JP2019172673A - 分解性ポリエチレングリコール結合体 - Google Patents
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Abstract
Description
特許文献1には、生体内で切断されるスルフィド結合やペプチド結合部位を有したポリエチレングリコール誘導体に関する記載がなされている。当該ポリエチレングリコール誘導体は、生体内で腎臓からの排出に適した分子量まで分解されるとの記載がある。しかし、具体的な分解に関するデータは全く示されておらず、腎臓からの排出が促進されたというデータもない。さらに細胞の空胞に関する記載はない。
[1] 下式(A):
で示される分解性ポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質。
[2] 下式(1):
で示される分解性ポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質である、[1]記載の生体関連物質。
[3] Qが、エチレングリコール、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリセリン、ペンタエリスリトール、ジグリセリンまたはキシリトールの残基である[1]または[2]記載の生体関連物質。
[4] Qが、オリゴペプチドの残基であり、該オリゴペプチドが、リジン、アスパラギン酸およびグルタミン酸のいずれか1つを含み、かつそれ以外のアミノ酸がシステインを除く中性アミノ酸からなる4〜8残基のオリゴペプチドである[1]または[2]記載の生体関連物質。
[5] Qのオリゴペプチドが、C末端のアミノ酸としてグリシンを有するオリゴペプチドである[4]記載の生体関連物質。
[6] Qのオリゴペプチドが、ハイドロパシー指標が2.5以上である疎水性の中性アミノ酸を少なくとも1つ有するオリゴペプチドである[4]または[5]記載の生体関連物質。
[7] Zのオリゴペプチドが、C末端のアミノ酸としてグリシンを有するオリゴペプチドである[1]〜[6]のいずれか1記載の生体関連物質。
[8] Zのオリゴペプチドが、ハイドロパシー指標が2.5以上である疎水性の中性アミノ酸を少なくとも1つ有するオリゴペプチドである[1]〜[7]のいずれか1記載の生体関連物質。
[9] Dに結合した分解性ポリエチレングリコール誘導体1分子の分子量が30,000以上である[1]〜[8]のいずれか1記載の生体関連物質。
[10] L1、L2、L3、L4及びL5がそれぞれ独立して、単結合、フェニレン基、アミド結合、エーテル結合、チオエーテル結合、ウレタン結合、2級アミノ基、カルボニル基、ウレア結合、トリアジン基、マレイミドとチオールの結合、オキシム結合、またはこれらの結合および基を含んでいてもよいアルキレン基である[1]〜[9]のいずれか1記載の生体関連物質。
[11] Dの生体関連物質が、ホルモン、サイトカイン、抗体、アプタマーまたは酵素である、[1]〜[10]のいずれか1記載の生体関連物質。
[12] Dの生体関連物質が、インスリン、カルシトニン、ヒト成長ホルモン、インターフェロン、顆粒球コロニー刺激因子、エリスロポエチンまたは抗体フラグメントである[1]〜[11]のいずれか1記載の生体関連物質。
[13] 式(1)中のZが、Z1、Aおよびグリシン残基で構成される、下式(2):
で示される分解性ポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質である、[2]記載の生体関連物質。
[14] Qが、エチレングリコール、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリセリン、ペンタエリスリトール、ジグリセリンまたはキシリトールの残基である[13]記載の生体関連物質。
[15] Qが、オリゴペプチドの残基であり、該オリゴペプチドが、リジン、アスパラギン酸およびグルタミン酸のいずれか1つを含み、かつそれ以外のアミノ酸がシステインを除く中性アミノ酸からなる4〜8残基のオリゴペプチドである[13]記載の生体関連物質。
[16] Qのオリゴペプチドが、C末端のアミノ酸としてグリシンを有するオリゴペプチドである[15]記載の生体関連物質。
[17] Qのオリゴペプチドが、ハイドロパシー指標が2.5以上である疎水性の中性アミノ酸を少なくとも1つ有するオリゴペプチドである[15]または[16]記載の生体関連物質。
[18] Z1のオリゴペプチドが、ハイドロパシー指標が2.5以上である疎水性の中性アミノ酸を少なくとも1つ有するオリゴペプチドである[13]〜[17]のいずれか1記載の生体関連物質。
[19] Aの中性アミノ酸が、ハイドロパシー指標が2.5以上である疎水性の中性アミノ酸である[13]〜[18]のいずれか1記載の生体関連物質。
[20] Dに結合した分解性ポリエチレングリコール誘導体1分子の分子量が30,000以上である[13]〜[19]のいずれか1記載の生体関連物質。
[21] L1、L2、L3、L4及びL5がそれぞれ独立して、単結合、フェニレン基、アミド結合、エーテル結合、チオエーテル結合、ウレタン結合、2級アミノ基、カルボニル基、ウレア結合、トリアジン基、マレイミドとチオールの結合、オキシム結合、またはこれらの結合および基を含んでいてもよいアルキレン基である[13]〜[20]のいずれか1記載の生体関連物質。
[22] Dの生体関連物質が、ホルモン、サイトカイン、抗体、アプタマーまたは酵素である、[13]〜[21]のいずれか1記載の生体関連物質。
[23] Dの生体関連物質が、インスリン、カルシトニン、ヒト成長ホルモン、インターフェロン、顆粒球コロニー刺激因子、エリスロポエチンまたは抗体フラグメントである[13]〜[22]のいずれか1記載の生体関連物質。
[24] 式(2)中のmが1である、下式(3):
で示される分解性ポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質である、[13]記載の生体関連物質。
[25] Qが、エチレングリコール、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリセリン、ペンタエリスリトール、ジグリセリンまたはキシリトールの残基である[24]記載の生体関連物質。
[26] Qが、オリゴペプチドの残基であり、該オリゴペプチドが、リジン、アスパラギン酸およびグルタミン酸のいずれか1つを含み、かつそれ以外のアミノ酸がシステインを除く中性アミノ酸からなる4〜8残基のオリゴペプチドである[24]記載の生体関連物質。
[27] Qのオリゴペプチドが、C末端のアミノ酸としてグリシンを有するオリゴペプチドである[26]記載の生体関連物質。
[28] Qのオリゴペプチドが、ハイドロパシー指標が2.5以上である疎水性の中性アミノ酸を少なくとも1つ有するオリゴペプチドである[26]または[27]記載の生体関連物質。
[29] Z1のオリゴペプチドが、ハイドロパシー指標が2.5以上である疎水性の中性アミノ酸を少なくとも1つ有するオリゴペプチドである[24]〜[28]のいずれか1記載の生体関連物質。
[30] Aの中性アミノ酸が、ハイドロパシー指標が2.5以上である疎水性の中性アミノ酸である[24]〜[29]のいずれか1記載の生体関連物質。
[31] Dに結合した分解性ポリエチレングリコール誘導体1分子の分子量が30,000以上である[24]〜[30]のいずれか1記載の生体関連物質。
[32] L1、L2、L3、L4及びL5がそれぞれ独立して、単結合、フェニレン基、アミド結合、エーテル結合、チオエーテル結合、ウレタン結合、2級アミノ基、カルボニル基、ウレア結合、トリアジン基、マレイミドとチオールの結合、オキシム結合、またはこれらの結合および基を含んでいてもよいアルキレン基である[24]〜[31]のいずれか1記載の生体関連物質。
[33] Dの生体関連物質が、ホルモン、サイトカイン、抗体、アプタマーまたは酵素である、[24]〜[32]のいずれか1記載の生体関連物質。
[34] Dの生体関連物質が、インスリン、カルシトニン、ヒト成長ホルモン、インターフェロン、顆粒球コロニー刺激因子、エリスロポエチンまたは抗体フラグメントである[24]〜[33]のいずれか1記載の生体関連物質。
[35] 式(1)中のQがエチレングリコールの残基であり、L1がCH2CH2Oであり、かつpが1である、下式(4):
で示される分解性ポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質である、[2]記載の生体関連物質。
[36] Zのオリゴペプチドが、C末端のアミノ酸としてグリシンを有するオリゴペプチドである[35]記載の生体関連物質。
[37] Zのオリゴペプチドが、ハイドロパシー指標が2.5以上である疎水性の中性アミノ酸を少なくとも1つ有するオリゴペプチドである[35]または[36]記載の生体関連物質。
[38] Dに結合した分解性ポリエチレングリコール誘導体1分子の分子量が30,000以上である[35]〜[37]のいずれか1記載の生体関連物質。
[39] L2、L3、L4及びL5がそれぞれ独立して、単結合、フェニレン基、アミド結合、エーテル結合、チオエーテル結合、ウレタン結合、2級アミノ基、カルボニル基、ウレア結合、トリアジン基、マレイミドとチオールの結合、オキシム結合、またはこれらの結合および基を含んでいてもよいアルキレン基である[35]〜[38]のいずれか1記載の生体関連物質。
[40] Dの生体関連物質が、ホルモン、サイトカイン、抗体、アプタマーまたは酵素である、[35]〜[39]のいずれか1記載の生体関連物質。
[41] Dの生体関連物質が、インスリン、カルシトニン、ヒト成長ホルモン、インターフェロン、顆粒球コロニー刺激因子、エリスロポエチンまたは抗体フラグメントである[35]〜[40]のいずれか1記載の生体関連物質。
[42] 式(2)中のQがエチレングリコールの残基であり、L1がCH2CH2Oであり、かつpが1である、下式(5):
で示される分解性ポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質である、[13]記載の生体関連物質。
[43] Z1のオリゴペプチドが、ハイドロパシー指標が2.5以上である疎水性の中性アミノ酸を少なくとも1つ有するオリゴペプチドである[42]記載の生体関連物質。
[44] Aの中性アミノ酸が、ハイドロパシー指標が2.5以上である疎水性の中性アミノ酸である[42]または[43]記載の生体関連物質。
[45] Dに結合した分解性ポリエチレングリコール誘導体1分子の分子量が30,000以上である[42]〜[44]のいずれか1記載の生体関連物質。
[46] L2、L3、L4及びL5がそれぞれ独立して、単結合、フェニレン基、アミド結合、エーテル結合、チオエーテル結合、ウレタン結合、2級アミノ基、カルボニル基、ウレア結合、トリアジン基、マレイミドとチオールの結合、オキシム結合、またはこれらの結合および基を含んでいてもよいアルキレン基である[42]〜[45]のいずれか1記載の生体関連物質。
[47] Dの生体関連物質が、ホルモン、サイトカイン、抗体、アプタマーまたは酵素である、[42]〜[46]のいずれか1記載の生体関連物質。
[48] Dの生体関連物質が、インスリン、カルシトニン、ヒト成長ホルモン、インターフェロン、顆粒球コロニー刺激因子、エリスロポエチンまたは抗体フラグメントである[42]〜[47]のいずれか1記載の生体関連物質。
[49] 式(3)中のQがエチレングリコールの残基であり、L1がCH2CH2Oであり、かつpが1である、下式(6):
で示される分解性ポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質である、[24]記載の生体関連物質。
[50] Z1のオリゴペプチドが、ハイドロパシー指標が2.5以上である疎水性の中性アミノ酸を少なくとも1つ有するオリゴペプチドである[49]記載の生体関連物質。
[51] Aの中性アミノ酸が、ハイドロパシー指標が2.5以上である疎水性の中性アミノ酸である[49]または[50]記載の生体関連物質。
[52] Dに結合した分解性ポリエチレングリコール誘導体1分子の分子量が30,000以上である[49]〜[51]のいずれか1記載の生体関連物質。
[53] L2、L3、L4及びL5がそれぞれ独立して、単結合、フェニレン基、アミド結合、エーテル結合、チオエーテル結合、ウレタン結合、2級アミノ基、カルボニル基、ウレア結合、トリアジン基、マレイミドとチオールの結合、オキシム結合、またはこれらの結合および基を含んでいてもよいアルキレン基である[49]〜[51]のいずれか1記載の生体関連物質。
[54] Dの生体関連物質が、ホルモン、サイトカイン、抗体、アプタマーまたは酵素である、[49]〜[52]のいずれか1記載の生体関連物質。
[55] Dの生体関連物質が、インスリン、カルシトニン、ヒト成長ホルモン、インターフェロン、顆粒球コロニー刺激因子、エリスロポエチンまたは抗体フラグメントである[49]〜[54]のいずれか1記載の生体関連物質。
本発明に係る分解性ポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質は、下式(A)で示される。
生体関連物質に結合する分解性ポリエチレングリコール誘導体の分子数を増やすことで得られる効果としては、血中半減期の延長、抗原性の低減などが挙げられるが、生体関連物質によっては活性が低下する可能性がある。酵素などの生体関連物質においては、複数のポリエチレングリコール誘導体を結合させても活性が低下しないことが知られている。
本発明に係る分解性ポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質は、下式(1)で示される。
また、Qの活性水素の数であるvと、式(1)におけるポリエチレングリコール誘導体部分のポリエチレングリコール鎖の本数を表すpとの関係は、好ましくはv=p+1であり、p=1の場合はv=2で、Qはエチレングリコールなどの残基であり、p=2の場合はv=3で、Qはグリセリン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸などの残基であり、p=3の場合はv=4で、Qはペンタエリスリトール、ジグリセリンなどの残基であり、p=4の場合はv=5で、Qはキシリトールなどの残基である。
Qがオリゴペプチドの残基である場合、該オリゴペプチドは、生体内の血中で安定であり、かつ細胞内の酵素で分解する性能を有し、リジン、アスパラギン酸およびグルタミン酸のいずれか1つを含み、かつそれ以外のアミノ酸がシステインを除く中性アミノ酸からなる4〜8残基のオリゴペプチドであれば特に制限は無いが、具体的な例としては、グルタミン酸−グリシン−フェニルアラニン−ロイシン−グリシン、グリシン−グルタミン酸−フェニルアラニン−ロイシン−グリシン、グルタミン酸−グリシン−グリシン−フェニルアラニン−グリシン、グルタミン酸−フェニルアラニン−グリシン、グルタミン酸−グリシン−フェニルアラニン−グリシン、グルタミン酸−グリシン−ロイシン−グリシン、グルタミン酸−バリン−シトルリン−グリシン、グルタミン酸−バリン−アラニン−グリシン、グルタミン酸−フェニルアラニン−グリシンなどであり、好ましくはグルタミン酸−グリシン−フェニルアラニン−ロイシン−グリシン、グルタミン酸−グリシン−フェニルアラニン−グリシン、グルタミン酸−バリン−シトルリン−グリシン、グルタミン酸−バリン−アラニン−グリシンであり、より好ましくはグルタミン酸−グリシン−フェニルアラニン−ロイシン−グリシン、グルタミン酸−バリン−シトルリン−グリシンである。該オリゴペプチドはまた、C末端のアミノ酸としてグリシンを有するオリゴペプチドであることが好ましい。該オリゴペプチドはさらに、ハイドロパシー指標が2.5以上である疎水性の中性アミノ酸を少なくとも1つ有するオリゴペプチドであることが好ましい。なお、該オリゴペプチドの詳細な説明については、上記Zのオリゴペプチドの説明を参照されたい。
式(1)中のL5は、上記の群(I)の(z1)、(z2)、(z3)、(z4)、(z5)、(z6)、(z7)、(z8)、(z9)、(z10)、(z12)、(z13)が好ましく、(z2)、(z3)、(z4)、(z5)、(z6)、(z7)、(z10)、(z12)、(z13)がより好ましく、(z3)、(z5)、(z12)が特に好ましい。
本発明の別の好ましい実施形態では、L1、L2、L3、L4及びL5はそれぞれ独立して、単結合、アミド結合、エーテル結合、2級アミノ基、カルボニル基、またはこれらの結合および基を含んでいてもよいアルキレン基(例、単結合、−O−、−(CH2)2−、−(CH2)3−、−(CH2)2−O−、−(CH2)3−O−、−(CH2)2−CO−NH−、−(CH2)2−CO−NH−(CH2)3−、−CO−、−(CH2)5−CO−、−NH−)であり、より好ましくはL1が単結合、エーテル結合またはエーテル結合を含んでいてもよいアルキレン基(例、単結合、−O−、−(CH2)2−O−)であり、L2がカルボニル基またはカルボニル基を含んでいてもよいアルキレン基(例、−CO−、−(CH2)5−CO−)であり、L3が2級アミノ基(−NH−)であり、L4がエーテル結合を含んでいてもよいアルキレン基(例、−(CH2)3−O−)であり、L5が単結合またはアミド結合を含んでいてもよいアルキレン基(例、単結合、−(CH2)2−、−(CH2)3−、−(CH2)2−CO−NH−、−(CH2)2−CO−NH−(CH2)3−)である。
より具体的には、サイトカインとしては、免疫を調整するインターフェロンタイプI、タイプII、タイプIIIや、インターロイキンや腫瘍壊死因子、それらの受容体アンタゴニストなどが挙げられる。成長因子としては、造血因子であるエリスロポエチンや刺激因子である顆粒球コロニー刺激因子(GCSF)などが挙げられ、血液凝固因子としては、第V因子、第VII因子、第VIII因子、第IX因子、第X因子、第XII因子などが挙げられる。ホルモンとしては、カルシトニンやインスリン、そのアナログやエキセンジン、GLP−1、そしてソマトスタチンやヒト成長ホルモンなどが挙げられる。抗体としては、その断片の抗体フラグメントとして、FabやsvFVなどが挙げられ、アプタマーとしては、DNAアプタマー、RNAアプタマーなどが挙げられ、酵素としては、スーパーオキシドディスムターゼやウリカーゼなどが挙げられる。これらタンパク質は、血中での安定性が低く、ポリエチレングリコールで修飾し、血中半減期を延長させることが望ましい。好適なタンパク質としては、インターフェロン、インターロイキン、エリスロポエチン、GCSF、第VIII因子、第IX因子、カルシトニン、インスリン、エキセンジン、ヒト成長ホルモン、抗体フラグメントであり、より好ましくは、インスリン、カルシトニン、ヒト成長ホルモン、インターフェロン、GCSF、エリスロポエチン、抗体フラグメント(特にFab)であり、さらに好ましくは、カルシトニン(特にサーモンカルシトニン)、インスリン、ヒト成長ホルモン、GCSFであり、特に好ましくはカルシトニン(特にサーモンカルシトニン)、ヒト成長ホルモン、GCSFである。
下式(4)は、式(1)のポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質において、Qがエチレングリコールの残基であり、L1がCH2CH2Oであり、かつpが1である、好適態様の直鎖型のポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質を示している。
式(1)のポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質のうち、pが2〜4であり、かつQが3〜5個の活性水素を持つ化合物の残基であるポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質は、好適態様の分岐型のポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質である。
Qの3〜5個の活性水素を持つ化合物の残基は、好ましくは、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリセリン、ペンタエリスリトール、ジグリセリンまたはキシリトールの残基、あるいはオリゴペプチドの残基であり、特に好ましくはリジン、グルタミン酸の残基である。ここで、該オリゴペプチドの好ましい態様は、上記の式(1)について説明した通りである。
なお、m、R、Z、D、L1、L2、L3、L4及びL5の好ましい態様は、上記の式(1)について説明した通りである。
Qの3〜5個の活性水素を持つ化合物の残基は、好ましくは、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリセリン、ペンタエリスリトール、ジグリセリンまたはキシリトールの残基、あるいはオリゴペプチドの残基であり、特に好ましくはリジン、グルタミン酸の残基である。ここで、該オリゴペプチドの好ましい態様は、上記の式(1)について説明した通りである。
なお、m、R、Z1、A、D、L1、L2、L3、L4及びL5の好ましい態様は、上記の式(1)および(2)について説明した通りである。
n3とn4は、それぞれ、ポリエチレングリコールの繰り返しユニット数であり、好ましくはそれぞれ独立して226〜455である。n3とn4は、異なっていても良く、また同じであっても良い。
Qの3〜5個の活性水素を持つ化合物の残基は、好ましくは、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリセリン、ペンタエリスリトール、ジグリセリンまたはキシリトールの残基、あるいはオリゴペプチドの残基であり、特に好ましくはリジン、グルタミン酸の残基である。ここで、該オリゴペプチドの好ましい態様は、上記の式(1)について説明した通りである。
なお、R、Z1、A、D、L1、L2、L3、L4及びL5の好ましい態様は、上記の式(1)および(2)について説明した通りである。
[ポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質(1−1)]
mが1〜3であり;
n1及びn2がそれぞれ独立して113〜568であり;
pが1または2であり;
Rが炭素数1〜3のアルキル基(例、メチル基)であり;
Zがシステインを除く中性アミノ酸からなる2〜4残基のオリゴペプチド(例、グリシン−フェニルアラニン−ロイシン−グリシン、グリシン−グリシン−フェニルアラニン−グリシン、グリシン−フェニルアラニン−グリシン、グリシン−グリシン−グリシン、バリン−シトルリン−グリシン、バリン−アラニン−グリシン、フェニルアラニン−グリシン)であり;
Qがエチレングリコールの残基またはリジンの残基であり;
Dがカルシトニン、ヒト成長ホルモンまたは顆粒球コロニー刺激因子であり;
L1、L2、L3、L4及びL5がそれぞれ独立して、単結合、アミド結合、エーテル結合、2級アミノ基、カルボニル基、またはこれらの結合および基を含んでいてもよいアルキレン基[好ましくは、それぞれ独立して、
式(1)のポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質。
mが1〜3であり;
n1及びn2がそれぞれ独立して113〜568であり;
pが1または2であり;
Rが炭素数1〜3のアルキル基(例、メチル基)であり;
Zがシステインを除く中性アミノ酸からなる2〜4残基のオリゴペプチド(例、グリシン−フェニルアラニン−ロイシン−グリシン、グリシン−グリシン−フェニルアラニン−グリシン、グリシン−フェニルアラニン−グリシン、グリシン−グリシン−グリシン、バリン−シトルリン−グリシン、バリン−アラニン−グリシン、フェニルアラニン−グリシン)であり;
Qがエチレングリコールの残基またはリジンの残基であり;
Dがカルシトニン、ヒト成長ホルモンまたは顆粒球コロニー刺激因子であり;
L1が単結合、エーテル結合またはエーテル結合を含んでいてもよいアルキレン基[好ましくは、
L2がカルボニル基またはカルボニル基を含んでいてもよいアルキレン基[好ましくは、
L3が2級アミノ基(−NH−)であり;
L4がエーテル結合を含んでいてもよいアルキレン基[好ましくは、
L5が単結合またはアミド結合を含んでいてもよいアルキレン基[好ましくは、
式(1)のポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質。
mが1〜3であり;
pが1または2であり;
n1及びn2がそれぞれ独立して113〜568であり;
Rが炭素数1〜3のアルキル基(例、メチル基)であり;
Z1がシステインを除く中性アミノ酸からなる2〜3残基のオリゴペプチド(例、グリシン−フェニルアラニン−ロイシン、グリシン−グリシン−フェニルアラニン、グリシン−フェニルアラニン、グリシン−グリシン、バリン−シトルリン、バリン−アラニン)であり;
Aがフェニルアラニンまたはロイシンであり;
a及びbがそれぞれ独立して0または1であり、かつ(a+b)≧1であり;
Qがエチレングリコールの残基またはリジンの残基であり;
Dがカルシトニン、ヒト成長ホルモンまたは顆粒球コロニー刺激因子であり;
L1、L2、L3、L4及びL5がそれぞれ独立して、単結合、アミド結合、エーテル結合、2級アミノ基、カルボニル基、またはこれらの結合および基を含んでいてもよいアルキレン基[好ましくは、それぞれ独立して、
式(2)のポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質。
mが1〜3であり;
pが1または2であり;
n1及びn2がそれぞれ独立して113〜568であり;
Rが炭素数1〜3のアルキル基(例、メチル基)であり;
Z1がシステインを除く中性アミノ酸からなる2〜3残基のオリゴペプチド(例、グリシン−フェニルアラニン−ロイシン、グリシン−グリシン−フェニルアラニン、グリシン−フェニルアラニン、グリシン−グリシン、バリン−シトルリン、バリン−アラニン)であり;
Aがフェニルアラニンまたはロイシンであり;
a及びbがそれぞれ独立して0または1であり、かつ(a+b)≧1であり;
Qがエチレングリコールの残基またはリジンの残基であり;
Dがカルシトニン、ヒト成長ホルモンまたは顆粒球コロニー刺激因子であり;
L1が単結合、エーテル結合またはエーテル結合を含んでいてもよいアルキレン基[好ましくは、
L2がカルボニル基またはカルボニル基を含んでいてもよいアルキレン基[好ましくは、
L3が2級アミノ基(−NH−)であり;
L4がエーテル結合を含んでいてもよいアルキレン基[好ましくは、
L5が単結合またはアミド結合を含んでいてもよいアルキレン基[好ましくは、
式(2)のポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質。
pが1または2であり;
n3及びn4がそれぞれ独立して340〜568であり;
Rが炭素数1〜3のアルキル基(例、メチル基)であり;
Z1がシステインを除く中性アミノ酸からなる2〜3残基のオリゴペプチド(例、グリシン−フェニルアラニン−ロイシン、グリシン−グリシン−フェニルアラニン、グリシン−フェニルアラニン、グリシン−グリシン、バリン−シトルリン、バリン−アラニン)であり;
Aがフェニルアラニンまたはロイシンであり;
a及びbがそれぞれ独立して0または1であり、かつ(a+b)≧1であり;
Qがエチレングリコールの残基またはリジンの残基であり;
Dがカルシトニン、ヒト成長ホルモンまたは顆粒球コロニー刺激因子であり;
L1、L2、L3、L4及びL5がそれぞれ独立して、単結合、アミド結合、エーテル結合、2級アミノ基、カルボニル基、またはこれらの結合および基を含んでいてもよいアルキレン基[好ましくは、それぞれ独立して、
式(3)のポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質。
pが1または2であり;
n3及びn4がそれぞれ独立して340〜568であり;
Rが炭素数1〜3のアルキル基(例、メチル基)であり;
Z1がシステインを除く中性アミノ酸からなる2〜3残基のオリゴペプチド(例、グリシン−フェニルアラニン−ロイシン、グリシン−グリシン−フェニルアラニン、グリシン−フェニルアラニン、グリシン−グリシン、バリン−シトルリン、バリン−アラニン)であり;
Aがフェニルアラニンまたはロイシンであり;
a及びbがそれぞれ独立して0または1であり、かつ(a+b)≧1であり;
Qがエチレングリコールの残基またはリジンの残基であり;
Dがカルシトニン、ヒト成長ホルモンまたは顆粒球コロニー刺激因子であり;
L1が単結合、エーテル結合またはエーテル結合を含んでいてもよいアルキレン基[好ましくは、
L2がカルボニル基またはカルボニル基を含んでいてもよいアルキレン基[好ましくは、
L3が2級アミノ基(−NH−)であり;
L4がエーテル結合を含んでいてもよいアルキレン基[好ましくは、
L5が単結合またはアミド結合を含んでいてもよいアルキレン基[好ましくは、
式(3)のポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質。
mが1〜3であり;
n5及びn6がそれぞれ独立して180〜525であり;
Rが炭素数1〜3のアルキル基(例、メチル基)であり;
Zがシステインを除く中性アミノ酸からなる2〜4残基のオリゴペプチド(例、グリシン−フェニルアラニン−ロイシン−グリシン、グリシン−グリシン−フェニルアラニン−グリシン、グリシン−フェニルアラニン−グリシン、グリシン−グリシン−グリシン、バリン−シトルリン−グリシン、バリン−アラニン−グリシン、フェニルアラニン−グリシン)であり;
Dがカルシトニン、ヒト成長ホルモンまたは顆粒球コロニー刺激因子であり;
L2、L3、L4及びL5がそれぞれ独立して、単結合、アミド結合、エーテル結合、2級アミノ基、カルボニル基、またはこれらの結合および基を含んでいてもよいアルキレン基[好ましくは、それぞれ独立して、
式(4)のポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質。
mが1〜3であり;
n5及びn6がそれぞれ独立して180〜525であり;
Rが炭素数1〜3のアルキル基(例、メチル基)であり;
Zがシステインを除く中性アミノ酸からなる2〜4残基のオリゴペプチド(例、グリシン−フェニルアラニン−ロイシン−グリシン、グリシン−グリシン−フェニルアラニン−グリシン、グリシン−フェニルアラニン−グリシン、グリシン−グリシン−グリシン、バリン−シトルリン−グリシン、バリン−アラニン−グリシン、フェニルアラニン−グリシン)であり;
Dがカルシトニン、ヒト成長ホルモンまたは顆粒球コロニー刺激因子であり;
L2がカルボニル基またはカルボニル基を含んでいてもよいアルキレン基[好ましくは、
L3が2級アミノ基(−NH−)であり;
L4がエーテル結合を含んでいてもよいアルキレン基[好ましくは、
L5が単結合またはアミド結合を含んでいてもよいアルキレン基[好ましくは、
式(4)のポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質。
mが1〜3であり;
n5及びn6がそれぞれ独立して180〜525であり;
Rが炭素数1〜3のアルキル基(例、メチル基)であり;
Z1がシステインを除く中性アミノ酸からなる2〜3残基のオリゴペプチド(例、グリシン−フェニルアラニン−ロイシン、グリシン−グリシン−フェニルアラニン、グリシン−フェニルアラニン、グリシン−グリシン、バリン−シトルリン、バリン−アラニン)であり;
Aがフェニルアラニンまたはロイシンであり;
a及びbがそれぞれ独立して0または1であり、かつ(a+b)≧1であり;
Dがカルシトニン、ヒト成長ホルモンまたは顆粒球コロニー刺激因子であり;
L2、L3、L4及びL5がそれぞれ独立して、単結合、アミド結合、エーテル結合、2級アミノ基、カルボニル基、またはこれらの結合および基を含んでいてもよいアルキレン基[好ましくは、それぞれ独立して、
式(5)のポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質。
mが1〜3であり;
n5及びn6がそれぞれ独立して180〜525であり;
Rが炭素数1〜3のアルキル基(例、メチル基)であり;
Z1がシステインを除く中性アミノ酸からなる2〜3残基のオリゴペプチド(例、グリシン−フェニルアラニン−ロイシン、グリシン−グリシン−フェニルアラニン、グリシン−フェニルアラニン、グリシン−グリシン、バリン−シトルリン、バリン−アラニン)であり;
Aがフェニルアラニンまたはロイシンであり;
a及びbがそれぞれ独立して0または1であり、かつ(a+b)≧1であり;
Dがカルシトニン、ヒト成長ホルモンまたは顆粒球コロニー刺激因子であり;
L2がカルボニル基またはカルボニル基を含んでいてもよいアルキレン基[好ましくは、
L3が2級アミノ基(−NH−)であり;
L4がエーテル結合を含んでいてもよいアルキレン基[好ましくは、
L5が単結合またはアミド結合を含んでいてもよいアルキレン基[好ましくは、
式(5)のポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質。
[ポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質(6−1)]
n7及びn8がそれぞれ独立して340〜568であり;
Rが炭素数1〜3のアルキル基(例、メチル基)であり;
Z1がシステインを除く中性アミノ酸からなる2〜3残基のオリゴペプチド(例、グリシン−フェニルアラニン−ロイシン、グリシン−グリシン−フェニルアラニン、グリシン−フェニルアラニン、グリシン−グリシン、バリン−シトルリン、バリン−アラニン)であり;
Aがフェニルアラニンまたはロイシンであり;
a及びbがそれぞれ独立して0または1であり、かつ(a+b)≧1であり;
Dがカルシトニン、ヒト成長ホルモンまたは顆粒球コロニー刺激因子であり;
L2、L3、L4及びL5がそれぞれ独立して、単結合、アミド結合、エーテル結合、2級アミノ基、カルボニル基、またはこれらの結合および基を含んでいてもよいアルキレン基[好ましくは、それぞれ独立して、
式(6)のポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質。
n7及びn8がそれぞれ独立して340〜568であり;
Rが炭素数1〜3のアルキル基(例、メチル基)であり;
Z1がシステインを除く中性アミノ酸からなる2〜3残基のオリゴペプチド(例、グリシン−フェニルアラニン−ロイシン、グリシン−グリシン−フェニルアラニン、グリシン−フェニルアラニン、グリシン−グリシン、バリン−シトルリン、バリン−アラニン)であり;
Aがフェニルアラニンまたはロイシンであり;
a及びbがそれぞれ独立して0または1であり、かつ(a+b)≧1であり;
Dがカルシトニン、ヒト成長ホルモンまたは顆粒球コロニー刺激因子であり;
L2がカルボニル基またはカルボニル基を含んでいてもよいアルキレン基[好ましくは、
L3が2級アミノ基(−NH−)であり;
L4がエーテル結合を含んでいてもよいアルキレン基[好ましくは、
L5が単結合またはアミド結合を含んでいてもよいアルキレン基[好ましくは、
式(6)のポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質。
下記の(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(j)、(k)
下記の(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)、(l)
下記の(h)、(m)、(n)、(p)
下記の(h)、(m)、(n)、(p)
下記の(h)、(m)、(o)
下記の(l)
当該分解性ポリエチレングリコール誘導体は、必要に応じて末端官能基を化学変換することができる。この官能基変換に用いられる反応は、従来公知の方法を用いることができるが、オリゴペプチドや、前記の2価のスペーサーが分解しない条件を適切に選択しなければならない。
オリゴペプチドのN末端のアミノ基の保護基は、特に制限は無いが、例えばアシル系保護基およびカーバメート系保護基が挙げられ、具体的にはトリフルオロアセチル基、9−フルオレニルメチルオキシカルボニル基およびt−ブチルオキシカルボニル基等が挙げられる。
縮合反応としては、特に制限は無いが、縮合剤を用いる反応が望ましい。縮合剤としては、ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(EDC)等のカルボジイミド系の縮合剤を単独で使用しても良く、N−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)、1−ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)、1−ヒドロキシ−7−アザベンゾトリアゾール(HOAt)等の試薬と併用しても良い。また、より反応性の高いHATUやHBTU、TATU,TBTU、COMU、DMT−MM等の縮合剤を使用しても良い。また反応を促進するため、トリエチルアミンやジメチルアミノピリジン等の塩基を用いても良い。
反応で副生した不純物、または反応で消費されず残存したオリゴペプチドや縮合剤などは、精製除去を行うのが好ましい。精製は、特に制限されないが、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、超臨界抽出等で精製することができる。
脱保護反応で副生した不純物などは、精製除去を行うのが好ましい。精製は、特に制限されないが、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、超臨界抽出等で精製することができる。
ポリエチレングリコール誘導体(7)は、片末端に保護基で保護されたアミノ基を有し、もう片末端に活性エステル基または活性カーボネート基などを有する。活性エステル基と活性カーボネート基の脱離基としては、スクシンイミジルオキシ基、フタルイミジルオキシ基、4−ニトロフェノキシ基、1−イミダゾリル基、ペンタフルオロフェノキシ基、ベンゾトリアゾール−1−イルオキシ基および7−アザベンゾトリアゾール−1−イルオキシ基などが挙げられる。また、ポリエチレングリコール誘導体(7)は、必ずしも活性化された官能基を有している必要は無く、末端にカルボキシル基を有する場合は、反応A−1と同様に、縮合剤を用いた反応を用いることができる。反応を促進するため、トリエチルアミンやジメチルアミノピリジン等の塩基を用いても良い。ポリエチレングリコール誘導体(7)の保護基は、特に制限は無いが、例えばアシル系保護基およびカーバメート系保護基が挙げられ、具体的にはトリフルオロアセチル基、9−フルオレニルメチルオキシカルボニル基およびt−ブチルオキシカルボニル基等が挙げられる。
反応で副生した不純物、または反応で消費されず残存したポリエチレングリコール誘導体などは、精製除去を行うのが好ましい。精製は、特に制限されないが、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、超臨界抽出等で精製することができる。
ポリエチレングリコール誘導体(8)の中から、分子量や官能基の異なるポリエチレングリコール不純物を除去する手法としては、特開2014−208786、特開2011−79934に記載の精製技術を用いることができる。
脱保護反応で副生した不純物などは、精製除去を行うのが好ましい。精製は、特に制限されないが、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、超臨界抽出等で精製することができる。
ポリエチレングリコール誘導体(9):2本のポリエチレングリコール鎖が1つのオリゴペプチドで繋がれた構造であるポリエチレングリコール誘導体
ポリエチレングリコール誘導体(13):3本のポリエチレングリコール鎖が2つのオリゴペプチドで繋がれた構造であるポリエチレングリコール誘導体
ポリエチレングリコール誘導体(14):4本のポリエチレングリコール鎖が3つのオリゴペプチドで繋がれた構造であるポリエチレングリコール誘導体
ポリエチレングリコール誘導体(15):5本のポリエチレングリコール鎖が4つのオリゴペプチドで繋がれた構造であるポリエチレングリコール誘導体
ポリエチレングリコール誘導体(7)に替わるポリエチレングリコール誘導体については、例えば以下の構造のものが挙げられる。
当該分解性ポリエチレングリコール誘導体は、必要に応じて末端官能基を化学変換することができる。この官能基変換に用いられる反応は、従来公知の方法を用いることができるが、オリゴペプチドや、前記の2価のスペーサーが分解しない条件を適切に選択しなければならない。
オリゴペプチドのN末端のアミノ基の保護基Pro3は、特に制限は無いが、例えばアシル系保護基およびカーバメート系保護基が挙げられ、具体的にはトリフルオロアセチル基、9−フルオレニルメチルオキシカルボニル基等が挙げられる。次にポリエチレングリコール誘導体(16)のカルボキシル基の保護基Pro2は、特に制限はないが、t−ブチル基などが挙げられる。
前記反応A−1と同条件で反応と精製が可能である。
脱保護反応で副生した不純物などは、精製除去を行うのが好ましい。精製は、特に制限されないが、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、超臨界抽出等で精製することができる。
前記反応A−1と同様に、縮合剤を用いた反応が望ましく、反応を促進するため、トリエチルアミンやジメチルアミノピリジン等の塩基を用いても良い。
反応で副生した不純物、または反応で消費されず残存したポリエチレングリコール誘導体などは、精製除去を行うのが好ましい。精製は、特に制限されないが、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、超臨界抽出等で精製することができる。
ポリエチレングリコール誘導体(21)の中から、分子量や官能基の異なるポリエチレングリコール不純物を除去する手法としては、特開2014−208786、特開2011−79934に記載の精製技術を用いることができる。
ポリエチレングリコール誘導体(20):2本のポリエチレングリコール鎖が1つのオリゴペプチドで繋がれた構造であるポリエチレングリコール誘導体
ポリエチレングリコール誘導体(22):3本のポリエチレングリコール鎖が2つのオリゴペプチドで繋がれた構造であるポリエチレングリコール誘導体
ポリエチレングリコール誘導体(23):4本のポリエチレングリコール鎖が3つのオリゴペプチドで繋がれた構造であるポリエチレングリコール誘導体
ポリエチレングリコール誘導体(24):5本のポリエチレングリコール鎖が4つのオリゴペプチドで繋がれた構造であるポリエチレングリコール誘導体
前記反応A−1と同様に、縮合剤を用いた反応が望ましく、反応を促進するため、トリエチルアミンやジメチルアミノピリジン等の塩基を用いても良い。
反応で副生した不純物、または反応で消費されず残存したポリエチレングリコール誘導体などは、精製除去を行うのが好ましい。精製は、特に制限されないが、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、超臨界抽出等で精製することができる。
ポリエチレングリコール誘導体(25)の中から、分子量や官能基の異なるポリエチレングリコール不純物を除去する手法としては、特開2014−208786、特開2011−79934に記載の精製技術を用いることができる。
分解率 = (試験前のピーク面積% − 試験後のピーク面積%) ÷ 試験前のピーク面積% × 100
例えば、安定性試験前の分解性ポリエチレングリコール誘導体のGPCメインフラクションのピーク面積%が95%であり、試験後のGPCメインフラクションのピーク面積%が90%だったとすると、分解率は以下のように算出される。
分解率 = (95−90)÷95×100 = 5.26(%)
分解性ポリエチレングリコール誘導体は、血中で分解してしまうと、目的とする血中半減期を得ることができないため、安定性試験において、96時間後の分解率は、10%以下が好ましく、5%以下がさらに好ましい。
例えば、細胞を用いた分解性試験前の分解性ポリエチレングリコール誘導体のGPCメインフラクションのピーク面積%が95%であり、試験後のGPCメインフラクションのピーク面積%が5%だったとすると、分解率は以下のように算出される。
分解率 = (95−5)÷95×100 = 94.7(%)
分解性ポリエチレングリコール誘導体は、細胞内で効率よく分解されないと、目的とする細胞の空胞を抑制できないため、分解性試験において、96時間後の分解率は、90%以上が好ましく、95%以上がさらに好ましい。
次に、生体関連物質であるタンパク質やペプチドなどのN末端のアミノ基をターゲットとする場合は、アルデヒド基を有したポリエチレングリコール誘導体が用いられる。具体的には、低pHの緩衝溶液中で、アルデヒド基を有したポリエチレングリコール誘導体と適切な還元剤を用いることで、タンパク質やペプチドのN末端のアミノ基に、選択的にポリエチレングリコール誘導体を結合させることができる。
これらポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質は、一般的な方法として知られている、透析やゲル浸透クロマトグラフィー(GPC)、イオン交換クロマトグラフィー(IEC)などで精製することができる。また、得られた生体関連物質は、一般的に、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析計(MALDI−TOF−MS)、ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)、逆相クロマトグラフィー(RPLC)などの分析方法にて評価することができる。
ポリエチレングリコール誘導体に導入した分解性ペプチドは、ポリエチレングリコールに細胞内での分解性を付与するが、そのペプチド構造によってポリエチレングリコールを結合させた生体関連物質の体内動態を変化させる可能性が考えられる。そこで、導入したペプチド構造の体内動態への影響を確認するため、血中半減期および、その体内分布について、分解性を持たない同分子量のポリエチレングリコール誘導体を修飾した生体関連物質と比較する必要がある。具体的には、放射性同位体でラベル化した生体関連物質に、分解性を持たないポリエチレングリコール誘導体と分解性ポリエチレングリコール誘導体をそれぞれ結合させ、得られた2種の生体関連物質をマウスに投与し、複数のタイムポイントで、血液、各臓器の放射線量を測定し、定量測定を行うことができる。
具体的には、ポリエチレングリコール誘導体を10〜250mg/mLの濃度になるように生理食塩水に溶解し、マウス尾静脈より週3回、4週間以上、20〜100μL投与を続け、空胞が発生しやすいといわれている器官である脳脈絡叢や脾臓などのパラフィン切片を作製して染色後、切片画像を病理学的手法により確認し、空胞抑制の評価を行うことができる。
なお、本評価においてポリエチレングリコールの投与量は、当該技術分野における一般的なポリエチレングリコールの投与量と比べ、大過剰のポリエチレングリコールを投与する必要がある。
なお、本評価においてポリエチレングリコールの投与量は、当該技術分野における一般的なポリエチレングリコールの投与量と比べ、大過剰のポリエチレングリコールを投与する必要がある。
GPC分析(分子量測定)
検出器:示差屈折計
カラム:ultrahydrogel500およびultrahydrogel250(WATERS)
移動相:100mM Acetate buffer+0.02%NaN3(pH5.2)
流速:0.5mL/min
サンプル量:5mg/mL、20μL
カラム温度:30℃
HPLC分析(アミン純度測定)
検出器:示差屈折計
カラム:TSKgel SP−5PW(東ソー)
移動相:1mM Sodium phosphate buffer(pH6.5)
流速:0.5mL/min
注入量:5mg/mL、20μL
カラム温度:40℃
化合物(p1)(ME−200GLFG(L)−200PA)の合成
NMR(CDCl3):0.89ppm(d、3H、−NH−CO−CH−CH2−CH(CH 3 )2)、0.92ppm(d、3H、−NH−CO−CH−CH2−CH(CH 3 )2)、1.36ppm(s、9H、−NH−CO−O−C(CH 3 ) 3 )、1.48ppm(m、1H、−NH−CO−CH−CH 2 −CH(CH3)2)、1.55ppm(m、1H、−NH−CO−CH−CH 2 −CH(CH3)2)、1.80ppm(m、3H)、3.13ppm(dd、1H、−NH−CO−CH−CH 2 −C6H5)、3.21ppm(dd、1H、−NH−CO−CH−CH 2 −C6H5)、3.33ppm(m、2H、−CO−NH−CH 2 −CH2−CH2−O−(CH2−CH2−O)n−CH3)、3.38ppm(s、3H、−CO−NH−CH2−CH2−CH2−O−(CH2−CH2−O)n−CH 3 )、3.65ppm(m、約2,000H、−CO−NH−CH2−CH2−CH2−O−(CH 2 −CH 2 −O)n−CH3)、3.91ppm(t、1H、−NH−CO−CH−CH2−CH(CH3)2)、4.43ppm(broad、1H)、4.55ppm(q、1H、−NH−CO−CH−CH2−C6H5)、5.77ppm(broad、1H)、6.76ppm(broad、1H)、6.86ppm(broad、1H)、6.90ppm(broad、1H)、7.14ppm(broad、1H)、7.20ppm(d、2H、−NH−CO−CH−CH2−C 6 H 5 )、7.32ppm(m、3H、−NH−CO−CH−CH2−C 6 H 5 )
NMR(CDCl3):0.89ppm(d、3H、−NH−CO−CH−CH2−CH(CH 3 )2)、0.91ppm(d、3H、−NH−CO−CH−CH2−CH(CH 3 )2)、1.53ppm(m、2H、−NH−CO−CH−CH 2 −CH(CH3)2)、1,70ppm(m、1H、−NH−CO−CH−CH2−CH(CH3)2)、1.80ppm(m、2H、−CO−NH−CH2−CH 2 −CH2−O−(CH2−CH2−O)n−CH3)、3.10ppm(dd、1H、−NH−CO−CH−CH 2 −C6H5)、3.18ppm(dd、1H、−NH−CO−CH−CH 2 −C6H5)、3.33ppm(m、7H)、3.74ppm(m、約1,900H、−CO−NH−CH2−CH2−CH2−O−(CH 2 −CH 2 −O)n−CH3)、4.31ppm(broad、1H)、4.55ppm(t、1H、−NH−CO−CH−CH2−C6H5)、6.91ppm(broad、1H)、7.00ppm(broad、1H)、7.28ppm(m、5H、−NH−CO−CH−CH2−C 6 H 5 )、7.98ppm(broad、1H)
NMR(CDCl3):0.90ppm(t、6H、−NH−CO−CH−CH2−CH(CH 3 )2)、1.44ppm(s、9H、−CH2−CH2−CH2−NH−CO−O−C(CH 3 ) 3 )、1.64ppm(m、1H)、1.76ppm(m、5H)、3.20ppm(m、4H)、3.33ppm(m、2H、−CO−NH−CH 2 −CH2−CH2−O−(CH2−CH2−O)n−CH3)、3.38ppm(s、3H、−CO−NH−CH2−CH2−CH2−O−(CH2−CH2−O)n−CH 3 )、3.64ppm(m、約3,800H、−NH−CH2−CH2−CH2−O−(CH 2 −CH 2 −O)n−CH3、−NH−CO−O−CH2−CH2−O−(CH 2 −CH 2 −O)n−CH2−CH2−)、4.10ppm(m、2H、−NH−CO−O−CH 2 −CH2−O−(CH2−CH2−O)n−CH2−CH2−)、4.32ppm(m、1H)、4.50ppm(q、1H)、5.02ppm(broad、1H)、6.45ppm(broad、1H)、6.93ppm(broad、1H)、7.06ppm(broad、1H)、7.13ppm(broad、1H)、7.27ppm(m、5H、−NH−CO−CH−CH2−C 6 H 5 )
NMR(CDCl3):0.90ppm(t、6H、−NH−CO−CH−CH2−CH(CH 3 )2)、1.48ppm(broad、1H)、1.62ppm(t、1H)、1.71ppm(m、1H)、1.82ppm(m、2H)、3.12ppm(m、2H)、3.19ppm(d、2H)、3.34ppm(m、2H)、3.38ppm(s、3H、−CO−NH−CH2−CH2−CH2−O−(CH2−CH2−O)n−CH 3 )、3.64ppm(m、約3,800H、−NH−CH2−CH2−CH2−O−(CH 2 −CH 2 −O)n−CH3、−NH−CO−O−CH2−CH2−O−(CH 2 −CH 2 −O)n−CH2−CH2−)、4.10ppm(m、2H)、4.34ppm(m、1H)、4.50ppm(q、1H)、6.46ppm(broad、1H)、6.94ppm(broad、1H)、7.08ppm(broad、1H)、7.27ppm(m、5H、−NH−CO−CH−CH2−C 6 H 5 )
化合物(p5)(ME−200GLFG(L)−200AL)の合成
NMR(CDCl3):1.20ppm(t、6H、−CH2−CH2−CH(OCH2 CH 3 )2)、1.90ppm(q、2H、−CH2−CH 2 −CH(OCH2CH3)2)、2.84ppm(s、4H、−O−CO−O−NC 4 H 4 O 2 )、3.65ppm(m、約1,900H、−O−CO−O−CH2−CH2−O−(CH 2 CH 2 O)n−CH2−)、4.46ppm(t、2H、−O−CO−O−CH 2 −CH2−O−(CH2CH2O)n−CH2−)、4.64ppm(t、1H、−CH2−CH2−CH(OCH2CH3)2)
NMR(CDCl3):0.90ppm(t、6H、−NH−CO−CH−CH2−CH(CH 3 )2)、1.20ppm(t、6H、−CH2−CH2−CH(OCH2 CH 3 )2)、1.47ppm(m、1H、−NH−CO−CH−CH 2 −CH(CH3)2)、1.61ppm(m、1H、−NH−CO−CH−CH 2 −CH(CH3)2)、1.72ppm(m、1H)、1.82ppm(m、2H)、1.90ppm(q、2H、−CH2−CH 2 −CH(OCH2CH3)2)、2.58ppm(m、1H)、3.19ppm(d、2H、−NH−CO−CH−CH 2 −C6H5)、3.33ppm(m、2H、−CO−NH−CH 2 −CH2−CH2−O−(CH2−CH2−O)n−CH3)、3.38ppm(−CO−NH−CH2−CH2−CH2−O−(CH2−CH2−O)n−CH 3 )、4.29ppm(m、1H)、4.50ppm(q、1H)、4.64ppm(t、1H、−CH2−CH2−CH(OCH2CH3)2)、6.38ppm(broad、1H)、6.89ppm(broad、1H)、6.99ppm(broad、1H)、7.10ppm(broad、1H)、7.29ppm(m、5H)
NMR(CDCl3):0.90ppm(t、6H、−NH−CO−CH−CH2−CH(CH 3 )2)、1.47ppm(m、1H、−NH−CO−CH−CH 2 −CH(CH3)2)、1.61ppm(m、1H、−NH−CO−CH−CH 2 −CH(CH3)2)、1.72ppm(m、1H)、1.84ppm(m、5H)、2.68ppm(m、2H)、3.19ppm(d、2H、−NH−CO−CH−CH 2 −C6H5)、3.33ppm(m、2H、−CO−NH−CH 2 −CH2−CH2−O−(CH2−CH2−O)n−CH3)、3.38ppm(−CO−NH−CH2−CH2−CH2−O−(CH2−CH2−O)n−CH 3 )、4.06ppm(m、1H、−NH−CO−O−CH 2 −CH2−O−(CH2CH2O)n−CH2CH2−)、4.12ppm(m、1H、−NH−CO−O−CH 2 −CH2−O−(CH2CH2O)n−CH2CH2−)、4.32ppm(m、1H)、4.51ppm(q、1H)、6.36ppm(broad、1H)、6.87ppm(broad、1H)、6.99ppm(broad、2H)、7.14ppm(broad、1H)、7.29ppm(m、5H)、9.80ppm(s、1H、−CH2CH2−CHO)
化合物(p8)(ME−100GLFG(L)−100GLFG(L)−100GLFG(L)−100PA)の合成
NMR(CDCl3):0.90ppm(t、6H、−NH−CO−CH−CH2−CH(CH 3 )2)、1.48ppm(broad、1H)、1.62ppm(t、1H)、1.71ppm(m、1H)、1.82ppm(m、2H)、3.12ppm(m、2H)、3.19ppm(d、2H)、3.34ppm(m、2H)、3.38ppm(s、3H、−CO−NH−CH2−CH2−CH2−O−(CH2−CH2−O)n−CH 3 )、3.64ppm(m、約1,800H、−NH−CH2−CH2−CH2−O−(CH 2 −CH 2 −O)n−CH3、−NH−CO−O−CH2−CH2−O−(CH 2 −CH 2 −O)n−CH2−CH2−)、4.10ppm(m、2H)、4.34ppm(m、1H)、4.50ppm(q、1H)、6.46ppm(broad、1H)、6.94ppm(broad、1H)、7.08ppm(broad、1H)、7.27ppm(m、5H、−NH−CO−CH−CH2−C 6 H 5 )
NMR(CDCl3):0.90ppm(t、12H、−NH−CO−CH−CH2−CH(CH 3 )2)、1.44ppm(s、9H、−CH2−CH2−CH2−NH−CO−O−C(CH 3 ) 3 )、1.64ppm(m、2H)、1.76ppm(m、5H)、3.20ppm(m、4H)、3.33ppm(m、4H、−CO−NH−CH 2 −CH2−CH2−O−(CH2−CH2−O)n−)、3.38ppm(s、3H、−O−(CH2−CH2−O)n−CH 3 )、3.64ppm(m、約1,800H、−O−(CH 2 −CH 2 −O)n−CH3、−NH−CO−O−CH2−CH2−O−(CH 2 −CH 2 −O)n−CH2−CH2−)、4.10ppm(m、2H、−NH−CO−O−CH 2 −CH2−O−(CH2−CH2−O)n−CH2−CH2−)、4.32ppm(m、2H)、4.50ppm(q、2H)、5.02ppm(broad、2H)、6.45ppm(broad、2H)、6.93ppm(broad、2H)、7.06ppm(broad、2H)、7.13ppm(broad、2H)、7.27ppm(m、10H、−NH−CO−CH−CH2−C 6 H 5 )
NMR(CDCl3):0.89ppm(d、6H、−NH−CO−CH−CH2−CH(CH 3 )2)、0.91ppm(d、6H、−NH−CO−CH−CH2−CH(CH 3 )2)、1.53ppm(m、4H、−NH−CO−CH−CH 2 −CH(CH3)2)、1,70ppm(m、2H、−NH−CO−CH−CH2−CH(CH3)2)、1.80ppm(m、4H、−CO−NH−CH2−CH 2 −CH2−O−(CH2−CH2−O)n−)、3.10ppm(dd、2H、−NH−CO−CH−CH 2 −C6H5)、3.18ppm(dd、2H、−NH−CO−CH−CH 2 −C6H5)、3.33ppm(m、14H)、3.74ppm(m、約1,800H、−CO−NH−CH2−CH2−CH2−O−(CH 2 −CH 2 −O)n−)、4.31ppm(broad、2H)、4.55ppm(t、2H、−NH−CO−CH−CH2−C6H5)、6.91ppm(broad、2H)、7.00ppm(broad、2H)、7.28ppm(m、10H、−NH−CO−CH−CH2−C 6 H 5 )、7.98ppm(broad、2H)
NMR(CDCl3):0.90ppm(t、12H、−NH−CO−CH−CH2−CH(CH 3 )2)、1.44ppm(s、9H、−CH2−CH2−CH2−NH−CO−O−C(CH 3 ) 3 )、1.64ppm(m、2H)、1.76ppm(m、10H)、3.20ppm(m、8H)、3.33ppm(m、6H、−CO−NH−CH 2 −CH2−CH2−O−(CH2−CH2−O)n−)、3.38ppm(s、3H、−(CH2−CH2−O)n−CH 3 )、3.64ppm(m、約2,700H、−NH−CH2−CH2−CH2−O−(CH 2 −CH 2 −O)n−CH3、−NH−CO−O−CH2−CH2−O−(CH 2 −CH 2 −O)n−CH2−CH2−)、4.10ppm(m、4H、−NH−CO−O−CH 2 −CH2−O−(CH2−CH2−O)n−CH2−CH2−)、4.32ppm(m、2H)、4.50ppm(q、2H)、5.02ppm(broad、2H)、6.45ppm(broad、2H)、6.93ppm(broad、2H)、7.06ppm(broad、2H)、7.13ppm(broad、2H)、7.27ppm(m、10H、−NH−CO−CH−CH2−C 6 H 5 )
NMR(CDCl3):0.90ppm(t、12H、−NH−CO−CH−CH2−CH(CH 3 )2)、1.48ppm(broad、2H)、1.62ppm(t、2H)、1.71ppm(m、2H)、1.82ppm(m、4H)、3.12ppm(m、4H)、3.19ppm(d、4H)、3.34ppm(m、4H)、3.38ppm(s、3H、−O−(CH2−CH2−O)n−CH 3 )、3.64ppm(m、約2,700H、−NH−CH2−CH2−CH2−O−(CH 2 −CH 2 −O)n−CH3、−NH−CO−O−CH2−CH2−O−(CH 2 −CH 2 −O)n−CH2−CH2−)、4.10ppm(m、4H)、4.34ppm(m、2H)、4.50ppm(q、2H)、6.46ppm(broad、2H)、6.94ppm(broad、2H)、7.08ppm(broad、2H)、7.27ppm(m、10H、−NH−CO−CH−CH2−C 6 H 5 )
化合物(p14)(ME−200G(Cit)V−200PA)の合成
NMR(d6−DMSO):0.84ppm(d、3H、−NH−CO−CH−CH(CH 3 )2)、0.85ppm(d、3H、−NH−CO−CH−CH(CH 3 )2)、1.37ppm(m、2H)、1.52ppm(m、1H)、1.63ppm(m、3H)、1.98ppm(m、1H、−O−CO−NH−CH−CH(CH3)2)、2.93ppm(m、4H)、3.09ppm(m、2H、−NH−CH−CH2−CH2−CH 2 −NH−CO−NH2)、3.24ppm(s、3H、−NH−CH2−CH2−CH2−O−(CH2−CH2−O)n−CH 3 )、3.48ppm(m、約1,900H、−NH−CH2−CH2−CH2−O−(CH 2 −CH 2 −O)n−CH3)、3.89ppm(m、2H)、4.25ppm(m、3H、−NH−CO−O−CH 2 −CH<)、5.35ppm(broad、2H、−NH−CH−CH2−CH2−CH2−NH−CO−NH 2 )、5.91ppm(broad、1H)、7.33ppm(t、2H、Ar)、7.41ppm(m、3H、Ar)、7.73ppm(m、3H、Ar)、7.89ppm(d、2H、Ar)、8.10ppm(d、1H)、8.20ppm(broad、1H)
NMR(d6−DMSO):0.77ppm(d、3H、−NH−CO−CH−CH(CH 3 )2)、0.87ppm(d、3H、−NH−CO−CH−CH(CH 3 )2)、1.35ppm(m、2H)、1.51ppm(m、1H)、1.64ppm(m、4H)、1.93ppm(m、1H、−O−CO−NH−CH−CH(CH3)2)、2.96ppm(m、4H)、3.10ppm(m、2H、−NH−CH−CH2−CH2−CH 2 −NH−CO−NH2)、3.24ppm(s、3H、−NH−CH2−CH2−CH2−O−(CH2−CH2−O)n−CH 3 、)、3.48ppm(m、約1,900H、−NH−CH2−CH2−CH2−O−(CH 2 −CH 2 −O)n−CH3)、4.21ppm(broad、1H)、5.34ppm(broad、2H、−NH−CH−CH2−CH2−CH2−NH−CO−NH 2 )、5.91ppm(broad、1H)、7.73ppm(t、1H)、8.08ppm(broad、1H)、8.23ppm(t、1H)
NMR(CDCl3):0.96ppm(d、3H、−NH−CO−CH−CH(CH 3 )2)、1.01ppm(d、3H、−NH−CO−CH−CH(CH 3 )2)、1.44ppm(s、9H、−CH2−CH2−CH2−NH−CO−O−C(CH 3 ) 3 )、1.59ppm(m、2H)、1.76ppm(m、3H)、1.82ppm(q、2H)、1.92ppm(m、1H)、3.09ppm(m、1H)、3.23ppm(m、2H、−NH−CH−CH2−CH2−CH 2 −NH−CO−NH2)、3.38ppm(s、3H、−NH−CH2−CH2−CH2−O−(CH2−CH2−O)n−CH 3 )、3.64ppm(m、約3,800H、−NH−CH2−CH2−CH2−O−(CH 2 −CH 2 −O)n−CH3、−NH−CO−O−CH2−CH2−O−(CH 2 −CH 2 −O)n−CH2−CH2−)、4.07ppm(dd、1H)、4.15ppm(m、2H)、4.31ppm(m、1H)、4.38ppm(m、1H)、5.02ppm(broad、1H)、5.24ppm(broad、2H、−NH−CH−CH2−CH2−CH2−NH−CO−NH 2 )、5.74ppm(broad、1H)、5.81ppm(d、1H)、7.05ppm(broad、1H)、7.46ppm(broad、1H)、8.30ppm(broad、1H)
NMR(CDCl3):0.96ppm(d、3H、−NH−CO−CH−CH(CH 3 )2)、1.01ppm(d、3H、−NH−CO−CH−CH(CH 3 )2)、1.60ppm(m、2H)、1.75ppm(m、3H)、1.82ppm(m、2H)、1.93ppm(m、1H)、2.23ppm(m、1H)、2.82ppm(t、2H、−CH2−CH2−CH2−NH 2 )、3.10ppm(m、1H)、3.30ppm(m、2H)、3.38ppm(m、4H)、3.64ppm(m、約3,800H、−NH−CH2−CH2−CH2−O−(CH 2 −CH 2 −O)n−CH3、−NH−CO−O−CH2−CH2−O−(CH 2 −CH 2 −O)n−CH2−CH2−)、3.95ppm(m、1H)、4.07ppm(dd、1H)、4.15ppm(m、1H)、4.31ppm(m、1H)、4.38ppm(m、1H)、5.24ppm(broad、2H、−NH−CH−CH2−CH2−CH2−NH−CO−NH 2 )、5.79ppm(broad、1H)、5.82ppm(broad、1H)、7.06ppm(broad、1H)、7.48ppm(broad、1H)、8.31ppm(broad、1H)
化合物(p18)(ME−200G(Cit)V−200MA)の合成
NMR(CDCl3):0.96ppm(d、3H、−NH−CO−CH−CH(CH 3 )2)、1.01ppm(d、3H、−NH−CO−CH−CH(CH 3 )2)、1.59ppm(broad、2H)、1.76ppm(m、5H)、2.46ppm(t、2H、−CH2−CH2−CH 2 −NH−CO−CH2−CH2−C4NO2H2)、3.12ppm(m、1H)、3.34ppm(m、5H)、3.64ppm(m、約3,800H、−NH−CH2−CH2−CH2−O−(CH 2 −CH 2 −O)n−CH3、−NH−CO−O−CH2−CH2−O−(CH 2 −CH 2 −O)n−CH2−CH2−)、4.02ppm(m、1H)、4.13ppm(m、1H)、4.28ppm(m、1H)、4.37ppm(m、1H)、5.86ppm(broad、1H)、6.42ppm(broad、1H)、6.68ppm(s、2H、−CH2−CH2−CH2−NH−CO−CH2−CH2−C 4 NO 2 H 2 )、7.04ppm(broad、1H)、7.46ppm(broad、1H)、8.20ppm(broad、1H)
化合物(p19)(ME−200GGG−200PA)の合成
NMR(D2O):1.45ppm(s、9H、−NH−CO−O−C(CH 3 ) 3 )、3.78ppm(s、2H、−CH 2 −NH−CO−O−C(CH3)3)、3.84ppm(s、2H、−CO−NH−CH 2 −COOH)、4.00ppm(s、2H、−CO−NH−CH 2 −CO−NH−)
NMR(CDCl3):1.45ppm(s、9H、−NH−CO−O−C(CH 3 ) 3 )、1.80ppm(m、2H、−CO−NH−CH2−CH 2 −CH2−O−(CH2−CH2−O)n−CH3)、3.38ppm(m、5H)、3.64ppm(m、約1,900H、−CO−NH−CH2−CH2−CH2−O−(CH 2 −CH 2 −O)n−CH3)、3.86ppm(d、2H、−CH 2 −NH−CO−O−C(CH3)3)、3.91ppm(d、2H)、3.99ppm(d、2H)、5.69ppm(broad、1H)、7.10ppm(broad、1H)、7.44ppm(broad、2H)
NMR(CDCl3):1.53ppm(broad、1H)、1.79ppm(m、2H、−CO−NH−CH2−CH 2 −CH2−O−(CH2−CH2−O)n−CH3)、3.38ppm(m、5H)、3.64ppm(m、約1,900H、−CO−NH−CH2−CH2−CH2−O−(CH 2 −CH 2 −O)n−CH3)、3.92ppm(d、2H)、4.01ppm(broad、1H)、7.06ppm(broad、1H)、7.24ppm(broad、1H)、7.86ppm(broad、1H)
NMR(CDCl3):1.44ppm(s、9H、−CH2−CH2−CH2−NH−CO−O−C(CH 3 ) 3 )、1.78ppm(m、4H、−CO−NH−CH2−CH 2 −CH2−O−(CH2−CH2−O)n−CH3、−CH2−CH 2 −CH2−NH−CO−O−C(CH3)3)、3.23ppm(m、2H、−CH2−CH2−CH 2 −NH−CO−O−C(CH3)3)、3.35ppm(m、2H)、3.38ppm(s、3H、−CO−NH−CH2−CH2−CH2−O−(CH2−CH2−O)n−CH 3 )、3.65ppm(m、約3,800H、−NH−CH2−CH2−CH2−O−(CH 2 −CH 2 −O)n−CH3、−NH−CO−O−CH2−CH2−O−(CH 2 −CH 2 −O)n−CH2−CH2−)、3.97ppm(d、2H)、4.23ppm(broad、2H、−NH−CO−O−CH 2 −CH2−O−(CH2−CH2−O)n−CH2−CH2−)、5.01ppm(broad、1H)、6.21ppm(broad、1H)、7.00ppm(broad、1H)、7.47ppm(broad、1H)、7.61ppm(broad、1H)
NMR(CDCl3):1.79ppm(m、4H、−CO−NH−CH2−CH 2 −CH2−O−(CH2−CH2−O)n−CH3、−CH2−CH 2 −CH2−NH2)、2.91ppm(broad、2H)、3.37ppm(m、5H)、3.65ppm(m、約3,800H、−NH−CH2−CH2−CH2−O−(CH 2 −CH 2 −O)n−CH3、−NH−CO−O−CH2−CH2−O−(CH 2 −CH 2 −O)n−CH2−CH2−)、3.90ppm(t、3H)、3.97ppm(d、2H)、4.23ppm(broad、2H、−NH−CO−O−CH 2 −CH2−O−(CH2−CH2−O)n−CH2−CH2−)、6.19ppm(broad、1H)、7.00ppm(broad、1H)、7.45ppm(broad、1H)、7.61ppm(broad、1H)
化合物(p24)(ME−200GF−200PA)の合成
NMR(d6−DMSO):1.62ppm(m、2H、−CO−NH−CH2−CH 2 −CH2−O−(CH2−CH2−O)n−CH3)、2.80ppm(m、1H、−NH−CO−CH−CH 2 −C6H5)、3.04ppm(m、1H、−NH−CO−CH−CH 2 −C6H5)、3.10ppm(m、2H、−CO−NH−CH 2 −CH2−CH2−O−(CH2−CH2−O)n−CH3)、3.24ppm(s、3H、−CO−NH−CH2−CH2−CH2−O−(CH2−CH2−O)n−CH 3 )、3.48ppm(m、約1,900H、−CO−NH−CH2−CH2−CH2−O−(CH 2 −CH 2 −O)n−CH3)、4.20ppm(m、4H)、7.33ppm(m、9H)、7.66ppm(m、4H、Ar)、7.88ppm(d、2H、Ar)、8.27ppm(t、1H)
NMR(d6−DMSO):1.62ppm(m、2H、−CO−NH−CH2−CH 2 −CH2−O−(CH2−CH2−O)n−CH3)、1.64ppm(broad、1H)、2.59ppm(dd、1H、−NH−CO−CH−CH 2 −C6H5)、2.98ppm(dd、1H、−NH−CO−CH−CH 2 −C6H5)、3.10ppm(q、2H、−CO−NH−CH 2 −CH2−CH2−O−(CH2−CH2−O)n−CH3)、3.24ppm(s、3H、−CO−NH−CH2−CH2−CH2−O−(CH2−CH2−O)n−CH 3 )、3.48ppm(m、約1,900H、−CO−NH−CH2−CH2−CH2−O−(CH 2 −CH 2 −O)n−CH3)、7.24ppm(m、6H、−NH−CO−CH−CH2−C 6 H 5 、−NH−)、7.73ppm(t、1H)、8.12ppm(broad、1H)
NMR(CDCl3):1.44ppm(s、9H、−CH2−CH2−CH2−NH−CO−O−C(CH 3 ) 3 )、1.77ppm(m、4H、−CO−NH−CH2−CH 2 −CH2−O−(CH2−CH2−O)n−CH3、−CH2−CH 2 −CH2−NH−CO−O−C(CH3)3)、3.02ppm(m、1H)、3.21ppm(m、3H)、3.36ppm(m、4H)、3.65ppm(m、約3,800H、−NH−CH2−CH2−CH2−O−(CH 2 −CH 2 −O)n−CH3、−NH−CO−O−CH2−CH2−O−(CH 2 −CH 2 −O)n−CH2−CH2−)、4.18ppm(m、2H、−NH−CO−O−CH 2 −CH2−O−(CH2−CH2−O)n−CH2−CH2−)、4.39ppm(q、1H、−NH−CO−CH−CH2−C6H5)、5.03ppm(broad、1H)、5.55ppm(d、1H)、6.86ppm(broad、1H)、7.02ppm(broad、1H)、7.25ppm(m、5H、−NH−CO−CH−CH2−C 6 H 5 )
NMR(CDCl3):1.77ppm(m、4H、−CO−NH−CH2−CH 2 −CH2−O−(CH2−CH2−O)n−CH3、−CH2−CH 2 −CH2−NH2)、2.87ppm(m、2H)、3.07ppm(m、1H)、3.30ppm(m、3H)、3.38ppm(s、3H、−NH−CH2−CH2−CH2−O−(CH2−CH2−O)n−CH 3 )、3.64ppm(m、約3,800H、−NH−CH2−CH2−CH2−O−(CH 2 −CH 2 −O)n−CH3、−NH−CO−O−CH2−CH2−O−(CH 2 −CH 2 −O)n−CH2−CH2−)、4.18ppm(m、2H、−NH−CO−O−CH 2 −CH2−O−(CH2−CH2−O)n−CH2−CH2−)、4.32ppm(q、1H、−NH−CO−CH−CH2−C6H5)、5.56ppm(broad、1H)、6.83ppm(broad、1H)、6.96ppm(broad、1H)、7.25ppm(m、5H、−NH−CO−CH−CH2−C 6 H 5 )
化合物(p28)(ME−200GAV−200PA)の合成
NMR(d6−DMSO):0.82ppm(dd、6H、−NH−CO−CH−CH2−CH(CH 3 )2)、1.21ppm(d、3H、−NH−CO−CH(CH3)−)、1.62ppm(m、4H、−CO−NH−CH2−CH 2 −CH2−O−(CH2−CH2−O)n−CH3、−CH2−CH 2 −CH2−NH2)、1.95ppm(m、1H)、3.10ppm(m、2H)、3.23ppm(s、3H、−O−(CH2−CH2−O)n−CH 3 )、3.60ppm(m、約3,800H、−NH−CH2−CH2−CH2−O−(CH 2 −CH 2 −O)n−CH3、−NH−CO−O−CH2−CH2−O−(CH 2 −CH 2 −O)n−CH2−CH2−)、4.05ppm(m、2H)、4.22ppm(m、1H)、7.24ppm(broad、1H)、7.69ppm(broad、1H)、8.10ppm(broad、2H)
化合物(p29)(ME−200GFGG−200PA)の合成
NMR(d6−DMSO):1.62ppm(m、4H、−CO−NH−CH2−CH 2 −CH2−O−(CH2−CH2−O)n−CH3、−CH2−CH 2 −CH2−NH2)、2.80ppm(m、1H)、3.10ppm(m、2H)、3.23ppm(s、3H、−O−(CH2−CH2−O)n−CH 3 )、3.60ppm(m、約3,800H、−NH−CH2−CH2−CH2−O−(CH 2 −CH 2 −O)n−CH3、−NH−CO−O−CH2−CH2−O−(CH 2 −CH 2 −O)n−CH2−CH2−)、4.05ppm(m、2H)、4.47ppm(m、1H)、7.20ppm(m、5H、−NH−CO−CH−CH2−C 6 H 5 )、7.43ppm(broad、1H)、7.62ppm(broad、1H)、8.00ppm(broad、1H)、8.12ppm(broad、1H)、8.24ppm(broad、1H)
化合物(p30)(ME−200GFG−200PA)の合成
NMR(d6−DMSO):1.62ppm(m、4H、−CO−NH−CH2−CH 2 −CH2−O−(CH2−CH2−O)n−CH3、−CH2−CH 2 −CH2−NH2)、2.80ppm(m、1H)、3.10ppm(m、2H)、3.23ppm(s、3H、−O−(CH2−CH2−O)n−CH 3 )、3.60ppm(m、約3,800H、−NH−CH2−CH2−CH2−O−(CH 2 −CH 2 −O)n−CH3、−NH−CO−O−CH2−CH2−O−(CH 2 −CH 2 −O)n−CH2−CH2−)、4.05ppm(m、2H)、4.47ppm(m、1H)、7.20ppm(m、5H、−NH−CO−CH−CH2−C 6 H 5 )、7.34ppm(broad、1H)、7.64ppm(broad、1H)、8.10ppm(broad、1H)、8.30ppm(broad、1H)
化合物(p31)(ME−200GF−200PA(amide))の合成
NMR(d6−DMSO):1.11ppm(m、2H、−NH−CO−CH2−CH2−CH 2 −CH2−CH2−O−(CH2−CH2−O)n−)、1.38ppm(m、2H、−NH−CO−CH2−CH 2 −CH2−CH2−CH2−O−(CH2−CH2−O)n−)、1.62ppm(m、6H、−NH−CO−CH2−CH2−CH2−CH 2 −CH2−O−(CH2−CH2−O)n−、−CO−NH−CH2−CH 2 −CH2−O−(CH2−CH2−O)n−CH3、−CH2−CH 2 −CH2−NH2)、2.02ppm(m、2H、−NH−CO−CH 2 −CH2−CH2−CH2−CH2−O−(CH2−CH2−O)n−)、2.80ppm(m、1H)、3.10ppm(m、2H)、3.23ppm(s、3H、−O−(CH2−CH2−O)n−CH 3 )、3.60ppm(m、約3,800H、−NH−CH2−CH2−CH2−O−(CH 2 −CH 2 −O)n−CH3、−NH−CO−O−CH2−CH2−O−(CH 2 −CH 2 −O)n−CH2−CH2−)、4.47ppm(m、1H)、7.20ppm(m、5H、−NH−CO−CH−CH2−C 6 H 5 )、7.26ppm(broad、1H)、7.64ppm(broad、1H)、8.10ppm(broad、1H)、8.30ppm(broad、1H)
化合物(p32)(ME−200GLFG(D)−200PA)の合成
NMR(CDCl3):0.90ppm(t、6H、−NH−CO−CH−CH2−CH(CH 3 )2)、1.48ppm(broad、1H)、1.62ppm(t、1H)、1.71ppm(m、1H)、1.82ppm(m、2H)、3.12ppm(m、2H)、3.19ppm(d、2H)、3.34ppm(m、2H)、3.38ppm(s、3H、−CO−NH−CH2−CH2−CH2−O−(CH2−CH2−O)n−CH 3 )、3.64ppm(m、約3,800H、−NH−CH2−CH2−CH2−O−(CH 2 −CH 2 −O)n−CH3、−NH−CO−O−CH2−CH2−O−(CH 2 −CH 2 −O)n−CH2−CH2−)、4.10ppm(m、2H)、4.34ppm(m、1H)、4.50ppm(q、1H)、6.46ppm(broad、1H)、6.94ppm(broad、1H)、7.08ppm(broad、1H)、7.27ppm(m、5H、−NH−CO−CH−CH2−C 6 H 5 )
化合物(p34)(LY−(ME−100GLFG(L)−100) 2 −PA)の合成
NMR(CDCl3):0.89ppm(d、3H、−NH−CO−CH−CH2−CH(CH 3 )2)、0.92ppm(d、3H、−NH−CO−CH−CH2−CH(CH 3 )2)、1.36ppm(s、9H、−NH−CO−O−C(CH 3 ) 3 )1.48ppm(m、1H、−NH−CO−CH−CH 2 −CH(CH3)2)、1.55ppm(m、1H、−NH−CO−CH−CH 2 −CH(CH3)2)、1.80ppm(m、3H)、3.13ppm(dd、1H、−NH−CO−CH−CH 2 −C6H5)、3.21ppm(dd、1H、−NH−CO−CH−CH 2 −C6H5)、3.33ppm(m、2H、−CO−NH−CH 2 −CH2−CH2−O−(CH2−CH2−O)n−CH3)、3.38ppm(s、3H、−CO−NH−CH2−CH2−CH2−O−(CH2−CH2−O)n−CH 3 )、3.65ppm(m、約820H、−CO−NH−CH2−CH2−CH2−O−(CH 2 −CH 2 −O)n−CH3)、3.91ppm(t、1H、−NH−CO−CH−CH2−CH(CH3)2)、4.43ppm(broad、1H)、4.55ppm(q、1H、−NH−CO−CH−CH2−C6H5)、5.77ppm(broad、1H)、6.76ppm(broad、1H)、6.86ppm(broad、1H)、6.90ppm(broad、1H)、7.14ppm(broad、1H)、7.20ppm(d、2H、−NH−CO−CH−CH2−C 6 H 5 )、7.32ppm(m、3H、−NH−CO−CH−CH2−C 6 H 5 )
NMR(CDCl3):0.89ppm(d、3H、−NH−CO−CH−CH2−CH(CH 3 )2)、0.91ppm(d、3H、−NH−CO−CH−CH2−CH(CH 3 )2)、1.53ppm(m、2H、−NH−CO−CH−CH 2 −CH(CH3)2)、1,70ppm(m、1H、−NH−CO−CH−CH2−CH(CH3)2)、1.80ppm(m、2H、−CO−NH−CH2−CH 2 −CH2−O−(CH2−CH2−O)n−CH3)、3.10ppm(dd、1H、−NH−CO−CH−CH 2 −C6H5)、3.18ppm(dd、1H、−NH−CO−CH−CH 2 −C6H5)、3.33ppm(m、7H)、3.74ppm(m、約820H、−CO−NH−CH2−CH2−CH2−O−(CH 2 −CH 2 −O)n−CH3)、4.31ppm(broad、1H)、4.55ppm(t、1H、−NH−CO−CH−CH2−C6H5)、6.91ppm(broad、1H)、7.00ppm(broad、1H)、7.28ppm(m、5H、−NH−CO−CH−CH2−C 6 H 5 )、7.98ppm(broad、1H)
NMR(CDCl3):1.52ppm(m、2H、-tetrahydropyranyl)、1.59ppm(m、2H、-tetrahydropyranyl)、1.73ppm(m、1H、-tetrahydropyranyl)、1.85ppm(m、1H、-tetrahydropyranyl)、2.85ppm(t、4H、-succinimide)、3.64ppm(m、約820H、−NH−CH2−CH2−CH2−O−(CH 2 −CH 2 −O)n−CH3、−NH−CO−O−CH2−CH2−O−(CH 2 −CH 2 −O)n−CH2−CH2−)、3.80ppm(m、2H)、3.88ppm(m、2H、-tetrahydropyranyl)、4.47ppm(m、2H)、4.64ppm(t、1H、-tetrahydropyranyl)
NMR(CDCl3):0.90ppm(t、6H、−NH−CO−CH−CH2−CH(CH 3 )2)、1.48ppm(broad、1H)、1.62ppm(t、1H)、1.71ppm(m、1H)、1.82ppm(m、2H)、3.19ppm(d、2H)、3.34ppm(m、2H)、3.38ppm(s、3H、−CO−NH−CH2−CH2−CH2−O−(CH2−CH2−O)n−CH 3 )、3.64ppm(m、約820H、−NH−CH2−CH2−CH2−O−(CH 2 −CH 2 −O)n−CH3、−NH−CO−O−CH2−CH2−O−(CH 2 −CH 2 −O)n−CH2−CH2−)、4.10ppm(m、2H)、4.34ppm(m、1H)、4.50ppm(q、1H)、6.46ppm(broad、1H)、6.94ppm(broad、1H)、7.08ppm(broad、1H)、7.27ppm(m、5H、−NH−CO−CH−CH2−C 6 H 5 )
NMR(CDCl3):0.90ppm(t、6H、−NH−CO−CH−CH2−CH(CH 3 )2)、1.44ppm(s、9H、−CH2−CH2−CH2−NH−CO−O−C(CH 3 ) 3 )、1.64ppm(m、1H)、1.76ppm(m、5H)、2.85ppm(t、4H、-succinimide)、3.20ppm(m、4H)、3.33ppm(m、2H、−CO−NH−CH 2 −CH2−CH2−O−(CH2−CH2−O)n−CH3)、3.38ppm(s、3H、−CO−NH−CH2−CH2−CH2−O−(CH2−CH2−O)n−CH 3 )、3.64ppm(m、約820H、−NH−CH2−CH2−CH2−O−(CH 2 −CH 2 −O)n−CH3、−NH−CO−O−CH2−CH2−O−(CH 2 −CH 2 −O)n−CH2−CH2−)、4.10ppm(m、2H、−NH−CO−O−CH 2 −CH2−O−(CH2−CH2−O)n−CH2−CH2−)、4.32ppm(m、1H)、4.50ppm(q、1H)、5.02ppm(broad、1H)、6.45ppm(broad、1H)、6.93ppm(broad、1H)、7.06ppm(broad、1H)、7.13ppm(broad、1H)、7.27ppm(m、5H、−NH−CO−CH−CH2−C 6 H 5 )
NMR(CDCl3):0.90ppm(t、6H、−NH−CO−CH−CH2−CH(CH 3 )2)、1.28ppm(t、3H、−CO−O−CH2−CH 3 )、1.36ppm(m、2H)、1.48ppm(broad、1H)、1.52ppm(m、2H)、1.62ppm(t、1H)、1.70ppm(m、2H)、1.82ppm(m、3H)、3.15ppm(q、2H)、3.19ppm(d、2H)、3.34ppm(m、2H)、3.38ppm(s、6H、−CO−NH−CH2−CH2−CH2−O−(CH2−CH2−O)n−CH 3 )、3.64ppm(m、約1,600H、−NH−CH2−CH2−CH2−O−(CH 2 −CH 2 −O)n−CH3、−NH−CO−O−CH2−CH2−O−(CH 2 −CH 2 −O)n−CH2−CH2−)、4.10ppm(m、2H)、4.21ppm(m、6H)、4.34ppm(m、2H)、4.50ppm(q、1H)、4.90ppm(broad、1H)、5.37ppm(d、1H)、6.46ppm(broad、1H)、6.94ppm(broad、1H)、7.08ppm(broad、1H)、7.27ppm(m、5H、−NH−CO−CH−CH2−C 6 H 5 )
NMR(CDCl3):0.90ppm(t、6H、−NH−CO−CH−CH2−CH(CH 3 )2)、1.36ppm(m、2H)、1.48ppm(broad、1H)、1.52ppm(m、2H)、1.62ppm(t、1H)、1.70ppm(m、2H)、1.82ppm(m、3H)、3.15ppm(m、2H)、3.19ppm(d、2H)、3.34ppm(m、2H)、3.38ppm(s、6H、−CO−NH−CH2−CH2−CH2−O−(CH2−CH2−O)n−CH 3 )、3.64ppm(m、約1,600H、−NH−CH2−CH2−CH2−O−(CH 2 −CH 2 −O)n−CH3、−NH−CO−O−CH2−CH2−O−(CH 2 −CH 2 −O)n−CH2−CH2−)、4.10ppm(m、2H)、4.21ppm(m、4H)、4.34ppm(m、2H)、4.50ppm(q、1H)、4.90ppm(broad、1H)、5.37ppm(d、1H)、6.46ppm(broad、1H)、6.94ppm(broad、1H)、7.08ppm(broad、1H)、7.27ppm(m、5H、−NH−CO−CH−CH2−C 6 H 5 )
NMR(CDCl3):0.90ppm(t、6H、−NH−CO−CH−CH2−CH(CH 3 )2)、1.36ppm(m、2H)、1.44ppm(s、9H)、1.48ppm(broad、1H)、1.52ppm(m、2H)、1.62ppm(m、3H)、1.70ppm(m、2H)、1.82ppm(m、3H)、3.15ppm(m、4H)、3.19ppm(d、2H)、3.29ppm(m、2H)、3.34ppm(m、2H)、3.38ppm(s、6H、−CO−NH−CH2−CH2−CH2−O−(CH2−CH2−O)n−CH 3 )、3.64ppm(m、約1,600H、−NH−CH2−CH2−CH2−O−(CH 2 −CH 2 −O)n−CH3、−NH−CO−O−CH2−CH2−O−(CH 2 −CH 2 −O)n−CH2−CH2−)、4.10ppm(m、3H)、4.21ppm(m、4H)、4.34ppm(m、1H)、4.50ppm(q、1H)、5.08ppm(broad、1H)、5.56ppm(d、1H)、6.46ppm(broad、1H)、6.94ppm(broad、1H)、7.08ppm(broad、1H)、7.27ppm(m、5H、−NH−CO−CH−CH2−C 6 H 5 )
NMR(CDCl3):0.90ppm(t、6H、−NH−CO−CH−CH2−CH(CH 3 )2)、1.37ppm(m、2H)、1.48ppm(broad、1H)、1.52ppm(m、2H)、1.62ppm(m、3H)、1.70ppm(m、2H)、1.82ppm(m、3H)、2.84ppm(m、2H)、3.15ppm(m、2H)、3.19ppm(d、2H)、3.34ppm(m、2H)、3.38ppm(s、6H、−CO−NH−CH2−CH2−CH2−O−(CH2−CH2−O)n−CH 3 )、3.64ppm(m、約1,600H、−NH−CH2−CH2−CH2−O−(CH 2 −CH 2 −O)n−CH3、−NH−CO−O−CH2−CH2−O−(CH 2 −CH 2 −O)n−CH2−CH2−)、4.10ppm(m、3H)、4.21ppm(m、4H)、4.34ppm(m、1H)、4.50ppm(q、1H)、5.58ppm(broad、1H)、6.46ppm(broad、1H)、6.94ppm(broad、1H)、7.08ppm(broad、1H)、7.27ppm(m、5H、−NH−CO−CH−CH2−C 6 H 5 )
化合物(p33)(ME−200F−200PA)の合成
NMR(d6−DMSO):1.62ppm(m、4H、−CO−NH−CH2−CH 2 −CH2−O−(CH2−CH2−O)n−CH3、−CH2−CH 2 −CH2−NH2)、2.80ppm(m、1H)、3.10ppm(m、2H)、3.23ppm(s、3H、−O−(CH2−CH2−O)n−CH 3 )、3.60ppm(m、約3,800H、−NH−CH2−CH2−CH2−O−(CH 2 −CH 2 −O)n−CH3、−NH−CO−O−CH2−CH2−O−(CH 2 −CH 2 −O)n−CH2−CH2−)、3.95ppm(m、2H)、4.13ppm(m、1H)、7.20ppm(m、5H、−NH−CO−CH−CH2−C 6 H 5 )、7.38ppm(broad、1H)、7.91ppm(broad、1H)
血清中での安定性試験
1.5mLのエッペンドルフチューブに、マウスまたはヒト血清1mLを加え、各種ポリエチレングリコール誘導体を5.0mg/mLの濃度になるように添加した。37℃で96時間インキュベーション後、200μLをサンプリングし、そこにアセトニトリルを添加し、ボルテックスにて1分間撹拌し、血清中のたんぱく質を析出させ、遠心分離後、上清を回収した。次に脂肪酸等の疎水性物質を除去するため、回収液にヘキサンを添加し、ボルテックスにて1分間撹拌し、遠心分離後、下層を回収した。この溶液を真空条件にて濃縮し、血清中からポリエチレングリコール誘導体の回収を行った。その後、GPC分析を行い、分解性ポリエチレングリコール誘導体の分解率を算出した。
分解率は以下の式にて算出した。
分解率 = (試験前の40kDaのピーク面積% − 試験後の40kDaのピーク面積%) ÷ (試験前の40kDaのピーク面積%) × 100
結果を以下の表2に示す。
細胞を用いた分解性試験
培地RPMI−1640(10%FBS Pn/St)10mLを用いて、100mmディッシュにRAW264.7を10×106cell播種し、37℃で24時間培養後、各種ポリエチレングリコール誘導体を10mg/mLの濃度になるよう溶解した培地に交換し、37℃で96時間培養した。培養後、細胞を1%SDS溶液にて溶解し、PBSにて希釈し、そこにアセトニトリルを添加し、ボルテックスにて1分間撹拌し、細胞溶解液中のたんぱく質を析出させ、遠心分離後、上清を回収した。次に脂肪酸等の疎水性物質を除去するため、回収液にヘキサンを添加し、ボルテックスにて1分間撹拌し、遠心分離後、下層を回収した。この溶液を真空条件にて濃縮し、細胞内からポリエチレングリコール誘導体の回収を行った。
また、細胞培養に使用した培地中での分解を確認するため、各種ポリエチレングリコール誘導体を10mg/mLの濃度になるよう溶解した培地のみで37℃で96時間培養し、上記と同操作にてポリエチレングリコール誘導体の回収を行った。
その後、回収した各種ポリエチレングリコール誘導体のGPC分析を行い、実施例14と同じ計算式にて分解性ポリエチレングリコール誘導体の分解率を算出した。
結果を以下の表3に示す。また、細胞実験の前後のGPCチャートを図1と図2に示す。
サーモンカルシトニン(sCT)のPEG化
アミノ酸配列:
CSNLSTCVLG KLSQELHKLQ TYPRTNTGSG TP(配列番号:1)
であるサーモンカルシトニン(sCT)(5mg、1.5×10−6モル、株式会社ピーエイチジャパン製)を100mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.0)に溶解し、実施例2で得られたME−200GLFG(L)−200ALまたはメトキシPEGアルデヒド40kDa(180mg、4.5×10−6モル)、および還元剤である2−ピコリルボラン(2.0×10−5モル)を加え、sCT濃度を1.0mg/mLに調整し、4℃にて24時間反応させた。その後、反応液を10mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.0)を用いて透析し、HiTrap SP HP(5mL、GEヘルスケア製)を用いたイオン交換クロマトグラフィーにて精製し、ME−200GLFG(L)−200−sCTまたはメトキシPEG40kDa−sCTを得た。モル収率44%。
装置:WATERS社製「ALLIANCE」
検出器:UV(280nm)
カラム:Inertsil WP300 C18(GLサイエンス)
移動相A:0.05%TFA−H2O
移動相B:0.05%TFA−ACN
グラジエント:B30%(0min)→B40%(5min)→B50%(15min)→B100%(16min)→B100%(20min)
流速:1.0mL/min
カラム温度:40℃
上記RPLC分析条件にて、PEG化sCTの純度を算出した。結果を図3に示す。
ME−200GLFG(L)−200−sCTのRPLC純度 99%
メトキシPEG40kDa−sCTのRPLC純度 99%
装置:Bruker社製「autoflex3」
サンプル:0.5mg/mL、PBS溶液
マトリクス:α−シアノ−4−ヒドロキシケイ皮酸(CHCA)飽和溶液(0.01%TFA−H2O:ACN=2:1)
サンプル(1μL)とマトリクス(19μL)を混合し、1μLをターゲットにスポット
上記MALDI−TOF−MS分析条件にて、原料のPEGおよびPEG化sCTの分子量を測定した。
図4には、原料であるME−200GLFG(L)−200ALと、ME−200GLFG(L)−200−sCTのMALDI−TOF−MSの結果を合わせて示す。
ME−200GLFG(L)−200−sCTの分子量46,289
ME−200GLFG(L)−200ALの分子量43,210
図5には、原料であるメトキシPEGアルデヒド40kDaと、メトキシPEG40kDa−sCTのMALDI−TOF−MSの結果を合わせて示す。
メトキシPEG40kDa−sCTの分子量46,427
メトキシPEGアルデヒド40kDaの分子量43,303
PEG化sCTの分子量は、原料のPEG誘導体の分子量に比べ、おおよそsCTの分子量の分だけ増加していることが確認できた。
キット:Thermo Fisher Scientific社製 NuPAGE(登録商標) Bis−Tris Precast Gel(ゲル濃度4−12%)
染色液:クマシーブリリアントブルー溶液(CBB溶液)またはヨウ素染色溶液(BaCl2+I2溶液)
上記SDS−PAGEキットの推奨測定条件に従い、PEG化sCTの評価を行った。結果を図6に示す。PEG化sCTにおいては、タンパク質やペプチドを選択的に染色させるCBB染色でバンドがみられ、さらに、ポリエチレングリコールを染色させるヨウ素染色においてもバンドが見られた。両方の染色でバンドがみられ、ポリエチレングリコール誘導体がsCTに結合していることを確認した。
ヒト成長ホルモン(hGH)のPEG化
アミノ酸配列:
MFPTIPLSRL FDNAMLRAHR LHQLAFDTYQ EFEEAYIPKE QKYSFLQNPQ TSLCFSESIP TPSNREETQQ KSNLELLRIS LLLIQSWLEP VQFLRSVFAN SLVYGASDSN VYDLLKDLEE GIQTLMGRLE DGSPRTGQIF KQTYSKFDTN SHNDDALLKN YGLLYCFRKD MDKVETFLRI VQCRSVEGSC GF(配列番号:2)
であるヒト成長ホルモン(hGH)(4mg、1.8×10−7モル、Shenandoah Biotechnology社製)を100mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.5)に溶解し、実施例2で得られたME−200GLFG(L)−200ALまたはメトキシPEGアルデヒド40kDa(36mg、9.0×10−7モル)、および還元剤であるシアノ水素化ホウ素ナトリウム(9.0×10−6モル)を加え、hGH濃度を1.0mg/mLに調整し、25℃にて24時間反応させた。その後、反応液を10mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH4.7)を用いて透析し、HiTrap SP HP(5mL、GEヘルスケア製)を用いたイオン交換クロマトグラフィーにて精製し、ME−200GLFG(L)−200−hGHまたはメトキシPEG40kDa−hGHを得た。モル収率30%。
装置:WATERS社製「ALLIANCE」
検出器:UV(280nm)
カラム:Inertsil WP300 C18(GLサイエンス)
移動相A:0.05%TFA−H2O
移動相B:0.05%TFA−ACN
グラジエント:B40%(0min)→B80%(25min)→B90%(27min)→B40%(27.1min)
流速:1.0mL/min
カラム温度:40℃
上記RPLC分析条件にて、PEG化hGHの純度を算出した。
ME−200GLFG(L)−200−hGHのRPLC純度 90%
メトキシPEG40kDa−hGHのRPLC純度 97%
装置:Bruker社製「autoflex3」
サンプル:0.5mg/mL、PBS溶液
マトリクス:ケイ皮酸(SA)飽和溶液(0.01%TFA−H2O:ACN=2:1)
サンプル(1μL)とマトリクス(19μL)を混合し、1μLをターゲットにスポット
上記MALDI−TOF−MS分析条件にて、PEG化hGHの分子量を測定した。結果を図7と図8に示す。
ME−200GLFG(L)−200−hGHの分子量65,153
メトキシPEG40kDa−hGHの分子量65,263
PEG化hGHの分子量は、原料のPEG誘導体(図4と図5参照)の分子量に比べ、おおよそhGHの分子量の分だけ増加していることが確認できた。
キット:Thermo Fisher Scientific社製 NuPAGE(登録商標) Bis−Tris Precast Gel(ゲル濃度4−12%)
染色液:クマシーブリリアントブルー溶液(CBB溶液)またはヨウ素染色溶液(BaCl2+I2溶液)
上記SDS−PAGEキットの推奨測定条件に従い、PEG化hGHの評価を行った。結果を図9に示す。PEG化hGHにおいては、タンパク質やペプチドを選択的に染色させるCBB染色でバンドがみられ、さらに、ポリエチレングリコールを染色させるヨウ素染色においてもバンドが見られた。両方の染色でバンドがみられ、ポリエチレングリコール誘導体がhGHに結合していることを確認した。
顆粒球コロニー刺激因子(GCSF)のPEG化
アミノ酸配列:
TPLGPASSLP QSFLLKCLEQ VRKIQGDGAA LQEKLCATYK LCHPEELVLL GHSLGIPWAP LSSCPSQALQ LAGCLSQLHS GLFLYQGLLQ ALEGISPELG PTLDTLQLDV ADFATTIWQQ MEELGMAPAL QPTQGAMPAF ASAFQRRAGG VLVASHLQSF LEVSYRVLRH LAQP(配列番号:3)
である顆粒球コロニー刺激因子(GCSF)(100μg、5.3×10−9モル、PeproTech社製)を10mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH4.6、5%ソルビトール含有)に溶解し、実施例2で得られたME−200GLFG(L)−200ALおよび還元剤であるシアノ水素化ホウ素ナトリウム(5.3×10−7モル)を加え、GCSF濃度を2.0mg/mLに調整し、4℃にて24時間反応させた。その後、反応液を10mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH4.6)を用いて希釈し、HiTrap SP HP(5mL、GEヘルスケア製)を用いたイオン交換クロマトグラフィーにて精製し、ME−200GLFG(L)−200−GCSFを得た。モル収率64%。
装置:WATERS社製「ALLIANCE」
検出器:UV(280nm)
カラム:Inertsil WP300 C18(GLサイエンス)
移動相A:0.1%TFA−H2O
移動相B:0.1%TFA−ACN
グラジエント:B40%(0min)→B70%(25min)→B90%(27min)→B40%(29min)
流速:1.0mL/min
カラム温度:40℃
上記RPLC分析条件にて、PEG化GCSFの純度を算出した。
ME−200GLFG(L)−200−GCSFのRPLC純度 97%
装置:Bruker社製「autoflex3」
サンプル:0.5mg/mL、PBS溶液
マトリクス:ケイ皮酸(SA)飽和溶液(0.01%TFA−H2O:ACN=2:1)
サンプル(1μL)とマトリクス(19μL)を混合し、1μLをターゲットにスポット
上記MALDI−TOF−MS分析条件にて、PEG化GCSFの分子量を測定した。ME−200GLFG(L)−200−GCSFの分子量62,266PEG化GCSFの分子量は、原料のPEG誘導体の分子量に比べ、おおよそGCSFの分子量の分だけ増加していることが確認できた。
キット:Thermo Fisher Scientific社製 NuPAGE(登録商標) Bis−Tris Precast Gel(ゲル濃度4−12%)
染色液:クマシーブリリアントブルー溶液(CBB溶液)またはヨウ素染色溶液(BaCl2+I2溶液)
上記SDS−PAGEキットの推奨測定条件に従い、PEG化GCSFの評価を行った。PEG化GCSFにおいては、タンパク質やペプチドを選択的に染色させるCBB染色でバンドがみられ、さらに、ポリエチレングリコールを染色させるヨウ素染色においてもバンドが見られた。両方の染色でバンドがみられ、ポリエチレングリコール誘導体がGCSFに結合していることを確認した。
PEG化サーモンカルシトニン(sCT)の生理活性評価
実施例16で得られた、分子量4万の分解性ポリエチレングリコール誘導体が結合したsCTであるME−200GLFG(L)−200−sCTと、非分解性であるメトキシPEG40kDaが結合したメトキシPEG40kDa−sCT、未修飾のsCT、および生理食塩水の4群にて、これらの生理活性を動物実験にて比較評価した。マウス種はBalb/c(8週齢、雄)、sCT溶液およびPEG化sCT溶液は、生理食塩水を用いてsCT濃度として0.5mg/mLになるようにそれぞれ調製し、sCTの投与量として40μg/kgとなるように投与した。1、3、6、24時間でマウスから微量の血液を採取し、カルシウムE−テストワコー(和光純薬工業株式会社製)を用いてカルシウム濃度を測定した。その結果を図10に示す。
生理食塩水(PBS)の群と比べ、すべてのsCTは有意にカルシウム濃度を低下させた。投与後6時間において、未修飾のsCTではカルシウム濃度の上昇がみられたが、ME−200GLFG(L)−200−sCTと、メトキシPEG40kDa−sCTにおいては、継続して低いカルシウム濃度を維持することが分った。PEG化によってsCTの血中半減期が長くなり、生理活性が延長されたことが示された。
動物実験による体内動態試験(放射性同位体)
実施例16で得られた、分子量4万の分解性ポリエチレングリコール誘導体が結合したsCTであるME−200GLFG(L)−200−sCTと、非分解性であるメトキシPEG40kDaが結合したメトキシPEG40kDa−sCTを、それぞれ0.1mg/mLの濃度になるように50mM炭酸水素ナトリウム水溶液に溶解し、そこにBolton−Hunter試薬(0.4625MBq)を添加し、ボルテックスにて撹拌後、室温で一晩反応させた。反応溶液をPD−10カラムにて分画し、各フラクションをポリエチレングリコール呈色試薬(チオシアン酸アンモニウムと硝酸コバルト)とガンマカウンターを用いて、125Iの含まれるフラクションを確認し、回収した。
得られた放射性同位体をラベル化した2種のPEG化sCTと、同様にラベル化したsCTを用いて、体内動態を動物実験にて評価した。マウス種はBalb/c(8週齢、雄)、PEG化sCT溶液は、生理食塩水を用いてそれぞれラベル化していないPEG化sCTを50mg/mLの濃度になるように調製し、放射性同位体をラベル化したPEG化sCTを微量添加し、マウス尾静脈より20μL投与した。その後、1、3、6、48時間でマウスから血液、各臓器(肝臓、腎臓、脾臓、肺、脳、心臓、胃、すい臓、腸、睾丸、甲状腺など)を取り出し、ガンマカウンターを用いてラベル化したPEG化sCTの滞留量を測定した。
放射性同位体をラベル化した、分解性ポリエチレングリコール誘導体が結合したsCTであるME−200GLFG(L)−200−sCTと非分解性であるメトキシPEG40kDaが結合したsCTであるメトキシPEG40kDa−sCTの体内動態試験の結果として、図11に血中濃度、図12〜15に代表的な臓器として肝臓、腎臓、脾臓、肺への滞留量を示す。
この結果より、ME−200GLFG(L)−200−sCTは、通常の分解性を有さないメトキシPEG40kDa−sCTと比較して、同程度の血中半減期を示し、また体内における分布も同じ傾向であることを証明できた。
動物実験による空胞形成評価試験
実施例1で得られた、末端にアミノ基を有した分子量4万である分解性ポリエチレングリコール誘導体であるME−200GLFG(L)−200PAと、非分解性であるメトキシPEGアミン40kDaを用いて、動物実験による空砲形成評価を行った。マウス種はBalb/c(8週齢、雄)、ポリエチレングリコール溶液は、生理食塩水を用いてポリエチレングリコール誘導体を100mg/mLの濃度になるように調製し、マウス尾静脈より20μL投与した。週3回、4週間連続投与を続け、投与終了後、マウスを4%パラホルムアルデヒド水溶液で灌流固定し、パラフィン切片を作製した。HE染色、および抗PEG抗体による免疫染色を行い、脳の脈絡叢上皮細胞における空胞形成を評価した。免疫染色としては、免疫染色キット(BOND Refine Polymer Detection Kit、ライカ社製)と抗PEG抗体(B-47抗体、アブカム社製)を用いて実施した。抗PEG抗体による免疫染色を行った脳の脈絡叢切片の画像を図16と図17に示す。
その結果、メトキシPEGアミン40kDaに比べ、分解性ポリエチレングリコールであるME−200GLFG(L)−200PAは有意に空胞の形成を抑制した。
なお、本実施例において投与したポリエチレングリコールの量は、あくまで空胞化を評価するために最適化した量であり、当該技術分野における一般的なポリエチレングリコールの投与量と比べ、極めて多量である。
動物実験によるポリエチレングリコールの蓄積性評価試験
末端にアミノ基を有した分子量4万である分解性ポリエチレングリコール誘導体であるME−200GLFG(L)−200PAと、非分解性であるメトキシPEGアミン20kDa、メトキシPEGアミン40kDa、コントロールであるPBSを用いて、動物実験によるポリエチレングリコールの蓄積性評価を行った。マウス種はBalb/c(8週齢、雄)、ポリエチレングリコール溶液は、生理食塩水を用いてポリエチレングリコール誘導体を62.5mg/mLの濃度になるように調製し、マウス尾静脈より100μL投与した。週3回、4週間連続投与を続け、投与終了後、マウスを4%パラホルムアルデヒド水溶液で灌流固定し、パラフィン切片を作製した。抗PEG抗体による免疫染色を行い、脳の脈絡叢上皮細胞における蓄積性を評価した。免疫染色を行ったそれぞれの脳の脈絡叢切片の画像を図18に示す。
ポリエチレングリコールが含まれないPBSを投与したマウスの脈絡叢切片では染色されないのに対し、非分解性であるメトキシPEGアミン40kDaでは、切片の広範囲で茶色に染色される結果となった。この染色部分はPEGが蓄積していることを示す。その一方で、分解性ポリエチレングリコールであるME−200GLFG(L)−200PAの切片においては、茶色に染色された部分が少なく、分子量が半分のメトキシPEGアミン20kDaと同等の蓄積を示した。結果として、分解性ポリエチレングリコールはその分解性により、同分子量の非分解性であるメトキシPEGアミン40kDaに比べ、有意に組織へのポリエチレングリコールの蓄積を抑制した。
これらの蓄積を定量化するため、以下の解析ソフトを用いて画像解析を行い、スコアを算出した。
装置:All in one microscopy BZ−X710
解析ソフト:BZ−X Analyzer
具体的には、画像中の脈絡叢組織の面積、そして蓄積を示す茶色の染色部分の面積を解析ソフトで抽出し、以下の計算式にてスコアリングを実施した。算出したスコアを表4に示す。
蓄積率 = 茶色の染色部分の面積 / 脈絡叢組織の面積
スコア = 蓄積率 / PBSの蓄積率
その結果、分解性ポリエチレングリコールは有意に組織へのポリエチレングリコールの蓄積を抑制できることが示された。
なお、本実施例において投与したポリエチレングリコールの量は、あくまで蓄積性を評価するために最適化した量であり、当該技術分野における一般的なポリエチレングリコールの投与量と比べ、極めて多量である。
Claims (16)
- 下式(A):
(式中、mは1〜7であり、n1及びn2はそれぞれ独立して45〜682であり、pは1〜4であり、Rは炭素数1〜4のアルキル基であり、Zはシステインを除く中性アミノ酸からなる2〜8残基のオリゴペプチドであり、Qは2〜5個の活性水素を持つ化合物の残基であり、Dは生体関連物質であり、L1、L2、L3、L4及びL5はそれぞれ独立して、単結合または2価のスペーサーであり、yは1〜40である。)
で示される分解性ポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質。 - 下式(1):
(式中、mは1〜7であり、n1及びn2はそれぞれ独立して45〜682であり、pは1〜4であり、Rは炭素数1〜4のアルキル基であり、Zはシステインを除く中性アミノ酸からなる2〜8残基のオリゴペプチドであり、Qは2〜5個の活性水素を持つ化合物の残基であり、Dは生体関連物質であり、L1、L2、L3、L4及びL5はそれぞれ独立して、単結合または2価のスペーサーである。)
で示される分解性ポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質である、請求項1記載の生体関連物質。 - Qが、エチレングリコール、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリセリン、ペンタエリスリトール、ジグリセリンまたはキシリトールの残基である請求項1または2記載の生体関連物質。
- Qが、オリゴペプチドの残基であり、該オリゴペプチドが、リジン、アスパラギン酸およびグルタミン酸のいずれか1つを含み、かつそれ以外のアミノ酸がシステインを除く中性アミノ酸からなる4〜8残基のオリゴペプチドである請求項1または2記載の生体関連物質。
- Qのオリゴペプチドが、C末端のアミノ酸としてグリシンを有するオリゴペプチドである請求項4記載の生体関連物質。
- Qのオリゴペプチドが、ハイドロパシー指標が2.5以上である疎水性の中性アミノ酸を少なくとも1つ有するオリゴペプチドである請求項4または5記載の生体関連物質。
- Zのオリゴペプチドが、C末端のアミノ酸としてグリシンを有するオリゴペプチドである請求項1〜6のいずれか1項記載の生体関連物質。
- Zのオリゴペプチドが、ハイドロパシー指標が2.5以上である疎水性の中性アミノ酸を少なくとも1つ有するオリゴペプチドである請求項1〜7のいずれか1項記載の生体関連物質。
- Dに結合した分解性ポリエチレングリコール誘導体1分子の分子量が30,000以上である請求項1〜8のいずれか1項記載の生体関連物質。
- L1、L2、L3、L4及びL5がそれぞれ独立して、単結合、フェニレン基、ウレタン結合、アミド結合、エーテル結合、チオエーテル結合、2級アミノ基、カルボニル基、ウレア結合、トリアジン基、マレイミドとチオールの結合、オキシム結合、またはこれらの結合および基を含んでいてもよいアルキレン基である請求項1〜9のいずれか1項記載の生体関連物質。
- Dの生体関連物質が、ホルモン、サイトカイン、抗体、アプタマーまたは酵素である、請求項1〜10のいずれか1項記載の生体関連物質。
- 式(1)中のZが、Z1、Aおよびグリシン残基で構成される、下式(2):
(式中、mは1〜7であり、n1及びn2はそれぞれ独立して45〜682であり、pは1〜4であり、Rは炭素数1〜4のアルキル基であり、Z1はシステインを除く中性アミノ酸からなる2〜6残基のオリゴペプチドであり、Aはシステインを除く中性アミノ酸であり、a及びbはそれぞれ独立して0または1であり、かつ(a+b)≧1であり、Qは2〜5個の活性水素を持つ化合物の残基であり、Dは生体関連物質であり、L1、L2、L3、L4及びL5はそれぞれ独立して、単結合または2価のスペーサーである。)
で示される分解性ポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質である、請求項2記載の生体関連物質。 - 式(2)中のmが1である、下式(3):
(式中、n3及びn4はそれぞれ独立して45〜682であり、pは1〜4であり、Rは炭素数1〜4のアルキル基であり、Z1はシステインを除く中性アミノ酸からなる2〜6残基のオリゴペプチドであり、Aはシステインを除く中性アミノ酸であり、a及びbはそれぞれ独立して0または1であり、かつ(a+b)≧1であり、Qは2〜5個の活性水素を持つ化合物の残基であり、Dは生体関連物質であり、L1、L2、L3、L4及びL5はそれぞれ独立して、単結合または2価のスペーサーである。)
で示される分解性ポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質である、請求項12記載の生体関連物質。 - 式(1)中のQがエチレングリコールの残基であり、L1がCH2CH2Oであり、かつpが1である、下式(4):
(式中、mは1〜7であり、n5及びn6はそれぞれ独立して113〜682であり、Rは炭素数1〜4のアルキル基であり、Zはシステインを除く中性アミノ酸からなる2〜8残基のオリゴペプチドであり、Dは生体関連物質であり、L2、L3、L4及びL5はそれぞれ独立して、単結合または2価のスペーサーである。)
で示される分解性ポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質である、請求項2記載の生体関連物質。 - 式(2)中のQがエチレングリコールの残基であり、L1がCH2CH2Oであり、かつpが1である、下式(5):
(式中、mは1〜7であり、n5及びn6はそれぞれ独立して113〜682であり、Rは炭素数1〜4のアルキル基であり、Z1はシステインを除く中性アミノ酸からなる2〜6残基のオリゴペプチドであり、Aはシステインを除く中性アミノ酸であり、a及びbはそれぞれ独立して0または1であり、かつ(a+b)≧1であり、Dは生体関連物質であり、L2、L3、L4及びL5はそれぞれ独立して、単結合または2価のスペーサーである。)
で示される分解性ポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質である、請求項12記載の生体関連物質。 - 式(3)中のQがエチレングリコールの残基であり、L1がCH2CH2Oであり、かつpが1である、下式(6):
(式中、n7及びn8はそれぞれ独立して226〜682であり、Rは炭素数1〜4のアルキル基であり、Z1はシステインを除く中性アミノ酸からなる2〜6残基のオリゴペプチドであり、Aはシステインを除く中性アミノ酸であり、a及びbはそれぞれ独立して0または1であり、かつ(a+b)≧1であり、Dは生体関連物質であり、L2、L3、L4及びL5はそれぞれ独立して、単結合または2価のスペーサーである。)
で示される分解性ポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質である、請求項13記載の生体関連物質。
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