用する塩基性触媒の種類は特に限定されないが、 例えば、 トリェチル ァミン、 ピリジン、 モルホリン、 酢酸アンモニゥム等の窒素含有物質、 リン酸ナ トリウム、 炭酸ナトリウム、 炭酸水素ナトリウム、 ホウ酸ナトリウム、 酢酸ナト リウム等の有機塩が挙げられる。 塩基性触媒の使用量は、 例えば、 ポリオキシァ ルキレンカルボン酸化合物に対して 1〜 1 0倍モル、 好ましくは 1 . 2〜 5倍モ ルである。 反応温度は、 通常 0〜 9 0 °C、 好ましくは 1 5〜 5 0 °C、 さらに好ま しくは 2 0〜 4 5 °Cである。 0 °Cより低温では反応率が低い場合があり、 9 0 °C より高温では副反応物が生成される場合がある。 反応時間は、 1時間以上、 好ま しくは 2〜 2 4時間である。
反応終了後、 以下の工程を行うことにより精製することができる。 反応溶液か ら不溶物を濾過後、 濾液を濃縮又は貧溶媒に投入して結晶化する等の方法により、 ポリォキシアルキレンーぺプチド化合物の結晶を純度よく得ることができる。 得 られた結晶を溶解し、 冷却又は貧溶媒を加えてポリオキシアルキレン一ペプチド 化合物の結晶を析出させることにより、 遊離のペプチド、 脱水縮合剤、 N—ヒド 口キシコハク酸ィミド、 ジシク口へキシルカルボジィミド等を除去して精製する ことができる。 この工程で使用する溶媒としては、 得られた結晶を溶解し、 冷却 によってポリオキシアルキレンーぺプチド化合物の結晶を析出させることのでき る溶媒、 例えば酢酸ェチル、 イソプロピルアルコール等のアルコール、 又はへキ サン、 エーテル等の貧溶媒を加えることによりポリオキシアルキレン一ペプチド 化合物を結晶化させることのできる溶媒が好ましい。
得られた結晶を酢酸ェチル等の溶媒に溶解後、 吸着剤を添加して攪拌する等の 方法により塩等の不純物を除去することが望ましい。 吸着剤としては、 アルカリ 土類金属酸化物 （例えば、 酸化アルミニウム、 酸化マグネシウム） 、 アルカリ土 類金属水酸化物 （例えば、 水酸化アルミニウム、 水酸化マグネシウム） 、 アルミ -ゥム又はケィ素 （例えば、 酸化ケィ素） を含有する吸着剤、 活性炭等が挙げら れる。 これらの吸着剤は商業的に入手することができ、 例えば、 キヨ一ワード 2 0 0、 キヨ一ワード 3 0 0、 キヨ一ワード 5 0 0、 キヨ一ワード 6 0 0、 キヨ一 ワード 7 0 0、 キヨ一ワード 1 0 0 0、 キヨ一ワード 2 0 0 0 (以上、 協和化学 工業 （株） 製、 商標） 、 トミックス一 A D 3 0 0、 トミックス一 A D 5 0 0、 ト ミックス一 AD 7 0 0 (以上、 冨田製薬 （株） 製、 商標） 等が挙げられる。 吸着 斉 IJは、 単独で又は 2種以上を組み合せて使用することができる。
吸着剤を用いて処理する温度は 1 0〜8 5 °C、 好ましくは 4 0〜 7 0 °Cであり、 処理時間は 1 0分〜 5時間、 好ましくは 3 0分〜 3時間である。 処理する温度が 1 0 °C未満ではポリオキシアルキレンーぺプチド化合物の結晶が析出してしまい、 吸着剤を除去する場合にポリオキシアルキレン一ペプチド化合物も一緒に除去さ れて収率が低下する傾向にある。 また、 8 5 °Cを超えると、 微量の水分の存在に よって吸着剤処理中にポリオキシアルキレン一ペプチド化合物の加水分解等が起 こる可能性がある。 吸着剤の使用量は、 処理する結晶 1 0 0重量部に対して 0 . 1〜 2 0 0重量部、 好ましくは 1〜 5 0重量部である。 吸着剤処理後、 濾過等の 方法により吸着剤を除去した後、 冷却するか、 又は貧溶媒を用いて結晶化させる ことができる。 好ましくは 1 0 °C以下に冷却して結晶化を行えば、 良好な収率で 結晶を得ることができる。 上記工程で使用する溶媒量は結晶に対して 1 ~ 1 0 0倍 （容量） 、 好ましくは 2〜5 0倍 （容量） である。 再結晶した後、 冷却するか、 又は貧溶媒を用いて結 晶化を行う。 具体的な結晶化方法としては、 以下の方法を挙げることができる。 酢酸ェチル、 トルエン、 クロ口ホルム等の溶媒に溶解した後、 エーテル又は炭素 数 5〜 8の脂肪族炭化水素の溶媒を添加することでポリォキシアルキレン—ぺプ チド化合物の結晶を析出させる。 具体的には、 酢酸ェチルを用いて溶解後、 へキ サンを添加し結晶化させる方法が好ましい。 炭素数 5〜 8の脂肪族炭化水素とし ては特に制限はないが、 例えば、 ペンタン、 イソペンタン、 ネオペンタン、 へキ サン、 ィソへキサン、 3—メチルペンタン、 ネオへキサン、 2， 3—ジメチノレブ タン、 ヘプタン、 2—メチノレへキサン、 3—メチルへキサン、 3—ェチルペンタ ン、 2， 2 _ジメチノレペンタン、 2 , 3—ジメチルペンタン、 3， 3—ジメチノレ ペンタン、 2， 3 , 3— トリメチノレブタン、 オクタン、 2—メチノレヘプタン、 3 ーメチノレヘプタン、 4—メチルヘプタン、 3—ェチノレへキサン、 2， 2—ジメチ ノレへキサン、 2 , 3—ジメチルへキサン、 2 , 4—ジメチ/レへキサン、 2 , 5 - ジメチノレへキサン、 3 , 3—ジメチ /レへキサン、 3 , 4—ジメチノレへキサン、 2 ーメチルー 3—ェチルペンタン、 3—メチルー 3—ェチルペンタン、 2 , 2， 3 一 トリメチルペンタン、 2 , 2 , 4—トリメチノレペンタン、 2 , 2 , 3 , 3—テ トラメチルブタン等を挙げることができる。 これらの中では、 へキサン、 ヘプタ ンが好ましい。 結晶の純度をさらに向上させたい場合には、 同様の晶析工程を数 回繰り返すことにより、 純度の一層優れたポリオキシアルキレン一ペプチド化合 物を得ることができる。
(製法 2 ： W及び Yがー C O N H—を含む 2価の基である場合）
ポリオキシアルキレン化合物として、 例えば、 前述したポリオキシアルキレン 鎖の末端が上記式 （j ) で表されるアミノ基であるポリオキシアルキレンァミン 化合物を使用することができる。
ペプチドとしては、 例えば、 C末端にカルボキシル基を有するペプチド、 ある いは側鎖にカルボキシル基を有するグルタミン酸残基又はァスパラギン酸残基を 有するペプチドを使用することができる。 ペプチドのカルボキシル基は、 脱水縮 合剤と活性化剤とを用いて活性化エステルとして用いてもよい。 この場合の脱水 縮合剤及び活性化剤としては、 前述の製法 1と同様の化合物が挙げられる。 ぺプ チドのラセミ化防止剤又は活性化エステル化剤としては、 1—ヒドロキシベンゾ トリァゾールが好ましい。 またポリオキシアルキレン化合物とぺプチドを溶媒あ るいは緩衝液もしくは水に溶解し、 脱水縮合剤を添カ卩して反応を行ってもよい。 脱水縮合剤としては 1—ェチルー 3— （3—ジメチルァミノプロピル） カルポジ イミ ド ( E D C ) 等の水溶性カルボジィミ ドを用いることもできる。 その他活性 化条件、 溶媒等についても前述の製法 1と同様である。
ポリオキシアルキレンァミン化合物とペプチドとを、 塩基性触媒の存在下、 上 記製法 1と同様の溶媒中で反応させることにより、 高純度で、 上記 2価の基を含 むポリォキシアルキレン—ぺプチド化合物を製造することができる。 ポリォキシ アルキレンァミン化合物の使用量は特に限定されるものではないが、 ポリオキシ アルキレンァミン化合物とペプチドとの当量比が 0 . 2 ： 1〜 1 ： 5であること が好ましい。 なお、 反応後の精製工程については、 前述の製法 1と同様の方法に より行うことができる。
(製法 3 ： W及び Yが _ N H C O O—を含む 2価の基である場合）
ポリオキシアルキレン化合物として、 例えば、 前述したポリオキシアルキレン 鎖の末端がカーボネート化されたポリオキシアルキレンカーボネート化合物を使 用することができる。 ポリオキシアルキレンカーボネート化合物としては、 例え ば、 ポリオキシアルキレン一 （p—-トロフエニルカーボネート） が挙げられる t ペプチドとしては、 例えば、 N末端にひーアミノ基を有するペプチド、 又は ε— ァミノ基を有するリジン残基を有するぺプチドを使用することができる。 ポリオ キシアルキレンカーボネート化合物とぺプチドとを塩基性触媒の存在下、 有機溶 媒中で反応させることにより、 高純度で、 上記 2価の基を有するポリオキシアル キレンーぺプチド化合物を製造することができる。 ポリォキシアルキレンカーボ ネート化合物の使用量は特に限定されるものではないが、 ポリオキシアルキレン カーボネート化合物とペプチドとの当量比が 5 ： 1〜 1 ： 5であることが好まし い。 なお、 反応条件及び精製工程については、 前述の製法 1と同様の方法により 行うことができる。
(製法 4 ： W及び Yが _ N H C H 2—を含む 2価の基である場合）
ポリオキシアルキレン化合物として、 例えば、 前述したポリオキシアルキレン 鎖の末端が上記式 （f ) で示されるアルデヒド基であるポリオキシアルキレンァ ルデヒド化合物、 又は末端が上記式 （b ) で示されるスルホン酸基であるポリオ キシアルキレンスルホン酸化合物を使用することができる。
ペプチドとしては、 例えば、 前述したポリオキシアルキレン基の N末端に α— アミノ基を有するペプチド、 又は ε—アミノ基を有するリジン残基を有するぺプ チドを使用することができる。 ポリオキシアルキレンアルデヒド化合物とぺプチ ドとを還元剤の存在下、 緩衝液中で反応させることにより、 高純度で、 上記 2価 の基を有するポリォキシアルキレンーぺプチド化合物を製造することができる。 ポリオキシアルキレンアルデヒド化合物の使用量は特に限定されるものではない 力 ポリオキシアルキレンアルデヒド化合物とペプチドとのモル比が 5 ： 1〜 1 ： 5であることが好ましい。
上記緩衝液としては、 酢酸緩衝液、 リン酸緩衝液、 トリス酸緩衝液等が好適に 使用される。 また、 反応に関与しないァセトニトリル、 ジメチルスルホキシド、 ジメチルホルムアミド、 ジメチルァセトアミド等の有機溶媒をさらに添加しても よい。 反応時の ρ Ηは ρ Η 2〜 8 . 5、 好ましくは ρ Η 3〜 7である。 反応温度 は 0〜 9 0 °Cであり、 反応時間は 0 . 5〜 2 0時間、 好ましくは 0 . 5〜 4時間 である。 上記還元剤が存在しない場合は、 シッフ塩基が形成される。 シッフ塩基 が形成された場合には、 これをシァノ水素化ホウ酸ナトリゥム等の還元剤を用い て還元処理を行い、 2級アミノ基を形成させる。 反応後は、 透析、 塩析、 限外ろ 過、 イオン交換クロマトグラフィー、 電気泳動、 抽出、 再結晶、 吸着処理、 再沈 殿、 カラムクロマトグラフィ一等の精製手段にて精製することができる。
(製法 5 ： W及び Yがー C O O—を含む 2価の基である場合） ポリオキシアルキレン化合物として、 例えば、 前述したポリオキシアルキレン 基の末端が水酸基であるポリオキシアルキレン化合物を使用することができる。 ペプチドとしては、 例えば、 C末端にカルボキシル基を有するペプチド、 あるい は側鎖にカルボキシル基を有するグルタミン酸残基又はァスパラギン酸残基を有 するペプチドを使用することができる。 反応条件及び精製条件は、 前述の製法 2 と同様である。
(製法 6 ： W及び Yがー S— C Hくを含む 2価の基である場合）
ポリオキシアルキレン化合物として、 例えば、 前述したポリオキシアルキレン 基の末端が上記式 （e ) で示されるマレイミ ド基であるポリオキシアルキレンマ レイミ ド化合物を使用することができる。 特に好ましいポリオキシアルキレンマ レイミ ド化合物としては、 下記式 （y l ) 〜 （y 3 ) で表されるマレイミ ド基を 有するポリオキシアルキレンマレイミ ド化合物が挙げられる。 なお、 下記式中、 aは 2又は 3、 bは 2〜5である。
Figure imgf000024_0001
ペプチドとしては、 例えば、 システィン残基由来のチオール基を有するぺプチ ド、 あるいはイミノチオラン等を用いてチオール基を導入したアミノ酸残基を有 するペプチドを使用することができる。 上記ポリオキシアルキレンマレイミ ド化 合物とぺプチドとを水又は緩衝液中で反応させることによりスルフィ ド結合が形 成される。 反応の上記緩衝液としては、 リン酸緩衝液、 ホウ酸緩衝液、 トリス酸 緩衝液、 酢酸緩衝液等の緩衝液が好ましい溶媒として挙げられる。 製法 4と同様 に有機溶媒を添加してもよい。 反応温度は特に限定されないが、 好ましくは 0〜 80°Cである。 反応時間は 0. 5〜72時間が好ましく、 さらに好ましくは、 1 〜24時間である。
上記のようにして得られたぺプチドーポリオキシアルキレン結合物を下記式 (2) の化合物とすると、 その末端基を、 以下の製法 7〜1 2を用いて、 上記式 (a) 〜 （k) に示した各種反応性基へ変性させることで本発明の化合物を製造 することが出来る。 また、 ペプチドのアミノ酸残基由来の官能基、 たとえばアミ ノ末端及び側鎖のアミノ基、 又は、 カルボキシ末端及び側鎖のカルボキシル基を そのまま反応性基として用いることもできる。 それらの官能基で、 反応に関与し ない基が残存していてもよい。
Figure imgf000025_0001
(式中、 Zは 2〜10残基のアミノ酸からなり側鎖に官能基を有するアミノ酸を 1残基以上有するペプチド残基、 OAは炭素数 2〜4のォキシアルキレン基、 R は水素原子あるいは炭素数 1〜 4の炭化水素基、 X p 1及び X p 2はァミノ基、 カルボキシル基、 チオール基又は水酸基を含む基、 Y及び Wはそれぞれ一 CON H—、 一 NHCO—、 一 OCONH—、 一 NHOCO—、 一 COO—、 一 OOC 一、 一 COS—、 一 SOC—、 一 CH2NH—、 一 NHCH2—、 _S— CH< >CH— S—、 一CH2— S—、 一 S— CH2—、 一 S— S—及び一 O—からな る群より選ばれる基を含む 2価の基、 n及び mは炭素数 2〜4のォキシアルキレ ン基の平均付加モノレ数であり、 nは 5〜： L 0◦ 0、 mは 5〜800、 かつ、 （n X k) + (mX j 1) が 30〜 2000を満たす整数、 j 1は 0〜 12、 j 2は 0 〜 8、 かつ、 1≤ j 1 + j 2≤ 1 2を満たす整数、 kは 0〜 1 1、 かつ、 2≤ k + j 1≤ 12、 3≤k+ j x+ j 2≤ 1 2を満たす整数を示す。 ）
<末端官能基 X 1及ぴ X 2の結合方法 >
(製法 7 ： (b) 、 （d) 、 （h) 、 ( i ) の製造方法）
式 （2) の化合物と下記一般式 （b 1) 、 （d l) 、 (h i) , (h 2) 、 ( i 1) で示される化合物のいずれかとを、 トリェチルァミン、 ピリジン、 4— ジメチルァミノピリジン等の有機塩基触媒、 又は、 炭酸ナトリウム、 水酸化ナト リゥム、 炭酸水素ナトリゥム、 酢酸ナトリゥム、 炭酸力リゥム、 水酸化力リゥム 等の無機塩基触媒の存在下、 無溶媒、 又は、 トルエン、 ベンゼン、 キシレン、 ァ セトニトリノレ、 酢酸ェチノレ、 ジェチルエーテル、 t一プチルーメチノレエーテノレ、 テトラヒ ドロフラン、 クロ口ホルム、 塩化メチレン、 ジメチルスルホキシド、 ジ メチルホルムァミド、 ジメチルァセトアミド等の非プロトン性溶媒中で反応させ ることにより、 それぞれ （b) 、 (d) 、 (h) 、 ( i ) を導入することができ る。 また、 上記有機塩基、 無機塩基は用いなくてもよい。 有機塩基、 無機塩基の 使用割合は、 特に制限はないが、 式 （2) の化合物に対して等モル以上が好まし レ、。 また、 ピリジン等の有機塩基を溶媒として用いてもよい。 (b 1) 、 (d 1) 、 (h 2) における Tは C I、 B r、 Iより選択されるハロゲン原子であり、 好ましくは C 1である。 一般式 （b 1) 、 （d l) 、 (h i) , (h 2) 、 ( i 1) で示される化合物の使用割合は、 特に制限はないが、 式 （2) の化合物に対 して等モル以上が好ましく、 さらに好ましくは等モルから 50モルの範囲で反応 させるのが好ましい。 反応温度としては、 0〜300°Cが好ましく、 20〜10 0 °Cがさらに好ましい。 反応時間は 10分〜 48時間が好ましく、 さらに好まし くは 30分〜 24時間である。 生成した化合物は、 抽出、 再結晶、 吸着処理、 再 沈殿、 カラムクロマトグラフィー、 超臨界抽出等の精製手段にて精製してもよい。
Figure imgf000027_0001
(製法 8 ： (a) 、 （g) の製造方法）
式 （2) の化合物を無水コハク酸や無水グルタル酸等のジカルボン酸無水物と 反応させてカルボキシル体 ) を得た後、 又はすでに式 （2) の Xp1がカル ボキシル基 （m) 、 Xp 2が力ルポキシル基 （m) 、 （ 1 ) である場合、 DCC、 EDC等の縮合剤存在下、 N—ヒドロキシコハク酸イミドと縮合反応させること で、 （a) あるいは （g) のコハク酸イミ ド体を得ることができる。 N—ヒドロ キシコハク酸イミ ドの他にも、 1ーヒ ドロキシベンゾトリァゾール、 N—ヒ ドロ キシ一 5—ノノレボノレネン一 2， 3—ジカノレポキシイミ ド、 N—ヒ ドロキシフタノレ イミド、 4ーヒ ドロキシフエニルジメチルスルホニゥム ' メチルサルフェート等 を使用することができる。 式 （2) の化合物とジカルボン酸無水物との反応は、 上述の非プロトン性溶媒又は無溶媒で行う。 ジカルボン酸無水物の使用割合は、 特に制限はないが、 式 （2) の化合物に対して 1当量以上が好ましく、 1〜5当 量がさらに好ましい。 反応温度は、 0〜1 50°Cが好ましく、 20〜1 30°Cが さらに好ましい。 反応時間は、 10分〜 48時間が好ましく、 30分〜 12時間 がさらに好ましい。 反応にはトリエチルァミン、 ピリジン、 ジメチルァミノピリ ジン等の有機塩基や、 炭酸ナトリゥム、 水酸化ナトリウム、 炭酸水素ナトリウム、 酢酸ナトリウム、 炭酸力リゥム、 水酸化力リゥム等の無機塩基を触媒として用い てもよい。 触媒の使用割合は、 0. 1〜50重量。 /0が好ましく、 0. 5〜20重 量％がさらに好ましい。 このようにして生成したカルボキシル体 （1) は、 前述 の精製手段にて精製してもよいし、 そのまま次の縮合反応に用いてもよい。 続く縮合反応も同様に上記非プロトン性溶媒中又は無溶媒で行う。 縮合剤とし ては、 特に制限は無いが、 好ましくは DC Cである。 DCCの使用割合は、 式 (2) の化合物に対して 1当量以上が好ましく、 1〜5当量がさらに好ましい。 N—ヒドロキシコハク酸イミドの使用割合は、 式 （2) の化合物に対して 1当量 以上が好ましく、 1〜5当量がさらに好ましい。 反応温度は、 0〜100°Cが好 ましく、 20〜80°Cがさらに好ましい。 反応時間は、 10分〜 48時間が好ま しく、 30分〜 12時間がさらに好ましい。 生成した化合物は前述の精製手段に て精製してもよい。
(製法 9 ： ( j ) の製造方法）
式 （2) の化合物を水、 ァセトニトリル等の溶媒中、 水酸化ナトリウム、 水酸 化力リゥム等の無機塩基を触媒とし、 アタリ口 -トリル等を付加させて二トリル 体を得たあと、 オートクレーブ中でニッケルやパラジウム触媒下で二トリル基の 水添反応を行うことで （j ) のアミン体を得ることができる。 二トリル体を得る 際の無機塩基の使用割合は、 特に制限はないが、 式 （2) の化合物に対して 0. 01〜 50重量％が好ましい。 アタリロニトリル等の使用割合は、 特に制限はな いが、 式 （2) の化合物に対して等モル以上が好ましく、 等モル〜 100モルの 範囲で反応させるのがさらに好ましい。 また、 アクリロニトリルを溶媒として用 いてもよい。 反応温度は、 一 50〜100°Cが好ましく、 一 20〜60°Cがさら に好ましい。 反応時間は、 1◦分〜 48時間が好ましく、 30分〜 24時間がさ らに好ましい。 続く二トリル体の水添反応における反応溶媒は、 反応に関与しな い溶媒であれば特に制限は無いが、 好ましくはトルエンである。 ニッケル、 もし くはパラジウム触媒の使用割合は、 特に制限は無いが、 二トリル体に対して 0. 05〜30重量。 /0であり、 好ましくは 0. 5〜5重量％でぁる。 反応温度は、 2 0〜200°Cが好ましく、 50〜150°Cがさらに好ましい。 反応時間は、 10 分〜 48時間が好ましく、 30分〜 24時間がさらに好ましい。 水素圧は、 2〜 l OMP aが好ましく、 3〜6MP aがさらに好ましい。 また、 二量化を防ぐた めに反応系中にアンモニアを加えてもよい。 アンモニアを加える場合の使用割合 は、 特に制限は無いが、 二トリル体に対して好ましくは 1〜 100重量％であり、 さらに好ましくは 5〜 50重量％である。 生成した化合物は前述の精製手段にて 精製してもよい。
上記アミン体 （j ) は、 （b) をアンモニア水に反応させることで得ることが できる。 反応は、 アンモニア水中で行い、 アンモニアの濃度は特に制限は無いが、 好ましくは 10〜40%の範囲である。 アンモニア水の使用割合は、 含有アンモ ニァが （b) の等モル以上であれば特に制限は無いが、 好ましくは、 等モル〜 5 0000倍モルである。 反応温度は、 0〜 100°Cが好ましく、 20〜80°C力 S さらに好ましい。 反応時間は、 10分〜 48時間が好ましく、 30分〜 1 2時間 がさらに好ましい。 生成した化合物は前述の精製手段にて精製してもよい。
(製法 10 : ( e ) の製造方法）
マレイミド体 （e) は、 下記一般式 （e l) と、 上述の （j ) 又は式 （2) の 1及び 1)2がすでに （k) であるァミンとを、 反応させることで得ること ができる。 反応は、 前述の非プロトン性溶媒中又は無溶媒で行い、 化合物 （e 1) を （j ) 又は （k) のァミンに対して等当量以上カ卩えて反応させる。 （e 1) の使用割合は （j ) 又は （k) の 1当量以上が好ましく、 等モル〜 5モルが さらに好ましい。 反応温度は、 0〜200°Cが好ましく、 20〜80°Cがさらに 好ましい。 反応時間は、 10分〜 48時間が好ましく、 30分〜 12時間がさら に好ましい。 生成した化合物は前述の精製手段にて精製してもよい。
上記のマレイミド体は （j ) 又は （k) のァミンを、 前述の非プロトン性溶媒 中又は無溶媒で、 無水マレイン酸と反応させてマレアミド体を得た後、 無水酢酸 及び酢酸ナトリウムを触媒として、 閉環反応させることで （e) のマレイミド体 を得ることもできる。 マレアミド化反応における無水マレイン酸の使用割合は、 特に制限はないが、 式 （2) の化合物に対して 1当量以上が好ましく、 1〜5当 量がさらに好ましい。 反応温度は、 0〜150°Cが好ましく、 20〜130°Cが さらに好ましい。 反応時間は、 10分〜 48時間が好ましく、 30分〜 12時間 がさらに好ましい。 生成したマレアミド体は、 前述の精製手段にて精製してもよ いし、 そのまま次の閉環反応に用いてもよい。
続く閉環反応における反応溶媒は特に限定されないが、 非プロトン性溶媒又は 無水酢酸が好ましい。 無水酢酸の使用割合は、 特に制限はないが、 マレアミ ド体 に対して等モル以上が好ましく、 等モル〜 50モルがさらに好ましい。 酢酸ナト リウムの使用割合は特に制限はないが、 マレアミド体に対して、 0. 5〜50重 量％である。 反応温度は、 0〜200°Cが好ましく、 20〜 150°Cがさらに好 ましい。 反応時間は、 10分〜 48時間が好ましく、 30分〜 12時間がさらに 好ましい。 生成した化合物は前述の精製手段にて精製してもよい。
Figure imgf000030_0001
(t°ftl〜7、 Uは水素原子又は— SO 3N aを示す。 ）
(製法 11 : ( f ) の製造方法）
化合物 （b) を （f 1) のァセタール化合物と反応させてァセタール体を得た 後、 酸性条件にて加水分解を行うことで、 アルデヒド体 （ f ) を得ることができ る。 化合物 （b) の製造は上述の通りである。 ァセタール化反応は前述の非プロ トン性溶媒中又は無溶媒で、 （ b ) と等モル以上、 好ましくは等モル〜 50モル の （f 1) を反応させることで得ることができる。 （f 1) は相当するアルコー ノレ力ゝら、 金属ナトリウム、 金属カリウム、 水素化ナトリウム、 水素化カリウム、 ナトリウムメ トキシド、 カリウム t一ブトキシド等を用いて調製することができ る。 反応温度は、 0〜300°Cが好ましく、 20〜150°Cがさらに好ましい。 反応時間は、 10分〜 48時間が好ましく、 30分〜 24時間がさらに好ましい。
( f 2) を用いる場合は、 化合物 （o) の Xp 1及び Xp 2の水酸基を上述の 方法でアルコラートとした後、 前述の非プロ トン性溶媒中又は無溶媒で、 1当量 以上、 好ましくは 1〜100当量の （f 2) を反応させることでァセタール体を 得ることができる。 反応温度は、 0〜200°Cが好ましく、 20〜1 30°Cがさ らに好ましい。 反応時間は、 10分〜 48時間が好ましく、 30分〜 24時間が さらに好ましい。
(ί 3) を用いる場合は、 （a) 、 （b) 、 （d) 、 （g) 、 （h) 、 （ i) 、 ( 1 ) 又は （m) と （f 3) を反応させることでァセタール体を得ることができ る。
OR1 OR 1
OR1
I I
MO(CH2)厂 CH W - (CH2)t— CH H2N(CH2)厂 CH
OR2 OR2 OR2
(fl) (f2) (f3) (式中、 R R 2は炭素数 1〜3の炭化水素基であり、 それぞれ同一であって も、 異なっていてもよく、 相互に間を形成してもよい。 Mはナトリウム又はカリ ゥム、 Wは C l、 B r、 Iより選択されるハロゲン原子であり、 tは 1〜5の整 数である。 ）
(a) 、 （b) 、 （d) 、 （g) 、 （h) 、 （ i) 、 （1 ) 及び （m) の製造 については前述の通りである。 （f 3) との反応では、 溶媒は特に制限されない 力 S、 好ましくは前述の非プロ トン性溶媒中で行う。 （a) 、 （b) 、 （d) 、
(g) s (h) 、 （i ) 、 （1) 又は （m) に対する （f 3) の仕込み割合は、 等当量以上が好ましく、 1〜10当量がさらに好ましい。 反応温度は、 一 20〜 100°Cが好ましく、 0〜 100°Cがさらに好ましい。 反応時間は、 10分〜 4 8時間が好ましく、 30分〜 24時間がさらに好ましい。 （ 1 ) 又は （m) を用 いる場合は、 適宜 DCC、 EDC等の縮合剤を用いてもよい。 このようにして得 られたァセタール体は前述の精製手段にて精製してもよいし、 精製を行わずにそ のまま次のアルデヒド化反応に用いてもよい。
アルデヒド化は、 ァセタール体を酢酸、 リン酸、 硫酸、 塩酸等の酸にて; HI 〜4に調整した水溶液中で加水分解させ、 製造することができる。 反応温度は、 0〜80°Cが好ましく、 0〜40°Cがさらに好ましい。 反応時間は、 10分〜 2 4時間が好ましく、 30分〜 10時間がさらに好ましい。 生成した化合物は前述 の精製手段にて精製してもよい。
(製法 12 : (c) の製造方法）
(c) のチオールは、 化合物 （j ) 又は （k) を下記化合物 （c 1) と反応さ せ、 還元させることにより得ることができる。 （j ) 又は （k) と （c l) との 反応は、 前述の非プロトン性溶媒中又は無溶媒で行う。 （c 1) の使用割合は、 化合物 （j ) 又は （k) に対して等当量以上が好ましく、 1〜50当量の範囲が さらに好ましい。 反応温度は、 0〜100°Cが好ましく、 20〜60°Cがさらに 好ましい。 反応時間は、 10分〜 48時間が好ましく、 30分〜 24時間がさら に好ましい。 続く還元は、 ジチオスレィトール等の還元剤を用いて行うのが好ま しい。 生成した化合物は前述の精製手段にて精製してもよい。
また、 上記チオールは、 化合物 （b) とチォゥレア等のチォ化剤とを反応させ ることで得ることができる。 化合物 （b) の製造は前述の通りである。 チォ化反 応は水、 アルコール、 ァセトニトリル等の溶媒中又は無溶媒で行う。 チォゥレア の使用割合は、 化合物 （b) に対して 1当量以上が好ましく、 1〜50当量の範 囲がさらに好ましい。 反応温度は、 0〜200°Cが好ましく、 20〜150°Cが さらに好ましい。 反応時間は、 10分〜 48時間が好ましく、 30分〜 24時間 がさらに好ましい。 反応後、 生成したチアゾリゥム塩をアルカリ加水分解し、 チ オールを得ることができる。 生成した化合物は前述の精製手段にて精製してもよ レ、。
Figure imgf000032_0001
( i i) の方法で製造する場合の製造例を以下に示す。 (製法 1 3 ： X1が (b) 、 （d) 、 （h) 、 ( i ) の場合の製造方法） 片末端にペプチドとの反応性官能基である （j ) 又は （a) もしくは （1 ) を、 もう片末端に水酸基を有するポリォキシアルキレン誘導体を用いて、 ぺプチドと 反応させた後、 得られた化合物のポリオキシアルキレン鎖末端の水酸基に、 製法 7の方法に従って （b) 、 (d) , (h) 、 ( i ) を導入することができる。 こ の場合ポリォキシアルキレン鎖末端の水酸基をべンジル基、 t—ブチル基等で保 護して用いてもよい。
ポリオキシアルキレン誘導体の片末端が （j ) の場合、 製法 8の方法に従って ペプチド由来のカルボキシル基を （a) 又は （g) の活性化エステルとした後、 下記に示したように ( j 1) のポリオキシアルキレン誘導体と製法 2の条件にて 反応させ、 （o l) とすることが出来る。
H2N— Q— (OA)m— OH ( )
Figure imgf000033_0001
( Zは 2〜 1 0残基のァミノ酸カゝらなり側鎖に官能基を有するァミノ酸を 1残基 以上有するペプチド残基、 Qはアルキレン基、 又は、 エーテル結合、 エステル結 合、 ウレタン結合、 アミド結合、 カーボネート結合もしくは 2級アミノ基を含む アルキレン基を示す。 ）
ポリオキシアルキレン誘導体の片末端が （a) 又は （ 1 ) の場合、 もう片末端 の水酸基は保護基を結合し （o 2) 、 (o 3) としたものを用いて製法 1の方法. に従ってペプチド反応した後、 脱保護することが好ましい。 例えば下記に示した ように、 （o 4) のポリオキシアルキレン誘導体と製法 1の条件にて反応させ、 酸性下で加水分解を行い、 （o l ) を得ることが出来る。
Figure imgf000034_0001
( Qはアルキレン基、 又は、 エーテル結合、 エステル結合、 ウレタン結合、 アミ ド結合、 カーボネート結合もしくは 2級アミノ基を含むアルキレン基を示す。 ）
Figure imgf000034_0002
50%TFA7CH2C1:
Figure imgf000034_0003
( Zは 2〜 1 0残基のァミノ酸カゝらなり側鎖に官能基を有するァミノ酸を 1残基 以上有するペプチド残基、 Qはアルキレン基、 又は、 エーテル結合、 エステル結 合、 ウレタン結合、 アミド結合、 カーボネート結合もしくは 2級アミノ基を含む アルキレン基を示す。 )
(o 2) 、 (o 3) の脱離方法としては、 特に制限されないが、 （o 3) のべ ンジル基はパラジウムカーボン触媒、 水素もしくは水素供与体を用い、 次に示す ような水添反応にて製造することができる。 パラジウム量としては、 1〜20重 量％が好ましい。 反応溶媒については、 特に制限されないが、 好ましくはメタノ ール、 エタノール、 2一プロパノール等が挙げられ、 さらに好ましくはメタノー ルである。 水素源については、 特に制限されないが、 水素ガス、 シクロへキセン、 2—プロパノール等が挙げられる。 反応温度は、 60°C以下が好ましい。 反応時 間については、 特に制限はなく、 触媒量が多いと短時間で反応が終了し、 触媒量 が少ないと長時間要するが、 0. 5〜8時間が好ましい。 得られた （o l) の化 合物は、 抽出、 再結晶、 吸着処理、 再沈殿、 カラムクロマトグラフィー、 超臨界 抽出等の精製手段にて精製してもよい。
(o 2) の t一ブチル基の脱離方法としては、 以下の方法が挙げられる。 反応 溶媒については、 酸性下で安定であれば特に制限されないが、 例えば水、 ァセト 二トリル、 メタノール、 エタノール、 2一プロパノール、 ジォキサン、 ジメチル ホルムアミ ド、 トルエン、 塩化メチレン等が挙げられ、 トルエンその他の有機溶 媒と水等の混合溶媒でも問題ない。 酸性条件としては p H 4以下、 好ましくは p H 2以下であり、 蟻酸、 酢酸、 塩酸、 トリフルォロ酢酸等を用いることができ、 反応温度は 0〜 1 50 °C、 好ましくは 20〜 1 00 °Cであり、 反応時間は 1 0分 〜3 0時間、 好ましくは 0. 5〜8時間である。 同様に得られた （o l) の化合 物は精製してもよい。
(製法 1 4 ： X1が （a) の場合の製造方法）
片末端にペプチドとの反応性官能基である （j ) 又は （b) 又は （d) 、
(h) もしくは （i) を、 もう片末端に （1 ) を有するポリオキシアルキレン誘 導体を用いて、 ペプチドと反応させた後、 得られた化合物のポリオキシアルキレ ン鎖末端の （ 1 ) に、 製法 8の方法に従って （a) を導入することができる。 ポリオキシアルキレン誘導体の片末端が （j ) の場合、 製法 8の方法に従って ペプチド由来のカルボキシル基を （a) 、 (g) の活性化エステルとした後、 ( 1 1) のポリオキシアルキレン誘導体と製法 2の条件にて反応させ、 末端カル ボキシル体 ( 1 2) とすることが出来る。 またポリオキシアルキレン誘導体の片 末端が （b) の場合、 製法 4の方法に従って、 ペプチド由来のァミノ基と反応す ることにより、 末端カルボキシル体 （1 3) とすることが出来る。 さらにポリオ キシアルキレン誘導体の片末端が （d) 、 (h) 又は （ i) の場合、 製法 8の方 法に従って、 ペプチド由来のァミノ基と反応することにより、 末端カルボキシル 体 （ 1 4) とすることが出来る。
得られた （1 2) 、 （ 1 3) 及び （ 1 4) を製法 8の方法に従って、 X1が (a) の （a 1) 、 (a 2) 及び （a 3) を得ることが出来る。 （a 3) の例を 下記に示す。
H2N— 0厂 (OA)m— Q2— COOH ( )
(Qi及び Q 2はそれぞれ独立してアルキレン基、 又は、 エーテノレ結合、 エステ ル結合、 ウレタン結合、 アミ ド結合、 カーボネート結合もしくは 2級アミノ基を 含むアルキレン基を示す。 ）
H N— Q厂 (OA)m— Qウー COOH
Figure imgf000037_0001
(Zは 2〜10残基のアミノ酸からなり側鎖に官能基を有するアミノ酸を 1残基 以上有するペプチド残基、 及び Q2はアルキレン基、 又は、 エーテル結合、 エステル結合、 ウレタン結合、 アミ ド結合、 カーボネート結合もしくは 2級アミ ノ基を含むァ<レキレン基を示す。 ）
HN-CH2CH2-(OA)m— Q— COOH
Ji
Figure imgf000038_0001
Figure imgf000038_0002
( Zは 2 ~ 10残基のァミノ酸からなり側鎖に官能基を有するァミノ酸を 1残基 以上有するペプチド残基、 Qはアルキレン基、 又は、 エーテル結合、 エステル結 合、 ウレタン結合、 アミド結合、 カーボネート結合もしくは 2級アミノ基を含む アルキレン基を示す。 ）
(製法 1 5 ： X1が (j ) の場合の製造方法）
片末端にペプチドとの反応性官能基である （a) 又は （d) 、 （h) もしくは ( i) を、 もう片末端の （j ) に保護基を結合し （j 2) を有するポリアルキレ ン誘導体を用いて、 ペプチドと反応させた後、 脱保護することにより （j ) とす ることができる。
ポリオキシアルキレン誘導体の片末端が （a) の場合、 もう片末端に （j 2) を有する 3) を用いて製法 1の方法に従ってペプチド由来のァミノ基と反応 する。 ポリオキシアルキレン誘導体の片末端が （d) 、 （h) 又は （ i) の場合、 製法 8の方法に従って、 ペプチド由来のァミノ基と反応する。 それぞれ反応した 後、 製法 1 3と同様にパラジウム触媒を用いた接触還元、 酸処理又は臭化水素 酢酸、 フッ化水素を用いた方法で脱保護し （j ) を得ることができる。
0
— Q— NHCO-D (j2)
(Dは、 ベンジル基、 t一ブチル基、 ρ—ニトロべンジル基、 ρ—メ トキシベン ジル基、 2—フエニルイソプロピル基、 9一フルォレニルメチル基、 メチルスル ホニルェチル基、 2 , 2， 2—トリクロ口ェチル基を示す。 Qはアルキレン基、 又は、 エーテル結合、 エステル結合、 ウレタン結合、 アミ ド結合、 カーボネート 結合もしくは 2級アミノ基を含むアルキレン基を示す。 ）
Figure imgf000039_0001
Figure imgf000039_0002
(Dは、 ベンジノレ基、 tーブチノレ基、 ρ—ニトロべンジノレ基、 ρ—メ トキシベン ジル基、 2—フエニルイソプロピル基、 9—フルォレニルメチル基、 メチルスル ホ-ルェチル基、 2， 2， 2—トリクロ口ェチル基を示す。 。 及ぴ^^はァル キレン基、 又は、 エーテル結合、 エステル結合、 ウレタン結合、 アミ ド結合、 力 ーボネート結合もしくは 2級アミノ基を含むアルキレン基を示す。 ） (製法 1 6 ： X1が （e) の場合の製造方法）
片末端にペプチドとの反応性官能基である （e) を、 もう片末端に （a) を有 するポリオキシアルキレン誘導体 （e 2) を用いて、 製法 1の方法に従ってぺプ チドのァミノ基と反応させることにより、 又は、 もう片末端に （d) 、 (h) 、 ( i ) を有するポリオキシアルキレン誘導体を用いて、 製法 3の方法に従ってべ プチドのァミノ基と反応させることにより、 （e) を導入することができる。
Figure imgf000040_0001
及び Q2は前記と同じである。 ）
(製法 1 7 ： X1が （f ) の場合の製造方法）
片末端に製法 1 1記載の方法にてァセタールを導入し、 もう片末端に （a) を 有するポリォキシアルキレン誘導体を用いて、 製法 1の方法に従ってべプチドの ァミノ基と反応させることにより、 又はもう片末端に （d) 、 （h) 、 ( i ) を 有するポリオキシアルキレン誘導体を用いて、 製法 3の方法に従ってぺプチドの ァミノ基と反応させることによりァセタール基を導入することができる。 さらに 製法 1 1記載の方法にて加水分解することにより、 （f ) を得ることができる。
(製法 1 8 ： X1が （c) の場合の製造方法）
片末端にペプチドとの反応性官能基である （c) を、 もう片末端に （j ) を有 するポリアルキレン誘導体を用いる場合、 製法 8の方法に従ってぺプチド由来の カルボキシル基を （a) 又は （g) の活性化エステルとした後、 ポリアルキレン 誘導体の （j ) と製法 2の条件にて反応させ、 （c) とすることが出来る。
( i i i ) の方法で製造する場合の製造例を以下に示す。
アミノ酸とポリオキシアルキレン化合物との反応については、 （i ) の方法に 記載した同様の方法で行うことができる。 アミノ酸とアミノ酸の反応については、 一方のァミノ酸のアミノ基ともう一方のァミノ酸のカルボキシル基とを、 脱水的 に縮合させてアミド結合を生成させる方法であれば、 特に限定するものではなく、 公知の方法で行うことができる。 2残基以上のアミノ酸が結合したぺプチドとァ ミノ酸との反応についても、 アミノ酸同士と同様に行うことができる。 なお、 ァ ミノ酸の側鎖のアミノ基、 カルボキシル基及ぴその他の官能基は、 合成工程にお いて、 「ペプチド合成の基礎と実験」 （泉屋信夫ら著、 丸善株式会社発行、 昭和 60年 1月 203) に記載されるような保護基で保護して使用することができる。
実施例
以下に実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、 本発明はこれらに限定 されるものではない。
以下、 それぞれのアミノ酸残基については下記の略号で示す。
グリシン： G 1 y、 グルタミン酸： G 1 u、 リジン： L y s、 システィン： C y s
(実施例 1 )
メチルポリオキシエチレン力ルバミル一 G 1 y -L y s (一メチルポリオキシ エチレンカノレバミル） 一 G 1 y— G 1 y— G 1 y—コハク酸エステノレ く M e O -PEG2000-G 1 y-Ly s (-PEG 2000-OMe) 一 G l v— G 1 y -G 1 y -NHS> の合成
(1) メチルポリオキシエチレン力ルバミル一G 1 y— L y s (—メチルポリオ キシエチレンカルバミノレ） -G 1 y-G 1 y -G 1 y く MeO— PEG 200 0 -G 1 y -L y s (- P EG 2000 -OMe ) — G 1 y— G 1 y— G 1 y〉 の合成
メ トキシポリエチレグリコール一： —二トロフエニルカーボネート （SUNB R I GHT MENP— 20H、 重量平均分子量 2000、 3本油脂 （株） 製、 式 （3) ) 1 2 g (6mmo 1 ) をァセト-トリル 40 m Lに溶解し、 この溶液 に 0. 75 g ( 2 mm o 1 ) の G l y— Ly s—G l y— G l y—G l y (配列 番号 1) を水 1 OmLに溶解させた水溶液を添カ卩して攪拌し、 さらにトリェチル ァミン 0. 5 g (0. 5mmo 1 ) を添加して室温で 3時間攪拌した。 反応終了 後、 ろ過にて不溶物を除去し、 続いてエバポレーターにて減圧で溶媒を除去した。 次いで、 酢酸ェチル 5 OmLを加えて溶解し、 硫酸ナトリウムを添加して攪拌し た後、 ろ過して脱水を行った。 次いで、 ろ液にへキサン 10 OmLを加えて 1 0°C以下に冷却後、 ろ過して粗結晶を得た。 粗結晶を酢酸ェチル 5 OmLに溶解 し、 吸着剤としてキヨ一ワード # 2000 (0. 05 g) 、 キヨ一ワード # 70 0 (0. 1 g) を加え、 60°Cにて 1時間攪拌した。 吸着剤をろ過後、 へキサン 10 OmLを加えて冷却して結晶化し、 さらに得られた結晶を酢酸ェチル 200 mLを加えて再度晶析を行い、 結晶をろ取し乾燥を行って目的化合物 6. 2 g (理論収率 70%) を得た。
CH30(CH2CH20)N-CO-< N02 … (3)
(2) (メチルポリオキシエチレン力ルバミル） 一G l y— Ly s (—メチルポ リォキシエチレンカルバミノレ） -G 1 y -G 1 y一 G 1 y—コハク酸エステル <MeO-PEG2000-G l y-Ly s (-PEG 2000-OMe) — G 1 y-G 1 y-G 1 y-NHS) の合成
(1) で得られた結晶をクロ口ホルム 2 OmLに溶解し、 N—ヒドロキシコハ ク酸イミド 0. 2 g (1. 7mmo 1 ) を添カ卩して 30分攪拌した。 さらにジシ クロへキシルカルポジイミド （DCC) を 0. 6 g (2. 7mmo 1 ) 添加して 2時間室温で攪拌した。 反応後、 ろ過にて生成したジシクロへキシルゥレア （D CU) を除去し、 エバポレーターにて減圧で溶媒を除去した。 次いで、 酢酸ェチ ノレ 20 OmLを加えて加温して溶解し、 室温に冷却後へキサンを 200 m Lを加 えて結晶化し、 ろ過して結晶を採取した。 同様の晶析をさらに 2回行った後、 得 られた結晶を乾燥し、 Me O— PEG2000— G l y— Ly s (-P EG 20 00-OMe) — G 1 y— G 1 y—G 1 y— NHSの結晶 5. 1 gを得た。
なお、 反応の進行及ぴ生成物の同定は、 シリカゲルプレートを用いた薄層クロ マトグラフィー (TLC) によって行った。 クロ口ホルムとメタノールとの混合 比 （容量比） が 85 ： 1 5の混合溶媒を展開溶媒として用い、 ヨウ素蒸気にて発 色を行い、 標準物質との R f値の比較により物質の定性を行った。 反応終点は、 上記 TLCにて R f値 0. 7~0. 8付近に検出されるメ トキシポリエチレダリ コーノレ一 ρ—二トロフエニルカーボネートのスポットと、 R f i!O. 1付近に検 出される G 1 y— Ly s— G 1 y— G 1 y— G 1 y (配列番号 1 ) のスポッ トと 力 R f値 0. 3〜0. 4付近に検出されるスポットに変換したことにより確認 した。 生成物の確認は、 — NMRより、 メチルポリオキシエチレン由来の末 端メチル基が δ ： 3. 3 p pm付近に、 ポリオキシエチレンのエチレン基が δ ： 3. 5 p pm付近に、 またペプチド由来のメチレン基が δ ： 1. 5 p pm付近に コハク酸イミ ドエステル由来のエチレン基が δ ： 2. 8 p pm付近にそれぞれ検 出されることにより、 メチルポリオキシエチレン鎖、 ペプチド鎖及びコハク酸ィ ミ ドエステルの存在を確認した。 また、 δ ： 3. 3 p pm付近のピークの積分値 を 6 (2本のメチルポリオキシエチレンの末端メチル由来） とした場合の、 δ ： 3. 5 p pm付近のポリオキシエチレンのエチレン基由来の積分値 Αを測定し、 以下の計算より生成物中のポリオキシエチレンの分子量を算出した。 算出した分 子量は 4235であった。
ォキシエチレン基分子の繰り返し数に 44をかけた値がポリオキシエチレンの 分子量であり、 ォキシエチレン基 1分子に含まれるプロ トンは 4個なので、 積分 値 AX 44 4=ポリオキシエチレン鎖の分子量となる。
δ (ppm)： 3.38 (6H, s, — CH3)， 3.40-3.80 (385H, m, 一 NH0C0 (CH2CH20) mCH3)
JH— NMR分析では、 日本電子 （株） 製 JNM— ECP400を用いた。 以 下すベて同様に測定を行った。 — NMR (CDC 1 a, 内部標準 TMS) 実施例 1の製造スキームを以下に示す。 Gly— Lys一 Gly一 Gly― Gly O- -NO
Figure imgf000044_0001
CH3O(CH2CH2O)n-C0NH— Gly— Lys― Gly― Gl ― Gly
CH30(CH2CH20)n-CONH
Figure imgf000044_0002
(実施例 2)
メチルポリオキシエチレン力ルバミル一 C y s (一メチルポリオキシエチレン —チォサクシンイミド） 一 G 1 y— G 1 y—コハク酸イミ ドエステル く M e O 一 PEG5000— Cy s (- P EG 2000 -OMe ) —G l y— G l y— N HS> の合成
(1) メチノレポリオキシエチレンカルパミル一 C y s く Me O— PEG500 O-Cy s> の合成
L一シスチン （ （株） 味の素タカラコーポレーション社製） 2. 5 g (10. 5 mm o 1 ) に 0. 1 M、 p H 9. 5のホウ酸緩衝液 1 50 m Lを加えて完全に 溶解するまで攪拌した。 メ トキシポリエチレグリコ一ルー p—二トロフエ二ルカ ーボネート （商品名： SUNBR I GHT ME N P— 50 H、 平均分子量 50 00、 日本油脂 （株） 製） 75 g (1 5mmo 1 ) を水 10 OmLに溶解し、 先 の L一シスチン溶液に加え、 pHを 9. 5に保ち室温で 2時間反応を行った。 反 応終了後、 希塩酸にて pH 5. 5に調整し、 2 °Cに冷却した。 次いで、 不溶物を ろ過して除去し、 ろ液を透析チューブ （分画分子量 350 ODa) を用いて 2 L のイオン交換水を用いて 5回透析を行った。 透析終了後、 pH7. 5に調整し溶 液を 2°Cに冷却し、 1， 4ージチオスレィトール 2. 8 gを添加し還元を行った。 還元後、 1. 5%酢酸水溶液を用いて透析を行い、 凍結乾燥してメチルポリオキ シエチレンカノレバミル一システィンの結晶 61 gを得た。
(2) メチルポリオキシエチレン力ルバミル一 C y s (一メチルポリオキシェチ レン一チォサクシンイミ ド） く Me O—PEG 5000— Cy s (— PEG 2 000— OMe ) > の合成
(1) で得られたメチルポリオキシエチレンカルバミルーシスティン 5. 1 g
( 1 mm o 1 ) を生理食塩緩衝液 （ P B S ) 5 OmLに溶解し、 — [ 3— (3 一マレイミ ドー 1—ォキソプロピル) ァミノ] プロピル一 ω—メ トキシ， ポリオ キシエチレン （商品名： SUNBR I GHT ΜΕ_020ΜΑ、 平均分子量 2 000、 日本油脂 （株） 製、 下記式 （4) ) 2. 4 g (1. 2mmo 1 ) を添加 し、 室温で 8時間反応させた。 反応後、 食塩を添加して溶解し 20%wZw水溶 液とした。 次いで、 クロ口ホルム 5 OmLを加えて抽出した後、 無水硫酸マグネ シゥムを加えて撹拌しろ過して脱水した後、 エバポレーターにて減圧で溶媒を除 去し、 残渣を酢酸ェチルで再溶解した。 次いで、 へキサンを加えて結晶化し、 ろ 過にてメチルポリオキシエチレン力ルバミル一 Cy s (一メチルポリオキシェチ レンーチォサクシンイミド） の結晶 5. 2 g (理論収率 73%) を得た。
Figure imgf000045_0001
(3) メチルポリオキシエチレン力ルバミル一 Cy s (—メチルポリオキシェチ. レンーチォサクシンイミ ド） コハク酸イミ ドエステル 〈MeO—PEG 500 0— Cy s (— P EG 2000— OMe ) -NHS) の合成 (2) で得られたメチルポリオキシエチレン力ルバミル一システィン (メチル ポリオキシエチレンチォサクシンイミ ド) 4. 2 g (0. 58 mmo 1 ) をクロ 口ホルム 8 OmLに溶解し、 N—ヒドロキシコハク酸イミ ド 0. l g (0. 87 mmo 1 ) を添カ卩して 30分攪拌した。 さらに DCCを 0. 24 g (1. 1 6m mo 1) 添加して 2時間室温で攪拌した。 反応後、 ろ過にて生成した DC Uを除 去し、 エバポレーターにて減圧で溶媒を除去した。 次いで、 酢酸ェチル Ι Ο Οπι Lを加え加温して溶解し、 室温に冷却後へキサンを 1 0 OmLを加えて結晶化し、 ろ過して結晶を採取した。 同様の晶析をさらに 2回行った後乾燥し、 メチルポリ ォキシエチレンカノレバミノレー C y s (ーメチノレポリォキシエチレンーチォサクシ ンィミ ド） コハク酸ィミ ドエステルの結晶 3. 2 gを得た。
(4) メチルポリオキシエチレン力ルバミル一 Cy s (—メチルポリオキシェチ レンーチォサクシンイミ ド） 一 G l y— G l y く M e O— P E G 5000— C y s -G 1 y-G 1 y> の合成
G 1 y -G 1 y 53mg (0. 4 mm o 1 ) をジメチルホルムアミ ド 1 m Lに 加えて攪拌し、 さらにトリェチルァミン 65 mg (0. 64 mmo 1 ) を添加し た。 この溶液に、 （3) で得られた結晶 3 g (0. 4mmo 1 ) をァセトニトリ ル 1 OmLに溶解した溶液を滴下しながら添加し、 室温にて 4時間反応させた。 反応後、 濃縮脱水し、 酢酸ェチル 10 OmLを加えて加温して溶解し、 室温に冷 却後不溶物をろ過して除去レ、 へキサンを 10 OmLを加えて結晶化し、 ろ過し て結晶を採取した。 同様の晶析をさらに 2回行った後、 得られた結晶を乾燥して メチルポリオキシエチレン力ルバミル— C y s (一メチルポリオキシエチレンチ ォサクシンイミド） 一 G 1 y— G 1 yの結晶 2. 2 gを得た。
(5) メチルポリオキシエチレン力ルバミル一 C y s (—メチルポリオキシェチ レン一チォサクシンィミド） 一G 1 y—G 1 y—コハク酸ィミドエステルの合成 (4) で得られた結晶をクロ口ホルムに溶解し、 実施例 1 (2) と同様にして グリシンのカルボキシル末端のカルボキシル基をコハク酸ィミ ドエステルとした メチルポリオキシエチレン力ルバミル一 C y s (一メチルポリオキシエチレン一 チォサクシンイミ ド） 一G 1 y _G 1 y—コハク酸イミ ドエステルの結晶 1. 1 5 gを得た。
なお、 反応の進行及び生成物の同定は、 実施例 1と同様に行い、 薄層クロマト グラフィ一によつて R f 値 0. 7〜0. 8付近に検出されるメチルポリオキシェ チレン化合物のスポットと、 R 0. 1付近に検出されるペプチドのスポット とが、 値0. 3〜0. 4付近に検出されるスポットに変換したことにより確 認した。 生成物の確認は、 Η— NMRより、 メチルポリオキシエチレン鎖、 ぺ プチド鎖及ぴコハク酸イミ ドエステルの存在を確認した。 また、 iH— NMRよ り求めた生成物中のポリオキシエチレンの分子量は 72 3 0であった。
δ (ppm)： 3.38 (6H, s, _CH3)， 3.40—3.80 (657H, m, — NH0C0 (CH2CH20) raCH3)
— NMR分析では、 日本電子 （株） 製 J NM—EC P 400を用いた。 1 H-NMR (CDC 1 3, 内部標準 TMS)
実施例 2の製造スキームを以下に示す。
Cys— Cys
Figure imgf000048_0001
DTT
CH30(CH2CH20)n-CONH'Cys
O
CH30(CH2CH20)n- (CH2)3NHCO(CH2)2 - N,
O
Figure imgf000048_0002
(実施例 3)
メチルポリオキシエチレン力ルバミル— G 1 y -L y s (—メチルポリオキシ エチレンカノレバミノレ） 一 G l y— G l y—アミ ドプロピノレポリオキシエチレン一 カルボ二ルイミダゾール く Me O— PEG20000— G l y— Ly s (- P EG 20000-OMe) — G l y— G l y— PEG 2000— C I〉 の合成 (1) メチルポリオキシエチレン力ルバミル一G 1 y— L y s (メチルポリオキ シエチレン力ルバミル） 一G l y— G l y く Me O— PEG20000— G 1 y— Ly s (-P EG 20000-OMe) —G l y— G l y〉 の合成 メ トキシポリエチレングリコーノレ一 p—ニ ト ロフエ二ノレカーボネート （商品 名： SUNBR I GHT ME N P _ 20 T、 平均分子量 20000、 日本油脂 (株） 製） 8 g (0. 4mmo 1 ) と G l y_Ly s— G l y— G l y (配列番 号 2) 50mg (0. 16mmo 1 ) を用いて、 実施例 1と同様に反応及び精製 を行い、 メチルポリオキシエチレン力ルバミノレー G 1 y - L y s (—メチルポリ ォキシエチレン力ルバミル） 一 G l y— G l y 5. 2 gを得た。
(2) メチルポリオキシエチレン力ルバミル一 G 1 y— L y s (—メチルポリオ キシエチレン力ルバミル） 一 G 1 y— G 1 y—コハク酸イミ ドエステル く M e O-PEG 20000-G 1 y-Ly s (-PEG20000-OMe) _G 1 y-G 1 y -NHS) の合成
上記で得られたメチルポリオキシエチレン力ルバミル一 G 1 y-Ly s (ーメ チルポリオキシエチレンカノレバミル） 一 G l y— G l y 1. 5 g (0. 04m mo 1 ) をクロ口ホルム 2 OmLに溶解し、 実施例 2の （3) と同様の方法にて ペプチドのカルボキシ末端のカルボキシル基をコハク酸イミ ドエステルとし、 結 晶を得た。
(3) メチノレポリオキシエチレン力ルバミル一 G 1 y _Ly s (—メチルポリオ キシエチレン力ルバミル） 一 G 1 y—G 1 y—アミ ドプロピルポリオキシェチレ ン く Me O— PEG20000— G 1 y_Ly s (― P E G 20000— OM e) -G 1 y-G 1 y-PEG 2000-OH) の合成 (2) で得られた結晶メチルポリオキシエチレン力ルバミル一 G 1 y - L y s (—メチルポリオキシエチレン力ルバミル） -G 1 y -G 1 y—コハク酸ィミ ド エステルをクロ口ホルム 2 OmLに溶解し、 そこに、 α—ァミノプロピル一ω— ヒ ドロキシ一ポリオキシエチレン （商品名 ： SUNBR I GHT ΗΟ— 020 ΡΑ、 平均分子量 2000、 本油脂 （株） 製、 下記式 （5) ) 0. 5 gをジメ チルホルムアミド 5mLに溶解したものを添加して攪拌し、 さらにトリェチルァ ミン 2 Omgを添加して 40°Cで 10時間反応を行った。 反応後、 上記 （ 2 ) と 同様の方法にて精製し、 結晶 1. 03 gを得た。
NH2(CH2)30(CH2CH20)nH · ■ ■ (5) (4) メチルポリオキシエチレン力ルバミル一 G 1 y— Ly s (—メチルポリオ キシエチレン力ルバミル） 一 G 1 y-G 1 y—アミ ドプロピルポリオキシェチレ ン一力ルポ二ルイミダゾール く Me O— P EG 20000— G l y— Ly s (-PEG20000 -OMe ) _G 1 y-G 1 y— PEG2000— C I〉 の合成
(3) で得られた結晶をクロ口ホルム 10 m Lに溶解し、 トリェチルァミン 2
Omgを添加し、 さらにカルボエルジイミダゾール 10 m gを添カ卩して、 50°C にて 4時間反応させた。 反応液をろ過し、 エバポレーターにて減圧で溶媒を除去 し、 残渣に酢酸ェチル 5 m Lを添カ卩して溶解し、 氷水中で冷却しさらにへキサン 1 OmLを添加してろ過にて結晶を得た。 得られた結晶に同様の晶析操作をさら に 2回行い、 結晶 870 m gを得た。
なお、 反応の進行及び生成物の同定は、 実施例 1と同様に行い、 薄層クロマト グラフィ一によつて R f値 0. 7〜0. 8付近に検出されるメチルポリオキシェ チレン化合物のスポットと、 ∑ 値0. 1付近に検出されるペプチドのスポット とが、 R O. 3〜0. 4付近に検出されるスポットに変換したことにより確 認した。 生成物の確認は、 — NMRより、 メチルポリオキシエチレン鎖、 ぺ プチド鎖及びカルボ二ルイミダゾール （δ ： 7. l p pm付近、 δ ： 7. 4 ρ ρ m付近、 δ 8. I p pm付近） の存在を確認した。 また、 一 NMRより求 めた生成物中のポリオキシエチレンの分子量は 43400であった。
δ (ppm)： 3.38 (6H， s， — CH3), 3.40-3.80 (3945H, m， -NH0C0 (CH2CH20) mCH3, - NH(CH2)0(CH2CH20)mC0 -）
iH— NMR分析では、 日本電子 （株） 製 J NM— ECP 400を用いた。 1 H-NMR (CDC 13, 内部標準 TMS)
実施例 3の製造スキームを以下に示す。
Gly— Lys— Gly— Gly - — NOつ
Figure imgf000052_0001
CH30(CH2CH20)n— CONH-Gly— Lys― Gly― Gly
CH30(CH2CH20)n-CONH
Figure imgf000052_0002
NH2(CH2)30(CH2CH20)nH
CH30(CH2CH20)n— CONH— Gly— Lys一 Gly― Gly— CO-NH(CH2)30(CH2CH
CH30(CH2CH20)n-CONH
Figure imgf000052_0003
(実施例 4)
メチルポリオキシエチレン力ルバミル一 G 1 y -G 1 y -G 1 u (一プロピル アルデヒド一ポリオキシエチレンォキシプロピルアミ ド） 一 G 1 y—プロピルァ ルデヒド—ポリオキシエチレンォキシプロピルアミド く Me O_PEG300 00 -G 1 y -G 1 y -G 1 u (-PEG 5000-ALD) —G l y— PEG 5000 -ALD> の合成
(1) メチルポリオキシエチレン力ルバミル一 G 1 y— G 1 y— G 1 u— G 1 y (MeO-PEG30000-G l y— G l y—G l u— G l y〉 の合成 メ トキシポリエチレグリコール一 p—二トロフエ二ノレカーボネート (SUNB R I GHT MENP— 30 T、 重量平均分子量 30000、 日本油脂 （株） 製） 3 g (0. lmmo l) をァセトニトリル 30 m Lに溶解し、 この溶液に、 G 1 y-G 1 y -G 1 u-G 1 y (配列番号 3 ) 2 Omg (0. 062mmo 1 ) を水 1 m Lに溶解させた水溶液を添カ卩し、 実施例 1と同様の方法にてメチル ポリオキシエチレン力ルバミル一 G 1 y-G 1 y— G 1 u-G 1 yの結晶 1. 5 2 gを得た。
(2) メチルポリオキシエチレン力ルバミル _G 1 y -G 1 y -G 1 u (- (ジ エトキシ） プロピル一ポリオキシエチレンォキシプロピルアミ ド） — G l y—
(ジェトキシ) プロピルポリオキシエチレンォキシプロピルアミ ド く Me O— P EG 30000— G 1 y _G 1 y— G 1 u (— P E G 5000 _D E P) — G 1 y— P EG 5000— DE P〉 の合成
(1) で得られた結晶をクロ口ホルムに溶解し、 実施例 2 (3) と同様の方法 にて力ルポキシル基をコハク酸イミドエステルとした結晶を得、 得られた結晶を クロ口ホルム 1 OmLに溶解し、 α—アミノプロピル一 ω— 3, 3—ジエトキシ プロピルォキシ， ポリオキシエチレン （重量平均分子量 5000、 下記式
(6) ) 60 Omg (0. 12 mm o 1 ) を添カ卩し、 40 °Cで 8時間反応を行つ た。 反応後、 ろ過して不溶物を除去し、 エバポレーターにて減圧で溶媒を除去し た後、 酢酸ェチルとへキサンを用いて晶析を行い精製し、 結晶 1. 15 gを得た。
OCH2CH3
NH2(CH2)30(CH2CH20)nCH2CH2CH · ■ · (6)
OCH2CH,
(3) メチルポリオキシエチレン力ルバミル一 G 1 y—G 1 y—G 1 u (—プロ ピルアルデヒ ド一ポリオキシエチレンォキシプロピルァミ ド） 一G 1 y—プロピ ルアルデヒ ドポリ才キシエチレンォキシプロピルァミ ド く MeO— P EG 30 000 -G 1 y -G 1 y -G 1 u (-PEG 5000 -ALD) 一 G l y— PE G 5000 -ALD) の合成
(2) で得られた結晶を水 5 OmLに溶解し、 リン酸を加えて pH 2に調整し、 室温にて 2時間攪拌を行った。 その後、 食塩 10 gを加えて溶解させ、 3 0 %水 酸化ナトリウム水溶液にて p Hを 7. 0に調整し、 クロ口ホルムで抽出を 3回行 つた。 得られたクロ口ホルム層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、 ろ過後、 クロロホ ルムを留去し、 濃縮を行った。 濃縮液にトルエン 5 m L、 酢酸ェチル 5 m Lを加 えて加温溶解後、 へキサン 2 OmLを加えて結晶を析出させろ過した。 得られた 結晶を乾燥し、 末端アルデヒド体であるメチルポリオキシエチレン力ルバミル一 G 1 y -G 1 y— G 1 u (—プロピルアルデヒドーポリオキシエチレンォキシプ 口ピルアミ ド） 一 G l y- (プロピルアルデヒドポリオキシエチレンォキシプロ ピルァミ ド） 0. 9 5 gを得た。
なお、 反応の進行及び生成物の同定は、 実施例 1と同様に行い、 薄層クロマト グラフィ一によつて R f値 0. 7〜0. 8付近に検出されるメチルポリオキシェ チレン化合物のスポットと、 1 £値0. 1付近に検出されるペプチドのスポット とが、 R f値 0. 3〜0. 4付近に検出されるスポットに変換したことにより確 認した。 生成物の確認では、 iH— NMRより、 メチルポリオキシエチレン鎖、 ペプチド鎖及びアルデヒド （δ ： 9. 8 p pm付近） の存在を確認した。 また、 iH— NMRより求めた生成物中のポリオキシエチレンの分子量は 42 1 00で あった。
δ (ppra)： 3.38 (3H, s， — CH3), 3.40-3.80 (3827H, m, -NH0C0 (CH2CH20) mCH3, - 0(CH2CH20)mCH2H2CH0)
ェ ー NMR分析では、 日本電子 （株） 製 J NM— EC P 400を用いた。 1 H-NMR (CDC 13, 内部標準 TMS)
実施例 4の製造スキームを以下に示す。 Gly-Gly— Glu— Gly
Figure imgf000055_0001
CH30(CH2CH20)n - CONH— Gly— Gly—Glu— Gly
Figure imgf000055_0002
(実施例 5 )
マレイミ ドプロピルアミ ドプロピル一ポリオキシエチレンへプチルアミ ドー G 1 y-Ly s (—マレイミ ドプロピルアミドプロピル一ポリオキシエチレンへプチ ルアミド） 一 Cy s (—メチルポリオキシエチレンーチォサクシンイミ ド） 一G 1 y—コハク酸ィミ ドエステル (MA L - P E G 5000— G l y-Ly s
(-PEG 5000-MAL) —Cy s (-PEG20000 -Me O) —G l y-NHS> の合成
(1) G l y— Ly s— Cy s (—メチルポリオキシエチレン一チォサクシンィ ミ ド） 一 G l y <G l y-Ly s-Cy s (— P E G 20000 _M e O) - G 1 y> の合成
G l y-Ly s -Cy s -G l y 12mg (0. 033 mm o 1 ) を、 0. 1 Nリン酸ナトリウム緩衝液 （pH6. 4) を用いて 4mg/mLとなるよう調 整し、 そこに l g (0. 05 mm o 1) の α— [3— (3—マレイミ ドー 1ーォ キソプロピル） ァミノ] プロピゾレー ω—メ トキシ， ポリオキシエチレン (SUN BR I GHT ME— 200MA、 重量平均分子量 20000、 日本油脂 （株） 製） を粉体のまま添加し、 4 °Cにて 4時間反応を行った。 その後以下のカラム精 製を行い、 得られた水溶液をクロ口ホルム抽出し、 得られたクロ口ホルム層をェ バポレーターで濃縮し、 酢酸ェチルとへキサンを用いて晶析し、 結晶 520mg を得た。
•棚旨： SP S e p h a r o s e F F
•溶媒： 2 OmM .T r i s— HC 1 (p H 8. 2) / 1 M N a C 1 / 2 OmM T r i s -HC 1 (p H 8. 2)
( 2 ) マレイミ ドプロピルァミ ドプロピル一ポリォキシエチレンへプチルァミ ド -G 1 y -L y s (一マレイミ ドプロピルアミ ドプロピル一ポリオキシエチレン ヘプチルァミ ド) -C y s (一メチルポリオキシエチレン一チォサクシンィミ ド） 一G l y <M A L-PEG5000-G 1 y-Ly s (— PEG5000 -MAL) -C y s (-PEG 20000 -Me O) _G l y〉 の合成
(1) で得られた結晶をクロ口ホルム 1 OmLに溶解し、 トリエチルァミン 2.
5mg ( 0. 025 mm o 1 ) を添加し、 さらに α— [3— (3—マレイミ ドー 1_ォキソプロピル） ァミノ] プロピル一 ω—サクシンィミジルカルボキシペン チルォキシ， ポリオキシエチレン （重量平均分子量 5000、 下記式 （7) ) 0. 3 g (0. 06mmo 1 ) を粉体のまま添加し、 40 °Cで 5時間攪拌を行った。 反応後ろ過して酢酸ェチルとへキサンを用いて晶析を行い、 結晶 0. 5 1 gを得 た。 0
： N— o (CH2)50(CH2CH20)n - (CH2)3NHCO(CH2)2~N:
(3) マレイミ ドプロピルアミ ドプロピル一ポリオキシエチレンへプチルアミ ド -G 1 y - L y s (—マレイミ ドプロピルアミ ドプロピル一ポリオキシエチレン ヘプチルアミ ド） 一 C y s (—メチルポリオキシエチレンーチォサクシンイミ ド） 一グリシノレ一コハク酸イミ ドエステル く MAL— P EG 5 0 0 ◦ _G 1 y - L y s (- P EG 5 0 0 O -MAL) —C y s (— P E G 2 0 0 0 0— M e O) — G 1 y -NHS> の合成
( 2) で得られた結晶をクロ口ホルムに溶解し、 実施例 2 (3) と同様の方法 にてカルボキシル基をコハク酸ィミドエステルとしたマレイミ ドプロピルアミ ド プロピル一ポリオキシエチレンへプチルアミ ドー G l y - L y s (—マレイミ ド プロピルアミ ドプロピル一ポリオキシエチレンへプチルアミ ド) -C y s (—メ チルポリオキシエチレンーチォサクシンイミ ド） 一G 1 y —コハク酸イミ ドエス テルの結晶 0. 4 gを得た。
なお、 反応の進行及ぴ生成物の同定は、 実施例 1と同様に行い、 薄層クロマト グラフィ一によつて R f 値 0. 7~0. 8付近に検出されるメチルポリオキシェ チレン化合物のスポットと、 値0. 1付近に検出されるペプチドのスポット とが、 R f値 0. 3〜0. 4付近に検出されるスポットに変換したことにより確 認した。 生成物の確認は、 — NMRより、 メチルポリオキシエチレン鎖、 ぺ プチド鎖、 コハク酸イミ ドエステル、 マレイミ ド基 (δ ： 6. 8 p p m付近） の 確認を行った。 また、 iH— NMRより求めた生成物中のポリオキシエチレンの 分子量は 3 2 4 0 0であった。
1H_NMR分析では、 日本電子 （株） 製 J NM— EC P 4 0 0を用いた。 1 H-NMR (CD C 1 3, 内部標準 TMS)
実施例 5の製造スキームを以下に示す。 Gly— Lys一 Cys一 Gly
Figure imgf000058_0001
(実施例 6 )
マレイミ ドプロピルアミ ドプロピル一ポリオキシエチレン力ルバミル一 { L y s (マレイミ ドプロピルアミ ドプロピル一ポリオキシエチレン力ルバミル） } . ーコハク酸イミ ドエステル く MAL— PEG 3400 _ {L y s (-PEG 3 400 -MAL) } 4-NH S) の合成
(1) t一ブチルォキシカルボ二ルーァミノプロピル一ポリオキシエチレンカル バミル一 {Ly s ( tーブチノレオキシカルボ-ル一ァミノプロピル—ポリオキシ エチレンカノレバミル） } 4 く B o c— PEG3400— {Ly s (一 P EG 3 400— B o c) } 4〉 の合成
t一ブチルォキシカルボニル (B o c) ーァミノプロピル一ポリオキシェチレ ン一 p—二トロフエニルカーボネート (重量平均分子量 3400、 下記式 (8) ) 2 g (0. 6mmo 1 ) をァセトニトリル 10 m Lに溶解し、 この溶液 に 50 m g (0. 094 mm o 1 ) のテトラリジン (Ly s— Ly s _Ly s— Ly s ;配列番号 4 ) を水 1. 5 m Lに溶解させた水溶液を添加して攪拌し、 さ らにトリェチルァミン 0. 1 gを添加して室温で 5時間攪拌した。'反応終了後、 ろ過にて不溶物を除去し、 続いてエバポレーターにて減圧で溶媒を除去した。 次 いで、 酢酸ェチル 1 OmLを加えて溶解し、 硫酸ナトリゥムを添加して攪拌した 後、 ろ過して脱水を行った。 次いで、 ろ液にへキサン 2 OmLを加えて 0°C以下 に冷却後、 ろ過して粗結晶を得た。 粗結晶を酢酸ェチル 2 OmLに溶解し、 吸着 剤としてキヨ一ワード # 2000 (0. 01 g) 、 キヨ一ワード # 700 (0. 1 g) を加え、 40°Cにて 0. 5時間攪拌した。 吸着剤をろ過後、 へキサン 10 OmLを加えて冷却して結晶化し、 さらに晶析を行って目的化合物 1. 2 g (収 率 55 %) を得た。
Figure imgf000059_0001
(2) ァミノプロピル一ポリオキシエチレン力ルバミル一 {Ly s (ァミノプロ ピル一ポリオキシエチレン力ルバミル） } 4 く NH2— P EG 3400— { L y s (一 PEG 3400— NH2) } 4〉 の合成
(1) で得られた結晶を 2 N塩酸溶液 2 OmLに溶解し、 30でで1時間撹拌 した。 反応後 30 %水酸化ナトリゥム溶液で中和し、 食塩 10 gを加えて溶解さ せ、 その後クロ口ホルム抽出を 3回行った。 得られたクロ口ホルム層を硫酸ナト リウムで乾燥させ、 ろ過後、 クロ口ホルムを留去し、 濃縮を行った。 濃縮液にト ルェン 5mL、 酢酸ェチル 5m Lを加えて加温溶解後、 へキサン 20mLを加え て結晶を析出させろ過した。 得られた結晶を乾燥し、 脱保護した末端アミノ体で ある (ァミノプロピル一ポリオキシエチレン力ルバミル) — {Ly s (アミノブ 口ピノレーポリオキシエチレンカノレバミル） } 4 0. 8 gを得た。
(3) マレイミ ドプロピルアミ ドプロピル一ポリオキシエチレン力ルバミル一 {L y s (マレイミ ドプロピルアミ ドプロピル一ポリオキシエチレンカルバミ ル） } 4 (MA L一 PEG 3400— {Ly s (― PEG3400— MA L) } 4 の合成
(2) で得られた結晶をァセトニトリル 1 OmLに溶解し、 N—サクシンイミ ジル （3—マレイミドプロピオネート) (SMP) 0. 35 gを添カ卩し、 さらに トリェチルァミン 0. 09 gを添カ卩し 40 °Cで 5時間撹拌した。 反応後、 吸着剤 である、 キヨ一ワード 700 0. 05 g、 キヨ一ワード 1000 0. 05 g を加え、 40°Cでさらに 0. 5時間攪拌した。 反応液をろ過し、 濾液にへキサン 5 OmLを加えて結晶を析出させ、 濾取した。 得られた結晶を酢酸ェチル 1 Om Lを加えて加温溶解後、 へキサン 2 OmLを加えて結晶を再度析出させ、 濾取乾 燥し、 マレイミ ドプロピルアミ ドプロピル一ポリオキシエチレン力ルバミル一 {リジン （マレイミ ドプロピルアミ ドプロピル一ポリオキシエチレンカルバミ ル） } 4 0. 8 gを得た。
(4) マレイミ ドプロピルアミ ドプロピル一ポリオキシエチレン力ルバミル一 {Ly s (マレイミ ドプロピルアミ ドプロピル一ポリオキシエチレンカルバミ ル） } 4ーコハク酸イミ ドエステル (MA L-PEG3400- {Ly s (一 P EG 3400 -MAL) } 4一 NHS〉 の合成
( 3 ) で得られた結晶をクロ口ホルム 10 m Lに溶解し、 実施例 2 (3) と同 様の方法にてマレイミ ドプロピルアミ ドプロピル一ポリオキシエチレンカルバミ ルー { L y s (マレイミ ドプロピルアミ ドプロピル一ポリオキシエチレン力ルバ ミル） } 4—コハク酸イミ ドエステルの結晶 0. 7 gを得た。
なお、 反応の進行及び生成物の同定は、 実施例 1と同様に行い、 薄層クロマト グラフィ一によつて R f値 0. 7〜0. 8付近に検出されるメチルポリオキシェ チレン化合物のスポットと、 R JH O. 1付近に検出されるペプチドのスポット とが、 R 0. 3〜0. 4付近に検出されるスポットに変換したことにより確 認した。 生成物の確認は、 — NMRより、 メチルポリオキシエチレン鎖、 ぺ プチド鎖、 コハク酸イミ ドエステル、 マレイミ ド基 （δ ： 6. 8 p pm付近） の 確認を行った。 また、 H— NMRより求めた生成物中のポリオキシエチレンの 分子量は 1 7700であった。
iH— NMR分析では、 日本電子 （株） 製 JNM—ECP400を用いた。 1 H-NMR (CDC 13, 内部標準 TMS)
実施例 6の製造スキームを以下に示す。
Lys— Lys— Lys— Lys
Figure imgf000062_0001
(実施例 7)
p—二トロフエ二ノレカノレポ二ルーポリォキシエチレンォキシプロピルアミノ― { ァスパラギン酸 （一メチル—ポリオキシエチレンォキシプロピルアミ ド） } 5— グルタリルォキシーメチルポリオキシエチレン (pNP-PEG 20000- {A s p (-PEG 2000-OMe) } 5- P EG 2000 -OMe) の合 成
(1) ペンジノレポリオキシエチレンォキシプロピルアミノー (ベンジルァスパラ ギン酸） 5 く BE— PEG20000— BA5〉 の合成
ベンジルポリオキシエチレンォキシプロピルァミン (SUNBR I GHT B E— 200 PA、 分子量 20000) 40 gをジクロロメタン 500 m Lに、 4 0°Cに加熱して溶解し、 β—ベンジノレ Lーァスパルテート Ν—カルボン酸無 水物 3 g (6当量） を添加し、 40°Cで 6時間反応を行った。 室温に冷却後、 反 応溶液に酢酸ェチル 1 Lとへキサン 1 Lの混合溶媒を添加して結晶化し、 さらに 同混合溶媒で結晶を洗浄し、 乾燥して目的物 BE— PEG20000— BA5の 結晶 41. 2 gを得た。
(2) ベンジルポリオキシエチレンォキシプロピルアミノー （ベンジルァスパラ ギン酸） 5_グルタレート く B E— P EG 20000— B A5— GC〉 の合 成
(1) で得られた結晶 19 gをトルエン 10 OmLを加え、 酢酸ナトリウム （ 0. 19 g) を添加して 55 °Cにて溶解した後、 無水ダルタル酸: L gを添加して、 55 °Cにて 9時間反応させた。 反応後、 濾過して不溶物を除去し、 ろ液にへキサ ンを加え結晶化し、 ァセトニトリル Z酢酸ェチル /へキサンの混合溶媒 （ 1 Z8 /8) を用いて 3回晶析を行い、 へキサンで結晶を洗浄し乾燥して目的物 BE— P EG 20000— B A5— GCの結晶 1 6 gを得た。
(3) ハイ ド口ポリオキシエチレンォキシプロピルァミノ一 {ァスパラギン酸 （ ーメチルーポリオキシエチレンォキシプロピルアミド） } 5—グルタレート く HO-P EG 20000- {AA (-PEG 2000-OMe) } 5— GC〉 の合成
( 2 ) で得られた結晶 10 gに 0. 5 N水酸化ナトリウム水溶液 51 gを加え、 室温で 24時間加水分解反応を行った。 反応後、 イオン交換水 50 gで希釈し、 リン酸にて： H 2に調整し、 酢酸ェチル 10 OmLを加えて 2回抽出した後、 水 層に塩化ナトリウムを加え、 クロ口ホルム 20 OmLで抽出を行った。 抽出後、 減圧で溶媒を除去し、 酢酸ェチル 10 OmLを加えて溶解し、 へキサン 1 O Om Lを加えて結晶化し、 さらに結晶をへキサンにて洗浄し、 乾燥してベンジルポリ ォキシエチレンォキシプロピルァミノ一 （ァスパラギン酸） 5—グルタレート く BE— PEG 20000— AA5— GC〉 6 gを得た。
得られた BE— PEG20000— AA5— GC 2. 5 gに、 トルエン 25 mLを加えて 40°Cで溶解し、 N—ヒドロキシスクシンイミ ド （NHS) 0. 25 gを添加した後、 ジシク口へキシルカルポジィミド （D C C) 0. 2 gを 加え、 40°Cで 30分間反応させ、 さらにメチルポリオキシエチレンォキシプロ ピルアミン （SUNBR I GHT ME P A— 20 H、 分子量 2000 ) 2. 5 gをトルェン 1 2 m Lに溶解して添加し、 40 で 7時間反応を行つた。 反応 後、 濾過した後、 へキサンを加え結晶化し、 ァセトニトリル Z酢酸ェチル Zへキ サンの混合溶媒 （10/80Z80) にて 2回晶析を行い、 さらに結晶をへキサ ンにて洗浄し、 乾燥してベンジルポリオキシエチレンォキシプロピルアミノー { ァスパラギン酸 （一メチル一ポリオキシエチレンォキシプロピルアミ ド） } 5— グルタリルォキシ一メチルポリオキシエチレン く BE— PEG20000— { AA (- P EG 2000 -OMe ) } 5-P EG 2000 -OMe) 1. 8 g を得た。 ,
得られた BE— PEG20000_ {AA (一 P E G 2000— OM e ) } 5 - P EG 2000 -OMe 1. 95 §に50/0? (1 〇 1. O gを加え、 メタ ノール 2 OmLとシクロへキセン 3. 3 m Lを加えて 55 °Cまで昇温し、 2時間 反応させた。 室温に冷却後、 クロ口ホルムを加え、 ろ過して P d/Cを除去し、 減圧で溶媒を除去した後、 残渣をトルエン 10 OmLに溶解し、 へキサンを添カロ し結晶化した後、 結晶をへキサンにて洗浄し、 乾燥して目的物 HO— PEG 2◦ 000— {AA (― PEG 2000— OMe) } 5— 0〇の結晶1. 25 gを得 た。
(4) p一二トロフエエノレカノレポニノレーポリオキシエチレンォキシプロピノレアミ ノ - {ァスパラギン酸 (一メチルーポリオキシエチレンォキシプロピルアミ ド） } 5—グルタリルォキシーメチルポリオキシエチレン <pNP-PEG 200 00— {A s (-PEG 2000-OMe) } 5— P E G 2000— OM e〉 の合成
(3) で得られた結晶 1 gをトルエン 1 OmLに溶解し、 p—-トロフエ-ル クロロホノレメート 0. 02 gとトリエチルァミン 0. 0 1 5 gを添加し、 80°C で 9時間反応させた。 反応溶液をろ過し、 へキサンを添加して結晶化した後、 酢 酸ェチル Zへキサンの混合溶媒で晶析を 2回行い、 結晶をへキサンにて洗浄し、 乾燥して目的物 pNP— PEG 20000— {A s (― PEG2000—OM e) } 5— P EG 2000― OMeの結晶 0. 8 gを得た。
生成物の確認、は、 ifi— NMRより、 メチルポリオキシエチレン鎖、 ペプチド 鎖、 p―ニトロフェルカーボネート基 （δ ： 8. 2 p pm付近） の確認、を行った。 また、 下記の G PCによって測定した生成物の分子量は 32100であった。 GPC分析は、 システムとして LC— 1 OA (S h i ma d z u) を用いて測定 を行った。 角军析は GP C s o f twa r e (S h i ma d z u) を用いた。 G PC測定値には、 高分子量不純物と低分子量不純物を、 溶出曲線の変曲点からべ ースラインに対して垂直に切って除いたメインピークでの解析値、 及ぴ溶出開始 点から溶出終了点までのピーク全体での解析値を併記した。
展開溶媒： DMF
流速： 0. 7 mL/m i n
カラム ： PL g e l MI XED_D X2
カラム温度： 65°C
サンプル量： 40mgZ30 g , 0. 1 mL 検出器： R I
S t a n d a r d : PEG620, PEG4 1 20、 PEG 1 1840、 PEG 32500、 PEG74900
実施例 7の製造スキームを以下に示す。
Figure imgf000066_0001
Figure imgf000066_0002
(実施例 8 )
メチルポリオキシエチレンォキソペンチルカルポ-ルー {Ly s (メチルポリオ キシエチレンォキソペンチルカルポニル） } 4ーコハク酸ィミ ドエステル く M E-PEG20000 - {Ly s (一 PEG 20000— OMe) } 3— NHS > の合成
(1) メチノレポリオキシエチレンォキソペンチノレ力/レポ二ルー {し y s (メチル ポリオキシエチレンォキソペンチルカルボ二ノレ） } 3 <ME- P EG 2000 0— {L y s (—PEG 20000— OMe) } 3〉 の合成
α—サクシンィミジルカルボキシペンチル一ω—メ トキシーポリオキシェチレ ン （SUNBR I GHT ME— 200 H S、 重量平均分子量 20000 ) 4. 37 g (22mmo 1 ) をジメチルスルホキシド 10 m Lに溶解し、 この溶液に 2 Omg (5 mm o 1 ) のトリリジン （L y s _Ly s— Ly s) を添カロして攪 拌し、 さらにトリェチルァミン 24 m gを添加して 40 で 5時間攪拌した。 反 応終了後、 ろ過にて不溶物を除去し、 次いで、 酢酸ェチル 5 OmLを加えて溶解 し、 へキサン 5 OmLを加えて結晶化し、 さらに同様に晶析を 2回行い目的化合 物 2. 9 g (収率 70 %) を得た。
(2) メチルポリォキシエチレンォキソペンチルカルポ二ルー {Ly s (メチル ポリオキシエチレンォキソペンチルカルボニル) } 3—コハク酸イミ ドエステル <ME-P EG 20000- {Ly s (-PEG20000 -OMe ) } 3— N HS> の合成
(1) で得られた結晶 2 gにトルエン 1 OmLを加えて 40°Cで溶解し、 N— ヒ ドロキシスクシンイミ ド （NHS) 4. 3mgを添 ¾した後、 ジシクロへキシ ルカルポジイミド （DCC) 1 3mgを加え、 40°Cで 4時間反応させた。 反応 後、 濾過した後、 へキサンを加え結晶化し、 ァセトニトリル/酢酸ェチル へキ サンの混合溶媒 （1 OZ80/80) にて 2回晶析を行い、 さらに結晶をへキサ ンにて洗浄し、 乾燥して目的化合物 2. 9 g (収率 70%) を得た。
なお、 反応の進行及び生成物の同定は、 実施例 6と同様に行い、 薄層クロマト グラフィ一によつて R f値 0. 7〜0. 8付近に検出されるメチルポリオキシェ チレン化合物のスポットと、 R f値 0. 1付近に検出されるペプチドのスポット とが、 R f値 0. 3〜0. 4付近に検出されるスポットに変換したことにより確 認した。 生成物の確認は、 一 NMRより、 メチルポリオキシエチレン鎖、 ぺ プチド鎖、 コハク酸イミ ドエステルの確認を行った。 また、 G P Cより求めた生 成物のポリオキシエチレンの分子量は 6 7 8 0 0であった。
実施例 8の製造スキームを以下に示す。
し ys—し VS——し ys
Figure imgf000068_0001
CH30(CH2CH20)n(CH2)5 - CONH
CH30(CH2CH20)n(CH2)5— CONH— Lys—— Lys— Lys
CH30(CH2CH20)n(CH2)5 - CONH
CH30(CH2CH20)n(CH2)5— CONA
Figure imgf000068_0002
CH30(CH2CH20)n(CH2)5— CONH Q
CH30(CH2CH20)n(CH2)5— CONH— Lys— Lys— Lys— N
CH30(CH2CH20)n(CH2)5— CONfi O
CH30(CH2CH20)n(CH2)5— CONH
産業上の利用可能性
本発明のポリオキシアルキレン誘導体は、 ドラッグデリバリーシステムとして 適用した際に、 タンパク質などの生理活性物質との結合において、 一つの結合で 異なる本数さらには分子量等性質の異なるポリォキシアルキレン鎖を導入できる だけでなく、 その結合の形式も変えることにより、 安定性の調節ができる。 また、 官能基を複数有することにより、 生理活性物質と抗体等を結合することができ、 標的部位へ生理活性物質等を集積することができる。 その結果生理活性物質の標 的部位への選択的送達性が向上し、 ひいては過剰投与による副作用の低減にも寄 与することができる。 本出願は、 日本で出願された特願 2 0 0 5— 0 4 1 5 2 3を基礎としており、 その内容は本出願にすべて包含されるものである。

Claims

請求の範囲 下記一般式 （1)
Figure imgf000070_0001
55 ((式式中中、、
ZZはは、、 22〜〜1100残残基基ののアアミミノノ酸酸かかららななるるペペププチチドド残残基基ででああっってて、、 官官能能基基をを含含むむ 側側鎖鎖をを有有すするるアアミミノノ酸酸をを 11残残基基以以上上含含むむぺぺププチチドド残残基基をを示示しし、、
◦◦ AAはは、、 炭炭素素数数 22〜〜44ののォォキキシシアアルルキキレレンン基基をを示示しし、、
RRはは、、 水水素素原原子子ああるるいいはは炭炭素素数数 11〜〜44のの炭炭化化水水素素基基をを示示しし、、
1100 XX11及及びび XX22はは、、 ココハハクク酸酸イイミミ ドド基基、、 ママレレイイミミ ドド基基、、 アアミミノノ基基、、 カカルルボボキキシシルル 基基、、 カカーーボボネネーートト基基、、 アアルルデデヒヒドド基基、、 ススルルホホニニルル基基、、 チチオオーールル基基、、 ビビュュルル基基、、 ァァ リリルル基基又又はは水水酸酸基基をを含含むむ基基をを示示しし、、
YY及及びび WWはは、、 そそれれぞぞれれ独独立立ししてて、、 ——CCOONNHH――、、 一一 NNHHCCOO——、、 --OOCCOONNHH 一一、、 一一 NNHHOOCCOO——、、 一一 CCOOOO——、、 一一 OOOOCC——、、 一一 CCOOSS——、、 一一 SSOOCC——、、 一一 CC 1155 HH22NNHH——、、 一一 NNHHCCHH22——、、 __SS—— CCHH<<、、 〉〉CCHH—— SS——、、 一一 CCHH22—— SS——、、 一一 SS—— CCHH22——、、 一一SS—— SS——及及びび—— OO——かかららななるる群群かからら選選ばばれれるる基基をを含含むむ 22価価のの基基 をを示示しし、、
nnはは 55〜〜11000000のの整整数数でであありり、、 mmはは 55〜〜880000のの整整数数でであありり、、 jj 11はは 00〜〜 11 22のの整整数数でであありり、、 jj 22はは 00〜〜 88のの整整数数でであありり、、 kkはは 00〜〜11 11のの整整数数でであありり、、 かかつつ、、 2200 11≤≤ jj !!++ jj 22≤≤ 11 22,, 22≤≤kk++ jj JJ≤≤ 1122,, 33≤≤kk++ jj 11++ jj 22≤≤ 1122,, 3300≤≤ ((nn XX kk)) ++ ((mmXX jj 22000000をを満満たたすす））
*
2 . Zが 2〜1 0残基のアミノ酸からなるペプチド残基であって、 アミノ基、 カルボキシル基、 チオール基及ぴ水酸基からなる群から選ばれる官能基を含む側 鎖を有するァミノ酸を 1残基以上有するぺプチド残基を示す、 請求項 1に記載の ポリオキシアルキレン誘導体。
3 . Zが 2〜1 0残基のアミノ酸からなるペプチド残基であって、 リジン、 了 スパラギン酸、 グルタミン酸、 システィン及びセリンからなる群から選ばれるァ ミノ酸を 1残基以上有するぺプチド残基を示す、 請求項 2に記載のポリォキシァ ルキレン誘導体。
4 . Zがリジン、 ァスパラギン酸及びグルタミン酸からなる群から選ばれるァ ミノ酸 2〜 1 0残基からなるぺプチド残基を示す、 請求項 3に記載のポリオキシ アルキレン誘導体。
5 . j 1が 0であり、 j 2が 1〜8であり、 kが 2〜： L 1である、 請求項 1〜 4のいずれか 1項に記載のポリォキシアル.キレン誘導体。
6 . j 2が 1である、 請求項 5に記載のポリオキシアルキレン誘導体。
7 . j 1が 1〜1 2である、 請求項 1〜4のいずれか 1項に記載のポリオキシ アルキレン誘導体。 „
8 . j 2が 0である、 請求項 7に記載のポリオキシアルキレン誘導体。
9 . j 1が 1である、 請求項 7又は 8に記載のポリオキシアルキレン誘導体。
1 0 . j 1が 2〜1 2である、 請求項 7に記載のポリオキシアルキレン誘導体。
1 1. j 2が 1〜8である、 請求項 7に記載のポリオキシアルキレン誘導体。
12. Zが、 3〜8残基のアミノ酸からなるペプチド残基であって、 グリシン、 リジン、 グルタミン酸、 システィン及びァスパラギン酸からなる群から選ばれる アミノ酸を 1残基以上有するぺプチド残基を示す、 請求項 1〜 1 1のいずれか 1 項に記載のポリオキシアルキレン誘導体。
13. Rがメチル基を示し、 OAがォキシエチレン基を示す、 請求項 1〜1 2 のいずれか 1項に記載のポリォキシァノレキレン誘導体。
14. X1及ぴ X2が、 それぞれ独立して、 下記式 （a) 〜 （p)
Figure imgf000072_0001
—— Q— NH2 (j) —— NH2 (k) —— Q— COOH (1)
—— COOH (m) —— SH (n) —— OH (o)
—— Q— CH=CH2 (p)
(Qは、 アルキレン基、 又は、 エステル結合、 アミド結合、 エーテル結合、 ウレ タン結合、 ゥレア結合、 カーボネート結合、 スルフイ ド結合、 ィミン結合もしく は 2級アミノ基を有するアルキレン基を示す。 Vはフッ素原子を含んでいてもよ い炭素数 1〜1 0の炭化水素基を示す。 ） からなる群から選択される基である、 請求項 1 ~ 1 3のいずれか 1項に記載のポリォキシアルキレン誘導体。
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