WO2005030975A1

WO2005030975A1 - α－グリコシルイソクエルシトリン、並びにその製造中間体及び副生成物の調製方法

Info

Publication number: WO2005030975A1
Application number: PCT/JP2004/013580
Authority: WO
Inventors: Masamitsu Moriwaki; Kazuhiro Emura; Hisashi Tanaka
Original assignee: San-Ei Gen F.F.I., Inc.
Priority date: 2003-09-29
Filing date: 2004-09-10
Publication date: 2005-04-07
Also published as: EP1669462A4; EP1669462B1; EP1669462A1; KR101086441B1; CN1860239A; DE602004024097D1; JPWO2005030975A1; ATE448317T1; US20080187622A1; JP4498277B2; KR20060096425A; CN100413975C; US7691425B2

Description

明細書 α _グリコシルイソクエルシ卜リン、

並びにその難中間体及び劄生成物の調觀去翻分野

本発明は、酸化防止剤、退色防！！^、及 Ό ^ 変化防止剤等として食品分里香粧品分野で広く棚されている、一グリコシルイソクエルシトリン及びその SSi 中間体であるイソクェルシトリンの^ 法に関する。ーグリコシルイソクエルシトリンは、水難溶性フラポノイドであるイソクェルシトリンを配糖化 βすることによって水溶'性を高めたものである。よってイソクェルシトリンは、 CK—グリコシルイソクエルシトリンの製造中間体としてィ立置づけることができる。

さらに、本発明はィソクエルシトリンの i¾iにおいて副産物として生成される、ラムノースの製法にも関する。背景羅

イソクェルシトリンは、イソクェルセチンとも呼ばれ、ドクダミ、ラフマ (ヤンロン茶)、キユウリ、ヮタ、シロッメクサ、及びクヮ等の植物に ¾Tる化合物である。当該化合物は抗酸化作用 (退色防止作用、香喊化防止作用)、紫外線防止作用、及び金属キレート作用に加えて、禾【腺作用、抗炎症作用、毛細血^^化作用、及びビ夕ミン Ρ様作用等の麵学的作用もあるといわれており、着色飲料の退色防止剤や食品の香!^変化防止剤としてのみならず、化粧品ゃ健賴品の素材としても使用されている有用な化合物である。

ィソクエルシトリンが退色防止作用や香酸化防止作用を発 Τるためには、少なくとも 0. 0 0 1 w/ V %以上の? litが求められる力^ ィソクエルシトリンは常温の水に対して駄 0. 0 01wZv %@ ^までし力溶けないため、水性の製品への適用は雜上難しい。

力る問題を解消する方法として、赚ょり、糖転移酵素を用いて、基質のダルコース歹雄をィソクエルシトリンのダルコ一ス¾¾部位に転移させることによって、ィソクエルシトリンの ί乍用を,したままで、水易溶性を^ Τる一ダリコシルイソクエルシトリンを調製する方法が驗されており（特開平 0 1— 2 1 3 2 9 3号公報)、斯くして得られる 0；—グリコシルイソクエルシトリンは酵素処理イソクェルシトリンとして食品または香粧品、医薬部外品分野において広く麵されている。かかる α—グリコシルィソクエルシトリンは、ルチンからィソクエルシトリンの生成を経て、次いで、上記糖転移酵素処理といった一連の反応によって調製されるが、その反応収率を更に向上させ、また纖の効率化を図ることは、当 ¾が今なお検討し、改良していかなければならなレ纏である。かかる方法として、有灘媒混合物被下で觀する方法（特表 2 0 0 2 - 5 2 8 1 3 3号公報)、及びアルプミンやシルクタンパク等を用いて反応を促進する方法（Biocatalysis and Biotransformat ion, Vol. 14, pp. 113-123 (1996)) が提案されている。発明の開示

本発明は、酸化防細、退色防 Il^ijや香献化防細などとして有用な α—ダリコシルイソクエルシトリンを収率高く製造する方法を提供することを目的とする。また、本発明は当該ひ一グリコシルイソクエルシトリンの ®i中間体であるィソクエルシトリンの収率の高い ϊϋ方法、ィソクエルシトリンの生成に伴って副次的に生)^るラムノースの収率の高い iSt方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、上記廳を解決すべく兌纖討していたところ、ルチンをナリンギナーゼ処理する際に、特定の可食' [« ^をさせておくと、効率よく反応がみ、高い収率でィソクエルシトリン並びにラムノースが得られることを見いだした。前述するようにィソクエルシトリンは、ひ一グリコシルイソクエルシトリンの S¾i 中間体である。よって、本発明者らは、上記反応を利用することによって、 α—グリコシルイソク： Ρレシ卜リンをも効率よくすることが出来ることを確認、した。

I . 本発明は、力かる知見に基づいて開発されたものであり、下記 α—グリコシルイソクエルシトリンの製造中間体であるィソクエルシトリンの製法に関するものである：

項 1. ルチンを、ゼラチン、小麦ダルテン、キトサン、レシチン、グリセロールの月旨 J!雄エステレ、キサンタンガム、カラギナン、コンドロイチン硫酸ナトリウム、カゼイン、酵素ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、コンニヤクイモ抽出物、ジエランガム、グァ一ガム、大豆タンパク、寒天、ぺクチン、酵母エキス、卵白ぺプチド、クラスターデキストリン、アラビアガム、アルギニン、メタリン酸ナトリウム、カラャガム、口一カストビーンガム、ピロ墜ナトリウム、ダルコサミン、キチン、グルタミン酸ナトリウム、デキストリン、及びトレハロースより選択される少なくとも 1種の可食! 分の^下でナリンギン^^性を ¾ る酵素で処理

(以下、「ナリンギン酵素処理」ともいう）する工程、及び当讓理物からイソクェルシトリン画分を取得する工程を^ る、ィソクエルシトリンの s¾it ^法。項 2. グリセロールの脂藤エステルが、へキサグリセリンジステアリン酸エステル、テトラグリセリンモノォレイン酸エステル、テトラグリセリンモノステアリン酸エステル、デカグリセリンモノォレイン酸エステル、及びデカグリセリンステアリン酸エステルよりなる群からされる少なくとも 1種である項 1に記るィソクエルシトリンの纖方法。

項 3. ルチンを、クズ粉、片栗粉、及を原料とする食品素材から選択される少なくとも 1種の可食賊分の被下、ナリンギン^^舌性をる酵素で処理する工程、及び当謹理物からイソクェルシトリン画分を取得する工程を^ る、ィソクエリレシトリンの製 ii^法。

項 4. 藤を原料とする食品素材が、米、大麦、小麦、ライ麦、ライ小麦、ェンパク、とうもろこし、ひえ、粟、もろこし、キビ、 Λトムギ、豆類、及び養麦よりなる群から選択される讓を原料とする食品素材である項 3に記載するイソクエルシ卜リンの製法。

項 5. 纖を原料とする食品素材が、小麦タンパク質、小雄、小麦フスマ、及び小接よりなる群から選択される小麦を原料とする食品素材である、項 3に記 iするイソクエレシトリンの法。

II. また本発明は、水易溶性のフラポノイドとして有用な、一グリコシルイソクエルシトリンの $¾t方法に関する：

項 6. 上記項 1乃至 5のレ Τれかの S¾i方法で得られるィソクエルシトリンを糖転移酵素処理する工程を有する、下式（1 )：

(式中、 Glcはグルコース残基、 nは 1以上の置を示す）

で示される α—ダリコシルイソクエルシトリンの製^ ^法。

項 7. 上記式 ( 1 )で示される ηが 1〜 7の S :である、項 6に記 ¾Τる —グリコシルイソクエルシトリンの製造方法。

III. 前述するように、ルチンをナリンギン^?^素処理することによって、上記イソクェルシトリンとともにラムノースが生成される。よって、本発明は、イソクェルシトリンの i¾tに際して副生成されるラムノ一スの S¾ ^法に関する：項 8. ルチンを、ゼラチン、小麦ダルテン、キトサン、レシチン、グリセロールの脂讀エステル、キサンタンガム、カラギナン、コンドロイチン碰ナトリウム、カゼイン、酵素ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、コンニヤクイモ抽出物、ジエランガム、グァーガム、大豆タンパク、寒天、ぺクチン、酵母エキス、卵白ぺプチド、クラスターデキス卜リン、アラビアガム、アルギニン、メタリン酸ナトリウム、カラャガム、ローカストビーンガム、ピロ鍾ナトリウム、ダルコサミン、キチン、グルタミン酸ナトリウム、デキストリン、及びトレハロースを料とする食品素材よりなる群から選択される少なくとも 1種の可食 IW分の被下、ナリンギン分館刮生をする酵素で処理する工程、及び当,理物からラムノース画分を取得する工程を有する、ラムノースの S ^法。

項 9. グリセロールの脂フェステルが、へキサグリセリンジステアリン酸エステル、テトラグリセリンモノォレイン酸エステル、テトラグリセリンモノステアリン酸エステル、デカグリセリンモノォレイン酸エステル、及びデカグリセリンステアリン酸エステルよりなる群から選択される少なくとも 1種である項 8に記 ¾Tるラムノースの^ 法。

項 1 0. ルチンを、クズ、粉、片栗粉、及を IT料とする食品素ネ拍ゝら選択される少なくとも 1種の可食 S ^分の^下、ナリンギン分解活性を有する酵素で処理する工程、及び当 ¾理物からラムノース画分を取得する工程をる、ラムノースの法。

項 1 1. 藤を原料とする食品素材が、米、大麦、小麦、ライ麦、ライ小麦、ェンバク、とうもろこし、ひえ、粟、もろこし、キビ、ハトムギ、豆類、及び養麦よりなる群から選択されるを原料とする食品素材である項 1 0に記 tr るラムノ一スの纖方法。

項 1 2. を料とする食品素材が、小麦タンパク質、小謙、小麦フスマ、及び小 ¾JJ接よりなる群から選択される小麦を原料とする食品素材である、項 1 0 に記載するラムノースの製造方法。

IV. さらに本発明は、下言己の翻に関する：

項 1 3. 上言頭 1乃至 5のいずれかの方法によって得られるィソクエルシトリンを力成分とするィソクエルシトリン翻。

項 1 4. 上言頭 6または 7のレずれかの方法によって得られる α—グリコシルィソクエルシトリンをとする α—ダリコシルイソクエルシトリン纖 «。下式に示すように、本発明カ豫とする、イソクェルシトリン（b)、ラムノース (c ) 並びに α—グリコシルイソクエルシトリン (d) は、いずれもルチン（a) を出発原料とする "^の反応によって i¾i取得することができる、食品分野並びに香粧品分野等において広く用いられている有用化合物である。なお、下記式で示される記号：「Glc」はグルコース藤、「Rha」はラムノース歹錢、及び nは 1以上のを意味する。

ラムノース（Rha) ( c )

反応 2

この式を参照しながら、以下に本発明を詳細に説明する。発明をるための最良の形態

( I ) イソクェルシトリンの^ 法、及びイソクェルシトリン製剤

上記式の反応 1において、ルチン（a) にナリンギン備刮生を有する酵素（以下、「ナリンギン酵素」ともいう）を ^させると、ルチンからラムノース藤が脱離して、イソクエ^ Iレシトリン（b ) が生成する。本発明は、係る反応 1において、ナリンギン離泰処理を特定の可食|«分の下で行うことを難とするイソクエレシトリンの $¾i ^法である。ここでナリンギン舌性を^ Tる酵素（ナリンギン耱素）とは、呼称の別に拘わらず、；ンをィソクエルシトリンとラムノースに舊する活性を^ Τる酵素を全て包含するものである。かかる活性を有する酵素としては、代表的にはナリンギナーゼを挙げることができるが、ラムノシダーゼ（a- L-ラムノシダーゼ： EC.3. 2. 1.40), ヘスペリジナ一ゼ、及びべクチナーゼ等の中にも、上記ナリンギン舌性を^ Tるものが知られている。かかる酵素はいずれも商業的に入手できる酵素であり、例えば、ナリンギナ一ゼは、天野ェンザィム（株）（[日本]、例えば、商品名：ナリンギナ一ゼ "ァマノ"）や田 (株） [日本]などから入手することができる。

これらの酵素は、必、ずしも精製されている必要はなぐ本発明の目的が達成できる限り、粗精勸であってもよい。例えば、ナリンギナ一ゼは、ァスペルギルス ' ニガ一属ゃぺニシリウム属などに属する微生物（ナリンギナ一ゼ'生成菌）によって雜されることが知られている。このため、ルチンを加えた培地に、当該ナリンギナ一ゼ生成菌を植菌し、発酵法により反応を行ってィソクエルシトリンを生成してもよいし、またナリンギナ一ゼまたはナリンギナーゼ^ ffiを固定化して、これをバッチしく «^ ¾に、ルチンとさせてイソクェルシトリンを生成してもよい。

本発明で用いられる特定の可食性成分としては、ゼラチン、小麦ダルテン、キトサン、キサンタンガム、カラギナン、コンドロイチン硫酸ナトリウム、酵素適ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、コンニヤクイモ抽出物、ジエランガム、グァ一ガム、寒天、ぺクチン、クラスタ一デキストリン、アラビアガム、カラャガム、ローカストビーンガム、グルコサミン、キチン、及びデキストリンといった増粘剤；レシチン、及びグリセロールの脂薩エステル（例えば、へキサグリセリンジステアリン酸エステル、テ卜ラグリセリンモノステアリン酸エステル、テトラグリセリンモノォレイン酸エステル、及びデカグリセリンモノォレイン酸エステル、デカダリセリンステアリン酸エステルなど）といった乳ィカゼイン、大豆タンパク、及び卵白べプチドといつた動植物性タンパク；アルギニン、及びグルタミン酸ナトリゥムといったアミノ酸；メタリン酸ナトリウム、及びピロ賺ナトリウムといった

^m. (キレート斉 10；酵母エキス；トレハロース；クズ片栗粉等の植物性賺；並びにを原料とする各種食品素材を挙げることができる。これらの中で、好ましくはゼラチン、小麦ダルテン、キトサン、レシチン、グリセロールの脂膽エステル (例えば、へキサグリセリンジステアリン酸エステル、テトラグリセリンモノステアリン酸エステル、デカグリセリンステアリン酸エステルなど)、キサンタンガム、カラギナン、コンドロイチン硫酸ナトリウム、カゼイン、酵素ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、コンニヤクイモ抽出物、ジエランガム、グァーガム、短タンパク、寒天、及 D¾を原料とする各種食品素材である。より好ましくはゼラチン、グリセロールの脂舰エステル（例えば、へキサグリセリンジステアリン酸エステル、テトラグリセリンモノステアリン酸エステル、デカグリセリンステアリン酸エステルなど)、キサンタンガム、力ラギナン、コンドロイチン硫酸ナトリゥム、カゼイン、酵素ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、コンニヤクイモ抽出物、及 «類を料とする各種食品素材である。さらに好ましくはゼラチン、小麦ダルテン、キトサン、レシチン、デカグリセリンステアリン酸エステル、キサンタンガム、カラギナン、コンドロイチン硫酸ナトリウム、及を原料とする各種食品素材である。さらにより好ましくはゼラチン、小麦ダルテン、キトサン、レシチン、及を原料とする各種食品素材である。なお、上記グリセロールの脂薩エステルとしては、 111^ 8が8〜1 1であるものがより好ましい。

ここで本発明でいう囊とは、細に供される禾應（イネ報乍物）の鶴、シュク纖（マメ禾徘物）の觀、及ぴ麦の鶴を意味する。細に供される禾穀類（イネ禾 4(乍物）の種実としては、例えばコメ、小麦小麦、デュラム小麦)、大麦（裸麦を含む)、ライ麦、ライ小麦、ェンバク、とうもろこし、ひえ、あわ、もろこし、きび、及びはとむぎを挙げること力きる。細に供されるシュク鐘（マメ禾 ¥乍物）の驗としては、大豆、小豆、緑豆、ささげ、ひよこ豆、及びレンズ" S などの豆類を挙げること力 ?さる。

本発明では、可食性成分として、これらの,をそのまま用いることを排除するものではないが、通常は、慣用の食品加工処理がされて、 "^的な食品素材としての形態または «を有するものを用いること力きる。

かかるものとしては、米タンパク質、米ぬか、米藤、及び^ ¾粉等のコメを原料とする各種食品素ネオ；小麦粉（強力粉、準強力粉、中力粉、薄力粉)、小麦藤、小麦タンパク質（小麦ダルテン、小麦グルテニン、小麦グルテリン)、小 ¾E 芽（I兑脂 fl接を含む)、小麦ふすま及び立粉等の小麦を原料とする各種食品素材；大^^^ ¾粉等の大麦を原料とする各種食品素材；ライ粉等のライ麦を原料とする各種食品素材；ェンパク!^ ^¾粉等のェンパクを原料とする各種食品素材；とうもろこし粉、トウモロコ' «、コーングリッツ、コーンダルテン等のとうもろこしを原料とする各種食品素材；ひえを原料とする各種食品素材；あわを原料とする各種食品素材；もろこしを！ ^料とする各種食品素材；きびを原料とする各種食品素材：はとむぎを原料とする各種食品素材；粉、大豆タンパク質、大豆レシチン、大豆カゼィン等の大豆を原料とする各種食品素材；小豆を料とする各種食品素材;養 ¾¾Η^¾Ι^の養麦を原料とする各種食品素材が例示できる。なお、これらの食品素材は、本発明の効果を妨げないことを隨として、本発明において可食す械分として用いられる:！^に、さらに任意の加工処理 (粉砕、抽出、焙煎等）力猫されていても良い。かかる Sを 1 ^料とする各種品素材のうち、好ましくは、小麦タンパク質（小麦ダルテン、小麦グルテニン、小麦グルテリン）や短タンパク質等の植物性タンパク質；小鎌（強力粉、準強力粉、中力粉、薄力粉）であり、より好ましくは小麦タンパク質である。

なお、これらの可食^分は、 1種職で使用されても 2種以上を任意に組み合わせて^ fflすることもできる。

ナリンギン^ ^素の反応条件は、リン、ナリンギン ^^酵素及び上記可食性成分との混合水系で、ナリンギン^^素がナリンギン^^性を発揮する条件であればよい。ルチン ΙΜ^に対するナリンギン^？^素の棚量としては、例えば磨素 i ?舌性が勺 1 0 0単位定のナリンギン溶液 (pH3. 5) において、 30分間に lmgのラムノースに相当する ¾を生成するときの酵素量を 1単位とする）のナリンギン； ^^素の:^、 0. 0 1〜5重量部の範囲からして棚することができる。好ましくま、 0. 0 2〜3重 *g階度、より好ましくは 0. 0 5〜2重歸隨である。

可食 1¾¾分の使用量は、可食の種類によって異なり、規¾ ~ることはできないが、例えば、ルチン 1重に対し、 0. 0 0 1〜2 0重黥好ましくは 0. 0 0 2〜1 0重量部、より好ましくは 0. 0 0 5〜5重の範囲から ¾Μ択することができる。

なお、反応系中のルチンの量は、特に制限されないが、イソクェルシトリンを効率よく^ iする目的からば、反応系 1 0 0重量％中に、通常 0. 1〜2 0重量％、好ましくは 0.；!〜 1 5重量％、より好ましくは 0. 1〜1 0重量％の割合で存在させることが望ましい。

反応系のおよび P H条件は、棚するナリンギン^^素の種類により変動するが、例えば、天野工ンザィム株式^ ¾S¾ナリンギナーゼ 'アマ,またはこれに準じるナリンギン^!^袠をする^のは Ί 5 °C未満であることが望ましい。この? S範囲内において、工業的には約 4 0〜7 5 C、好ましくは約 6 0〜7 5 °Cの範囲を用いることカ^"利である。また p H条件〖¾1常 pH 8 以下、好ましくは pH 6〜4である。

反応は、静置また〖纖若しくは βしながら行うこと力きる。反応中の酸化を防止するために、反応系のへッドスペースの空気を窒素等の不活性ガスで置換してもよく、またァスコルビン酸等の酸化防 ih を系に添加することも可能である。

斯くして、ルチンからラムノース残基が脱離し、ラムノースとともに、目的のィソクエルシトリンが賊ざれる。

なお、所望に応じて、系からイソク工ルシトリンを職 '精製することもできる。例えば、反応系を 4 以下に 7^¾1することによって、 τ難溶性のイソクェルシトリンを析出沈殿させて ^i ることができる。ィソクエルシトリンの精法は、特に制限されず、慣用の方法を任意に組み合わせて実ることがきる。' 具体的には各種の樹脂処理法（吸着法、イオン¾法、ゲルろ過法など)、 »理法 ■Μ»理法、逆觀腿理法、イオン交理法、ゼ—タ電鍾など)、電析法、溶媒分画法およ性炭を例示することがきる。

斯くして得られるイソクェルシトリンは、それ自体、酸化防退色防細や香口変化防止剤等として食品や香粧品分野に用いられる他、碰する 0! _ダリコシルイソクエルシトリンの^ t原料（ルチンを出発!^料とする: fc は、 α—グリコシルイソクエルシトリンの i¾t中間体）として^ fflすること力きる。なお、ひ一グリコシルイソクエルシトリンの^ ϋ ^料また中間体として使用する：！^、ィソクエルシトリン《it製される鞭はなぐ粗精製物（例えば、上言 at殿物）であつてよいし、また上記の反応混合物の状態であってもよい。

なお、イソクェルシトリンそれ自体を酸化

等として用いる：^には、上記の単離若しく «II製したイソクェルシトリンに、さらに担体または添加剤等の成分を配合して、任意の纖 IJ化処理を行い、製剤として調製される。

ここで^ または担体としては、本発明の効果を妨げないものであれば特に制限されず、例えばシュクロ一ス、クレコース、果糖、マル! ^一ス、トレハロ一ス、学し糖、オリゴ糖、デキストリン、デキストラン、サイクロデキストリン、 «、 τΚ 飴、及び異性化 «などの糖類；エタノール、プロピレングリコール、及びグリセリン等のアルコール鎮；ソルビトール、マンニトール、エリスリトール、ラクチトール、キシリトール、マルチトール、パラチノース、及び灘^ 物等の糖アルコール類；トリァセチン等の溶剤；アラビアガム、カラギナン、キサンタンガム、グァ一ガム、ジエランガム、及びべクチン等の多糖類；また « jを挙げることがきる。また添加剤としては、キレート剤等の助剤、香料、 ¾¾¾出物、及び! ¾ などを挙げることができる。

棚上の利便等から、これらの希!^！!、担体または添加剤を用いて例えぱ酸化防細の液体繊！！を調製するは、イソクェルシトリンが、飄 IJ 1 0 0≤*%中に 0. 0 1〜 5 0 %、好ましくは 0. 1〜 3 0重量％の割合で含まれるように調製することが望ましい。

またかかる纖|』は、その形態を特に制限するものではなぐ例え^^末状、驟粒状、及び織！]状などの固体状；波状及し液濃の溜夜状；またはペースト體の半固体状などの、任意の形態に調製すること力きる。 (I I) α—グリコシルイソクエルシトリンの製法、及び α—グリコシルイソクエルシトリン S^ij

前述する式の反応 2において、上記の方法で得られたイソクェルシトリン（b) をグルコース難移酵素で処理することによって、イソクェルシトリン（b) のグルコシル魁に更に 1以上のダルコシル基が結合して、一グリコシルイソクエルシトリン（c ) が、生る。本発明は、係る反応 2において、前述する反応 1によつて生成されたイソクエルシトリン（b) を料として用いることを赚とする α ーグリコシルイソク：ルシトリンの ^it^法である。

反応 2の出発料として用いるイソクエルシトリン（b)は、 ( I )において前述する法で得られるものであればよぐその精製の禾驢は特に制限されるものではない。上記反応 1力 ^連続して行う齢には、反応 1の結; ¾ί辱られる混合物を、例えば 4 0°C以下に御することによって、析出 «したイソクェルシトリンを回収して、棚することができる。

イソクェルシトリン（b) から α—グリコシルイソクェルシトリン ( c ) を製造する方法は、特に制限されず、 «έ¾^Πの方法または将来開発される方法がいずれも使用できる。通常は、イソクェルシトリン（b) にダルコシダ一ゼまたはトランスダルコシダ一ゼ等のグルコース歹»¾移酵素を用いて、グルコース魁を等モル以上転移させて配糖化させる（以下、配糖化と呼ぶ）ことによって実施される。配糖化の際に用いられるグルコース源としては、そのダルコ一ス菌の 1奸以上がイソクェルシトリン（b) の 1分子に転移されうるものであればよぐ例えばグルコース、マルトース、アミロース、アミ口べクチン、でん粉、でん粉液化物、でん画匕物、デキストリン、及びシクロデキストリンなどを用いることがきる。グルコース源の翻量は、反応系にるイソクェルシトリン（b) 1重量部に対して、通常 1〜2 0重量部の割合、好ましくは 0. 5〜1 5重量部、より好ましくは 1〜 1 0重量咅 βの割合を挙げることができる。

ダルコシダ一ゼとしては、例えば α—アミラーゼ（Ε. 3. 2. 1. 1)、《—ダルコシダ一ゼ（Ε. 3. 2. 1. 20)、 /3—アミラーゼ (E. C. 3. 2. 1. 2) , ダルコアミラーゼ (E. C. 3. 2. 1. 3)等を用いることができ、またトランスダルコシダ一ゼとしては、例えばシクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ (Ε. C. 2. 4. 1. 19) (以下 C GT a s eと略記する）等を用いることができる。

C GT a s eは、パチルス 'サーキュランス、ノチルス'マセランス、パチルス · ステアロザーモフィルス、バチルス ·メガテリゥム、バチルス ·ポリミキサなどのバチルス属、クレブシーラ '二ュ一モニァェなどのクレブシーラ属などの細菌によつてされることが知られており、いずれもこの発明に自由にィ¾^することがきる。

これらのグルコース ^^移酵素はいずれも商業的に入手できる酵素であり、簡便にはかかる市販の酵素剤（例えば、天野ェンザィム（株）製、商品名：コンチザィム、日本）を使用することもできる。当該酵素は、必ずしも精製されている必要はなぐ本発明の目的が達成できる限り、粗精動であってもよい。例えば、イソク工ルシトリン（b) を加えた培地に、当該グルコース歹! ¾ ^移酵素生成菌を纖し、発赚により反応を行つて《—グリコシルイソクエルシトリンを生成してもよいし、またグルコース歹^ 移酵素またはグルコース ¾¾¾移酵素继菌を固定化して、これをパッチ雄しくは連誠に、イソクェルシトリン（b) と反応させてひーグリコシルィソク: リレシ卜リンを; ¾してもよい。

グルコース ¾¾¾移酵素の反応条件は、イソクェルシトリン（b)、グルコース残蔬移酵素及び上記グルコース源との混合水系で、グルコース ¾S¾移酵素が作用する条件であればよい。グルコース残基転移酵素の使用量はィソクエルシトリン (b) 1重量部に対し、グルコース ¾¾¾移酵素が C GT a s eの齢〔酵素 lt¾ '[も約 1 0 0単位 (溶性デンプンから β -シクロデキストリンを 1分間あたり 1 m g生成する酵素量を 1単位とする)〕 0 · 0 0 1〜 2 0重の範囲から iigil択して使用することが、できる。好ましくは、 0. 0 0 5〜1 0重量咅 l¾Jt、より好ましくは 0. 0 1〜5重量咅艘でぁる。

なお、反応系中のィゾクエルシトリン（b) の量は、特に制限されないが、配糖化を効率よく行う目的からは、系 1 0 0重量％中に、通常 0.：！〜 3 0重量％、好ましくは 0. 5〜2 0重量％、より好ましくは:！〜 1 0重量％の割合で含まれていることが望ましい。

この反応系のは、使用する酵素の種類により変動するが、約 8 0 以下の範囲を適 151択して用いることができる。この範囲内において工業的に有利なのは約 2 0〜8 0°C、好ましくは約 4 0〜7 5。Cである。また pH条件は通常 pH 3〜 1 1程度以下、好ましくま pH4〜8である。

反応は、静置また《¾拌若しくはしながら行うことができる。反応中の酸化を防止するために、反系のへッドスペースを窒素等の不活性ガスで置換してもよく、またァスコルピン酸等の酸化防止剤を反応系に添力 ΠΤることも可能である。なお、グルコース移酵素は、ダルコシダ一ゼまたはトランスダルコシダ一ゼの各々単独を用いて行うこともできるし、また両者を組み合わせて（同時または違镜して）使用することもできる。

斯くして、イソクェルシトリンのグルコース魁にグルコース基が結合し、目的の α—ダリコシルイソクエルシトリンが生成される。

なお、イソクエルシトリンのグルコース残基へのグルコース基の結合数（上記式 ( 1 ) において ηの数）は、特に制限されないが、通常 1〜3 0、好ましくは：！〜 1 2、さらに好ましくは 1〜7である。かかるグルコース基の!^数（η数）は、任意に調ることができる。例えば、 α—グリコシルイソクエルシトリン生厳に、各種のアミラーゼ（α—アミラーゼ、）3—アミラーゼ、ダルコアミラーゼ、 K- ダルコシダーゼ、及びマルターゼ等）を戦虫もしくは複猶且み合わせて処理することにより、 2 (式（1 )) によって生じた at—グリコシルイソク工ルシトリン分子中のグルコース誦数を減少させて、任意のグルコース糖鎖長を持つ Q!—ダリコシリレイソクエレシ卜リンを得ることもできる。

所望に応じて、 2 (式 ( 1 ))の反応系または上記アミラーゼ処理の反応系から α—ダリコシルイソクエレシトリンを単離 ·精製することもできる。かかる方法として、例えば、反応系を酸性に調整して御することによって、 —グリコシルイソクエレシトリンを析出 «させてする方法を挙げることができる。 α—グリコシルイソクエルシトリンの精法は、特に制限されず、慣用の方法を任意に組み合わせてること力きる。具体的には各種の樹脂処理法着法、ィォン交換法、ゲルろ過法など)、醒理法（P 濾 i J»理法、逆理法、ィォン交理法、ゼ一夕電法など)、電^！祈法、塩析、酸析、再結晶、溶媒分画法およ rm'tt^as¾ を例示すること力さる。ルセチン 3— 0—モノダルコサイド）のグルコース残基に更にグルコースが等モル以上量結合したフラポノール配糖体であって水易溶性のものである。このため、イソクェルシトリンが^ Tる優れた機能（例えば、抗酸化作用、退色防止作用、香ィ匕防止作用）等を、 τ系の溶媒中で機に発揮させること力きる。よって水溶性の酸化防止剤、退色防や香変化防止剤等として食品や香被品分野にに使用することができる。

a—グリコシルイソクェルシトリンは、酸化防 ih¾j、聽防 ih¾や香変化防止剤等として用いられるには、上記の単離若しく製したひ _グリコシルイソクエレシトリンに、さらに !]、担体または添加剤等の成分を配合して、任意の製剤 ί匕処理を行い、として調製される。

ここでほたは担体としては、本発明の効果を妨げないものであれば特に制限されず、例えばシュクロース、グルコース、；¾、マルトース、トレ八ロース、 ¾Jき、オリゴ糖、デキストリン、デキストラン、サイクロデキストリン、 «、水飴、及び異性化赚などの糖類；エタノール、プロピレングリコール、グリセリン等のアルコール類；ゾルビトール、マンニトール、エリスリトール、ラクチトール、キシリトール、マルデトール、 ¾パラチノース、及び物等の糖アルコール類；トリァセチン等の溶剤；アラビアガム、カラギナン、キサンタンガム、グァーガム、ジエランガム、及びべクチン等の多糖類；または水を挙げること力？きる。また添加剤としては、キレート剤等の助剤、香料、香 ffltt出物、及び腐剤などを挙げること^¹できる。

使用上の利便等から、これらの ¾WJ、担体または添加剤を用いて上言 BS Jを調製する場合は、《—グリコシルイソクエルシトリンが講 J 1 0 0重量％中に、 0. 0 1〜： I 0 0重量％、好ましくは:!〜 1 0 0重量％の割合で含まれるように調製することが望ましい。

またかかる織 ijは、その形態を特に制限するものではなぐ例え^^末状、顆粒状、及び猫 I欺などの固体状；波状、及し液の溜概；またはペーストの半固体状などの、任意の形態に調製すること力きる。

(III) ラムノースの靠驢方法、及びラムノース

前述する反応 1において、ルチン（a) にナリンギン ί ^性を ¾ る酵素を反応させることによって、ルチンからイソクエルシトリン（b) とともにラムノースが生^ Tる。ゆえに、本発明は、係るにおいて、ナリンギン^ W素処理を特定の可食性 β¾の ϊ¾下で行うことを特徴とするラムノースの法を提 ί共するものでもある。当該ラムノースの i¾iは、ルチン（a) を原料として、 ( I )で前述する反応 1の方法に従ってることがきる。ナリンギン^ W素処理によって、ラムノ一スを含む反応混合物（イソクェルシトリン、ラムノース、及び未反応ルチン）が得られるが、必要に応じてその混合物の中からラムノースを単離 ·精製することもでさる。

例えば、反編合物を 4 0 °C以下に御させることによって、 τΚ難溶性のイソクエルシトリンを析出させ、それを遠心分離またはろ過などの慣用の固 ί紛離により^ ¾し、得られた液相からラムノースを回収することができる。

回収したラムノースはさらに精»理に供することもできる。ラムノースの精製方法は、特に制限されず、慣用の方法を任意に組み合わせてることがきる。具体的には各種の樹脂処理法（吸着法、イオン交衡去、ゲルろ過法など)、腿理法理法、逆理法、イオン理法、ゼ—タ電麵去など)、電^ (f法、溶媒分画法およ 0¾¾^1理¾ ^を例示することがきる。

斯くして得られるラムノースは、例え源、甘、食品 m&n物、医薬品添加物として食品分野、医薬品、医薬部外品分野、及 ¾ 粧品分野で利用される。また、例えばフラネオ一ル等の香料難の願として、さらに医薬品、化粧品、 m 化質 ssgの原料として好適に麵することがきる。

本発明によれば、する験例で示すように、ルチンから、 α—グリコシルイソクエルシトリンの ¾ ^中間体であるィソクエルシ卜リンを高い収率で製造することができる。よって、本発明は、イソクェルシトリンの効率よい法として有用であるだけでなく、 Q!—グリコシルイソクエリレシトリンの効率よい製法として有用である。また、ルチンからイソクェルシトリンが生成されるに伴い、ラムノースが生成される。よって、別の観点から、ラムノースの SSi方法に係る本発明は、ルチンから、糖源であるラムノ一スを高い収率で $¾tできる方法として有用である。

実施例

以下、実験例及び実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例等に！ ^されるものではない。実験例 1

? } 9 omLに、ルチン 5 gを分散し、これに表 1に記 * rる各種の可食性

(食品働口物素材）を 0. 0 5重量％又は 0. 5重量％の割合で添加して、溶艦しくは分散させた。次いで加温して '離を 7 2°Cに調整した。これを ρΗΡ^ (硫酸、水酸化 Na) を用いて pH4. 7に調るとともに、 τΚで^ *が 1 0 0 mLとなるように調整した。これに、ナリンギナ一ゼ（天野ェ？ィム（株）製、商品名：ナリンギナ一ゼ'ァマノ）の水赚 (ナリンギナーゼ [比活性： 3000U/g] 0.02gを 10ml の水に溶解して調^) lmLを添カロし、反応を開始した。 5時間後、反]» ら 4 ΐサンプリングして、 1 Ν水酸化ナトリゥム水賺を 5 0 L添加して溶解し、さらに 1 5容量％ァセトニトリルと 0. 0 8 5 wZv%リン酸の混合激夜を添加し (総量 2mL)、反応を停止した。得られた反雄を、下記の条件の HP L Cに供して、ルチンとィソク工ルシトリンのピーク面口に fするィソクェレシトリンのピーク面積比からィソクエルシトリンの生成量を算出し、ィソクエルシトリンの生成収率

(%) を求めた。なお、対照試験として、上記可食を配合しない系（コントロール）で同様に反応させて、同様にイソクェルシトリンの生舰率 (%) を求めた。

<HP L C条件〉

カラム： OD Sカラム（東ソ一、 Super 0DS φ4. 6 X 100藤、日本）

移動ネ目： 1 5容量％ァセトニトリレと 0. 0 8 5wZv %リン酸の混合謹髓： 0. 8mL/m i n

検出： UV 3 5 O nm

カラム： 4 O

結果を表 1に併せて示す。く表 1>

その結果、上記可食性成分の下でルチンをナリンギナーゼ'処理することによつてイソクエルシトリンの生成量（生成収率）が増大することがわかった。

実験例 2

可食 I'械分として、表 2に記 ¾τる食品素材を用いるは、実験例 1と同様に試験を行い、 HPL C分析によりイソクェルシトリンの生成量を算出し、その生成収率 ( ) を求めた。結果を表 2に併せて示す。

く表 2 >

その結果、上記可食性 ί ^の存在下でルチンをナリンギン分素処理することによってイソクエレシトリンの生成量（生^ R率）が増大することがわかった。実施例 1

水 1 0 0 L (¾ 5 5 °C) にルチン 5 k gを爐し、これにナリンギナーゼ（天野ェンザィム株式会社、商品名ナリンギナーゼ'ァマノ"、日本） 1 0 g及び上記表 1及び 2に記る可食性成分 (食品添加物素材、食品素材）をそれぞれ添加した。なお、各可食性成分の配合害 (I合は、調製した混合物中における濃度が表 1または 2 に記載する鍵（0.5 S*%または 0.05重量％) となるように設定した。この系の pHは 4. 7であった。これを 2 4時間 7 2 °Cにィ親したのち、この反 j¾夜を 3 0。C に冷却した。 Mlして ®したを濾別し、固形分を水洗した後、しイソクエルシ卜リンを回収した。

実施例 2 上記実施例 1で取得したィソクエルシトリン 2 k gに、 100 Lの水を加え、コーンスターチ 8 kgを添加し、均質にした。これに CGTas e (天野ェンザィム株式会社、商品名コンチザィム、日本） 200mlを添加し、 i 60。C、 pH7. 25にて 26時間保持した。得られた反夜を吸着樹脂カラム（三 ¾ (匕成（株）製ダイヤイオン HP— 21、日本）に通して α—グリコシルイソクェルシトリンを吸着させ水洗した後、当該カラムに 50容量％メタノール水赚を通液して脱着させた。脱着液を濃縮後、して固形物を得た。

得られた固形 i勿を、高速液体クロマトグラフィー（HPLC、日本^ ¾株式会社製、カラム ODS、溶離夜 25容量％THFZ0. 01%リン M/JO にかけて、各ピ一ク画分（各構成）を分取し、次いで、得られた各成分を、質散析装置 (M S、株式会社日翅作所製、型式 M—80B、日本）を使用して分析した。その結果、上記固形物は、未 S ^のイソクエルシトリン 24モル％と、下式で示す α—グリコシルイソクエルシトリンの混合物からなることがわかつた。

(式中、 Glcはグルコース藤、 nは 1以上の撒を示す。 n=lの化合物： 23 モル％、 n=2の化合物： 17モル％、 n=3の化合物： 12モル％、 n = 4のィ匕合物： 9モル％、 n=5の化合物： 7モル％、 n=6の化合物： 4モル％、 n=7 の化合物： 2モル％、 n= 8以上の化合物： 2モル％)。

難例 3

実施例 1において得られた、ルチン、ナリンギナ一ゼ及ぴ食性成分との反夜からイソクェルシトリンを濾別した残りの慮夜を用い、これを吸着樹脂カラム（三謝匕成（株）製ダイヤイオン HP— 21、日本）に通した。次に、分画 ^ΐ»公称 1万のろ «にてろ過し、得られた分画 ^^¾公称 1万以下の画分を、さらにカチオン、ァニオン Ε¾イオン交漏脂（オルガノ株式懷）に通液し、得られた溶出液を？膽乞固することによって、ラムノースを採取した。実施例 4

上記例 1で取得したイソクェルシトリンを用いて、下記処方からなるイソクエルシトリン翻（液体）を調製した：

プロピレングリコール 9 7 (重量％)

3

総量 1 0 0 重量％

実施例 5

上記難例 2で取得した α—ダリコシルイソクエルシトリンの混合物（固形物）を用いて、下記処方からなる酵素処理イソクェルシトリン纖!！（液体）を調製した：プロピレングリコール 9 0 (重量％)

a一ダリコシルィソクエルシトリンの混合物 1 0

総量 1 0 0 重量％産業上の利用可能性

請求項 1乃至 5にかかる本発明の方法によれば、ルチンから、 ο;—グリコシルイソクエルシ卜リンの製造中間体であるィソクエルシ卜リンを高い収率で製造することができる。よって、当淋発明は、イソクェルシトリンの効率よい am^法として有用であるだけでなく、 0!—グリコシリレイソクエルシトリンの効率よい製^^法として有用である。また、請求項 6及び 7にかかる本発明の方法は、《—グリコシルイソクエリレシトリンの効率よい S¾t^法として有用である。

さらに、請求項 1乃至 5にかかる本発明の方法において、ルチンからイソクェルシトリンが生成されるに伴って、ラムノースが劚次的に生成される。よって、別の観点から、本発明はラムノースの法を提供するものである (請求項 8〜 1 2 )。当該本発明は、ルチンから、糖源であるラムノースを高い収率で SSitできる方法として有用である。

また、請求項 1 3および 1 4に記るイソクエルシトリン鳐 IJ及びひ一グリコシルイソクエルシトリン觀 IJは、食品分里?^香粧品分野などにおいて、酸化防 _Μ、退色防 ih 、及 0¾»ί匕防 it ^などとして有用である。

Claims

1. ルチンを、ゼラチン、小麦ダルテン、キトサン、レシチン、グリセロールの脂薩エステル、キサンタンガム、カラギナン、コンドロイチン硫酸ナトリウム、カゼイン、酵素ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、コンニヤクイモ抽出物、ジエランガム、グァ一ガム、大豆タンパク、寒天、ぺクチン、酵母エキス、卵白ぺプチド、クラスターデキストリン、アラビアガム、アルギニン、メタリン酸ナトリウム、カラャガム、口一カストビーンガム、ピロ燐酸ナトリウム、ダルコサミン、キチン、グルタミン酸ナトリウム、デキストリン、及びトレハロースより選択される少なくとも 1種の可食分の^ Ϊ下でナリンギン ^^舌性を；る酵素で処理する工程、及び当魏理物からイソクェルシトリン画分を取得する工程をる、ィソクエレシトリンの製法。

2. グリセロールの脂 fi雄エステルが、へキサダリセリンジステアリン酸エステル、テトラグリセリンモノォレイン酸エステル、テトラグリセリンモノステアリン酸エステ^/、デカグリセリンモノォレイン酸エステル、及びデカグリセリンステァリン酸エステノレより選択される少なくとも 1種である請求項 1に記るイソクエルシトリンの^ ^法。

3. ルチンを、クズ粉、片栗粉、及 D ^を原料とする食品素材から選択される少なくとも 1種の可食 |械分の下でナリンギン^ m性をる酵素で処理する工程、及び当該処理物からイソクエルシトリン画分を取得する工程をる、ィソクエリレシトリンの製造方法。

4. 纖を IT料とする食品素材が、米、大麦、小麦、ライ麦、ライ小麦、ェンノク、とうもろこし、ひえ、粟、もろこし、キビ、ハトムギ、豆類、及び養麦から選択される Sを原料とする食品素材である請求項 3に記載するィソクエルシトリンの^ 法。

5. 議を原料とする食品素材が、小麦タンパク質、小麵、小麦フスマ、及び小劃錢から選択される小麦を原料とする食品素材である、請求項 3に記 ¾fるイソクエレシトリンの^ 法。

6. 請求項 1乃至 5のレずれかの法で得られるィソクエルシトリンを糖転移酵素処理する工程を ¾ る、下式（1 )

(式中、 Glcはグルコース藤、 nは 1以上の纖を示す）

で示されるひーグリコシルイソクエルシトリンの i ^法。

7. 上記 α—グリコシルイソクェルシトリンが、上記式 ( 1 ) において ηが 1 〜 7の皿であるものである、請求項 6に記載する α—グリコシルイソク: ^レシトリンの^ 法。

8. ルチンを、ゼラチン、小麦ダルテン、キトサン、レシチン、グリセロールの脂薩エステル、キサンタンガム、カラギナン、コンドロイチン碰ナトリウム、カゼイン、酵素舊ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、コンニヤクイモ抽出物、ジエランガム、グァーガム、大豆タンパク、鼓、ぺクチン、酵母エキス、卵白ぺプチド、クラスタ一デキストリン、アラビアガム、アルギニン、メタリン酸ナトリウム、カラャガム、ローカストビーンガム、ピロ賺ナトリウム、ダルコサミン、キチン、グルタミン酸ナトリウム、デキストリン、及びトレ八ロースから選択される少なくとも 1種の可食分の下でナリンギン，舌性を^ Tる酵素で処理する工程、及び当謹理物からラムノース画分を取得する工程を^ Tる、ラムノースの SSi^法。

9. グリセロールの脂肪酸エステルが、へキサグリセリンジステアリン酸エステル、テトラグリセリンモノォレイン酸エステル、テ卜ラグリセリンモノステアリン酸エステル、デカグリセリンモノォレイン酸エステル、及ぴデ力グリセリンステァリン酸エステルより選択される少なくとも 1種である、請求項 8に記 »るラムノースの s¾e方法。

1 0. ルチンを、クズ粉、片栗粉、及 t¾を原料とする食品素材から選択される少なくとも 1種の可食性成分の存在下でナリンギン分解活性を Wする酵素で処理する工程、及び当該処理物からラムノース画分を取得する工程をる、ラムノ —スの iSi方法。

1 1. 藤を原料とする食品素材が、米、大麦、小麦、ライ麦、ライ小麦、ェンパク、とうもろこし、ひえ、粟、もろこし、キビ、ノ、トムギ、豆類、及び養麦から選択される穀類を料とする食品素材である請求項 1 0に記 g るラムノースの製去。

1 2. 穀類を原料とする食品素材が、小麦タンパク質、小鎌、小麦フスマ、及び小劑碟から選択される小麦を原料とする食品素材である、請求項 1 0に記 grr るラムノースの製法。

1 3. 請求項 1乃至 5のいずれかの方法によって得られるィソクエルシトリンを ¾成分とするィソクエリレシトリン »J。

1 4. 請求項 6または 7のいずれかの方法によって得られる α—グリコシルイソクエルシトリンを^)成分とするーグリコシルイソクエルシトリン賺 lj。