WO2006064131A1 - Production d’acides dicarboxyliques par des souches mutantes ameliorees de yarrowia lipolytica - Google Patents

Production d’acides dicarboxyliques par des souches mutantes ameliorees de yarrowia lipolytica Download PDF

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    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/44—Polycarboxylic acids

Definitions

  • the invention relates to a process for the production of dicarboxylic acids by fermentation using a mutant strain of Yarrowia lipolytica yeast from a bioconversion substrate.
  • the dicarboxylic acids also called “diacids”
  • dicarboxylic acids are used as raw materials for example in the synthesis of polyamides and polyesters, lubricating oils, plasticizers or perfumes.
  • DGA ⁇ acyl-CoA: diacylglycerol acyltransferase
  • TGL ⁇ triacylglycerol lipase
  • G3P glycerol-3-phosphate dehydrogenase
  • SCP2 putative sterol transporter
  • LR0 ⁇ ⁇ LR0 lecithin cholesterol acyltransferase
  • IFP 621 unknown function
  • IPF 905 unknown function
  • IPF 2569 NADH-ubiquinone reductase subunit
  • Yarrowia lipolytica is very different from that of Candida tropicalis. Unlike Candida tropicalis, which is a diploid yeast, Yarrowia lipolytica is indeed a haploid species. In this last microorganism, the gene deletion operations are therefore much more efficient and safer, because of the presence of a single set of chromosomes.
  • a promoter of the POX2 gene encoding Pacyl-CoA oxidase is used to overexpress genes such as, for example, those encoding cytochrome P450 monooxygenase and for NADPH-cytochrome reductase.
  • the pPOX2 promoter has the property of being a strong promoter inducible by the bioconversion substrates.
  • the overexpression of a gene of interest is achieved by the addition of a single gene copy under the control of the pPOX2 promoter, making it possible to obtain Yarrowia lipolytica mutants which are efficient, stable and non-reverting, unlike the Candida tropicalis mutants obtained by a multicopy amplification system.
  • Another advantage of Yarrowia lipolytica on Candida tropicalis for the production of diacids from esters of fatty acids or natural oils, for example vegetable oils, is the following: the transformation of natural oils into diacids by Candida tropicalis requires hydrolysis at least partial chemical substrate before the implementation of fermentation (see US Patent 5,962,285).
  • This hydrolysis is carried out by a saponification conducted in the presence of calcium hydroxide or magnesium. It produces the corresponding salts of fatty acids (soaps).
  • Yarrowia lipolytica has the ability to assimilate triglycerides as a carbon source.
  • the first step of this catabolism involves the hydrolysis of triglycerides to free fatty acids and glycerol by the lipolytic enzymes (lipases), identified by Peters and Nelson in 1951. An extracellular lipase activity and two membrane lipases of 39 and 44 kDa (Barth et al.
  • the strains used in the process of the invention are derived from the wild strain Yarrowia lipolytica W29 (ATCC 20460, listed under CLIB89 in the Biotechnology Yeast-CLIB Collection).
  • new mutant strains derived from the strain Yarrowia lipolytica ATCC 20460 can be used via the strain PoId [auxotrophic strain for leucine (leu-) and uracil (ura-)], described in the review by G. Barth et al. . It is listed under CLIB139 in the CLIB.
  • the mutant strain chosen is cultured in a medium consisting essentially of an energetic substrate which comprises at least one carbon source and one nitrogen source until the end of the growth.
  • the bioconversion substrate alkane or mixture of alkanes, fatty acid or mixture of fatty acids, fatty acid ester or mixture of fatty acid esters or natural oil or mixture of these different substrates
  • the culture medium may comprise a supply of secondary energy substrate generally consisting of at least one polyhydroxy compound, such as, for example, glycerol or a sugar.
  • POX genes of the wild-type strain whose sequences are different from those of Candida tropicalis are cloned.
  • Disruption cassettes of the genes coding for the isozymes of acyl-CoA oxidase are then constructed.
  • the genes of acyl-CoA oxidase are disrupted using the selectable marker URA3.
  • Promoter and terminator regions are amplified by a first PCR, using specific oligonucleotide pairs, eliminating the full frame of the open reading frame
  • a second PCR is then performed with the external primers and PCR products of the promoters and terminators, which fuse via a common 20 bp extension with a site for the restriction enzyme I-SceI.
  • the PCR product is cloned to give a series of plasmids (designated pPOX-PT) containing the promoter-terminator module
  • a URA3 gene is introduced into the I-SceI site of the POX-PT cassette.
  • a series of pPOX-PUT plasmids containing the promoter-URA3 ⁇ terminator module is constructed (disruption cassette 1). These constructs are called pPOX1-P ⁇ JT, pPOX2-POT, pPOX3-PUT, pPOX4-PDT and pPOX5-P ⁇ JT for the plasmids containing the disruption cassette 1, on the one hand, and pPOX1-PT, pPOX2-PT , pPOX3-P1, pPOX4-PT, and pPOX & PT for the plasmids containing the disruption cassette 2, on the other hand.
  • the transformation of Yarrowia lipolytica can be carried out by various methods.
  • the presence of disruption is verified by PCR according to the technique of Gussow et al. : Direct Clone Characterization of Plates and Colonies by Polymerase Chain Reaction. Nucleic Acids Res. 17, 1989, 4000, then confirmed by Southern blot hybridization.
  • Disruption of a gene and excision of the marker can still be done by a method involving recombination or recombinase.
  • markers can be used with either a repeat sequence (allowing the recombination that is selected) or a lox sequence that is recognized by the Cre recombinase. Excision occurs when one expresses Recombinase Cre, Fickers et al., 2003 New Disruption Cassettes for Rapid Disease Gene and Marker Rescue in the Yeast Yarrowia lipolytica. J. Microbiol. Methods 55/3: 727-737.
  • strain MTLY74 Leu + Ura- was constructed.
  • the first step is the construction of the auxotrophic MTLY40 strain for uracil (Leu +, Ura-) by conversion of the URA3 marker by the ura3-41 marker by transforming the PCR fragment containing this marker and selecting the Ura- in the presence of 5FOA.
  • Loss of the plasmid pRRQ2 is performed by cultivation on YPD rich medium and isolating a clone (Leu-, Ura-, Hy 9 -).
  • 2b From mutant MTLY66, a mutant strain Yarrowia lipolytica MTLY74 Leu + Ura- was constructed which overexpresses NADPH-cytochrome reductase, expressing it under the control of the strong pPOX2 promoter, induced by bioconversion substrates, of the fatty acid type, fatty acid ester or natural oil.
  • MTLY80 expressing NADPH-cytochrome reductase and cytochrome P450 monooxygenase ALK2 under the control of the pPOX2 promoter inducible by fatty acids, fatty acid esters or natural oils
  • mutant Yarrowia lipolytica strain MTLY80 was constructed which overexpresses the genes encoding NADPH-cytochrome reductase [CPR] and cytochrome P450 monooxygenase (ALK2) under bioconversion conditions, under the control of the strong pPOX2 promoter. induced by bioconversion substrates of the fatty acid, fatty acid ester or natural oil type.
  • CPR NADPH-cytochrome reductase
  • ALK2 cytochrome P450 monooxygenase
  • the ALK2 gene coding for cytochrome P450 monooxygenase was introduced into a vector containing the URA3 selection gene, for example JMP61, under the control of the pPOX2 promoter that is inducible by fatty acids, fatty acid esters or natural oils.
  • the marker-promoter-gene cassette (URA3-pPOX2-> AKL2) is introduced by transformation.
  • MTLY81 expressing NADPH-cytochrome reductase without the cytochrome P450 monooxygenase genes (ALK1 or ALK2) under the control of the pPOX2 promoter inducible by fatty acids, fatty acid esters or natural oils
  • a mutant Yarrowia lipolytica strain MTLY81 was constructed which overexpressed the gene coding for NADPH-cytochrome reductase (CPR) under the control of the strong pPOX2 promoter induced by fatty acid type bioconversion substrates, ester of fatty acid or natural oil.
  • CPR NADPH-cytochrome reductase
  • Mutant MTLY74 prototroph was made by transformation with plasmid JMP61 carrying the marker URA3.
  • the MTLY37 strain or the MTLY66 strain 1) constructing a PCR ("Polymerase Chain Reaction") disruption cassette or by cloning, using a counter-selectable marker, for example the URA3 marker (with which one can select for the Ura + phenotype or for the Ura-phenotype). ), or by using a marker with either a repeat sequence (allowing the recombination that is selected) or a lox sequence that is recognized by the Cre recombinase
  • the strains are selected with the gene of interest deleted (transformation and selection of the transformants, advantageously Ura + if the marker is URA3) and the disruption of the gene is verified; 3) the strains are selected with the deleted marker (transformation and selection of the transformants); advantageously 5FOA R if the marker is URA3 or advantageously a plasmid expressing the recombinase if the marker has the lox sequence and the disruption of the gene is verified.
  • strain FT120 Leu-Ura-, ⁇ pox1-6 was constructed.
  • mutant strain MTLY95 ⁇ pox1-6 was constructed by insertion of deletion of the POX1 and POX6 genes and deletion of the marker according to the method described previously.
  • mutant strain Yarrowia lipolytica FT101 Leu + Ura- which overexpresses the gene coding for NADPH-cytochrome reductase (CPR) under bioconversion conditions was constructed, expressing it under the control of the strong pPOX2 promoter, induced by bioconversion substrates, fatty acid type, fatty acid ester or natural oil.
  • strain FT120 To obtain this strain, one can proceed as for the construction of strain FT120:
  • the strains are selected with the deleted marker (transformation and selection of the transformants); advantageously 5FOA R if the marker is URA3 or advantageously a plasmid expressing the Cre recombinase if the marker has the lox sequence and the disruption of the gene is verified.
  • strain FT130 Leu-Ura-, ⁇ pox1-6, ⁇ dgai was constructed.
  • the MTLY66, MTLY81, FT120 and FT 130 strains were deposited in the National Collection of Microorganism Cultures under the respective registration numbers CNCM 1-3319, CNCM I-3320, CNCM I-3527 and CNCM I-3528.
  • the mutant strains FT120 and FT130 were tested under identical conditions.
  • the deletion of the POX1 and POX 6 genes makes it possible to reduce the degradation of the diacids for FT120.
  • the deletion of an additional DGA1 gene coding for acyl-CoA diacylglycerol acyltransferase results in a decrease in the accumulation of the bioconversion substrate in the form of lipid bodies within the Yarrowia lipolytica cell.
  • most of the diacids obtained in these examples are composed of diacids containing 18 carbon atoms, like the bioconversion substrate used, which is predominantly composed of 18-carbon fatty acids.
  • Example 1 Process for producing dicarboxylic acids from oleic sunflower oil with the MTLY37 mutant
  • a preculture of mutant MTLY37, preserved on agar medium of composition: yeast extract 10 gl '1 ; peptone 10 gl '1 ; glucose 10 gl '1 ; Agar 20 gl '1 , is carried out by seeding which provides an initial absorbance of the preculture medium close to 0.30.
  • the preculture is carried out with orbital shaking (200 rpm) for 24 h at 30 ° C. in a 500 ml finned flask containing 25 ml of medium (10 ⁇ l -1 yeast extract, 10 ⁇ l -1 peptone, 20 ⁇ l -1 glucose).
  • the medium used for the culture is deionized water, yeast extract at 10 gl -1 , tryptone at 20 gl -1 , glucose at 40 gl -1 , and oleic sunflower oil at 30 gl. "1 .
  • Seeding of the fermenter is performed with the entire preculture vial.
  • the culture is conducted at 30 ° C. in a 4 L fermentor with 2 l medium at a ventilation rate of 0.5 vvm and a stirring speed of 800 rpm provided by a double-acting centripetal turbine.
  • the cell biomass is removed by centrifugation.
  • the supernatant is then acidified to pH 2.5 by the addition of 6M HCl and the insoluble dicarboxylic acids are recovered by centrifugation of the acidified wort and dried.
  • the dicarboxylic acid composition of the mixture is determined by gas chromatography on a DB1 column after conversion of the dicarboxylic acids to diesters according to the method described by Uchio et al: Microbial Production of Long-chain Dicarboxylic Acids from / 7-Alkanes. Part II. Production by Candida cloacae Mutant Unable to Assimilate Dicarboxylic Acid. Agr Biol. Chem. 36, No. 3, 1972, 426-433. The oven temperature of the chromatograph is programmed from 150 ° C. to 28 ° C. at a rate of 8 ° C. per min. The results show a maximum production of diacids in the supernatants of 5.9 gl -1 after 130 h.
  • Example 1 is repeated replacing the tryptone with peptone at the same concentration in the culture medium. After 130 hours of culture, 9.9 g -1 of dicarboxylic acids are obtained, giving a production increase of about 68% compared to Example 1.
  • EXAMPLE 3 Production of Dicarboxylic Acids by Mutant MTLY37 with Continuous Feeding of Oleic Sunflower Oil
  • Example 2 is repeated. removing oleic sunflower oil from the culture medium and replacing it with a continuous injection of the same oil at a sub-limiting flow of 1 ml into the reactor.
  • Example 4 Production of dicarboxylic acids from oleic sunflower oil with the mutant MTLY79 overexpressed for CPR and ALK1
  • Example 3 is repeated replacing the MTLY37 mutant with the MTLY79 mutant overexpressing the CPR and ALK1 genes. After 130 hours of culture, 16 gl -1 of dicarboxylic acids are obtained.
  • Example 5 Production of dicarboxylic acids from oleic sunflower oil with the MTLY80 mutant overexpressed for CPR and ALK2
  • Example 3 is repeated replacing the MTLY37 mutant with the MTLY80 mutant overexpressing the CPR and ALK2 genes. After 130 hours of culture, 16 gl -1 of dicarboxylic acids are obtained.
  • Example 3 is repeated replacing the MTLY37 mutant with the mutant MTLY81 overexpressing only the CPR gene. After 130 hours of culture, 16 g are obtained. I- 1 dicarboxylic acids.
  • EXAMPLE 7 Production of Dicarboxylic Acids from Oleic Sunflower Oil with the FT120 Mutant Deleted for the Six POX ( ⁇ poxi-6) Genes and Overexpressing the CPR Gene
  • Example 3 is repeated replacing the mutant MTLY37 with the mutant FT120 deleted the six POX genes and overexpressing the CPR gene. After 130 hours of culture, 18 gl -1 of dicarboxylic acids are obtained
  • Example 8 Production of dicarboxylic acids from oleic sunflower oil with the mutant FT130 deleted for the six POX genes ( ⁇ pox1-6) and deleted for the DGA ⁇ gene ( ⁇ dgai) and overexpressing the CPR gene Example 3 is repeated, replacing the mutant MTLY37 with the mutant FT130 deleted from the six POX genes and the DGA ⁇ gene and overexpressing the CPR gene. After 130 hours of culture, 23 gl -1 of dicarboxylic acids are obtained

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Abstract

L'invention concerne un procédé de production d'acides dicarboxyliques (DCA) à longues chaînes hydrocarbonées, également appelés diacides, dans lequel on met en culture une souche mutante de Yarrowia lipolytica obtenue par mutagénèse dirigée et plus particulièrement disruptée au moins pour les gènes POX2, POX3, POX4 et POX5 codant pour Pacyl-CoA oxydase, dans un milieu constitué essentiellement d'un substrat énergétique qui comprend au moins une source de carbone et une source d'azote et on soumet ladite souche à un substrat de bioconversion choisi parmi les n-alcanes d'au moins 10 atomes de carbone, les acides gras d'au moins 10 atomes de carbone, leurs esters d'alkyle et les huiles naturelles.

Description

PRODUCTION D'ACIDES DICARBOXYLIQUES PAR DES SOUCHES MUTANTES AMÉLIORÉES DE YARROWIA UPOLYTICA
Domaine de l'invention
L'invention concerne un procédé de production d'acides dicarboxyliques par une fermentation mettant en œuvre une souche mutante de la levure Yarrowia lipolytica à partir d'un substrat de bioconversion. Les acides dicarboxyliques (aussi appelés "diacides") sont utilisés comme matières premières par exemple dans la synthèse de polyamides et de polyesters, d'huiles lubrifiantes, d'agents plastifiants ou de parfums.
Les procédés de production des diacides varient suivant le nombre d'atomes de carbone du squelette carboné du diacide considéré (Johnson RW, Pollock CM, Cantrell RR, Editors Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology, 4th Edition, 1983, pp. 118-136). Ainsi, l'acide azélaïque (diacide en C9) est obtenu classiquement par oxydation chimique de l'acide oléique par l'ozone tandis que l'acide sébacique (diacide en C10) est produit par oxydation alcaline de l'acide ricinoléique. L'acide dodécanedioïque (diacide en C12) est un produit de la pétrochimie. La voie microbiologique est utilisée pour la production d'acide brassylique (diacide en C13) à partir de tridécane.
Compte tenu de la diversité des diacides qui sont utilisés dans les différentes applications, l'intérêt d'une voie de production applicable à la plus large gamme possible de diacides est incontestable. Bien que se caractérisant par une vitesse de réaction plus lente que celle de la voie chimique, la voie biologique présente l'intérêt d'être applicable à une grande variété de substrats (le processus de production des diacides par voie biologique est représenté schématiquement à la Figure 1).
En fait, de nombreuses espèces microbiennes sauvages telles que Cryptococcus neoformans, Pseudomonas aeruginosa, Candida cloacae, etc. sont capables d'excréter de faibles quantités de diacides (Chan et al. : Stimulation of n-alkane conversion to dicarboxylic acid by organic-solvent- and detergent-treated microbes. Appl. Microbiol. Biotechnol., 34, 1991 , 772-777 ; Shiio et al. : Microbial
Production of Long-chain Dicarboxylic Acids from n-Alkanes. Part I. Screening and Properties of Microorganisms Producing Dicarboxylic Acids. Agr. Biol. Chem. 35,
No. 13, 1971 , p. 2033-2042).
Cependant, pour obtenir des excrétions substantielles de diacides, il convient d'utiliser des mutants qui ont été bloqués au niveau de la β-oxydation. Pour de nombreuses espèces, de tels mutants ont été obtenus par une mutagénèse au hasard, suivie d'une sélection appropriée (brevet EP 0 229 252 B1 ; Shiio et al. ; Jiao et al. Isolation and Enzyme Détermination of Candida tropicalis Mutants for DCA Production. J. Gen. Appl. Microbiol. 2000, 46: 245-249). Une voie beaucoup plus élégante mais plus contraignante, mettant en œuvre les techniques de mutagénèse dirigée, a cependant été développée pour Candida tropicalis. À partir d'une souche sauvage appartenant à cette espèce, Picataggio et al. ont disrupté séquentiellement les quatre gènes codant les deux isoenzymes de Pacyl-CoA oxydase (Aox) qui catalysent la première étape de la β-oxydation (Détermination of Candida tropicalis Acylcoenzyme A Oxidase Isoenzyme Function by.Sequential Gène Disruption. Mol. CeII. Biol. 11 , 1991 , 4333-4339, et brevet US 5254466 A1).
Ces mêmes auteurs ont ensuite surexprimé les gènes codant pour la cytochrome P450 mono-oxygénase et la NADPH-cytochrome réductase, qui constituaient les activités limitant la cinétique de la conversion des n-alcanes en diacides (Picataggio et al. : Metabolic Engineering of Candida tropicalis for the Production of Long-chain Dicarboxylic Acids. Biotechnol. 10, 1992, 894-898, et brevet US 5 648 247 A1). Cependant, les mutants de Candida tropicalis produits selon un système d'amplification multicopies ne semblent pas totalement stables et se prêtent à des réversions possibles. C'est pour cette raison que des améliorations ont dû être apportées à l'art antérieur (demande de brevet US 2004/0014198 At).
Objet de l'invention
L'objet de l'invention est de remédier aux inconvénients de l'art antérieur. On a en effet découvert qu'il était possible, de manière avantageuse, de produire des diacides en utilisant des mutants de Yarrowia lipolytica dont les gènes codant pour Pacyl-CoA oxydase ont été disruptés.
- Les diacides que le procédé de l'invention vise à préparer sont des composés organiques à chaîne hydrocarbonée linéaire d'au moins 10 atomes de carbone comportant une fonction carboxylique à chaque extrémité de la chaîne. On utilise comme microorganisme un mutant de Yarrowia lipolytica dans lequel au moins les gènes POX2, POX3, POX4 et POX5 ont été disruptés, pour le bloquer partiellement au niveau de la β-oxydation. Hormis les acyl-CoA oxydases codées par les gènes P0X2, POX3, POX4 et POX5, deux autres acyl-CoA oxydases codées par les gènes POX1 et POX6, de fonction inconnue, sont présentes dans le génome de Yarrowia lipolytica.
Ces deux acyl-CoA oxydases sont impliquées dans la reconsommation des diacides biosynthétisés par élimination séquentielle de deux atomes de carbone.
La disruption supplémentaire des gènes POXΛ et POXQ entraîne donc la production de diacides correspondant au profil du substrat de bioconversion. Par exemple, si on utilise l'huile de tournesol oléique, composée en majorité d'acides gras à 18 atomes de carbone, comme substrat de bioconversion, la souche délétée de l'ensemble des gènes POX, produira en majorité des diacides à 18 atomes de carbone.
D'autre part, le substrat de bioconversion peut être stocké sous forme de triglycérides au sein même de la cellule sous forme de corps lipidiques et devenir donc inaccessible pour sa bioconversion en diacides. Des gènes ont été identifiés, par analyse protéomique, comme étant impliqués dans l'accumulation du substrat de bioconversion. Nous avons identifié les gènes: DGAλ (acyl-CoA:diacylglycerol acyltransferase) TGLΛ (triacylglycerol lipase), G3P (glycerol-3-phosphate dehydrogénase), SCP2 (transporteur putatif de stérol), LR0~\ (lecithine cholesterole acyltransferase putatif) ainsi que les IFP 621 (fonction inconnue), IPF 905 (fonction inconnue), et IPF 2569 (sous-unité NADH-ubiquinone réductase).
La modification de l'activité de ces gènes (par disruption ou surexpression) entraîne donc une diminution de l'accumulation du substrat de bioconversion sous forme de corps lipidiques au sein de la cellule de Yarrowia lipolytica.
On notera que le système génétique de Yarrowia lipolytica est très différent de celui de Candida tropicalis. Contrairement à Candida tropicalis qui est une levure diploïde, Yarrowia lipolytica est en effet une espèce haploïde. Chez ce dernier microorganisme, les opérations de délétion génique sont donc beaucoup plus efficaces et plus sûres, du fait même de la présence d'un jeu unique de chromosomes. D'autre part, un promoteur du gène POX2 codant pour Pacyl-CoA oxydase est utilisé pour surexprimer des gènes tels que, par exemple, ceux codant pour la cytochrome P450 mono-oxygénase et pour la NADPH-cytochrome réductase. Le promoteur pPOX2 a la propriété d'être un promoteur fort inductible par les substrats de bioconversion. Ainsi, la surexpression d'un gène d'intérêt est réalisée par l'addition d'une seule copie de gène sous le contrôle du promoteur pPOX2, permettant d'obtenir des mutants de Yarrowia lipolytica efficaces, stables et non- revertants contrairement aux mutants de Candida tropicalis obtenus par un système d'amplification multicopies. Un autre avantage de Yarrowia lipolytica sur Candida tropicalis pour la production de diacides à partir d'esters d'acides gras ou d'huiles naturelles, par exemple végétales, est le suivant : la transformation des huiles naturelles en diacides par Candida tropicalis nécessite une hydrolyse chimique au moins partielle du substrat avant la mise en œuvre de la fermentation (voir brevet US 5 962 285). Cette hydrolyse est réalisée par une saponification conduite en présence d'hydroxyde de calcium ou de magnésium. Elle produit les sels d'acides gras (savons) correspondants. Or, Yarrowia lipolytica présente la capacité d'assimiler les triglycérides comme source de carbone. La première étape de ce catabolisme implique l'hydrolyse des triglycérides en acides gras libres et glycérol par les enzymes lipolytiques (lipases), identifiées par Peters et Nelson en 1951. Une activité lipase extracellulaire et deux lipases membranaires de 39 et 44 kDa (Barth et al., Yarrowia lipolytica. in: Nonconventional Yeasts in Biotechnology A Handbook (WoIf, K., Ed.), Vol. 1 , 1996, pp. 313-388. Springer-Verlag) furent ensuite décrites. Yarrowia lipolytica est capable de produire plusieurs lipases (activité extracelluiaire, membranaire et intracellulaire). Récemment, les gènes correspondants aux lipases décrites ont été identifiés. Le gène LIP2 code pour une lipase extracellulaire, Lip2p (Pignede et al., 2000). Il a été démontré qu'elle hydrolysait préférentiellement les triglycérides à longue chaîne des résidus oléiques (Barth et al, 1996). Yarrowia lipolytica hydrolyse donc directement les esters et les huiles naturelles en acides gras libres et glycérol dans des conditions de pH compatibles avec la conduite de la fermentation. Dans ces conditions, l'hydrolyse de l'ester ou de l'huile et sa conversion en diacides ont lieu simultanément, ce qui présente l'avantage de mener à un protocole opératoire simplifié puisque l'étape d'hydrolyse chimique est éliminée.
Description détaillée de l'invention
De manière plus détaillée, l'invention propose un procédé production d'au moins un acide dicarboxylique qui comprend :
(a) une phase de croissance, dans laquelle on met en culture une souche mutante de Yarrowia lipolytica disruptée au moins pour les gènes POX2, POX3, POX4 et POX5 (codant pour l'acyl-CoA oxydase) dans un milieu de culture constitué essentiellement d'un substrat énergétique qui comprend au moins une source de carbone et une source d'azote ;
(b) une phase de bioconversion, dans laquelle on soumet ladite souche à un substrat de bioconversion choisi parmi les A?-alcanes d'au moins 10 atomes de carbone, les acides gras d'au moins 10 atomes de carbone, les esters d'alkyle de 1 à 4 atomes de carbone de ces acides gras, tels que les mélanges d'esters méthyliques ou éthyliques, ou encore les huiles naturelles (mélanges d'esters d'acides gras du glycérol), en présence d'un substrat énergétique ; et
(c) une phase de récupération de l'acide dicarboxylique formé.
Les souches utilisées dans le procédé de l'invention dérivent de la souche sauvage Yarrowia lipolytica W29 (ATCC 20460, répertoriée sous CLIB89 dans la Collection de Levures d'Intérêt Biotechnologique-CLIB). Ainsi, on peut utiliser de nouvelles souches mutantes dérivant de la souche Yarrowia lipolytica ATCC 20460 par l'intermédiaire de la souche PoId [souche auxotrophe pour la leucine (leu-) et l'uracile (ura-)], décrite dans la revue de G. Barth et al. . Elle est répertoriée sous CLIB139 dans la CLIB.
L'obtention de ces nouvelles souches mutantes (MTLY37, MTLY66, MTLY74, MTLY79, MTLY80, MTLY81 , FT 120 et FT 130) sera décrite plus loin.
Dans le procédé de production de diacides selon l'invention, on met la souche mutante choisie en culture dans un milieu constitué essentiellement d'un substrat énergétique qui comprend au moins une source de carbone et une source d'azote jusqu'à la fin de la croissance. On ajoute alors le substrat de bioconversion (alcane ou mélange d'alcanes, acide gras ou mélange d'acides gras, ester d'acide gras ou mélange d'esters d'acides gras ou huile naturelle ou mélange de ces différents substrats) de façon à initier la bioconversion en diacides et on récupère les diacides formés par une technique connue de l'homme du métier, telle que la précipitation des sels de calcium. Lors de la phase de bioconversion, le milieu de culture peut comprendre un apport de substrat énergétique secondaire consistant en général en au moins un composé polyhydroxylé, tel que par exemple le glycérol ou un sucre. 1. Obtention de la souche mutante MTLY37
Pour obtenir cette souche, on peut procéder comme suit :
1) on séquence le gène d'intérêt (ou bien on dispose de la séquence de ce gène dans une banque de données) ; 2) on construit une cassette de disruption par PCR ("Polymerase Chain Reaction") ou par clonage, en utilisant un marqueur contre-sélectionnable, par exemple le marqueur URA3 (avec lequel on peut sélectionner pour le phénotype Ura+ ou pour le phénotype lira-) ;
3) on sélectionne les souches avec le gène d'intérêt délété (transformation et sélection des transformants (avantageusement Ura+ si le marqueur est URA3) et on vérifie la disruption du gène.
On décrit ci-après une méthode particulière d'obtention de la souche mutante MTLY37.
On clone tout d'abord et on séquence des gènes POX de la souche sauvage, dont les séquences sont différentes de celles de Candida tropicalis. On construit ensuite des cassettes de disruption des gènes codant pour les iso-enzymes de l'acyl-CoA oxydase. On disrupte les gènes de l'acyl-CoA oxydase en utilisant le marqueur sélectionnable URA3. On amplifie les régions promotrices et terminatrices par une première PCR, en utilisant des paires d'oligonucléotides spécifiques, ce qui élimine la séquence complète du cadre de lecture ouverte
(ORF : "Open Reading Frame"). On effectue ensuite une seconde PCR avec les amorces externes et les produits de PCR des promoteurs et terminateurs, qui fusionnent via une extension commune de 20 bp comportant un site pour l'enzyme de restriction I-Scel. Le produit de PCR est clone pour donner une série de plasmides (désignés par pPOX-PT) contenant le module promoteur-terminateur
(cassette de disruption 2).
Un gène URA3 est introduit dans le site I-Scel de la cassette POX-PT. Une série de plasmides pPOX-PUT contenant le module promoteur-URA3~terminateur est construite (cassette de disruption 1). On appelle ces constructions pPOX1-P\JT, pPOX2-POT, pPOX3-PUT, pPOX4-PDT et pPOX5-P\JT pour les plasmides contenant la cassette de disruption 1 , d'une part, et pPOX1-PT, pPOX2-PT, pPOX3-Pl, pPOX4-PT, et pPOX&PT pour les plasmides contenant la cassette de disruption 2, d'autre part. Les cassettes de disruption sont amplifiées par PCR avec les amorces spécifiques externes en utilisant par exemple la Pfu polymérase (fournie par Stratagene, La JoIIa, Californie). L'analyse finale des séquences de protéines révèle que les acyl-CoA oxydases de Yarrowia lipolytica ont un degré d'identité de 45 % (50 % de similarité) avec celui des autres levures. Le degré d'identité entre elles varie de 55 à 70 % (65 à 76 % de similarité).
Après avoir construit les cassettes de disruption des gènes codant pour les acyl- CoA oxydase, on peut réaliser la transformation de Yarrowia lipolytica par différentes méthodes. On peut mettre en œuvre une électroporation, dans laquelle I1ADN rentre grâce au choc électrique. Plus avantageusement, on mettra en œuvre la méthode à l'acétate de lithium et au polyéthylène glycol. Cette méthode est décrite par Gaillardin et al. : LEU2 Directed Expression of Beta-gallactosidase Activity and Phleomycin Résistance in Yarrowia lipolytica. Curr. Genêt. 11 , 1987, 369-375. La présence de disruption est vérifiée par PCR selon la technique de Gussow et al. : Direct Clone Characterization from Plaques and Colonies by the Polymérase Chain Reaction. Nucleic Acids Res. 17, 1989, 4000, puis confirmée par hybridation Southern blot.
Au départ de la souche PoId, les disruptions sont effectuées en deux étapes. Dans un premier temps, PoId est transformé avec Ia cassette 1 de disruption de PCR PUT et sélectionné. Dans un deuxième temps, les clones Ura+ sont transformés avec la cassette de disruption 2, pour éliminer le gène URA3 et sont sélectionnés. Ce protocole permet l'obtention du quadruple disruptant MTLY37 - pox2ΔPT- pox3ΔPT- pox4ΔPT-pox5ΔPUT. La représentation schématique de la construction de ce mutant est résumée dans le Tableau 1 ci-dessous.
Tableau 1 : Étapes de transformation requises pour la production du mutant MTLY37 ne poussant plus sur acide oléique
Figure imgf000009_0001
La disruption d'un gène et l'excision du marqueur peuvent encore se faire par une méthode mettant en jeu une recombinaison ou une recombinase. On peut par exemple utiliser des marqueurs avec de part et d'autre une séquence répétée (permettant la recombinaison qui est sélectionnée) ou une séquence lox qui est reconnue par la recombinase Cre. L'excision a lieu quand on exprime la Recombinase Cre, Fickers et al., 2003 New Disruption Cassettes for Rapid Gène Disruption and Marker Rescue in the Yeast Yarrowia lipolytica. J. Microbiol. Methods 55/3:727-737.
2. Obtention de la souche Yarrowia lipolytica mutante MTLY74
À partir du mutant MTLY37, on a construit la souche MTLY74 Leu+Ura-.
2a. À partir du mutant MTLY37 prototrophe (Leu+, Ura+), on a construit une souche Yarrowia lipolytica mutante MTLY66 auxotrophe pour la leucine et l'uracile (Leu-, lira-). La première étape est la construction de la souche MTLY40 auxotrophe pour l'uracile (Leu+, Ura-) par conversion du marqueur URA3 par le marqueur ura3-41 en transformant le fragment de PCR contenant ce marqueur et en sélectionnant les Ura- en présence de 5FOA. A partir du mutant MTLY40, on a construit une souche Yarrowia lipolytica mutante MTLY64 auxotrophe pour la leucine (Leu-, Ura-, Hyg+) par disruption du marqueur LEU2 en transformant la cassette de disruption PHTIeu2 et en sélectionnant les transformants hygromycine résistant (Ieu2 ::Hyg). A partir du mutant MTLY64, on a construit une souche Yarrowia lipolytica mutante MTLY66 auxotrophe pour la leucine (Leu-, Ura-) par excision du marqueur HYG en transformant le vecteur réplicatif pRRQ2 contenant la recombinase Cre et le marqueur LEU2 (Cre-LEU2) et en sélectionnant les transformants hygromycine sensible, Leu+. La perte du plasmide pRRQ2 est réalisée par une culture sur milieu riche YPD et par l'isolement d'un clone (Leu-, Ura-, Hy9-). 2b. À partir du mutant MTLY66, on a construit une souche Yarrowia lipolytica mutante MTLY74 Leu+ Ura- qui surexprime la NADPH-cytochrome réductase, en l'exprimant sous le contrôle du promoteur fort pPOX2, induit par les substrats de bioconversion, du type acide gras, ester d'acide gras ou huile naturelle.
On a introduit le gène codant pour la NADPH-cytochrome réductase (CPR) dans un vecteur contenant le gène de sélection LEU2, par exemple JMP21 , sous le contrôle du promoteur pPOX2 inductible par les acides gras, les esters d'acide gras ou les huiles naturelles. La cassette marqueur-promoteur-gène (LEU2- pPOX2-CPf?) est introduite par transformation.
La représentation schématique de la construction de ce mutant est résumée dans le Tableau 2 ci-dessous.
Tableau 2 : Étapes de transformation requises pour la production du mutant
MTLY74 à partir de MTLY37
Figure imgf000011_0001
3. Obtention des souches MTLY79, MTLY80 et MTLY81 à partir du mutant commun MTLY74 3a. MTLY79 exprimant la NADPH-cytochrome réductase et la cytochrome P450 monooxygénase ALK1 sous le contrôle du promoteur pPOX2 inductible par les acides gras, les esters d'acide gras ou les huiles naturelles
À partir du mutant MTLY74, on a construit une souche Yàrrowia lipolytica mutante MTLY79 qui surexprime la NADPH-cytochrome réductase et la cytochrome P450 monooxygénase ALKΛ dans les conditions de bioconversion, sous le contrôle du promoteur fort pPOX2 induit par les substrats de bioconversion du type acide gras, ester d'acide gras ou huile naturelle.
On a introduit le gène ALKA codant pour la cytochrome P450 monooxygénase dans un vecteur contenant le gène de sélection URA3, par exemple JMP61 , sous le contrôle du promoteur pPOX2 inductible par les acides gras, les esters d'acide gras ou les huiles naturelles. La cassette marqueur-promoteur-gene (URA3- pPOX2->4/<L1) est introduite par transformation. La représentation schématique de la construction de ce mutant est résumée dans le Tableau 3 ci-dessous.
Tableau 3 : Étape de transformation requise pour la production du mutant MTLY79 surexprimé pour ALKΛ et CPR à partir de MTLY74
Figure imgf000012_0001
3b. MTLY80 exprimant la NADPH-cytochrome réductase et la cytochrome P450 monooxygénase ALK2 sous le contrôle du promoteur pPOX2 inductible par les acides gras, les esters d'acide gras ou les huiles naturelles
À partir du mutant MTLY74, on a construit une souche Yarrowia lipolytica mutante MTLY80 qui surexprime les gènes codant pour la NADPH-cytochrome réductase [CPR) et la cytochrome P450 monooxygénase (ALK2) dans les conditions de bioconversion, sous le contrôle du promoteur fort pPOX2 induit par les substrats de bioconversion du type acide gras, ester d'acide gras ou huile naturelle.
On a introduit le gène ALK2 codant pour la cytochrome P450 monooxygénase dans un vecteur contenant le gène de sélection URA3, par exemple JMP61 , sous le contrôle du promoteur pPOX2 inductible par les acides gras, les esters d'acide gras ou les huiles naturelles. La cassette marqueur-promoteur-gène (URA3- pPOX2->AKL2) est introduite par transformation.
La représentation schématique de la construction de ce mutant est résumée dans le Tableau 4 ci-dessous.
Tableau 4 : Étape de transformation requise pour la production du mutant MTLY80 surexprimé pour ALK2 et CPR à partir de MTLY74
Figure imgf000013_0001
3c. MTLY81 exprimant la NADPH-cytochrome réductase sans les gènes de la cytochrome P450 monooxygénase (ALK1 ou ALK2) sous le contrôle du promoteur pPOX2 inductible par les acides gras, les esters d'acide gras ou les huiles naturelles
À partir du mutant MTLY74, on a construit une souche Yarrowia lipolyîica mutante MTLY81 qui surexprime le gène codant pour la NADPH-cytochrome réductase (CPR) sous le contrôle du promoteur fort pPOX2 induit par les substrats de bioconversion du type acide gras, ester d'acide gras ou huile naturelle.
On a rendu le mutant MTLY74 prototrophe par transformation avec le plasmide JMP61 portant le marqueur URA3.
La représentation schématique de la construction de ce mutant est résumée dans le Tableau 5 ci-dessous.
Tableau 5 : Étape de transformation requise pour la production du mutant
MTLY81 surexprimé pour CPR à partir de MTLY74
Figure imgf000013_0002
4. Obtention de la souche mutante FT120
Pour obtenir cette souche, on peut procéder comme pour la construction de la souche MTLY37 ou de la souche MTLY66: 1) on construit une cassette de disruption par PCR ("Polymerase Chain Reaction") ou par clonage, en utilisant un marqueur contre-sélectionnable, par exemple le marqueur URA3 (avec lequel on peut sélectionner pour le phénotype Ura+ ou pour le phénotype Ura-), ou en utilisant un marqueur avec de part et d'autre une séquence répétée (permettant la recombinaison qui est sélectionnée) ou une séquence lox qui est reconnue par la recombinase Cre
2) on sélectionne les souches avec le gène d'intérêt délété (transformation et sélection des transformants ; avantageusement Ura+ si le marqueur est URA3) et on vérifie la disruption du gène ; 3) on sélectionne les souches avec le marqueur délété (transformation et sélection des transformants); avantageusement 5FOAR si le marqueur est URA3 ou avantageusement un plasmide exprimant la recombinase si le marqueur présente la séquence lox et on vérifie la disruption du gène.
On décrit ci-après une méthode particulière d'obtention de la souche mutante FT120.
À partir du mutant MTLY66, on a construit la souche FT120 Leu- Ura-, Δpox1-6.
4a. À partir du mutant MTLY66 Δpox2-5, on a construit une souche Yarrowia lipolytica mutante MTLY95 Δpox1-6 par insertion de délétion des gènes POX1 et POX6 et délétion du marqueur selon la méthode décrite précédemment. 4b. À partir du mutant MTLY95, on a construit une souche Yarrowia lipolytica mutante FT101 Leu+ Ura- qui surexprime le gène codant pour la NADPH- cytochrome réductase (CPR) dans les conditions de bioconversion, en l'exprimant sous le contrôle du promoteur fort pPOX2, induit par les substrats de bioconversion, du type acide gras, ester d'acide gras ou huile naturelle. On a introduit le gène codant pour pour la NADPH-cytochrome réductase dans un vecteur contenant le gène de sélection LEU2 excisable, par exemple JMP21- LEU2ex, sous le contrôle du promoteur pPOX2 inductible par les acides gras, les esters d'acide gras ou les huiles naturelles. La cassette marqueur-promoteur-gène (LEU2ex-pPOX2-CPR) est introduite par transformation. La souche FT120 est obtenue à la suite de l'excision du marqueur LEU2ex par transformation avec le plasmide pUB4-CRE, sélection Hyg+, perte du plasmide sur YPD et enfin isolement d'un clone Leu-. La représentation schématique de Ia construction de ce mutant est résumée dans le Tableau 6 ci-dessous.
Tableau 6 : Étapes de transformation requises pour Ia production du mutant
FT120 à partir de MTLY66
Figure imgf000015_0001
5. Obtention de la souche mutante FT130
Pour obtenir cette souche, on peut procéder comme pour la construction de la souche FT120 :
1) on construit une cassette de disruption par PCR ("Polymerase Chain Reaction") ou par clonage, en utilisant un marqueur contre-sélectionnable, par exemple le marqueur LJRA3 (avec lequel on peut sélectionner pour le phénotype Ura+ ou pour le phénotype Ura-), ou en utilisant un marqueur avec de part et d'autre une séquence répétée (permettant la recombinaison qui est sélectionnée) ou une séquence lox qui est reconnue par la recombinase Cre ; 2) on sélectionne les souches avec le gène d'intérêt délété (transformation et sélection des transformants ; avantageusement Ura+ si le marqueur est URA3) et on vérifie la disruption du gène ;
3) on sélectionne les souches avec le marqueur délété (transformation et sélection des transformants) ; avantageusement 5FOAR si le marqueur est URA3 ou avantageusement un plasmide exprimant la recombinase Cre si le marqueur présente la séquence lox et on vérifie la disruption du gène.
On décrit ci-après une méthode particulière d'obtention de la souche mutante FT130.
À partir du mutant FT120, on a construit la souche FT130 Leu- Ura-, Δpox1-6, Δdgai .
6. À partir du mutant FT120 Leu- Ura-, Δpox1-6, pPOX2-CPR on a construit une souche Yarrowia lipolytica mutante FT130 Leu- Ura+, Δpox1-6, pPOX2- CPR, Δdgai par insertion de délétion du gène DGA1 codant pour l'acyl-CoA diacylglycerol acyltransferase. Tableau 7 : Étape de transformation requise pour la production du mutant
FT130 à partir de FT120
Figure imgf000016_0001
Les souches MTLY66, MTLY81 , FT120 et FT 130 ont été déposées à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes sous les numéros d'enregistrement respectifs CNCM 1-3319, CNCM I-3320, CNCM I-3527 et CNCM I-3528.
Les exemples suivants illustrent l'invention sans en limiter la portée. EXEMPLES
Dans ces exemples, on a testé l'influence des conditions de culture et de la composition du milieu sur la production de diacides. On a ainsi constaté avec le mutant MTLY37 que l'utilisation de peptone favorisait fortement la production de diacides, notamment par rapport à la bacto-tryptone (Exemples 1 et 2). On a en outre testé dans les mêmes conditions les mutants MTLY79, MTLY80 et MTLY81. On a ainsi constaté que la NADPH-cytochrome réductase catalysait une étape limitante dans la production de diacides. En effet, la surexpression de cette enzyme seule permet d'augmenter significativement la production et la productivité des diacides (Exemples 4 à 6). On a testé dans des conditions identiques les souches mutantes FT120 et FT130 (exemples 7 et 8). La délétion des gènes POX1 et POX 6 permet de diminuer la dégradation des diacides pour FT120. La délétion d'un gène supplémentaire DGA1 codant pour l'acyl-CoA diacylglycerol acyltransferase entraîne une diminution de l'accumulation du substrat de bioconversion sous forme de corps lipidiques au sein de la cellule de Yarrowia lipolytica. Ainsi la majorité des diacides obtenus dans ces exemples est composée de diacides à 18 atomes de carbone à l'image du substrat de bioconversion utilisé, composé en majorité d'acides gras à 18 atomes de carbones.
Exemple 1 : Procédé de production d'acides dicarboxyliques à partir d'huile de tournesol oléique avec le mutant MTLY37
Une préculture du mutant MTLY37, conservé sur milieu gélose de composition : extrait de levure 10 g.l'1; peptone 10 g.l'1; glucose 10 g.l'1 ; Agar 20 g.l'1, est effectué grâce à un ensemencement qui fournit une absorbance initiale du milieu de préculture voisine de 0,30. La préculture est conduite sous agitation orbitale (200 rpm) pendant 24 h à 300C dans une fiole à ailettes de 500 ml contenant 25 ml de milieu (10 g.l"1 extrait de levure; 10 g.l"1 peptone; 20 g.l"1 glucose). Le milieu utilisé pour la culture est composé d'eau désionisée, d'extrait de levure à 10 g.l"1; de tryptone à 20 g.l'1; de glucose à 40 g.l'1; et d'huile de tournesol oléique à 30 g.l"1.
L'ensemencement du fermenteur est effectué avec la totalité de la fiole de préculture.
La culture est conduite à 3O0C dans un fermenteur de 4 I avec 2 I de milieu à un débit d'aération de 0,5 vvm et une vitesse d'agitation de 800 rpm assurée par une turbine centripète à double effet.
Après 17 heures de culture dès lors que le glucose du milieu est épuisé, on ajoute 60 ml d'huile de tournesol oléique, composée en majorité d'acides gras à 18 atomes de carbone, dans le réacteur que l'on soumet à une alimentation continue de glycérol à raison de 1 ml. h"1. Le pH de la culture est alors maintenu à la valeur constante de 8 par addition régulée de soude 4 M. La fermentation dure 130 h.
En fin de culture, on élimine la biomasse cellulaire par centrifugation. Le surnageant est ensuite acidifié jusqu'à pH 2,5 par addition d'HCI 6M et les acides dicarboxyliques insolubles sont récupérés par centrifugation du moût acidifié puis séchés.
La composition en acides dicarboxyliques du mélange est déterminée par chromatographie en phase gazeuse sur une colonne DB1 après conversion des acides dicarboxyliques en diesters selon la méthode décrite par Uchio et al : Microbial Production of Long-chain Dicarboxylic Acids from /7-Alkanes. Part II. Production by Candida cloacae Mutant Unable to Assimilate Dicarboxylic Acid. Agr Biol. Chem. 36, No. 3, 1972, 426-433. La température du four du chromatographe est programmée de 150°C à 28O0C à raison de 8°C par min. Les résultats montrent une production maximale de diacides dans les surnageants de 5,9 g.l"1 après 13O h.
Exemple 2
On répète l'Exemple 1 en remplaçant dans le milieu de culture la tryptone par de la peptone à la même concentration. Au bout de 130 h de culture, on obtient 9,9 g.l"1 d'acides dicarboxyliques, soit un accroissement de production d'environ 68 % par rapport à l'Exemple 1. Exemple 3 : Production d'acides dicarboxyliques par le mutant MTLY37 avec alimentation continue d'huile de tournesol oléique
On répète l'Exemple 2 . en éliminant l'huile de tournesol oléique du milieu de culture et en la remplaçant par une injection continue de cette même huile à un flux sub-limitant de 1 ml dans le réacteur.
Dans ces conditions, 14,7 g.l"1 d'acides dicarboxyliques sont produits dans le milieu de culture après 130 h.
Exemple 4 : Production d'acides dicarboxyliques à partir d'huile de tournesol oléique avec le mutant MTLY79 surexprimé pour CPR et ALK1 On répète l'Exemple 3 en remplaçant le mutant MTLY37 par le mutant MTLY79 surexprimant les gènes CPR et ALK1. Au bout de 130 h de culture, on obtient 16 g.l"1 d'acides dicarboxyliques.
Exemple 5 : Production d'acides dicarboxyliques à partir d'huile de tournesol oléique avec le mutant MTLY80 surexprimé pour CPR et ALK2 On répète l'Exemple 3 en remplaçant le mutant MTLY37 par le mutant MTLY80 surexprimant les gènes CPR et ALK2. Au bout de 130 h de culture, on obtient 16 g.l"1 d'acides dicarboxyliques.
Exemple 6
On répète l'Exemple 3 en remplaçant le mutant MTLY37 par le mutant MTLY81 surexprimant uniquement le gène CPR. Au bout de 130 h de culture, on obtient 16 g. I"1 d'acides dicarboxyliques.
Exemple 7 : Production d'acides dicarboxyliques à partir d'huile de tournesol oléique avec le mutant FT120 délété pour les six gènes POX (Δpoxi -6) et surexprimant le gène CPR On répète l'Exemple 3 en remplaçant le mutant MTLY37 par le mutant FT120 délété des six gènes POX et surexprimant le gène CPR. Au bout de 130 h de culture, on obtient 18 g.l"1 d'acides dicarboxyliques
Exemple 8 : Production d'acides dicarboxyliques à partir d'huile de tournesol oléique avec le mutant FT130 délété pour les six gènes POX (Δpox1-6) et délété pour le gène DGA\ (Δdgai) et surexprimant le gène CPR On répète l'Exemple 3 en remplaçant le mutant MTLY37 par le mutant FT130 délété des six gènes POX et du gène DGAλ et surexprimant le gène CPR. Au bout de 130 h de culture, on obtient 23 g.l"1 d'acides dicarboxyliques

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de production d'acides dicarboxyliques, caractérisé en ce qu'il comprend : a) une phase de croissance, dans laquelle on met en culture une souche mutante de Yarrowia lipolytica disruptée au moins pour les gènes POX2, POX3, POX4 et POX5 (codant pour l'acyl-CoA oxydase) ; dans un milieu de culture constitué essentiellement d'un substrat énergétique qui comprend au moins une source de carbone et une source d'azote ; b) une phase de bioconversion, dans laquelle on soumet ladite souche à un substrat de bioconversion choisi parmi les n-alcanes d'au moins 10 atomes de carbone, les acides gras d'au moins 10 atomes de carbone, les esters d'alkyle de 1 à 4 atomes de carbone de ces acides gras et les huiles naturelles, en présence d'un substrat énergétique ; et c) une phase de récupération de l'acide dicarboxylique formé.
2. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que le mutant utilisé est MTLY37.
3. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que le mutant utilisé est MTLY79 surexprimant les gènes CPR et ALKI .
4. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que le mutant utilisé est MTLY80 surexprimant les gènes CPR et ALK2.
5. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que le mutant utilisé est MTLY81 surexprimant le gène CPR.
6. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que le mutant utilisé est FT 120 surexprimant le gène CPR.
7. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que le mutant utilisé est FT 130 surexprimant le gène CPR.
8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5 caractérisé en ce que ledit substrat de bioconversion consiste en un mélange d'esters méthyliques ou un mélange d'esters éthyliques.
9. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5 caractérisé en ce que ledit substrat de bioconversion consiste en une huile de tournesol oléique.
10. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7 caractérisé en ce que, dans la phase de bioconversion, le milieu de culture comprend de la peptone.
11. Procédé selon l'une des revendications 1 à 8 caractérisé en ce que, dans la phase de bioconversion, le milieu de culture comprend un apport de substrat énergétique secondaire consistant en au moins un composé polyhydroxylé.
12. Procédé selon la revendication 9 caractérisé en ce que ledit composé polyhydroxylé est le glycérol ou un sucre.
13. Procédé selon l'une des revendications 1 à 10 caractérisé en ce que, dans la phase (c), l'acide dicarboxylique est récupéré par précipitation sous forme de sel de calcium.
14. Procédé d'obtention d'une souche Yarrowia lipolytica mutante MTLY66 auxotrophe, Leu- Ura-, à partir du mutant MTLY37 prototrophe, et utilisable pour la transformation avec, comme marqueurs de sélection, les gènes LEU2 et URA3, caractérisé en ce que l'on met en œuvre les opérations de transformation des étapes 1 à 3 du tableau suivant :
Figure imgf000023_0001
15. Procédé d'obtention, à partir du mutant MTLY66, d'une souche Yarrowia lipolytica mutante MTLY74 Leu+ Ura- qui surexprime le gène CPR codant pour la NADPH-cytochrome réductase dans les conditions de bioconversion, par transformation du vecteur JMP21-CPR contenant le marqueur de sélection LEU2 et la cassette d'expression avec le gène CPR sous le contrôle du promoteur pPOX2 inductible par les acides gras, les esters d'acide gras ou les huiles naturelles.
16. Procédé d'obtention, à partir de la souche Yarrowia lipolytica mutante MTLY74, d'une souche Yarrowia lipolytica mutante MTLY79 qui surexprime les gènes codant pour la NADPH-cytochrome réductase et pour la cytochrome P450 monooxygénase dans les conditions de bioconversion, par transformation du vecteur JMP61-/U.K1 contenant le marqueur de sélection URA3 et la cassette d'expression avec le gène ALKI sous le contrôle du promoteur pPOX2 inductible par les acides gras, les esters d'acide gras ou les huiles naturelles.
17. Procédé d'obtention, à partir de la souche Yarrowia lipolytica mutante MTLY74, d'une souche Yarrowia lipolytica mutante MTLY80 surexprimant les gènes codant pour la NADPH-cytochrome réductase et pour la cytochrome P450 monooxygénase ALK2 dans les conditions de bioconversion, par transformation du vecteur JMP61-ALK2 contenant le marqueur de sélection URA3 et la cassette d'expression avec Ie gène ALK2 sous le contrôle du promoteur pPOX2 inductible par les acides gras, les esters d'acide gras ou les huiles naturelles.
18. Procédé d'obtention d'une souche Yarrowia lipolytica mutante MTLY81 à partir du mutant MTLY74 qui surexprime le gène CPR codant pour la NADPH-cytochrome réductase dans les conditions de bioconversion, en l'exprimant sous le contrôle du promoteur pPOX2 induit par les substrats de bioconversion, du type acide gras, ester d'acide gras ou huile naturelle et qui est prototrophe, en rendant le mutant MTLY74 prototrophe par transformation avec le plasmide JMP61 portant le marqueur URA3.
19. Procédé d'obtention, à partir de la souche Yarrowia lipolytica mutante MTLY66, d'une souche Yarrowia lipolytica mutante FT120 Leu- Ura-, caractérisé en ce que l'on met en oeuvre les opérations de transformation des étapes 1 à 4 du tableau suivant :
Figure imgf000025_0001
puis en ce qu'on réalise la construction de la souche mutante FT101 Leu+ Ura-, à partir de la souche Yarrowia lipolytica MTLY95, qui surexprime le gène (CPR) codant pour la NADPH-cytochrome réductase dans les conditions de bioconversion, par transformation du vecteur JMP21-LEU2ex- CPR, contenant le marqueur de sélection LEU2 excisable et le gène CPf? sous le contrôle du promoteur pPOX2 inductible par les acides gras, les esters d'acide gras ou les huiles naturelles, la souche FT120 étant obtenue à la suite de l'excision du marqueur LEU2ex par transformation avec le plasmide pUB4-CRE, sélection Hyg+, perte du plasmide sur YPD et enfin isolement d'un clone Leu-.
20. Procédé d'obtention, à partir de la souche Yarrowia lipolytica mutante FT120, d'une souche Yarrowia lipolytica mutante FT130 caractérisé en ce qu'on met en oeuvre l'étape de transformation suivante :
Figure imgf000026_0001
21. Nouvelle souche Yarrowia lipolytica mutante MTLY66.
22. Nouvelle souche Yarrowia lipolytica mutante MTLY81 ,
23. Nouvelle souche Yarrowia lipolytica mutante FT120.
24. Nouvelle souche Yarrowia lipolytica mutante FT130.
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