WO2005095600A1 - ヘパラン硫酸糖鎖を付加したヘパリン結合性タンパク質、その製造方法及びそれを含有する医薬組成物 - Google Patents

ヘパラン硫酸糖鎖を付加したヘパリン結合性タンパク質、その製造方法及びそれを含有する医薬組成物 Download PDF

Info

Publication number
WO2005095600A1
WO2005095600A1 PCT/JP2005/006364 JP2005006364W WO2005095600A1 WO 2005095600 A1 WO2005095600 A1 WO 2005095600A1 JP 2005006364 W JP2005006364 W JP 2005006364W WO 2005095600 A1 WO2005095600 A1 WO 2005095600A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
sugar chain
heparan sulfate
binding protein
heparin
seq
Prior art date
Application number
PCT/JP2005/006364
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Toru Imamura
Masahiro Asada
Masashi Suzuki
Original Assignee
National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology filed Critical National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology
Priority to US11/547,346 priority Critical patent/US7741078B2/en
Priority to GB0621466A priority patent/GB2427863B/en
Priority to DE112005000737T priority patent/DE112005000737T5/de
Publication of WO2005095600A1 publication Critical patent/WO2005095600A1/ja

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/50—Fibroblast growth factors [FGF]
    • C07K14/501—Fibroblast growth factors [FGF] acidic FGF [aFGF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/14—Drugs for dermatological disorders for baldness or alopecia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/35—Fusion polypeptide containing a fusion for enhanced stability/folding during expression, e.g. fusions with chaperones or thioredoxin

Definitions

  • the present invention relates to a heparin-binding protein that has been highly functionalized by selectively covalently binding a heparan sulfate sugar chain, a method for producing the same, and a pharmaceutical composition containing the same.
  • heparin-binding proteins particularly proteins classified into the fibroblast growth factor (hereinafter referred to as "FGF") family, are sulfated polysaccharides such as heparin and heparan.
  • FGF fibroblast growth factor
  • heparin-binding protein such as fibroblast growth factor
  • a sulfated polysaccharide such as henoline
  • the biological activity and physical properties of the heparin-binding protein change, and the function changes. It has been known that the functions may be enhanced. However, even if the sulfated polysaccharide was mixed, the expected high functionality was limited. In addition, when these are used as pharmaceutical compositions, there has been a problem of undesired physiological activity due to free sulfated polysaccharide.
  • Patent Document 1 "Glycosylated heparin-binding protein, method for producing the same, and No.3318602 (2002) Toru Imamura, Masahiro Asada, Osamu Oka, Osamu Suzuki, Atsuko Yoneda, Keiko Ota, Yuko Oda, Kazuko Takakawa, Noriko Orikasa, Tomoe Matsuda, Tetsuto Kojima : Yoneda A, Asada M, Oda Y, buzuki M, Imamura T. 'Engineering of an FGF— Proteoglycan Fusion Protein with Heparin— Independent, Deg radation- Augmented, Mitogenic Activity. "Nature Biotechnology 18 (6), 641-644 ( 2000)
  • Non-Patent Document 2 Atsuko Yoneda, Masahiro Asada, Toru Imamura “Modification of Heparin-Binding Growth Factor FGF-1 Activity by Fusion with Syndecan” Cell Engineering 19 (9), 1338-1340 (2000) : Asaaa M, Yoneda A, Imamura T. Engineering of a
  • An object of the present invention is to provide a heparan sulfate-selective glycosaminodalicanic sugar chain that is hardly containing chondroitin sulfate and covalently binds a glycosaminodalican sugar chain, with the aim of modifying the function of the hene binding protein.
  • An object of the present invention is to establish a protein binding protein and a method for producing the same, and to provide a pharmaceutical composition containing the same.
  • syndecan 4 sequence having a plurality of sites modified by both sugar chains of heparan sulfate and chondroitin sulfate.
  • Analysis of the chimeric protein of the sugar chain modification site of syndecan 4 and the reporter revealed that the serine residue at position 39 in the primary structure (No. 9) was specifically modified by heparan sulfate.
  • cDNA encoding a peptide capable of selectively receiving heparan sulfate (SEQ ID NO: 8) (SEQ ID NO: 13) and cDNA encoding a non-binding protein (SEQ ID NO: 7) (SEQ ID NO: 10) and the heparan sulfate sugar chain is covalently linked by producing the gene product of the linked cDNA in animal cells. It was found that the heterozygous binding protein can be produced by the combination. In addition, it was confirmed that the function of the henon-binding protein to which the heparan sulfate sugar chain was added was improved. The present invention has been completed based on such findings.
  • the present invention provides a henolin-binding protein that has been highly functionalized by covalently binding a sugar chain rich in heparan sulfate.
  • the henolin-binding protein of the present invention is a henolin-binding protein in which 90% or more of the composition is a heparan sulfate sugar chain, which is covalently linked to a sulfated glycosaminodalican sugar chain.
  • the composition of the sulfated glycosaminodalican sugar chain can be determined, for example, according to the method described in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., UNIT 17.13B (1996).
  • the sugar chain is composed of (1) heparan sulfate, (2) an N-linked sugar chain combined with heparan sulfate and another type of glycosaminodalican, and (3) heparan sulfate and other glycosylate. It can be selected from the group consisting of O-linked sugar chains combined with Saminodalican, and (4) a combination thereof.
  • the henolin binding protein may be a factor belonging to the FGF family or a closely related factor.
  • the heparin-binding protein may have a sugar chain covalently bonded thereto via a peptide capable of preferentially receiving the addition of a heparan sulfate sugar chain.
  • the holin-binding protein that covalently binds a sugar chain may be any one of the following (a) or (b):
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 or 7 has an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted, added or modified, and has FGF activity; and A protein that can preferentially receive the addition of paran sulfate sugar chains.
  • the FGF activity refers to an activity of promoting or suppressing the proliferation of fibroblasts, vascular endothelial cells, myoblasts, chondrocytes, osteoblasts, and glial cells. FGF activity can be measured according to the method described in Ornitz DM & Leder P., Journal of Biological Chemistry 267 (23), p. 16305-16311 (1992).
  • Proteins that can preferentially receive the addition of heparan sulfate sugar chains include other sugars (eg, chondroitin) in vivo that have heparan sulfate sugar chain addition pathways. (Sulfated sugar chains) and can be received with higher selectivity. Just do it.
  • Living organisms having a heparan sulfate sugar chain addition pathway include animal cells (eg, COS cells, CHO cells, BHK cells, NIH3T3 cells, BALB / c3T3 cells, HUVE cells, LEII cells), insect cells (eg, Sf-9 cells). , Tn cell), etc. The force is not limited to these.
  • the present invention relates to a method for producing a non-binding protein having a composition in which 90% or more of the composition is a heparan sulfate sugar chain to which a sugar chain of glycosaminodalican sulfate is covalently bound.
  • the peptide that can be preferentially subjected to the addition of heparan sulfate sugar chain may be any one of the following (a) or (b):!
  • amino acids In the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, one or several amino acids may be deleted, substituted, added, or modified, and may preferentially receive heparan sulfate sugar chains. Peptides that can.
  • Peptides that can preferentially receive the addition of heparan sulfate sugar chains can be used to convert the addition of heparan sulfate sugar chains to other saccharides (eg, chondroitin sulfate) in a living body having a heparan sulfate sugar chain addition pathway. Any substance that can be received with higher selectivity than the addition of a sugar chain) may be used.
  • Living organisms having a heparan sulfate glycosylation pathway include animal cells (eg, COS cells, CHO cells, BHK cells, NIH3T3 cells, BALB / c3T3 cells, HUVE cells, LEII cells), and insect cells (eg, Sf-9 cell, Tn cell), etc. Will not be.
  • animal cells eg, COS cells, CHO cells, BHK cells, NIH3T3 cells, BALB / c3T3 cells, HUVE cells, LEII cells
  • insect cells eg, Sf-9 cell, Tn cell
  • a cDNA encoding a peptide capable of receiving heparan sulfate sugar chain preferentially, a cDNA having the base sequence of SEQ ID NO: 13 can be mentioned.
  • the heparin-binding protein is a heparin-binding protein in which 90% or more of the composition is a heparan sulfate sugar chain, to which a sugar chain of glycosaminodalican sulfate is covalently bonded.
  • the sugar chains are (1) heparan sulfate, (2) N-linked sugar chains combined with heparan sulfate and other glycosaminodalicans, (3) heparan sulfate and other glycosaminoglycans. O-linked sugar chains, and (4) a combination thereof.
  • the henolin binding protein may be a factor belonging to the FGF family or a closely related factor.
  • Henoline-binding proteins have covalently linked sugar chains via peptides that can preferentially receive heparan sulfate sugar chains.
  • the holin-binding protein that covalently bonds a sugar chain may be any one of the following (a) or (b):
  • the present invention provides a pharmaceutical composition containing, as an active ingredient, the above-mentioned heparin-binding protein, which is highly functionalized by covalently binding a heparan sulfate sugar chain.
  • the present invention provides a nucleic acid that encodes a peptide having the base sequence of SEQ ID NO: 13 and capable of preferentially receiving carohydrate of a heparan sulfate sugar chain.
  • the nucleic acid include DNA, RNA, chimeric molecules of DNA and RNA, derivatives thereof, and the like.
  • the nucleic acid is Preferably, it is DNA.
  • the term "sulfuric acid glycosaminodalican sugar chain” refers to a variety of sugars that extend from xylose bound to a serine residue in the primary structure of a protein or exist in a free state. It is a generic term for chain structures, such as N-acetyldarcosamine and N- It has a repeating structure consisting of an amino sugar represented by acetyl galatatosamine and a disaccharide unit represented by diuronic acid or galactosca represented by glucuronic acid and diuronic acid.Some of the hydroxyl groups or amino groups are replaced by sulfate groups. What is being said.
  • a heparin-binding protein that selectively covalently binds a heparan sulfate sugar chain and contains almost no chondroitin sulfate, and a method for producing the same are provided.
  • the heparin-binding protein of the present invention has a higher degree of functional modification than a heparin-binding protein containing heparan sulfate and chondroitin sulfate.
  • the heparin-binding protein of the present invention can be used as a pharmaceutical.
  • FIG. 1 shows that trunc. PG-FGF-l protein secreted by COS-1 cells was separated by SDS denaturing electrophoresis and stained with anti-FGF-1 monoclonal antibody in Test Example 1. 4 is an electrophoresis photograph showing the results.
  • FIG. 2 shows that in Test Example 2, trunc. PG-FGF-1 protein and S / FGF-la-II protein were converted to various glycosaminodalicanases (GAG'ase) and peptide N-glycosidase in Test Example 2.
  • GAG'ase glycosaminodalicanases
  • 5 is an electrophoretic photograph showing the results of analysis by SDS denaturing electrophoresis and anti-FGF-1 monoclonal antibody staining after treatment with F.
  • FIG. 3 is a graph showing the results of evaluating the cell growth promoting activity of Ba / F3 cells expressing FGF receptors of various proteins in Test Example 3.
  • the henon-binding protein to which a heparan sulfate sugar chain is to be covalently bound is a protein having a henoline binding property, and as a specific example, belongs to the FGF family. Or closely related factors, or those that have heparin binding but have no structural similarity to the former! /, And other proteins. Other proteins described here include, specifically, heparin-binding epidermal growth factor-like factor (HB-EGF), platelet-derived growth factor (PDGF), and the like. Absent. Specific examples of factors belonging to the FGF family include FGF-1 to 23.
  • the heparin-binding protein may be covalently bound to a heparan sulfate sugar chain via a peptide capable of receiving sugar chain addition.
  • the heparin-binding protein for covalently binding a heparan sulfate sugar chain may be any of the following proteins (a) or (b).
  • the protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 is encoded by, for example, the DNA sequence of SEQ ID NO: 10.
  • the heparin-binding protein for covalently binding the heparan sulfate sugar chain may be any of the following proteins (a,) or (b,). (a ′) a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6;
  • the protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 is encoded by, for example, the DNA sequence of SEQ ID NO: 5.
  • This protein contains, in addition to the peptide sequence of a factor belonging to the FGF family, a peptide sequence capable of preferentially receiving the addition of heparan sulfate sugar chain and a signal peptide sequence.
  • the term "heparin-binding protein” refers to a secretory protein called a signal peptide existing at the amino terminus when the cDNA described in the sequence listing is added to the protein defined below and secreted from the cell. Includes truncated forms of the peptide sequence.
  • the henolin-binding protein contained as an active ingredient of the pharmaceutical composition of the present invention is
  • the heparan sulfate sugar chain to be covalently bound to the heparin-binding protein may be any one as long as the heparin-binding protein is highly functionalized by covalently binding.
  • “highly functional” means that the activity of the target protein is increased.
  • the heparan sulfate sugar chain is covalently bound to the protein, and the active force remaining after the treatment with heat, acid or alkali. In comparison, it is higher.
  • the heparan sulfate sugar chain refers to the above-mentioned sulfated glycosaminodalican sugar chain, in which the amino sugar is N-acetyldarcosamine, and a peronic acid (glucuronic acid or iduronic acid). Having a repeating structure of a disaccharide unit, wherein some of the hydroxyl groups or amino groups are substituted with sulfate groups.
  • This heparan sulfate sugar chain may have an addition, deletion, substitution or modification in a part of the sugar chain sequence as long as it exerts its function.
  • heparan sulfate sugar chain-added henon-binding protein In binding a heparan sulfate sugar chain to a heparin-binding protein, only the heparan sulfate sugar chain may be directly covalently bound to the heparin-binding protein.
  • a peptide of any length covalently linked to a sulfated sugar chain may be covalently linked to the hetero-binding protein.
  • heparan sulfate sugar chain-added henon-binding protein To produce the heparan sulfate sugar chain covalently bound heparan sulfate protein of the present invention (hereinafter referred to as "heparan sulfate sugar chain-added henon-binding protein").
  • a cDNA encoding a peptide capable of preferentially receiving addition of a heparan sulfate sugar chain is linked to a cDNA encoding a heparin-binding protein, and this is incorporated into an appropriate expression vector. May be introduced into a host cell having a glycosylation pathway to express a heparan sulfate glycosylation type heparin-binding protein.
  • cDNAs of various heparin-binding proteins are designed by appropriate primers from sequences registered in gene banks such as DDBJ (Japan DNA Data Bank), and RT-PCR (RT-PCR) is performed from mRNA of the relevant tissue of the animal. It can be obtained by performing reverse transcription PCR).
  • DDBJ Joint DNA Data Bank
  • RT-PCR RT-PCR
  • Peptides that are known to preferentially receive heparan sulfate sugar chains include core proteins of various proteodaricans (eg, syndecan, glypican, perlecan, etc.) or a part thereof. . As a part of the core protein of proteodarican, it contains Ser-Gly repeat sequence which is considered to be a glycosylation site of proteodalican. Peptides. Examples of peptides that can receive heparan sulfate sugar chain preferentially include the following peptides (a) and (b).
  • amino acids In the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, one or several amino acids may be deleted, substituted, added, or modified, and may preferentially receive heparan sulfate sugar chains. Peptides that can.
  • the site to which the heparan sulfate sugar chain is bound may be a site where a turn is formed in the secondary structure of the henon-binding protein, or the vicinity of the terminal or a three-dimensional structure due to sugar chain-attached sugar. The part does not change significantly.
  • an oligonucleotide encoding a peptide known to preferentially receive a secretion signal and the addition of heparan sulfate sugar chain is synthesized or amplified by a PCR reaction, and this is amplified by a heline binding property. Insert at the 5 'end of the plasmid encoding the protein.
  • the secretory signal peptide for example, the amino terminus of a typical secretory glycoprotein can be used, and specific examples include amino acids 18 residues from the N-terminus of human syndecan-14.
  • a plasmid encoding a heparin binding protein can be prepared by incorporating DNA encoding a heparin binding protein into an appropriate plasmid. This
  • any plasmid can be used as long as it can be replicated and maintained in the host.
  • pBR322 and pUC18 derived from Escherichia coli, and constructed based on these, PET-3c and the like.
  • Examples of a method for incorporating the above-mentioned oligonucleotide into a plasmid encoding a heparin-binding protein include the method described in T. Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, p. 239 (1982).
  • a secretion signal From the plasmid prepared as described above, a secretion signal, bases encoding all peptides of heparin-binding protein known to preferentially receive carohydrate attached to heparan sulfate sugar chains, and bases encoding all of heparin-binding proteins Region containing the sequence (hereinafter referred to as "heparan sulfate Region containing a nucleotide sequence encoding a compatible protein ". ) Is cut out and ligated downstream of a promoter in a vector suitable for expression, whereby an expression type vector can be obtained.
  • the region containing the nucleotide sequence encoding the glycosylated heme-binding protein has ATG at the 5 'end as a translation initiation codon, and TAA and TGA at the 3' end as translation termination codons. Or it may have a TAG.
  • a promoter is connected upstream thereof.
  • the promoter used in the present invention may be any promoter that is suitable for the host used for gene expression. When the host to be transformed is an animal cell, examples include an SV40-derived promoter and a retrovirus promoter.
  • any plasmid that can be expressed in host cells should be used.
  • a vector constructed based on pBR322, PUC18 derived from Escherichia coli and the like can be mentioned.
  • Examples of the method for incorporation into a plasmid include the method described in T. Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, p. 239 (1982).
  • a transformant carrying the vector is produced.
  • Any host cell can be used as long as it has a heparan sulfate sugar chain addition pathway (eg, COS cell, CHO cell, BHK cell, NIH3T3 cell, BALB / c3T3 cell, HUVE cell). , LEII cell), insect cells (eg, Sf-9 cell, Tn cell) and the like. The present invention is not limited to these.
  • the above transformation is performed by a method generally performed for each host.
  • any method that is not general but applicable can be used.
  • the host is an animal cell
  • a vector containing the recombinant DNA is introduced into cells in the growth phase or the like by the calcium phosphate method, the lipofection method, or the electoral poration method.
  • a heparan sulfate sugar chain-added heparin-binding protein is produced.
  • the medium used for culturing is generally used for each host. Is used. Alternatively, any medium that is not general but can be used may be used.
  • the host is an animal cell, one obtained by adding animal serum to Dulbecco's MEM or the like is used. Culture is performed under conditions generally used for each host. In addition, it is sufficient if the conditions are not general but applicable. For example, if the host is animal cells, perform at about 32 to 37 ° C, 5% C02, 100% humidity for about 24 hours to 2 weeks, and change the gas phase conditions or add agitation as necessary. Can be.
  • the protein released into the culture is separated from the supernatant after centrifugation. Can be collected directly.
  • the supernatant fluid can be purified by appropriately combining known separation and purification methods to purify the heparan sulfate sugar chain-added henon-binding protein.
  • known separation and purification methods include salting out, solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, ion exchange chromatography, affinity chromatography, reverse phase High performance liquid chromatography, isoelectric focusing and the like can be used.
  • the preparation thus obtained can be dialyzed and freeze-dried to obtain a dry powder as long as the activity of the heparan sulfate sugar chain-added heptane-binding protein is not impaired. Further, adding and storing serum albumin or the like as a carrier is effective for preventing the sample from adsorbing to the container. Further, the coexistence of a trace amount of a reducing agent in the purification step or the storage step is suitable for preventing oxidation of the sample.
  • the reducing agent include ⁇ -mercaptoethanol, dithiothreitol, and glutatin.
  • glycosylated heparin-binding protein of the present invention can also be produced by binding a sugar chain to a heparin-binding protein by a chemical method.
  • a chemical method one of the following a) and b) or a combination of these methods can be considered.
  • a heparan sulfate sugar chain is first completed by a biological method, a chemical synthesis method, or a combination thereof.
  • an appropriate protein-binding residue may be introduced into the sugar chain terminal.
  • an aldehyde group is formed, and this is amino-bonded to an amino group in the protein, thereby completing the binding of the heparan sulfate sugar chain to the protein. I do.
  • an aldehyde group is formed by reducing and partially oxidizing a reducing end of a monosaccharide or an appropriate protein-binding residue bonded to the monosaccharide, and this is converted to an amino acid in a protein.
  • the amino bond to the group completes the bond between the monosaccharide and the protein.
  • a hetero sulfate sugar chain is completed. This binding may be a biological method, a chemical synthesis method, or a method of appropriately combining them.
  • a protein that has been highly functionalized by covalently binding a heparan sulfate sugar chain to a henolin-binding protein can be used as a medicine.
  • the heparan sulfate sugar chain-added heparin-binding protein of the present invention has an effect of regulating the physiological function of FGF.
  • the physiological function of FGF refers to promoting or suppressing the proliferation of fibroblasts, vascular endothelial cells, myoblasts, chondrocytes, osteoblasts, and glial cells.
  • the heparan sulfate sugar chain-added henon-binding protein of the present invention is effective for promoting cell proliferation and regeneration of tissues such as liver, controlling wound healing and nervous function, and regulating proliferation of fibroblasts and the like.
  • Various diseases specifically, fibroblastoma, hemangiomas, osteoblastoma, neuronal cell death, Alheimer's disease, Parkinson's disease, neuroblastoma, amnesia, dementia, prevention and cure of myocardial infarction It is useful for treatment, and can also be used as a hair growth agent, a hair restorer, and the like.
  • the heparan sulfate sugar chain-added heparin-binding protein of the present invention can be prepared by using a pharmaceutically acceptable solvent, excipient, carrier, adjuvant, etc., in the form of a liquid preparation, a batch preparation, or the like, according to a standard method for preparation of a pharmaceutical preparation.
  • Pharmaceutical compositions such as screens, aerosols, injections, powders, granules, tablets, suppositories, enteric agents and capsules may be used.
  • the content of the heparan sulfate sugar chain-added heparin-binding protein as an active ingredient in the pharmaceutical composition may be about 0.0000000001 to 1.0% by weight.
  • the pharmaceutical composition can be safely administered parenterally or orally to mammals such as humans, mice, rats, puppies, dogs and cats.
  • the dose of the pharmaceutical composition may be appropriately changed depending on the dosage form, administration route, symptoms, and the like.
  • the heparin-sulfated sugar chain-added heparin-binding protein is administered.
  • the quality is exemplified by applying 0.0001-100 mg to the affected area several times a day.
  • a natural protein having no sugar chains other than the henolin-binding protein can be obtained by covalently linking the sugar chains. Can also be enhanced.
  • phR7A8 is a plasmid in which the human ryucan cDNA (PCR product) is inserted into the EcoR V site of pBluescript II (KS +) cloning vector. Including the 7th to 2610th of the mRNA sequence shown in Accession No. D13292 (see B.B.R.C.Vol. 190, No. 3, p. 814-822, 1993). This was digested with Pvu II, and the obtained DNA fragment of 2,232 base pairs was subjected to PCR (Polymerase Chain Reaction) using the ⁇ type.
  • PCR Polymerase Chain Reaction
  • the resulting 422 base pair band was separated and extracted, and inserted into pBluescript II (KS +) cloning vector (2934 base pairs) double-cut with EcoR I and Sal I to obtain FGF-la. / pBluescript II (KS +) was obtained.
  • FGF-la / pBluescript II (KS +) was sequentially digested with Aor51H I and Sal I, and the resulting 2626 base pair band was separated and extracted, and used for the ligation reaction described below.
  • PCR polymerase chain reaction
  • # 117 5, -tcttccgatagactgcgtcg- «3,) (Rooster system No. 1) and # RI45 (5-gtaattagctacatcctcatcgtctgg-3 ') (SEQ ID NO: 2) were used.
  • the specifically amplified 200 bp band was separated by electrophoresis and extracted.
  • the DNA sequence of the translation region of the S / FGF-la-11 / pMEXneo plasmid is shown in SEQ ID NO: 11. It encodes a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12 in mammalian cells.
  • PCR was performed using the S / FGF-la-II / pMEXneo plasmid as type III.
  • # 646 ⁇ -gaggatgtagctaattacaagaagccca-3,) (rooster sequence number 3) and # 118 (5-cattctagttgtggtttgtcc-3 ') (sequence number 4) were used. 479 base pairs specifically amplified was separated by electrophoresis and extracted.
  • the DNA fragments obtained in the above (1) and (2) were mixed to form ⁇ , and PCR was performed using # 117 and # 118 as primers.
  • the specifically amplified 661 bp band was separated by electrophoresis and extracted. This was further cut with EcoR I and Sal I, and the resulting 564 bp band was separated and extracted. This was inserted into a pMEXneo expression vector (5916 base pairs) double-cut with EcoR I and Sal I to obtain trunc.
  • PG-FGF-1 / pMEXneo This expression vector contains the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5, which encodes a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 in mammalian cells.
  • the obtained trunc. PG-FGF-1 / pMEXneo was transfected into COS-1 cells (monkey kidney-derived cell line) by the lipofection method. By culturing in a serum-free medium, the protein synthesized in the medium was secreted, and the culture supernatant was collected 3 days later. The obtained conditioned medium was centrifuged at low speed, and the supernatant was stored at 4 ° C.
  • the conditioned medium of trunc. PG-FGF-1 protein secreting cells was dialyzed against distilled water and concentrated by freeze-drying. Add this to the electrophoresis buffer (containing SDS, 2-mercaptoethanol). Boiled together to prepare a sample for electrophoresis. Perform electrophoresis using 12.5% acrylamide gel in the presence of SDS and 2-mercaptoethanol.Transfer electrically to nitrocellulose membrane, anti-FGF-1 monoclonal antibody, horseradish peroxidase-labeled anti-mouse. The cells were stained with an IgG antibody and detected by a chemiluminescence method. The results are shown in Figure 1.
  • the left line shows the migration position of the standard protein with a known molecular weight and its molecular weight (unit: dalton).
  • the migration position of the molecular weight marker is shown on the left.
  • PG-FGF-1 protein is a protein with 183 amino acid residues as shown in SEQ ID NO: 6. It is expressed as an unmodified simple protein.If secreted, it should give a band around 20 kDa. It is. However, it was actually detected as a smear band around 40 to 100 kDa. This is a characteristic pattern for proteins modified with glycosaminodalican sugar chains. It is considered that the smear is caused by the uneven length of glycosaminodalican sugar chains.
  • PG-FGF-1 treated with a mixture of heparanase and heparitinase HP, ase & HS, ase
  • HP, ase & HS, ase completely eliminates the smear band and gives two bands at 21 kDa and 25 kDa.
  • S / FGF-la-II is a mixture of heparanase and heparitinase (HP 'ase &HS' ase) alone, and although some of the molecules are reduced in molecular weight, it is not possible to completely eliminate the smear band.
  • the physiological activity of trunc. PG-FGF-1 protein as a growth factor was evaluated.
  • FGF-1 binds to a target cell receptor and exerts its biological activity, coexistence of heparin or heparan sulfate is essential. Therefore, we targeted a cell line that expressed the FGF receptor (Rlc type) on mouse Ba / F3 cells (a cell line derived from pro B cells), which are known not to express endogenous heparan sulfate.
  • the cell growth promoting activity of trunc. PG-FGF-1 protein was evaluated in the presence or absence of heparin. The evaluation of the cell growth promoting activity was based on the measurement of the number of living cells using Tetracolor One.
  • Ba / F3 cells expressing the FGF receptor were seeded on a 96-well plate, and at the same time, crudely purified trunc. PG-FGF-1 protein was added at various concentrations. At this time, 10 ug (microgram) co-existing and non-co-existing heparin were prepared. Forty-eight hours later, Tetracolor One was added with 10 ⁇ l (micro-liter) of casket, and the mixture was kept warm for 4 hours, and then the absorbance at 450 nm was measured.
  • the cell growth promoting activity is represented by the ratio of the absorbance at 450 nm in the presence of each growth factor, with the absorbance at 450 nm when the cells are cultured in a growth medium (containing IL-3) of Ba / F3 cells.
  • the S / FGF-la-II protein shows activity at high concentrations (10-100 ng / ml) even without heparin (triangular dashed line).
  • PG-FGF-1 protein exhibits activity even at a low concentration of 1 to 10 ng / ml without coexisting with henolin (circled line). Its activity is comparable to the case where heparin coexists with simple protein FGF-1 (solid line) and has a higher specific activity than S / FGF-la-II. Based on the above results, the S / FGF-la-II protein and trunc.
  • PG-FGF-1 protein have a heparan sulfate sugar chain in their own molecules (see Fig. 2), which substitutes for the function of heparin. It is thought that it is.
  • the S / FGF-la-II protein has not only a heparan sulfate sugar chain but also a chondroitin sulfate sugar chain, which is thought to contribute to exerting its activity. Specific activity is not very high.
  • PG-FGF-1 protein is almost exclusively modified with heparan sulfate sugar chain, it is considered that high specific activity was obtained.
  • the novel heparan sulfate sugar chain-added henon-binding protein of the present invention has excellent stability such as heat resistance, acid resistance, alkali resistance, and protease resistance, and has high biological activity. Therefore, the use of the heparan sulfate sugar chain-added heparin-binding protein of the present invention in pharmaceuticals provides excellent in vivo stability, especially acid resistance, alkali resistance, and immature stability. Drugs that can be applied to medicines and have high medicinal effects can be designed.
  • SEQ ID NO: 1 shows the nucleotide sequence of primer # 117 used in Example 1.
  • SEQ ID NO: 2 shows the nucleotide sequence of primer # 645 used in Example 1.
  • SEQ ID NO: 3 shows the nucleotide sequence of primer # 646 used in Example 1.
  • SEQ ID NO: 4 shows the nucleotide sequence of primer # 118 used in Example 1.
  • SEQ ID NO: 5 shows the nucleotide sequence of trunc. PG-FGF-1.
  • SEQ ID NO: 6 shows the amino acid sequence of trunc. PG-FGF-1.
  • SEQ ID NO: 7 shows the amino acid sequence of FGF-la.
  • SEQ ID NO: 8 shows a partial amino acid sequence of human syndecan-4.
  • SEQ ID NO: 9 shows the entire amino acid sequence of human syndecan-4.
  • SEQ ID NO: 10 shows the nucleotide sequence of FGF-la.
  • SEQ ID NO: 11 shows the nucleotide sequence of S / FGF-la-II.
  • SEQ ID NO: 12 shows the amino acid sequence of S / FGF-la-II.
  • SEQ ID NO: 13 shows a partial nucleotide sequence of human syndecan-4.
  • SEQ ID NO: 14 shows the entire nucleotide sequence of human syndecan-4.
  • SEQ ID NO: 15 shows the nucleotide sequence of primer # 109 used in Reference Example 1.
  • SEQ ID NO: 16 shows the nucleotide sequence of primer # 111 used in Reference Example 1.
  • SEQ ID NO: 17 shows the nucleotide sequence of primer # 967 used in Reference Example 1.
  • SEQ ID NO: 18> shows the nucleotide sequence of primer # 967 used in Reference Example 1.
  • SEQ ID NO: 18 shows the nucleotide sequence of primer # 630 used in Reference Example 1.

Abstract

　選択的にヘパラン硫酸の付加を受けることができるペプチドをコードするcDNAとヘパリン結合性タンパク質をコードするcDNAを連結し、この連結cDNAの遺伝子産物を動物細胞に生産させることにより、ヘパラン硫酸糖鎖を共有結合によって分子内に有するヘパリン結合性タンパク質を生産する。このヘパラン硫酸糖鎖が付加したヘパリン結合性タンパク質は、コンドロイチン硫酸をほとんど含まない硫酸化グリコサミノグリカン糖鎖が共有結合されており、例えば、熱、酸、アルカリ等に対して、あるいは生体内で安定である等、高機能化されており、また、細胞増殖、組織再生等に有効であるほか　さらにＦＧＦの生理機能を調節する作用を有し、ＦＧＦに関連する種々の疾患に対する予防乃至治療用医薬として極めて有用である。 　  

Description

へパラン硫酸糖鎖を付加したへノ、。リン結合性タンパク質、その製造方法 及びそれを含有する医薬組成物
技術分野
[0001] 本発明は、へパラン硫酸糖鎖を選択的に共有結合させることにより高機能化された へパリン結合性タンパク質、その製造方法及びそれを含有する医薬組成物に関する
背景技術
[0002] 従来、へパリン結合性タンパク質、なかでも繊維芽細胞増殖因子 (fibroblast growth factor,以下「FGF」と記す。）ファミリーに分類されるタンパク質は、硫酸化多糖であ るへパリンやへパラン硫酸と非共有的な結合様式で強く結合することが知られていた
。そして繊維芽細胞増殖因子などのへノ リン結合性タンパク質をへノ リンなどの硫酸 化多糖との混合物とした場合、へパリン結合性タンパク質の生物活性や物性が変化 し、その機能が変化し、高機能化する場合があることが知られていた。しかしながら、 硫酸ィ匕多糖を混合しても、期待できる高機能化は限定的なものであった。また、これ らを医薬品組成物として用いる場合には、遊離状態の硫酸ィ匕多糖による好ましくない 生理活'性が問題となっていた。
[0003] そこで既にへパリン結合性タンパク質の高機能化を意図してへパリン結合性タンパ ク質とへパラン硫酸を選択的に共有結合によって一体ィ匕したタンパク質の作製が意 図され、へパラン硫酸を共有結合で有するへノ^ン結合性タンパク質の作製方法が 発明された。し力しながら、当該発明によっては、共有結合する硫酸化グリコサミノグ リカン糖鎖の内訳として、へパラン硫酸とコンドロイチン硫酸の混合物が得られた。分 祈の結果、当該物質の高機能化はへパラン硫酸のみによっていることが明らかとなつ たので、へパラン硫酸が付加し、コンドロイチン硫酸がほとんど付加しない作製方法 が待ち望まれていた。
特許文献 1 :「糖鎖付加型へパリン結合性タンパク質、その製造方法およびそれを含 有する医薬組成物」特許第 3318602号 (2002)今村 亨、浅田真弘、岡 修ー、鈴木 理、米田敦子、大田恵子、織田裕子、宫川和子、折笠訓子、松田知栄、小嶋哲人 非特干文献 1： Yoneda A, Asada M, Oda Y, buzuki M, Imamura T. 'Engineering of an FGF— Proteoglycan Fusion Protein with Heparin— Independent, Deg radation- Augmented, Mitogenic Activity." Nature Biotechnology 18 (6), 641-644 (2000)
非特許文献 2 :米田敦子、浅田眞弘、今村亨 「シンデカンとの融合によるへパリン 結合性増殖因子 FGF- 1の活性改変」 細胞工学 19 (9), 1338-1340 (2000) 非特干文献 3 :Asaaa M, Yoneda A, Imamura T. Engineering of a
Heparin— Binding Growth Factor with Heparan Sulfate Sugar Chains. (へノヽプン硫酸 糖鎖によるへパリン結合性増殖因子のリモデリング）" Trends in Glycoscience and
Glycotechnology 13 (72) 385—394 (2001)
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0004] 本発明の課題は、へノ^ン結合性タンパク質の機能改質を目指し、へパラン硫酸選 択的でコンドロイチン硫酸をほとんど含まないグリコサミノダリカン糖鎖を共有結合さ せたへノ^ン結合性タンパク質とその製造方法を確立し、これを含む医薬組成物を 提供することにある。
課題を解決するための手段
[0005] 本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、へパラン硫酸とコン ドロイチン硫酸の両方の糖鎖により複数の部位が修飾されている天然分子シンデカ ン 4 (配列番号 9)の一次構造における第 39番目のセリン残基が特にへパラン硫酸に 選択的に修飾されて ヽることを、シンデカン 4の糖鎖修飾部位とレポーターのキメラタ ンパク質を解析することにより見出した。これに注目して、選択的にへパラン硫酸の付 加を受けることができるペプチド (配列番号 8)をコードする cDNA (配列番号 13)とへ ノ^ン結合性タンパク質 (配列番号 7)の cDNA (配列番号 10)を連結し、この連結 cDNAの遺伝子産物を動物細胞に生産させることにより、へパラン硫酸糖鎖を共有結 合によって分子内に有するへノ^ン結合性タンパク質を生産できることを見出した。さ らに、このへパラン硫酸糖鎖が付加したへノ^ン結合性タンパク質の機能が向上して いることを確認した。本発明はこのような知見に基づいて完成されたものである。
[0006] すなわち、本発明は、へパラン硫酸に富む糖鎖を共有結合させることにより高機能 化されたへノ リン結合性タンパク質を提供する。本発明のへノ リン結合性タンパク質 は、組成の 90%以上がへパラン硫酸糖鎖である硫酸ィ匕グリコサミノダリカン糖鎖を共 有結合させたへノ^ン結合性タンパク質である。硫酸ィ匕グリコサミノダリカン糖鎖の組 成は、例 は、 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., UNIT 17.13B (1996)に記載の方法などに従って判定することができる。
[0007] 糖鎖は、（1)へパラン硫酸、（2)へパラン硫酸及び他種グリコサミノダリカンと組み合 わされた N—結合型糖鎖、（3)へパラン硫酸と他のグリコサミノダリカンと組み合わさ れた O—結合型糖鎖、及び (4)それらの組み合わせ力 なる群より選択することがで きる。へノ リン結合性タンパク質は FGFファミリ一に属する因子またはその近縁の因 子であってもよい。へパリン結合性タンパク質は、へパラン硫酸糖鎖の付加を優先的 に受ける事ができるペプチドを介して糖鎖を共有結合していてもよい。たとえば、糖 鎖を共有結合させるへノ リン結合性タンパク質は、以下の、（a)または (b)のいずれか のタンパク質であってもよ 、。
(a) 配列番号 6または 7の 、ずれかのアミノ酸配列力 なるタンパク質。
(b) 配列番号 6または 7の 、ずれかのアミノ酸配列にお!、て 1若しくは数個のアミノ酸 が欠失、置換、付加若しくは修飾されたアミノ酸配列力もなり、 FGF活性を有し、かつ へパラン硫酸糖鎖の付加を優先的に受けることができるタンパク質。
[0008] FGF活性とは、具体的には、繊維芽細胞、血管内皮細胞、筋芽細胞、軟骨細胞、 骨芽細胞、グリア細胞の増殖を促進または抑制する活性をいう。 FGF活性は、 Ornitz DM & Leder P., Journal of Biological Chemistry 267 (23), p. 16305—16311 (1992)に 記載の方法に従って測定することができる。
[0009] へパラン硫酸糖鎖の付加を優先的に受けることができるタンパク質は、へパラン硫 酸糖鎖付加経路を有する生体内でへパラン硫酸糖鎖の付加を他の糖類 (例えば、コ ンドロイチン硫酸糖鎖)の付加よりも高 、選択性を持って受けることができるものであ ればよい。へパラン硫酸糖鎖付加経路を有する生体としては、動物細胞 (例えば COS cell, CHO cell, BHK cell, NIH3T3 cell, BALB/c3T3 cell, HUVE cell, LEII cell) 、昆虫細胞（例えば、 Sf-9 cell 、 Tn cell )などを例示することができる力 これらに限 定されることはない。
[0010] また、本発明は、組成の 90%以上がへパラン硫酸糖鎖である硫酸ィ匕グリコサミノダリ カン糖鎖を共有結合させたへノ^ン結合性タンパク質の製造方法であって、以下の 工程：
(a)へパラン硫酸糖鎖の付加を優先的に受けることができるペプチドをコードする cDNAとへノ リン結合性タンパク質をコードする cDNAとを連結する工程、
(b)当該連結 cDNAを発現ベクターに組み込む工程、
(c)当該発現ベクターをへパラン硫酸糖鎖付加経路を有する宿主細胞に導入するェ 程、および
(d)当該宿主細胞において、へパラン硫酸糖鎖の付加を優先的に受けることができる ペプチドを介してへパラン硫酸糖鎖が共有結合しているへノ^ン結合性タンパク質を 発現させる工程
を含む、前記の方法を提供する。
[0011] 本発明の方法において、へパラン硫酸糖鎖の付加を優先的に受けることができる ペプチドは、以下の (a)または (b)の!、ずれかのペプチドであるとよ!、。
(a) 配列番号 8のアミノ酸配列からなるペプチド。
(b) 配列番号 8のアミノ酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付カロ 若しくは修飾されたアミノ酸配列カゝらなり、へパラン硫酸糖鎖の付加を優先的に受け ることができるペプチド。
[0012] へパラン硫酸糖鎖の付加を優先的に受けることができるペプチドは、へパラン硫酸 糖鎖付加経路を有する生体内でへパラン硫酸糖鎖の付加を他の糖類 (例えば、コン ドロイチン硫酸糖鎖)の付加よりも高 、選択性を持って受けることができるものであれ ばよい。へパラン硫酸糖鎖付加経路を有する生体としては、動物細胞 (例えば COS cell, CHO cell, BHK cell, NIH3T3 cell, BALB/c3T3 cell, HUVE cell, LEII cell) 、昆 虫細胞（例えば、 Sf-9 cell 、 Tn cell )などを例示することができる力 これらに限定さ れることはない。
[0013] へパラン硫酸糖鎖の付カ卩を優先的に受けることができるペプチドをコードする cDNA としては、配列番号 13の塩基配列を有するものを挙げることができる。
[0014] 本発明の方法において、へパリン結合性タンパク質は組成の 90%以上がへパラン 硫酸糖鎖である硫酸ィ匕グリコサミノダリカン糖鎖を共有結合させたへノ^ン結合性タ ンパク質である。糖鎖は、（1)へパラン硫酸、（2)へパラン硫酸及び他種グリコサミノ ダリカンと組み合わされた N—結合型糖鎖、 (3)へパラン硫酸と他のグリコサミノグリカ ンと組み合わされた O—結合型糖鎖、及び (4)それらの組み合わせ力 なる群より選 択することができる。へノ リン結合性タンパク質は FGFファミリーに属する因子または その近縁の因子であってもよい。へノ リン結合性タンパク質は、へパラン硫酸糖鎖の 付加を優先的に受ける事ができるペプチドを介して糖鎖を共有結合している。たとえ ば、糖鎖を共有結合させるへノ リン結合性タンパク質は、以下の、（a)または (b)のいず れかのタンパク質であってもよ 、。
(a) 配列番号 6または 7のアミノ酸配列からなるタンパク質。
(b) 配列番号 6または 7のアミノ酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置 換、付加若しくは修飾されたアミノ酸配列からなり、 FGF活性を有し、かつへパラン硫 酸糖鎖の付加を優先的に受けることができるタンパク質。
[0015] さらに、本発明は、へパラン硫酸糖鎖を共有結合させることにより高機能化された前 記のへパリン結合性タンパク質を有効成分として含有する医薬組成物を提供する。
[0016] さらにまた、本発明は、配列番号 13の塩基配列を有し、へパラン硫酸糖鎖の付カロ を優先的に受けることができるペプチドをコードする核酸を提供する。核酸としては、 DNA、 RNA、 DNAと RNAのキメラ分子、それらの誘導体などを挙げることができる 力 本発明の高機能化されたへパリン結合性タンパク質の製造方法に使用する場合 には、核酸は DNAであることが好ましい。
[0017] 本明細書において、「硫酸ィ匕グリコサミノダリカン糖鎖」とは、タンパク質の一次構造 に存するセリン残基に結合したキシロースを起点として伸長する、あるいは遊離状態 で存在する多様な糖鎖構造を総称するものであり、 N—ァセチルダルコサミンや N— ァセチルガラタトサミンに代表されるァミノ糖と、グルクロン酸ゃィズロン酸に代表され るゥロン酸あるいはガラクトースカ なる二糖単位の繰り返し構造をもち、いくつかの 水酸基あるいはァミノ基が硫酸基で置換されているものをいう。具体的な構造は、「糖 鎖の細胞における運命」（永井'箱守'木幡編、講談社サイエンティフィック）などに記 載されている。この硫酸ィ匕グリコサミノダリカン糖鎖は、その機能を発揮する限りにお いて、その糖鎖配列の一部に、付加、欠失、置換または修飾があってもよい。 発明の効果
[0018] 本発明により、へパラン硫酸糖鎖を選択的に共有結合させ、コンドロイチン硫酸を ほとんど含まな 、へノ リン結合性タンパク質及びその製造方法が提供された。本発 明のへノ リン結合性タンパク質は、へパラン硫酸とコンドロイチン硫酸とを含むへパリ ン結合性タンパク質よりも機能改質の度合 、が高 、。本発明のへパリン結合性タンパ ク質は、医薬品として利用することができる。 図面の簡単な説明
[0019] [図 1]図 1は、試験例 1において、 COS-1細胞が分泌した trunc. PG-FGF-l蛋白質を SDS変性電気泳動で分離した後、抗 FGF-1単クローナル抗体で染色した結果を示 す電気泳動写真である。
[図 2]図 2は、試験例 2において、 trunc. PG- FGF-1蛋白質及び、 S/FGF-la-II蛋白 質を各種グリコサミノダリカン分解酵素（GAG' ase)及びペプチド N-グリコシダーゼ F で処理した後、 SDS変性電気泳動及び抗 FGF-1単クローナル抗体染色で解析した 結果を示す電気泳動写真である。
[図 3]図 3は、試験例 3において、各種蛋白質の FGF受容体を発現する Ba/F3細胞に 対する細胞増殖促進活性を評価した結果を示すグラフである。
発明を実施するための最良の形態
[0020] 以下、本発明を詳細に説明する。
本発明にお 、て、へパラン硫酸糖鎖を共有結合させるべきへノ^ン結合性タンパク 質は、へノ リン結合性を有するタンパク質であり、具体例としては、 FGFファミリーに属 する因子または近縁の因子、またはへパリン結合性を有するが前者と構造的な類似 性はな!/、他のタンパク質を挙げることができる。ここで述べる他のタンパク質としては、 具体的には、へパリン結合性上皮細胞増殖因子様因子 (HB-EGF)、血小板由来増 殖因子（PDGF)などが挙げられる力 これに限定されるものではない。 FGFファミリー に属する因子の具体例としては、 FGF-1〜23などが知られている。へパリン結合性タ ンパク質は、糖鎖の付加を受けることができるペプチドを介してへパラン硫酸糖鎖を 共有結合していてもよい。例えば、へパラン硫酸糖鎖を共有結合させるへパリン結合 性タンパク質は、以下の（a)または（b)の 、ずれかのタンパク質であってもよ 、。
(a)配列番号 7のアミノ酸配列からなるタンパク質。
(b)配列番号 7のアミノ酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付カロ 若しくは修飾されたアミノ酸配列カゝらなり、 FGF活性を有し、かつへパラン硫酸糖鎖の 付加を優先的に受けることができるタンパク質。
[0021] 配列番号 7のアミノ酸配列を有するタンパク質は、例えば、配列番号 10の DNA配列 によりコードされる。あるいはまた、へパラン硫酸糖鎖を共有結合させるへノ リン結合 性タンパク質は、以下の（a，）または（b，）の 、ずれかのタンパク質であってもよ 、。 (a' )配列番号 6のアミノ酸配列からなるタンパク質。
(b' )配列番号 6のアミノ酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付 加若しくは修飾されたアミノ酸配列カゝらなり、 FGF活性を有し、かつへパラン硫酸糖鎖 の付加を優先的に受けることができるタンパク質。
[0022] 配列番号 6のアミノ酸配列を有するタンパク質は、例えば、配列番号 5の DNA配列 によりコードされる。このタンパク質は、 FGFファミリーに属する因子のペプチド配列の 他、へパラン硫酸糖鎖の付加を優先的に受けることができるペプチド配列とシグナル ペプチドの配列を含んでいる。本明細書でいうへノ リン結合性タンパク質は、配列表 に記載された cDNAがー次的に規定するタンパク質にカ卩えて、細胞から分泌される 際にそのアミノ末端に存するシグナルペプチドと呼ばれる分泌の為のペプチド配列 が切断された形のタンパク質を含む。本発明の医薬組成物の有効成分として含有さ せるへノ リン結合性タンパク質は
、初めからシグナルペプチドを欠損する形で製造してもその有用性には変化がな 、。 [0023] へノ リン結合性タンパク質に共有結合させるへパラン硫酸糖鎖は、共有結合させる ことによりへノ リン結合性タンパク質が高機能化されるものであれば、いかなるもので あってもよい。本明細書において、「高機能化」とは、対象のタンパク質の活性が上が ることを意味する。高機能化の例として、へパラン硫酸糖鎖をタンパク質に共有結合 させることにより、熱、酸またはアルカリによる処理の後に残っている活性力 へパラン 硫酸糖鎖を共有結合させて 、な 、タンパク質に比べて、高くなることが挙げられる。 本明細書で ヽうへパラン硫酸糖鎖とは、上述した硫酸ィ匕グリコサミノダリカン糖鎖のう ち、ァミノ糖が N—ァセチルダルコサミンであり、ゥロン酸（グルクロン酸またはィズロン 酸）との二糖単位の繰り返し構造をもち、いくつかの水酸基あるいはァミノ基が硫酸基 で置換されているものをいう。このへパラン硫酸糖鎖は、その機能を発揮する限りに おいて、その糖鎖配列の一部に、付加、欠失、置換または修飾があってもよい。
[0024] へパラン硫酸糖鎖をへノ リン結合性タンパク質に結合させるにあたっては、へパラ ン硫酸糖鎖のみを直接へノ^ン結合性タンパク質に共有結合させてもょ 、し、へパラ ン硫酸糖鎖を共有結合している任意の長さのペプチドをへノ^ン結合性タンパク質 に共有結合させてもよい。本発明のへパラン硫酸糖鎖が共有結合しているへノ^ン 結合性タンパク質 (以下、「へパラン硫酸糖鎖付加型へノ^ン結合性タンパク質」と記 す。）を製造するには、まず、へパラン硫酸糖鎖の付加を優先的に受けることができる ペプチドをコードする cDNAとへパリン結合性タンパク質をコードする cDNAとを連結し 、これを適切な発現ベクターに組み込み、当該発現ベクターを糖鎖付加経路を有す る宿主細胞に導入して、へパラン硫酸糖鎖付加型へパリン結合性タンパク質を発現 させればよい。
[0025] 各種へパリン結合性タンパク質の cDNAは、 DDBJ (日本 DNAデータバンク）など遺 伝子バンクに登録された配列から適当なプライマーを設計し、当該動物の当該組織 の mRNAより RT-PCR (逆転写 PCR)を行うことによって、取得できる。
[0026] へパラン硫酸糖鎖の付加を優先的に受けることが知られているペプチドとしては、 各種プロテオダリカン（例えば、シンデカン、グリピカン、パールカンなど）のコアタン ノ ク質またはその一部分が挙げられる。プロテオダリカンのコアタンパク質の一部分と しては、プロテオダリカンの糖鎖付加部位と考えられる Ser-Glyの繰り返し配列を含む ペプチドが挙げられる。へパラン硫酸糖鎖の付加を優先的に受けることができるぺプ チドとしては、以下の (a)、（b)のペプチドが挙げられる。
(a) 配列番号 8のアミノ酸配列からなるペプチド。
(b) 配列番号 8のアミノ酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付カロ 若しくは修飾されたアミノ酸配列カゝらなり、へパラン硫酸糖鎖の付加を優先的に受け ることができるペプチド。
[0027] 本発明でへパラン硫酸糖鎖を結合させる部位としては、へノ^ン結合性タンパク質 の 2次構造においてターンを形成している部位又は末端近傍や糖鎖付カ卩によって 3 次元構造が大きく変化しな 、部位がょ 、。
[0028] 本発明のへパラン硫酸糖鎖付加型へノ^ン結合性タンパク質の製造方法の一例を 以下に説明する。
[0029] まず、分泌シグナルおよびへパラン硫酸糖鎖の付加を優先的に受けることが知られ ているペプチドをコードするオリゴヌクレオチドを合成し、あるいは PCR反応によって 増幅し、これをへノ リン結合性タンパク質をコードするプラスミドの 5'端に組み込む。 分泌シグナルペプチドとしては、例えば、典型的な分泌型糖タンパク質のァミノ末端 を利用することができ、具体的には、ヒトシンデカン一 4の N末端より 18残基のアミノ酸 などが挙げられる。へノ リン結合性タンパク質をコードするプラスミドは、へパリン結合 性タンパク質をコードする DNAを適当なプラスミドに組み込むことにより調製すること ができる。この
へパリン結合性タンパク質をコードする DNAを組み込むプラスミドとしては、宿主内で 複製保持されるものであれば、いずれも使用することができるが、例えば大腸菌由来 の pBR322、 pUC18、及びこれらを基に構築された pET-3cなどを挙げることができる。 へパリン結合性タンパク質をコードするプラスミドに上記のオリゴヌクレオチドを組み 込む方法としては、例えば T.Maniatisら、 Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, p. 239 (1982)に記載の方法などが挙げられる。
[0030] 上記のようにして作製したプラスミドから、分泌シグナル、へパラン硫酸糖鎖の付カロ を優先的に受けることが知られているペプチドおよびへパリン結合性タンパク質のす ベてをコードする塩基配列を含む領域 (以下、「へパラン硫酸糖鎖付加型へパリン結 合性タンパク質をコードする塩基配列を含む領域」と記す。 )を切り出し、これを発現 に適したベクター中のプロモーターの下流に連結することにより、発現型ベクターを 得ることができる。この糖鎖付加型へノ^ン結合性タンパク質をコードする塩基配列を 含む領域はその 5'末端に翻訳開始コドンとしての ATGを有し、また 3'末端には翻訳 終始コドンとしての TAA、 TGAまたは TAGを有してもよい。さらに該翻訳領域にコード されているタンパク質を発現させるにはその上流にプロモーターを接続する。本発明 で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切な プロモーターであれば 、かなるものでもよ 、。形質転換する宿主が動物細胞である 場合には、 SV40由来のプロモーター、レトロウイルスのプロモーターなどが挙げられ る。このようにして構築された糖鎖付加型へノ^ン結合性タンパク質をコードする塩基 配列を有する組み換え DNAを組み込むプラスミドとしては、宿主細胞内で発現され るものであれば、いずれも使用することができる力 例えば大腸菌由来の pBR322、 PUC18などを基に構築されたベクターなどを挙げることができる。プラスミドに組み込 む方法としては、例えば T.Maniatisら、 Molecular Clonin g, Cold Spring Harbor Laboratory, p. 239 (1982)に記載の方法などが挙げられる。
[0031] 上記の組み換え DNAを含むベクターを宿主細胞に導入することにより、該ベクター を保持する形質転換体を製造する。宿主細胞としては、へパラン硫酸糖鎖付加経路 を有するものであれば、いかなるものであってもよぐ動物細胞（例えば COS cell, CHO cell, BHK cell, NIH3T3 cell, BALB/c3T3 cell, HUVE cell, LEII cell)、昆虫細 胞（例えば、 Sf-9 cell 、 Tn cell )などを例示することができる力 これらに限定されるこ とはない。
上記の形質転換は、それぞれの宿主について一般的に行われている方法で行う。ま た、一般的でなくとも適用可能な方法ならばよい。例としては、宿主が動物細胞であ れば、増殖期等の細胞に組み換え DNAを含むベクターをリン酸カルシウム法、リポ フエクシヨン法あるいはエレクト口ポレーシヨン法により導入する。
[0032] このようにして得られた形質転換体を培地にて培養することにより、へパラン硫酸糖 鎖付加型へパリン結合性タンパク質を産生させる。形質転換体を培養する場合、培 養に使用される培地としては、それぞれの宿主にっ 、て一般的に用いられて 、るも のを用いる。または一般的でなくとも適用可能な培地ならば良い。例としては、宿主 が動物細胞であれば、 Dulbecco's MEMに動物血清をカ卩えたものなどを用いる。培養 は、それぞれの宿主について一般的に用いられている条件で行う。また一般的でな くとも適用可能な条件ならばよい。例としては、宿主が動物細胞であれば約 32〜37°C で、 5% C02、 100%湿度の条件で約 24時間〜 2週間行い、必要により気相の条件を 変えたり撹拌を加えることができる。
[0033] 上記のような形質転換体の培養物からへパラン硫酸糖鎖付加型へパリン結合性タ ンパク質を得るには、培養液中に放出されたものを、遠心分離後の上澄み液から直 接回収できる。この上澄み液力もへパラン硫酸糖鎖付加型へノ^ン結合性タンパク 質を精製するには、公知の分離 ·精製法を適切に組み合わせて行うことができる。こ れらの公知の分離、精製法としては、塩析、溶媒沈殿、透析、限外濾過、ゲル濾過、 SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、ァフィ-ティーク 口マトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、等電点電気泳動などが使用され うる。このようにして得られた標品はへパラン硫酸糖鎖付加型へノ^ン結合性タンパク 質の活性が損なわれない限りにおいて透析、凍結乾燥を行い、乾燥粉末とすることも できる。さらに、担体として血清アルブミンなどを添加して保存することは、標品の容 器への吸着を防ぐのに有効である。また、精製過程、あるいは保存過程での微量の 還元剤の共存は、該標品の酸ィ匕を防ぐのに好適である。還元剤としては、 β メルカ プトエタノール、ジチオスレィトール、グルタチンなどが挙げられる。
[0034] 本発明の糖鎖付加型へノ^ン結合性タンパク質は、化学的な方法で糖鎖をへパリ ン結合性タンパク質に結合させることにより、製造することもできる。その具体的な方 法としては以下の a)、 b)いずれか、あるいはこれらの組み合わせによる方法が考えら れる。
[0035] a)例えば、まずへパラン硫酸糖鎖を生物学的方法または化学的合成法またはこれ の適宜組み合わせた方法により完成させる。その際、糖鎖末端に適当なタンパク質 結合用の残基を導入しておくこともできる。例えば、完成された糖鎖の還元末端を還 元および部分酸化することによりアルデヒド基を形成し、これをタンパク質中のアミノ 基とアミノ結合させることにより、へパラン硫酸糖鎖とタンパク質の結合が完成する。 [0036] b)例えば、まず、単糖の還元末端、あるいは単糖に結合した適当なタンパク質結合 用の残基を還元および部分酸化することによりアルデヒド基を形成し、これをタンパク 質中のアミノ基とアミノ結合させることにより、単糖とタンパク質の結合が完成する。こ の単糖の水酸基などの官能基にさらなる単糖や糖鎖などを結合させることにより、へ ノ ン硫酸糖鎖を完成させる。この結合には生物学的方法または化学的合成法また はこれの適宜組み合わせた方法などが考えられる。
[0037] へノリン結合性タンパク質にへパラン硫酸糖鎖を共有結合させることにより高機能 化したタンパク質は医薬として利用可能である。例えば、本発明のへパラン硫酸糖鎖 付加型へパリン結合性タンパク質は、 FGFの生理的機能を調節する作用を有する。 FGFの生理的機能とは、具体的には、繊維芽細胞、血管内皮細胞、筋芽細胞、軟骨 細胞、骨芽細胞、グリア細胞の増殖を促進または抑制することをいう。従って、本発 明のへパラン硫酸糖鎖付加型へノ^ン結合性タンパク質は、細胞増殖や肝臓など組 織再生の促進、創傷治癒や神経機能調節、および繊維芽細胞等の増殖調節に有効 であり、各種疾病、具体的には、繊維芽細胞腫、血管腫、骨芽腫、神経細胞死、アル ッハイマー病、パーキンソン病、神経芽腫、健忘症、痴呆病、心筋梗塞の予防や治 療に有用であり、発毛剤、育毛剤などとしても利用可能である。
[0038] 本発明のへパラン硫酸糖鎖付加型へパリン結合性タンパク質は、医薬的に許容で きる溶剤、賦形剤、担体、補助剤などを使用し、製剤製造の常法に従って液剤、ロー シヨン剤、エアゾール剤、注射剤、散剤、顆粒剤、錠剤、坐剤、腸溶剤およびカプセ ル剤などの医薬組成物としてもよい。医薬組成物中、有効成分であるへパラン硫酸 糖鎖付加型へパリン結合性タンパク質の含有量は、 0.0000000001〜1.0重量％程度 とすればよい。該医薬組成物は、例えばヒト、マウス、ラット、ゥサギ、ィヌ、ネコ等の哺 乳動物に対して非経口的にまたは経口的に安全に投与することができる。本医薬組 成物の投与量は、剤形、投与ルート、症状等により適宜変更しうるが、例えばヒトを含 む哺乳動物に投与する場合、当該へパラン硫酸糖鎖付加型へパリン結合性タンパク 質を、 0.0001〜100mgを患部に 1日に数回適用することが例示される。
[0039] 以上、へノ^ン結合性タンパク質を例にとり本発明を説明したが、糖鎖を共有結合 させることにより、へノリン結合性タンパク質以外の糖鎖を持たない天然のタンパク質 も高機能化することができる。
[0040] 〔微生物の寄託〕
本発明のへパラン硫酸糖鎖付加型へパリン結合性タンパク質をコードする遺伝子 を作成するために用いた遺伝子 (配列番号 11の DNA配列を有する）を組み込んだプ ラスミドを含む大腸菌 DH5 a株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄 託センターに寄託番号 FERM P-16412〖こて、平成 9年 9月 10日に寄託されている。
実施例
[0041] 以下、実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施 例に制限されるものではな 、。
[0042] 〔参考例 1〕 S/FGF- la- II/pMEXneoプラスミドの構築
1) S/FGF-la-IIプラスミドの構築
1.ヒトリュウドカン cDNA断片の作製
phR7A8は、ヒトリュウドカンの cDNA (PCR産物）を pBluescript II (KS+)クローニン グベクターの EcoR V部位に挿入したプラスミドである。ァセッション番号 D13292に 示される mRNA配列のうち、 7番目から 2610番目までを含む（B.B.R.C. Vol. 190, No. 3, p.814-822, 1993を参照のこと）。これを Pvu IIで消化し、得られた 2,232塩 基対の DNA断片を铸型として PCR(Polymerase Chain Reaction:ポリメレース連鎖反 応）を行った。プライマーとして # 109 (5 -TTG TCG ACC CAC CAT GGC CCC CGC CCG TCT-3' ) (配列番号 15)および、 # 111 (5'- TTG ATA TCT AGA GGC ACC AAG GGA TG- 3' ) (配列番号 16)を用いた。特異的に増幅された 276塩基対 のバンドを電気泳動により分離し、これを抽出後、 EcoR Vおよび Sal Iで二重切断し た。得られた、 268塩基対のバンドを分離抽出し、以下に示す連結反応に用いた。
2. FGF-la/pBluescript II (KS+)の作製
ヒト FGF— 1 cDNAを铸型とし、 # 967 (5'— GCG TCG ACA GCG CTA ATT ACA AGAAGC CCA AAC TC- 3，）（配列番号 17)および # 630 (5'- CCG AAT TCG AAT TCT TTAATC AGA AGA GAC TGG- 3') (配列番号 18)をプライマーとして PCR反 応を行った。特異的に増幅された 434塩基対のバンドを電気泳動により分離し、これ を抽出後、 EcoR Iおよび Sal Iで二重切断した。得られた、 422塩基対のバンドを分 離抽出し、これを、 EcoR I, Sal Iで二重切断した pBluescript II (KS+)クローニングべ クタ一（ 2934塩基対）に挿入して、 FGF-la/pBluescript II (KS+)を得た。
FGF-la/pBluescript II (KS+)を Aor51H Iおよび Sal Iで順次消化し、得られた 2626 塩基対のバンドを分離抽出し、以下に示す連結反応に用いた。
3. S/FGF-la-IIキメラ遺伝子の作製
ヒトリュウドカンの PCR産物の EcoR V/Sal I断片、及び FGF- la/pBluescript II (KS+)の Aor51H I/Sal I断片を DNA連結反応に供し、 S/FGF- la- II/pBluescript II (KS+)ベクターを得た。さらにこれを、 EcoR Iおよび Sal Iで二重切断し、得られた、 678 塩基対のバンドを分離抽出した。これを、 EcoR I, Sal Iで二重切断した pMEXneo発 現ベクター（5916塩基対）に挿入して、 S/FGF-la-11/pMEXneoを得た。この発現型 ベクターは、配列番号 11の塩基配列を含む。 〔実施例 l〕trunc. PG- FGF- 1蛋白質の調製
1. trunc. PG- FGF- 1プラスミドの構築
(1) trunc. PG- FGF- 1前半部遺伝子の構築
S/FGF- la- II/pMEXneo (参考例 1)プラスミドを铸型として、 PCR (polymerase chain reaction;ポリメレース連鎖反応)を行った。プライマーとして、 #117 (5，- tcttccgatagactgcgtcg— «3，) (酉歹 号 1)及び #り45 (5 ― gtaattagctacatcctcatcgtctgg -3') (配列番号 2)を用いた。特異的に増幅された 200塩基対のバンドを電気泳動に より分離し、これを抽出した。
なお、 S/FGF-la-11/pMEXneoプラスミドが持つ翻訳領域の DNA配列を配列番号 11 に示す。また、これは、哺乳動物細胞では配列番号 12のアミノ酸配列を持つ蛋白質 をコードする。
(2) trunc. PG- FGF- 1後半部遺伝子の構築
S/FGF- la- II/pMEXneoプラスミドを铸型として、 PCRを行った。プライマーとして、 #646 (ΰ - gaggatgtagctaattacaagaagccca - 3，) (酉己列番号 3)及び #118 (5 - cattctagttgtggtttgtcc - 3') (配列番号 4)を用いた。特異的に増幅された 479塩基対 のバンドを電気泳動により分離し、これを抽出した。
(3)trunc. PG- FGF- 1全長遺伝子の構築
上記（1)及び（2)で得られた DNA断片を混合して铸型とし、プライマーとして #117 及び #118を用いた PCRを行った。特異的に増幅された 661塩基対のバンドを電気泳 動により分離し、これを抽出した。さらにこれを、 EcoR Iおよび Sal Iで二重切断し、得 られた、 564塩基対のバンドを分離抽出した。これを、 EcoR I, Sal Iで二重切断した pMEXneo発現ベクター（5916塩基対）に挿入して、 trunc. PG- FGF- 1/pMEXneoを 得た。この発現型ベクターは、配列番号 5の塩基配列を含み、これは、哺乳動物細胞 では配列番号 6のアミノ酸配列を持つ蛋白質をコードする。
[0044] 2. trunc. PG- FGF- 1蛋白質の発現
得られた trunc. PG-FGF-1/pMEXneoをリポフエクシヨン法によって COS- 1細胞（ サル腎臓由来細胞株）に遺伝子導入した。無血清培地中で培養することで、培地中 に生合成された蛋白質を分泌させ、 3日後に培養上清を回収した。得られた馴化培 地は低速遠心分離した後、その上清を 4°Cで保存した。
[0045] 3.陰イオン交換クロマトグラフィーによる trunc. PG- FGF- 1蛋白質の粗精製
trunc. PG- FGF-1蛋白質の分泌細胞の馴化培地に DEAE (ジェチルアミノエチル） -セファロースビーズを加え、 4°Cで攪拌した。低速遠心によって沈降するビーズを回 収し、カラム管につめた。 0.001% CHAPS (コールアミドプロピルジメチルアンモ-ォ プロパンスルフォネート）を含むトリス塩酸緩衝液（10 mM, pH 7.4)で十分に洗浄した 後、 0.5 M NaClを含む同緩衝液によって結合した蛋白質を溶出した。さらにこの溶出 液を生理的リン酸緩衝液（ PBS： phosphate buffered saline, pH 7.4)に対して透析し た。
[0046] 〔試験例 1〕 （SDS変性電気泳動）
trunc. PG-FGF-1蛋白質の分泌細胞の馴化培地を蒸留水に対して透析した後、凍 結乾燥により濃縮した。これを、電気泳動用緩衝液 (SDS, 2-メルカプトエタノール含 有）と共に煮沸し、電気泳動用試料とした。 12.5 %アクリルアミドゲルを用い、 SDS、 2- メルカプトエタノール存在下で電気泳動を行!、、ニトロセルロース膜に電気的に転写 後、抗 FGF-1単クローナル抗体、西洋ヮサビペルォキシダーゼ標識抗マウス IgG抗 体を用いて染色し、化学発光法で検出した。結果を図 1に示す。
図中、左の線は分子量既知の標準タンパク質の泳動位置とその分子量 (単位：ダ ルトン）を示す。また、分子量マーカーの泳動位置を左側に示す。 trunc. PG-FGF-1 蛋白質は配列番号 6で示すところの 183残基のアミノ酸力もなる蛋白質であり、修飾 がない単純蛋白質として発現'分泌されていれば、約 20 kDa付近にバンドを与える はずである。ところが、実際には、 40 kDa〜100 kDaあたりにスメァなバンドとして検 出された。これは、グリコサミノダリカン糖鎖で修飾された蛋白質に特徴的なパターン である。スメァになる原因としては、グリコサミノダリカン糖鎖の鎖長が均一でないため であると考えられる。
〔試験例 2〕 （糖質分解酵素処理）
上記試験例 1の通り、凍結乾燥により濃縮した trunc. PG- FGF-1蛋白質を、各種グ リコサミノダリカン分解酵素（GAG' ase)で処理した後、さらにペプチド N-グリコシダー ゼ Fで処理した。これを、上記と同様に SDS変性電気泳動で解析した。比較として、 参考例 1で作製した S/FGF- la- Π/pMEXneoも同様に解析した。結果を図 2に示す。 図中、左半分は、 trunc. PG-FGF-1の結果を、右半分は S/FGF-la-IIの結果を示す 。分子量マーカーの泳動位置を両端に示す。 trunc. PG- FGF-1はへパラナーゼと へパリチナーゼの混合物（HP， ase & HS， ase)で処理することにより、スメァなバンドは 完全に消失し 21 kDa及び 25 kDaの 2本のバンドを与える（レーン 3)。一方、 S/FGF-la-IIはへパラナーゼとへパリチナーゼの混合物（HP' ase & HS' ase)だけで は、その一部は低分子化するものの、スメァなバンドを完全に消失させることはできず (レーン 9)、これにさらにコンドロイチナーゼ（CS， ase)をカ卩えることによって初めてスメ ァなバンドが消失する（レーン 11)。以上の結果から、 S/FGF-la-IIはへパラン硫酸 のみならずコンドロイチン硫酸でも修飾されている力 trunc. PG-FGF-1はへパラン 硫酸のみで修飾されていることが判明した。 また、 HP' ase & HS' ase、 CS' aseで処 理した後に現れる 2本のバンド（レーン 3、レーン 11)を解析する目的で、これらの酵 素で処理した後、さらにすベての N-結合型糖鎖を遊離する酵素であるペプチド N-グ リコシダーゼ Fを添加した。その結果、高分子側のバンドは消失し、 1本のバンドに収 斂した（レーン 4。レーン 12)。この結果から、 trunc. PG-FGF-1、 S/FGF-la-IIは共に 、その一部は N-結合型糖鎖でも修飾されて ヽることが判明した。
[0048] 〔試験例 3〕 （細胞増殖促進活性）
trunc. PG-FGF-1蛋白質の増殖因子としての生理活性を評価した。 FGF-1は標的 細胞の受容体に結合して生理活性を発揮する際にはへパリンまたはへパラン硫酸の 共存が必須である。そこで、内在性へパラン硫酸を発現しないことが知られているマ ウス Ba/F3細胞 (pro B細胞由来細胞株）に FGF受容体 (Rlcタイプ）を発現させた細 胞株を標的とし、外来へパリンの共存あるいは非共存下における、 trunc. PG-FGF-1 蛋白質の細胞増殖促進活性を評価した。細胞増殖促進活性の評価にあたっては、 テトラカラーワンを利用した生細胞数の測定に基づいた。
[0049] 96穴プレートに FGF受容体を発現する Ba/F3細胞を播種すると同時に、粗精製した trunc. PG- FGF- 1蛋白質を各種濃度で添カ卩した。また、この際、 10 ug (micro- gram) のへノ リンを共存させたもの、させないものを用意した。 48時間後、テトラカラーワンを 10 ul (micro-liter)添カ卩し、さらに 4時間保温した後 450 nmの吸光度を測定した。また 、比較として、参考例 1で作製した S/FGF-la-11/pMEXneoを同様に解析した結果、 及び、大腸菌で生産した単純蛋白質 FGF-1を同様に解析した。結果を図 3に示す。 図中、丸は trunc. PG-FGF-1蛋白質の細胞増殖促進活性を、三角は S/FGF-la-II 蛋白質の細胞増殖促進活性を、四角は大腸菌で生産した単純蛋白質 FGF-1の細 胞増殖促進活性を、それぞれ示す。また、実線はへパリン共存下 (5 micro-gram/ml) 、破線はへパリン非共存下での細胞増殖促進活性を示す。 Ba/F3細胞の増殖培地 (IL-3を含む）で培養した場合の 450 nmの吸光度を 100%とし、各増殖因子存在下で の 450 nmの吸光度の割合で、細胞増殖促進活性を表す。
大腸菌で生産した単純蛋白質 FGF-1では、へノ^ンが共存した場合に限って、濃 度依存的な細胞増殖促進活性が検出される（四角実線)。しかし、へパリンが共存し な ヽ場合には、全く活'性が検出されな ヽ（四角破線) o
S/FGF-la-II蛋白質では、へパリンが共存しなくとも、高濃度（10〜100 ng/ml)では 活性が見られる（三角破線)。 trunc. PG-FGF-1蛋白質の場合には、 1〜10 ng/ml の低濃度でも、へノリンの共存なしに活性を発揮する（丸破線)。その活性は、単純 蛋白質 FGF-1にへパリンを共存させた場合（四角実線）に匹敵するものであり、 S/FGF-la-IIより高い比活性を有する。 以上の結果から、 S/FGF-la-II蛋白質や trunc. PG-FGF-1蛋白質は自身の分子内にへパラン硫酸糖鎖を有する（図 2参照） ため、これがへパリンの機能を代用していると考えられる。 しかし、 S/FGF-la-II蛋白 質にはへパラン硫酸糖鎖のみならず、活性の発揮に寄与しな!、と考えられて 、るコ ンドロイチン硫酸糖鎖もが付加しているため、比活性はそれほど高くはない。これに 対し、 trunc. PG-FGF-1蛋白質は、ほとんどへパラン硫酸糖鎖のみで修飾されている ため、高い比活性が得られたものと考えられる。 この結果から、その活性発現にへ ノ^ンやへパラン硫酸の共存が求められる生理活性因子に対し、糖鎖の共存がなく ても活性を発揮するように、タンパク質のリモデリングを行うにあたっては、へパラン硫 酸とコンドロイチン硫酸の混合物でよりも、へパラン硫酸だけで修飾された分子をデ ザインする方が有効であることが示された。
産業上の利用可能性
本発明の新規なへパラン硫酸糖鎖付加型へノ^ン結合性タンパク質は、耐熱性、 耐酸性、耐アルカリ性、蛋白質分解酵素抵抗性などの安定性に優れ、高い生物学的 活性を有する。従って、本発明のへパラン硫酸糖鎖付加型へノ リン結合性タンパク 質を医薬品に利用することにより、生体内での安定性、特に、耐酸性、耐アルカリ性 、つた安定性に優れ、経口投与への適用が可能でかつ薬効が高い医薬品を設計 することができる。
配列表フリーテキスト <配列番号 1 >
配列番号 1は、実施例 1で用いたプライマー #117の塩基配列を示す。 <配列番号 2>
配列番号 2は、実施例 1で用いたプライマー #645の塩基配列を示す。 <配列番号 3 >
配列番号 3は、実施例 1で用いたプライマー #646の塩基配列を示す。 <配列番号 4>
配列番号 4は、実施例 1で用いたプライマー #118の塩基配列を示す。 <配列番号 5 >
配列番号 5は、 trunc. PG-FGF-1の塩基配列を示す。
<配列番号 6 >
配列番号 6は、 trunc. PG- FGF-1のアミノ酸配列を示す。
<配列番号 7>
配列番号 7は、 FGF-laのアミノ酸配列を示す。
<配列番号 8 >
配列番号 8は、 human syndecan-4の部分アミノ酸配列を示す。
<配列番号 9 >
配列番号 9は、 human syndecan- 4の全アミノ酸配列を示す。
く配列番号 10 >
配列番号 10は、 FGF-laの塩基配列を示す。
<配列番号 11 >
配列番号 11は、 S/FGF-la-IIの塩基配列を示す。
く配列番号 12 >
配列番号 12は、 S/FGF- la- IIのアミノ酸配列を示す。
く配列番号 13 >
配列番号 13は、 human syndecan-4の部分塩基配列を示す。
く配列番号 14 >
配列番号 14は、 human syndecan-4の全塩基配列を示す。 く配列番号 15 >
配列番号 15は、参考例 1で用いたプライマー #109の塩基配列を示す。 <配列番号 16 >
配列番号 16は、参考例 1で用 、たプライマー #111の塩基配列を示す。 く配列番号 17 >
配列番号 17は、参考例 1で用いたプライマー #967の塩基配列を示す。 く配列番号 18 >
配列番号 18は、参考例 1で用いたプライマー #630の塩基配列を示す。

Claims

請求の範囲
[1] 組成の 90%以上がへパラン硫酸糖鎖である硫酸ィ匕グリコサミノダリカン糖鎖を共有結 合させたへパリン結合性タンパク質。
[2] へノ^ン結合性タンパク質が繊維芽細胞増殖因子ファミリーに属する因子またはその 近縁の因子である、請求項 1に記載のへノ^ン結合性タンパク質。
[3] 糖鎖を共有結合させるへノ リン結合性タンパク質が、以下の (a)または (b)のいずれか のタンパク質である、請求項 2記載のへノ リン結合性タンパク質。
(a) 配列番号 6または 7の 、ずれかのアミノ酸配列力 なるタンパク質。
(b) 配列番号 6または 7の 、ずれかのアミノ酸配列にお!、て 1若しくは数個のアミノ酸 が欠失、置換、付加若しくは修飾されたアミノ酸配列力 なり、繊維芽細胞増殖因子 活性を有し、かつへパラン硫酸糖鎖の付加を優先的に受けることができるタンパク質
[4] 組成の 90%以上がへパラン硫酸糖鎖である硫酸ィ匕グリコサミノダリカン糖鎖を共有結 合させたへノ^ン結合性タンパク質の製造方法であって、以下の工程：
(a)へパラン硫酸糖鎖の付加を優先的に受けることができるペプチドをコードする cDNAとへノ リン結合性タンパク質をコードする cDNAとを連結する工程、
(b)当該連結 cDNAを発現ベクターに組み込む工程、
(c)当該発現ベクターをへパラン硫酸糖鎖付加経路を有する宿主細胞に導入するェ 程、および
(d)当該宿主細胞において、へパラン硫酸糖鎖の付加を優先的に受けることができる ペプチドを介してへパラン硫酸糖鎖が共有結合しているへノ^ン結合性タンパク質を 発現させる工程を含む、前記の方法。
[5] へパラン硫酸糖鎖の付加を優先的に受けることができるペプチドが、以下の (a)または (b)の 、ずれかのペプチドである、請求項 4に記載の方法。
(a) 配列番号 8のアミノ酸配列からなるペプチド。
(b) 配列番号 8のアミノ酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付カロ 若しくは修飾されたアミノ酸配列カゝらなり、へパラン硫酸糖鎖の付加を優先的に受け ることができるペプチド。
[6] へパラン硫酸糖鎖の付加を優先的に受けることができるペプチドをコードする cDNA が配列番号 13の塩基配列を有する、請求項 4に記載の方法。
[7] へノ^ン結合性タンパク質が繊維芽細胞増殖因子ファミリーに属する因子またはその 近縁の因子である、請求項 4に記載の方法。
[8] 請求項 1〜3の ヽずれかに記載のへパリン結合性タンパク質を有効成分として含有 する、医薬組成物。
[9] 配列番号 13の塩基配列を有し、へパラン硫酸糖鎖の付加を優先的に受けることがで きるペプチドをコードする核酸。
PCT/JP2005/006364 2004-03-31 2005-03-31 ヘパラン硫酸糖鎖を付加したヘパリン結合性タンパク質、その製造方法及びそれを含有する医薬組成物 WO2005095600A1 (ja)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US11/547,346 US7741078B2 (en) 2004-03-31 2005-03-31 Heparin-binding protein modified with heparan sulfate sugar chains, process for producing the same and pharmaceutical compositions containing the same
GB0621466A GB2427863B (en) 2004-03-31 2005-03-31 Heparin-Binding Protein Having Heparan Sulfate Sugar Chain Attached Thereto Process For Producing The Same And Medicinal Composition Containing The Same
DE112005000737T DE112005000737T5 (de) 2004-03-31 2005-03-31 Mit Heparansulfat-Zuckerketten modifizierte Heparin-bindende Proteine, Verfahren zur Erzeugung derselben und Arzneimittel, welche dieselben enthalten

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2004108570A JP4505631B2 (ja) 2004-03-31 2004-03-31 ヘパラン硫酸糖鎖を付加したヘパリン結合性タンパク質、その製造方法及びそれを含有する医薬組成物
JP2004-108570 2004-03-31

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2005095600A1 true WO2005095600A1 (ja) 2005-10-13

Family

ID=35063780

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2005/006364 WO2005095600A1 (ja) 2004-03-31 2005-03-31 ヘパラン硫酸糖鎖を付加したヘパリン結合性タンパク質、その製造方法及びそれを含有する医薬組成物

Country Status (5)

Country Link
US (1) US7741078B2 (ja)
JP (1) JP4505631B2 (ja)
DE (1) DE112005000737T5 (ja)
GB (1) GB2427863B (ja)
WO (1) WO2005095600A1 (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010530856A (ja) * 2007-06-22 2010-09-16 シュー，ハンメイ 血管生成の抑制剤、並びにその製造方法、修飾方法及び抗腫瘍薬の製造における用途
US7956033B2 (en) * 2008-06-10 2011-06-07 Eu Sol Biotech Co., Ltd. Modified peptide of human acidic fibroblast growth factor

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JOP20190083A1 (ar) 2008-06-04 2017-06-16 Amgen Inc بولي ببتيدات اندماجية طافرة لـfgf21 واستخداماتها
UA105016C2 (uk) 2008-10-10 2014-04-10 Амген Інк. Fgf21 мутанти і їх застосування
EP2427207B1 (en) 2009-05-05 2017-08-16 Amgen, Inc Fgf21 mutants and uses thereof
TWI560197B (en) 2009-05-05 2016-12-01 Amgen Inc Fgf21 mutants and uses thereof
AU2010262927A1 (en) * 2009-06-17 2012-01-19 Amgen Inc. Chimeric FGF19 polypeptides and uses thereof
TWI434698B (zh) * 2009-08-14 2014-04-21 Eu Sol Biotech Co Ltd 人類酸性纖維母細胞生長因子之醫藥用途
JP5830464B2 (ja) * 2009-09-01 2015-12-09 レンセラー ポリテクニック インスティチュート Ｋ５ヘパロサン発酵および精製
MX2012006397A (es) * 2009-12-02 2012-11-30 Amgen Inc PROTEINAS DE ENLACE QUE ENLAZAN A FGFR1C HUMANO, ß-KLOTHO HUMANA Y TANTO FGFR1C HUMANO COMO ß-KLOTHO HUMANA.
EP2338909B1 (en) 2009-12-08 2013-07-10 EU Sol Biotech Co., Ltd. Modified peptide of human acidic fibroblast growth factor
JP2011121882A (ja) * 2009-12-09 2011-06-23 Eu Sol Biotech Co Ltd ヒト酸性繊維芽細胞増殖因子の改変ペプチド
JP2013523184A (ja) 2010-04-15 2013-06-17 アムジエン・インコーポレーテツド ヒトＦＧＦ受容体およびβ−ＫＬＯＴＨＯ結合性タンパク質
JP2014193870A (ja) * 2014-04-23 2014-10-09 Eu Sol Biotech Co Ltd ヒト酸性繊維芽細胞増殖因子の改変ペプチド

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH11137255A (ja) * 1997-11-10 1999-05-25 Agency Of Ind Science & Technol 糖鎖付加型ヘパリン結合性タンパク質、その製造方法およびそれを含有する医薬組成物

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5486599A (en) * 1989-03-29 1996-01-23 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Construction and use of synthetic constructs encoding syndecan
US5622562A (en) * 1993-05-27 1997-04-22 Alcan International Limited Coating strip material with protective decorative layers while avoiding use of solvents
IL133318A0 (en) * 1999-12-05 2001-04-30 Yeda Res & Dev Proteoglycans and pharmaceutical compositions comprising them

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH11137255A (ja) * 1997-11-10 1999-05-25 Agency Of Ind Science & Technol 糖鎖付加型ヘパリン結合性タンパク質、その製造方法およびそれを含有する医薬組成物

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ASADA M. ET AL: "Engineering of a Heparin-Binding Growth Factor with Heparan Sulfate Sugar Chains.", TRENDS GLYCOSCIENCE GLYCOTECHNOLOGY., vol. 13, no. 72, 2001, pages 385 - 394, XP002993406 *
ASADA M. ET AL: "Modification of FGF-1, preferentially with heparan sulfate but not chondroitin sulfate.", vol. 76, no. 8, 25 August 2004 (2004-08-25), pages 1006, XP002993405 *
ASADA M. ET AL: "Tosa Donyu ni yoru Peptide-sei Yukazai no Anteika.", vol. 74, no. 8, 2002, pages 848, XP002993408 *
YONEDA A. ET AL: "Engineering of an FGF-proteoglycan fusion protein with heparin-independent, mitogenic activity.", NAT BIOTECHNOL., vol. 18, no. 6, 2000, pages 641 - 644, XP002993409 *
YONEDA A. ET AL: "Syndecan tono Yugo ni yoru Heparin Ketsugosei Zoshoku Inshi FGF-1 no Kassei Kaihen.", CELL TECHNOLOGY., vol. 19, no. 9, 2000, pages 1338 - 1340, XP002993407 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010530856A (ja) * 2007-06-22 2010-09-16 シュー，ハンメイ 血管生成の抑制剤、並びにその製造方法、修飾方法及び抗腫瘍薬の製造における用途
US7956033B2 (en) * 2008-06-10 2011-06-07 Eu Sol Biotech Co., Ltd. Modified peptide of human acidic fibroblast growth factor

Also Published As

Publication number Publication date
US7741078B2 (en) 2010-06-22
US20080119403A1 (en) 2008-05-22
GB0621466D0 (en) 2006-12-20
GB2427863A (en) 2007-01-10
JP4505631B2 (ja) 2010-07-21
JP2005287431A (ja) 2005-10-20
DE112005000737T5 (de) 2007-04-12
GB2427863B (en) 2008-12-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2005095600A1 (ja) ヘパラン硫酸糖鎖を付加したヘパリン結合性タンパク質、その製造方法及びそれを含有する医薬組成物
JP7142915B2 (ja) ラクトフェリン／アルブミン融合タンパク質及びその製造方法
FI117136B (fi) Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten erytropoietiinianalogien valmistamiseksi
RU2250213C2 (ru) Выделенный белок фактора роста кератиноцита (kgf), рекомбинантная молекула днк, вектор, способ конструирования клетки-хозяина, способ получения белка, фармацевтическая композиция
KR101160381B1 (ko) 생체내에서 조혈 자극제로서 사용하기 위한 재조합 ｔａｔ-ｈｏｘｂ４ｈ 단백질의 제조 방법
EP3678687B1 (en) Mutant fgf-21 peptide conjugates and uses thereof
KR20100037145A (ko) 크로마토그래피 방법
KR20100072169A (ko) Ｐｅｇ-결합된 폴리펩티드의 정제
WO2011084711A2 (en) Hair growth methods using fgfr3 extracellular domains
US7282481B2 (en) Heparin-binding proteins modified with sugar chains, method of producing the same and pharmaceutical compositions containing same
JP2002509691A (ja) 生物学的活性が改変された組換えタンパク質多量体の製造及び使用
JP3903503B2 (ja) 可溶性ポリペプチド
JPH02152990A (ja) 細胞接着活性ポリペプチド
JP2729712B2 (ja) 機能性ポリペプチド
CA2105449A1 (en) An interferon-.alpha./.beta. binding protein, its preparation and pharmaceutical compositions containing it
JPH05503006A (ja) ヒトｂＦＧＦムテインの製造法
JP4423394B2 (ja) 新規糖鎖認識蛋白質及びその遺伝子
JP3790810B2 (ja) 蛋白質変異体の生産方法、蛋白質変異体ライブラリーの作製方法、および蛋白質変異体をコードするｃＤＮＡのライブラリーの作製方法
JP4006511B2 (ja) Ｄｎａ増幅方法、アミノ酸配列の繰り返し配列をコードする遺伝子
WO1999053056A1 (fr) Nouvelle proteine et ses procedes de production
JP3490125B2 (ja) 巨核球増幅因子をコードする遺伝子
JP2839837B2 (ja) 顆粒球コロニー刺激因子受容体のリガンド結合領域蛋白質をコードしているｄｎａ
CN112770766A (zh) 经修饰的人促红细胞生成素
WO2010020767A2 (en) Glp-1 fusion polypeptides
JP2005506282A (ja) Ｆｌｉｎｔグリコフォーム

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BW BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NA NI NO NZ OM PG PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL SM SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): GM KE LS MW MZ NA SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IS IT LT LU MC NL PL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1120050007375

Country of ref document: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 0621466.2

Country of ref document: GB

Ref document number: 0621466

Country of ref document: GB

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 11547346

Country of ref document: US

RET De translation (de og part 6b)

Ref document number: 112005000737

Country of ref document: DE

Date of ref document: 20070412

Kind code of ref document: P

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 112005000737

Country of ref document: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase
WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 11547346

Country of ref document: US