WO2006018981A1 - Ｄｎａチップの製造方法と製造システム、ハイブリダイゼーション検出方法と検出システム、並びに基板処理装置と基板処理方法 - Google Patents

Ｄｎａチップの製造方法と製造システム、ハイブリダイゼーション検出方法と検出システム、並びに基板処理装置と基板処理方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2006018981A1
WO2006018981A1 PCT/JP2005/014314 JP2005014314W WO2006018981A1 WO 2006018981 A1 WO2006018981 A1 WO 2006018981A1 JP 2005014314 W JP2005014314 W JP 2005014314W WO 2006018981 A1 WO2006018981 A1 WO 2006018981A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
substrate
detection
nucleic acid
reaction region
hybridization
Prior art date
Application number
PCT/JP2005/014314
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Takayoshi Mamine
Yasuhiro Sakamoto
Original Assignee
Sony Corporation
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sony Corporation filed Critical Sony Corporation
Priority to EP05768495A priority Critical patent/EP1775589A4/en
Publication of WO2006018981A1 publication Critical patent/WO2006018981A1/ja

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/5308—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for analytes not provided for elsewhere, e.g. nucleic acids, uric acid, worms, mites
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54373—Apparatus specially adapted for solid-phase testing involving physiochemical end-point determination, e.g. wave-guides, FETS, gratings
    • G01N33/5438—Electrodes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N35/00—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor
    • G01N35/00029—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor provided with flat sample substrates, e.g. slides
    • G01N35/00069—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor provided with flat sample substrates, e.g. slides whereby the sample substrate is of the bio-disk type, i.e. having the format of an optical disk

Definitions

  • DNA chip manufacturing method and manufacturing system hybridization detection method and detection system, and substrate processing apparatus and substrate processing method
  • the present invention relates to a technique related to a DNA chip. More specifically, the present invention relates to a DNA chip manufacturing method and manufacturing system, a hybridization detection method and detection system, and a substrate processing apparatus and a substrate processing method.
  • DNA chips DNA microarrays
  • SNPs nucleotide polymorphism
  • This "DNA chip” is a comprehensive collection of DNA and hybridization because a large number of DNA oligo strands and cDNA (complementary DNA) are integrated on a glass substrate or silicon substrate. The feature is that analysis is possible.
  • the technology for producing this DNA chip is currently a technology and mechanism using ink-jetting, such as photolithography using semiconductor exposure technology and piezoelectric technology.
  • -Cal Micro Spotting (mecha nical microspotting) and other technologies are used, and these technologies are said to have advantages and disadvantages.
  • the surface of the substrate made of non-porous glass or synthetic resin with a smooth and uniform surface is used because the sample does not diffuse or absorb, and the sample is sufficient. Assuming that.
  • This "DNA chip” can be roughly divided into two types.
  • the first type is a method in which oligonucleotides are directly synthesized on a predetermined substrate using the above-mentioned photolithography technique, and is representatively produced by Affymetrix (Affymetrix). (See Table 4 No. 505763).
  • Affymetrix Affymetrix
  • This type of chip has a high degree of integration, there is a limit to DNA synthesis on the substrate, and the length is about several tens of bases.
  • the second type is also referred to as the “Stanford method”, and is prepared by dispensing and solidifying a prepared DNA on a substrate using a front-end pin. (For example, see Japanese National Publication No. 10-503841).
  • This type of chip has the advantage of being able to immobilize DNA fragments of about 1 kb, although the degree of integration is lower than the former.
  • This fluorescence detection system is a system that detects fluorescence obtained by irradiating the fluorescent material with predetermined excitation light. According to this system, fluorescent materials are used in place of the conventional radioactive materials, so that detection can be speeded up, and accuracy and safety can be improved.
  • a double-stranded nucleic acid molecule extends or moves when subjected to the action of an electric field in a liquid phase.
  • the principle is thought to be that ion clouding is created by phosphate ions (negative charge) forming the skeleton and hydrogen atoms (positive charge) in the vicinity of the hydropower S ions, and these negative and positive charges are formed.
  • the polarization vector (dipole) generated by the Seiichi Suzu ki Takeshi Yamanashi, Shin-ichi Tazawa, usamu Kurosawa and asao Washizu: Q uantitative analysis on electrostatic orientation of DNA in stationary AC electric fiel d using fluorescence anisotropy, ⁇ Transaction on Industrial Applications, Vol.3 4, No.l, P75-83 (1998)).
  • the conventional DNA chip technology has a problem that the efficiency of hybridization is still unsatisfactory for the spread of the technology, although to a certain extent. This is mainly because (1) the higher-order structure of the nucleic acid tends to be in a rounded or entangled state (random coil state). (2) The target nucleic acid and other detection-related substances adhere to the surface of the substrate around the detection nucleic acid, which may hinder hybridization. It is the main cause. If these causes can be resolved, the assembly time using the DNA chip can be greatly shortened.
  • the conventional DNA chip technology has a problem that false positives and false negatives occur frequently to the extent that they cannot be ignored due to the occurrence of mishybridization. That is, in the conventional DNA chip technology, it is necessary to improve detection accuracy.
  • the present invention can efficiently advance (immobilize) genetic information and hybridization on a substrate in a short time, and can perform highly accurate detection. It is an object of the present invention to provide a DNA chip manufacturing method and manufacturing system, a hybridization detection method and detection system, a substrate processing apparatus, and a substrate processing method, including techniques for obtaining results.
  • the present invention provides a “DNA chip manufacturing method” performed using a substrate on which a portion is disposed.
  • the step of surface treatment of the substrate and the application of an electric field via the counter electrode to a medium that is stored or held in the reaction region and includes a preliminarily adjusted nucleic acid for detection comprising at least the step of fixing the detection nucleic acid on the electrode surface and the step of removing excess detection nucleic acid from the reaction region.
  • the step of performing the surface treatment of the substrate is, for example, a step of performing lyophilic processing of the substrate.
  • the medium is stored or held by being dropped or injected into the reaction region.
  • the medium may be dropped or injected while rotating the substrate.
  • the electric field application includes a process of moving the detection nucleic acid based on the dielectrophoresis by the electric field application. Further, this electric field application is a high frequency electric field, and it is desirable that this high frequency electric field is 1 MV Vm or more and 1 MHz or more.
  • At least a reaction region serving as a hybridization field and a counter electrode disposed so as to be able to apply an electric field to a medium stored or held in the reaction region are provided.
  • a medium containing a nucleic acid for detection prepared in advance is dropped on the reaction region or
  • a DNA chip manufacturing system comprising at least means for injecting and means for applying an electric field to the medium stored or held in the reaction region via the counter electrode.
  • spotting means for dropping or injecting a medium into the reaction region and storing or holding the medium, or means for removing excess detection nucleic acid existing in the reaction region from the reaction region Is provided.
  • the electric field applying means a high-frequency electric field applying means can be suitably employed, and the substrate is preferably a disk-shaped substrate, for example, and may be provided with means for rotating the disk-shaped substrate.
  • the dropping or injecting means may supply the medium to the reaction region in synchronization with the rotation of the substrate.
  • a reaction region that serves as a hybridization field a counter electrode that is arranged so that an electric field can be applied to a medium stored or held in the reaction region
  • the present invention provides a “hybridization detection method” using a substrate on which a detection unit comprising at least a detection nucleic acid immobilized on a substrate is provided.
  • a “hybridization detection method” that performs at least the step of detecting fluorescence intensity obtained by irradiation.
  • the electric field application in the step of applying the electric field may be performed on the substrate all at once or for each block region.
  • the "step of dropping or injecting a medium containing the target nucleic acid into the reaction region” and the “step of dropping or injecting an intercalator into this reaction region” are performed simultaneously to simplify the process. You may hesitate. Hybridization may be performed with an electric field applied, or in some cases, with the electric field off.
  • a process of removing excess target nucleic acid present in the reaction region from the hybridization region is performed to improve detection accuracy. It may be raised.
  • This removal step may be a method of attracting excess target nucleic acid to the electrode surface outside the hybridization region by applying an electric field.
  • the excitation light used for detection or the like is radiated from the back side of the substrate.
  • a step of dropping or injecting a medium containing a target nucleic acid prepared in advance into the reaction region, a step of dropping or injecting an intercalator into the reaction region, or an excitation light of a predetermined wavelength A step of detecting the fluorescence intensity obtained by irradiating the reaction region is performed.
  • a reaction region serving as a hybridization field a counter electrode disposed so as to be able to apply an electric field to a medium stored or held in the reaction region
  • a “noblation detection system” uses a substrate on which a detection unit having at least a detection nucleic acid immobilized on the substrate is disposed.
  • Means for applying, means for advancing hybridization between the nucleic acid for detection and the target nucleic acid, means for dropping or injecting an intercalator into the reaction region, and excitation light of a predetermined wavelength in the reaction region There is provided a hybridization detection system comprising at least a means for detecting fluorescence intensity obtained by irradiation.
  • the substrate is provided with a layer that transmits the excitation light, and the light source of the excitation light is preferably disposed on the back side of the substrate.
  • a medium dropping or injecting device group can be arranged in the upper region of the substrate, and an optical device group related to hybridization detection can be arranged in the lower region.
  • the entire detection device can be made compact and the device configuration can be simplified.
  • the substrate is devised so as to have a disk-like substrate rotating means, and further, a positioning servo means and a focus servo means of the detecting portion of the substrate are provided. [0044] (5) A substrate processing apparatus.
  • an apparatus for processing a substrate having a reaction region on its surface capable of providing a hybridization field, wherein the detection nucleic acid is immobilized Supply means for supplying the target nucleic acid to the reaction region; heating means for controlling the temperature of the substrate to which the target nucleic acid has been supplied; reading means for reading the hybridization status of the substrate;
  • a substrate processing apparatus having a transfer means for transferring a substrate.
  • this apparatus it is further devised to include means for applying an electric field to the substrate, and for example, optical reading means can be suitably employed as the reading means.
  • the substrate may be continuously conveyed between the supply unit, the heating unit, and the reading unit by the conveyance unit, or the supply unit, the heating unit, and the reading unit.
  • the means may be arranged in series, or the supply means may be provided with a humidifying means.
  • a substrate introduction unit for introducing the substrate toward the supply unit, a substrate extraction unit for taking out the substrate from the reading unit, and a substrate introduction unit are provided.
  • the substrate taking-out means may be a common means.
  • the supply means, the heating means, the reading means, the substrate inlet, and the substrate outlet may be arranged in series.
  • a second supply means for supplying a solvent to a reaction region (on a substrate) on which a detection nucleic acid is immobilized and an extraction means for extracting nucleic acid from blood can be provided.
  • a method for treating a substrate having a reaction region on its surface capable of providing a hybridization field, wherein the detection nucleic acid is immobilized A nucleic acid supply step for supplying a target nucleic acid to the reaction region; a temperature control step for controlling the temperature of the substrate to which the target nucleic acid has been supplied; and a reading step for reading the state of hybridization in the reaction region; There is provided a substrate processing method devised so as to sequentially perform each of the above steps.
  • a step of applying an electric field to the substrate may be performed.
  • nucleic acid can be used to improve the efficiency of hybridization and improve the detection accuracy of hybridization. Can give electrodynamic effects to molecules.
  • the temperature control step for example, it is used as a step of setting the optimum temperature of the hybridization, and the hybridization between the nucleic acid for detection and the target nucleic acid proceeds. Can be made.
  • the reading step is an optical reading step
  • the substrate is transported between the nucleic acid supply step, the temperature control step, and the reading step, or the nucleic acid supply step. It can be devised to perform humidification.
  • Detection nucleic acid is a nucleic acid molecule having a complementary base sequence that exists in a fixed or free state in a medium stored or held in a reaction region and specifically interacts with the nucleic acid molecule. It is a nucleic acid molecule that functions as a probe (detector) for detecting. Representative examples are oligonucleotides or polynucleotides such as DNA probes.
  • the “target nucleic acid” is a nucleic acid molecule having a base sequence complementary to the detection nucleic acid.
  • Nucleic acid refers to a polymer (nucleotide chain) of a nucleoside phosphate ester in which a purine or pyrimidine base and a sugar are glycosidically linked, and includes oligonucleotides, polynucleotides, purine nucleotides and pyrimidines containing probe DNA. It includes a wide range of DNAs (full length or fragments thereof) obtained by polymerization of nucleotides, cDNA (c probe DNA) obtained by reverse transcription, RNA, polyamide nucleotide derivatives (PNA), and the like.
  • Hybridization means a complementary strand (double strand) forming reaction between complementary base sequence structures. “Misuno, hybridization” means the complementary strand formation reaction which is not normal, and is often abbreviated as “mishypri” in the present invention.
  • the "reaction region” is a region that can provide a reaction field for hybridization and other interactions, and can include, for example, a reaction field having a well shape that can store a liquid phase, gel, and the like. .
  • the interaction performed in this reaction region is not narrowly limited as long as it meets the purpose and effect of the present invention.
  • Counter electrode means at least a pair of electrodes arranged with their electrode surfaces facing each other.
  • the “opposite axis” means an axis formed by a straight line connecting the centers of two opposing electrode surfaces. “Intersection” includes both the case of intersection on the same plane forming an intersection point and the case of three-dimensional intersection without forming an intersection point. Any configuration that can achieve the purpose and effect can be adopted.
  • the "surplus substance” is an excess of the detection nucleic acid such as probe DNA existing in the reaction region, or a surplus of the target nucleic acid having a base sequence portion complementary to the detection nucleic acid, Alternatively, a surplus of so-called “intercalators” having the property of being inserted and bonded to a complementary strand obtained as a result of hybridization.
  • An “intercalator” is a fluorescently labeled substance that can be inserted and bound to a double-stranded nucleic acid, and is a substance used for detection of hybridization.
  • an “intercalator” is a fluorescently labeled substance that can be inserted and bound to a double-stranded nucleic acid, and is a substance used for detection of hybridization.
  • POPO-1 or TOTO 3 can be used.
  • Step hindrance refers to the presence of bulky substituents in the vicinity of the reaction center in the molecule, the posture of the reaction molecule, and the three-dimensional structure (higher order structure). By becoming difficult, it means a phenomenon in which a desired reaction (in this application, no) is difficult to occur.
  • Dielectrophoresis is a phenomenon in which the electric field is uniform !, in the field !, and the molecule is driven to the direction of strong electric field! Since the polarity of the polarization also reverses as the polarity of the polarity is reversed, the driving effect can be obtained in the same way as in the case of direct current (supervised by Teru Hayashi, “Micromachine and Material Technology (issued by CMC)”, ⁇ 37- ⁇ 46 ⁇ 5th See chapter Cell and DNA manipulation).
  • DNA chip broadly means a hybridization detection substrate in which nucleic acids such as DNA probes are immobilized and finely arranged, and also includes the concept of a DNA microarray.
  • gene information can be efficiently accumulated (immobilized) on a substrate, and hybridization can be efficiently advanced in a short time to improve detection accuracy. Can do.
  • FIG. 1 is an external view showing an example of a preferred embodiment of a disc-like substrate 1 that can be employed in the present invention.
  • FIG. 2 is a partial sectional view showing a basic layer structure of the substrate 1.
  • FIG. 3 is an enlarged view of a detection surface U portion formed in the reaction region R of the detection unit 3
  • FIG. 4 is a cross-sectional view of the detection unit 3 showing an example of the arrangement of a pair of counter electrodes.
  • FIG. 5 is a cross-sectional view of the detection unit 3 showing another arrangement example of a pair of counter electrodes.
  • FIG. 6 is a cross-sectional view of the detection unit 3 showing still another example of arrangement of a pair of counter electrodes.
  • FIG. 7 is a cross-sectional view of the detection unit 3 showing an example of the arrangement of two sets of counter electrodes whose opposing axes are orthogonal to each other.
  • FIG. 8 is a diagram schematically showing an electrode arrangement configuration in which the scanning electrode C group is operated in the detection unit 3.
  • FIG. 9 is a diagram showing a configuration of a detection surface U formed by patterning.
  • FIG. 10 is a diagram showing an embodiment of the detection unit 3 in which protruding electrodes are arranged.
  • FIG. 11 is a diagram showing an example of an embodiment of the power supply wiring 7 for the counter electrode.
  • FIG. 12 is a diagram showing a flow of one process example of the method of manufacturing the DNA chip 10.
  • FIG. 13 is a view showing a flow of another process example of the manufacturing method.
  • FIG. 14 is a block diagram showing an example of an embodiment of a system according to the present invention.
  • FIG. 15 is a conceptual diagram schematically showing an example of a preferred embodiment of a substrate processing apparatus in which the components of the system are integrated.
  • FIG. 16 is a conceptual diagram of a substrate processing system that can be employed when manufacturing a DNA chip or performing Z and noise detection.
  • FIG. 17 is a diagram showing an example of a process flow of the hybridization detection method.
  • FIG. 18 is a diagram showing another process flow of the method.
  • FIG. 19 shows a case where a low-frequency electric field W is applied immediately after a high-frequency electric field W is applied.
  • FIG. 20 shows the low-frequency electric field W applied portion in FIG.
  • FIG. 21 is a waveform diagram showing an example of electric field application in which the electric field is zero after applying the high-frequency electric field W.
  • FIG. 22 shows an electric field mark in which a direct current (DC) electric field W is applied after a high frequency electric field W is applied.
  • DC direct current
  • FIG. 23 shows an example of electric field application in which a DC electric field W is applied before a high frequency electric field W is applied
  • FIG. 24 shows a high-frequency electric field applied with a DC component simultaneously.
  • Figure 25 shows a low-frequency electric field W in which a DC component is simultaneously applied after applying a high-frequency electric field W.
  • FIG. 6 is a waveform diagram showing an example of applying an electric field in which 6 is applied.
  • FIG. 26 shows the DC component after applying the high-frequency electric field W to which the DC component is simultaneously applied.
  • the substrate that can be used in the present invention can also form a base material similar to an optical information recording medium such as a CD (Compact Disc), a DVD (Degital Versatile Disc), or an MD (Mini Disc).
  • an optical information recording medium such as a CD (Compact Disc), a DVD (Degital Versatile Disc), or an MD (Mini Disc).
  • the shape of the substrate according to the present invention is not particularly limited, but a disc-shaped substrate (disk) is particularly suitable. In the following description, a case where a disk-shaped substrate is employed will be described as a representative example.
  • FIG. 1 illustrates a preferred embodiment of a disk-shaped substrate that is an embodiment of a substrate that can be suitably employed in the present invention.
  • the disc-shaped substrate 1 shown in FIG. Abbreviated. Is formed into a disk shape using a synthetic resin such as light-transmitting quartz glass, silicon, polycarbonate, or polystyrene, preferably an injection-moldable synthetic resin.
  • a synthetic resin such as light-transmitting quartz glass, silicon, polycarbonate, or polystyrene, preferably an injection-moldable synthetic resin.
  • a hole having a predetermined diameter (or a hole that does not pass through) indicated by reference numeral 2 in FIG. 1 may be formed in the central portion of the substrate 1.
  • a chucking jig such as a spindle (symbol 9), which will be described later, into the hole 2, the substrate 1 can be held or rotated.
  • FIG. 2 shows a partial cross-sectional view showing the basic layer structure of the substrate 1.
  • the substrate 1 basically includes a reflection layer 11 and a light transmission layer 12 that transmits light in a predetermined wavelength range. More preferably, as shown in the example shown in FIG. 2, the light transmission layer 12 is provided on the lower layer side and the reflection layer 11 is provided on the upper layer side. With this contrivance, detection work and the like can be performed by light irradiation from the lower side (back side) of the substrate 1.
  • an apparatus related to the dropping or injection of the sample solution or the like is arranged above the substrate 1.
  • a group of optical devices for detection (reading) can be arranged together.
  • the reflective layer 11 of the substrate 1 is formed to have a film thickness in the range of several nm to several tens of nm.
  • the reflective layer 11 is a single-layer metal material or a single-layer inorganic material, the reflectance with respect to a laser beam for servo operation (see V in FIG. 10) described later is 5% or more, Desirable to be in the range of 50% or less.
  • the reflective layer 11 may be a reflective film having a wavelength selectivity by laminating a plurality of inorganic materials. In this case, it is possible to reflect only the laser beam for servo operation (see symbol V in Fig. 10), so there is no need to worry about the excitation light for fluorescence intensity measurement or the loss of fluorescence.
  • the reflective layer 11 having a laser light reflectance exceeding 50% (for example, a reflectance of 90% or more) without worrying about the influence on the fluorescence intensity measurement is formed. can do.
  • a reactive region forming layer such as a light transmitting layer 12 of the substrate 1 or a synthetic resin (for example, a photosensitive polyimide resin layer) laminated on the light transmitting layer 12.
  • a well-known optical disc mastering technique provides a field of hybridization between a nucleic acid for detection such as a DNA probe and a target nucleic acid, for example, a well-like reaction region R, and the reaction
  • a large number of detection units 3 each including at least one pair of counter electrodes (not illustrated in FIG. 1 because they are minute) or at least one electrode arranged so as to face the region R are arranged (see FIG. 1). .
  • the light transmission layer 12 may have a two-layer structure (not shown). If the upper light-transmitting layer has a refractive index higher than the refractive index of the medium and the lower light-transmitting layer, the focus servo control and positioning servo control described later can be performed accurately and at high speed. I can.
  • each detection unit 3 a detection region (corresponding to a part of the reaction region R) and a servo region are formed.
  • the servo area is provided with a servo mark for radial position control and an address mark for providing address information on the substrate 1 of each detector 3.
  • the detection unit 3 When the detection unit 3 is disposed on the substrate 1 in the circumferential direction or in a spiral shape, the detection region is formed in the order of the servo region, and the servo region is in a discontinuous state.
  • a sample servo system in the field of optical disc technology can be used.
  • the servo mark and address can be formed by a conventional optical disc mastering process. That is, when the substrate 1 is considered as an optical disc, the reaction region R that is the dropping and detection position can be considered as the user data region. In other areas, sync pits can be arranged using a sample servo system, etc., and can also be used as a tracking servo. Furthermore, position information can be obtained by inserting an address section (geographic address on board 1) immediately afterwards. Can be given.
  • the address part starts with the sector one mark force, which is the first pattern, VFO (Variable Frequency Oscillator) that gives the rotational phase of the substrate 1 that is actually rotating, and the address mark, track, and sector that give the start position of the address data Combine ID (Identifer) etc. with the number of.
  • VFO Very Frequency Oscillator
  • the radial information of the substrate 1 is the track position information obtained from the fine error signal and the address mark based on the difference in signal level from the tracking mark located in the 1Z4 track + and-directions in the radial direction, respectively. Based.
  • the entire substrate 1 is placed on a radial stage and driven to rotate, thereby positioning the optical head for performing the ejection head for supplying the medium and the optical pickup for detection. It can be carried out.
  • the control related to the positioning operation of the ejection head and the optical head is performed by the reading side force of the substrate 1 that is placed on the radial stage and rotating. Address of the reproduction signal force obtained by the optical pickup 'tracking error signal and focus error This can be done based on the signal.
  • the surface of the substrate 1 used in the present invention is previously subjected to a surface treatment based on an amphiphilic process.
  • a surface treatment based on an amphiphilic process On the surface of the substrate 1, by forming the surface portion that is hydrophobic and the surface portion that is hydrophilic separately according to the purpose, loss of the aqueous sample solution can be prevented and smooth. It is possible to obtain an effect that a desired biological substance can be guided to the detection surface region.
  • the detection unit 3 is a minute region arranged in a large number on the substrate 1.
  • the detection unit 3 stores an aqueous solution containing a sample or holds a gel (for example, agarose gel), thereby
  • a reaction zone R eg a micro-well-shaped zone
  • the peripheral force of the reaction region R may be replenished with moisture.
  • the detection unit 3 may be arranged on the substrate 1 so as to be easily grouped according to the purpose of the assembly.
  • the detection units in the substrate 1 having a disk shape, can be arranged in a regular manner at a predetermined interval in the circumferential direction, spiral shape, or radial shape.
  • the three detection units can be grouped for each predetermined angular region in the circumferential direction depending on the type of sample substance used and the difference in gene.
  • the shape and size of the reaction region R provided in the detection unit 3 are not particularly limited, but the length, width, and depth are several / zm force and several hundred / zm, respectively. It can be determined based on the spot diameter of excitation light and the minimum amount of sample solution (detection nucleic acid-containing solution, target nucleic acid-containing solution) that can be dropped.
  • a surface (hereinafter referred to as "detection surface") that has been subjected to a surface treatment so as to fix a detection nucleic acid such as a DNA probe can be formed. Keep it.
  • FIG. 3 schematically shows an enlarged view of the detection surface U portion in the reaction region R.
  • the end of the detection nucleic acid D is immobilized on the detection surface U, and the target nucleic acid T hybridized to the detection nucleic acid D is inserted and bound to the double-stranded part.
  • the intercalator I is shown schematically.
  • the detection surface U for example, the surface of a metal thin film such as gold or the surface of an electrode provided so as to face the reaction region R can be used.
  • the surface treatment of the detection surface U for example, the electrode surface
  • a desired detection nucleic acid D such as a DNA probe
  • an amino group-containing silane coupling agent solution or polylysine solution it is possible to adopt a method of performing surface treatment in advance.
  • the surface is treated with an amino group-containing silane coupling agent solution or a polylysine solution.
  • the surface is treated with an amino group-containing silane coupling agent solution after plasma treatment and DUV (Deep UV) irradiation treatment.
  • a substance having a functional group (active group) such as a group, a thiol group or a carboxyl group, cysteamine, streptavidin or the like may be coated.
  • the detection surface that has been surface-treated with streptavidin it is suitable for immobilizing the ends of piotinylated DNA probes.
  • the detection nucleic acid D such as probe DNA modified with a thiol group at its end should be fixed by a disulfide bond (one S-S-bond). Suitable for! /
  • the detection surface U is bonded with an intercalating molecule containing a linker, spacer, etc. for immobilizing the detection nucleic acid D, if necessary.
  • the distance between U and nucleic acid D for detection may be secured to prevent mutual interference. In other words, it may be possible to prevent the detection nucleic acid D from adhering to the detection surface U other than the immobilization site of the detection nucleic acid D.
  • linkers having different molecular lengths are alternately bonded to the detection surface U at predetermined intervals, thereby being immobilized on the detection surface U. You can devise so that the detection nucleic acids D do not interfere with each other.
  • the molecular length of the intervening molecule to be used can be appropriately determined according to the length (number of bases) of the detection nucleic acid D or target nucleic acid T, the distance between the detection nucleic acids D, and the like. For example, assuming that a target nucleic acid T of about 1,600 bases is hybridized to a detection nucleic acid D obtained by extending a probe DNA of LOO base 50-: DNA, the surplus base sequence of the target nucleic acid T The diameter when the part (sequence part that does not form a complementary strand) becomes a random coil-like molecular mass due to Brownian motion can be calculated as 10 to 40 nm.
  • the molecular length of the intercalating molecule (or the intercalated molecule in the extended state) of 10 to 40 nm.
  • the distance between the intervening molecules arranged on the detection surface U is preferably about 10 to 40 nm.
  • the reaction region R of the detection unit 3 is provided with at least a pair of counter electrodes E and E so as to face the reaction region R (see, for example, FIG. 4).
  • the counter electrodes E and E are made of aluminum. It can be formed of a metal such as metal gold or a transparent conductor such as ITO (indium-tin-oxide).
  • the counter electrodes E and E sandwich the detection surface U region in the reaction region R.
  • FIG. 4 shows an arrangement example of a pair of counter electrodes E 1 and E 2. This counter electrode E, E
  • Reference numeral 2 denotes a pair of electrodes having an opposing arrangement provided to apply an electric field to a medium such as an aqueous solution stored in the reaction region R or a held gel.
  • One electrode (for example, E in Fig. 4) is used as an external electrode unit, and it is opposed to the electrode on the substrate 1 side as necessary.
  • the counter electrodes E 1 and E 2 can be obtained by applying an electric field such as a high-frequency AC electric field (described later), for example.
  • nucleic acid molecules detection nucleic acid D, target nucleic acid T
  • detection nucleic acid D detection nucleic acid D
  • target nucleic acid T target nucleic acid
  • 1 2 is free to use when using electrodynamic effects such as electrophoresis or electroosmotic flow.
  • nobridization proceeds between single-stranded nucleic acid molecules that are rounded or entangled in a random coil shape, and therefore affected by steric hindrance.
  • the efficiency of complementary coupling is reduced, and mishybridization is likely to occur.
  • any counter electrode provided in the reaction region R can be energized to the external power source V.
  • the electric current application can be turned on and off by operating the switch s (see, for example, FIG. 4).
  • any counter electrode provided in the reaction region R is subjected to electric field control so that selection of electric field strength, selection of AC and DC, or selection of a high-frequency electric field or a low-frequency electric field can be freely performed. ing.
  • a configuration (see FIG. 6) arranged side by side with a predetermined interval can be exemplified.
  • a plurality of counter electrodes may be provided by appropriately combining these counter electrodes.
  • two pairs of counter electrodes may be arranged in the reaction region R so that their counter axes intersect.
  • a counter electrode EE arranged in the vertical direction and a counter electrode EE arranged in the horizontal direction are formed in each reaction region R.
  • one of the counter electrodes EE is connected to the higher-order structure adjustment or hybridizer of the nucleic acid D for detection.
  • the other counter electrode E-E is used as a high frequency electric field applying means for the purpose of improving the efficiency of the hybridization.
  • Surplus detection nucleic acid D, surplus target nucleic acid T, surplus intercalator I, etc.) and mishybridized nucleic acid molecules should be used as a means for applying an electric field to forcibly remove the detection surface site force to other areas. Can do. Removal work using such an electric field is
  • the removal work by applying an electric field it may be devised to actively use a low-frequency electric field.
  • a low-frequency electric field By applying a low-frequency electric field to the medium in the reaction region R, it is possible to dissociate the nucleic acid molecule from the nucleic acid D for detection by applying an appropriate vibration to the nucleic acid molecule that has been mishybridized.
  • the electric field strength of the low frequency electric field is a regular hybridizer. Do not let Chillon dissociate.
  • capillary action may be used.
  • a suction hole H communicating with the reaction region R and an outside air communication hole H are provided.
  • peripheral surface region of the upper opening of the suction hole H may be made hydrophobic, which is a hydrophilicity opposite to the medium! /.
  • scan electrode group C may be disposed in reaction region R.
  • FIG. FIG. 8 shows a simplified arrangement of electrodes in the detection unit 3. First, a counter electrode E-E is provided, and the common electrode G is connected between the counter electrodes E-E.
  • 1 2 1 2 is provided with a scanning electrode group C in which the respective edges d face each other.
  • the switching operation of the illustrated switches is sequentially performed at a predetermined timing, so that adjacent scanning electrodes (for example, C-C, C-C
  • the electric field can be applied in order, and the extended detection nucleic acid (symbol X) can be bridged between the edges d, d of the adjacent scan electrodes.
  • symbol L in FIG. 8 schematically shows electric lines of force concentrated on the edge d portion of the scanning electrode (Cx, Cy).
  • the electrode surface constituting the counter electrode facing the reaction region R is used as the detection surface U for fixing the detection nucleic acid D such as a DNA probe (see Fig. 3 again). It can be done.
  • the area of the electrode surface on the side that functions as the detection surface U is smaller than the surface area of the other electrode facing the detection surface U.
  • the non-uniform electric field is formed by concentrating the electric field (electric field lines) on the electrode E on the side where the area is narrowed. This facilitates the movement of the nucleic acid molecule to the electrode E side.
  • the surface of the electrode used for the fixing plate that is, the detection surface U is roughened into an uneven shape or has an island shape as shown in FIG. 9, for example.
  • a patterning may also be formed.
  • the detection surface U has an inverted conical shape or a U-shaped recess or conical section. Convex portions such as shapes may be formed regularly.
  • a method for roughening the electrode surface can be performed using, for example, a known sputtering deposition technique, epitaxy deposition technique, or etching technique, but the method is not particularly limited.
  • each electrode is made of a material such as SiO, SiN, SiOC, SiC, SiOF, or TiO.
  • each of the electrodes constituting the counter electrodes E 1 and E disposed so as to be able to apply an electric field to the medium accommodated in the reaction region R of the detector 3 is provided.
  • It may have a shape protruding toward the reaction region R.
  • Electric field lines concentrate on the tip portions el and e2 of such a protruding counter electrode, and a non-uniform electric field is likely to be formed. Therefore, it is preferably used as a fixing site for nucleic acid D for detection. be able to.
  • the power supply to each counter electrode provided in the reaction region R is not particularly limited.
  • an external current supply jig (not shown) is provided at the center of the substrate 1. )) Is formed so as to be exposed on the peripheral wall surface of the hole 2, and the power supply wiring extended from the current conducting part 6 so as to cover the entire board is formed. This can be done through 7 groups.
  • the current-carrying portion 6 can be appropriately selected from shapes such as a circle, a ring, and a divided ring (see FIG. 11) according to the purpose.
  • symbol 21 in FIG. 11 is a notch part formed in order to position the non-illustrated energizing jig and the chucking jig.
  • the current-carrying jig or the chucking jig may be positioned by forming a convex portion or by devising the shape of the hole 2 itself.
  • the specific method of positioning is not particularly limited.
  • the power supply wiring 7 is a first wiring that extends radially from the current-carrying portion 6 of the substrate 1 toward the outer periphery of the substrate.
  • (Core Wiring) 71 a second wiring 72 branched from the first wiring 71 in the circumferential direction, and a third wiring 73 branched from the second wiring 72 and connected to the electrode.
  • the second wiring 72 extends so as to have a concentric or spiral shape when viewed from above.
  • These wirings 71 to 73 are formed in a single layer, divided into a plurality of layers, or straddled, and extended to the wiring board (layer) la.
  • the wiring substrate (wiring layer) la is accurately positioned on the detection substrate lb on which the detection unit 3 is arranged, and is bonded and integrated to form the substrate 1.
  • the configuration of the power supply wiring 7 (71, 72, 73) as described above is adopted, it is used as a reference for the rotation synchronization signal used for reading recorded information or as a reference for the tracking signal. be able to. As a result, there is no need to provide dedicated signals and marks such as pit groups and bar code groups for obtaining these signals on the substrate 1, so that the configuration of the substrate 1 can be further simplified. is there.
  • a DNA chip is produced using the substrate 1 that has been formed into a disk shape having the above-described configuration or structure and that has been subjected to surface treatment.
  • the substrate 1 includes a reaction region R that serves as a hybridization field, and a counter electrode that can be applied to an electric field in a medium stored or held in the reaction region R (for example, a large number of detectors 3 including at least E ⁇ E) are arranged (see FIG. 1). this
  • a so-called “DNA chip” on which a predetermined nucleic acid D for detection is immobilized (assembled) is produced using the substrate 1.
  • Step P for performing surface treatment on the substrate 1 Step P for dropping or injecting a medium containing a nucleic acid D for detection prepared in advance into the reaction region R, and storing or storing in the reaction region R Protection
  • An electric field is applied to the held medium via the counter electrode (for example, E-E).
  • the dielectrophoresis that is an electrodynamic effect obtained by applying an electric field, While the nucleic acid D is elongated, it is immobilized on the electrode surface (for example, the surface) that functions as the detection surface U. Furthermore, a step P for removing excess nucleic acid D for detection from the reaction region R.
  • the manufacturing process of the A chip 10 will be described step by step.
  • a substrate 1 on which a reaction region R capable of providing a hybridization field is formed is used V, and the surface of the substrate is treated with a hydrophobic substance to form a hydrophobic surface.
  • a hydrophilization process in which part of the hydrophobic surface is converted to a hydrophilic surface.
  • a predetermined region or partial region on the substrate 1 can be made a hydrophilic surface or a hydrophobic surface depending on the purpose.
  • a wall surface constituting the reaction region R can be converted to a hydrophilic surface, and the other part (non-reaction region) on the substrate 1 can be made a hydrophobic surface.
  • the biological material is dissolved by surface-treating the substrate 1 so that the reaction region R on the substrate 1 is a hydrophilic surface and the non-reaction region (region not directly involved in the reaction) is a hydrophobic surface.
  • the sample solution or the like When the sample solution or the like is dropped on the substrate 1, the sample solution or the like can be accurately sent to the hydrophilic surface region in the reaction region R or can be reliably retained in the hydrophilic surface region. Monkey.
  • a predetermined portion in the reaction region R on the substrate 1 can be appropriately made a hydrophilic surface or a hydrophobic surface depending on the purpose.
  • the detection surface portion for example, the electrode surface portion
  • the portion other than the detection surface in the reaction region R Only the (non-detection surface) can be converted into a hydrophilic surface.
  • the hydrophobizing step is, for example, an alkylsilane (R—Si—X, X,
  • X, R alkyl group (which may contain unsaturated groups), Xn: Cl, OR) on the surface of the substrate
  • the hydrophilization step for converting a part of the hydrophobic surface into a hydrophilic surface can be easily performed based on a reaction for forming a hydroxyl group on the hydrophobic surface.
  • a hydroxyl group can be added to the alkyl group of the alkylsilane by irradiating the alkylsilane with ultraviolet light in the presence of oxygen.
  • the nucleic acid D for detection prepared in advance is dropped or injected.
  • the nucleic acid D for detection include DNA probes such as DNA oligo strands such as cDNA (complementary DNA) (including cDNA fragments such as EST (Expression sequence tag and ORF (Open reading frame)). .
  • the specific method for dripping or injecting is not particularly limited, but, for example, through a small jet nozzle whose position is controlled by an XYZ operation control system by piezoelectric technology using ink jet printing technology.
  • the sample solution containing the DNA probe can be accurately sprayed onto the reaction region R on the substrate 1.
  • a nucleic acid for detection prepared in advance by a microspotting technology a microspotting pen whose position is controlled by an XYZ operation control system, a capillary, or a tweezers is mounted on the substrate 1.
  • the "inkjet printing method” is a method of applying a nozzle used in an ink jet printer, and using an electricity, the nucleic acid for detection is ejected from the printer head onto the substrate like an ink jet printer and fixed. Is the method.
  • This method includes a piezoelectric inkjet method, a bubble jet (registered trademark) method, and an ultrasonic jet method.
  • the piezoelectric ink jet method is a method in which a droplet is ejected by a displacement pressure generated by applying a pulse to a piezoelectric body.
  • the normal Bubble Jet (registered trademark) method is a thermal method in which droplets are blown by the pressure of bubbles generated by heating a heater in a nozzle.
  • a silicon substrate serving as a heater is embedded in the nozzle and controlled at about 300 ° CZs to create uniform bubbles and push out the droplets.
  • the ultrasonic jet method is a method in which an ultrasonic beam is applied to a free surface of a liquid and a high pressure is locally applied to release a droplet at a local force. No nozzle is required, and droplets with a diameter of about 1 m can be formed at high speed.
  • the “ink jet printing method” a method that has less thermal influence on the medium, such as the “piezoelectric ink jetting method”, can be preferably used. Since the size of the droplet (micro droplet) can be controlled by changing the shape of the pulse to be applied, it is suitable for improving the analysis accuracy. When the radius of curvature of the droplet surface is small, the droplet can be made small, and when the radius of curvature of the droplet is large, the droplet can be enlarged. It is also possible to reduce the radius of curvature by pulling the droplet surface inward by abruptly changing the pulse in the negative direction.
  • micro mecha-cal spotting method uses a microspotting pen, a capillary (capillary tube), or a print head with tweezers attached to a detection surface site on a substrate. It is a way to spot.
  • a device that discharges a discharge rock medium by being driven by a conductive voice coil that vibrates due to an interaction between an induced current generated by electromagnetic induction and an external magnetic field may be employed as the dropping means.
  • the next process P is started and drops in the reaction zone R.
  • An electric field may be applied to the lower or injected medium (step P in FIG. 13).
  • step P Subsequent to step P (see FIG. 12) or simultaneously with step P (see FIG. 13),
  • An electric field is applied to the medium stored or held in the reaction region R on the plate 1 via the counter electrode (for example, E E) in the reaction region R. This will be specifically described below.
  • the single-stranded detection nucleic acid D (eg, DNA probe) is free in the medium of the reaction region R. Existing. At this time, the detection nucleic acid D is present in a higher-order structure rounded in a random coil shape due to the action of Brownian motion.
  • the high frequency electric field is preferably 1 MV / m or more and 500 kHz or more, for example, approximately 1 X 10 / m, approximately 1 MHz is preferably selected (Masao Washizu and Osamu Kurosawa: “Electrostatic Manipulation of DNA in Microfabricated Structures”, IEEE Transaction on Industrial Application Vol. 26, No. 26, p. 1165-1172 (1990)).
  • the nucleic acid D for detection in the form of a random coil is stretched and moved toward the electrode surface where the lines of electric force are concentrated.
  • the modified end site of the detection nucleic acid D can be immobilized on the electrode surface through a coupling reaction or the like (see, for example, the state of FIG. 4). That is, the electrode surface is caused to function as the detection surface U.
  • the application of an electric field can accelerate the movement of the nucleic acid for detection, which is effective for shortening the process time.
  • This process P is not fixed in the reaction zone R, and remains in a free state, leaving an excessive amount.
  • This step is intended to remove and recover the detection nucleic acid D from the reaction region R.
  • the step that can be exemplified is that a buffer solution prepared in advance for washing is dropped or injected into the reaction region, and when this washing solution is recovered, excess nucleic acid for detection is simultaneously removed from the reaction region R. It is a method of removing.
  • the capillary phenomenon can be effectively used by forming a capillary (not shown) so as to communicate with the reaction region R of the substrate 1.
  • the centrifugal force obtained by rotating the substrate 1 by actively utilizing the morphological characteristics of the disc-shaped substrate 1 can be used effectively.
  • the cleaning liquid for example, SSC (Saline-Sodium containing surfactant SDS)
  • Citrate buffer solution or the like can be used.
  • a method that can be exemplified is that a counter electrode (for example, the counter electrode E-E in FIG. 6) different from the counter electrode used for fixing is provided in the reaction region R in advance.
  • a counter electrode for example, the counter electrode E-E in FIG. 6
  • the counter electrode E-E in FIG. 6 different from the counter electrode used for fixing is provided in the reaction region R in advance.
  • the electrodes E, E By applying an electric field with such an intensity that the immobilized nucleic acid for detection does not come off, the electrodes E, E
  • the user himself / herself performs a series of operations of immobilizing the detection nucleic acid D and hybridization, or using the DNA chip 10 on which the nucleic acid D for detection is immobilized. It is considered to be a particularly effective method when performing a look-up work.
  • the child is shown schematically.
  • the substrate 1 in which the detection nucleic acid D is immobilized on the detection surface U of the reaction region R and the excess detection nucleic acid D is removed from the reaction region R is It is packaged and shipped to users as a “DNA chip” with integrated genetic information.
  • the DNA chip is denoted by reference numeral 10.
  • FIG. 14 is a block diagram showing an example of a preferred embodiment of the system.
  • the detection nucleic acid D immobilization system (that is, the DNA chip production system) is used for the means for dropping or injecting the medium and the servo mechanism.
  • the fluorescence detection means is a means relating to hybridization detection.
  • the system shown in Fig. 14 is separated into apparatus components necessary only for the DNA chip manufacturing system and apparatus components necessary only for the hybridization detection system. Designing as a separate system that is specific to the purpose can be done freely. This also applies to the system shown in FIG. 15 and the system shown in FIG.
  • the substrate 1 (or DNA chip 10) shown in FIG. 14 has the form and configuration as described above.
  • This substrate 1 (or DNA chip 10) is fixed to a spindle (jig) 9 protruding above a disk support 8 provided with a rotating means.
  • the spindle 9 is positioned and attached to the hole 2 (see FIG. 1) in the center of the substrate 1 (or 10).
  • the medium M containing the nucleic acid D for detection is dropped or injected into the reaction region R of the substrate in the manufacturing stage of the DNA chip 10, and the medium containing the target nucleic acid T is detected in the hybridization detection stage. M is dripped or injected.
  • These media M and M are generally in the form of a solution or a viscosity-adjusted gel.
  • a plurality of nozzle heads N are arranged on the upper surface lc side (upper side) of the substrate 1 (or DNA chip 10).
  • This nozzle head N A fixed medium M (for example, M to M) is applied to the reaction area scale of the detector 3 arranged at a predetermined position.
  • It is configured so that it can be dripped or injected at a predetermined timing while accurately following.
  • Reference numeral 31 in FIG. 14 simply shows the "control unit” in a block diagram form.
  • the control unit 31 controls the entire operation of dropping or injecting the nozzle head N based on “focus information” for the substrate 1 (or DNA chip 10) and “tracking information” obtained from the substrate 1.
  • the excitation light indicated by the symbol Q in FIG. 14 is information reading light used in the noise detection stage.
  • the excitation light Q is emitted from the laser diode 12, converted into parallel light by the collimator lens L, and then refracted by 90 ° by the dichroic mirror 13.
  • the excitation light Q is refracted by 90 ° by the mirror 14 arranged in front of the traveling direction of the light, and then enters the condenser lens L supported by the actuator 15, and from the back surface Id side of the substrate 1.
  • Reference numeral 16 denotes a signal for controlling the laser diode driver 17 transmitted from the control unit 31.
  • Excitation light Q is reflected by the condenser lens L on the front surface (back surface) of the substrate 1 (or the DN A chip 10).
  • the nozzle head N that drops or injects the medium M containing the nucleic acid for detection, the medium M containing the target nucleic acid, etc. on the substrate 1 (or DNA chip 10) is a pico.
  • An ink jet printing nozzle capable of dropping a small amount of solution is suitable.
  • the number of inkjet printing nozzles which is an example of the nozzle head N, may be prepared as many as the number and type of the medium to be used. By dropping the solution, various media may be handled with a small number of nozzles.
  • medium M containing intercalator 1 (see Fig. 3) can be dropped or injected simultaneously with medium M containing the target nucleic acid.
  • the reaction zone R can be dropped or injected into the reaction region R at a predetermined timing after the digitization, or a predetermined cleaning solution can be dropped or injected into the reaction region R at a predetermined timing after the fixing step. I'll do it for you.
  • the medium When the medium is dropped or injected onto the substrate 1 (or the DNA chip 10), it is recorded in advance on the substrate 1 (or the DNA chip 10) using a servo laser beam V (described later). While reading the address mark information, drop or inject the medium to the desired address (address).
  • the detection nucleic acid D immobilized in advance on the reaction region R (the detection surface thereof) and the target nucleic acid T that is dropped or injected later indicate hybridization, After forming a complementary double-stranded nucleic acid, or simultaneously with the dripping or injection of the target nucleic acid T, an integral force I that can be inserted and bonded to the double-stranded nucleic acid via a predetermined nozzle head N A medium M containing can be dropped or injected into the reaction region R.
  • the interferometer I can be transferred to the reaction region R from the stage before the target nucleic acid ⁇ is dropped or injected.
  • the fluorescence power intercalator indicated by the symbol F is also emitted, and the fluorescence F returns to the back surface Id side of the substrate 1.
  • This fluorescence F is refracted by 90 ° by the mirror 14 disposed below the DNA chip 10, then passes straight through the Dyke mouth mirror 13 disposed in the light traveling direction, and is disposed further forward. Refracted by the dichroic mirror 18 at 90 °.
  • the fluorescence F is incident on the upper lens L and collected, and is guided to the detector 19.
  • the dichroic mirror 18 has a property of reflecting the fluorescence F and a property of transmitting light to a servo laser beam Z described later.
  • the fluorescence intensity is very weak compared to a general optical disk RF signal or the like. Therefore, it is preferable to use a photomultiplier (phototube) or an avalanche photodiode (APD) as the detector 19 for detecting fluorescence, which is very sensitive compared to a general photodiode.
  • a photomultiplier phototube
  • APD avalanche photodiode
  • the fluorescence F detected by the detector 19 is converted into a digital signal 32 having a predetermined number of bits by AD conversion.
  • This digital signal 32 is used, for example, for analysis such as creation of a map in which addresses on the substrate 1 are associated with emitted fluorescence intensity.
  • the actuator 15 is driven in the focus direction (vertical direction) and the tracking direction (circumferential direction) by the actuator 15.
  • the actuator 15 is preferably a two-axis voice coil type of the same type as that used for picking up an optical disk.
  • the substrate 1 (or the DNA chip 10) is held horizontally, and the condensing lens L is installed at a vertically lower position when viewed from the substrate 1 (or the DNA chip 10).
  • the excitation light Q and the servo laser light Z used for the focus servo and tracking servo are irradiated from the back surface side Id of the substrate 1 (or DNA chip 10).
  • the servo laser beam Z is detected by the detection unit of the substrate 1 (or DNA chip 10). Without being affected by the detection nucleic acid D or the target nucleic acid T existing in the medium 3, the light is reflected back from the back surface Id of the substrate 1 (or DNA chip 10).
  • the servo can operate stably without being affected by disturbances such as focus error and tracking error.
  • reference numeral 22 in FIG. 14 denotes a servo laser diode
  • a driver 23 for controlling the diode 22 is disposed behind the servo laser diode.
  • a collimator lens L is arranged in the light emission direction of the servo laser diode 22.
  • the servo laser beam Z is converted into parallel light and directly converted.
  • the diffraction grating 24 shown in FIG. 14 is placed between the collimator lens L and the dichroic mirror 25 of the servo laser optical system.
  • the diffracted 0th order and ⁇ 1st order light is transmitted through the condenser lens L to the substrate 1 (or DNA).
  • Reference numeral 26 in FIG. 14 denotes a detector of servo laser reflected light.
  • the driver 23 and the detector 26 are controlled by the control unit 31 (see FIG. 12).
  • the wavelength of the excitation light Q, the wavelength of the fluorescence F, and the wavelength of the laser light Z may be different from each other.
  • the reflective layer 11 (see FIG. 2) provided on the substrate 1 has a predetermined degree of transmission with respect to the wavelength of the fluorescence F. Physical properties that have optical properties (transmittance) and reflectivity of laser light that can be operated by servo are required.
  • the reflectance / transmittance has wavelength dependence, it does not matter, and preferably has a low-pass filter-like frequency characteristic. In the case of a single wavelength, it is difficult to improve both the transmittance of fluorescence F and the reflectance of laser light Z. By making it wavelength dependent, the transmittance of fluorescence F and laser The reflectance of light Z can be improved.
  • FIG. 15 is a conceptual diagram schematically showing an example of a preferred embodiment of a substrate processing apparatus in which the components of the system are integrated.
  • This substrate processing apparatus can be used as a DNA chip manufacturing apparatus, a hybridization detection apparatus, or an apparatus responsible for both DNA chip manufacturing and hybridization detection. It should be noted that the arrangement of each means constituting the substrate processing apparatus according to the present invention is not limited to the embodiment shown in FIG.
  • reference numeral 100 shown in FIG. 15 exemplifies an apparatus in which all the means necessary for manufacturing the DNA chip 10 and detecting hybridization are integrated. That is, this device 100 is shown in FIG. 14, and all the means are integrally arranged at a predetermined location.
  • Nucleic acid for detection D is an environment setting means 104 that functions as a heating means that can control the temperature environment of the assembly such as immobilization and hybridization, and a humidification means that can control humidity conditions, and the detection nucleic acid Supply means N for supplying the target nucleic acid to the fixed reaction region, and reading means 103 for reading the status of the hybridization.
  • the substrate introduction means and the substrate take-out means may be the common means 101 as shown in FIG. 15, or may be separated means.
  • target nucleic acid T (cDNA) is automatically amplified from mRNA or the like extracted from cells, tissues, etc., and introduced into supply means N (nozzle head N).
  • the hybridization detection assembly may be more automated.
  • the supply means N, the environment setting means 104 including the heating means, the reading means, the substrate inlet, and the substrate outlet are arranged in series. You may do it. This is because the substrate transport path is linear, and the apparatus configuration can be simplified.
  • the substrate 1 or the DNA chip 10 is sealed in the storage section 102, and the temperature and humidity are set within a range suitable for the assembly by the environment setting means 104, and then the detection nucleic acid D Such as dripping or injecting, fixation, dripping or injecting target nucleic acid T or intercalator, electric field application, hybridization, washing or removing work, detection (reading), etc. are automatically performed at a specified timing. It functions as a device that can be used.
  • the apparatus 100 can implement a method for treating a substrate having a reaction region on its surface that can provide a hybridization field.
  • a nuclear acid supply step (which may be humidified) for supplying the target nucleic acid T to the reaction region R on which the detection nucleic acid D is immobilized, and the substrate on which the target nucleic acid T is supplied 1 (or DNA chip 10) It is possible to carry out a method in which a reading process (for example, an optical reading process) for reading the state of the blinding is successively performed. In addition, a step of applying an electric field to the reaction region R of the substrate can be performed to improve hybridization efficiency and detection accuracy.
  • a reading process for example, an optical reading process
  • Drying of the medium can be prevented by performing humidification in the nucleic acid supply step.
  • the temperature control step hybridization between the detection nucleic acid D and the target nucleic acid T fixed in the reaction region R can be performed by setting an optimum temperature condition.
  • FIG. 16 is a conceptual block diagram of a substrate processing system that can be employed in the manufacture of a DNA chip or the detection of Z and hybridization.
  • the automatic processing system 200 shown in Fig. 16 can be used as an automation system that is particularly suitable when a large amount of fixing work or hybridization detection work is performed.
  • the concept and configuration of the automation system may be applied to the substrate processing apparatus 100.
  • the system 200 includes a first stocker 201 capable of stocking a predetermined number of substrates 1 (unfixed) and DNA chips 10 (fixed).
  • the first stocker 201 includes a space that can be sealed, and includes means that can control temperature and humidity conditions.
  • the first stocker 201 automatically identifies the stocked substrate 1 and the DNA chip 10 and discharges them toward another stage, or the substrate 1 and DNA chip that have been sent to other stages. It has a function of identifying 10 and accommodating it in a designated location.
  • the present system 200 is configured so that the substrate 1 (or DNA chip 10) can be transferred to and from the first stocker 201 in both directions, and the nozzle head N, the medium reservoir, and the medium It includes a spotting stage 202 on which a control unit (see FIG. 14) for controlling dropping or injection is arranged.
  • a hybridizing stage 203 having an energizing means for applying an electric field, a means for controlling electric field application, and a means for controlling temperature and humidity is provided.
  • the hybridization 'stage 203 can transfer the substrate 1 (or DNA chip 10) in both directions between the first stocker 201 and the spotting' stage 202. It is configured to function.
  • a plurality of spotting 'stages 202 may be provided. In this case, different detection nucleic acids D are dropped or injected into each spotting' stage 202.
  • Reference numeral 204 in Fig. 16 denotes a detection (reading) stage.
  • This detection stage 204 is provided with optical system means for detection or servo (see FIG. 14), rotation means for the DNA chip 10, servo mechanism, and the like.
  • This detection stage 204 is a place for detecting the hybridization state in each detection section 3 of the DNA chip 10 where the hybridization is completed, and is connected to an analysis section and a display section (not shown). Has been. This detection stage 204 is configured so that the DNA chip 10 can be transferred in both directions between the hybridization stage 203 or the first stocker 201.
  • Reference numeral 205 denotes a second stocker, which is a place where the DNA chip 10 for which detection work has been completed in the detection stage 204 is collected and stocked.
  • the second stocker 205 may receive and collect the substrate 1 and the DNA chip 10 from the spotting 'stage 202 and the hybridization' stage 203.
  • FIG. 17 is a diagram showing an example of a process flow of the hybridization detection method
  • FIG. 18 is a diagram showing another process flow of the method.
  • the DNA chip 10 on which the nucleic acid D for detection has already been aligned and fixed is fixed horizontally on the disk support 8 (see Fig. 14). Then, while the focus servo and tracking servo are operated, the DNA chip 10 is rotated, and the medium M containing the target nucleic acid is dropped through the nozzle head N to the selected detection unit 3 while detecting the address information. Or note
  • the application of the electric field can solve problems such as steric hindrance, so that the hybridization reaction can be completed in a very short time.
  • the processes P and P are performed separately, but may be performed simultaneously.
  • the detection unit 3 unit is devised to include a heating unit that can select the reaction temperature condition and a temperature detection unit that detects the temperature of the medium of the detection unit 3, and the detection unit 3 Based on the optimum reaction conditions between the nucleic acid D and the target nucleic acid T, the heating means is controlled and operated to set optimum temperature conditions for the three detection units, and the detection You can devise to promote the hybridization between the nucleic acid D and the target nucleic acid T.
  • a fluorescently labeled intercalator I is dropped or injected into the reaction region R via the nozzle head N, and the intercalator I is obtained by the hybridization.
  • the double-stranded nucleic acid is inserted and bound (step indicated by symbol P in FIG. 17). Also this
  • the process P may be performed simultaneously with the processes P and P. Furthermore, it will be described later.
  • Substance B for example, excess target nucleic acid or excess intercalator, see FIG. 7 may be removed from the hybridization region (detection surface region) (step indicated by symbol P in FIG. 17). ).
  • the excitation light Q having a predetermined wavelength is applied to the reaction region scale.
  • the fluorescence intensity obtained by irradiation is measured by the optical pickup means (see Fig. 14) of the above system. To detect (step indicated by symbol P in FIG. 17).
  • the intensity of the fluorescence F emitted from the intercalator is also detected, and the state of hybridization between the nucleic acid substance for detection and the target nucleic acid is judged.
  • the detector output is converted to a digital signal 32 with a specific number of bits by AD conversion 20 (see Fig. 12).
  • FIG. 18 shows a step P of dropping or injecting the target nucleic acid T and a drop of the intercalator.
  • Electrode 10 is the step of immobilizing a nucleic acid for detection when the DNA chip 10 is produced from the substrate 1, or the hybridizer at the time of hybridization detection using the DNA chip 10. It can be appropriately employed in the initialization process and the processes before and after it depending on the effect of each electric field application example.
  • the electric field strength, frequency, and application time are not limited. It is desirable to select an appropriate electric field strength, frequency, and application time depending on the type, length, etc. of the nucleic acid.
  • the waveform is not limited to a sine wave, but may be a triangular wave, for example.
  • FIG. 19 shows the low frequency indicated by the symbol W immediately after the high frequency electric field indicated by the symbol W is applied.
  • Fig. 1 shows an example of electric field application when a two-wave electric field is applied.
  • Fig. 20 shows an example of electric field application where the low-frequency electric field W application part in Fig. 19 is a low-frequency rectangular AC electric field indicated by the symbol W.
  • FIG. 21 shows a modification of FIG. 19, in which the electric field is set to 0 after applying the high-frequency electric field W (see the W part in the figure), and the target nucleic acid brown collected by the dielectrophoretic effect around the electrode. motion After allowing time for natural hybridization to occur, the low-frequency electric field w
  • a time W of the electric field 0 may be provided.
  • Fig. 23 shows that the DC electric field W is applied before the high-frequency electric field W is applied.
  • An example of electric field application is shown in which a target nucleic acid is attracted to an electrode by electrophoresis, followed by applying a high-frequency electric field W and then applying a low-frequency electric field W.
  • Figure 24 shows the application of a high-frequency electric field W in which a DC component is also applied simultaneously.
  • Figure 25 shows that after applying a high-frequency electric field W, a low-frequency electric field W to which a DC component is also applied is applied, and by electrophoresis, excessive non-complementary target nucleic acids and mistakes are detected.
  • the example shows the application of an electric field that synergizes the effect of pulling off the force near the electrode of a complementary target nucleic acid that cannot be fully developed due to steric hindrance.
  • Figure 26 shows the target by electrophoresis using a high-frequency electric field W to which a DC component is simultaneously applied.
  • Sarasuko uses low frequency electric field W or low frequency AC electric field W.
  • hybridization in a minute reaction region provided on a substrate can be efficiently advanced, so that the time for the hybridization can be greatly reduced.
  • conditions and environments in which accurate hybridization can easily proceed can be provided, the occurrence of false positives and false negatives can be suppressed, and detection accuracy can be greatly improved.
  • the present invention can be used as an apparatus, a system, and a method capable of efficiently performing hybridization detection in a short time and capable of performing hybridization detection with high detection accuracy. Can do.

Abstract

　ハイブリダイゼーションを短時間で効率よく進行させることができ、かつ高精度な検出結果が得られるＤＮＡチップ関連技術を提供することを目的とする。ハイブリダイゼーションの場となる反応領域Ｒと、該反応領域Ｒに貯留又 保持される媒質に電界印加可能に配置される対向電極（Ｅ１－Ｅ２，など）と、を少なくとも備える検出部３が配設されてなる円盤状基板１あるいはＤＮＡチップ１０を用いて、前記対向電極を用いた電界印加によって、前記検出用核酸Ｄを検出表面Ｕに固定化したり、検出用核酸Ｄと標的核酸Ｔをハイブリダイゼーションさせたり、余剰物質Ｂを除去したりすることにより、ハイブリダイゼーションを短時間で効率よく進行させ、かつ高精度な検出結果を得る。 

Description

明 細 書
DNAチップの製造方法と製造システム、ハイブリダィゼーシヨン検出方法 と検出システム、並びに基板処理装置と基板処理方法
技術分野
[0001] 本発明は、 DNAチップに係わる技術に関する。より詳しくは、 DNAチップの製造 方法と製造システム、ハイブリダィゼーシヨン検出方法と検出システム、並びに基板 処理装置と基板処理方法に関する。
背景技術
[0002] 1970年代頃に開発されたハイブリダィゼーシヨンを検出するためのアツセィ技術で は、ニトロセルロース膜などの多孔膜材料、放射性標識技術、オートラジオグラフィー 技術などが主に用いられて 、た。
[0003] し力し、近年、マイクロアレイ技術によって所定の DNAが微細配列された、 、わゆ る DNAチップ又は DNAマイクロアレイ（以下、本願では「DNAチップ」と総称。）と呼 ばれるバイオアツセィ用の集積基板が、遺伝子の変異解析、 SNPs (—塩基多型)分 析、遺伝子発現頻度解析等に利用されるようになり、創薬、臨床診断、薬理ジエノミク ス、進化の研究、法医学その他の分野において広範囲に活用され始めている。
[0004] この「DNAチップ」は、ガラス基板やシリコン基板上に多種'多数の DNAオリゴ鎖 や cDNA (complementary DNA)等が集積されていることから、ノ、イブリダィゼーショ ンの網羅的解析が可能となる点が特徴とされている。
[0005] この DNAチップによる解析手法の一例を簡潔に説明すれば、ガラス基板ゃシリコ ン基板上に保持された DNAプローブに対して、細胞、組織等カゝら抽出した mRNA を逆転写 PCR反応等によって蛍光プローブ dNTPを組み込みながら PCR増幅し、 前記基板上にぉ 、てハイブリダィゼーシヨンを行った後に、所定の検出器で蛍光測 定を行うという手法である。
[0006] この DNAチップを作製するための技術は、現在、半導体露光技術を利用したフォ トリソグラフィー (photolithogrphy)、圧電技術 (piezoelectric technology)などのインク ジエツティング（ink- jetting)を利用した技術、メカ-カルマイクロスポッティング (mecha nical microspotting)などの技術を駆使して行われており、これらの技術には一長一短 があるとされている。しかし、いずれの技術でも、試料の拡散や吸収が起こることがな ぐかつ試料が微量で足りる等の理由から、表面が平滑で均一な非多孔性のガラス 製又は合成樹脂製の基板表面を用いることを前提として 、る。
[0007] この「DNAチップ」は、概ね二つのタイプに大別できる。第 1のタイプは、上記フォト リソグラフィ一の技術を用いて、所定の基板上に直接オリゴヌクレオチドを合成してい くものであり、ァフィメトリタス社 (Affymetrix社）によるものが代表的である（例えば、 特表平 4 505763号公報参照)。この種のチップは、集積度は高いが、基板上での DNA合成には限界があって、数十塩基程度の長さである。
[0008] 第 2のタイプは、「スタンフォード方式」とも称されるもので、先割れピンを用いて、予 め用意された DNAを基板上に分注 ·固相化していくことによって作製されるものであ る（例えば、特表平 10— 503841号公報参照)。この種のチップは、集積度は前者に 比べて低いが、 lkb程度の DNA断片を固相化できるという利点がある。
[0009] 次に、現在既に提案されている DNAチップの多くは、概ね、特開 2000— 60554 号公報 (特に、請求項 1、図 1参照）に開示されている形態の DNAチップのように、矩 形状の基板上を区画割りした構成のものが多ぐ基板上の各区画にプローブを保持 し、そこで、ハイブリダィゼーシヨンを進行させる。この特開 2000— 60554号公報に は、区画にゲルを導入し、電気泳動により試料ポリヌクレオチドを移動させる技術も開 示されている。
[0010] DNAチップ上の所定の反応領域で進行したハイブリダィゼーシヨンの検出又は読 み取りに係わる作業は、現在、核酸分子に標識される蛍光色素物質力 得られる蛍 光を検出（蛍光スキャニング)するシステム等を用いるのが一般的である。
[0011] この蛍光検出システムは、前記蛍光物質に所定の励起光を照射して得られる蛍光 を検出するシステムである。このシステムによれば、旧来の放射性物質に代わって蛍 光物質を用いるので、検出の迅速化、精度及び安全性の向上を達成することができ るよつになった。
[0012] 蛍光の検出作業では、共焦点スキャニング装置（confocal scanner)や CCDカメラを 用いたイメージングなどの技術が利用されて 、る。 DNAチップ力 放出された蛍光 が所定の検出装置によってデジタル出力に変換される。そして、これに続いて、デー タファイルの定量と解析が行われる。
[0013] 次に、荷電して存在する物質に対する電界の作用に係わる技術が知られて 、る。
具体的には、二本鎖核酸分子は、液相中において電界の作用を受けると伸長又は 移動することが知られている。その原理は、骨格をなすリン酸イオン (陰電荷)とその 周辺にある水力 Sイオンィ匕した水素原子（陽電荷）とによってイオン曇を作っていると考 えられ、これらの陰電荷及び陽電荷により生じる分極ベクトル (双極子）が、高周波高 電圧の印加により全体として一方向を向き、その結果として伸長し、カロえて、不均一 電界が印加された場合、電気力線が集中する部位に向力つて移動する（Seiichi Suzu ki, Takeshi Yamanashi, Shin-ichi Tazawa, usamu Kurosawa and asao Washizu: Q uantitative analysis on electrostatic orientation of DNA in stationary AC electric fiel d using fluorescence anisotropy ,ΙΕΕΕ Transaction on Industrial Applications, Vol.3 4,No.l,P75- 83(1998)参照）。
[0014] また、数十から数百/ z mのギャップを持つ微細電極中に DNA溶液をおき、ここに 1 MVZm、 1MHz程度の高周波電界を印加すると、ランダムコイル状で存在する DN Aに誘電分極が生じ、その結果、 DNA分子は電界と平行に直線状に引き伸ばされ る。そして、「誘電泳動」と呼ばれる電気力学的効果によって、分極した DNAは自発 的に電極端へと引き寄せられ、電極エッジにその一端を接した形で固定される（鷲津 正夫、「見ながら行う DNAノヽンドリング」、可視化情報 Vol. 20 No. 76 (2000年 1 月）参照)。
[0015] カロえて、電気的効果を利用する DNAチップ技術としては、例えば、 DNAプローブ に直流電圧を印加することで、相補鎖を形成した DNAと相補鎖を形成しな力つた D NAを分離したり、引き伸ばしたりする生体高分子検出装置が提案されている (特開 2 002— 168864号公報 (特に、段落 0015、図 7参照）参照)。また、電極ピンにオリゴ ヌクレオチドが固定された構成を備える DNAチップも提案されている（特開 2001— 241315号公報参照)。
[0016] 現在提案されて!、る様々な DNAチップ技術は、端的に言えば、物質間の相互作 用の場、即ちハイブリダィゼーシヨンの場を提供する反応領域を基板上に予め設定し ておき、この反応領域中にプローブ DNA等の検出用核酸を固定しておくことによつ て、この検出用核酸と相補的な標的核酸との間の相互作用であるハイブリダィゼーシ ヨンを解析する技術であると言える。
[0017] し力し、従来の DNAチップ技術においては、その程度の差はあれ、ハイブリダィゼ ーシヨンの効率は、当該技術の普及拡大にはいまだ不満足なレベルであるという問 題を有している。これは、主に、（1)核酸の高次構造が丸まったり、絡まったりした状 態（ランダムコイル状態）になり易いため、ノ、イブリダィゼーシヨンの際に、いわゆる立 体障害が発生して塩基部分が相補結合し難いという点、（2)検出用核酸の周辺の基 板表面に標的核酸等や検出関連物質が付着してハイブリダィゼーシヨンの障害とな る点、などが主原因となっている。これらの原因を解決できれば、 DNAチップを用い たアツセィ時間を大幅に短縮ィ匕できる。
[0018] また、従来の DNAチップ技術では、ミスハイブリダィゼーシヨンの発生等によって、 擬陽性や偽陰性の発生が無視できない程度に頻出してしまうという問題を抱えてい る。即ち、従来の DNAチップ技術においては、検出精度の向上が必要となっている
[0019] この検出精度の向上を図るためには、まず、第一に、ハイブリダィゼーシヨンの精度 を高めることができる反応場の条件や環境を案出することが根本的に必要であると考 えられる。第二に、従来の DNAチップ技術では、検出の際の障害となる不要な物質 (例えば、ハイブリダィゼーシヨンしな力つた遊離状態の一本鎖核酸など)を、検出作 業前に所定の水溶液で反応場力 洗浄除去する作業が必須であるが、この洗浄除 去作業が、検出精度に好ましくない影響を与えることがあるため、この問題を解決し なければならない。
[0020] 更には、今後、ハイブリダィゼーシヨンの網羅的解析のニーズが更に拡大していく ならば、基板上の情報集積量の増カロ、多数又は多様な遺伝子の同時解析、解析技 術の簡易化、解析装置やチップ基板などの低コスト化に寄与できる新規技術が更に 要求されて!ヽくことになると考えられる。
[0021] そこで、本発明は、基板上に対して遺伝子情報を効率よく集積（固定化)する技術 やハイブリダィゼーシヨンを短時間で効率よく進行させることができ、かつ高精度な検 出結果が得られる技術などを包含する DNAチップの製造方法と製造システム、ハイ ブリダィゼーシヨン検出方法と検出システム、並びに基板処理装置と基盤処理方法を 提供することを目的とする。
発明の開示
[0022] 本発明では、以下に説明する、（l) DNAチップの製造方法、（2) DNAチップの製 造システム、 （3)ハイブリダィゼーシヨン検出方法、（4)ハイブリダィゼーシヨン検出シ ステム、 （5)基板処理装置、（6)基板処理方法を提供する。
[0023] (l) DNAチップの製造方法。
[0024] 第一に、本発明では、ハイブリダィゼーシヨンの場となる反応領域と、該反応領域に 貯留又保持される媒質に電界印加可能に配置される対向電極と、を少なくとも備える 検出部が配設されてなる基板を用いて行う「DNAチップの製造方法」を提供する。
[0025] 具体的には、基板の表面処理を行う工程と、前記反応領域に貯留又は保持され、 予め調整された検出用核酸を含む媒質に対して、前記対向電極を介して電界印加 を行うことによって、前記電極表面に前記検出用核酸を固定する工程と、余剰の前 記検出用核酸を前記反応領域から除去する工程と、を少なくとも行う DNAチップの 製造方法を提供する。
[0026] 基板の表面処理を行う工程は、例えば、基板の親媒性加工を行う工程である。また 、前記媒質は、前記反応領域に対して滴下又は注入することにより、貯留又は保持さ れる。
[0027] 前記基板を回転させながら前記媒質の滴下又は注入を行なうようにしてもよい。電 界印加では、この電界印加による誘電泳動に基づいて検出用核酸を移動させるェ 程を含む。また、この電界印加は、高周波電界であり、さらにこの高周波電界は、 1M VZm以上及び 1MHz以上が望まし 、。
[0028] (2) DN Aチップの製造システム。
[0029] 第二に、本発明では、ハイブリダィゼーシヨンの場となる反応領域と、該反応領域に 貯留又保持される媒質に電界印加可能に配置される対向電極と、を少なくとも備える 検出部が配設されてなる基板を用いる DNAチップの製造システムを提供する。
[0030] 具体的には、予め調整された検出用核酸を含む媒質を前記反応領域に滴下又は 注入する手段と、前記反応領域に貯留又は保持された前記媒質に対して、前記対 向電極を介して電界印加を行う手段と、を少なくとも備える DNAチップの製造システ ムを提供する。
[0031] さらに、同システムでは、媒質を前記反応領域に滴下又は注入にして、貯留または 保持するためのスポッティング手段や前記反応領域に存在する余剰の前記検出用 核酸を前記反応領域から除去する手段を備える。前記電界印加手段は、高周波電 界印加手段を好適に採用でき、前記基板は、好適には、例えば円盤状基板であり、 この円盤状基板を回転させる手段を備えるようにしてもよい。また、滴下又は注入す る手段は、基板の回転に同期して前記反応領域に媒質を供給するようにしてもよい。
[0032] (3)ハイブリダィゼーシヨン検出方法。
[0033] 第三に、本発明では、ハイブリダィゼーシヨンの場となる反応領域と、該反応領域に 貯留又保持される媒質に電界印加可能に配置される対向電極と、前記反応領域中 に固定された検出用核酸と、を少なくとも備える検出部が配設されてなる基板を用い る「ハイブリダィゼーシヨン検出方法」を提供する。
[0034] 具体的には、予め調整された標的核酸を含む媒質を前記反応領域に滴下又は注 入する工程と、前記反応領域に貯留又は保持された前記媒質に前記対向電極を介 して電界印加を行う工程と、前記検出用核酸と前記標的核酸との間のハイブリダィゼ ーシヨンを進行させる工程と、前記反応領域にインターカレータを滴下又は注入する 工程と、所定波長の励起光を前記反応領域に照射して得られる蛍光強度を検出す る工程と、を少なくとも行う「ハイブリダィゼーシヨン検出方法」を提供する。なお、前記 電界印加を行う工程の電界印加は、前記基板を一括又はブロック領域毎に行うよう にしてもよい。
[0035] この方法では、「標的核酸を含む媒質を反応領域に滴下又は注入する工程」と「こ の反応領域にインターカレータを滴下又は注入する工程」を同時に行うようにして、 工程を簡略ィ匕してもよい。ハイブリダィゼーシヨンは、電界印加の状態で行うようにし てもよく、場合によっては、電界オフの状態で行うようにしてもよい。
[0036] また、少なくとも検出工程を行う前の段階で、反応領域中に存在する余剰の標的核 酸を、ハイブリダィゼーシヨン領域から除去する工程を行うようにして、検出精度を向 上させてもよい。この除去工程は、電界印加によって、ハイブリダィゼーシヨン領域外 の電極表面に余剰の標的核酸を引き寄せる方法でもよい。
[0037] 検出等に用いる励起光は、好適には基板の裏面側から照射するように工夫する。
本方法で用いる基板を回転させながら、予め調整された標的核酸を含む媒質を前記 反応領域に滴下又は注入する工程や反応領域にインターカレータを滴下又は注入 する工程、あるいは、所定波長の励起光を前記反応領域に照射して得られる蛍光強 度を検出する工程を行う。
[0038] (4)ハイブリダィゼーシヨン検出システム。
[0039] 第四に、本発明では、ハイブリダィゼーシヨンの場となる反応領域と、該反応領域に 貯留又保持される媒質に電界印加可能に配置される対向電極と、前記反応領域中 に固定化された検出用核酸と、を少なくとも備える検出部が配設されてなる基板を用 V、る「ノヽイブリダィゼーシヨン検出システム」を提供する。
[0040] 具体的には、予め調整された標的核酸を含む媒質を前記反応領域に滴下又は注 入する手段と、前記反応領域に貯留又は保持された前記媒質に前記対向電極を介 して電界印加を行う手段と、前記検出用核酸と前記標的核酸との間のハイブリダィゼ ーシヨンを進行させる手段と、前記反応領域にインターカレータを滴下又は注入する 手段と、所定波長の励起光を前記反応領域に照射して得られる蛍光強度を検出す る手段と、を少なくとも備えるハイブリダィゼーシヨン検出システムを提供する。
[0041] 前記基板は、前記励起光を透過する層を備えるようにし、該励起光の光源は、好適 には、基板の裏面側に配置する。これにより、基板上方領域には媒質の滴下又は注 入装置群を配置し、同下方領域にはハイブリダィゼーシヨン検出に係わる光学的装 置群を配置することができる。その結果、検出装置全体のコンパクト化や装置構成の 簡略化を達成できる。
[0042] また、本システムでは、前記ハイブリダィゼーシヨンの温度制御手段又は Z及び湿 度制御手段や前記反応領域に水分等の溶媒を補給する手段を設けて媒質の乾燥 を防止してもよい。
[0043] 前記基板の円盤状基板の回転手段を有するように工夫し、さらには、この基板の前 記検出部の位置決め用サーボ手段及びフォーカスサーボ手段を設けるようにする。 [0044] (5)基板処理装置。
[0045] 第五に、本発明では、ハイブリダィゼーシヨンの場を提供し得る反応領域をその表 面に有する基板を処理するための装置であって、検出用核酸が固定された前記反 応領域に標的核酸を供給する供給手段と、前記標的核酸が供給された前記基板の 温度制御を行うための加熱手段と、前記基板のハイブリダィゼーシヨンの状況を読取 る読取り手段と、前記基板を搬送する搬送手段と、を有する基板処理装置を提供す る。本装置では、さらに、前記基板に電界を印加する手段を備えるように工夫し、前 記読取り手段としては、例えば、光学的読取り手段を好適に採用可能である。
[0046] また、本装置では、基板が前記搬送手段によって、前記供給手段と前記加熱手段 と前記読取り手段の間を連続的に搬送されるようにしたり、前記供給手段と前記加熱 手段と前記読取り手段を直列に配置したり、前記供給手段に加湿手段を設けるよう にしてもよい。
[0047] 次に、本装置では、前記供給手段に向けて前記基板を導入するための基板導入 手段と、前記読取り手段から前記基板を取り出すための基板取り出し手段を設け、ま た、基板導入手段と基板取り出し手段を共通の手段としてもよい。また、前記供給手 段と、前記加熱手段と、前記読取り手段と、前記基板の導入口と、前記基板の取り出 し口と、を直列に配置するように工夫してもよい。
[0048] さらには、本装置では、検出用核酸が固定された (基板の)反応領域に対して溶媒 を供給する第二の供給手段や血液から核酸を抽出する抽出手段を設けることもでき る。
[0049] (6)基板処理方法。
[0050] 第六に、本発明では、ハイブリダィゼーシヨンの場を提供し得る反応領域をその表 面に有する基板を処理するための方法であって、検出用核酸が固定された前記反 応領域に対して標的核酸を供給する核酸供給工程と、前記標的核酸が供給された 前記基板の温度を制御する温度制御工程と、前記反応領域におけるハイブリダィゼ ーシヨンの状態を読取るための読み取り工程と、を有し、上記各工程を順次連続的に 行うように工夫した基板処理方法を提供する。
[0051] また、本方法においては、前記基板に電界を印加する工程を行うようにしてもよい。 例えば、核酸供給工程の段階やハイブリダィゼーシヨンを進行させる段階などで電界 印加を行うことによって、ハイブリダィゼーシヨン効率の向上やハイブリダィゼーシヨン 検出精度の向上に役立つように、核酸分子に対して電気力学的効果を与えるができ る。
[0052] 前記した温度制御工程では、例えば、ノ、イブリダィゼーシヨンの至適温度を設定す る工程として利用し、検出用核酸と標的核酸との間のハイブリダィゼーシヨンを進行さ せることができる。
[0053] また、本方法では、読取り工程を光学的読取り工程としたり、核酸供給工程と温度 制御工程と読取り工程の各工程間で基板が搬送されるようにしたり、あるいは、核酸 供給工程の段階で加湿を行ったりするように工夫することができる。
[0054] ここで、本発明で使用する主たる技術用語の定義付けを行う。
[0055] 「検出用核酸」とは、反応領域に貯留又は保持された媒質中に固定又は遊離の状 態で存在し、当該核酸分子と特異的に相互作用する相補的塩基配列を有する核酸 分子を検出するための探り針 (検出子)として機能する核酸分子である。代表例は、 DNAプローブなどのオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドである。「標的核酸」とは 、前記検出用核酸と相補的な塩基配列を有する核酸分子である。
[0056] 「核酸」とは、プリンまたはピリミジン塩基と糖がグリコシド結合したヌクレオシドのリン 酸エステルの重合体 (ヌクレオチド鎖）を意味し、プローブ DNAを含むオリゴヌクレオ チド、ポリヌクレオチド、プリンヌクレオチドとピリミジンヌクレオチォドが重合した DNA (全長あるいはその断片）、逆転写により得られる cDNA(cプローブ DNA)、 RNA、 ポリアミドヌクレオチド誘導体 (PNA)等を広く含む。
[0057] 「ハイブリダィゼーシヨン」は、相補的な塩基配列構造を備える間の相補鎖（二本鎖 )形成反応を意味する。「ミスノ、イブリダィゼーシヨン」は、正規ではない前記相補鎖形 成反応を意味し、本発明では、しばしば「ミスハイプリ」と略称する。
[0058] 「反応領域」は、ハイブリダィゼーシヨンその他の相互作用の反応場を提供できる領 域であり、例えば、液相やゲルなどを貯留できるゥエル形状を有する反応場を挙げる ことができる。この反応領域で行われる相互作用は、本発明の目的や効果に沿う限り において、狭く限定されない。 [0059] 「対向電極」は、電極面が向かい合った状態で配置される少なくとも一対の電極を 意味する。「対向軸」とは、対向する二つの電極面の中心同士を結ぶ直線によって形 成される軸を意味する。「交差」とは、交点を形成する同一平面上での交差の場合や 交点を形成しないで立体交差する場合の双方を含み、交差する角度については、直 交する角度以外にも、本発明の目的や効果が得られる構成であれば採用できる。
[0060] 「余剰物質」とは、反応領域中に存在するプローブ DNA等の検出用核酸の余剰の ものゃ該検出用核酸と相補的な塩基配列部分を備える標的核酸のうちの余剰のもの 、あるいはノ、イブリダィゼーシヨンの結果得られる相補鎖に挿入結合される特性を備 える、いわゆる「インターカレータ」のうちの余剰のものなどが含まれる。
[0061] 「インターカレータ」は、二本鎖核酸に挿入結合可能な蛍光標識された物質であり、 ハイブリダィゼーシヨン検出に用いられる物質である。例えば、 POPO—1や TOTO 3を用いることができる。
[0062] 「立体障害（steric hindrance)」は、分子内の反応中心等の近傍に嵩高い置換基の 存在や反応分子の姿勢や立体構造 (高次構造）によって、反応相手の分子の接近が 困難になることによって、所望の反応 (本願では、ノ、イブリダィゼーシヨン）が起こり難 くなる現象を意味する。
[0063] 「誘電泳動」は、電界が一様でな!、場にお!、て、分子が電界の強!、方へ駆動する 現象であり、交流電圧をかけた場合も、かけた電圧の極性の反転につれて分極の極 性も反転するので、直流の場合と同様に駆動効果が得られる (監修'林 輝、「マイク ロマシンと材料技術（シーエムシー発行）」、 Ρ37〜Ρ46 ·第 5章 ·細胞および DNAの マニピュレーション参照）。
[0064] 「DNAチップ」は、 DNAプローブなどの核酸が固定ィ匕されて微細配列された状態 のハイブリダィゼーシヨン検出用基板を広く意味し、 DNAマイクロアレイの概念も含 む。
[0065] 本発明によれば、基板に対して遺伝子情報を効率よく集積（固定化)することができ 、また、ハイブリダィゼーシヨンを短時間で効率よく進行させ、検出精度を向上させる ことができる。
図面の簡単な説明 [図 1]図 1は、本発明で採用できる円盤状基板 1の好適な実施形態の一例を示す外 観図である。
[図 2]図 2は、同基板 1の基本的な層構造を示す部分断面図である。
[図 3]図 3は、検出部 3の反応領域 R内に形成される検出表面 U部分の拡大図である
[図 4]図 4は、一組の対向電極の一配置例を示す検出部 3の断面図である。
[図 5]図 5は、一組の対向電極の他の配置例を示す検出部 3の断面図である。
[図 6]図 6は、一組の対向電極のさらに別の配置例を示す検出部 3の断面図である。
[図 7]図 7は、対向軸が直交する二組の対向電極の一配置例を示す検出部 3の断面 図である。
[図 8]図 8は、検出部 3内に走査電極 C群が操作の電極配置構成が簡略に示されて いる図である。
[図 9]図 9は、パターニング形成された検出表面 Uの構成を示す図である。
[図 10]図 10は、突起状の電極が配置された検出部 3の実施形態を示す図である。
[図 11]図 11は、対向電極に対する給電用配線 7の実施形態の一例を示す図である。
[図 12]図 12は、 DNAチップ 10の製造方法の一工程例のフローが示された図である
[図 13]図 13は、同製造方法の他の工程例のフローが示された図である。
[図 14]図 14は、本発明に係るシステムの実施形態例を示すブロック図である。
[図 15]図 15は、同システムの構成要素を一体化した基板処理装置の好適な実施形 態の一例を簡略に示す概念図である。
[図 16]図 16は、 DNAチップの製造又は Z及びノヽイブリダィゼーシヨン検出を行う際 に採用可能な基板処理システムの概念図である。
[図 17]図 17は、ハイブリダィゼーシヨン検出方法の工程フローの一例を示す図である [図 18]図 18は、同方法の他の工程フローを示す図である。
[図 19]図 19は、高周波電界 Wを印加した直後に、低周波電界 W印加した場合の
1 2
電界印加例を示す波形図である。 [図 20]図 20は、図 19における低周波電界 W印加部分を、低周波の矩形交流電界
2
wとした電界印加例を示す波形図である。
3
[図 21]図 21は、高周波電界 W印加した後に電界を 0とした電界印加例を示す波形 図である。
[図 22]図 22は、高周波電界 W印加した後に、直流 (DC)電界 Wを印加した電界印
1 4
加例を示す波形図である。
[図 23]図 23は、高周波電界 W印加する前に、直流電界 W印加した電界印加例の
1 4
波形図を示している。
[図 24]図 24は、直流成分も同時に印加するようにした高周波電界 W印加した電界
5
印加例を示す波形図である。
[図 25]図 25は、高周波電界 W印加した後に、直流成分も同時に印加された低周波 電界 W
6を印加するようにした電界印加例を示す波形図である。
[図 26]図 26は、直流成分を同時に印加した高周波電界 Wを印加した後に、直流成
5
分を同時に印加した低周波電界 Wを印加した電界印加例を示す波形図である。
6
発明を実施するための最良の形態
[0067] 以下、本発明を実施するための好適な形態について、添付図面を参照しながら説 明する。なお、添付図面に示された各実施形態は、本発明に係わる物や方法の代表 的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈される ことはない。
[0068] < 1.本発明を実施する際に用いる好適な「基板」について〉
(1)基板の基本構成。
[0069] 本発明で採用できる基板は、 CD (Compact Disc)、 DVD (Degital Versatile Disc)、 MD(Mini Disc)等の光情報記録媒体と同様の基材カも形成することができる。また、 本発明に係る基板の形状は、特に限定されないが、円盤状をなす基板 (ディスク）は 、特に好適である。以下の説明では、円盤状の基板を採用した場合を代表例として 説明する。
[0070] 図 1には、本発明で好適に採用できる基板の一実施形態である円盤状基板の好適 な実施形態が例示されている。この図 1に示された円盤状基板 1 (以下、単に「基板 1 」と略称。 )は、光透過性の石英ガラスやシリコン、ポリカーボネート、ポリスチレン等の 合成樹脂、好ましくは射出成形可能な合成樹脂によって円盤状に成形する。基板 1 を安価な合成樹脂を用いて基板を成形することで、従来使用されていたガラスチップ に比して、低ランニングコストを実現できる。
[0071] また、基板 1の中心部分には、図 1中に符号 2で示された所定口径の孔 (又は貫通 しない穴でもよい。）を形成しておいてもよい。この孔 2に、後述するスピンドル (符号 9 )などのチヤッキング治具を挿着することにより、該基板 1を保持したり、回転させたり することができる。
[0072] また、前記孔 2に対しては、給電用の通電治具（図示せず)を挿着することによって 、基板 1に配設された対向電極群 (後述)の全てか又は選択された一部に対して、電 界印加する構成としてもょ ヽ。
[0073] 図 2には、基板 1の基本的な層構造を示す部分断面図が示されている。基板 1は、 反射層 11と、所定波長域の光を透過する光透過層 12と、を基本的に備えている。よ り好ましくは、図 2に示された例のように、下層側に光透過層 12、上層側に反射層 11 を有するように工夫する。この工夫により、基板 1の下方側 (裏面側）からの光照射に よって検出作業等を実施できる。
[0074] また、前記層構成によって、基板 1周辺に、必要な装置群の配置設計を行う場合に おいては、基板 1の上方側には、試料溶液などの滴下又は注入に係わる装置を配置 し、基板 1の下方側には、検出（読み取り）用の光学的装置群をまとめて配置すること ができる。
[0075] 基板 1の反射層 11は、数 nmから数十 nm程度の範囲の膜厚に形成する。この反射 層 11が、単層の金属材料若しくは単層の無機材料カゝらなる場合においては、後述 するサーボ動作用のレーザー光（図 10の符号 V参照）に対する反射率を、 5%以上、 50%以下の範囲とすることが望まし 、。
[0076] これは、基板 1に対して、より安定なサーボ動作 (フォーカスサーボ及びトラッキング サーボ）を行うために要求される、より高いレーザー光反射率と蛍光強度測定のため に必要な励起光及び蛍光に対する透光性とを両立させることができる好適な範囲で あるからである。 [0077] また、前記した反射率の範囲を採用することによって、基板 1の表面に存在する物 質の屈折率が、基板 1の屈折率と非常に近い場合であっても、基板 1上で反射したサ ーボ用レーザー光（図 10の符号 V参照）に対する外乱を完全に取り除くことができる
[0078] 反射層 11は、複数の無機材料を積層し、波長選択性のある反射膜としてもよい。こ の場合では、サーボ動作用レーザー光（図 10の符号 V参照）だけを反射させることが 可能となるので、蛍光強度測定用の励起光や蛍光の損失を心配する必要がなくなる
[0079] 即ち、前記反射膜を採用すれば、蛍光強度測定への影響を心配することなぐレー ザ一光反射率が 50%を越える（例えば、反射率 90%以上の)反射層 11を形成する ことができる。
[0080] 次に、基板 1の光透過層 12、あるいはこの光透過層 12に積層された合成樹脂（例 えば、感光性ポリイミド榭脂層）など力 なる反応領域形成層（図示せず。 )には、公 知の光ディスクマスタリング技術によって、 DNAプローブ等の検出用核酸と標的核 酸との間のノ、イブリダィゼーシヨンの場を提供する、例えばゥエル状の反応領域 Rと、 該反応領域 Rに臨むように配置された少なくとも一対の対向電極 (微少なため図 1で は図示省略)あるいは少なくとも一つの電極と、を少なくとも備える検出部 3を多数配 設しておく（図 1参照)。
[0081] なお、光透過層 12は、二層構造としてもよい（図示せず)。上層側の光透過層を、 媒質の屈折率及び下層側の光透過層の屈折率よりも高い屈折率を有するようにす れば、後述のフォーカスサーボ制御及び位置決めサーボ制御を正確かつ高速に行 うことができる。
[0082] また、各検出部 3には、検出領域 (反応領域 Rの一部に相当）とサーボ領域を形成 する。そして、前記サーボ領域には、半径位置制御用のサーボマークと、各検出部 3 の基板 1上の番地情報を提供するアドレスマークと、を設けておくようにする。
[0083] この検出部 3を、基板 1上に周方向又はスパイラル状に配設すると、前記検出領域 、サーボ領域の順番で次々に形成されることになり、サーボ領域は不連続状態となる ため、光ディスク技術分野で言うサンプルサーボ方式とすることができる。 [0084] なお、サーボマークとアドレスは、慣用の光ディスクマスタリングプロセスにより形成 することができる。即ち、基板 1を光ディスクとして考えた場合、滴下及び検出位置で ある反応領域 Rをユーザーデータ領域と考えることができる。他の領域は、サンプル サーボ方式等により同期ピットを配列し、かつトラッキングサーボとしても利用すること ができ、更に、直後にアドレス部（基板 1上の地理的な番地）を挿入することによって 位置情報を与えることができる。
[0085] アドレス部は、先頭パターンであるセクタ一マーク力 始まり、実際に回転している 基板 1の回転位相を与える VFO (Variable Frequency Oscillator)とアドレスデータの 開始位置を与えるアドレスマークとトラックとセクタのナンバーが入った ID (Identifer) 等を組み合わせる。
[0086] 基板 1の半径方向の情報は、それぞれ半径方向に 1Z4トラック +と—方向に位置 するトラッキングマークからの信号レベルの差分によるファインエラー信号とアドレスマ ークとから得られるトラック位置情報に基づく。
[0087] このトラック位置情報を用いて、基板 1全体を、半径ステージに載置して回転駆動 することによって、媒質供給用の吐出ヘッドや検出用の光ピックアップを行う光学へッ ドの位置決めを行うことができる。
[0088] 吐出ヘッドや光学ヘッドの位置決め動作に係わる制御は、半径ステージに載置さ れて回転する基板 1の読み取り側力 光ピックアップにより得られた再生信号力 の アドレス 'トラッキングエラー信号並びにフォーカスエラー信号に基づいて行うことがで きる。
[0089] 次に、本発明で用いる基板 1の表面は、予め、親媒性加工に基づく表面処理を施 すようにしておく。基板 1の表面上において、疎水性である表面部分と親水性である 表面部分を目的に応じて区別して形成しておくことによって、試料水溶液のロスを防 止することができ、また、スムーズに所望の生体物質を検出表面領域に導くことがで きる等の効果を得ることができる。
[0090] (2)「検出部 3」の構成。
[0091] 検出部 3は、基板 1上に多数配列された微小な領域である。検出部 3には、試料が 含有された水溶液を貯留したり、ゲル (例えば、ァガロースゲル)を保持したりして、ハ イブリダィゼーシヨンの場を提供することになる反応領域 R (例えば、ゥエル形状の微 小領域)が設けられている。なお、この反応領域 Rの媒質の蒸発を防止するために、 反応領域 Rの周辺力 水分の補給を行なうことができる構成としてもよい。
[0092] この検出部 3は、アツセィの目的に応じて、グループ分けし易いように、基板 1上に 配列すればよい。例えば、円盤状をなす基板 1では、周方向、スパイラル状あるいは 放射状に検出部を所定間隔で整然と配列させておくことが可能となる。例えば、使用 する試料物質の種類や遺伝子の違いによって、検出部 3群を、周方向所定角度領域 毎にグループ分けしておくことも自在にできる。
[0093] 検出部 3に設けられた反応領域 Rの形状やサイズは特に限定されないが、その長さ 、幅、深さは、それぞれ数/ z m力も数百/ z mであって、このサイズ値は、励起光のスポ ット径やサンプル溶液 (検出用核酸含有溶液、標的核酸含有溶液)の最小滴下可能 量に基づ 、て決定することができる。
[0094] (3)「検出表面 U」の構成。
[0095] 検出部 3を構成する反応領域 R内には、 DNAプローブ等の検出用核酸を固定ィ匕 できるように表面処理加工された表面（以下、「検出表面」という。）を、形成しておく。
[0096] 図 3には、反応領域 R内の検出表面 U部分の拡大図が模式的に示されている。図 3 では、この検出表面 U部分に検出用核酸 Dの末端が固定ィ匕されており、この検出用 核酸 Dにハイブリダィゼーシヨンした標的核酸 T、更には、二本鎖部分に挿入結合し たインターカレータ Iが模式的に示されている。
[0097] この検出表面 Uとしては、例えば、金などの金属薄膜表面や反応領域 R内に臨むよ うに設けられた電極の表面を活用することができる。
[0098] DNAプローブ等の所望の検出用核酸 Dを固定するための検出表面 U (例えば、電 極表面）の表面処理法については、例えば、アミノ基含有のシランカップリング剤溶 液やポリリシン溶液で予め表面処理しておく方法を採用できる。
[0099] 例えば、アミノ基含有のシランカップリング剤溶液やポリリシン溶液で表面処理され る。合成樹脂製基板であれば、その表面をプラズマ処理及び DUV(DeepUV、遠赤 外)照射処理後、アミノ基含有シランカップリング剤溶液で処理する。
[0100] また、表面に銅、銀、アルミニウム又は金をスパッタして成膜して、その表層にァミノ 基、チオール基、カルボキシル基等の官能基 (活性基)を有する物質やシステアミン 、ストレプトアビジン等をコートしてもよい。
[0101] ストレプトアビジンによって表面処理された検出表面の場合には、ピオチンィ匕された DNAプローブ末端の固定に適している。あるいは、チオール（SH)基によって表面 処理された検出表面の場合には、チオール基が末端に修飾されたプローブ DNA等 の検出用核酸 Dをジスルフイド結合（一 S— S—結合）により固定することに適して!/、る
[0102] また、検出表面 Uには、必要に応じて、検出用核酸 Dを固定ィ匕するためのリンカ一 ゃスぺーサ一などを含む介挿分子を結合させておくことによって、検出表面 Uと検出 用核酸 Dとの距離を確保し、互いの干渉を防ぐように工夫してもよい。即ち、検出用 核酸 Dの固定ィ匕部位以外が検出表面 Uに付着してしまうのを防止するようにしてもよ い。
[0103] 介挿分子の分子長を選択することによって、例えば、分子長の異なるリンカ一を、所 定間隔で検出表面 Uに交互に結合しておくことで、該検出表面 Uに固定化された検 出用核酸 D同士が互いに干渉し合わな 、ように工夫してもよ 、。
[0104] なお、使用する介揷分子の分子長は、検出用核酸 Dや標的核酸 Tの長さ (塩基数） 、検出用核酸 D同士の距離等に応じて適宜決定できる。例えば、 50〜： LOO塩基のプ ローブ DNAを伸長した検出用核酸 Dに対して 1, 600塩基程度の標的核酸 Tをハイ ブリダィゼーシヨンさせる場合を想定すると、標的核酸 Tの余剰塩基配列部分 (相補 鎖を作らない配列部分)がブラウン運動によってランダムコイル状の分子塊になった ときの直径は、 10〜40nmと計算できる。
[0105] この場合、標的核酸 Tの前記分子塊部分による立体障害を有効に防ぐためには、 介挿分子 (又は伸長した状態の介挿分子)の分子長は、 10〜40nm確保するのが好 適であり、また検出表面 U上に配列される介揷分子間の距離についても、 10〜40n m程度が望ましい。
[0106] (4)「対向電極」の構成。
[0107] 検出部 3の反応領域 Rには、該反応領域 Rに臨むように、少なくとも一対の対向電 極 E , Eが設けられている（例えば、図 4参照）。この対向電極 E , Eは、アルミ-ゥ ムゃ金などの金属、あるいは ITO (インジウム—スズ—オキサイド）等の透明な導体で 形成することができる。この対向電極 E , Eは、反応領域 R内の検出表面 U領域を挟
1 2
むような配置関係で設ける。
[0108] 図 4には、一組の対向電極 E , Eの一配置例が示されている。この対向電極 E , E
1 2 1
2は、反応領域 Rに貯留された水溶液や保持されたゲルなどの媒質に電界を印加す るために設けられた、相対向する配置関係にある電極対である。なお、一方の電極（ 例えば、図 4中の E )を外部電極ユニットとし、必要に応じて、基板 1側の電極と対向
2
電極を形成できるようにしてもょ 、。
[0109] この対向電極 E , Eは、例えば、高周波交流電界等の電界印加（後述）により得ら
1 2
れる誘電泳動の電気力学的効果によって、前記媒質中に存在する核酸分子 (検出 用核酸 D、標的核酸 T)を直鎖状に伸長させたり、電気力線が集中する電極エッジ等 の所定箇所に向けて移動させたり、伸長させながら移動させたり、あるいは引き寄せ たりするための手段として機能する。なお、図 4に示された符号 Dは、伸長した状態で 固定ィ匕されている検出用核酸が模式的に示されている。なお、対向電極 E , E
1 2を、 電気泳動や電気浸透流などの電気力学的効果を利用する場合に用いるのは自由で ある。
[0110] ノ、イブリダィゼーシヨンは、通常、ランダムコイル状に丸まったり、絡まったりしている 状態の一本鎖核酸分子同士間で進行するので、立体障害の影響などを受けて、相 補結合の効率が低下し、ミスハイブリダィゼーシヨンも起き易くなる。
[0111] しかし、対向電極 E , Eを介して電界印加を行うことよって、核酸分子の高次構造
1 2
を伸長状態に調整したり、あるいは、核酸分子の会合の確率 (即ち、濃度）が高まるよ うに、所定領域へ移動させてぉ ヽたりすることができる。
[0112] 電界印加がなされた状態でハイブリダィゼーシヨンを行うと、立体障害の影響を低 減できるので、該ノ、イブリダィゼーシヨンの効率と精度を飛躍的に高めることができる 。この結果、高速のハイブリダィゼーシヨン検出を実現できる。なお、ノ、イブリダィゼー シヨンの際には、電界オフの状態 (時間帯)を形成し、自然なブラウン運動に委ねて ハイブリダィゼーシヨンを進行させてもょ 、。
[0113] なお、反応領域 Rに設けられるいずれの対向電極も、外部電源 Vに通電可能に構 成され、スィッチ sの操作により、電界印加のオン Zオフが自在な通電構成とされて いる（例えば、図 4参照)。
[0114] また、反応領域 Rに設けられるいずれの対向電極も、電界強度の選択、交流と直流 の選択、あるいは高周波電界や低周波電界の選択を自在に行うことができるように、 電界制御されている。
[0115] ここで、反応領域 Rにおける対向電極の主な配置構成例を列挙すると、（1)反応領 域 Rの底面 4部分に一つの電極 Eを形成しておき、この電極 Eと対向する上方位置 にもう一方の電極 Eを配置する構成（図 4参照）、（2)反応領域 Rを形成する壁面の
2
対向する縦壁面 5, 5部分に、互いに向かい合うように電極 E、 Eを配置する構成（
3 4
図 5参照）、（3)互いの電極エッジ部分が対向する二つの電極 E、Eが底面 4部分に
5 6
所定間隔を置 、て並べて配置された構成（図 6参照)などを例示できる。
[0116] あるいは、これらの対向電極を適宜自在に組み合わせて、複数の対向電極を設け るようにしてもよい。例えば、二対の対向電極を、その対向軸が交差するように反応 領域 Rに配置してもよい。具体的には、図 7に示すように、垂直方向に配置された対 向電極 E— Eと水平方向に配置された対向電極 E— Eを各反応領域 Rに形成して
1 2 3 4
ちょい。
[0117] この場合、一方の対向電極 E— Eを、検出用核酸 Dの高次構造調整やハイブリダ
1 2
ィゼーシヨン効率向上を目的とする高周波電界印加手段として使用し、他方の対向 電極 E -Eは、ハイブリダィゼーシヨン検出の際の障害となる余剰物質 (例えば、余
3 4
剰の検出用核酸 D、余剰の標的核酸 T、余剰のインターカレータ Iなど）やミスハイブ リダィゼーシヨンした核酸分子を検出表面部位力 他の領域へ強制的に除去するた めの電界印加手段として使用することができる。このような電界を用いた除去作業は
、現在一般に実施されている水溶液を用いた洗浄除去作業に変わり得る新規技術と なる。
[0118] 電界印加による前記除去作業の際には、低周波電界を積極的に用いるように工夫 してもよい。反応領域 R中の媒質に低周波電界を印加することによって、ミスハイプリ ダイゼーシヨンした核酸分子に適当な振動を与えて、該核酸分子を検出用核酸 Dか ら解離させることができる。なお、低周波電界の電界強度は、正規のハイブリダィゼー シヨンを解離させてしまわな 、程度とする。
[0119] なお、アツセィで用いる試料物質を含む媒質を、検出部 3の反応領域 Rへ確実に送 り込むために、毛細管現象を利用するようにしてもよい。このために、例えば、図 4や 図 7に示すように、反応領域 Rに連通する吸入孔 Hと、外気連通孔 Hとを設けるよう
1 2
に工夫し、さらには、前記吸入孔 Hの上方開口部の周辺表面領域を、媒質と逆の親 媒性である疎水性としてもよ!/、。
[0120] 反応領域 Rには、対向電極に加えて、走査電極 C群を配置してもよい。その一実施 形態を図 8に示す。図 8には、検出部 3内の電極配置構成が簡略に示されている。ま ず、対向電極 E— Eが設けられており、この対向電極 E— E間に、共通電極 Gとこ
1 2 1 2 れにそれぞれのエッジ dが対向する配置関係にある走査電極 C群が設けられている。
[0121] 図 8の実施形態では、図示されたスィッチ（S〜Sz)の切換え操作を所定のタイミン グで順次行うことによって、隣り合う走査電極 (例えば、 C—C、 C - C
1 2 2 3 )間に順番に 電界印加を行っていき、隣なり合う走査電極の各エッジ d, d間に、伸長状態の検出 用核酸 (符号 X)を架橋するように固定することができる。なお、図 8中の符号 Lは、走 查電極 (Cx、 Cy)のエッジ d部分に集中する電気力線を模式的に示したものである。
[0122] ここで、既述したように、反応領域 Rを臨む対向電極を構成する電極表面は、 DNA プローブなどの検出用核酸 Dを固定するための検出表面 U (図 3再参照）として用い ることがでさる。
[0123] この場合、検出表面 Uとして機能させる側の電極表面の面積は、その対向する他 方の電極の表面面積よりも狭小の面積に形成するのがより望ましい。例えば、図 4、 図 7に示されているように、面積狭小とされた側の電極 Eには、電界 (電気力線）がよ り集中して不均一電界が形成されるので、誘電泳動によって、電極 E側へ核酸分子 が移動し易くなる。
[0124] また、固定ィ匕用に用いられる電極の表面、即ち検出表面 Uは、例えば、図 9に示さ れているように、凹凸形状に粗面加工を施したり、島状になるようにパターユング形成 したりするようにしてもよい。このような構成を採用すれば、電気力線が、該電極表面 の凸部位 u (山状部位）〖こ集中し易くなるので、不均一電界が形成され易くなるので 好ましい。なお、図示しないが、検出表面 Uに逆円錐状や断面 U字状の凹部や円錐 状などの凸部を規則的に形成しておいてもよい。
[0125] なお、電極表面を粗面加工する方法は、例えば、公知のスパッタリング蒸着技術、 ェピキタシー蒸着技術やエッチング技術を用いて実施することができるが、該方法は 特に限定されない。
[0126] また、各電極表面は、 SiO、 SiN、 SiOC、 SiC、 SiOF、 TiOなどの材料によって
2 2
形成した絶縁層で覆うことがより望ましい。反応領域中に貯留される場合があるィォ ン溶液による電気化学的な反応を防止することができる力 である。
[0127] なお、図 10に示す実施形態のように、検出部 3の反応領域 R中に収容された媒質 に対して電界印加可能に対向配置される対向電極 E , Eを構成する各電極が、該
1 2
反応領域 Rに向けて突起した形態を有するようにしてもょ ヽ。
[0128] このような突起状の対向電極の先端部位 el, e2には、電気力線が集中し、不均一 電界が形成され易くなるので、検出用核酸 Dの固定部位として、好適に利用すること ができる。
[0129] (5)「対向電極」への給電手段。
[0130] 反応領域 Rに設けられた各対向電極への給電は、特に限定されないが、例えば、 図 11に図示されているように、基板 1の中心部に、外部の通電治具（図示せず。）と 接触可能な通電部 6を、孔 2の周壁面に露出するように形成しておき、この通電部 6 から導出されて、基板全体を網羅するように延設された給電用配線 7群を介して行う ことができる。
[0131] なお、前記通電部 6は、円形、リング状、分割されたリング状（図 11参照）などの形 状を、目的に応じて、適宜選択することができる。なお、図 11中の符号 21は、図示し な ヽ通電治具やチヤッキング治具の位置決めをするために形成された切り欠き部で ある。
[0132] なお、切り欠き部 21以外にも、凸部を形成したり、孔 2の形状それ自体を工夫したり することにより、通電治具やチヤッキング治具の位置決めを行うようにしてもよぐ位置 決めの具体的方法は、特に限定されない。
[0133] ここで、図 11に基づいて、給電用配線 7の実施形態の一例を説明すると、給電用 配線 7は、基板 1の通電部 6から基板外周側へ向けて放射状に延びる第 1配線 (基幹 配線） 71、この第 1配線 71から周方向に枝分かれする第 2配線 72、さらには、この第 2配線 72から枝分かれして電極に接続する第 3配線 73等である。なお、前記第 2配 線 72は、上方視したときに、同心円状あるいはスパイラル状を呈するように延設する
[0134] これらの配線 71〜73を単一層内に形成したり、あるいは複数層に分けたり、跨った りさせて形成して、配線用基板 (層） laに延設しておく。この配線用基板 (配線層） la を、検出部 3が配列された検出用基板 lbに正確に位置決めし、貼り合わせ等を行つ て一体化し、基板 1を形成すればよい。
[0135] 上記したような給電用配線 7 (71, 72, 73)の構成を採用すれば、記録情報読み取 りの際に使用する回転同期信号の基準として、あるいはトラッキング信号の基準とし て利用することができる。この結果、これらの信号を得るためのピット群やバーコード 群などの専用の信号やマークを基板 1にわざわざ設けなくてもよくなるため、基板 1の 構成をより簡素化することができるという利点がある。
[0136] < 2. DNAチップの製造方法について >
本発明では、既述した構成あるいは構造を備える円盤状の形態に成形され、かつ 表面処理が施された基板 1を用 ヽて DNAチップを製造する。
[0137] この基板 1は、既述したように、ハイブリダィゼーシヨンの場となる反応領域 Rと、該 反応領域 Rに貯留又保持される媒質に電界印加可能に配置される対向電極 (例え ば、 E— E )と、を少なくとも備える検出部 3が多数配設されている（図 1参照)。この
1 2
基板 1を用いて、所定の検出用核酸 Dが固定 (集積)された、いわゆる「DNAチップ」 を製造する。
[0138] 本製造方法を同方法の工程例のフローが示された図 12、図 13を参照して説明す る。
[0139] 基板 1に対して表面処理を行う工程 Pと、予め調製された検出用核酸 Dを含む媒 質を、前記反応領域 Rに滴下又は注入する工程 Pと、前記反応領域 Rに貯留又は保
2
持された前記媒質に対して、前記対向電極 (例えば、 E— E )を介して電界印加を
1 2
行う工程 Pを行う。
3
[0140] 電界印加により得られる電気力学的効果である「誘電泳動」によって、前記検出用 核酸 Dを伸長させながら、検出表面 Uとして機能する電極表面 (例えば、 表面）に 固定する。さらに、余剰の前記検出用核酸 Dを反応領域 Rから除去する工程 Pと、を
4 行い、続く包装工程 Pを経て、 DNAチップ 10をユーザへ出荷する。以下、この DN
5
Aチップ 10の製造工程を工程別に順次説明する。
[0141] (1) (基板の）表面処理工程 P。
[0142] まず、ハイブリダィゼーシヨンの場を提供できる反応領域 Rが形成された基板 1を用 V、て、この基板表面を疎水性物質で処理して疎水面を形成する疎水化工程を行 ヽ、 これに続いて疎水面の一部を親水面に変換する親水化工程を行う。
[0143] これらの工程を適宜に組み合わせることによって、基板 1上の所定の領域又は部分 領域を、目的に応じて、親水面にしたり、疎水面にしたりすることができる。例えば、 反応領域 Rを構成する壁面のみを親水面に変換し、基板 1上のそれ以外の部分 (非 反応領域)を疎水面とすることができる。
[0144] 遺伝子解析などのバイオアツセィに用いる核酸などの生体物質は、親水性である 場合がほとんどであるため、これらの生体物質は、水溶液等に含有された状態で、基 板 1の反応領域 Rに滴下、注入、あるいは送液されること〖こなる。
[0145] 従って、基板 1上の反応領域 Rが親水面に、非反応領域 (反応に直接係わらない 領域）が疎水面になるように基板 1を表面処理することによって、生体物質が溶解さ れた試料溶液等を基板 1上に滴下等する際に、この試料溶液等を、反応領域 R内の 親水表面領域に的確に送り込んだり、該親水表面領域に確実にとどまらせたりするこ とがでさる。
[0146] また、上記の工程 Pでは、基板 1上の反応領域 R内の所定部分のみを、目的に応 じて、適宜、親水面又は疎水面にすることも可能である。例えば、上記親水化工程に より、反応領域 R内に配置された検出表面部分 (例えば、電極表面部分)のみを親水 面に変換したり、逆に、反応領域 R中の前記検出表面以外の部分 (非検出用表面） のみを親水面に変換したりすることもできる。
[0147] このように、反応領域 R内に、親水面と疎水面を、目的に応じて設けることによって、 DNAチップ製造段階にぉ 、て使用する親水性、あるいは疎水性の試料溶液や試料 ゲル等を目的の場所に保持させたり、反応領域 R内の目的の場所に検出用核酸を 送り込んで固定ィ匕したりすることなど力 自在に行えるようになる。
[0148] 上記疎水化工程は、例えば、疎水性物質であるアルキルシラン (R— Si— X , X ,
1 2
X、 R:アルキル基（不飽和基を含んでいてもよい）、 Xn: Cl, OR)を、基板の表面に
3
固定ィ匕することにより行うことができる。
[0149] 上記の疎水面の一部を親水面に変換する親水化工程は、疎水面に水酸基を形成 する反応に基づいて、簡易に行うことができる。例えば、疎水面が、前記したアルキ ルシランで形成されている場合、アルキルシランに、酸素存在下で紫外線を照射す ることにより、アルキルシランのアルキル基に、水酸基を付加することができる。
[0150] (2)検出用核酸の滴下又は注入工程 P
2。
[0151] この工程 Pでは、上記表面処理工程を経て得られた基板 1上の反応領域 Rに対し
2
て、予め調製された検出用核酸 Dを滴下又は注入する。検出用核酸 Dとしては、 DN Aオリゴ鎖ゃ cDNA (complementary DNA)等（cDNA断片である EST (Expression s equence tagや ORF (Open reading frame)などのポリヌクレオチドを含む）の DNAプ ローブを例示できる。
[0152] この滴下又は注入に係わる具体的方法は、特に限定されないが、例を挙げると、ィ ンクジェットプリンティング技術を利用した圧電技術によって、 XYZ作動制御システム によって位置制御された小さなジェットノズルを介して、前記 DNAプローブを含む試 料溶液を基板 1上の反応領域 Rに正確に噴射することができる。
[0153] あるいは、マイクロスポッティング技術を用いて、 XYZ作動制御システムによって位 置制御されたマイクロスポッティングペン、キヤビラリ一、あるいはピンセットを装着した プリントヘッドにより、予め調製された検出用核酸を基板 1上の反応領域 Rにスポット することができる。
[0154] これらの滴下 (スポッティング)方法は、基板 1上の検出部 3位置に正確に追従させ ながら、検出用核酸 Dを含む微小滴並びに標的核酸 Tを含む微小滴などを、正確に 滴下することができる。
[0155] なお、「インクジェットプリンティング法」は、インクジェットプリンターで用いられるノズ ルを応用する方法であって、電気を用いてインクジェットプリンターのようにプリンター ヘッドから基板に検出用核酸を噴射し、固定する方法である。 [0156] この方法には、圧電式インクジェット法、バブルジェット（登録商標）法、超音波ジェ ット法がある。圧電式インクジェット法は、圧電体にパルスを印加することによって生じ る変位の圧力によって液滴を飛ばす方法である。通常のバブルジェット (登録商標） 法は、熱方式であって、ノズル中のヒーターを熱して発生させた気泡の圧力によって 液滴を飛ばす方式である。ノズル内にヒーターとなるシリコン基盤を埋め込み、約 30 0°CZsで制御して一様な気泡を作成し、液滴を押し出す。し力しながら、高温に液体 力 S曝されることになることから、生体物質試料には適さないと考えられる。超音波ジェ ット法は、超音波ビームを液体の自由面にあてて、局所的に高い圧力を与えることに よってその箇所力も小滴を放出させる方式である。ノズルを必要とせず、高速で直径 約 1 mの小滴を形成できる。
[0157] 本発明においては、「インクジェットプリンティング法」として、「圧電式インクジエツテ イング法」のように、媒質への熱影響が少ない方法を好適に採用できる。印加するパ ルスの形状を変えることによって、液滴 (微小滴）のサイズを制御することができるので 、解析精度向上に好適である。液滴表面の曲率半径が小さいときは液滴を小さくし、 液滴の曲率半径が大きいときは液滴を大きくすることができる。また、パルスを急激に 負の方向に変化させることにより液滴表面を内側に引っ張り、曲率半径を小さくする ことも可能である。
[0158] 「マイクロメカ-カルスポッティング法」は、マイクロスポッティングペン、キヤビラリ一 ( 細管）、あるいはピンセットを装着させたプリントヘッドを用いて、検出用核酸を含む微 小滴を基板上の検出表面部位にスポットしていく方法である。
[0159] なお、本発明では、電磁誘導により生じた誘導電流と外部磁場との相互作用により 振動する導電性ボイスコイルにより駆動して吐出ロカ 媒質を吐出する装置を滴下 手段として採用してもよい。
[0160] この工程 Pは、基板 1上の所定の検出部 3 (あるいは検出部 3群）の位置をサーボ
2
機構によって読み取り、この円盤状をなす基板 1を回転させながら行うことができる。 なお、この工程 Pを開始と同時に、次の工程 Pを開始しておき、反応領域 R中に滴
2 3
下又は注入された媒質に対して、電界印加を行うようにしてもよい（図 13の工程 P
21 参照)。 [0161] (3)電界印加工程 (検出用核酸の固定工程) P3。
[0162] 前記工程 Pに続いて（図 12参照）、あるいは前記工程 Pと同時に（図 13参照）、基
2 2
板 1上の反応領域 Rに貯留又は保持された媒質に対して、該反応領域 Rの対向電極 (例えば、 E E )を介して、電界印加を行う。以下、具体的に説明する。
1 2
[0163] 前記媒質に電界印加がされな!/、段階 (電界オフの段階)では、一本鎖の検出用核 酸 D (例えば、 DNAプローブ）は、反応領域 Rの媒質中に遊離状態で存在している。 このとき、検出用核酸 Dは、ブラウン運動の作用を受けて、ランダムコイル状に丸まつ た高次構造で存在して ヽる。
[0164] 電界印加を実施する本工程 P (図 12)又は P (図 13)では、外部電源に接続され
3 21
た対向電極 (例えば、 E — E )を用いて、反応領域 R内の媒質に対して高周波交流
1 2
電界を印加する。このときの印加電界の好適な条件として、高周波電界は、 1MV/ m以上及び 500kHz以上が望ましぐ例えば、約 1 X 10 /m,約 1MHzを好適に 選択でさ (Masao Washizu and Osamu Kurosawa： 'Electrostatic Manipulation of D NA in Microfabricated Structures", IEEE Transaction on Industrial Application Vol. 26,No.26,p.1165-1172(1990)参照）。
[0165] この電界印加によって得られる誘電泳動の電気力学的効果によって、ランダムコィ ル状の検出用核酸 Dを伸長させながら、電気力線が集中する電極表面に向けて移 動させ、 DNAプローブ等の検出用核酸 Dの修飾された末端部位を、カップリング反 応等を介して、電極表面に固定することができる (例えば、図 4の状態を参照)。即ち 、電極表面を検出表面 Uとして機能させる。特に、電界印加により、検出用核酸の移 動を速めることができるので、プロセス時間の短縮に有効である。
[0166] 既述したように、例えば、ストレプトアビジンによって表面処理された電極表面には、 ピオチン化された DNAプローブ末端の固定が適している。あるいは、チオール（SH )基によって表面処理された電極表面の場合は、チオール基が末端に修飾された D NAプローブをジスルフイド結合（ S— S 結合）によって固定するのに適して!/、る。
[0167] (4)除去 (洗浄)工程 P。
[0168] この工程 Pは、反応領域 R中に固定されな 、まま遊離状態で存在して 、る余剰の
4
検出用核酸 Dを、反応領域 R中から除去し、回収することを目的とする工程である。 [0169] 第一に例示できる工程は、予め洗浄用に調製されたバッファー溶液を反応領域に 滴下又は注入し、この洗浄溶液を回収する際に、余剰の検出用核酸を同時に反応 領域 R中から除去するという方法である。
[0170] この方法における洗浄液の回収作業では、基板 1の反応領域 Rに連通するようにキ ャピラリー（図示せず)を形成しておくことによって、毛細管現象を有効に利用できる。 あるいは円盤状をなす基板 1の形態的特性を積極的に活用し、該基板 1を回転させ ることによって得られる遠心力を有効に利用することもできる。
[0171] なお、洗浄液としては、例えば、界面活性剤 SDSを含む SSC (Saline -Sodium
Citrate)バッファー溶液などを用いることができる。
[0172] 第二に例示できる方法は、固定用として用いた対向電極とは別組の対向電極 (例 えば、図 6中の対向電極 E— E )を反応領域 Rに予め設けておき、この対向電極に、
3 4
固定化された検出用核酸が外れてしまわない程度の強度の電界を印加することによ つて、当該電極 E , E
3 4の表面近傍の領域へ、即ち検出表面領域に影響のない領域 へ、余剰の検出用核酸を回収又はトラップする方法である（図 7参照)。
[0173] なお、この第二の方法は、反応領域 Rから余剰の検出用核酸 D等を除去してしまう 方法ではなぐ該反応領域 Rの検出に障害とならない領域へ余剰の検出用核酸など の余剰物質を移動させておく方法である。
[0174] 従って、この方法は、ユーザ自身が、検出用核酸 Dの固定作業とハイブリダィゼー シヨンの一連の作業を行う場合や検出用核酸 Dが固定された DNAチップ 10を用い てノ、イブリダィゼーシヨン作業を行う場合などに、特に有効な方法であると考えられる
[0175] なお、上記説明で用いた図 7には、電極 E表面にノ、イブリダィゼーシヨンした二本 鎖核酸が存在し、電極 Eや E表面近傍には、余剰物質 Bが引き寄せられている様
3 4
子が模式的に示されている。
[0176] 上記工程を経て、検出用核酸 Dが反応領域 Rの検出表面 Uに固定ィ匕され、さらに は余剰の検出用核酸 Dが反応領域 Rから除去された状態とされた基板 1は、パッケ一 ジングされて、遺伝子情報が集積された「DNAチップ」としてユーザに向けて出荷さ れる。以下、 DNAチップは、符号 10をもって示す。以上、電界印加を用いたプロ一 ブ固定について説明した力 プローブ固定は化学反応で起こるので、必ずしも電界 印加は必要ない。
[0177] < 3. DNAチップの製造システム/ハイブリダィゼーシヨン検出システムにつ!/、て
>
以下、上記基板 1から得られた DNAチップ 10の製造システム、並びに本発明に係 る DNAチップ 10を用いたノヽイブリダィゼーシヨン検出システムの好適な実施形態に ついて説明する。図 14は、同システムの好適な実施形態の一例を示すブロック図で ある。
[0178] なお、この図 14に示されているシステム構成の中で、媒質を滴下又は注入するた めの手段やサーボ機構については、検出用核酸 Dの固定システム（即ち DNAチップ の製造システム）とハイブリダィゼーション検出システムの両方に使用できる構成であ り、蛍光検出手段は、ハイブリダィゼーシヨン検出に関する手段である。
[0179] なお、図 14に示されたようなシステムを、 DNAチップの製造システムのみに必要な 装置構成部分とハイブリダィゼーシヨン検出システムにのみに必要な装置構成部分 に分離し、それぞれの目的に特ィ匕した別システムとして設計することは、自由に行な うことができる、なお、この点、図 15の装置、図 16のシステムでも同様である。
[0180] まず、図 14に示された基板 1 (又は DNAチップ 10)は、既述したような形態や構成 を備えている。この基板 1 (又は DNAチップ 10)を、回転手段を備えるディスク支持 台 8の上方に突設されたスピンドル (治具） 9に固定する。このスピンドル 9は、基板 1 ( 又は 10)中心の孔 2 (図 1参照）〖こ位置決めされて揷着されている。
[0181] なお、基板の反応領域 Rには、 DNAチップ 10の製造段階では検出用核酸 Dを含 む媒質 Mが滴下又は注入され、ハイブリダィゼーシヨン検出段階では、標的核酸 T を含む媒質 Mが滴下又は注入される。
2
[0182] これらの媒質 M , Mは、溶液状や粘度調製されたゲル状を成すのが一般的であ
1 2
る。特に、溶液状の媒質の場合は、液ダレ等の種々の問題を避けるために、前記媒 質 Mが滴下又は注入される基板 1は、水平に保持するのが望ましい。
[0183] 図 14に示されているシステム構成においては、ノズルヘッド Nが基板 1 (又は DNA チップ 10)の上面 lc側（上方側）に複数配置されている。このノズルヘッド Nは、所 定の媒質 M (例えば、 M〜M )を、所定位置に配列された検出部 3の反応領域尺に
1 3
正確に追従しながら、所定のタイミングで滴下、あるいは注入できる構成とされている
[0184] 図 14中の符号 31は、「制御部」をブロック図的に簡略に示している。この制御部 31 は、基板 1 (又は DNAチップ 10)に対する「フォーカス情報」と基板 1から得られる「ト ラッキング情報」に基づいて、ノズルヘッド Nの滴下又は注入の動作全体を制御して いる。
[0185] ここで、図 14に符号 Qで示されている励起光は、ノ、イブリダィゼーシヨン検出段階 で使用する情報読み取り用の光である。この励起光 Qは、レーザーダイオード 12から 出射され、コリメータレンズ Lにて平行光とされた後、ダイクロイツクミラー 13で 90° 屈折される。
[0186] その後、励起光 Qは、光の進行方向前方に配置されたミラー 14で 90° 屈折された 後、ァクチユエータ 15で支持された集光レンズ Lに入射し、基板 1の裏面 Id側から
2
検出部 3 (の反応領域 R)に照射される。なお、符号 16は、制御部 31から送信される レーザーダイオードドライバ 17を制御するための信号である。
[0187] 励起光 Qは、前記集光レンズ Lによって基板 1 (又は DN Aチップ 10)の表面 (裏面
2
)で数/ z m程度の大きさまで絞り込まれる。この微小な励起光スポット径を活かすため に、基板 1 (又は DNAチップ 10)上に、検出用核酸を含む媒質 M、標的核酸を含む 媒質 Mなどを滴下又は注入するノズルヘッド Nとしては、ピコリットルオーダーの微
2 1
少量溶液を滴下可能なインクジェットプリンティングノズルが好適である。
[0188] ノズルヘッド Nの一例であるインクジェットプリンティングノズルの数は、使用する媒 質の数や種類だけ用意してもよいし、 1種類の媒質を滴下後、一旦ノズルを洗浄し、 別種類の溶液を滴下することにより、少な 、ノズル数で多種の媒質を扱うようにしても よい。
[0189] なお、このインクジェットプリンティングノズルを用いて、インターカレータ 1 (図 3参照） を含む媒質 Mを、標的核酸を含む媒質 Mと同時に滴下又は注入できるし、ハイプリ
3 2
ダイゼーシヨン後の所定タイミングで、反応領域 Rに滴下又は注入することもできるし 、所定の洗浄溶液を固定ィ匕工程後の所定タイミングで、反応領域 Rに滴下又は注入 することちでさる。
[0190] 基板 1 (又は DNAチップ 10)上に媒質滴下又は注入する際には、サーボ用レーザ 一光 V (後述）を用いて、基板 1 (又は DNAチップ 10)上に予め記録されているァドレ スマーク情報を読み取りながら、所望のアドレス (番地）に、媒質を滴下又は注入する
[0191] DNAチップ 10の場合では、反応領域 R (の検出表面）に予め固定された検出用核 酸 Dとあとから滴下又は注入されてくる標的核酸 Tとがハイブリダィゼーシヨンを示し、 相補的な二本鎖核酸を形成した後、あるいは、標的核酸 Tの滴下又は注入と同時に 、所定のノズルヘッド Nを介して、前記二本鎖核酸に対して挿入結合可能なインタ 一力レータ Iを含む媒質 Mを、反応領域 Rへ滴下又は注入することができる。なお、
3
媒質等を工夫することによって、標的核酸 τの滴下又は注入する前の段階からインタ 一力レータ Iを反応領域 Rへカ卩えておくこともできる。
[0192] 励起光 Qが照射されると、符号 Fで示される蛍光力インターカレータカも発せられ、 基板 1の裏面 Id側に該蛍光 Fが戻ってくる。この蛍光 Fは、 DNAチップ 10の下方に 配置された前記ミラー 14で 90° 屈折された後、光進行方向に配置された前記ダイク 口イツクミラー 13を透過して直進し、更に前方に配置されたダイクロイツクミラー 18で 9 0° 屈折される。
[0193] 続いて、この蛍光 Fは、上方のレンズ Lに入射して集光され、ディテクタ 19に導か
3
れる。このように、ダイクロイツクミラー 18は、蛍光 Fを反射する性質を有するとともに、 後述するサーボ用レーザー光 Zに対して透光性を有する性質を備える。
[0194] ここで、蛍光強度は、一般の光ディスク RF信号等と比較して、非常に弱いことが予 想される。従って、蛍光検出用のディテクタ 19には、一般のフォトダイオードと比較し て非常に感度の高 、フォトマルチプライヤー（光電管）やアバランシェフオトダイォー ド (APD)を採用するのが好適である。
[0195] 前記ディテクタ 19で検出された蛍光 Fは、 AD変 によって所定ビット数のデ ジタル信号 32に変換される。このデジタル信号 32は、例えば、基板 1上のアドレスと 発せられた蛍光強度とを対応させたマップの作成等の解析に利用される。
[0196] 次に、本発明に係るシステムや装置を構成する「サーボ機構」について、具体的に 説明する。
[0197] まず、基板 1 (又は DNAチップ 10)の下方に配置される上記集光レンズ Lは、上記
2 ァクチユエータ 15によって、フォーカス方向（上下方向）及びトラッキング方向（周方 向）に駆動される構成とされている。このァクチユエータ 15としては、光ディスクのピッ クアップに使用されるものと同じタイプの、 2軸ボイスコイル型のものが好適である。
[0198] 上記したように、基板 1 (又は DNAチップ 10)は水平に保持され、かつ前記集光レ ンズ Lは、基板 1 (又は DNAチップ 10)から見て鉛直方向下方位置に設置されてい
2
るので、励起光 Q並びにフォーカスサーボ及びトラッキングサーボに利用されるサー ボ用レーザー光 Zは、基板 1 (又は DNAチップ 10)の裏面側 Idから照射される。
[0199] 基板 1 (又は DNAチップ 10)の裏面 Id側からサーボ用レーザー光 Zを照射する構 成を採用したことによって、サーボ用レーザー光 Zは、基板 1 (又は DNAチップ 10) の検出部 3の媒質中に存在している検出用核酸 Dや標的核酸 Tの影響を全く受けず に、基板 1 (又は DNAチップ 10)の裏面 Idから反射されて戻ってくる。
[0200] このため、基板 1 (又は DNAチップ 10)が回転しても、基板 1 (又は DNAチップ 10) 中の媒質により反射光の方向及び強度が乱されることはないので大変好適である。 即ち、フォーカスエラー及びトラッキングエラーも外乱を受けることなぐサーボが安定 して動作できるようになる。
[0201] 具体的に説明すると、まず、図 14中の符号 22は、サーボ用レーザーダイオードを 示しており、その後方には前記ダイオード 22を制御するためのドライバ 23が配置され ている。サーボ用レーザーダイオード 22の光出射方向には、コリメータレンズ Lが配
4 置されている。
[0202] このコリメータレンズ Lによって、サーボ用レーザー光 Zは、平行光に変換されて直
4
進する。なお、コリメータレンズ Lの前方に配置されたダイクロイツクミラー 25は、サー
4
ボ用レーザー光 zに対して透光性を有する性質を備える。
[0203] ここで、フォーカスエラーの発生には、非点収差法、ナイフエッジ法、スキュー法等 、幾つかの方法が考えられるが、図 14の構成の場合、非点収差発生レンズ Lを用い
5 た非点収差法採用して 、る。
[0204] また、トラッキングエラーの発生には、ディファレンシャルプシュプル法と 3スポット法 が好適であると考えられる。両方法ともディスク上で 3つの光スポットを得る必要がある
[0205] 従って、光ディスクピックアップで一般的であるように、図 14中に示された回折格子 24を、サーボ用レーザー光学系のコリメータレンズ Lとダイクロイツクミラー 25の間に
4
揷設して、回折された 0次及び ± 1次光を、集光レンズ Lを介して基板 1 (又は DNA
2
チップ 10)に照射する。
[0206] 図 14における符号 26は、サーボ用レーザー反射光のディテクタを示している。な お、ドライバ 23及びディテクタ 26は、制御部 31によって制御されている（図 12参照）
[0207] 上記した励起光 Qの波長、蛍光 Fの波長、レーザー光 Zの波長は、それぞれ異なつ ていてもよい。これらの光 Q、 F、 Zの波長が異なるようにした構成を採用する場合に は、基板 1に設けられた反射層 11 (図 2参照）が、蛍光 Fの波長に対して所定程度の 透光性 (透過率)を有し、かつサーボ動作が可能なレーザー光反射率を備える物性 が要求される。
[0208] つまり、反射率 ·透過率に波長依存性があっても力まわず、好ましくはローパスフィ ルタ的な周波数特性があればよい。単一の波長の場合では、蛍光 Fの透過率とレー ザ一光 Zの反射率の両方を向上させることは困難である力 波長依存性を持たせるこ とによって、蛍光 Fの透過率及びレーザー光 Zの反射率を向上させることができる。
[0209] < 4.基板処理装置及びシステムについて >
次に、図 15は、上記システムの構成要素を一体化した基板処理装置の好適な実 施形態の一例を簡略に示す概念図である。この基板処理装置は、 DNAチップの製 造装置やハイブリダィゼーシヨン検出装置、あるいは DNAチップの製造とハイブリダ ィゼーシヨン検出の両方を担う装置として利用できる。なお、本発明に係る基板処理 装置を構成する各手段の配置構成は、図 15に示された実施形態に狭く限定されな い。
[0210] まず、図 15に示された符号 100は、 DNAチップ 10の製造やハイブリダィゼーショ ンの検出に必要な手段が全て一体ィ匕された装置を例示している。即ち、この装置 10 0は、図 14で示されて 、る全ての手段が所定箇所に一体に配備されて 、る。 [0211] カロえて、基板 1 (又は DNAチップ 10)を装置 100内へ導入する手段と装置外へ取り 出す手段の両方受け持つ手段 101と、基板 1 (又は DNAチップ 10)の収納部 102と 、検出用核酸 Dの固定やハイブリダィゼーシヨン等のアツセィの温度環境を制御でき る加熱手段や湿度条件を制御できる加湿手段として機能する環境設定手段 104と、 検出用核酸ゃ該検出用核酸が固定された前記反応領域へ標的核酸を供給する供 給手段 Nと、ノ、イブリダィゼーシヨンの状況を読取る読取り手段 103と、を備える。
[0212] 更には、反応領域 Rへの電界印加手段や余剰の検出用核酸 Dなどを洗浄除去す るための手段（図示せず。）を備える。なお、基板導入手段と前記基板取り出し手段 は、図 15のように共通の手段 101であってもよいが、分離された手段であってもよい
[0213] 本装置 100では、上記の手段に加えて、細胞、組織等力 抽出した mRNA等から 標的核酸 T(cDNA)を自動的に増幅作製し、供給手段 N (ノズルヘッド N )へ導入 する手段（101a)を一体ィ匕することによって、ハイブリダィゼーシヨン検出アツセィをよ り自動化するようにしてもよい。
[0214] また、本装置 100では、供給手段 Nと、加熱手段を含む環境設定手段 104と、前記 読取り手段と、前記基板の導入口と、前記基板の取り出し口と、を直列に配置するよ うにしてもよい。基板の搬送経路が直線的になるので、装置構成を簡略化できるから である。
[0215] この装置 100は、基板 1あるいは DNAチップ 10を収納部 102内部に入れて密閉し 、環境設定手段 104により温度や湿度を当該アツセィに適した範囲に設定した上で、 検出用核酸 Dの滴下又は注入、固定、標的核酸 Tやインターカレータの滴下又は注 入、電界印加、ハイブリダィゼーシヨン、洗浄又は除去作業、検出（読み取り）などの 作業を所定のタイミングで、自動的に実施できるようにした装置として機能する。
[0216] 即ち、この装置 100は、ハイブリダィゼーシヨンの場を提供し得る反応領域をその表 面に有する基板を処理するための方法を実施できる。
[0217] 例えば、検出用核酸 Dが固定された反応領域 Rに対して標的核酸 Tを供給する核 酸供給工程 (加湿を行ってもよい。）と、前記標的核酸 Tが供給された前記基板 1 (又 は DNAチップ 10)の温度を制御する温度制御工程と、前記反応領域 Rにおけるハイ ブリダィゼーシヨンの状態を読取るための読み取り工程 (例えば、光学的な読み取り 工程)を順次連続的に行う方法を実施できる。また、前記基板の反応領域 Rに電界を 印加する工程を実施し、ハイブリダィゼーシヨン効率や検出精度を向上させることもで きる。
[0218] 核酸供給工程で加湿を行うことにより、媒質 (例えば溶液)の乾燥を防止することが できる。また、温度制御を行う工程では、至適温度条件を設定して、反応領域 Rに固 定された検出用核酸 Dと標的核酸 Tとの間のハイブリダィゼーシヨンを行うことができ る。
[0219] ここで、図 16は、 DNAチップの製造又は Z及びハイブリダィゼーシヨン検出の際に 採用可能な基板処理システムの概念ブロック図である。
[0220] この図 16に示された自動処理システム 200は、固定作業やハイブリダィゼーシヨン 検出作業を大量に行う場合に特に好適なオートメーションシステムとして利用できる。 なお、このオートメーションシステムの概念や構成を上記基板処理装置 100に応用し てもよい。
[0221] まず、システム 200は、（未固定状態の）基板 1や（固定済みの） DNAチップ 10を、 所定枚数ストック可能な第 1ストッカー 201を備える。この第 1ストッカー 201は、密閉 可能な空間を備え、温度や湿度の条件を制御できる手段を備える。
[0222] また、第 1ストッカー 201は、ストックされた基板 1や DNAチップ 10を自動識別して、 他のステージに向けて排出したり、他のステージ力 送られてきた基板 1や DNAチッ プ 10を識別して、指定の箇所に収容したりする機能を有する。
[0223] また、本システム 200は、この第 1ストッカー 201との間で、双方向に基板 1 (又は D NAチップ 10)の搬送が可能に構成され、ノズルヘッド N、媒質貯留部、媒質の滴下 又は注入を制御する制御部等（図 14参照）が配置されたスポッティング 'ステージ 20 2を備える。
[0224] また、電界印加のための通電手段や電界印加を制御する手段、そして、温度や湿 度を制御する手段を有するハイブリダィゼーシヨン'ステージ 203を備える。
[0225] このハイブリダィゼーシヨン'ステージ 203は、前記第 1ストッカー 201や前記スポッ ティング 'ステージ 202との間で、双方向に基板 1 (又は DNAチップ 10)の搬送が可 能に構成されている。
[0226] なお、スポッティング 'ステージ 202は、複数箇所設けられていてもよぐこの場合、 各スポッティング 'ステージ 202において、それぞれ異なる検出用核酸 Dが滴下又は 注入されるようにする。
[0227] 図 16の符号 204は、検出（読み取り）ステージを示している。この検出ステージ 204 には、検出用又はサーボ用の光学系手段（図 14参照）、 DNAチップ 10の回転手段 、サーボ機構などが設けられている。
[0228] この検出ステージ 204は、ハイブリダィゼーシヨンが完了した DNAチップ 10の各検 出部 3におけるハイブリダィゼーシヨンの状態を検出する場所であり、図示しない解析 部や表示部と連結されている。この検出ステージ 204は、ハイブリダィゼーシヨン'ス テージ 203、あるいは第 1ストッカー 201との間で、双方向に DNAチップ 10の受け渡 しが可能に構成されている。
[0229] 符号 205は、第 2ストッカーであり、検出ステージ 204で検出作業を終えた DNAチ ップ 10を回収し、ストックする場所である。なお、この第 2ストッカー 205は、スポッティ ング 'ステージ 202やハイブリダィゼーシヨン'ステージ 203からの基板 1や DNAチッ プ 10を受け取り、回収できるようにしてもよい。
[0230] 以上説明したようなシステム 200を有効に利用すれば、必要なときに、所望するアツ セィ作業を迅速に、かつ大量に実施することができる。
[0231] < 5.ハイブリダィゼーシヨン検出方法について >
次に、本発明に係る「ノヽイブリダィゼーシヨン検出方法」を、図 14に加えて、図 17、 図 18を主に参照して、具体的に説明する。なお、図 17は、ハイブリダィゼーシヨン検 出方法の工程フローの一例を示す図、図 18は、同方法の他の工程フローを示す図 である。
[0232] まず、検出用核酸 Dが既に整列固定ィ匕されている DNAチップ 10を、水平にデイス ク支持台 8 (図 14参照）に固定する。そして、フォーカスサーボ及びトラッキングサー ボを動作させながら DNAチップ 10を回転させ、アドレス情報を検出しながら、選択さ れた検出部 3に標的核酸を含有する媒質 Mを、ノズルヘッド Nを介して滴下又は注
2 1
入する（図 17の符号 Pで示す工程)。 [0233] 次に、前記反応領域 Rに貯留又は保持された媒質に、対向電極 (例えば、 E -E、
1 2 図 4参照)介して、「電界印カロ」を行うことで得られる誘電泳動によって、固定化されて V、る検出用核酸 (D)の伸長と、反応領域 R中に遊離状態で存在して!/、る標的核酸（ T)の伸長及び検出表面 Uへの移動と、を少なくとも行う（図 17の符号 Pで示す工程
) o
[0234] 続、て、電界オフの状態を形成するか、あるいは電界印加の状態を継続するかし て、検出用核酸 Dと標的核酸 Tとの間のノ、イブリダィゼーシヨンを、自然なブラウン運 動の支配下で進行させる（図 17の符号 Pで示す工程)。
8
[0235] 本発明では、前記電界印加によって、立体障害などの問題が解消できるので、ハイ ブリダィゼーシヨン反応を極めて短時間で完了させることができる。なお、上記説明で は、工程 Pと Pをそれぞれ分離して行ったが、同時に行ってもよい。
7 8
[0236] なお、本方法では、検出部 3単位に、反応温度条件を選択できる加温手段並びに 検出部 3の媒質の温度を検出する温度検出手段と、を備えるように工夫し、前記検出 用核酸 Dと標的核酸 Tと間の至適反応条件に基づ 、て、前記加温手段を制御して作 動させることによって、前記検出部 3単位に至適温度条件を設定し、前記検出用核 酸 Dと標的核酸 Tとの間のハイブリダィゼーシヨンを進行させるように工夫してもよ 、。
[0237] 次に、反応領域 Rに対して、ノズルヘッド Nを介して、蛍光標識されたインターカレ ータ Iを滴下又は注入して、このインターカレータ Iを前記ハイブリダィゼーシヨンにより 得られた二本鎖核酸に挿入結合させる（図 17の符号 Pで示す工程)。また、このェ
9
程 Pは、前記工程 Pと Pと同時に行ってもよいことは言うまでもない。さらに、後述す
9 7 8
る図 18に示す場合も同様である。
[0238] その後に、前記反応領域 Rに貯留又は保持されている媒質に対して、再び「電界 印加」を行うことで得られる誘電泳動によって、ミスハイブリダィゼーシヨンを示した物 質や余剰物質 B (例えば、余剰の標的核酸や余剰のインターカレータ、図 7参照）を、 ハイブリダィゼーシヨン領域 (検出表面領域)から除去するようにしてもょ 、（図 17の 符号 P で示す工程)。
10
[0239] 前記工程 Pあるいは前記工程 P に続いて、所定波長の励起光 Qを反応領域尺に
9 10
照射して得られる蛍光強度を、上記したシステムの光ピックアップ手段（図 14参照）を 用いて検出する（図 17の符号 P で示す工程)。
11
[0240] 即ち、インターカレータカも発せられた蛍光 Fの強度を検出し、検出用核酸物質と 標的核酸とのハイブリダィゼーシヨンの状況を判断する。ディテクタ出力は AD変 20によって特定ビット数のデジタル信号 32に変換される（図 12参照)。
[0241] これにより、 DNAチップ 10上のアドレスと蛍光強度を対応させたマップを作成する ことができる。そして、このマップと各反応領域 Rに対してどのような塩基が配列の検 出用核酸に固定化されていたかを示す配置マップに基づき、標的核酸の解析を行 なう（図 17の符号 P で示す工程)。
12
[0242] なお、図 18には、標的核酸 Tを滴下又は注入する工程 Pと、インターカレータを滴
6
下又は注入する工程 Pを同時に行うように工夫した変形例である工程が示されて!/ヽ
9
る。この工程では、工程 Pと工程 Pを併合することで、一工程省略できる結果、作業
6 9
効率の面では有利となる。
[0243] < 6.電界印加の方法について >
以下、本発明に係る方法で採用可能な「電界印力！]」の方法を、具体例を挙げて説 明する。
[0244] 以下に説明する「電界印加」は、基板 1から DNAチップ 10を製造する際の検出用 核酸の固定化工程、あるいは DNAチップ 10を用いたハイブリダィゼーシヨン検出の 際のハイブリダィゼーシヨン工程及びその前後の工程で、それぞれの電界印加例の 作用効果に応じて、適宜採用可能である。
[0245] なお、電界強度、周波数、印加時間は限定されるものではなぐ核酸の種類、長さ 等により、適正な電界強度、周波数、印加時間を選ぶことが望ましい。波形について も、サイン波に限定するものではなぐ例えば、三角波等でもよい。
[0246] まず、図 19は、符号 Wで示す高周波電界を印加した直後に、符号 Wで示す低周
1 2 波電界を印加した場合の電界印加例を示している。続く、図 20は、図 19における低 周波電界 W印加部分を、符号 Wで示す低周波の矩形交流電界とした電界印加例
2 3
を示している。
[0247] 次に、図 21は、図 19の変形例で、高周波電界 Wを印加した後に電界を 0とし（図 中の W部分参照）、電極周辺に誘電泳動効果で集まった標的核酸のブラウン運動 による自然なハイブリダィゼーシヨンを起こさせる時間を設けた後に、低周波電界 w
2 を印加した方法例である。
[0248] なお、図 20の電界印加例においても、低周波の交流電界 Wを印加する前に、同
3
様の電界 0の時間 Wを設けてもよい。
0
[0249] 図 22は、高周波電界 Wを印加した後に、符号 Wで示す直流 (DC)電界を印加し
1 4
、電気泳動により標的核酸を電極に引き寄せる効果を相乗させるように工夫し、その 後に低周波電界 Wを印加した電界印加例を示して ヽる。
2
[0250] 図 23は、高周波電界 Wを印加する前に、直流電界 Wを印加しておいて、予め電
1 4
気泳動により標的核酸を電極に引き寄せておき、それに続いて、高周波電界 Wを印 カロしたあとに、低周波電界 Wを印加した電界印加例を示している。
2
[0251] 図 24は、直流成分も同時に印加するようにした高周波電界 Wを印加しておくこと
5
で、電気泳動により標的核酸を電極に引き寄せる効果を相乗させるようにし、その後 に低周波電界 wを印加した電界印加例を示して ヽる。
2
[0252] 図 25は、高周波電界 Wを印加した後に、直流成分も同時に印加された低周波電 界 Wを印加するようにして、電気泳動により、余剰な相補的ではない標的核酸やミス
6
ノ、イブリを起こした核酸、立体障害が原因でハイプリが完全にできな力つた相補的な 標的核酸を電極近傍力 引き離す効果を相乗させるようにした電界印加例を示して いる。
[0253] 図 26は、直流成分を同時に印加した高周波電界 Wによって、電気泳動により標的
5
核酸を電極に引き寄せる効果を相乗させ、その後に、直流成分を同時に印加した低 周波電界 wを印加しておくことによって、電気泳動により余剰な相補的ではない核
6
酸やミスハイプリを起こした標的核酸、立体障害が原因でハイプリが完全に出来なか つた相補的な標的核酸を電極近傍から引き離す効果を相乗させた電界印加例を示 している。
[0254] なお、図示はしないが、図 19〜図 26において、低周波電界 W部分を低周波の交
2
流電界 Wとしてもよい。さら〖こは、低周波電界 Wあるいは低周波の交流電界 Wを
3 2 3 印加する前に、電界を 0の時間 Wを設け、電極周辺に誘電泳動効果で集まった標
0
的核酸のブラウン運動による自然なハイブリダィゼーシヨンを起こさせる時間を設けて ちょい。
産業上の利用可能性
[0255] 本発明は、基板に設けられた微少な反応領域内でのハイブリダィゼーシヨンを効率 よく進行させることができるので、該ハイブリダィゼーシヨンの時間を大幅に短縮する ことができる。また、正確なハイブリダィゼーシヨンが進行し易い条件や環境を提供で きるので、擬陽性や偽陰性の発生を少なく抑え、検出精度を飛躍的に向上させること ができる。
[0256] 本発明は、ハイブリダィゼーシヨン検出に係わる作業を短時間で効率よく実施でき、 かつ検出精度の高いハイブリダィゼーシヨン検出を実施できる装置、システム、並び に方法として利用することができる。

Claims

請求の範囲 [1] ハイブリダィゼーシヨンの場となる反応領域と、該反応領域に貯留又保持される媒 質に電界印加可能に配置される対向電極と、を少なくとも備える検出部が配設されて なる基板を用いて、
(1)前記基板の表面処理を行う工程と、
(2)前記反応領域に貯留又は保持され、予め調整された検出用核酸を含む媒質に 対して、前記対向電極を介して電界印加を行うことによって、前記電極表面に前記検 出用核酸を固定する工程と、
(3)余剰の前記検出用核酸を前記反応領域力 除去する工程と、
を少なくとも行うことを特徴とする DNAチップの製造方法。
[2] 前記（1)の工程は、前記基板の親媒性加工を行う工程である請求項 1記載の DNA チップの製造方法。
[3] 前記媒質は、前記反応領域に対して滴下又は注入することにより、該反応領域に 貯留又は保持されることを特徴とする請求項 1記載の DNAチップの製造方法。
[4] 前記基板は、円盤状基板であることを特徴とする請求項 1記載の DNAチップの製 造方法。
[5] 前記円盤状基板を回転させながら前記媒質の滴下又は注入を行なうことを特徴と する請求項 4記載の DNAチップの製造方法。
[6] 前記（2)の工程は、電界印加による誘電泳動に基づいて前記検出用核酸を移動さ せる工程を含むことを特徴とする請求項 1記載の DNAチップの製造方法。
[7] 前記電界印加は、高周波電界印加であることを特徴とする請求項 1記載の DNAチ ップの製造方法。
[8] 前記高周波電界は、 lMVZm以上及び 1MHz以上であることを特徴とする請求 項 7記載の DNAチップの製造方法。
[9] ハイブリダィゼーシヨンの場となる反応領域と、該反応領域に貯留又保持される媒 質に電界印加可能に配置される対向電極と、を少なくとも備える検出部が配設されて なる基板を用いて、
予め調整された検出用核酸を含む媒質を前記反応領域に滴下又は注入する手段 と、
前記反応領域に貯留又は保持された前記媒質に対して、前記対向電極を介して 電界印加を行う手段と、
を少なくとも備えることを特徴とする DNAチップの製造システム。
[10] 前記媒質を前記反応領域に滴下又は注入し、該反応領域に前記媒質を貯留また は保持するためのスポッティング手段を備えることを特徴とする請求項 9記載の DNA チップの製造システム。
[11] 前記反応領域に存在する余剰の前記検出用核酸を前記反応領域から除去する手 段を備えることを特徴とする請求項 9記載の DNAチップの製造システム。
[12] 前記電界印加を行う手段は、高周波電界印加を行う手段であることを特徴とする請 求項 9記載の DNAチップの製造システム。
[13] 前記基板を回転させる手段を備えることを特徴とする請求項 9記載の DNAチップ の製造システム。
[14] 前記滴下又は注入する手段は、前記基板の回転に同期して前記反応領域に媒質 を供給する請求項 13記載の DNAチップの製造システム。
[15] ハイブリダィゼーシヨンの場となる反応領域と、該反応領域に貯留又保持される媒 質に電界印加可能に配置される対向電極と、前記反応領域中に固定された検出用 核酸と、を少なくとも備える検出部が配設されてなる基板を用いて、
(1)予め調整された標的核酸を含む媒質を前記反応領域に滴下又は注入する工程 と、
(2)前記反応領域に貯留又は保持された前記媒質に前記対向電極を介して電界印 加を行う工程と、
(3)前記検出用核酸と前記標的核酸との間のハイブリダィゼーシヨンを進行させるェ 程と、
(4)前記反応領域にインターカレータを滴下又は注入する工程と、
(5)所定波長の励起光を前記反応領域に照射して得られる蛍光強度を検出するェ 程と、
を少なくとも行うことを特徴とするハイブリダィゼーシヨン検出方法。
[16] 前記（1)工程と (4)工程を、同時に行うことを特徴とする請求項 15記載のハイブリダ ィゼーシヨン検出方法。
[17] 前記（3)の工程を電界印加の状態で行うことを特徴とする請求項 15記載のハイプリ ダイゼーシヨン検出方法。
[18] 前記（3)の工程を電界オフの状態で行うことを特徴とする請求項 15記載のハイプリ ダイゼーシヨン検出方法。
[19] 少なくとも前記 (5)の工程を行う前に、前記反応領域中に存在する余剰の標的核 酸を、ハイブリダィゼーシヨン領域から除去する工程を行うことを特徴とする請求項 15 記載のハイブリダィゼーシヨン検出方法。
[20] 電界印加によって、ハイブリダィゼーシヨン領域外の電極表面に余剰の標的核酸を 引き寄せることを特徴とする請求項 19記載のハイブリダィゼーシヨン検出方法。
[21] 前記基板は、前記励起光を透過する層を備えることを特徴とする請求項 15記載の ノヽイブリダィゼーシヨン検出方法。
[22] 前記励起光を基板の裏面側力も照射することを特徴とする請求項 15記載のハイブ リダィゼーシヨン検出方法。
[23] 前記（2)の工程の電界印加は、前記基板を一括又はブロック領域毎に行うことを特 徴とする請求項 15記載のハイブリダィゼーシヨン検出方法。
[24] 前記基板を回転させながら、前記（1)工程又は Z及び (4)工程を行うことを特徴と する請求項 15記載のハイブリダィゼーシヨン検出方法。
[25] 前記（5)工程にぉ ヽて、前記基板を回転させることを特徴とする請求項 23記載の ノヽイブリダィゼーシヨン検出方法。
[26] ハイブリダィゼーシヨンの場となる反応領域と、該反応領域に貯留又保持される媒 質に電界印加可能に配置される対向電極と、前記反応領域中に固定化された検出 用核酸と、を少なくとも備える検出部が配設されてなる基板を用いて、
(1)予め調整された標的核酸を含む媒質を前記反応領域に滴下又は注入する手段 と、
(2)前記反応領域に貯留又は保持された前記媒質に前記対向電極を介して電界印 加を行う手段と、 (3)前記検出用核酸と前記標的核酸との間のハイブリダィゼーシヨンを進行させる手 段と、
(4)前記反応領域にインターカレータを滴下又は注入する手段と、
(5)所定波長の励起光を前記反応領域に照射して得られる蛍光強度を検出する手 段と、
を少なくとも備えることを特徴とするハイブリダィゼーシヨン検出システム。
[27] 前記基板は、前記励起光を透過する層を備えることを特徴とする請求項 26記載の ハイブリダィゼーシヨン検出システム。
[28] 前記励起光の光源は、基板の裏面側に配置されたことを特徴とする請求項 26記載 のハイブリダィゼーシヨン検出システム。
[29] 前記ハイブリダィゼーシヨンの温度制御手段又は Z及び湿度制御手段を備えること を特徴とする請求項 26記載のノ、イブリダィゼーシヨン検出システム。
[30] 前記反応領域に水分を補給する手段を備えることを特徴とする請求項 26記載のハ イブリダィゼーシヨン検出システム。
[31] 前記基板の回転手段を有することを特徴とする請求項 26記載のノ、イブリダィゼー シヨン検出システム。
[32] 前記基板の前記検出部の位置決め用サーボ手段及びフォーカスサーボ手段を有 することを特徴とする請求項 26記載のハイブリダィゼーシヨン検出システム。
[33] ノ、イブリダィゼーシヨンの場を提供し得る反応領域をその表面に有する基板を処理 するための装置であって、
(1)検出用核酸が固定された前記反応領域へ標的核酸を供給する供給手段と、
(2)前記標的核酸が供給された前記基板の温度制御を行うための加熱手段と、
(3)前記基板のハイブリダィゼーシヨンの状況を読取る読取り手段と、
(4)前記基板を搬送する搬送手段と、
を有する基板処理装置。
[34] 前記基板に電界を印加する手段を備えることを特徴とする請求項 33記載の基板処 理装置。
[35] 前記読取り手段は光学的読取り手段であることを特徴とする請求項 33記載の基板 処理装置。
[36] 前記基板が、前記搬送手段によって、前記供給手段と前記加熱手段と前記読取り 手段の間を連続的に搬送されることを特徴とする請求項 33記載の基板処理装置。
[37] 前記供給手段と前記加熱手段と前記読取り手段が直列に配置されていることを特 徴とする請求項 33記載の基板処理装置。
[38] 前記供給手段は加湿手段を備えることを特徴とする請求項 33記載の基板処理装 置。
[39] 前記供給手段に向けて前記基板を導入するための基板導入手段と、
前記読取り手段から前記基板を取り出すための基板取り出し手段と、
を備えることを特徴とする請求項 33記載の基板処理装置。
[40] 前記基板導入手段と前記基板取り出し手段は、共通の手段であることを特徴とする 請求項 39記載の基板処理装置。
[41] 前記供給手段と、前記加熱手段と、前記読取り手段と、前記基板の導入口と、前記 基板の取り出し口と、が直列に配置されていることを特徴とする請求項 39記載の基 板処理装置。
[42] 検出用核酸が固定された前記反応領域に対して溶媒を供給する第二の供給手段 を備えることを特徴とする請求項 33記載の基板処理装置。
[43] 血液から核酸を抽出する抽出手段を備えることを特徴とする請求項 33記載の基板 処理装置。
[44] ノ、イブリダィゼーシヨンの場を提供し得る反応領域をその表面に有する基板を処理 するための方法であって、
検出用核酸が固定された前記反応領域に対して標的核酸を供給する核酸供給ェ 程と、
前記標的核酸が供給された前記基板の温度を制御する温度制御工程と、 前記反応領域におけるハイブリダィゼーシヨンの状態を読取るための読み取り工程 と、を有し、上記各工程が順次連続的に行われる基板処理方法。
[45] 前記基板に電界を印加する工程を行うことを特徴とする請求項 44記載の基板処理 方法。
[46] 前記温度制御を行う工程において、前記検出用核酸と前記標的核酸との間のハイ ブリダィゼーシヨンを行うことを特徴とする請求項 44記載の基板処理方法。
[47] 前記読取り工程は、光学的読取り工程であることを特徴とする請求項 44記載の基 板処理方法。
[48] 前記核酸供給工程と前記温度制御工程と前記読取り工程の各工程間で、前記基 板が搬送されることを特徴とする請求項 44記載の基板処理方法。
[49] 前記核酸供給工程の段階で加湿を行うことを特徴とする請求項 44記載の基板処 理方法。
PCT/JP2005/014314 2004-08-05 2005-08-04 Ｄｎａチップの製造方法と製造システム、ハイブリダイゼーション検出方法と検出システム、並びに基板処理装置と基板処理方法 WO2006018981A1 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP05768495A EP1775589A4 (en) 2004-08-05 2005-08-04 METHOD FOR PRODUCING DNA CHIPS, MANUFACTURING SYSTEM, HYBRIDIZATION DETECTION METHOD, DEFINITION SYSTEM, SUBSTRATE TREATMENT DEVICE AND SUBSTRATE TREATMENT METHOD

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2004229837A JP2006047153A (ja) 2004-08-05 2004-08-05 Ｄｎａチップの製造方法と製造システム、ハイブリダイゼーション検出方法と検出システム、並びに基板処理装置と基板処理方法
JP2004-229837 2004-08-05

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2006018981A1 true WO2006018981A1 (ja) 2006-02-23

Family

ID=35907371

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2005/014314 WO2006018981A1 (ja) 2004-08-05 2005-08-04 Ｄｎａチップの製造方法と製造システム、ハイブリダイゼーション検出方法と検出システム、並びに基板処理装置と基板処理方法

Country Status (5)

Country Link
EP (1) EP1775589A4 (ja)
JP (1) JP2006047153A (ja)
KR (1) KR20070048713A (ja)
CN (1) CN1993617A (ja)
WO (1) WO2006018981A1 (ja)

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011046059A1 (ja) * 2009-10-13 2011-04-21 株式会社村田製作所 液中物質検出装置の製造方法及び液中物質検出装置
JP2013224947A (ja) * 2008-04-03 2013-10-31 Regents Of The Univ Of California 細胞、小胞、ナノ粒子およびバイオマーカーを分離および単離するためのエキソビボの多次元システム
US8815555B2 (en) 2012-04-16 2014-08-26 Biological Dynamics, Inc. Nucleic acid sample preparation
US8932815B2 (en) 2012-04-16 2015-01-13 Biological Dynamics, Inc. Nucleic acid sample preparation
US9387489B2 (en) 2014-04-08 2016-07-12 Biological Dynamics, Inc. Devices for separation of biological materials
US10232369B2 (en) 2016-03-24 2019-03-19 Biological Dynamics, Inc. Disposable fluidic cartridge and components
WO2020095944A1 (ja) * 2018-11-08 2020-05-14 株式会社エンプラス 流体取扱装置、保持装置および流体取扱システム
US10818379B2 (en) 2017-05-08 2020-10-27 Biological Dynamics, Inc. Methods and systems for analyte information processing
US11731132B2 (en) 2017-12-19 2023-08-22 Biological Dynamics, Inc. Methods and devices for detection of multiple analytes from a biological sample
US11883833B2 (en) 2018-04-02 2024-01-30 Biological Dynamics, Inc. Dielectric materials

Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007105784A1 (ja) * 2006-03-10 2007-09-20 Cluster Technology Co., Ltd. 誘電泳動装置
US11098345B2 (en) 2006-06-05 2021-08-24 California Institute Of Technology Methods for detecting target analytes
US11525156B2 (en) 2006-07-28 2022-12-13 California Institute Of Technology Multiplex Q-PCR arrays
WO2008014485A2 (en) 2006-07-28 2008-01-31 California Institute Of Technology Multiplex q-pcr arrays
US11560588B2 (en) 2006-08-24 2023-01-24 California Institute Of Technology Multiplex Q-PCR arrays
JP2009034052A (ja) 2007-08-02 2009-02-19 Canon Inc ハイブリダイゼーション方法および装置
GB0804491D0 (en) 2008-03-11 2008-04-16 Iti Scotland Ltd Detecting analytes
KR20100084019A (ko) * 2009-01-15 2010-07-23 삼성전자주식회사 회전체의 원점 인식 장치 및 방법
JP5456355B2 (ja) * 2009-04-02 2014-03-26 東洋鋼鈑株式会社 Ｉｔｏ層を有する生体物質固定化用担体
JP5310373B2 (ja) 2009-05-14 2013-10-09 ソニー株式会社 光学的検出装置
JP2012255773A (ja) * 2011-05-13 2012-12-27 Jvc Kenwood Corp 試料分析用ディスクおよび試料分析用ディスク製造方法
JP5967756B2 (ja) * 2012-04-27 2016-08-10 学校法人 東洋大学 分光用基板
CN105874320B (zh) * 2013-12-13 2019-08-30 阿比奥尼克公司 用于纳米流体生物传感器的气体排空系统
US9708647B2 (en) * 2015-03-23 2017-07-18 Insilixa, Inc. Multiplexed analysis of nucleic acid hybridization thermodynamics using integrated arrays
WO2017155858A1 (en) 2016-03-07 2017-09-14 Insilixa, Inc. Nucleic acid sequence identification using solid-phase cyclic single base extension
CN105772127B (zh) * 2016-04-28 2017-10-31 宁波大学 一种生物芯片杂交装置
CN107118960B (zh) * 2017-05-15 2019-10-01 京东方科技集团股份有限公司 一种基因测序芯片、基因测序系统及其测序方法
JP2022525322A (ja) 2019-03-14 2022-05-12 インシリクサ， インコーポレイテッド 時間ゲート蛍光ベースの検出のための方法およびシステム
CN111718849B (zh) * 2019-03-19 2024-04-30 深圳华大智造科技股份有限公司 加载促进装置及加载装置

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002286737A (ja) * 2001-03-28 2002-10-03 Canon Inc プローブ担体製造方法および装置
JP2004012273A (ja) * 2002-06-06 2004-01-15 Sony Corp バイオアッセイ装置及びバイオアッセイ用基板
JP2004045376A (ja) * 2002-05-21 2004-02-12 Sony Corp バイオアッセイ用基板
JP2004132910A (ja) * 2002-10-11 2004-04-30 Aloka Co Ltd 展開部材、処理ユニットおよび処理装置
JP2004135512A (ja) * 2002-08-20 2004-05-13 Sony Corp ハイブリダイゼーション検出部とセンサーチップ及びハイブリダイゼーション方法
EP1507146A1 (en) 2002-05-21 2005-02-16 Sony Corporation Bioassay method, bioassay device, and bioassay substrate

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6569382B1 (en) * 1991-11-07 2003-05-27 Nanogen, Inc. Methods apparatus for the electronic, homogeneous assembly and fabrication of devices
US20020142341A1 (en) * 2001-03-28 2002-10-03 Makoto Kameyama Method and apparatus for producing probe carrier
JP4151483B2 (ja) * 2003-06-10 2008-09-17 ソニー株式会社 バイオアッセイ用基板並びにバイオアッセイ装置及び方法
JP4321854B2 (ja) * 2003-10-02 2009-08-26 ソニー株式会社 ハイブリダイゼーションその他の相互作用検出部と該検出部を備えるｄｎａチップその他のバイオアッセイ用基板

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002286737A (ja) * 2001-03-28 2002-10-03 Canon Inc プローブ担体製造方法および装置
JP2004045376A (ja) * 2002-05-21 2004-02-12 Sony Corp バイオアッセイ用基板
EP1507146A1 (en) 2002-05-21 2005-02-16 Sony Corporation Bioassay method, bioassay device, and bioassay substrate
JP2004012273A (ja) * 2002-06-06 2004-01-15 Sony Corp バイオアッセイ装置及びバイオアッセイ用基板
JP2004135512A (ja) * 2002-08-20 2004-05-13 Sony Corp ハイブリダイゼーション検出部とセンサーチップ及びハイブリダイゼーション方法
JP2004132910A (ja) * 2002-10-11 2004-04-30 Aloka Co Ltd 展開部材、処理ユニットおよび処理装置

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See also references of EP1775589A4 *

Cited By (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2013224947A (ja) * 2008-04-03 2013-10-31 Regents Of The Univ Of California 細胞、小胞、ナノ粒子およびバイオマーカーを分離および単離するためのエキソビボの多次元システム
WO2011046059A1 (ja) * 2009-10-13 2011-04-21 株式会社村田製作所 液中物質検出装置の製造方法及び液中物質検出装置
US9206416B2 (en) 2012-04-16 2015-12-08 Biological Dynamics, Inc. Nucleic acid sample preparation
US10006083B2 (en) 2012-04-16 2018-06-26 Biological Dynamics, Inc. Nucleic acid sample preparation
US8871481B2 (en) 2012-04-16 2014-10-28 Biological Dynamics, Inc. Nucleic acid sample preparation
US8877470B2 (en) 2012-04-16 2014-11-04 Biological Dynamics, Inc. Nucleic acid sample preparation
US8932815B2 (en) 2012-04-16 2015-01-13 Biological Dynamics, Inc. Nucleic acid sample preparation
US9005941B2 (en) 2012-04-16 2015-04-14 Biological Dynamics, Inc. Nucleic acid sample preparation
US9034579B2 (en) 2012-04-16 2015-05-19 Biological Dynamics, Inc Nucleic acid sample preparation
US9034578B2 (en) 2012-04-16 2015-05-19 Biological Dynamics, Inc. Nucleic acid sample preparation
US8815555B2 (en) 2012-04-16 2014-08-26 Biological Dynamics, Inc. Nucleic acid sample preparation
US8815554B2 (en) 2012-04-16 2014-08-26 Biological Dynamics, Inc. Nucleic acid sample preparation
US9499812B2 (en) 2012-04-16 2016-11-22 Biological Dynamics, Inc. Nucleic acid sample preparation
US9827565B2 (en) 2012-04-16 2017-11-28 Biological Dynamics, Inc. Nucleic acid sample preparation
US9682385B2 (en) 2014-04-08 2017-06-20 Biological Dynamics, Inc. Devices for separation of biological materials
US9387489B2 (en) 2014-04-08 2016-07-12 Biological Dynamics, Inc. Devices for separation of biological materials
US10232369B2 (en) 2016-03-24 2019-03-19 Biological Dynamics, Inc. Disposable fluidic cartridge and components
US11534756B2 (en) 2016-03-24 2022-12-27 Biological Dynamics, Inc. Compact device for detection of nanoscale analytes
US10818379B2 (en) 2017-05-08 2020-10-27 Biological Dynamics, Inc. Methods and systems for analyte information processing
US11731132B2 (en) 2017-12-19 2023-08-22 Biological Dynamics, Inc. Methods and devices for detection of multiple analytes from a biological sample
US11883833B2 (en) 2018-04-02 2024-01-30 Biological Dynamics, Inc. Dielectric materials
WO2020095944A1 (ja) * 2018-11-08 2020-05-14 株式会社エンプラス 流体取扱装置、保持装置および流体取扱システム

Also Published As

Publication number Publication date
KR20070048713A (ko) 2007-05-09
JP2006047153A (ja) 2006-02-16
EP1775589A1 (en) 2007-04-18
EP1775589A4 (en) 2007-11-14
CN1993617A (zh) 2007-07-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2006018981A1 (ja) Ｄｎａチップの製造方法と製造システム、ハイブリダイゼーション検出方法と検出システム、並びに基板処理装置と基板処理方法
US8211380B2 (en) Bio-assay substrate, bio-assay apparatus, and reading apparatus
CN1869693B (zh) 生物鉴定用基板和装置、以及基板的制造方法
JP4193421B2 (ja) バイオアッセイ装置及びその製造方法、並びにバイオアッセイ方法
CN100350249C (zh) 相互作用检测方法、生物测定装置以及用于生物测定的基板
CN100387990C (zh) 生物测定方法、生物测定设备和生物测定衬底
JP4200801B2 (ja) バイオアッセイ用基板
JP4285119B2 (ja) 生化学反応装置、生化学反応用基板、ハイブリダイゼーション用基板の製造方法及びハイブリダイゼーション方法
JP4218257B2 (ja) バイオアッセイ方法及びバイオアッセイ装置
JP2005300460A (ja) 相互作用検出部と該検出部を備えるバイオアッセイ用基板、並びに媒質滴下方法と媒質の水分の蒸発を防止する方法
US20080124788A1 (en) Bioassay System And Bioassay Method
JP4321085B2 (ja) バイオアッセイ用基板とバイオアッセイ装置及び読み取り装置
JP4218274B2 (ja) バイオアッセイ装置
JP2005345181A (ja) 物質間の相互作用検出部と該検出部を備えるバイオアッセイ用基板、並びに物質間の相互作用の検出方法
JP2005030784A (ja) 生化学反応用基板、生化学反応装置及びハイブリダイゼーション方法
KR101162365B1 (ko) 바이오 어세이 방법, 바이오 어세이 장치 및 바이오어세이 기판
JP4984648B2 (ja) 検出素子、その製造方法、および標的検出装置
JP2006003148A (ja) リザーバ部に連通するチャネル部を備える検出部及びバイオアッセイ用基板
JP2002325566A (ja) 核酸センサ

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BW BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS KE KG KM KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NA NG NI NO NZ OM PG PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL SM SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): BW GH GM KE LS MW MZ NA SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IS IT LT LU LV MC NL PL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2005768495

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1020077002778

Country of ref document: KR

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 200580026530.2

Country of ref document: CN

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2005768495

Country of ref document: EP