JP4321085B2

JP4321085B2 - バイオアッセイ用基板とバイオアッセイ装置及び読み取り装置

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Publication number: JP4321085B2
Application number: JP2003068481A
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Inventors: 基裕古木; 久行山津
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Filing date: 2003-03-13
Publication date: 2009-08-26
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Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、バイオインフォマティクス（生命情報科学）分野において有用なバイオアッセイツールとなる円盤状の情報記録媒体等に関する。より詳細には、検出用物質が固相化された基板表面部位に標識化されたターゲット物質を含む溶液を滴下することにより、ハイブリダイゼーションその他の分子間相互反応が高精度に起こるように工夫されたバイオアッセイ用基板、該基板を用いたバイオアッセイ方法及び該基板を利用したバイオアッセイ装置並びにその記録情報の読み取り装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
【０００３】
本発明の主たる従来技術を以下説明する。現在、マイクロアレイ技術によって所定のＤＮＡが微細配列された、いわゆるＤＮＡチップ又はＤＮＡマイクロアレイ（以下、「ＤＮＡチップ」と総称。）と呼ばれるバイオアッセイ用の集積基板が、遺伝子の変異解析、ＳＮＰｓ（一塩基多型）分析、遺伝子発現頻度解析等に利用されており、創薬、臨床診断、薬理ジェノミクス、法医学その他の分野において広範囲に活用され始めている。
【０００４】
このＤＮＡチップは、ガラス基板やシリコン基板上に多種・多数のＤＮＡオリゴ鎖やｃＤＮＡ（complementary DNA）等が集積されていることから、ハイブリダイゼーション等の分子間相互反応の網羅的解析が可能となる点が特徴とされている。
【０００５】
ＤＮＡチップによる解析手法の一例を簡潔に説明すれば、ガラス基板やシリコン基板上に固相化されたＤＮＡプローブに対して、細胞、組織等から抽出したｍＲＮＡを逆転写ＰＣＲ反応等によって蛍光プローブｄＮＴＰを組み込みながらＰＣＲ増幅し、前記基板上においてハイブリダイゼーションを行い、所定の検出器で蛍光測定を行うという手法である。
【０００６】
ここで、ＤＮＡチップは二つのタイプに分類できる。第１のタイプは、半導体露光技術を応用したフォトリソグラフィーの技術を用いて、所定の基板上に直接オリゴヌクレオチドを合成していくものであり、アフィメトリクス社（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）によるものが代表的である。この種のチップは、集積度は高いが、基板上でのＤＮＡ合成には限界があって、数十塩基程度の長さである。第２のタイプは、「スタンフォード方式」とも称されるもので、先割れピンを用いて、予め用意されたＤＮＡを基板上に分注・固相化していくことによって作製されるものである。この種のチップは、集積度は前者に比べて低いが、１ｋｂ程度のＤＮＡ断片を固相化できるという利点がある。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記した従来のＤＮＡチップ技術では、該ＤＮＡチップ自体の集積数、集積密度が少なかったので、一度のアッセイで達成できる解析量が充分とは言えなかった。また、検出用物質の種類と数、更にはその基板上における配置分け（グルーピング）を、ユーザーが自由に設定することが困難であった。
【０００８】
また、Ｔｍ（melting Temperature）又はＧＣ含有率が揃っていないＤＮＡプローブが二次元の平面的な広がりを持つ基板表面上に検出用物質が配列された構成の従来のＤＮＡチップにおいては、同一のハイブリダイゼーション条件、洗浄条件に晒されて偽陽性又は偽陰性を示す危険性が高いという問題があった。
【０００９】
また、基板表面にＤＮＡプローブ等の検出用物質を固相化するとともに、ターゲット物質を含むサンプル溶液を滴下（スポッティング）するアッセイ装置と、該検出用物質と前記標識ターゲット物質の間の相互反応結果を読み取る、「リーダー」又は「スキャナー」とも称される解析装置が、従来別個独立の構成であったので、バイオアッセイとそれに続く読み取り及び解析作業を一連化できなかったので、非常に不便であった。
【００１０】
更に、ＤＮＡプローブ等の検出用物質やサンプル溶液の微小滴の量や形状が不均一であったので、蛍光強度読み取り精度が低いという技術的課題があった。
【００１１】
そして、チップ１枚当たり、更には集積量当りの単価が高く、解析装置も非常に高価な装置であった。
【００１２】
そこで、本発明は、固相化される検出用物質の集積量が多く、また、該物質のグルーピングが自在で、かつ安価なバイオアッセイ基板と、該基板の好適な製造方法並びにバイオアッセイを効率的かつ確実に行えるバイオアッセイ装置とアッセイと読み取り解析作業を一連化できる基板記録情報の読み取り装置を提供することを主な目的とする。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
上記技術的課題を解決するために、まず、本発明においては、以下の「バイオアッセイ用基板」を提供する。なお、本発明において「バイオアッセイ」とは、物質間の相互反応に基づく生化学的分析を意味する。
【００１４】
第１に提供するバイオアッセイ用基板は、光学的に記録情報の読み取りが可能とされた円盤状基板の表面に検出用物質を固相化できる検出表面を備え、この検出表面を、前記基板に上方視放射方向に延びるように設けられた溝構造内に設けるように工夫した。
【００１５】
ここで、本発明において「検出用物質」とは、検出表面に直接的に、又はリンカーを介して間接的に固相化され、蛍光物質等により標識されたターゲット物質と特異的な相互結合反応を発揮する低分子、高分子及び生体物質等を広く包含し、狭く解釈されない。また、基板に形成される「溝構造」とは、例えば、筋状に延設されたマイクロチャンネル構造又は溝構造部位であり、この溝構造内にはピットやセル構造等によって放射方向に区切りがあってもよく、また、ピットやセル構造の集合体から構成され、これらのピットやセル構造が配列された部位を上方視したときに略筋状の外観を呈するような構造であってもよく、狭く解釈されない。この溝構造を備えるバイオアッセイ用基板が属する一つの分野は、円盤状のマイクロチャネルアレイである。
【００１６】
このバイオアッセイ用基板は、検出用物質を固相化するための基板として、例えば、直径１０ｃｍ程度の円盤状基板が採用されているので、検出用物質を固相化できる検出表面又は該検出表面を備えるピット、グルーブ等を多数集積できるという利点がある。即ち、記録情報の集積量が多いＤＮＡチップやバイオセンサーチップ等を提供できる。
【００１７】
また、前記基板上に上方視放射状をなすように、互いにコンタミネーションしないように所定間隔で設けられた溝構造内に検出表面を設けた構成を採用しているので、溝構造毎に検出用物質の種類をグルーピングできる。例えば、疾病発症のマーカー遺伝子を溝構造単位でグルーピングしたり、Ｔｍ又はＧＣ含有率の違いに基づいて、溝構造単位に固相化するヌクレオチド（検出用物質）をグルーピングしたりすることが可能となる。これにより、検出用物質の至適反応が得られるバッファー組成、濃度等のハイブリダイゼーション条件その他の反応条件、洗浄条件、サンプル溶液濃度等を変えることが可能になるので、解析作業において偽陽性又は偽陰性が示される危険性を格段に減少させることができる。
【００１８】
また、円盤状基板の中心側から外周側に延びる上方視放射状の溝構造を該基板上に形成したことによって、毛細管現象を利用した送液や、円盤状の基板を所定の方法で回転させることによって生じる遠心力を生かした送液も利用することができる。例えば、反応後にアクティブに結合しなかった余分なターゲット物質を除去する際には、洗浄液を基板中心領域から溝構造内（の各検出表面部位）に、円滑かつ確実に送液することが可能となる。
【００１９】
続いて提供するバイオアッセイ用基板は、前記検出表面部位の位置情報と回転同期情報を提供する手段を備えるものであり、また、この手段が前記基板上に設けられたウォブリング又はアドレスピットによるものとすることができる。なお、「ウォブリング」とは、ディスク上の物理的な番地（アドレス）の情報を予めディスク上に記録するために、ユーザーによるデータを記録するグルーブ（案内溝）をトラックの中心に対してわずかに左右に蛇行させることである。通常、トラッキングサーボ帯域より高い周波数に対し、わずかな周波数の偏向（Deviation）を有するＦＭ変調を行われ、正弦波変調信号振幅をグルーブ半径方向変位として基板上に刻まれる。
【００２０】
このバイオアッセイ用基板は、位置情報と回転同期情報に基づいて、検出用物質含有溶液並びにターゲット物質含有溶液を所定の検出表面部位に正確に追従させて滴下する場合に好適に利用することができる。
【００２１】
更に提供するバイオアッセイ用基板は、上記基板上に形成された上記検出表面部位に、ヌクレオチド鎖、ペプチド、タンパク質、脂質、低分子化合物、リポソームその他の生体物質のいずれかが少なくとも固相化された構成を備えるものである。
【００２２】
この基板は、一本鎖ヌクレオチド鎖間の相互反応、即ちハイブリダイゼーションを行わせるＤＮＡチップ二本鎖ヌクレオチド鎖とペプチド（又はタンパク質）の相互反応、抗原抗体反応その他の分子間相互反応を行わせるバイオセンサーチップとして広く利用できる。
【００２３】
ここで、「ヌクレオチド鎖」とは、ヌクレオチドが重合したＤＮＡプローブを含むオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、プリンヌクレオチドとピリミジンヌクレオチオドが重合したＤＮＡ（全長あるいはその断片）、逆転写により得られるｃＤＮＡ（ｃＤＮＡプローブ）、ＲＮＡ等を広く含む。一本鎖の場合は、標的ヌクレオチド分子とのハイブリダイゼーション反応に基づく分析を行う。二本鎖の場合は、タンパク質とＤＮＡ（特定の配列部位）との反応に分析を行うことができ、例えば、転写因子であるホルモンレセプター等のレセプター分子と応答配列ＤＮＡ部分の結合等を分析することができる。「ペプチド」は、複数のアミノ酸がペプチド結合によって結合したものである。「タンパク質」は、Ｌ−α−アミノ酸がペプチド結合によって連結したポリペプチド鎖を主要構成成分とする生体高分子であって、単純タンパク質、複合タンパク質のいずれも含む。以上には、ストレプトアビジンと強固に結合するビオチンが結合されたＤＮＡ断片や種々のリガンド分子が含まれる。「脂質」には、リン脂質膜が含まれ、検出表面を膜モデルとして利用できる。「低分子化合物」には、シランカップリング剤が含まれる。該剤はシリコン表面又はガラス表面に結合され、ぺプチド、タンパク質等のリンカーとして機能する架橋剤の一種である。「生体分子」には、細胞やウイルス粒子も含まれる。なお、検出表面処理の構成は、固相化する検出用物質によって適宜選択でき、場合によっては吸着防止剤であるポリリシンで処理される。
【００２４】
次に、本発明では、以下の「バイオアッセイ方法」を提供する。
【００２５】
即ち、本発明に係るバイオアッセイ方法は、反射膜上に形成された光透過層に、複数の溝構造が上方視放射状に形成され、該溝構造内に検出用物質を固相化できるように表面処理された複数の検出表面部位が列設されるとともに、前記溝構造間の領域に前記検出表面部位の位置情報と回転同期情報を提供するウォブリング又はアドレスピットが設けられた構成の円盤状のバイオアッセイ用基板に対して、インクジェットプリンティング法によって、前記基板を回転させながら、複数の前記検出表面部位に同時に検出用物質含有溶液を滴下した後、下記数式により求められる時間Ｔ経過後に、前記検出用物質含有溶液を滴下した複数の検出表面部位に同時に標識ターゲット分子含有液を滴下する方法である。なお、下記数式におけるＬ_０は対物レンズの中心と一列目のノズル群までの距離、Ｌ_１はノズル群の配列間隔、ｎはノズル群の配列数、φは液滴の径、Ｖ_１は基板の線速度、Ｖ_２は液滴速度、Ｗはノズルから基板までの距離である。

【００２６】
この方法は、溝構造内の所定の検出表面部位に正確に追従させながら、検出用物質を含む微小滴、並んでいる標識ターゲット物質を含む微小滴を、正確に滴下する方法として、好適である。
【００２７】
ここで、「インクジェットプリンティング法」は、インクジェットプリンターで用いられるノズルを応用する方法であって、電気を用いてインクジェットプリンターのようにプリンターヘッドから基板に検出用物質を噴射し、固定する方法である。
【００２８】
この方法には、圧電式インクジェット法、バブルジェット法、超音波ジェット法がある。圧電式インクジェット法は、圧電体にパルスを印加することによって生じる変位の圧力によって液滴を飛ばす方法である。バブルジェット法は、熱方式であって、ノズル中のヒーターを熱して発生させた気泡の圧力によって液滴を飛ばす方式である。ノズル内にヒーターとなるシリコン基盤を埋め込み、約３００℃／ｓで制御して一様な気泡を作成し、液滴を押し出す。しかしながら、高温に液体が曝されることになることから、生体物質試料には適さないと考えられる。超音波ジェット法は、超音波ビームを液体の自由面に当てて、局所的に高い圧力を与えることによってその箇所から小滴を放出させる方式である。ノズルを必要とせず、高速で直径約１μｍの小滴を形成できる。
【００２９】
本発明においては、「インクジェットプリンティング法」として、「圧電式インクジェッティング法」を好適に採用できる。印加するパルスの形状を変えることによって、液滴（微小滴）のサイズを制御することができるので、解析精度向上に好適である。液滴表面の曲率半径が小さいときは液滴を小さくし、液滴の曲率半径が大きいときは液滴を大きくすることができる。また、パルスを急激に負の方向に変化させることにより液滴表面を内側に引っ張り、曲率半径を小さくすることも可能である。
【００３０】
「マイクロメカニカルスポッティング法」は、マイクロスポッティングペン、キャピラリー（細管）、あるいはピンセットを装着させたプリントヘッドを用いて、検出用物質を含む微小滴を基板上の検出表面部位にスポットしていく方法である。
【００３１】
次に、本発明では、以下の構成の「バイオアッセイ装置」を提供する。
【００３２】
まず、第１に提供されるバイオアッセイ装置は、光学的に記録情報の読み取りが可能とされた円盤状基板の表面に、検出用物質を固相化できる検出表面を備え、前記基板に上方視放射方向に延びるように設けられた溝構造内に前記検出表面が設けられ、位置情報と回転同期情報を提供するバイオアッセイ用基板を用いるバイオアッセイ装置であって、次の（１）〜（４）の手段等を少なくとも備える。
【００３３】
（１）前記バイオアッセイ用基板を回転可能に保持する基板回転手段、（２）前記基板回転手段によって、前記バイオアッセイ用基板を回転させながら検出用物質含有溶液並びに標識ターゲット物質含有溶液を前記検出表面部位に滴下する滴下装置、（３）該滴下装置と前記バイオアッセイ用基板との間の距離を一定に保持するためのフォーカスサーボ機構、（４）前記位置情報と回転同期情報に基づいて、前記溶液の滴下を前記検出表面部位に追従させるトラッキングサーボ機構。
【００３４】
このバイオアッセイ装置では、円盤状のバイオアッセイ用基板を、該基板の位置情報と回転同期情報に基づいて回転させながら、フォーカスサーボ機構によって、滴下距離を高精度に一定に維持することにより、所定位置に設けられた検出表面部位の一定の領域に均一形状の微小滴を滴下でき、蛍光強度を再現性良く検出することができる。また、トラッキングサーボ機構によって、検出用物質含有溶液とターゲット物質含有溶液を、順次所定の溝構造内の検出表面部位に追従させて確実に滴下することができる。この結果、検出用物質と標識ターゲット物質の反応を高精度に行わせることができるとともに、解析シグナルが安定し、解析精度が向上する。
【００３５】
ここで、上記バイオアッセイ装置において好適に採用できる滴下装置は、インクジェットプリンティング装置である。なお、インクジェットプリンティング装置は、既述した「インクジェットプリンティング法」を実施できる装置を意味する。なお、インクジェットプリンティング装置を採用する場合は、既述した理由により、圧電式インクジェットプリンティング法を実施できる装置が好適である。
【００３６】
ここで、上記バイオアッセイ装置における滴下装置としてインクジェットプリンティング装置を採用した構成では、バイオアッセイ用基板に対向配置されており、フォーカスサーボ及びトラッキングサーボを担うレーザー光を前記基板に出射する対物レンズを収容する支持体に、インクジェットノズルを一体化する。
【００３７】
この支持体一体型のインクジェットノズル構成は、フォーカスサーボ及びトラッキングサーボと同期させながら、基板に対して所定溶液の滴下を行うことができ、かつ装置をコンパクト化できる。
【００３８】
次に本発明では、以下の構成の「基板記録情報の読み取り装置」を提供する。
【００３９】
本発明で提供する基板記録情報の読み取り装置は、まず、上記バイオアッセイ装置とユニット化されている点に特徴を有し、そして、バイオアッセイ用基板に対して、フォーカスサーボとトラッキングサーボをかけるとともに、ピックアップレンズ等によって集光したレーザー光を、前記検出表面において前記検出用物質と結合したる蛍光標識ターゲット物質に照射し、励起されて発光する蛍光色素強度を検出するという構成を備える。
【００４０】
この手段では、基板表面にＤＮＡプローブ等の検出用物質を固相化し、続いてターゲット物質を含むサンプル溶液を滴下（スポッティング）して前記各物質間の相互反応を行うことができるバイオアッセイ装置と該検出用物質と前記ターゲット物質の間の相互反応情報に関する読み取り装置が一体化されているので、アッセイ作業とそれに続く読み取り作業を一連化することができる
【００４１】
以上のように、本発明は、ＤＮＡチップやバイオセンサーチップに係わる新規技術を提供するという技術的意義を有している。
【００４２】
【発明の実施の形態】
以下、添付図面に基づき、本発明の好適な実施形態について説明する。図１は、本発明に係る好適な実施形態であるバイオアッセイ用基板を上方視したときの外観図、図２（Ａ）は、同基板の構成を一部誇張して示す模式図、図２（Ｂ）は、同基板に配設された溝構造部分の一実施形態の構成を表す部分拡大図である。
【００４３】
まず、図１の符号１は、本発明に係るバイオアッセイ用基板の好適な一実施形態を示している。このバイオアッセイ用基板１（以下、「基板１」と略称）は、ＣＤ、ＤＶＤ、ＭＤ等の光情報記録媒体に用いられる円盤基板（ディスク）に採用される基材から形成されている。
【００４４】
該基材は、石英ガラスやシリコン、ポリカーボネート、ポリスチレンその他の円盤状に成形可能な合成樹脂、好ましくは射出成形可能な合成樹脂によって円盤状に形成されている。なお、安価な合成樹脂基板を用いることで、従来使用されていたガラスチップに比して低ランニングコストを実現できる。基板1の中心には、後述する基板回転手段に設けられたスピンドルに固定するための孔２が形成されている。
【００４５】
この基板１の一方の表面には、反射膜である厚さ４０ｎｍ程度のアルミ蒸着層が形成されており、該層は反射膜として機能している。この反射膜は、屈折率１．５以上の基盤単体からの表面反射４％以上とする。この反射膜の上層には、透明なガラスや透明樹脂等からなる光透過層が成膜されている。なお、基材が高反射率の材料である場合には、基材表面自体が反射面として機能するので前記反射膜は形成しなくてもかまわない。また、金属膜などの高反射率膜を形成すれば蛍光標識されたターゲット物質の蛍光強度を、感度良く検出することができる。
【００４６】
前記光透過層には、基板１の中心部から上方視放射状に延びる溝構造３が所定間隔で凹設されている。各溝構造３内には、検出用物質を固相化できるように表面処理された検出表面部位Ｓ（図２参照）が、半径方向に所定間隔で配列されている。なお、検出表面部位Ｓは、各溝構造内に配列されたピット部分に形成してもよく、各溝構造３の内側壁面全体に亘って形成することも可能である。
【００４７】
また、基板１の変形例を表す外観図である図３のように、セル状のピット３ａに検出表面部位Ｓを設け、そしてこのピット３ａを放射状方向に複数配列し、更に放射状に並んだピット３ａの列を、周方向に複数形成した構成を採用することも可能である。溝構造３、該溝構造３内のピット又はセル状のピット３ａの検出表面に対して微小滴を滴下することによって、ほぼ同一のスポットサイズを実現できるので、再現性の良い蛍光強度検出を実現できる。なお、図３中の符号４ａは、アドレスピット等を表している。
【００４８】
前記検出表面部位Ｓは、ＤＮＡプローブ等の所望の検出用物質を固相化するために好適な表面処理が適宜選択されて施されている。例えば、アミノ基含有のシランカップリング剤溶液やポリリシン溶液で表面処理される。合成樹脂製基板であれば、その表面をプラズマ処理及びＤＵＶ（ＤｅｅｐＵＶ、遠赤外）照射処理後、アミノ基含有シランカップリング剤溶液で処理する。
【００４９】
また、表面に銅、銀、アルミニウム又は金をスパッタして成膜し、その表層にアミノ基、チオール基、カルボキシル基等の官能基（活性基）を有する物質やシステアミン、ストレプトアビジン等をコートしてもよい。また、検出表面には、必要に応じて検出用物質を固相化するためのリンカーを結合させておいてもよい。
【００５０】
基板１の回転方向には、予め光ディスクマスタリングプロセスにより形成された多数のアドレスピット４，４・・・が形成されている。ここで、基板１の位置情報及び回転同期情報について説明すると、基板１を光ディスクとして考えた場合、滴下検出位置である溝構造３をユーザーデータ領域と考え、他の領域は、サンプルサーボ方式等により同期ピットを配列し、かつトラッキングサーボとしても利用し、更に、直後にアドレス部（ディスク上の地理的な番地）を挿入することによって位置情報を与える。
【００５１】
アドレス部は、先頭パターンであるセクターマークから始まり、実際に回転しているディスクの回転位相を与えるＶＦＯ（Variable Frequency Oscillator）とアドレスデータの開始位置を与えるアドレスマークとトラックとセクタのナンバーが入ったＩＤ（Identifer）などが組み合わされてなる。
【００５２】
なお、上記アドレスピットを用いる代わりにトラック上にウォブリングを形成し、位置に応じたクロック情報を持たせるようにウォブリングの蛇行を調節して、ディスク上の位置情報を取得してアドレッシングを行うようにしても良い。同時に、ウォブリング周波数成分を利用することでトラッキングサーボを行うことができる。さらに、アドレスピットとウォブリングを併せて形成することにより、より高精度のアドレッシング及びトラッキングサーボが可能となる。
【００５３】
次に、図４に基づいて、上記基板１を用いる本発明に係るバイオアッセイ装置の好適な実施形態について説明する。なお、図４は、同装置の構成を簡略に表すブロック図である。
【００５４】
まず、図４に示されたバイオアッセイ装置１０は、上記構成の基板１を用いるバイオアッセイ装置であって、前記基板１を回転可能に保持する基板回転手段５と、この基板回転手段５によって、前記基板１を回転させながら検出用物質含有溶液Ｄ並びに標識ターゲット物質含有溶液Ｔを検出表面部位Ｓに、所定の順序、タイミングで滴下する滴下装置６と、該滴下装置６と前記バイオアッセイ用基板との間の距離を一定に保持するためのフォーカスサーボ機構７と、基板１からの位置情報と回転同期情報に基づいて、前記溶液Ｄ，Ｔの滴下を基板１の検出表面部位Ｓに追従させるトラッキングサーボ機構８を備えている。
【００５５】
ここで、バイオアッセイ装置１０は、励起光源である青色半導体レーザー１１と、フォーカスサーボ機構７とトラッキングサーボ機構８を担う赤色半導体レーザー２１を備えている。
【００５６】
青色半導体レーザー１１は、基板１の反応情報読み取りのための励起光源として機能する。まず、この青色半導体レーザー１１から出射されたレーザー光Ｂは、反射ミラー１２で直角に反射され、該反射光の進行方向に並設されたレンズ１３、１４によって平行光とされる。
【００５７】
この平行光は、反射ミラー１５で直角に反射された後、λ／４板１６を通過して円偏光とされる。この円偏光は、凹レンズ１７，凸レンズ１８によってビームが拡大された後にダイクロイックミラー１９により反射され、基板１に対向配置された対物レンズ２０に入射される。なお、対物レンズ２０は支持体Ｇに収容されている。
【００５８】
ダイクロイックミラー１９は、青色半導体レーザー１１から出射されたレーザー光Ｂを中心とする波長帯の光を反射し、それ以外の光を透過するように設計されている。より詳しくは、レーザー光Ｂを反射し、後述する、レーザー光Ｂによって励起された基板１上の蛍光物質からの蛍光を透過するように設計されている。
【００５９】
このようにして、対物レンズ２０の下方位置に、基板回転手段５に保持された基板１に対し、前記対物レンズ２０から青色レーザー光Ｂを照射する。この青色レーザー光Ｂによって励起された（ターゲット物質に標識として結合されている）蛍光物質からの蛍光は、対物レンズ２０を通過し、更にダイクロイックミラー１９，２６を通過し、反射ミラー２７により直角に反射されて、光電子増倍管及びアバランシェフォトダイオード検出器（ディテクター）２８によって検出される。この構成によって、蛍光強度を検出する。なお、ダイクロイックミラー２６は、後述する赤色レーザー光Ｒの波長を中心とする波長帯の光を反射し、蛍光を含む他の光を透過するように設計されている。
【００６０】
次に、符号２１で示す赤色半導体レーザーから出射された赤色レーザー光Ｒは、基板１と対物レンズ２０との間の距離を一定に保つ役割を果たすフォーカシングのために利用される。
【００６１】
また、この赤色レーザー光Ｒは、基板１のアドレスピット４又は／及びウォブリングされたグルーブによって提供される位置情報及び回転同期情報に基づいて、上記対物レンズ２０が基板１に配設された溝構造３内の検出表面部位Ｓを追従するトラッキングサーボを行うために利用される。なお、符号２９は、赤色レーザー光Ｒの照射位置を調整するためのポジションセンサーディテクター（ＰＳＤ）である。
【００６２】
具体的には、図４に示された赤色半導体レーザー２１から出射されたレーザー光Ｒは、該レーザー光Ｒの進行方向に並設された二枚のレンズ２２，２３によって平行光とされる。この平行光は、前方に配置された偏光ビームスプリッタ２４により分光され、一方は更にλ／４板２５を通過した後、ダイクロイックミラー２６で直角に反射され、前記対物レンズ２０に入射し、他方はＰＳＤ２９に導かれる。
【００６３】
このようにして、対物レンズ２０から出射される赤色レーザー光Ｒを用いて、フォーカシングサーボとトラッキングサーボを行いながら、基板１の所定の検出表面部位Ｓの位置を正確に読み取って、上記支持体Ｇに対物レンズ２０と一体化して設けられたインクジェットノズル３０（以下、単に「ノズル３０」と称する。）を介して、検出用物質含有溶液Ｄ又は標識ターゲット物質含有溶液Ｔを、検出表面部位Ｓの真上に順次、所定タイミングで正確に滴下する。
【００６４】
次に、図５に基づいて、支持体Ｇ内に対物レンズ２０と一体化されたノズル３０の構成について詳説する。図５（Ａ）は、ノズル３０周辺部分の外観斜視図、同図（Ｂ）は、ノズル３０の拡大図である。
【００６５】
対物レンズ２０を支持する矩形のアクチュエーターホルダーＨの中央に、上記対物レンズ２０が設けられ、前記ホルダーＨの対物レンズ２０の後方側領域に、ノズル３０が設けられている。なお、このノズル３０は、複数設けてもよい。
【００６６】
また、ノズル３０は、圧電体に印加するパルスの形状を変えることで吐出される液滴の大きさを制御し易いという利点があるため、圧電式インクジェットノズルを採用するのが好ましい。なお、図５中の符号Ｘで示す矢印は、基板１の進行方向（回転方向）を示している。
【００６７】
ここで、ノズル３０には、ラジアル方向Ｙに一列に並設されたノズル群３１が、矢印Ｘ方向に沿って複数列配設されている。このノズル群３１は、同一の検出用物質含有溶液Ｄを同時に滴下するためのノズル孔３２，３２・・・の集合体である。ノズル群３１，３１・・・からは、順次、異種の検出用物質含有溶液Ｄが下方の基板１における溝構造３内の対応する検出表面部位Ｓに同時に滴下され、続いて、所定時間後に、異種又は同種の標識ターゲット物質含有溶液Ｔが、同検出表面部位Ｓに同時に滴下される。
【００６８】
なお、検出用物質含有溶液Ｄを検出表面部位Ｓに滴下してから、その上に標識ターゲット分子含有溶液を滴下させるまでの時間Ｔは、次式にて算定できる。
Ｔ＝[Ｌ_０＋（ｎ−１）Ｌ_１＋０．５φ]÷Ｖ_１−Ｗ／Ｖ_２
【００６９】
なお、上記式において、Ｌ_０は、対物レンズ２０の中心と一列目のノズル群３１ａまでの距離、Ｌ_１はノズル群３１の配置間隔、φはプローブＤＮＡの液滴の径、Ｖ_１は基板１の線速度、Ｗはノズル３０と基板１までの距離、Ｖ_２はノズル３０からの液滴速度、をそれぞれ表している。この式に従えば、検出用物質含有溶液の液滴の真上に、ターゲット物質含有溶液を滴下させることができる。
【００７０】
最後に、図６に基づいて、上記基板１を用いて実施できるバイオアッセイプロセスについて簡潔に説明する。なお、図６（Ａ）〜（Ｅ）は、同基板１を用いて実施できるバイオアッセイプロセスのフロー図である。
【００７１】
まず、基板１の孔２を、基板回転手段５（図４参照）のスピンドル５１（図４参照）に固定して回転させ、フォーカスサーボ機構７又は／及びトラッキングサーボ機構８により位置情報を検出しながら、基板１に対向配置されたノズル３０（ノズル群３１）からインクジェットプリンティング法に基づき、検出用物質含有溶液Ｄ_１，Ｄ_２・・・を基板１上に設けられた所定の検出表面部位Ｓ（図２参照）に滴下する（図６（Ａ）参照）。
【００７２】
続いて、蛍光標識されたターゲット物質含有溶液Ｔを、フォーカスサーボ機構７又は／及びトラッキングサーボ機構８（図４参照）により位置情報を検出しながら、基板１に対向配置されたノズル３０（ノズル群３１）からインクジェットプリンティング法により、上記検出表面部位Ｓの上に滴下する（図６（Ｂ）参照）。
【００７３】
次に、基板１の検出表面部位Ｓにおいて、検出用物質と標識ターゲット物質との間のハイブリダイゼーションその他の相互結合反応を至適に行うために、基板１を恒温恒湿槽９において数時間加温する（図６（Ｃ）参照）。
【００７４】
続いて、再びスピンドル５１によって基板１を回転させながら、該基板１に対向配置された洗浄ノズルＮから所定の洗浄液Ｕを滴下することによって、アクティブな結合反応を示さなかった標識ターゲット物質を検出表面部位Ｓから除去する。洗浄液は、例えば、界面活性剤ＳＤＳを含むＳａｌｉｎｅ−ＳｏｄｉｕｍＣｉｔｒａｔｅ（ＳＳＣ）バッファー溶液を用いる（図６（Ｄ）参照）。
【００７５】
基板１に青色レーザー光Ｂを照射して各検出表面部位Ｓを励起させ、蛍光強度の大きさを検出器２８によって検出し、検出用物質と標識ターゲット物質の間の結合反応の状況を判断する。最後に、各検出表面部位Ｓに対する蛍光強度を、Ａ／Ｄ変換して結合反応割合をコンピュータＣの画面に分布表示することによって、視覚化する（図６（Ｅ）参照）。
【００７６】
【実施例】
直径１２ｃｍの石英ガラス基板を使用した。該基板の表面を、半径２０ｍｍから４０ｍｍまで、トラックピッチ５０μｍ、Ｄｕｔｙ７０％、溝深さ５００ｎｍのグルーブをエッチングして形成した。また、基板表面は、シランカップリング剤（日本ユニチカ：Ａ１１００）のエタノール溶液０．３ｗｔ％を用いて、スピンコートにより処理した。その後１００℃で２時間、ベーク炉にて乾燥させた。
【００７７】
更に、フォトビオチン；ｐｈｏｔｏｂｉｏｔｉｎ（Ｓｉｇｍａ-Ａｌｄｒｉｃｈ：Ｎ-（４-ａｚｉｄｏ-２-ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）-Ｎ’-（３−ｂｉｏｔｉｎｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）-Ｎ’-ｍｅｔｈｙｌ-１，３-ｐｒｏｐａｎｙｄｉａｍｉｎｅ（ａｃｅｔａｔｅ）を、１０μｇ／ｍＬ濃度になるように蒸留水に溶解し、前記シラン処理を施した基板表面にスピンコートした。
【００７８】
波長６８０ｎｍの赤外半導体レーザーを用いて、ＮＡ０．４５のピックアップレンズで集光し、基板へフォーカスサーボ及びトラキングサーボをかけた。基板とレンズとの間の距離を一定に保って、線速１ｍ／秒で、グルーブに追従させながら、フォトビオチン（ｐｈｏｔｏｂｉｏｔｉｎ）を青色半導体レーザー、波長４０５ｎｍ、１ｍＷ，１０ｋＨｚで変調し、対物レンズＮＡ０．４５にて露光を行った。その後、蒸留水にて洗浄し、露光されたエリアのみフォトビオチン（ｐｈｏｔｏｂｉｏｔｉｎ）パターンが形成され、ネガ型リソグラフィを得た。
【００７９】
アビジン：Ａｖｉｄｉｎ（ＶｅｃｔｏｒＬａｂ：ＡｖiｄｉｎＤ）２５μｇ／ｍｌ.ＰＢＳ溶液を、インクジェットノズルから吐出し、上記フォトビオチンパターンの上に半径ｒ＝２０−３０までをトラッキングサーボ及びフォーカスサーボをかけながら滴下を行った。
【００８０】
次に２５０μｇ／ｍｌのアビジン（Ａｖｉｄｉｎ）Ｄ.ＰＢＳ溶液を、半径ｒ＝３０−４０に滴下した。その後、ｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｓｕｇｍａ：１００３）溶液にてスピンコート洗浄を行った。
【００８１】
再度波長６８０ｎｍの赤外半導体レーザーを用いて、基板にトラッキングサーボ及びフォーカスサーボをかけ、グルーブに追従させながら、更に青色半導体レーザーによって、出力１００μＷ、ビーム径２ｍｍのレーザー光を出射し、上記ＮＡＯ．４５の対物レンズを用いて、線速５ｍ／秒にて、蛍光強度を読み取った。
【００８２】
検出器は、光電子増倍管（浜松ホトニクス：Ｈ５７８４−０１）を使用した。読み取りに要した時間はｒ＝２０−３０で約６．３秒、ｒ＝２０−４０で約８．８秒であった。これにより、従来の読み取り装置に比べて非常に短時間で読み取ることができることが判明した。
【００８３】
また蛍光強度比は、濃度２５μｇ／ｍｌのものは平均１２０ｍＶ，２５０μｇ／ｍｌのものは、平均６００ｍＶという値が得られ、強度比１／５という値が得られた。また、どちらも強度ばらつきは、σで１ｍＶと非常に精度の高い結果が得られた。
【００８４】
【発明の効果】
（１）本発明に係るバイオアッセイ用基板は、上方視放射状に配設された溝構造内に検出表面部位が配列された構成を備えているので、多量・多数の検出用物質を集積することができる。また、複数の検出用物質をグルーピングして配列させて、溝構造毎に至適反応条件等を選択してアッセイを行うことができるので、偽陽性、偽陰性の結果の発生率が格段に減少する。従って、前記バイオアッセイ用基板によれば、網羅的かつ効率的で、しかも高精度な解析を行うことができる。また、記録情報当りのコストも安価である。
【００８５】
（２）本発明に係るバイオアッセイ用基板は、ＤＮＡチップやバイオセンサーチップとして、特に有用である。また、新規構造を備える円盤状のマイクロチャネルアレイを提供できる。本基板をＤＮＡチップとして利用する場合は、遺伝子の変異解析、ＳＮＰｓ（一塩基多型）分析、遺伝子発現頻度解析等に利用でき、創薬、臨床診断、薬理ジェノミクス、法医学その他の分野において広範囲に活用できる。本基板をバイオセンサーチップとして利用する場合は、抗原抗体反応の検査、内分泌攪乱物質の検定等に利用できる。
【００８６】
（３）次に、本発明に係るバイオアッセイ装置は、基板上での検出用物質のスポッティング及び固相化作業、続く標識タ−ゲット物質のスポッティング及び反応、洗浄、反応結果の読み取り及び解析を一連の作業で円滑に行うことができるので、アッセイから解析に至る作業が効率化、迅速化し、大変便利である。
【００８７】
（４）本発明に係る前記アッセイ装置とユニット化された基板情報の読み取り装置を用いて、基板にファーカスサーボ及び／又はトラッキングサーボをかけながら、一定量周期的に基板に検出用物質含有溶液を滴下し、続いてＤＮＡプローブ、抗体等の検出用物質を所定の検出表面に固相化し、更に、蛍光物質が標識されたｃＤＮＡ、抗原等のターゲット物質を，再度上記サーボをかけながら検出表面部位に滴下し、続いて、所定の相互反応促進プロセスを行い、所定条件下で洗浄し、最後にレーザー光により蛍光物質を励起させて、蛍光発行量を検出して情報を読み取るという複雑な作業を、一連で行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係る好適な実施形態であるバイオアッセイ用基板（１）を上方視したときの外観図
【図２】（Ａ）同基板（１）の構成を一部誇張して示す模式図
（Ｂ）同基板（１）に配設された溝構造（３）部分の一実施形態の構成を表す部分拡大図
【図３】同基板（１）の変形例を上方視したときの外観図
【図４】本発明に係るバイオアッセイ装置（１０）の好適な実施形態の構成を簡略に表すブロック図
【図５】（Ａ）ノズル（３０）周辺部分の外観斜視図
（Ｂ）ノズル（３０）の拡大平面図
【図６】本発明に係る好適な実施形態であるバイオアッセイ用基板（１）を用いて実施できるバイオアッセイプロセスのフロー図
【符号の説明】
１バイオアッセイ基板
３溝構造
５基板回転手段
７フォーカシングサーボ機構
８トラッキングサーボ機構
３０インクジェットノズル
Ｂ励起光であるレーザー光
Ｄ検出用物質含有溶液
Ｇ支持体
Ｓ検出表面部位
Ｔ標識ターゲット物質含有溶液

Claims

反射膜と、
前記反射膜上に形成された光透過層と、
前記光透過層に、上方視放射状に形成された複数の溝構造と、
前記溝構造内に列設され、検出用物質を固相化できるように表面処理された複数の検出表面部位と、
前記溝構造間の領域に設けられ、前記検出表面部位の位置情報と回転同期情報を提供するウォブリング又はアドレスピットと、
を有する円盤状のバイオアッセイ用基板。
前記検出用物質は、ヌクレオチド鎖、ペプチド、タンパク質、脂質、低分子化合物、リポソームその他の生体物質のいずれかであることを特徴とする請求項１記載のバイオアッセイ用基板。
反射膜上に形成された光透過層に、複数の溝構造が上方視放射状に形成され、該溝構造内に検出用物質を固相化できるように表面処理された複数の検出表面部位が列設されるとともに、前記溝構造間の領域に前記検出表面部位の位置情報と回転同期情報を提供するウォブリング又はアドレスピット設けられた構成の円盤状のバイオアッセイ用基板に対して、
インクジェットプリンティング法によって、前記基板を回転させながら、複数の前記検出表面部位に同時に検出用物質含有溶液を滴下した後、下記数式により求められる時間Ｔ経過後に、前記検出用物質含有溶液を滴下した複数の検出表面部位に同時に標識ターゲット分子含有液を滴下するバイオアッセイ方法。
反射膜上に形成された光透過層に、複数の溝構造が上方視放射状に形成され、該溝構造内に検出用物質を固相化できるように表面処理された複数の検出表面部位が列設されるとともに、前記溝構造間の領域に前記検出表面部位の位置情報と回転同期情報を提供するウォブリング又はアドレスピットが設けられた構成の円盤状のバイオアッセイ用基板を用いるバイオアッセイ装置であって、
前記バイオアッセイ用基板を回転可能に保持する基板回転手段と、
前記基板回転手段によって、前記バイオアッセイ用基板を回転させながら検出用物質含有溶液並びに標識ターゲット物質含有溶液を前記検出表面部位に滴下する滴下装置と、
該滴下装置と前記バイオアッセイ用基板との間の距離を一定に保持するためのフォーカスサーボ機構と、
前記位置情報と回転同期情報に基づいて、前記溶液の滴下を前記検出表面部位に追従させるトラッキングサーボ機構と、を有し、
前記滴下装置が、インクジェットプリンティング装置であって、前記バイオアッセイ用基板に対向配置され、フォーカスサーボ及びトラッキングサーボを担うレーザー光を前記基板に出射する対物レンズを収容する支持体に、複数のノズル孔を備えたインクジェットノズルが一体化されているバイオアッセイ装置。
請求項４記載のバイオアッセイ装置とユニット化され、請求項１又は２記載のバイオアッセイ用基板上の記録情報を読み取る装置であって、
前記バイオアッセイ用基板に対して、フォーカスサーボとトラッキングサーボをかけるとともに、集光したレーザー光を、前記検出表面において前記検出用物質と結合したる蛍光標識ターゲット物質に照射し、励起されて発光する蛍光色素強度を検出する基板記録情報の読み取り装置。