JPWO2018190378A1 - ステビア由来ラムノース合成酵素及び遺伝子 - Google Patents
ステビア由来ラムノース合成酵素及び遺伝子 Download PDFInfo
- Publication number
- JPWO2018190378A1 JPWO2018190378A1 JP2019512555A JP2019512555A JPWO2018190378A1 JP WO2018190378 A1 JPWO2018190378 A1 JP WO2018190378A1 JP 2019512555 A JP2019512555 A JP 2019512555A JP 2019512555 A JP2019512555 A JP 2019512555A JP WO2018190378 A1 JPWO2018190378 A1 JP WO2018190378A1
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- rhamnose
- seq
- amino acid
- glucose
- acid sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 141
- SHZGCJCMOBCMKK-JFNONXLTSA-N L-rhamnopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-JFNONXLTSA-N 0.000 title claims abstract description 137
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 103
- PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N L-rhamnose Natural products CC(O)C(O)C(O)C(O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 103
- HELXLJCILKEWJH-NCGAPWICSA-N rebaudioside A Chemical compound O([C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]([C@@H]1O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)O[C@]12C(=C)C[C@@]3(C1)CC[C@@H]1[C@@](C)(CCC[C@]1([C@@H]3CC2)C)C(=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O HELXLJCILKEWJH-NCGAPWICSA-N 0.000 title abstract description 35
- 241000544066 Stevia Species 0.000 title abstract description 31
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 96
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims abstract description 88
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims abstract description 88
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 85
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims abstract description 85
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims abstract description 85
- 235000019202 steviosides Nutrition 0.000 claims abstract description 68
- 150000008144 steviol glycosides Chemical class 0.000 claims abstract description 67
- 239000004383 Steviol glycoside Substances 0.000 claims abstract description 66
- 235000019411 steviol glycoside Nutrition 0.000 claims abstract description 66
- 229930182488 steviol glycoside Natural products 0.000 claims abstract description 66
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 56
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 25
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 77
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 65
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 34
- 235000013305 food Nutrition 0.000 claims description 34
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 25
- HSCJRCZFDFQWRP-JZMIEXBBSA-N UDP-alpha-D-glucose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](N2C(NC(=O)C=C2)=O)O1 HSCJRCZFDFQWRP-JZMIEXBBSA-N 0.000 claims description 22
- HSCJRCZFDFQWRP-UHFFFAOYSA-N Uridindiphosphoglukose Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC1C(O)C(O)C(N2C(NC(=O)C=C2)=O)O1 HSCJRCZFDFQWRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 22
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 22
- QFVOYBUQQBFCRH-UHFFFAOYSA-N Steviol Natural products C1CC2(C3)CC(=C)C3(O)CCC2C2(C)C1C(C)(C(O)=O)CCC2 QFVOYBUQQBFCRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 19
- 229940032084 steviol Drugs 0.000 claims description 19
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 19
- QFVOYBUQQBFCRH-VQSWZGCSSA-N steviol Chemical compound C([C@@]1(O)C(=C)C[C@@]2(C1)CC1)C[C@H]2[C@@]2(C)[C@H]1[C@](C)(C(O)=O)CCC2 QFVOYBUQQBFCRH-VQSWZGCSSA-N 0.000 claims description 17
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 15
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 claims description 13
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 claims description 13
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 12
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 10
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 8
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 8
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 8
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 8
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 8
- 125000002791 glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 claims description 7
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical group 0.000 claims description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 2
- 235000013361 beverage Nutrition 0.000 claims description 2
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 31
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 claims 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 69
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 57
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 31
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 30
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 30
- QSRAJVGDWKFOGU-WBXIDTKBSA-N rebaudioside c Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@]1(CC[C@H]2[C@@]3(C)[C@@H]([C@](CCC3)(C)C(=O)O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)CC3)C(=C)C[C@]23C1 QSRAJVGDWKFOGU-WBXIDTKBSA-N 0.000 description 28
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 26
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 25
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 23
- DRDCJEIZVLVWNC-SLBWPEPYSA-N UDP-beta-L-rhamnose Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](C)O[C@@H]1OP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](N2C(NC(=O)C=C2)=O)O1 DRDCJEIZVLVWNC-SLBWPEPYSA-N 0.000 description 22
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 19
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 19
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 15
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 15
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 15
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 14
- 239000001776 FEMA 4720 Substances 0.000 description 14
- 101100101356 Stevia rebaudiana UGT91D2 gene Proteins 0.000 description 14
- 229930182470 glycoside Natural products 0.000 description 14
- 235000009508 confectionery Nutrition 0.000 description 13
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 13
- 239000000047 product Substances 0.000 description 13
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 12
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 12
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 11
- 244000228451 Stevia rebaudiana Species 0.000 description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 10
- 150000002338 glycosides Chemical class 0.000 description 10
- QSIDJGUAAUSPMG-CULFPKEHSA-N steviolmonoside Chemical compound O([C@]12C(=C)C[C@@]3(C1)CC[C@@H]1[C@@](C)(CCC[C@]1([C@@H]3CC2)C)C(O)=O)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O QSIDJGUAAUSPMG-CULFPKEHSA-N 0.000 description 10
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 8
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 101100427140 Stevia rebaudiana UGT74G1 gene Proteins 0.000 description 8
- 101100262416 Stevia rebaudiana UGT76G1 gene Proteins 0.000 description 8
- 101100048059 Stevia rebaudiana UGT85C2 gene Proteins 0.000 description 8
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 8
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 1H-imidazole Chemical compound C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 7
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 7
- -1 steviol trisaccharide glycoside Chemical class 0.000 description 7
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 7
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 7
- 101000707716 Arabidopsis thaliana UDP-4-keto-6-deoxy-D-glucose 3,5-epimerase/UDP-4-keto-L-rhamnose 4-keto-reductase Proteins 0.000 description 6
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 6
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 6
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 6
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 6
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 6
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 6
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 6
- 229930188195 rebaudioside Natural products 0.000 description 6
- OMHUCGDTACNQEX-OSHKXICASA-N steviolbioside Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@]12C(=C)C[C@@]3(C1)CC[C@@H]1[C@@](C)(CCC[C@]1([C@@H]3CC2)C)C(O)=O)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O OMHUCGDTACNQEX-OSHKXICASA-N 0.000 description 6
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 5
- 241000954177 Bangana ariza Species 0.000 description 5
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 5
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 5
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 5
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 230000036541 health Effects 0.000 description 5
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 5
- 235000015067 sauces Nutrition 0.000 description 5
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 4
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 4
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- 108091060211 Expressed sequence tag Proteins 0.000 description 4
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 4
- 229960003136 leucine Drugs 0.000 description 4
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 4
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 235000021419 vinegar Nutrition 0.000 description 4
- 239000000052 vinegar Substances 0.000 description 4
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 3
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- 239000004395 L-leucine Substances 0.000 description 3
- 235000019454 L-leucine Nutrition 0.000 description 3
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 3
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- YWPVROCHNBYFTP-UHFFFAOYSA-N Rubusoside Natural products C1CC2C3(C)CCCC(C)(C(=O)OC4C(C(O)C(O)C(CO)O4)O)C3CCC2(C2)CC(=C)C21OC1OC(CO)C(O)C(O)C1O YWPVROCHNBYFTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 3
- 229960005261 aspartic acid Drugs 0.000 description 3
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 3
- 235000015872 dietary supplement Nutrition 0.000 description 3
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 3
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 3
- 229960002989 glutamic acid Drugs 0.000 description 3
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 3
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 3
- 235000013402 health food Nutrition 0.000 description 3
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 3
- XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M lithium acetate Chemical compound [Li+].CC([O-])=O XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 229960003646 lysine Drugs 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 3
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 235000012149 noodles Nutrition 0.000 description 3
- 235000021110 pickles Nutrition 0.000 description 3
- QRGRAFPOLJOGRV-UHFFFAOYSA-N rebaudioside F Natural products CC12CCCC(C)(C1CCC34CC(=C)C(CCC23)(C4)OC5OC(CO)C(O)C(OC6OCC(O)C(O)C6O)C5OC7OC(CO)C(O)C(O)C7O)C(=O)OC8OC(CO)C(O)C(O)C8O QRGRAFPOLJOGRV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HYLAUKAHEAUVFE-AVBZULRRSA-N rebaudioside f Chemical compound O([C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]([C@@H]1O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)CO1)O)O[C@]12C(=C)C[C@@]3(C1)CC[C@@H]1[C@@](C)(CCC[C@]1([C@@H]3CC2)C)C(=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O HYLAUKAHEAUVFE-AVBZULRRSA-N 0.000 description 3
- YWPVROCHNBYFTP-OSHKXICASA-N rubusoside Chemical compound O([C@]12C(=C)C[C@@]3(C1)CC[C@@H]1[C@@](C)(CCC[C@]1([C@@H]3CC2)C)C(=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O YWPVROCHNBYFTP-OSHKXICASA-N 0.000 description 3
- 229960001153 serine Drugs 0.000 description 3
- 235000013555 soy sauce Nutrition 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 229960002898 threonine Drugs 0.000 description 3
- 229960004441 tyrosine Drugs 0.000 description 3
- 229960004295 valine Drugs 0.000 description 3
- 101150084750 1 gene Proteins 0.000 description 2
- OGNSCSPNOLGXSM-UHFFFAOYSA-N 2,4-diaminobutyric acid Chemical compound NCCC(N)C(O)=O OGNSCSPNOLGXSM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QDGAVODICPCDMU-UHFFFAOYSA-N 2-amino-3-[3-[bis(2-chloroethyl)amino]phenyl]propanoic acid Chemical compound OC(=O)C(N)CC1=CC=CC(N(CCCl)CCCl)=C1 QDGAVODICPCDMU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KWTQSFXGGICVPE-UHFFFAOYSA-N 2-amino-5-(diaminomethylideneamino)pentanoic acid;hydron;chloride Chemical compound Cl.OC(=O)C(N)CCCN=C(N)N KWTQSFXGGICVPE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OYIFNHCXNCRBQI-UHFFFAOYSA-N 2-aminoadipic acid Chemical compound OC(=O)C(N)CCCC(O)=O OYIFNHCXNCRBQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PECYZEOJVXMISF-UHFFFAOYSA-N 3-aminoalanine Chemical compound [NH3+]CC(N)C([O-])=O PECYZEOJVXMISF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MKPCNMXYTMQZBE-UHFFFAOYSA-N 7h-purin-6-amine;sulfuric acid;dihydrate Chemical group O.O.OS(O)(=O)=O.NC1=NC=NC2=C1NC=N2.NC1=NC=NC2=C1NC=N2 MKPCNMXYTMQZBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WBZFUFAFFUEMEI-UHFFFAOYSA-M Acesulfame k Chemical compound [K+].CC1=CC(=O)[N-]S(=O)(=O)O1 WBZFUFAFFUEMEI-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 description 2
- 108010011485 Aspartame Proteins 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N D-OH-Asp Natural products OC(=O)C(N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 2
- 239000001512 FEMA 4601 Substances 0.000 description 2
- 108010031186 Glycoside Hydrolases Proteins 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N L-Aspartic acid Natural products OC(=O)[C@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 244000294411 Mirabilis expansa Species 0.000 description 2
- 235000015429 Mirabilis expansa Nutrition 0.000 description 2
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 2
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 2
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 238000011530 RNeasy Mini Kit Methods 0.000 description 2
- HELXLJCILKEWJH-SEAGSNCFSA-N Rebaudioside A Natural products O=C(O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)[C@@]1(C)[C@@H]2[C@](C)([C@H]3[C@@]4(CC(=C)[C@@](O[C@H]5[C@H](O[C@H]6[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O6)[C@@H](O[C@H]6[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O6)[C@H](O)[C@@H](CO)O5)(C4)CC3)CC2)CCC1 HELXLJCILKEWJH-SEAGSNCFSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 2
- UEDUENGHJMELGK-HYDKPPNVSA-N Stevioside Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@]12C(=C)C[C@@]3(C1)CC[C@@H]1[C@@](C)(CCC[C@]1([C@@H]3CC2)C)C(=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O UEDUENGHJMELGK-HYDKPPNVSA-N 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000010358 acesulfame potassium Nutrition 0.000 description 2
- 229960004998 acesulfame potassium Drugs 0.000 description 2
- 239000000619 acesulfame-K Substances 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- QWCKQJZIFLGMSD-UHFFFAOYSA-N alpha-aminobutyric acid Chemical compound CCC(N)C(O)=O QWCKQJZIFLGMSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 2
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000605 aspartame Substances 0.000 description 2
- IAOZJIPTCAWIRG-QWRGUYRKSA-N aspartame Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)OC)CC1=CC=CC=C1 IAOZJIPTCAWIRG-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 2
- 235000010357 aspartame Nutrition 0.000 description 2
- 229960003438 aspartame Drugs 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 150000004141 diterpene derivatives Chemical class 0.000 description 2
- PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N dl-hydroxyproline Natural products OC1C[NH2+]C(C([O-])=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- NIKHGUQULKYIGE-SHAPNJEPSA-N ent-kaur-16-en-19-oic acid Chemical compound C([C@H]1C[C@]2(CC1=C)CC1)C[C@H]2[C@@]2(C)[C@H]1[C@](C)(C(O)=O)CCC2 NIKHGUQULKYIGE-SHAPNJEPSA-N 0.000 description 2
- KWVKUAKMOIEELN-UHFFFAOYSA-N ent-kaur-16-en-19-oic acid Natural products CC1(C)CCCC2(C)C1CCC34CC(=C(C3)C(=O)O)CCC24 KWVKUAKMOIEELN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010026539 ent-kaurenoic acid 13-hydroxylase Proteins 0.000 description 2
- HELXLJCILKEWJH-UHFFFAOYSA-N entered according to Sigma 01432 Natural products C1CC2C3(C)CCCC(C)(C(=O)OC4C(C(O)C(O)C(CO)O4)O)C3CCC2(C2)CC(=C)C21OC(C1OC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)OC(CO)C(O)C1OC1OC(CO)C(O)C(O)C1O HELXLJCILKEWJH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N geneticin Chemical compound O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N 0.000 description 2
- 235000015243 ice cream Nutrition 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- JEIPFZHSYJVQDO-UHFFFAOYSA-N iron(III) oxide Inorganic materials O=[Fe]O[Fe]=O JEIPFZHSYJVQDO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YOBAEOGBNPPUQV-UHFFFAOYSA-N iron;trihydrate Chemical compound O.O.O.[Fe].[Fe] YOBAEOGBNPPUQV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NIKHGUQULKYIGE-UHFFFAOYSA-N kaurenoic acid Natural products C1CC2(CC3=C)CC3CCC2C2(C)C1C(C)(C(O)=O)CCC2 NIKHGUQULKYIGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 235000013536 miso Nutrition 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 2
- 239000006072 paste Substances 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 2
- 235000019203 rebaudioside A Nutrition 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 229940013618 stevioside Drugs 0.000 description 2
- OHHNJQXIOPOJSC-UHFFFAOYSA-N stevioside Natural products CC1(CCCC2(C)C3(C)CCC4(CC3(CCC12C)CC4=C)OC5OC(CO)C(O)C(O)C5OC6OC(CO)C(O)C(O)C6O)C(=O)OC7OC(CO)C(O)C(O)C7O OHHNJQXIOPOJSC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- 235000013618 yogurt Nutrition 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N (2R)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2R,3S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-amino-1-hydroxyethylidene)amino]-3-carboxy-1-hydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1,5-dihydroxy-5-iminopentylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=N[C@@H](CS)C(=N[C@@H](C)C(=N[C@@H](CO)C(=NCC(=N[C@@H](CCC(=N)O)C(=NC(CS)C(=N[C@H]([C@H](C)O)C(=N[C@H](CS)C(=N[C@H](CO)C(=NCC(=N[C@H](CS)C(=NCC(=N[C@H](CCCCN)C(=O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)N=C([C@H](CS)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](C)N=C(CN=C([C@H](CO)N=C([C@H](CS)N=C(CN=C(C(CS)N=C(C(CC(=O)O)N=C(CN)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N 0.000 description 1
- BJBUEDPLEOHJGE-UHFFFAOYSA-N (2R,3S)-3-Hydroxy-2-pyrolidinecarboxylic acid Natural products OC1CCNC1C(O)=O BJBUEDPLEOHJGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YOFPFYYTUIARDI-ZCFIWIBFSA-N (2r)-2-aminooctanedioic acid Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CCCCCC(O)=O YOFPFYYTUIARDI-ZCFIWIBFSA-N 0.000 description 1
- BVAUMRCGVHUWOZ-ZETCQYMHSA-N (2s)-2-(cyclohexylazaniumyl)propanoate Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC1CCCCC1 BVAUMRCGVHUWOZ-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- MRTPISKDZDHEQI-YFKPBYRVSA-N (2s)-2-(tert-butylamino)propanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(C)(C)C MRTPISKDZDHEQI-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- NPDBDJFLKKQMCM-SCSAIBSYSA-N (2s)-2-amino-3,3-dimethylbutanoic acid Chemical compound CC(C)(C)[C@H](N)C(O)=O NPDBDJFLKKQMCM-SCSAIBSYSA-N 0.000 description 1
- UKAUYVFTDYCKQA-UHFFFAOYSA-N -2-Amino-4-hydroxybutanoic acid Natural products OC(=O)C(N)CCO UKAUYVFTDYCKQA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GVEZIHKRYBHEFX-MNOVXSKESA-N 13C-Cerulenin Natural products CC=CCC=CCCC(=O)[C@H]1O[C@@H]1C(N)=O GVEZIHKRYBHEFX-MNOVXSKESA-N 0.000 description 1
- 101150076401 16 gene Proteins 0.000 description 1
- OWEFQTXQEHYDEJ-UHFFFAOYSA-N 2,3-dihydroxypropanal diphosphono hydrogen phosphate Chemical compound OCC(O)C=O.OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O OWEFQTXQEHYDEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710163881 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid oxidase Proteins 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- TWCMVXMQHSVIOJ-UHFFFAOYSA-N Aglycone of yadanzioside D Natural products COC(=O)C12OCC34C(CC5C(=CC(O)C(O)C5(C)C3C(O)C1O)C)OC(=O)C(OC(=O)C)C24 TWCMVXMQHSVIOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 description 1
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 1
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 1
- 101100433757 Arabidopsis thaliana ABCG32 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PLMKQQMDOMTZGG-UHFFFAOYSA-N Astrantiagenin E-methylester Natural products CC12CCC(O)C(C)(CO)C1CCC1(C)C2CC=C2C3CC(C)(C)CCC3(C(=O)OC)CCC21C PLMKQQMDOMTZGG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018185 Betula X alpestris Nutrition 0.000 description 1
- 235000018212 Betula X uliginosa Nutrition 0.000 description 1
- 101100327917 Caenorhabditis elegans chup-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100289995 Caenorhabditis elegans mac-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 241000238557 Decapoda Species 0.000 description 1
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 210000000712 G cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- 101150094690 GAL1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150038242 GAL10 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100028501 Galanin peptides Human genes 0.000 description 1
- 102100024637 Galectin-10 Human genes 0.000 description 1
- 229930191978 Gibberellin Natural products 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000005744 Glycoside Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108700023372 Glycosyltransferases Proteins 0.000 description 1
- 101150009006 HIS3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100246753 Halobacterium salinarum (strain ATCC 700922 / JCM 11081 / NRC-1) pyrF gene Proteins 0.000 description 1
- 102000002812 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101100121078 Homo sapiens GAL gene Proteins 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N Hydroxyproline Chemical compound O[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N 0.000 description 1
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 1
- SNDPXSYFESPGGJ-BYPYZUCNSA-N L-2-aminopentanoic acid Chemical compound CCC[C@H](N)C(O)=O SNDPXSYFESPGGJ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 235000019766 L-Lysine Nutrition 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N L-Methionine Natural products CSCCC(N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N L-Ornithine Chemical compound NCCC[C@H](N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- UKAUYVFTDYCKQA-VKHMYHEASA-N L-homoserine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCO UKAUYVFTDYCKQA-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 229930195722 L-methionine Natural products 0.000 description 1
- SNDPXSYFESPGGJ-UHFFFAOYSA-N L-norVal-OH Natural products CCCC(N)C(O)=O SNDPXSYFESPGGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N L-norleucine Chemical compound CCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 1
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- YBHQCJILTOVLHD-YVMONPNESA-N Mirin Chemical compound S1C(N)=NC(=O)\C1=C\C1=CC=C(O)C=C1 YBHQCJILTOVLHD-YVMONPNESA-N 0.000 description 1
- 241000713333 Mouse mammary tumor virus Species 0.000 description 1
- ACFIXJIJDZMPPO-NNYOXOHSSA-N NADPH Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 ACFIXJIJDZMPPO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 1
- 240000002853 Nelumbo nucifera Species 0.000 description 1
- 235000006508 Nelumbo nucifera Nutrition 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- KNTFCRCCPLEUQZ-VKHMYHEASA-N O-methylserine Chemical compound COC[C@H](N)C(O)=O KNTFCRCCPLEUQZ-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N Orn-delta-NH2 Natural products NCCCC(N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N Ornithine Natural products OC(=O)C(C)CCCN UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100054296 Oryza sativa subsp. japonica ABCG37 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100107593 Oryza sativa subsp. japonica ABCG40 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000206607 Porphyra umbilicalis Species 0.000 description 1
- 241000282330 Procyon lotor Species 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100394989 Rhodopseudomonas palustris (strain ATCC BAA-98 / CGA009) hisI gene Proteins 0.000 description 1
- 241001092459 Rubus Species 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 101100491255 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) YAP1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000020719 Satsuma Species 0.000 description 1
- 241000235347 Schizosaccharomyces pombe Species 0.000 description 1
- 241000269821 Scombridae Species 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000006092 Stevia rebaudiana Nutrition 0.000 description 1
- 101100370749 Streptomyces coelicolor (strain ATCC BAA-471 / A3(2) / M145) trpC1 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 244000269722 Thea sinensis Species 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150103101 UGT74G1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150092338 UGT76G1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150046863 UGT85C2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150050575 URA3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150044776 URA5 gene Proteins 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 108010084455 Zeocin Proteins 0.000 description 1
- 244000273928 Zingiber officinale Species 0.000 description 1
- 235000006886 Zingiber officinale Nutrition 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 235000013334 alcoholic beverage Nutrition 0.000 description 1
- 150000003862 amino acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 239000003125 aqueous solvent Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003121 arginine Drugs 0.000 description 1
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 description 1
- 239000008122 artificial sweetener Substances 0.000 description 1
- 235000021311 artificial sweeteners Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 235000008452 baby food Nutrition 0.000 description 1
- 235000015241 bacon Nutrition 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 235000013527 bean curd Nutrition 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 1
- 235000008429 bread Nutrition 0.000 description 1
- GVEZIHKRYBHEFX-UHFFFAOYSA-N caerulein A Natural products CC=CCC=CCCC(=O)C1OC1C(N)=O GVEZIHKRYBHEFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 235000013574 canned fruits Nutrition 0.000 description 1
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- GVEZIHKRYBHEFX-NQQPLRFYSA-N cerulenin Chemical compound C\C=C\C\C=C\CCC(=O)[C@H]1O[C@H]1C(N)=O GVEZIHKRYBHEFX-NQQPLRFYSA-N 0.000 description 1
- 229950005984 cerulenin Drugs 0.000 description 1
- 239000007806 chemical reaction intermediate Substances 0.000 description 1
- 235000015218 chewing gum Nutrition 0.000 description 1
- 229940112822 chewing gum Drugs 0.000 description 1
- BJBUEDPLEOHJGE-IUYQGCFVSA-N cis-3-hydroxy-D-proline zwitterion Chemical compound O[C@H]1CCN[C@H]1C(O)=O BJBUEDPLEOHJGE-IUYQGCFVSA-N 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 235000012489 doughnuts Nutrition 0.000 description 1
- 235000015071 dressings Nutrition 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000003028 enzyme activity measurement method Methods 0.000 description 1
- 238000009585 enzyme analysis Methods 0.000 description 1
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 1
- 238000012262 fermentative production Methods 0.000 description 1
- 235000021107 fermented food Nutrition 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 235000012041 food component Nutrition 0.000 description 1
- 235000011194 food seasoning agent Nutrition 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- IXORZMNAPKEEDV-UHFFFAOYSA-N gibberellic acid GA3 Natural products OC(=O)C1C2(C3)CC(=C)C3(O)CCC2C2(C=CC3O)C1C3(C)C(=O)O2 IXORZMNAPKEEDV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003448 gibberellin Substances 0.000 description 1
- 235000008397 ginger Nutrition 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000045442 glycosyltransferase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108700014210 glycosyltransferase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 229960002885 histidine Drugs 0.000 description 1
- PFOARMALXZGCHY-UHFFFAOYSA-N homoegonol Natural products C1=C(OC)C(OC)=CC=C1C1=CC2=CC(CCCO)=CC(OC)=C2O1 PFOARMALXZGCHY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000033444 hydroxylation Effects 0.000 description 1
- 238000005805 hydroxylation reaction Methods 0.000 description 1
- 229960002591 hydroxyproline Drugs 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- BBJIPMIXTXKYLZ-UHFFFAOYSA-N isoglutamic acid Chemical compound OC(=O)CC(N)CC(O)=O BBJIPMIXTXKYLZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 235000015110 jellies Nutrition 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 230000001050 lubricating effect Effects 0.000 description 1
- 235000020640 mackerel Nutrition 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 238000012269 metabolic engineering Methods 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 1
- 235000020124 milk-based beverage Nutrition 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 101150095344 niaD gene Proteins 0.000 description 1
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 229960003104 ornithine Drugs 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 235000015927 pasta Nutrition 0.000 description 1
- 229940023462 paste product Drugs 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 description 1
- 229960005190 phenylalanine Drugs 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N phleomycin D1 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC[C@@H](N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCCCNC(N)=N)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000000419 plant extract Substances 0.000 description 1
- 239000003375 plant hormone Substances 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 235000013580 sausages Nutrition 0.000 description 1
- 229930000044 secondary metabolite Natural products 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 235000011888 snacks Nutrition 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000014214 soft drink Nutrition 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 235000014347 soups Nutrition 0.000 description 1
- 235000011496 sports drink Nutrition 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- WPLOVIFNBMNBPD-ATHMIXSHSA-N subtilin Chemical compound CC1SCC(NC2=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C(C)CC)C(=O)NC(=C)C(=O)NC(CCCCN)C(O)=O)CSC(C)C2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C1NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C1NC(=O)C(=C/C)/NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)CNC(=O)C(NC(=O)C(NC(=O)C2NC(=O)CNC(=O)C3CCCN3C(=O)C(NC(=O)C3NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(=C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(CCCCN)NC(=O)C(N)CC=4C5=CC=CC=C5NC=4)CSC3)C(C)SC2)C(C)C)C(C)SC1)CC1=CC=CC=C1 WPLOVIFNBMNBPD-ATHMIXSHSA-N 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 229940034610 toothpaste Drugs 0.000 description 1
- 239000000606 toothpaste Substances 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- AVBGNFCMKJOFIN-UHFFFAOYSA-N triethylammonium acetate Chemical compound CC(O)=O.CCN(CC)CC AVBGNFCMKJOFIN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150016309 trpC gene Proteins 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001195 ultra high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000004704 ultra performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/90—Isomerases (5.)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L2/00—Non-alcoholic beverages; Dry compositions or concentrates therefor; Their preparation
- A23L2/52—Adding ingredients
- A23L2/60—Sweeteners
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L2/00—Non-alcoholic beverages; Dry compositions or concentrates therefor; Their preparation
- A23L2/52—Adding ingredients
- A23L2/66—Proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L27/00—Spices; Flavouring agents or condiments; Artificial sweetening agents; Table salts; Dietetic salt substitutes; Preparation or treatment thereof
- A23L27/10—Natural spices, flavouring agents or condiments; Extracts thereof
- A23L27/11—Natural spices, flavouring agents or condiments; Extracts thereof obtained by solvent extraction
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L27/00—Spices; Flavouring agents or condiments; Artificial sweetening agents; Table salts; Dietetic salt substitutes; Preparation or treatment thereof
- A23L27/30—Artificial sweetening agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L27/00—Spices; Flavouring agents or condiments; Artificial sweetening agents; Table salts; Dietetic salt substitutes; Preparation or treatment thereof
- A23L27/30—Artificial sweetening agents
- A23L27/31—Artificial sweetening agents containing amino acids, nucleotides, peptides or derivatives
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L27/00—Spices; Flavouring agents or condiments; Artificial sweetening agents; Table salts; Dietetic salt substitutes; Preparation or treatment thereof
- A23L27/30—Artificial sweetening agents
- A23L27/33—Artificial sweetening agents containing sugars or derivatives
- A23L27/36—Terpene glycosides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
- A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
- A23L33/13—Nucleic acids or derivatives thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
- A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
- A23L33/17—Amino acids, peptides or proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
- C07H15/20—Carbocyclic rings
- C07H15/24—Condensed ring systems having three or more rings
- C07H15/256—Polyterpene radicals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H3/00—Compounds containing only hydrogen atoms and saccharide radicals having only carbon, hydrogen, and oxygen atoms
- C07H3/08—Deoxysugars; Unsaturated sugars; Osones
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P15/00—Preparation of compounds containing at least three condensed carbocyclic rings
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/02—Monosaccharides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/24—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of an isomerase, e.g. fructose
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
- C12P19/56—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen atom of the saccharide radical directly bound to a condensed ring system having three or more carbocyclic rings, e.g. daunomycin, adriamycin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y501/00—Racemaces and epimerases (5.1)
- C12Y501/03—Racemaces and epimerases (5.1) acting on carbohydrates and derivatives (5.1.3)
- C12Y501/03013—Racemaces and epimerases (5.1) acting on carbohydrates and derivatives (5.1.3) dTDP-4-dehydrorhamnose 3,5-epimerase (5.1.3.13)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y503/00—Intramolecular oxidoreductases (5.3)
- C12Y503/01—Intramolecular oxidoreductases (5.3) interconverting aldoses and ketoses (5.3.1)
- C12Y503/01014—L-Rhamnose isomerase (5.3.1.14)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
- A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/13—Plant traits
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Mycology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Botany (AREA)
- Obesity (AREA)
- Hematology (AREA)
- Child & Adolescent Psychology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本発明は、グルコースからラムノースを生成する活性を有するタンパク質及びこれをコードするポリヌクレオチドを提供することを目的とする。本発明は、ステビア由来ラムノース合成酵素及び遺伝子を用いたグルコースからラムノースを製造する方法を提供する。本発明は、またステビア由来ラムノース合成酵素を用いたステビオール配糖体の製造方法を提供する。
Description
本発明は、グルコースからラムノースを生成する活性を有するタンパク質及びこれをコードするポリヌクレオチド、同タンパク質を利用したラムノース及びステビオール配糖体の製造方法に関する。
キク科ステビア(Stevia rebaudiana)の葉にはジテルペノイドの一種であるステビオール(Steviol)とよばれる二次代謝産物が含まれており、ステビオール配糖体は砂糖の約300倍もの甘味を呈することからカロリーレスの甘味料として食品産業に利用されている。肥満が深刻な社会問題として国際的に発展しており、健康増進及び医療費削減の観点からもカロリーレスの甘味料の要望は日々大きくなっている。現在では人工的に合成されたアミノ酸誘導体のアスパルテーム(Aspartame)やアセスルファムカリウム(Acesulfame Potassium)が人工甘味料として利用されているが、ステビオール配糖体のように天然に存在するカロリーレス甘味料はより安全で消費者理解（Public Acceptance）が得られやすいと期待される。
ステビアの主要なステビオール配糖体は最終的には4つの糖が付いたレバウディオシドA (Rebaudioside A; RebA)と呼ばれる配糖体にまで糖で修飾される（図1）。その前駆体であるステビオール3糖配糖体のステビオシド(Stevioside)が量的に最も多く、これら2つがステビアの甘味の中心的な物質である。ステビオシドは、ステビア葉で最も含有量が多く、砂糖の250〜300倍程の甘味を呈することが知られている。RebAは、甘味が高く（砂糖の350〜450倍）、且つ味質が良いとされるステビオール4糖配糖体であり、これらはカロリーレス甘味料として注目されている。これら以外に反応中間体と思われる配糖体や糖の種類が異なる類縁体の存在が知られている。例えば、RebAの4つの配糖体糖はすべてグルコースであるが、このうち13位のグルコースの2位にグルコースではなくラムノースが付加されたレバウディオシドC(RebC)や、同位置にキシロースが付加されたレバウディオシドF(RebF)が知られている。
RebAの生合成に至る酵素遺伝子はステビアのExpressed Sequence Tag（EST）解析を通じて単離されている（非特許文献1及び2、特許文献1）。植物ホルモンであるジテルペノイドのジベレリン(Gibberellin)の前駆体であるエントカウレン酸(ent-kaurenoic acid)の13位がエントカウレン酸13位水酸化酵素(EK13H)によって水酸化されることでステビオールが生成する（図１）（特許文献１）。ステビオールはまず13位の水酸基がステビアのUDP糖依存的糖転移酵素(UDP-sugar dependent glycosyltransferase: UGT)であるUGT85C2によって配糖体化（グルコシル化）されることでステビオールモノシド(Steviolmonoside)が生成する（非特許文献１，２）。ステビオールモノシドの13位のグルコースの2位が更にグルコシル化されることでステビオールビオシド(Steviolbioside)、あるいはステビオールモノシドの19位のカルボキシル基がグルコシル化されてルブソシド（Rubusoside）と呼ばれるステビオールの二糖配糖体が生じる。ステビオールビオシド、あるいはルブソシドの13位グルコースの2位をグルコシル化する酵素としてはUGT91D2が報告されている（以前はUGT91D-like3と呼ばれていた）（特許文献2）。一方、13位グルコースの3位はUGT76G1によってグルコシル化され、19位のカルボン酸についてはUGT74G1によってそれぞれグルコシル化されることが報告されている（非特許文献2）。このようにRebAまで配糖化を担う酵素遺伝子は同定されており、ステビオール配糖体の生合成酵素群を酵母で異所的に発現させ、培養によりステビオール配糖体を生産させることが報告されており（特許文献3）、ステビア酵素の産業利用が進められている。
グルコース以外の配糖体糖を含むステビオール配糖体としてはRebC（ラムノース含有）やRebF(キシロース含有)が知られているが、グルコース以外の糖を付加するUGT酵素は未解明である。さらに、グルコースの以外のUDP-糖の生成についてはシロイヌナズナでUDPラムノース合成酵素が報告されているが（非特許文献3）、ステビアでは不明である。
Brandle and Telmer (2007) Phytochemistry 68, 1855-1863
Richman et al (2005) Plant J. 41, 56-67
Oka et al (2007) J. Biol. Chem.282, 5389-5403
Natsume et al (2015) Plant Cell Physiol. 56, 428-441
本発明の課題は、グルコースからラムノースを生成する活性を有するタンパク質及びこれをコードするポリヌクレオチドを提供することである。
本発明者らは鋭意研究を遂行した結果、ステビアにおいてグルコースからラムノースを生成するSrRHM1及びSrRHM2タンパク質のアミノ酸配列と該タンパク質をコードする遺伝子配列を同定することに成功した。本発明は、上記知見に基づくものである。
本発明の酵素を用いることで、グルコースからラムノースを生成することができる。また、このようにして生成されたラムノースを用いて、ラムノース基を有するステビオール配糖体を生産することができる。また本酵素の働きを促進又は阻害することでステビア植物体の中のステビオール配糖体の種類を制御することができる。さらに本発明の酵素を発現する遺伝子を使って、代謝工学的にラムノース基を有するステビオール配糖体の生産が可能となる。
以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施をすることができる。なお、本明細書において引用した全ての文献、及び公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。また、本明細書は、2017年4月12日に出願された本願優先権主張の基礎となる日本国特許出願（特願2017-079041号）の明細書及び図面に記載の内容を包含する。
本発明者らは、ステビアにおいてグルコースからラムノースを生成するSrRHM1タンパク質及びSrRHM2タンパク質のアミノ酸配列と該タンパク質をコードする遺伝子配列を同定することに初めて成功した。SrRHM1タンパク質には３種の変異体SrRHM1＃１、SrRHM1＃２及びSrRHM1＃３が含まれ、そのアミノ酸配列はそれぞれ配列番号２、４及び６であり、そのCDS配列はそれぞれ配列番号１、３及び５に示される。SrRHM2タンパク質には２種の変異体SrRHM2＃１及びSrRHM2＃２が含まれ、そのアミノ酸配列はそれぞれ配列番号８及び１０であり、そのCDS配列はそれぞれ配列番号７及び９に示される。
ここで、用語「SrRHM1タンパク質」とは、３種の変異体SrRHM1＃１、SrRHM1＃２及びSrRHM1＃３の各タンパク質を包括するものであり、用語「SrRHM2タンパク質」とは２種の変異体SrRHM2＃１及びSrRHM2＃２の各タンパク質を包括するものである。
ポリヌクレオチド及び酵素は、後述の実施例に記載した手法、公知の遺伝子工学的手法、公知の合成手法等によって取得することが可能である。
ここで、用語「SrRHM1タンパク質」とは、３種の変異体SrRHM1＃１、SrRHM1＃２及びSrRHM1＃３の各タンパク質を包括するものであり、用語「SrRHM2タンパク質」とは２種の変異体SrRHM2＃１及びSrRHM2＃２の各タンパク質を包括するものである。
ポリヌクレオチド及び酵素は、後述の実施例に記載した手法、公知の遺伝子工学的手法、公知の合成手法等によって取得することが可能である。
1. ステビア由来ラムノース合成酵素
本発明は、以下の（a）〜（c）よりなる群より選ばれるいずれかに記載のタンパク質（以下、「本発明のタンパク質」という）を提供する。
（a）配列番号2、4、6、8又は10のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（b）配列番号2、4、6、8又は10のアミノ酸配列において、1〜33個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつグルコースからラムノースを生成する活性を有するタンパク質；
（c）配列番号2、4、6、8又は10のアミノ酸配列に対して、95％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつグルコースからラムノースを生成する活性を有するタンパク質。
本発明は、以下の（a）〜（c）よりなる群より選ばれるいずれかに記載のタンパク質（以下、「本発明のタンパク質」という）を提供する。
（a）配列番号2、4、6、8又は10のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（b）配列番号2、4、6、8又は10のアミノ酸配列において、1〜33個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつグルコースからラムノースを生成する活性を有するタンパク質；
（c）配列番号2、4、6、8又は10のアミノ酸配列に対して、95％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつグルコースからラムノースを生成する活性を有するタンパク質。
上記（b）、又は（c）に記載のタンパク質は、代表的には、天然に存在する配列番号2、4、6、8又は10のポリペプチドの変異体であるが、例えば、"Sambrook ＆ Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Vol. 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001"、"Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley ＆ Sons 1987-1997"、"Nuc. Acids. Res., 10, 6487（1982）"、"Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409（1982）"、"Gene, 34, 315 （1985）"、"Nuc. Acids. Res., 13, 4431（1985）"、"Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488（1985）"等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、人為的に取得することができるものも含まれる。
本明細書中、「配列番号2、4、6、8又は10のアミノ酸配列において、1〜33個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつグルコースからラムノースを生成する活性を有するタンパク質」としては、配列番号2、4、6、8又は10のアミノ酸配列において、例えば、1〜33個、1〜32個、1〜31個、1〜30個、1〜29個、1〜28個、1〜27個、1〜26個、1〜25個、1〜24個、1〜23個、1〜22個、1〜21個、1〜20個、1〜19個、1〜18個、1〜17個、1〜16個、1〜15個、1〜14個、1〜13個、1〜12個、1〜11個、1〜10個、1〜9個（1〜数個）、1〜8個、1〜7個、1〜6個、1〜5個、1〜4個、1〜3個、1〜2個、又は1個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつグルコースからラムノースを生成する活性を有するタンパク質が挙げられる。上記アミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び／又は付加の数は、一般的には小さい程好ましい。
また、このようなタンパク質としては、配列番号2、4、6、8又は10のアミノ酸配列と95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、又は99.9％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつグルコースからラムノースを生成する活性を有するタンパク質が挙げられる。上記配列同一性の数値は一般的に大きい程好ましい。
ここで、「グルコースからラムノースを生成する活性」とは、下記式のように、グルコースからラムノースを生成する活性を意味する。
本発明の好ましい態様によれば、上記グルコースがウリジン二リン酸グルコースの形態にある。また、本発明の他の好ましい態様によれば、上記ラムノースがウリジン二リン酸ラムノースの形態にある。
あるいは、本発明のタンパク質を用いてグルコースからラムノースを生成する際、下記の構造を有する、４−ケト−６−デオキシグルコースを中間体として得てもよい。
グルコースからラムノースを生成する活性は、被検タンパク質、及びグルコース（例えば、UDP-グルコース）1〜1000 μM（好ましくは、100〜700 μM、最も好ましくは500 μM）を含むpH6.0〜8.0の中性領域の緩衝液（例えば、リン酸ナトリウムバッファー又はリン酸カリウムバッファー）中において、20〜40℃の温度で10分間〜2時間インキュベートした後に精製し、精製した生成物をLC-MS分析（Liquid Chromatography-Mass Spectrometry）等の公知の手法により分析することで検証することができる。
LC-MS分析の結果、ラムノースが検出された場合、前記被検タンパク質はグルコースからラムノースを生成する活性を有するものと言える。
前記ラムノース生成反応は、一般に、1分〜12時間程度で終了する。
前記ラムノース生成反応は、一般に、1分〜12時間程度で終了する。
本発明のタンパク質のアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたとは、同一配列中の任意かつ1若しくは複数のアミノ酸配列中の位置において、1若しくは複数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び／又は付加があることを意味し、欠失、置換、挿入及び付加のうち2種以上が同時に生じてもよい。
以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。A群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、2−アミノブタン酸、メチオニン、o−メチルセリン、t−ブチルグリシン、t−ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン；B群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、2−アミノアジピン酸、2−アミノスベリン酸；C群：アスパラギン、グルタミン；D群：リジン、アルギニン、オルニチン、2，4−ジアミノブタン酸、2，3−ジアミノプロピオン酸；E群：プロリン、3−ヒドロキシプロリン、4−ヒドロキシプロリン；F群：セリン、スレオニン、ホモセリン；G群：フェニルアラニン、チロシン。
本発明のタンパク質は、これをコードするポリヌクレオチド（後述する「本発明のポリヌクレオチド」を参照）を適切な宿主細胞内で発現させることにより得ることができるが、Fmoc法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、tBoc法（t-ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によっても製造することができる。また、Advanced Automation Peptide Protein Technologies社製、Perkin Elmer社製、Protein Technologies社製、PerSeptive社製、Applied Biosystems社製、SHIMADZU社製等のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。
2．ラムノースの製造方法
本発明のタンパク質が有する、グルコースからラムノースを生成する活性を利用することにより、ラムノースを容易かつ多量に製造することが可能である。
本発明のタンパク質が有する、グルコースからラムノースを生成する活性を利用することにより、ラムノースを容易かつ多量に製造することが可能である。
そこで、別の実施形態において、本発明は、本発明のタンパク質と、グルコースとを反応させて、ラムノースを製造する方法を提供する。具体的には、本発明のラムノースの製造方法は、以下の（a）〜（c）よりなる群より選ばれるいずれかに記載のタンパク質と、グルコースとを反応させる工程を含む、ラムノースの製造方法である。
（a）配列番号2、4、6、8又は10のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（b）配列番号2、4、6、8又は10のアミノ酸配列において、1〜33個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつグルコースからラムノースを生成する活性を有するタンパク質；
（c）配列番号2、4、6、8又は10のアミノ酸配列に対して、95％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつグルコースからラムノースを生成する活性を有するタンパク質。
（a）配列番号2、4、6、8又は10のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（b）配列番号2、4、6、8又は10のアミノ酸配列において、1〜33個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつグルコースからラムノースを生成する活性を有するタンパク質；
（c）配列番号2、4、6、8又は10のアミノ酸配列に対して、95％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつグルコースからラムノースを生成する活性を有するタンパク質。
ここで、上記（a）〜（c）については、既に「本発明のタンパク質」について説明したとおりである。また、本発明の好ましい態様によれば、上記グルコースがウリジン二リン酸グルコースの形態にある。また、本発明の他の好ましい態様によれば、上記ラムノースがウリジン二リン酸ラムノースの形態にある。あるいは、本発明の形質転換体を用いてグルコースからラムノースを生成する際、上記の構造を有する、４−ケト−６−デオキシグルコースを中間体として得てもよい。
本発明の第1のラムノースの製造方法は、さらに、前記工程での生成物を精製する工程を含んでいてもよい。
生成したラムノースは、適切な溶媒（水等の水性溶媒又はアルコール、エーテル及びアセトン等の有機溶媒）による抽出、酢酸エチルその他の有機溶媒：水の勾配、高速液体クロマトグラフィー（High Performance Liquid Chromatography：HPLC）、超高性能液体クロマトグラフィー (Ultra （High）Performance Liquid chromatography：UPLC) 等の公知の方法によって精製することができる。
本発明の別態様によれば、本発明のラムノースの製造方法によって得られたラムノース又はウリジン二リン酸ラムノースを含む、甘味料、飲食品又は医薬品が提供される。甘味料、飲食品又は医薬品の例は本明細書において後述する。また、本発明の更なる別態様によれば、発明のラムノースの製造方法によって得られたラムノースを少なくとも１つ含む、ステビオール配糖体が提供される。なお、本明細書において、「ラムノースを少なくとも１つ含むステビオール配糖体」とは、「ラムノース基を少なくとも１つ有するステビオール配糖体」を意味する。
3．ラムノース高含有非ヒト形質転換体
ラムノースは、本発明のタンパク質を用いて細菌（大腸菌又は酵母など）、植物、微生物、昆虫、ヒトを除く哺乳動物などの細胞内で生成することもできる。本発明のタンパク質は、ステビアに由来する酵素又はその変異体であるため、細胞内環境においても高い活性を有することが期待されるからである。この場合、本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチド（後述する「本発明のポリヌクレオチド」を参照）と発現カセットとを含むベクターを、細菌、微生物、植物、昆虫、ヒトを除く哺乳動物などに由来する宿主細胞に導入して本発明のタンパク質を発現させ、本発明のタンパク質と、前記細胞内に存在するグルコース又はUDP-グルコースとを反応させることによりラムノース又はUDP-ラムノースを生成することができる。
ラムノースは、本発明のタンパク質を用いて細菌（大腸菌又は酵母など）、植物、微生物、昆虫、ヒトを除く哺乳動物などの細胞内で生成することもできる。本発明のタンパク質は、ステビアに由来する酵素又はその変異体であるため、細胞内環境においても高い活性を有することが期待されるからである。この場合、本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチド（後述する「本発明のポリヌクレオチド」を参照）と発現カセットとを含むベクターを、細菌、微生物、植物、昆虫、ヒトを除く哺乳動物などに由来する宿主細胞に導入して本発明のタンパク質を発現させ、本発明のタンパク質と、前記細胞内に存在するグルコース又はUDP-グルコースとを反応させることによりラムノース又はUDP-ラムノースを生成することができる。
そこで、本発明は、以下の（a）〜（ｄ）よりなる群より選ばれるいずれかに記載のポリヌクレオチド（以下、「本発明のポリヌクレオチド」という）が導入された非ヒト形質転換体（以下、「本発明の形質転換体」という）を提供する。
（a）配列番号1、3、5、7又は9の塩基配列を含有するポリヌクレオチド；
（b）配列番号2、4、6、8又は10のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（c）配列番号2、4、6、8又は10のアミノ酸配列において、1〜33個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつグルコースからラムノースを生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（d）配列番号2、4、6、8又は10のアミノ酸配列に対して、95％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつグルコースからラムノースを生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（a）配列番号1、3、5、7又は9の塩基配列を含有するポリヌクレオチド；
（b）配列番号2、4、6、8又は10のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（c）配列番号2、4、6、8又は10のアミノ酸配列において、1〜33個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつグルコースからラムノースを生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（d）配列番号2、4、6、8又は10のアミノ酸配列に対して、95％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつグルコースからラムノースを生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
本発明の好ましい態様によれば、上記グルコースがウリジン二リン酸グルコースの形態にある。また、本発明の他の好ましい態様によれば、上記ラムノースがウリジン二リン酸ラムノースの形態にある。あるいは、本発明の形質転換体を用いてグルコースからラムノースを生成する際、上記の構造を有する、４−ケト−６−デオキシグルコースを中間体として得てもよい。
本明細書中、「ポリヌクレオチド」とは、DNA又はRNAを意味する。上記した本発明のポリヌクレオチドは、公知の遺伝子工学的手法又は公知の合成手法によって取得することが可能である。
本発明のポリヌクレオチドは、好ましくは、適切な発現ベクターに挿入された状態で宿主に導入される。
適切な発現ベクターは、通常、
（i）宿主細胞内で転写可能なプロモーター；
（ii）該プロモーターに結合した、本発明のポリヌクレオチド；及び
（iii）RNA分子の転写終結及びポリアデニル化に関し、宿主細胞内で機能するシグナルを構成要素として含む発現カセット
を含むように構成される。
発現ベクターの作製方法としては、プラスミド、ファージ又はコスミドなどを用いる方法が挙げられるが特に限定されない。
適切な発現ベクターは、通常、
（i）宿主細胞内で転写可能なプロモーター；
（ii）該プロモーターに結合した、本発明のポリヌクレオチド；及び
（iii）RNA分子の転写終結及びポリアデニル化に関し、宿主細胞内で機能するシグナルを構成要素として含む発現カセット
を含むように構成される。
発現ベクターの作製方法としては、プラスミド、ファージ又はコスミドなどを用いる方法が挙げられるが特に限定されない。
ベクターの具体的な種類は特に限定されず、宿主細胞中で発現可能なベクターが適宜選択され得る。すなわち、宿主細胞の種類に応じて、確実に本発明のポリヌクレオチドを発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと本発明のポリヌクレオチドを各種プラスミド等に組み込んだベクターを発現ベクターとして用いればよい。
本発明の発現ベクターは、導入されるべき宿主の種類に依存して、発現制御領域（例えば、プロモーター、ターミネーター及び／又は複製起点等）を含有する。細菌用発現ベクターのプロモーターとしては、慣用的なプロモーター（例えば、trcプロモーター、tacプロモーター、lacプロモーター等）が使用され、酵母用プロモーターとしては、例えば、GAL1プロモーター、GAL10プロモーター、グリセルアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター、PH05プロモーター等が挙げられ、糸状菌用プロモーターとしては、例えば、アミラーゼ、trpC等が挙げられる。また、植物細胞内で目的遺伝子を発現させるためのプロモーターの例としては、植物細胞内でポリヌクレオチドを構成的に発現させるプロモーターを有するベクター又は外的な刺激によって誘導的に活性化されるプロモーターを有するベクターが挙げられる。ポリヌクレオチドを構成的に発現させるプロモーターの例としては、カリフラワーモザイクウィルスの35S RNAプロモーター、rd29A遺伝子プロモーター、rbcSプロモーター、mac-1プロモーター等が挙げられる。外的な刺激によって誘導性に活性化されるプロモーターの例としては、mouse mammary tumor virus（MMTV）プロモーター、テトラサイクリン応答性プロモーター、メタロチオネインプロモーター及びヒートショックプロテインプロモーター等が挙げられる。動物細胞宿主用プロモーターとしては、ウイルス性プロモーター（例えば、SV40初期プロモーター、SV40後期プロモーター等）が挙げられる。
発現ベクターは、少なくとも1つの選択マーカーを含むことが好ましい。このようなマーカーとしては、栄養要求性マーカー（ura5、niaD、TRP1、URA3、HIS3、 LEU2）、薬剤耐性マーカー（hygromycine、ゼオシン）、ジェネチシン耐性遺伝子（G418r）、銅耐性遺伝子（CUP1）（Marin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 81, p. 337, 1984）、セルレニン耐性遺伝子（fas2m, PDR4）（それぞれ、猪腰淳嗣ら, 生化学, vol. 64, p. 660, 1992；Hussain et al., Gene, vol. 101, p. 149, 1991）などが利用可能である。
本発明の形質転換体は、ラムノースを高効率で生産することが期待される。形質転換に用いられる宿主細胞は、特に限定されるものではなく、公知の各種細胞を好適に用いることができる。例えば、宿主細胞の例としては、大腸菌（Escherichia coli）等の細菌、酵母（出芽酵母Saccharomyces cerevisiae、分裂酵母Schizosaccharomyces pombe）等の微生物、植物細胞、ヒトを除く動物細胞等が挙げられる。
上記の宿主細胞のための適切な培養培地及び条件は当分野で周知である。また、形質転換の対象となる生物も特に限定されるものではなく、上記宿主細胞で例示した各種微生物又は植物又はヒトを除く動物が挙げられる。
その他、一般的な分子生物学的な手法に関しては、"Sambrook ＆ Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Vol. 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001"、"Methods in Yeast Genetics、A laboratory manual （Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor, NY）"等を参照することができる。
本発明の1つの態様において、形質転換の宿主細胞としては任意の酵母を用いることができる。具体的には、サッカロマイセス（Saccharomyces）属等の酵母が挙げられるが、これに限定されない。
酵母の形質転換方法としては一般に用いられる公知の方法が利用できる。例えば、エレクトロポレーション法“Meth. Enzym., 194,p182(1990)”、スフェロプラスト法“Proc.(12) JP 4918504 B2 2012.4.18Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929(1978)”、酢酸リチウム法“J.Bacteriology, 153, p163(1983)”、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929(1978)、 Methods in yeast genetics, 2000 Edition : A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manualなど に記載の方法で実施可能であるが、これらに限定されない。形質転換株は、使用した選択マーカーに合わせた選択圧のある培地（たとえば、抗生物質を含む培地あるいは栄養素を欠失させた培地）で生育する株として選抜して取得する。
本発明の1つの態様において、形質転換に用いられる宿主細胞としては、任意の植物体を用いることができる。本実施形態に係る植物形質転換体は、本発明に係るポリヌクレオチドを含む組換えベクターを、当該ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドが発現され得るように植物体中に導入することによって取得される。あるいは、本発明の遺伝子は子孫に遺伝することから、本発明の形質転換体を交配親として用いることで、当該遺伝子を有する新たな植物体を得ることができる。
本発明において形質転換の対象となる植物体は、植物体全体、植物器官（例えば葉、花弁、茎、根、種子など）、植物組織（例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束、柵状組織、海綿状組織など）又は植物培養細胞、あるいは種々の形態の植物細胞（例えば、懸濁培養細胞）、プロトプラスト、葉の切片、カルスなどのいずれをも意味する。形質転換に用いられる植物体としては、特に限定されず、単子葉植物綱又は双子葉植物綱に属する植物体のいずれでもよい。特に好ましい例としては、ステビオールをアグリコンとして種々の配糖体を生合成することが知られている植物体を使用することが望ましく、このような植物体としては、ステビアやテンチャ（Rubus suauissimus）等を挙げることができる。
植物体への遺伝子の導入には、当業者に公知の形質転換方法（例えば、アグロバクテリウム法、遺伝子銃法、PEG法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法など）が用いられる。
遺伝子が導入された細胞又は植物組織は、まずハイグロマイシン耐性などの薬剤耐性で選択され、次いで定法によって植物体に再生される。形質転換細胞から植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが可能である。
本発明のポリヌクレオチドが植物に導入されたか否かの確認は、PCR法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法などによって行うことができる。
このようにして得られた形質転換体を培養することにより、形質転換体にラムノースを生産させることが可能である。前述の通り、形質転換体の培養系に基質としてグルコース又はグルコースを含む植物抽出物を添加することにより、ラムノースの製造を促進することもできる。蓄積された生成物を抽出・精製することにより、目的のラムノースを得ることができる。
4. 形質転換体の抽出物及びその利用
本発明はまた、別の実施形態において、上記の形質転換体の抽出物を提供する。本発明の形質転換体は、適切な基質を有する場合、もしくは、適切な基質を外部から添加した場合、その野生型と比べてラムノースの含有量が高いので、その抽出物には、ラムノース又はラムノース基を有するステビオール配糖体が高濃度で含まれると考えられる。
本発明はまた、別の実施形態において、上記の形質転換体の抽出物を提供する。本発明の形質転換体は、適切な基質を有する場合、もしくは、適切な基質を外部から添加した場合、その野生型と比べてラムノースの含有量が高いので、その抽出物には、ラムノース又はラムノース基を有するステビオール配糖体が高濃度で含まれると考えられる。
本発明の形質転換体の抽出物は、形質転換体をガラスビーズ、ホモジェナイザー又はソニケーター等を用いて破砕し、当該破砕物を遠心処理し、その上清を回収することにより、得ることができる。さらに、上記で述べたラムノースの抽出方法により、さらなる抽出工程を施してもよい。
本発明の形質転換体の抽出物は、常法に従って、例えば、甘味料、飲食品、医薬品、工業原料の製造等の用途に使用することができる。
本発明はまた、別の実施形態において、本発明の形質転換体の抽出物を含む甘味料、飲食品、医薬、工業原料（飲食品等の原料）を提供する。本発明の形質転換体の抽出物を含む甘味料、飲食品、医薬、工業原料の調製は、常法による。このように、本発明の形質転換体の抽出物を含む甘味料、飲食品、医薬、工業原料等は、本発明の形質転換体を用いて生成されたラムノース又はラムノース基を有するステビオール配糖体を含有する。
本発明の飲食品の例としては、栄養補助食品、健康食品、特定保健用食品、機能性表示食品、幼児用食品、老人用食品等が挙げられる。本明細書中、食品は、固体、流動体、及び液体、並びにそれらの混合物であって、摂食可能なものの総称である。
栄養補助食品とは、特定の栄養成分が強化されている食品をいう。健康食品とは、健康的な又は健康によいとされる食品をいい、栄養補助食品、自然食品、ダイエット食品等を含む。特定保健用食品とは、からだの生理学的機能などに影響を与える成分を含んでいて、特定の保健の効果が科学的に証明され、国に科学的根拠を示して、有効性や安全性の審査を受けている食品である。機能性表示食品とは、科学的根拠を基に商品パッケージに機能性を表示するものとして、消費者庁に届け出られた食品である。幼児用食品とは、約6歳までの子供に与えるための食品をいう。老人用食品とは、無処理の食品と比較して消化及び吸収が容易であるように処理された食品をいう。
本発明の飲食品は、甘味料としてラムノース又はラムノース基を有するステビオール配糖体を使用している。このため、本発明の食品は低カロリーであり、健康増進又は健康維持に寄与するというメリットを有する。
これらの飲食品の形態の例としては、パン、麺類、パスタ、ごはん、菓子類（ケーキ、アイスクリーム、アイスキャンデー、ドーナツ、焼き菓子、キャンデー、チューインガム、グミ、錠菓、並びに団子及びまんじゅう等の和菓子）、豆腐及びその加工品等の農産食品、清酒、薬用酒、みりん、食酢、醤油、みそ等の発酵食品、ヨーグルト、ハム、ベーコン、ソーセージ等の畜産食品、かまぼこ、揚げ天、はんぺん等の水産食品、果汁飲料、清涼飲料、スポーツ飲料、アルコール飲料、茶等又は調味料であってもよい。さらなる食品の形態の例としては、低カロリー飲料、ノンシュガー飲料、フルーツ缶詰、乳飲料、粉末飲料、ヨーグルト、ゼリー、ドレッシング、麺つゆ、漬物、佃煮、醤油、味噌、塩辛、バーモント酢、甘酢らっきょ漬け、甘酢生姜、酢レンコン、また、漬物、天ぷら及びカバ焼きのタレ、焼肉のタレ、ソース等、ガム、キャンディー・飴、歯磨きペースト、さつま揚げ、だし巻き、焼きそばソース、冷やし中華のタレ、しめ鯖、氷菓、シャーベット、ソフトクリーム、練り製品、スナック、米菓、コーンカップ、味付け海苔、天カス、ふりかけなどが挙げられる。
本発明の医薬品（組成物）の剤型は、特に限定されず、溶液状、ペースト状、ゲル状、固体状、粉末状等任意の剤型をとることができる。
本発明の医薬組成物は、必要に応じてさらに、その他の医薬活性成分（例えば、消炎成分）又は補助成分（例えば、潤滑成分、担体成分）を含んでいてもよい。
5．ラムノース基を有するステビオール配糖体の製造方法
本発明の他の態様によれば、本発明のタンパク質とグルコースとを反応させてラムノースを得る工程と、ラムノースをステビオール又はステビオール配糖体に転移する工程と、
を含む、ステビオール配糖体の製造方法を提供する。具体的には、本発明のステビオール配糖体の製造方法は、以下の（a）〜（c）よりなる群より選ばれるいずれかに記載のタンパク質と、グルコースとを反応させてラムノースを得る工程と：
（a）配列番号2、4、6、8又は10のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（b）配列番号2、4、6、8又は10のアミノ酸配列において、1〜33個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつグルコースからラムノースを生成する活性を有するタンパク質；
（c）配列番号2、4、6、8又は10のアミノ酸配列に対して、95％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつグルコースからラムノースを生成する活性を有するタンパク質
ラムノースをステビオール又はステビオール配糖体に転移する工程と、
を含む、ステビオール配糖体の製造方法である。
本発明の他の態様によれば、本発明のタンパク質とグルコースとを反応させてラムノースを得る工程と、ラムノースをステビオール又はステビオール配糖体に転移する工程と、
を含む、ステビオール配糖体の製造方法を提供する。具体的には、本発明のステビオール配糖体の製造方法は、以下の（a）〜（c）よりなる群より選ばれるいずれかに記載のタンパク質と、グルコースとを反応させてラムノースを得る工程と：
（a）配列番号2、4、6、8又は10のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（b）配列番号2、4、6、8又は10のアミノ酸配列において、1〜33個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつグルコースからラムノースを生成する活性を有するタンパク質；
（c）配列番号2、4、6、8又は10のアミノ酸配列に対して、95％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつグルコースからラムノースを生成する活性を有するタンパク質
ラムノースをステビオール又はステビオール配糖体に転移する工程と、
を含む、ステビオール配糖体の製造方法である。
本発明のタンパク質とグルコースとを反応させてラムノースを得る工程は、「2．ラムノースの製造方法」において記載したとおりである。ラムノースをステビオール又はステビオール配糖体に転移する工程は、ステビオール又はステビオール配糖体にラムノースを転移することができれば特に限定されないが、例えば、ステビオール又はステビオール配糖体にラムノースを転移する酵素を用いて行ってもよい。そのような酵素として、UGT91D2酵素（配列番号１１）又はUGT91D2#16酵素（配列番号１３）等を使用することができる。また、そのような酵素をコードする遺伝子（配列番号１２および１４）を導入した宿主細胞を用いてステビオール又はステビオール配糖体にラムノースを転移してもよい。本発明の好ましい態様によれば、ラムノースをステビオール又はステビオール配糖体に転移する工程は、（i）配列番号11若しくは13の塩基配列を含有するポリヌクレオチド、又は、（ii）配列番号12若しくは14のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有し、かつ、ステビオール配糖体の13位に結合したグルコースに1→2結合でラムノースを付加する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを導入した非ヒト形質転換体を用いて行われてもよい。
さらに、ステビオールからレバウディオシドCまでの一連の配糖体合成に関与する配糖体化酵素をコードする遺伝子を導入した又はこれらの遺伝子を発現する宿主細胞を用い、同宿主細胞で本発明のポリヌクレオチドを発現させることにより、より高度に配糖化されたステビオール配糖体（例えば、ステビアにおいてラムノース基を有するズルコシドA、レバウディオシドC、レバウディオシドN及びレバウディオシドO等）を作製することができる。ステビオールからレバウディオシドCまでの一連の配糖体合成に関与する配糖体化酵素及びその遺伝子の例としては、UGT91D2（CDS配列：配列番号１１、アミノ酸配列：配列番号１２）、UGT91D2#16（CDS配列：配列番号１３、アミノ酸配列：配列番号１４）、UGT85C2（CDS配列：配列番号１５、アミノ酸配列：配列番号１６）、UGT74G1（CDS配列：配列番号１７、アミノ酸配列：配列番号１８）、及びUGT76G1（CDS配列：配列番号１９、アミノ酸配列：配列番号２０）等が挙げられる。本発明のステビオール配糖体の製造方法の好ましい態様において、下記の（ａ）〜（ｅ）の少なくとも１つのポリヌクレオチドを導入した非ヒト形質転換体を用いる工程がさらに含まれる。
（ａ）（i）配列番号15の塩基配列を含有するポリヌクレオチド、又は、（ii）配列番号16のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有し、かつ、ステビオール配糖体の13位の水酸基にグルコースを付加する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｂ）（i）配列番号17の塩基配列を含有するポリヌクレオチド、又は、（ii）配列番号18のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有し、かつ、ステビオール配糖体の19位のカルボン酸にグルコースを付加する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｃ）（i）配列番号19の塩基配列を含有するポリヌクレオチド、又は、（ii）配列番号20のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有し、かつ、ステビオール配糖体の13位のグルコースの3位に1→3結合でグルコースを付加する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｄ）（i）配列番号11若しくは13の塩基配列を含有するポリヌクレオチド、又は、（ii）配列番号12若しくは14のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有し、かつ、ステビオール配糖体の19位のグルコースに、1→2結合でグルコースを付加する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｅ）（i）配列番号19の塩基配列を含有するポリヌクレオチド、又は、（ii）配列番号20のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有し、かつ、ステビオール配糖体の19位のグルコースに、1→3結合でグルコースを付加する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ａ）（i）配列番号15の塩基配列を含有するポリヌクレオチド、又は、（ii）配列番号16のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有し、かつ、ステビオール配糖体の13位の水酸基にグルコースを付加する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｂ）（i）配列番号17の塩基配列を含有するポリヌクレオチド、又は、（ii）配列番号18のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有し、かつ、ステビオール配糖体の19位のカルボン酸にグルコースを付加する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｃ）（i）配列番号19の塩基配列を含有するポリヌクレオチド、又は、（ii）配列番号20のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有し、かつ、ステビオール配糖体の13位のグルコースの3位に1→3結合でグルコースを付加する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｄ）（i）配列番号11若しくは13の塩基配列を含有するポリヌクレオチド、又は、（ii）配列番号12若しくは14のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有し、かつ、ステビオール配糖体の19位のグルコースに、1→2結合でグルコースを付加する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｅ）（i）配列番号19の塩基配列を含有するポリヌクレオチド、又は、（ii）配列番号20のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有し、かつ、ステビオール配糖体の19位のグルコースに、1→3結合でグルコースを付加する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
ステビオール配糖体は、ラムノース基を有していれば特に限定されないが、好ましくはズルコシドA、レバウディオシドC、レバウディオシドN及びレバウディオシドO又はこれらの組み合わせからなる群より選択される。
6．ラムノース基を有するステビオール配糖体含有量に応じて植物体をスクリーニングする方法
本発明は、ラムノース基を有するステビオール配糖体含有量に応じて植物体をスクリーニングする方法（以下、「本発明のスクリーニング方法」という）を提供する。ここで、「スクリーニング」とは、ラムノース基を有するステビオール配糖体含有量が所定量以上（もしくは以下）の植物体とそれ以外の植物体とを識別し、ラムノース基を有するステビオール配糖体含有量の高い（もしくは低い）植物体を選択することを意味する。具体的には、本発明のスクリーニング方法は、ラムノース基を有するステビオール配糖体含有量の高い植物体、ラムノース基を有するステビオール配糖体含有量の低い植物体、又はラムノース基を有するステビオール配糖体を含まない植物体をスクリーニングする方法である。したがって、本発明のスクリーニング法を用いることで、ラムノース基を有さず、グルコース基のみを含むステビオール配糖体の含有量の高い植物を選択することもできる。
本発明は、ラムノース基を有するステビオール配糖体含有量に応じて植物体をスクリーニングする方法（以下、「本発明のスクリーニング方法」という）を提供する。ここで、「スクリーニング」とは、ラムノース基を有するステビオール配糖体含有量が所定量以上（もしくは以下）の植物体とそれ以外の植物体とを識別し、ラムノース基を有するステビオール配糖体含有量の高い（もしくは低い）植物体を選択することを意味する。具体的には、本発明のスクリーニング方法は、ラムノース基を有するステビオール配糖体含有量の高い植物体、ラムノース基を有するステビオール配糖体含有量の低い植物体、又はラムノース基を有するステビオール配糖体を含まない植物体をスクリーニングする方法である。したがって、本発明のスクリーニング法を用いることで、ラムノース基を有さず、グルコース基のみを含むステビオール配糖体の含有量の高い植物を選択することもできる。
本発明のスクリーニング方法は、ラムノース基を有するステビオール配糖体含有量に応じて植物体をスクリーニングする方法であって、
被検植物体から、以下の（a）〜（d）よりなる群より選ばれるポリヌクレオチドを定量する工程、及び前記ポリヌクレオチド量を基準値と比較してポリヌクレオチド量に応じて被験植物体を選別する工程を含む方法である。
（a）配列番号1、3、5、7又は9の塩基配列を含有するポリヌクレオチド；
（b）配列番号2、4、6、8又は10のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（c）配列番号2、4、6、8又は10のアミノ酸配列において、1〜33個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつグルコースからラムノースを生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（d）配列番号2、4、6、8又は10のアミノ酸配列に対して、95％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつグルコースからラムノースを生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
被検植物体から、以下の（a）〜（d）よりなる群より選ばれるポリヌクレオチドを定量する工程、及び前記ポリヌクレオチド量を基準値と比較してポリヌクレオチド量に応じて被験植物体を選別する工程を含む方法である。
（a）配列番号1、3、5、7又は9の塩基配列を含有するポリヌクレオチド；
（b）配列番号2、4、6、8又は10のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（c）配列番号2、4、6、8又は10のアミノ酸配列において、1〜33個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつグルコースからラムノースを生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（d）配列番号2、4、6、8又は10のアミノ酸配列に対して、95％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつグルコースからラムノースを生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
本発明のスクリーニング方法の好ましい態様において、ラムノース基を有するステビオール配糖体含有量に応じて植物体をスクリーニングする方法であって、
被検植物体から、以下の（a’）〜（d’）よりなる群より選ばれるポリヌクレオチドを定量する工程、及び前記ポリヌクレオチド量を基準値と比較してポリヌクレオチド量に応じて被験植物体を選別する工程を含む方法が提供される。
（a’）配列番号7又は9の塩基配列を含有するポリヌクレオチド；
（b’）配列番号8又は10のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（c’）配列番号8又は10のアミノ酸配列において、1〜33個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつグルコースからラムノースを生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（d’）配列番号8又は10のアミノ酸配列に対して、95％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつグルコースからラムノースを生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
被検植物体から、以下の（a’）〜（d’）よりなる群より選ばれるポリヌクレオチドを定量する工程、及び前記ポリヌクレオチド量を基準値と比較してポリヌクレオチド量に応じて被験植物体を選別する工程を含む方法が提供される。
（a’）配列番号7又は9の塩基配列を含有するポリヌクレオチド；
（b’）配列番号8又は10のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（c’）配列番号8又は10のアミノ酸配列において、1〜33個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつグルコースからラムノースを生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（d’）配列番号8又は10のアミノ酸配列に対して、95％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつグルコースからラムノースを生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
当該ポリヌクレオチドを定量する第1の工程は、マイクロアレイ法、RealTime PCR法、サザンブロッティング法、ノーザンブロッティング法等の公知の方法で行うことができる。
前記ポリヌクレオチド量を基準値と比較してポリヌクレオチド量に応じて被験植物体を選別する第2の工程において、「基準値」は当業者であれば適宜設定することができる。例えば、基準値とは任意のステビア植物体の一部（葉、茎、根等）に含まれる当該ポリヌクレオチドの量と定め、選別においては被験植物体の対応する部分（葉、茎、根等）に含まれる当該ポリヌクレオチドの量が前記基準値よりも多い（少ない）場合に、当該被験植物体をラムノース基を有するステビオール配糖体含有量が高い（低い）植物体として選別することができる。
あるいは、基準値とは変動的であってもよい。例えば、複数の被験植物体を比較し、そのうち1番からｎ番目（ｎは１以上の整数）に当該ポリヌクレオチド量が多かった（少なかった）被験植物体をラムノース基を有するステビオール配糖体含有量が高い（低い）植物体として選別することが可能であり、この場合は、ｎ＋１番目に当該ポリヌクレオチド量が多かった被験植物体の当該ポリヌクレオチド量が基準値となる。
前記ポリヌクレオチド量を基準値と比較してポリヌクレオチド量に応じて被験植物体を選別する第2の工程において、「基準値」は当業者であれば適宜設定することができる。例えば、基準値とは任意のステビア植物体の一部（葉、茎、根等）に含まれる当該ポリヌクレオチドの量と定め、選別においては被験植物体の対応する部分（葉、茎、根等）に含まれる当該ポリヌクレオチドの量が前記基準値よりも多い（少ない）場合に、当該被験植物体をラムノース基を有するステビオール配糖体含有量が高い（低い）植物体として選別することができる。
あるいは、基準値とは変動的であってもよい。例えば、複数の被験植物体を比較し、そのうち1番からｎ番目（ｎは１以上の整数）に当該ポリヌクレオチド量が多かった（少なかった）被験植物体をラムノース基を有するステビオール配糖体含有量が高い（低い）植物体として選別することが可能であり、この場合は、ｎ＋１番目に当該ポリヌクレオチド量が多かった被験植物体の当該ポリヌクレオチド量が基準値となる。
以下、実施例を用いて本発明をより具体的に説明するが、本発明の範囲は、これらの実施例によって限定されるものではない。
［実施例１］ラムノース合成酵素の候補遺伝子の単離
本実施例において用いる分子生物学的手法は、他で詳述しない限り、Molecular Cloning（Sambrookら, Cold Spring Harbour Laboratory Press, 2001）に記載の方法に従った。
本実施例において用いる分子生物学的手法は、他で詳述しない限り、Molecular Cloning（Sambrookら, Cold Spring Harbour Laboratory Press, 2001）に記載の方法に従った。
ステビア葉からRNeasy Plant Miniキット（QIAGEN）を用いて総RNAを抽出し、DNAase set(QIAGEN)により混在するDNAを消化した。抽出されたRNAはBioAnalyzerのRNA6000 nano chip（Agilent technologies）により品質を確認したのちに、TrueSeq Standard total RNA with RiboZero Plant Kit (Illumina)を用いて当業者が推奨する方法でcDNAライブラリーを構築した。 生成したライブラリーはBioAnalyzerのDNA1000 chip（Agilent technologies）を用いて品質を確認した後に、Cycleave PCR Quantification Kit (TaKaRa Bio)を用いて定量した。ライブラリーはHiSeq1500(Illumina)シークエンサーを用いて Pair end (2x101サイクル)シークエンスを行った。得られたリードの塩基配列は（非特許文献4）に記載の方法でTrinityプログラムを用いて、デノボアセンブルを行い、ステビア葉のEST情報を得た。
得られたステビアESTに対して、公知のAtRHM2（配列番号２１）の配列情報（非特許文献３）をクエリーとしてtBlastxによる相同性検索解析に供した。その結果、AtRHM2とDNAレベルで74％および72%の配列同一性を示す、ステビアSrRHM1#1遺伝子（配列番号１）遺伝子及びSrRHM2#1遺伝子（配列番号７）を見出した。
ステビア葉で見出されたSrRHM1遺伝子およびSrRHM2遺伝子を得るために、下記のプライマーセット（配列番号２２及び２３、並びに配列番号２４および２５）で系統の異なる複数のステビア葉から調製しcDNAを鋳型にPCRを行った。
SrRHM1-pET-FW （配列番号２２）
TGCCGCGCGGCAGCCATATGGCTACTTACGTGCCAAAG
SrRHM1-pET-RV （配列番号２３）
GTTAGCAGCCGGATCCTTAATGTTTTTTGTTAGGTTCGAATACG
SrRHM2Full-Fw （配列番号２４）
TGCCGCGCGGCAGCCATATGACCAGTTATACACCTAAAAAC
SrRHM2Full-Rv （配列番号２５）
GTTAGCAGCCGGATCCTTAGGTTGTCTTGTTGGGTGCAAATAC
ステビア葉cDNAについてはステビア葉からRNeasy Plant Miniキット（QIAGEN）を用いて総RNAを抽出し、そのうち0.5μgをRandom Oligo-dTプライマーで逆転写（RT）反応することによって得た。
SrRHM1-pET-FW （配列番号２２）
TGCCGCGCGGCAGCCATATGGCTACTTACGTGCCAAAG
SrRHM1-pET-RV （配列番号２３）
GTTAGCAGCCGGATCCTTAATGTTTTTTGTTAGGTTCGAATACG
SrRHM2Full-Fw （配列番号２４）
TGCCGCGCGGCAGCCATATGACCAGTTATACACCTAAAAAC
SrRHM2Full-Rv （配列番号２５）
GTTAGCAGCCGGATCCTTAGGTTGTCTTGTTGGGTGCAAATAC
ステビア葉cDNAについてはステビア葉からRNeasy Plant Miniキット（QIAGEN）を用いて総RNAを抽出し、そのうち0.5μgをRandom Oligo-dTプライマーで逆転写（RT）反応することによって得た。
PCR反応液（50μl）は、ステビア葉由来cDNA 1μl、1×ExTaq buffer（TaKaRaBio）、0.2mM dNTPs、プライマー各0.4pmol/μl、ExTaq polymerase 2.5Uからなる組成とした。PCR反応は、94℃で3分間反応させた後、94℃で1分間、50℃で1分間、72℃で2分間の反応を計30サイクルの増幅を行った。PCR産物を0.8％アガロースゲルによる電気泳動し、エチジウムブロマイド染色した結果、SrRHM1及びSrRHM2遺伝子のcDNAから推定された約2.0kbのサイズに増幅バンドが得られた（図２）。
この約２ｋｂのPCR産物はpET15bベクター（Novagen社）の NdeI及びBamHIのサイトにクローニングし、DNA Sequencer model 3100（Applied Biosystems）を用い、合成オリゴヌクレオチドプライマーによるプライマーウォーキング法によって配列を決定した。その結果、配列番号１のSrRHM1#1に加え、それとDNA及びアミノ酸レベルで99%の配列同一性を示すSrRHM1#2及びSrRHM1#3の計３種類のSrRHM1遺伝子が存在することが明らかとなった（配列番号３及び５）。同様にSrRHM1#1とDNAレベルおよびアミノ酸レベルで99%の配列同一性を示すSrRHM2#2が得られた（配列番号９）。なお、これらSrRHM遺伝子は本ベクターNdeIサイト上流にあるHisタグと挿入した遺伝子のオープンリーディングフレームが合っており、SrRHM1とHisタグの融合したキメラタンパク質が発現するよう設計した。
なお、シロイヌナズナのAtRHM2に対してはステビア由来SrRHM1#1、SrRHM1#2及びSrRHM1#3がDNAレベルで74%の配列同一性を示し、SrRHM2#1及び#2はDNAレベルで72%の配列同一性を示した。
［実施例2］組み換えタンパク質の発現及び精製
本発明の酵素の生化学的な機能を明らかにするために、本発明の酵素を大腸菌において発現させた。上記で得られた3種のSrRHM1遺伝子及び2種のSrRHM2の大腸菌発現用プラスミドを用い定法に従って大腸菌BL21（DE3）株を形質転換した。得られた形質転換体を、50μg/mlのアンピシリンを含むLB培地（10 g/l typtone pepton，5 g/l yeast extract，1 g/l NaCl）4 mlにて、37℃で一晩振盪培養した。静止期に達した培養液4 mlを同組成の培地80 mlに接種し、37℃で振盪培養した。菌体濁度（OD600）がおよそ0.5に達した時点で終濃度0.5 mMのIPTGを添加し、18℃で20 hr振盪培養した。
本発明の酵素の生化学的な機能を明らかにするために、本発明の酵素を大腸菌において発現させた。上記で得られた3種のSrRHM1遺伝子及び2種のSrRHM2の大腸菌発現用プラスミドを用い定法に従って大腸菌BL21（DE3）株を形質転換した。得られた形質転換体を、50μg/mlのアンピシリンを含むLB培地（10 g/l typtone pepton，5 g/l yeast extract，1 g/l NaCl）4 mlにて、37℃で一晩振盪培養した。静止期に達した培養液4 mlを同組成の培地80 mlに接種し、37℃で振盪培養した。菌体濁度（OD600）がおよそ0.5に達した時点で終濃度0.5 mMのIPTGを添加し、18℃で20 hr振盪培養した。
以下のすべての操作は4℃で行った。培養した形質転換体を遠心分離（5,000×g，10 min）にて集菌し、Buffer S［20 mM HEPESバッファー（pH 7.5），20 mM imidazol, 14 mM β-メルカプトエタノール］1 ml/g cellを添加して、懸濁した。続いて、超音波破砕（15 sec×8回）を行い，遠心分離（15,000×g，15 min）を行った。得られた上清を粗酵素液として回収した。粗酵素液をBuffer Sにて平衡化したHis SpinTrap（GE Healthcare）に負荷し、遠心（70×g，30 sec）した。Bufferで洗浄後、100mM及び 500 mMのimidazoleを含むBuffer S 各5mlにて、カラムに結合したタンパク質を段階的に溶出した。各溶出画分をMicrocon YM-30（Amicon）を用いて20 mM HEPESバッファー（pH 7.5）、14 mM β-メルカプトエタノールにバッファー置換した（透析倍率約500倍）。
調製した酵素のSDS-PAGE分離後のCBB染色及び抗HisTag抗体を用いたウエスタンブロット解析の結果、200 mM imidazole溶出画分においてSrRHM1又はSrRHM2とHisタグの融合キメラタンパク質の推定分子量の約75kDa付近にネガティブコントロール区(pET15b empty vector)で見られないタンパク質を検出したので、この画分を酵素解析に用いた（図３）。
［実施例3］酵素活性測定
標準的な酵素反応条件は以下の通りである。反応液（100 mM リン酸カリウムバッファー（pH 7.5）、5mM UDP-グルコース(基質)、2mM NADPH、5mM DTT、2mM EDTA、精製酵素溶液60μl）を蒸留水で100μlに調製し、30℃、24時間反応させた。酵素反応液5μlを下記の条件でLC-MS分析を行った。
LC condition
カラム : 東ソー TSKgel Amide-80 3μm (2.0 x 150 mm)
移動相：A: 10mM 酢酸アンモニウム水溶液,B: アセトニトリル
グラジエント：0 - 0.2 min (B conc 95% 一定),
0.2 - 14.0 min (B conc 95% → 30%),
14.0 - 14.2 min (B conc 30% → 95%)
20.0 min分析終了
流速：0.2 mL/min
カラムオーブン：４０℃
MS condition
ESI (negative mode)
MRM測定(CE 25): m/z 565.1 → 323.0 (UDP-Glucose)
m/z 549.1 → 323.0 (UDP-Rhamnose)
標準的な酵素反応条件は以下の通りである。反応液（100 mM リン酸カリウムバッファー（pH 7.5）、5mM UDP-グルコース(基質)、2mM NADPH、5mM DTT、2mM EDTA、精製酵素溶液60μl）を蒸留水で100μlに調製し、30℃、24時間反応させた。酵素反応液5μlを下記の条件でLC-MS分析を行った。
LC condition
カラム : 東ソー TSKgel Amide-80 3μm (2.0 x 150 mm)
移動相：A: 10mM 酢酸アンモニウム水溶液,B: アセトニトリル
グラジエント：0 - 0.2 min (B conc 95% 一定),
0.2 - 14.0 min (B conc 95% → 30%),
14.0 - 14.2 min (B conc 30% → 95%)
20.0 min分析終了
流速：0.2 mL/min
カラムオーブン：４０℃
MS condition
ESI (negative mode)
MRM測定(CE 25): m/z 565.1 → 323.0 (UDP-Glucose)
m/z 549.1 → 323.0 (UDP-Rhamnose)
上記の条件で酵素反応液を分析したところ、ネガティブコントロールの空ベクター実験区では保持時間約10分に基質のUDP-グルコースのみが検出された(図４−１)。一方で、ポジティブコントロールのシロイヌナズナのAtRHM2の組換えタンパク質の反応区では基質のUDP-グルコースに加え、保持時間約9.6分にUDP-ラムノースが検出された(図４−２)。
次に、組換えSrRHM1#1、SrRHM1#2、及びSrRHM1#3タンパク質をそれぞれUDP-グルコースと反応させたところ、いずれの反応区においても顕著な UDP-ラムノースの合成が確認された（図４−３、４−４、及び４−５）。
同様にSrRHM2についても活性評価を行った。SrRHM2#1, SrRHM2#2タンパク質をそれぞれUDP-グルコースと反応させたところ、いずれの反応区においても顕著な UDP-ラムノースの合成が確認された（図４−６，４−７）。
次に、これらの組換えタンパク質の比活性を評価した。反応後の残存UDP-グルコース量と反応により生成したUDP-ラムノース量の合計を１と基準化した。その結果、本発明の組換えタンパク質（SrRHM1#1、SrRHM1#2、及びSrRHM1#3タンパク質並びにSrRHM2#1及びSrRHM2#2タンパク質）は、シロイヌナズナのAtRHM2の組換えタンパク質よりも高いラムノース生成活性を有することが確認された。また、SrRHM2系の方がSrRHM1系よりもラムノース生成量が高い傾向があること確認できた（図５）。
次に、組換えSrRHM1#1、SrRHM1#2、及びSrRHM1#3タンパク質をそれぞれUDP-グルコースと反応させたところ、いずれの反応区においても顕著な UDP-ラムノースの合成が確認された（図４−３、４−４、及び４−５）。
同様にSrRHM2についても活性評価を行った。SrRHM2#1, SrRHM2#2タンパク質をそれぞれUDP-グルコースと反応させたところ、いずれの反応区においても顕著な UDP-ラムノースの合成が確認された（図４−６，４−７）。
次に、これらの組換えタンパク質の比活性を評価した。反応後の残存UDP-グルコース量と反応により生成したUDP-ラムノース量の合計を１と基準化した。その結果、本発明の組換えタンパク質（SrRHM1#1、SrRHM1#2、及びSrRHM1#3タンパク質並びにSrRHM2#1及びSrRHM2#2タンパク質）は、シロイヌナズナのAtRHM2の組換えタンパク質よりも高いラムノース生成活性を有することが確認された。また、SrRHM2系の方がSrRHM1系よりもラムノース生成量が高い傾向があること確認できた（図５）。
以上の結果より、SrRHM1#1、SrRHM1#2、及びSrRHM1#3タンパク質並びにSrRHM2#1及びSrRHM2#2タンパク質はステビア葉において発現しているUDP-ラムノース合成酵素であることが示された。したがって、これらの酵素が、ステビアにおいてラムノース基を有するズルコシドA、レバウディオシドC、レバウディオシドN及びレバウディオシドOなどの合成に関与しているものと考えられる。
［実施例4］遺伝子発現解析
今回活性の見られた二つのSrRHM遺伝子の発現について、RebCを含有する独立したステビア植物体（１，２）およびRebCが検出されないステビア植物体（３，４）の葉において発現の有無をRT-PCR法によって解析した。
SrRHM1については配列番号２２および２３、SrRHM2については配列番号２４、２５のプライマーセットにより実施例１と同じ条件で、32サイクル増幅した。内部標準遺伝子としてステビアのアクチン遺伝子(SrACTIN)を用い、配列番号２６および２７のプライマーセットにより増幅した（２３サイクル）。
SrRHM1-pET-FW （配列番号２２）
TGCCGCGCGGCAGCCATATGGCTACTTACGTGCCAAAG
SrRHM1-pET-RV （配列番号２３）
GTTAGCAGCCGGATCCTTAATGTTTTTTGTTAGGTTCGAATACG
SrRHM2Full-Fw （配列番号２４）
TGCCGCGCGGCAGCCATATGACCAGTTATACACCTAAAAAC
SrRHM2Full-Rv （配列番号２５）
GTTAGCAGCCGGATCCTTAGGTTGTCTTGTTGGGTGCAAATAC
SrACTIN-Fw （配列番号２６）
ATGGCCGATACTGAGGATATTCAG
SrACTIN-Rv （配列番号２７）
AGCACTTCCTGTGGACAATGGA
その結果、RebCが検出されないステビア植物体（３，４）において特異的にSrRHM2の遺伝子発現が減少していることが確認された(図６)。したがって、ステビア葉においてステビオール配糖体のラムノース転移に利用されているUDP-ラムノースは主にSrRHM2によって供給されていることが示された。
今回活性の見られた二つのSrRHM遺伝子の発現について、RebCを含有する独立したステビア植物体（１，２）およびRebCが検出されないステビア植物体（３，４）の葉において発現の有無をRT-PCR法によって解析した。
SrRHM1については配列番号２２および２３、SrRHM2については配列番号２４、２５のプライマーセットにより実施例１と同じ条件で、32サイクル増幅した。内部標準遺伝子としてステビアのアクチン遺伝子(SrACTIN)を用い、配列番号２６および２７のプライマーセットにより増幅した（２３サイクル）。
SrRHM1-pET-FW （配列番号２２）
TGCCGCGCGGCAGCCATATGGCTACTTACGTGCCAAAG
SrRHM1-pET-RV （配列番号２３）
GTTAGCAGCCGGATCCTTAATGTTTTTTGTTAGGTTCGAATACG
SrRHM2Full-Fw （配列番号２４）
TGCCGCGCGGCAGCCATATGACCAGTTATACACCTAAAAAC
SrRHM2Full-Rv （配列番号２５）
GTTAGCAGCCGGATCCTTAGGTTGTCTTGTTGGGTGCAAATAC
SrACTIN-Fw （配列番号２６）
ATGGCCGATACTGAGGATATTCAG
SrACTIN-Rv （配列番号２７）
AGCACTTCCTGTGGACAATGGA
その結果、RebCが検出されないステビア植物体（３，４）において特異的にSrRHM2の遺伝子発現が減少していることが確認された(図６)。したがって、ステビア葉においてステビオール配糖体のラムノース転移に利用されているUDP-ラムノースは主にSrRHM2によって供給されていることが示された。
[実施例5]酵母を用いたＵＤＰ−ラムノースの発酵生産
次に得られたSrRHM１およびSrRHM2を使って、酵母にてＵＤＰ‐ラムノースの合成ができるかを検討した。
次に得られたSrRHM１およびSrRHM2を使って、酵母にてＵＤＰ‐ラムノースの合成ができるかを検討した。
酵母用発現ベクターの構築
UDP-ラムノース合成酵素遺伝子を酵母発現ベクターに組み込むために下記のプライマーセットを設計した。
StRHM1セット
Apa-SrRHM1-F（下線部ApaI認識部位）：
5’- GGGCCCATGGCTACTTACGTGCCAAAG -3’ （配列番号２８）
Xho- SrRHM1-R（下線部XhoI認識部位）：
5’- CTCGAGTTAATGTTTTTTGTTAGGTTCGAATACG-3’ （配列番号２９）
StRHM2セット
Bam-SrRHM2-F（下線部ApaI認識部位）：
5’- GGATCCATGACCAGTTATACACCTAAAAACATCC -3’ （配列番号３０）
Xho- SrRHM2-R（下線部XhoI認識部位）：
5’- CTCGAGTTAGGTTGTCTTGTTGGGTGC -3’ （配列番号３１）
UDP-ラムノース合成酵素遺伝子を酵母発現ベクターに組み込むために下記のプライマーセットを設計した。
StRHM1セット
Apa-SrRHM1-F（下線部ApaI認識部位）：
5’- GGGCCCATGGCTACTTACGTGCCAAAG -3’ （配列番号２８）
Xho- SrRHM1-R（下線部XhoI認識部位）：
5’- CTCGAGTTAATGTTTTTTGTTAGGTTCGAATACG-3’ （配列番号２９）
StRHM2セット
Bam-SrRHM2-F（下線部ApaI認識部位）：
5’- GGATCCATGACCAGTTATACACCTAAAAACATCC -3’ （配列番号３０）
Xho- SrRHM2-R（下線部XhoI認識部位）：
5’- CTCGAGTTAGGTTGTCTTGTTGGGTGC -3’ （配列番号３１）
SrRHM1を鋳型としてSrRHM1セット、SrRHM2を鋳型としてSrRHM2セットの鋳型とプライマーの組み合わせで、耐熱性KOD DNAポリメラーゼ（東洋紡）を用いて、PCRにより増幅し、それぞれのORFの両端に制限酵素サイトを付加した。得られたDNA断片を、ゼロBlunt-TOPO PCRクローニングキット（インビトロジェン）を用いてサブクローニングし、DNA Sequencer model 3100（Applied Biosystems）を用い、合成オリゴヌクレオチドプライマーによるプライマーウォーキング法によって配列を決定し、目的のUGT遺伝子がそれぞれクローン化されていることを確認した。
pESC酵母発現システム（ストラタジーン）を用いて、上記遺伝子を酵母で発現させるために、次の発現ベクターを構築した。
・ プラスミドpESC-TRP-SrRHM1の構築
SrRHM1を制限酵素ApaIとXhoIで切り出し、ベクターpESC-TRP（ストラタジーン）を制限酵素ApaIと制限酵素XhoIで切断したものと連結して、プラスミドpESC-TRP-SrRHM1を得た。
・ プラスミドpESC-TRP-SrRHM2の構築
SrRHM2を制限酵素BamHIとXhoIで切り出し、ベクターpESC-TRP（ストラタジーン）を制限酵素BamHIと制限酵素XhoIで切断したものと連結して、プラスミドpESC-TRP-SrRHM2を得た。
・ プラスミドpESC-TRP-SrRHM1の構築
SrRHM1を制限酵素ApaIとXhoIで切り出し、ベクターpESC-TRP（ストラタジーン）を制限酵素ApaIと制限酵素XhoIで切断したものと連結して、プラスミドpESC-TRP-SrRHM1を得た。
・ プラスミドpESC-TRP-SrRHM2の構築
SrRHM2を制限酵素BamHIとXhoIで切り出し、ベクターpESC-TRP（ストラタジーン）を制限酵素BamHIと制限酵素XhoIで切断したものと連結して、プラスミドpESC-TRP-SrRHM2を得た。
酵母の形質転換
Saccharomyces cerevisiae YPH499株（ura3-52 lys2-801amber ade2-101ochre trp1-Δ63 his3-Δ200 leu2-Δ1 a）を宿主として、酢酸リチウム法で、プラスミドpESC-TRP-SrRHM1、pESC-TRP-SrRHM2、により形質転換した。形質転換株として、SC-Trp寒天培地（1Lあたり、Yeast nitrogen baase without amino acids 6.7g、グルコース 20g、アミノ酸ミックスパウダー-Trp 1.3g、Bacto agar 20g）で生育するものを選抜した。なお、アミノ酸ミックスパウダー-Trpは、アデニン硫酸塩 2.5g、L-アルギニン塩酸塩 1.2g、L-アスパラギン酸 6.0g、L-グルタミン酸 6.0g、L-ヒスチジン 1.2ｇ、L-ロイシン3.6g、L-リジン 1.8g、L-メチオニン 1.2g、L-フェニルアラニン 3.0g、L-セリン 22.5g、L-スレオニン12g、L-チロシン 1.8g、L-バリン 9.0g、ウラシル1.2ｇを混ぜて調製した。一方、ベクターpESC-TRPにより、上記と同様の方法で形質転換した株をコントロール株（C-1株）とした。
Saccharomyces cerevisiae YPH499株（ura3-52 lys2-801amber ade2-101ochre trp1-Δ63 his3-Δ200 leu2-Δ1 a）を宿主として、酢酸リチウム法で、プラスミドpESC-TRP-SrRHM1、pESC-TRP-SrRHM2、により形質転換した。形質転換株として、SC-Trp寒天培地（1Lあたり、Yeast nitrogen baase without amino acids 6.7g、グルコース 20g、アミノ酸ミックスパウダー-Trp 1.3g、Bacto agar 20g）で生育するものを選抜した。なお、アミノ酸ミックスパウダー-Trpは、アデニン硫酸塩 2.5g、L-アルギニン塩酸塩 1.2g、L-アスパラギン酸 6.0g、L-グルタミン酸 6.0g、L-ヒスチジン 1.2ｇ、L-ロイシン3.6g、L-リジン 1.8g、L-メチオニン 1.2g、L-フェニルアラニン 3.0g、L-セリン 22.5g、L-スレオニン12g、L-チロシン 1.8g、L-バリン 9.0g、ウラシル1.2ｇを混ぜて調製した。一方、ベクターpESC-TRPにより、上記と同様の方法で形質転換した株をコントロール株（C-1株）とした。
導入遺伝子の発現誘導と発現解析
得られた形質転換株を以下の通り培養した。
まず、前培養としてSC-Trp液体培地（SC- Trp寒天培地のBacto agarを除く）10 mlに、それぞれの形質転換株を植菌し、30℃で1日間振とう培養した。次に、本培養として前培養液のうち、1 mlを10 mlのSG-Trp液体培地（1Lあたり、Yeast nitrogen baase without amino acids 6.7g、ガラクトース 20g、アミノ酸ミックスパウダー-Trp 1.3g）に植菌し、30℃で2日間振とう培養した。
得られた形質転換株を以下の通り培養した。
まず、前培養としてSC-Trp液体培地（SC- Trp寒天培地のBacto agarを除く）10 mlに、それぞれの形質転換株を植菌し、30℃で1日間振とう培養した。次に、本培養として前培養液のうち、1 mlを10 mlのSG-Trp液体培地（1Lあたり、Yeast nitrogen baase without amino acids 6.7g、ガラクトース 20g、アミノ酸ミックスパウダー-Trp 1.3g）に植菌し、30℃で2日間振とう培養した。
形質転換株で導入した遺伝子が発現したかどうかを確認するため、培養液から菌体を集め、RNeasy Mini Kitを用いて、トータルRNAを精製した。
トータルRNA 1μgをとり、スーパースクリプトII逆転写酵素（サーモフィッシャーサイエンティフィック）、ランダムヘキサマーをプライマーとして、cDNAを合成した。
トータルRNA 1μgをとり、スーパースクリプトII逆転写酵素（サーモフィッシャーサイエンティフィック）、ランダムヘキサマーをプライマーとして、cDNAを合成した。
導入遺伝子の発現を確認するために、以下のプライマーを作成した。
SrRHM1発現確認用
SrRHM1-r1
5’- CGAGTTAGGTATTTGGACACCA-3’ （配列番号３２）
SrRHM2発現確認用
SrRHM2-r1
5’- TACCGGGTCCTGAAAGATGAC-3’ （配列番号３３）
GAL10p領域 （プロモーター領域）
PGAL10-f3：
5’-GATTATTAAACTTCTTTGCGTCCATCCA-3’ （配列番号３４）
SrRHM1発現確認用
SrRHM1-r1
5’- CGAGTTAGGTATTTGGACACCA-3’ （配列番号３２）
SrRHM2発現確認用
SrRHM2-r1
5’- TACCGGGTCCTGAAAGATGAC-3’ （配列番号３３）
GAL10p領域 （プロモーター領域）
PGAL10-f3：
5’-GATTATTAAACTTCTTTGCGTCCATCCA-3’ （配列番号３４）
各導入遺伝子が発現していることは、以下のプライマーの組み合わせで、先に合成したcDNAを鋳型として、ExTaq（タカラバイオ）を用いてPCRを行い、その産物をアガロースゲル電気泳動により確認した。
SrRHM1：SrRHM1-r1（配列番号３２）とPGAL10-f3（配列番号３４）
SrRHM2：SrRHM2-r1（配列番号３３）とPGAL10-f3（配列番号３４）
導入した遺伝子が発現していることが確認できた株をそれぞれSR1-1株、SR2-１株とした。
SrRHM1：SrRHM1-r1（配列番号３２）とPGAL10-f3（配列番号３４）
SrRHM2：SrRHM2-r1（配列番号３３）とPGAL10-f3（配列番号３４）
導入した遺伝子が発現していることが確認できた株をそれぞれSR1-1株、SR2-１株とした。
UDP-糖の分析
上記の発現解析についての操作と同様に培養して得られた１０ｍｌ培養液より、遠心分離により回収した酵母菌体に、氷冷した１Mぎ酸（1−ブタノール飽和）を１５ｍｌ添加し、４℃で1時間緩やかに撹拌した。遠心分離により菌体を除いた上清を凍結乾燥した。得られた凍結乾燥物を200μｌの水に溶解し、HPLCに供した。
上記の発現解析についての操作と同様に培養して得られた１０ｍｌ培養液より、遠心分離により回収した酵母菌体に、氷冷した１Mぎ酸（1−ブタノール飽和）を１５ｍｌ添加し、４℃で1時間緩やかに撹拌した。遠心分離により菌体を除いた上清を凍結乾燥した。得られた凍結乾燥物を200μｌの水に溶解し、HPLCに供した。
HPLC条件は以下のとおりである。
カラム：COSMOSIL(R) ５C１８−ARII（4.6mml.D x 250mm）
カラム温度：40℃
移動相：20ｍM トリエチルアミンアセテート（pH7.0）、流速：1ml/min
検出：UV260
その結果、C-1株では、UDP-ラムノースの生成が確認できなかったのに対し、SR1-1株、SR2-１株ともに、UDP-ラムノースの生成が確認できた。
カラム：COSMOSIL(R) ５C１８−ARII（4.6mml.D x 250mm）
カラム温度：40℃
移動相：20ｍM トリエチルアミンアセテート（pH7.0）、流速：1ml/min
検出：UV260
その結果、C-1株では、UDP-ラムノースの生成が確認できなかったのに対し、SR1-1株、SR2-１株ともに、UDP-ラムノースの生成が確認できた。
［実施例６］酵母を用いたＲｅｂＣの生成
ステビア由来配糖化酵素遺伝子cDNAのクローニング
cDNAのクローニングには、それぞれ下記のプライマーセットを用いた。
UGT85C2遺伝子増幅用プライマーセット
CACC-NdeI-SrUGT85C2-Fw（下線部NdeI認識部位）：
5’-CACCCATATGGATGCAATGGCTACAACTGAGAA-3’（配列番号３５）
BglII-SrUGT85C2-Rv（下線部BglII認識部位）：
5’-AGATCTCTAGTTTCTTGCTAGCACGGTGATTT-3’（配列番号３６）
UGT91D2及びUGT91D2#16遺伝子増幅用プライマーセット
SrUGT91D2-pET15b-FW
5’-TGCCGCGCGGCAGCCATATGTACAACGTTACTTATCATC-3’（配列番号３７）
SrUGT91D2-pET15b-RV
5’-GTTAGCAGCCGGATCCTTAACTCTCATGATCGATGGCAA-3’（配列番号３８）
UGT74G1遺伝子増幅用プライマーセット
CACC-NdeI-SrUGT74G1-Fw（下線部NdeI認識部位）：
5’-CACCCATATGGCGGAACAACAAAAGATCAAGAAAT-3’ （配列番号３９）
BamHI-SrUGT74G1-Rv（下線部BamHI認識部位）：
5’-GGATCCTTAAGCCTTAATTAGCTCACTTACAAATT-3’ （配列番号４０）
UGT76G1遺伝子増幅用プライマーセット
CACC-NdeI-SrUGT76G1-Fw（下線部NdeI認識部位）：
5’-CACCCATATGGAAAATAAAACGGAGACCA-3’ （配列番号４１）
BamHI-SrUGT76G1-Rv（下線部BamHI認識部位）：
5’-GGATCCTTACAACGATGAAATGTAAGAAACTA-3’ （配列番号４２）
ステビア由来配糖化酵素遺伝子cDNAのクローニング
cDNAのクローニングには、それぞれ下記のプライマーセットを用いた。
UGT85C2遺伝子増幅用プライマーセット
CACC-NdeI-SrUGT85C2-Fw（下線部NdeI認識部位）：
5’-CACCCATATGGATGCAATGGCTACAACTGAGAA-3’（配列番号３５）
BglII-SrUGT85C2-Rv（下線部BglII認識部位）：
5’-AGATCTCTAGTTTCTTGCTAGCACGGTGATTT-3’（配列番号３６）
UGT91D2及びUGT91D2#16遺伝子増幅用プライマーセット
SrUGT91D2-pET15b-FW
5’-TGCCGCGCGGCAGCCATATGTACAACGTTACTTATCATC-3’（配列番号３７）
SrUGT91D2-pET15b-RV
5’-GTTAGCAGCCGGATCCTTAACTCTCATGATCGATGGCAA-3’（配列番号３８）
UGT74G1遺伝子増幅用プライマーセット
CACC-NdeI-SrUGT74G1-Fw（下線部NdeI認識部位）：
5’-CACCCATATGGCGGAACAACAAAAGATCAAGAAAT-3’ （配列番号３９）
BamHI-SrUGT74G1-Rv（下線部BamHI認識部位）：
5’-GGATCCTTAAGCCTTAATTAGCTCACTTACAAATT-3’ （配列番号４０）
UGT76G1遺伝子増幅用プライマーセット
CACC-NdeI-SrUGT76G1-Fw（下線部NdeI認識部位）：
5’-CACCCATATGGAAAATAAAACGGAGACCA-3’ （配列番号４１）
BamHI-SrUGT76G1-Rv（下線部BamHI認識部位）：
5’-GGATCCTTACAACGATGAAATGTAAGAAACTA-3’ （配列番号４２）
PCR反応液（50μl）は、ステビア葉由来cDNA 1μl、1×KOD plus buffer（TOYOBO）、0.2mM dNTPs、プライマー各0.4pmol/μl、1mM MgSO4, 1U 耐熱性 KOD plus polymeraseからなる組成とした。PCR反応は、95℃で5分間反応させた後、94℃で0.5分間、50℃で0.5分間、68℃で2分間の反応を計30サイクルの増幅を行った。各PCR産物を0.8％アガロースゲルによる電気泳動し、エチジウムブロマイド染色した結果、それぞれの鋳型DNAから推定された約1.4kbのサイズに増幅バンドが得られた。
このPCR産物はpENTR-TOPO Directionalベクター（Invitrogen）に製造業者が推奨する方法でサブクローニングした。DNA Sequencer model 3100（Applied Biosystems）を用い、合成オリゴヌクレオチドプライマーによるプライマーウォーキング法によって配列を決定し、目的のUGT遺伝子、すなわちUGT85C2、UGT91D2及びUGT91D2#16、UGT74G1、UGT76G1の全てのUGT遺伝子がクローニングできたことを確認した。
酵母用発現ベクターの構築
これらのUGT遺伝子およびUDP-ラムノース合成酵素遺伝子を酵母発現ベクターに組み込むために下記のプライマーセットを設計した。
SrUGT85C2セット
Bgl2-UGT85C2-F（下線部BglII認識部位）：
5’-ACAGATCTATGGATGCAATGGCTACAACTGAGA-3’ （配列番号４３）
Sal-UGT85C2-R（下線部SalI認識部位）：
5’-TAGTCGACTAGTTTCTTGCTAGCACGGTGATTTC-3’ （配列番号４４）
SrUGT91D2セット
NotI-UGT91DIL3-F（下線部NotI認識部位）：
5’-AAGCGGCCGCATGTACAACGTTACTTATCATCAAAATTCAAA-3’ （配列番号４５）
Pac-UGT91D1L3-R（下線部PacI認識部位）：
5’-CGTTAATTAACTCTCATGATCGATGGCAACC-3’ （配列番号４６）
SrUGT74G1セット
Not-UGT74G1-F（下線部NotI認識部位）：
5’-AAGCGGCCGCATGGCGGAACAACAAAAGATCAAG-3’ （配列番号４７）
Pac-UGT74G1-R（下線部PacI認識部位）：
5’-CGTTAATTAAGCCTTAATTAGCTCACTTACAAATTCG-3’ （配列番号４８）
SrUGT76G1セット
Bam-UGT76G1-F(下線部BamHI認識部位）：
5’-AAGGATCCATGGAAAATAAAACGGAGACCACCG-3’ （配列番号４９）
Sal-UGT76G1-R(下線部SalI認識部位）：
5’-GCGTCGACTTACAACGATGAAATGTAAGAAACTAGAGACTCTAA-3’ （配列番号５０）
これらのUGT遺伝子およびUDP-ラムノース合成酵素遺伝子を酵母発現ベクターに組み込むために下記のプライマーセットを設計した。
SrUGT85C2セット
Bgl2-UGT85C2-F（下線部BglII認識部位）：
5’-ACAGATCTATGGATGCAATGGCTACAACTGAGA-3’ （配列番号４３）
Sal-UGT85C2-R（下線部SalI認識部位）：
5’-TAGTCGACTAGTTTCTTGCTAGCACGGTGATTTC-3’ （配列番号４４）
SrUGT91D2セット
NotI-UGT91DIL3-F（下線部NotI認識部位）：
5’-AAGCGGCCGCATGTACAACGTTACTTATCATCAAAATTCAAA-3’ （配列番号４５）
Pac-UGT91D1L3-R（下線部PacI認識部位）：
5’-CGTTAATTAACTCTCATGATCGATGGCAACC-3’ （配列番号４６）
SrUGT74G1セット
Not-UGT74G1-F（下線部NotI認識部位）：
5’-AAGCGGCCGCATGGCGGAACAACAAAAGATCAAG-3’ （配列番号４７）
Pac-UGT74G1-R（下線部PacI認識部位）：
5’-CGTTAATTAAGCCTTAATTAGCTCACTTACAAATTCG-3’ （配列番号４８）
SrUGT76G1セット
Bam-UGT76G1-F(下線部BamHI認識部位）：
5’-AAGGATCCATGGAAAATAAAACGGAGACCACCG-3’ （配列番号４９）
Sal-UGT76G1-R(下線部SalI認識部位）：
5’-GCGTCGACTTACAACGATGAAATGTAAGAAACTAGAGACTCTAA-3’ （配列番号５０）
UGT85C2を鋳型としてSrUGT85C2セット、UGT91D2又はUGT91D2L＃16を鋳型としてSrUGT91D2セット、UGT74G1を鋳型としてSrUGT74G1セット、UGT76G1を鋳型としてSrUGT76G1セット、AtAHM2を鋳型としてAtAHM2セットの鋳型とプライマーの組み合わせで、耐熱性KOD DNAポリメラーゼ（東洋紡）を用いて、PCRにより増幅し、それぞれのORFの両端に制限酵素サイトを付加した。得られたDNA断片を、ゼロBlunt-TOPO PCRクローニングキット（インビトロジェン）を用いてサブクローニングし、DNA Sequencer model 3100（Applied Biosystems）を用い、合成オリゴヌクレオチドプライマーによるプライマーウォーキング法によって配列を決定し、目的のUGT遺伝子がそれぞれクローン化されていることを確認した。
pESC酵母発現システム（ストラタジーン）を用いて、上記遺伝子を酵母で発現させるために、次の発現ベクターを構築した。
（1）プラスミドpESC-URA-UGT56又はpESC-URA-UGT56Rの構築
UGT85C2を制限酵素BglIIと制限酵素SalIで切り出し、ベクターpESC-URA（ストラタジーン）を制限酵素BamHIと制限酵素SalIで切断したものと連結して、プラスミドpESC-URA-UGT-1を得た。このプラスミドpESC-URA-UGT-1を制限酵素NotIと制限酵素PacIで切断したものと、UGT91D2又はUGT91D2L＃16を制限酵素NotIと制限酵素PacIで切り出したものを連結し、pESC-URA-UGT56又はpESC-URA-UGT56Rを得た。
（2）プラスミドpESC-HIS-UGT78の構築
UGT76G1を制限酵素BamHIと制限酵素SalIで切り出し、ベクターpESC-HIS（ストラタジーン）を同じ制限酵素で切断したものを連結し、プラスミドpESC-HIS-UGT-8を得た。このプラスミドpESC-HIS-UGT-8を制限酵素NotIと制限酵素PacIで切断したものと、UGT74G1をNotIとPacIで切り出したものを連結し、pESC-HIS-UGT78を得た。
（1）プラスミドpESC-URA-UGT56又はpESC-URA-UGT56Rの構築
UGT85C2を制限酵素BglIIと制限酵素SalIで切り出し、ベクターpESC-URA（ストラタジーン）を制限酵素BamHIと制限酵素SalIで切断したものと連結して、プラスミドpESC-URA-UGT-1を得た。このプラスミドpESC-URA-UGT-1を制限酵素NotIと制限酵素PacIで切断したものと、UGT91D2又はUGT91D2L＃16を制限酵素NotIと制限酵素PacIで切り出したものを連結し、pESC-URA-UGT56又はpESC-URA-UGT56Rを得た。
（2）プラスミドpESC-HIS-UGT78の構築
UGT76G1を制限酵素BamHIと制限酵素SalIで切り出し、ベクターpESC-HIS（ストラタジーン）を同じ制限酵素で切断したものを連結し、プラスミドpESC-HIS-UGT-8を得た。このプラスミドpESC-HIS-UGT-8を制限酵素NotIと制限酵素PacIで切断したものと、UGT74G1をNotIとPacIで切り出したものを連結し、pESC-HIS-UGT78を得た。
酵母の形質転換
Saccharomyces cerevisiae YPH499株（ura3-52 lys2-801amber ade2-101ochre trp1-Δ63 his3-Δ200 leu2-Δ1 a）を宿主として、酢酸リチウム法で、表１のプラスミドを導入した。形質転換株として、SC-Trp&Ura＆His寒天培地（1Lあたり、Yeast nitrogen baase without amino acids 6.7g、グルコース 20g、アミノ酸ミックスパウダー-Trp&Ura&His 1.3g、Bacto agar 20g）で生育するものを選抜した。
Saccharomyces cerevisiae YPH499株（ura3-52 lys2-801amber ade2-101ochre trp1-Δ63 his3-Δ200 leu2-Δ1 a）を宿主として、酢酸リチウム法で、表１のプラスミドを導入した。形質転換株として、SC-Trp&Ura＆His寒天培地（1Lあたり、Yeast nitrogen baase without amino acids 6.7g、グルコース 20g、アミノ酸ミックスパウダー-Trp&Ura&His 1.3g、Bacto agar 20g）で生育するものを選抜した。
なお、アミノ酸ミックスパウダー-Trp&Ura&Hisは、アデニン硫酸塩 2.5g、L-アルギニン塩酸塩 1.2g、L-アスパラギン酸 6.0g、L-グルタミン酸 6.0g、L-ロイシン3.6g、L-リジン 1.8g、L-メチオニン 1.2g、L-フェニルアラニン 3.0g、L-セリン 22.5g、L-スレオニン12g、L-チロシン 1.8g、L-バリン 9.0gを混ぜて調製した。
導入遺伝子の発現誘導と発現解析
得られた形質転換株を以下の通り培養した。
まず、前培養としてSC-Trp&Ura&His液体培地（SC- Trp&Ura&His寒天培地のBacto agarを除く）10 mlに、それぞれの形質転換株を植菌し、30℃で1日間振とう培養した。次に、本培養として前培養液のうち、1 mlを10 mlのSG-Trp&Ura&His液体培地（1Lあたり、Yeast nitrogen baase without amino acids 6.7g、ガラクトース 20g、アミノ酸ミックスパウダー-Trp&Ura&His 1.3g）に植菌し、30℃で2日間振とう培養した。
形質転換株で導入した遺伝子が発現したかどうかを確認するため、培養液から菌体を集め、RNeasy Mini Kitを用いて、トータルRNAを精製した。
トータルRNA 1μgをとり、スーパースクリプトII逆転写酵素（サーモフィッシャーサイエンティフィック）、ランダムヘキサマーをプライマーとして、cDNAを合成した。
得られた形質転換株を以下の通り培養した。
まず、前培養としてSC-Trp&Ura&His液体培地（SC- Trp&Ura&His寒天培地のBacto agarを除く）10 mlに、それぞれの形質転換株を植菌し、30℃で1日間振とう培養した。次に、本培養として前培養液のうち、1 mlを10 mlのSG-Trp&Ura&His液体培地（1Lあたり、Yeast nitrogen baase without amino acids 6.7g、ガラクトース 20g、アミノ酸ミックスパウダー-Trp&Ura&His 1.3g）に植菌し、30℃で2日間振とう培養した。
形質転換株で導入した遺伝子が発現したかどうかを確認するため、培養液から菌体を集め、RNeasy Mini Kitを用いて、トータルRNAを精製した。
トータルRNA 1μgをとり、スーパースクリプトII逆転写酵素（サーモフィッシャーサイエンティフィック）、ランダムヘキサマーをプライマーとして、cDNAを合成した。
導入遺伝子の発現を確認するために、以下のプライマーを作製した。
UGT85C2発現確認用
UGT85C2-r1：
5’-CAAGTCCCCAACCAAATTCCGT-3’ （配列番号５１）
UGT91D2およびUGT91D2L3#16発現確認用
UGT91D1L3-r1：
5’-CACGAACCCGTCTGGCAACTC-3’ （配列番号５２）
UGT74G1発現確認用
UGT74G1-r1：
5’-CCCGTGTGATTTCTTCCACTTGTTC-3’ （配列番号５３）
UGT76G1発現確認用
UGT76G1-r1：
5’-CAAGAACCCATCTGGCAACGG-3’ （配列番号５４）
GAL10p領域 （プロモーター領域）
PGAL10-f3：
5’-GATTATTAAACTTCTTTGCGTCCATCCA-3’ （配列番号５５）
GAL1p領域（プロモーター領域）
PGAL1-f3：
5’-CCTCTATACTTTAACGTCAAGGAGAAAAAACC-3’ （配列番号５６）
UGT85C2発現確認用
UGT85C2-r1：
5’-CAAGTCCCCAACCAAATTCCGT-3’ （配列番号５１）
UGT91D2およびUGT91D2L3#16発現確認用
UGT91D1L3-r1：
5’-CACGAACCCGTCTGGCAACTC-3’ （配列番号５２）
UGT74G1発現確認用
UGT74G1-r1：
5’-CCCGTGTGATTTCTTCCACTTGTTC-3’ （配列番号５３）
UGT76G1発現確認用
UGT76G1-r1：
5’-CAAGAACCCATCTGGCAACGG-3’ （配列番号５４）
GAL10p領域 （プロモーター領域）
PGAL10-f3：
5’-GATTATTAAACTTCTTTGCGTCCATCCA-3’ （配列番号５５）
GAL1p領域（プロモーター領域）
PGAL1-f3：
5’-CCTCTATACTTTAACGTCAAGGAGAAAAAACC-3’ （配列番号５６）
各導入遺伝子が発現していることは、以下のプライマーの組み合わせで、先に合成したcDNAを鋳型として、ExTaq（タカラバイオ）を用いてPCRを行い、その産物をアガロースゲル電気泳動により確認した。
UGT85C2：UGT85C2-r1（配列番号５１）とPGAL1-f3（配列番号５６）
UGT91D2又はUGT91D2L3：UGT91D1L3-r1（配列番号５２）とPGAL10-f3（配列番号５５）
UGT74G1：UGT74G1-r1（配列番号５３）とPGAL1-f3（配列番号５６）
UGT76G1：UGT76G1-r1（配列番号５４）とPGAL10-f3（配列番号５５）
これにより、形質転換株で、導入した遺伝子が発現していることが確認できた。
UGT85C2：UGT85C2-r1（配列番号５１）とPGAL1-f3（配列番号５６）
UGT91D2又はUGT91D2L3：UGT91D1L3-r1（配列番号５２）とPGAL10-f3（配列番号５５）
UGT74G1：UGT74G1-r1（配列番号５３）とPGAL1-f3（配列番号５６）
UGT76G1：UGT76G1-r1（配列番号５４）とPGAL10-f3（配列番号５５）
これにより、形質転換株で、導入した遺伝子が発現していることが確認できた。
ステビオール配糖体の生産
培養は、SG-Trp&Ura&His液体培地に培地1 mlあたり2μｇのステビオール（ChromaDex Inc.）を添加した以外は、上記実施例５と同様の条件で行った。培養終了後、培養液を遠心分離により、上清と菌体に分離した。培養上清を、アセトニトリルで洗浄後、水で平衡化したSep-Pak C18カラムに供し、20％ アセトニトリルで洗浄後、80％アセトニトリルで溶出し、乾固後、少量の80％ アセトニトリルに溶解して配糖体サンプルを調製した。この配糖体サンプルを以下の分析に供した。
培養は、SG-Trp&Ura&His液体培地に培地1 mlあたり2μｇのステビオール（ChromaDex Inc.）を添加した以外は、上記実施例５と同様の条件で行った。培養終了後、培養液を遠心分離により、上清と菌体に分離した。培養上清を、アセトニトリルで洗浄後、水で平衡化したSep-Pak C18カラムに供し、20％ アセトニトリルで洗浄後、80％アセトニトリルで溶出し、乾固後、少量の80％ アセトニトリルに溶解して配糖体サンプルを調製した。この配糖体サンプルを以下の分析に供した。
HPLCによる分析
得られたステビオール配糖体をHPLCによって分析した。条件は以下のとおりである。
カラム：コスモシール５Ｃ１８−ＡＲ−ＩＩ ４．６ｍｍＩ．Ｄ．ｘ２５０ｍｍ（ナカライテスク）
移動相：Ａ；アセトニトリル、Ｂ；10mM リン酸ナトリウムバッファー（pH2.6）
Ｂ ｃｏｎｃ．７０％→３０％ ４０分 ｌｉｎｅａｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ
流速：１ｍｌ／分
温度：４０℃
検出：ＵＶ ２１０ｎｍ
得られたステビオール配糖体をHPLCによって分析した。条件は以下のとおりである。
カラム：コスモシール５Ｃ１８−ＡＲ−ＩＩ ４．６ｍｍＩ．Ｄ．ｘ２５０ｍｍ（ナカライテスク）
移動相：Ａ；アセトニトリル、Ｂ；10mM リン酸ナトリウムバッファー（pH2.6）
Ｂ ｃｏｎｃ．７０％→３０％ ４０分 ｌｉｎｅａｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ
流速：１ｍｌ／分
温度：４０℃
検出：ＵＶ ２１０ｎｍ
UDP-ラムノース合成酵素遺伝子とステビオール配糖化酵素遺伝子を共発現させたS1-5678株、S1-56R78株、S2-5678株、S2-56R78株でrebCが生成した。UGT91D2L#16を発現させたほうがUGT91D2を発現させた株よりrebCの生成量は多かった。UGT91D2L#16を発現させた結果を図７に示す。
本発明によれば、SrRHM1およびSrRHM2遺伝子を利用してグルコースからラムノースを生成することができる。また、ラムノース基を含有するステビオール配糖体の含有量を制御することでステビア甘味製剤の甘味度および味質を制御させることができる。特にSrRHM2の遺伝子発現はラムノース基含有ステビオール配糖体の有無と関連性が高く、この遺伝子をマーカーにステビア植物体の甘味配糖体を構成する糖の質的な選抜に利用可能と考える。また本発明は、植物のみならず微生物においてRebCに代表されるラムノース基を含有するステビオール配糖体を代謝工学的に生産させるための分子ツールを与える。
Claims (22)
- 以下の（a）〜（c）よりなる群より選ばれるいずれかに記載のタンパク質：
（a）配列番号2、4、6、8又は10のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（b）配列番号2、4、6、8又は10のアミノ酸配列において、1〜33個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつグルコースからラムノースを生成する活性を有するタンパク質；
（c）配列番号2、4、6、8又は10のアミノ酸配列に対して、95％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつグルコースからラムノースを生成する活性を有するタンパク質。 - 前記グルコースがウリジン二リン酸グルコースの形態にある、請求項1に記載のタンパク質。
- 前記ラムノースがウリジン二リン酸ラムノースの形態にある、請求項1又は2に記載のタンパク質。
- 以下の（a）〜（d）よりなる群より選ばれるポリヌクレオチド。
（a）配列番号1、3、5、7又は9の塩基配列を含有するポリヌクレオチド；
（b）配列番号2、4、6、8又は10のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（c）配列番号2、4、6、8又は10のアミノ酸配列において、1〜33個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつグルコースからラムノースを生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（d）配列番号2、4、6、8又は10のアミノ酸配列に対して、95％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつグルコースからラムノースを生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。 - 前記グルコースがウリジン二リン酸グルコースの形態にある、請求項4に記載のポリヌクレオチド。
- 前記ラムノースがウリジン二リン酸ラムノースの形態にある、請求項4又は5に記載のポリヌクレオチド。
- 請求項4〜6のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドと発現カセットとを含むベクター。
- 請求項7に記載のベクターが細胞内に導入された形質転換体。
- 前記細胞が細菌、微生物又は植物の細胞である、請求項８に記載の形質転換体。
- 請求項8又は9に記載の形質転換体の抽出物。
- 請求項１０に記載の抽出物を含む、甘味料、飲食品又は医薬品。
- 以下の（a）〜（c）よりなる群より選ばれるいずれかに記載のタンパク質と、グルコースとを反応させる工程を含む、ラムノースの製造方法：
（a）配列番号2、4、6、8又は10のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（b）配列番号2、4、6、8又は10のアミノ酸配列において、1〜33個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつグルコースからラムノースを生成する活性を有するタンパク質；
（c）配列番号2、4、6、8又は10のアミノ酸配列に対して、95％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつグルコースからラムノースを生成する活性を有するタンパク質。 - 前記グルコースがウリジン二リン酸グルコースの形態にある、請求項12に記載の方法。
- 前記ラムノースがウリジン二リン酸ラムノースの形態にある、請求項12又は13に記載の方法。
- 請求項12〜14のいずれか一項に記載の方法で製造されたラムノース又はウリジン二リン酸ラムノース。
- 請求項15に記載のラムノース又はウリジン二リン酸ラムノースを含む、甘味料、飲食品又は医薬品。
- 以下の（a）〜（c）よりなる群より選ばれるいずれかに記載のタンパク質と、グルコースとを反応させてラムノースを得る工程と：
（a）配列番号2、4、6、8又は10のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（b）配列番号2、4、6、8又は10のアミノ酸配列において、1〜33個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつグルコースからラムノースを生成する活性を有するタンパク質；
（c）配列番号2、4、6、8又は10のアミノ酸配列に対して、95％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつグルコースからラムノースを生成する活性を有するタンパク質
前記ラムノースをステビオール又はステビオール配糖体に転移する工程と、
を含む、ステビオール配糖体の製造方法。 - 前記ラムノースがウリジン二リン酸ラムノースである、請求項17に記載の方法。
- 前記ラムノースをステビオール又はステビオール配糖体に転移する工程が、（i）配列番号11若しくは13の塩基配列を含有するポリヌクレオチド、又は、（ii）配列番号12若しくは14のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有し、かつ、ステビオール配糖体の13位に結合したグルコースに1→2結合でラムノースを付加する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを導入した非ヒト形質転換体を用いて行われる、請求項17又は18に記載の方法。
- 下記の（ａ）〜（ｅ）の少なくとも１つのポリヌクレオチドを導入した非ヒト形質転換体を用いる工程をさらに含む、請求項17〜19のいずれか一項に記載の方法。
（ａ）（i）配列番号15の塩基配列を含有するポリヌクレオチド、又は、（ii）配列番号16のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有し、かつ、ステビオール配糖体の13位の水酸基にグルコースを付加する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｂ）（i）配列番号17の塩基配列を含有するポリヌクレオチド、又は、（ii）配列番号18のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有し、かつ、ステビオール配糖体の19位のカルボン酸にグルコースを付加する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｃ）（i）配列番号19の塩基配列を含有するポリヌクレオチド、又は、（ii）配列番号20のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有し、かつ、ステビオール配糖体の13位のグルコースの3位に1→3結合でグルコースを付加する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｄ）（i）配列番号11若しくは13の塩基配列を含有するポリヌクレオチド、又は、（ii）配列番号12若しくは14のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有し、かつ、ステビオール配糖体の19位のグルコースに、1→2結合でグルコースを付加する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｅ）（i）配列番号19の塩基配列を含有するポリヌクレオチド、又は、（ii）配列番号20のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有し、かつ、ステビオール配糖体の19位のグルコースに、1→3結合でグルコースを付加する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド - 請求項１７に記載の方法で製造された、ステビオール配糖体。
- ラムノース基を有するステビオール配糖体含有量に応じて植物体をスクリーニングする方法であって、
被検植物体から、以下の（a）〜（d）よりなる群より選ばれるポリヌクレオチドを定量する工程、及び前記ポリヌクレオチド量を基準値と比較してポリヌクレオチド量に応じて被験植物体を選別する工程を含む方法。
（a）配列番号1、3、5、7又は9の塩基配列を含有するポリヌクレオチド；
（b）配列番号2、4、6、8又は10のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（c）配列番号2、4、6、8又は10のアミノ酸配列において、1〜33個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつグルコースからラムノースを生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（d）配列番号2、4、6、8又は10のアミノ酸配列に対して、95％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつグルコースからラムノースを生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2017079041 | 2017-04-12 | ||
| JP2017079041 | 2017-04-12 | ||
| PCT/JP2018/015256 WO2018190378A1 (ja) | 2017-04-12 | 2018-04-11 | ステビア由来ラムノース合成酵素及び遺伝子 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPWO2018190378A1 true JPWO2018190378A1 (ja) | 2020-02-20 |
| JP7011649B2 JP7011649B2 (ja) | 2022-02-10 |
Family
ID=63792488
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2019512555A Active JP7011649B2 (ja) | 2017-04-12 | 2018-04-11 | ステビア由来ラムノース合成酵素及び遺伝子 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US11447765B2 (ja) |
| EP (1) | EP3611265A4 (ja) |
| JP (1) | JP7011649B2 (ja) |
| CN (1) | CN110494564B (ja) |
| WO (1) | WO2018190378A1 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2024010442A1 (en) | 2022-07-07 | 2024-01-11 | Purecircle Sdn Bhd | High-purity steviol glycosides |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS59139309A (ja) * | 1983-01-28 | 1984-08-10 | Nonogawa Shoji:Kk | 乳化化粧料 |
| WO2005030975A1 (ja) * | 2003-09-29 | 2005-04-07 | San-Ei Gen F.F.I., Inc. | α－グリコシルイソクエルシトリン、並びにその製造中間体及び副生成物の調製方法 |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS4918504B1 (ja) | 1970-08-22 | 1974-05-10 | ||
| US7927851B2 (en) | 2006-03-21 | 2011-04-19 | Vineland Research And Innovation Centre | Compositions having ent-kaurenoic acid 13-hydroxylase activity and methods for producing same |
| JP4258670B2 (ja) * | 2006-05-23 | 2009-04-30 | 独立行政法人産業技術総合研究所 | Ｕｄｐ−ラムノ−スの製造方法 |
| NZ708078A (en) * | 2010-06-02 | 2017-01-27 | Evolva Nutrition Inc | Recombinant production of steviol glycosides |
| BR112014003037B1 (pt) | 2011-08-08 | 2022-04-05 | Evolva Sa | Hospedeiro recombinante e método para produzir um glicosídeo de esteviol |
| CA2867112C (en) * | 2012-03-16 | 2021-04-20 | Suntory Holdings Limited | Steviol glucosyltransferases and genes encoding the same |
| BR112015019160A2 (pt) | 2013-02-11 | 2017-08-22 | Dalgaard Mikkelsen Michael | Produção de glicosídeos de esteviol em hospedeiros recombinantes |
| JPWO2015016393A1 (ja) * | 2013-08-02 | 2017-03-02 | サントリーホールディングス株式会社 | ヘキセノール配糖体化酵素の利用方法 |
| WO2015152707A1 (en) * | 2014-04-02 | 2015-10-08 | Purecircle Sdn Bhd | Compounds produced from stevia and process for producing the same |
| EP2957182A1 (en) * | 2014-06-18 | 2015-12-23 | Technische Hochschule Mittelhessen | Improved natural sweetener compositions |
| JP6561763B2 (ja) | 2015-10-22 | 2019-08-21 | 富士通コネクテッドテクノロジーズ株式会社 | 電子機器 |
| US10766935B2 (en) * | 2015-12-28 | 2020-09-08 | Evogene Ltd. | Plant traits conferred by isolated polynucleotides and polypeptides |
-
2018
- 2018-04-11 JP JP2019512555A patent/JP7011649B2/ja active Active
- 2018-04-11 CN CN201880024193.0A patent/CN110494564B/zh active Active
- 2018-04-11 US US16/604,303 patent/US11447765B2/en active Active
- 2018-04-11 WO PCT/JP2018/015256 patent/WO2018190378A1/ja unknown
- 2018-04-11 EP EP18784713.2A patent/EP3611265A4/en active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS59139309A (ja) * | 1983-01-28 | 1984-08-10 | Nonogawa Shoji:Kk | 乳化化粧料 |
| WO2005030975A1 (ja) * | 2003-09-29 | 2005-04-07 | San-Ei Gen F.F.I., Inc. | α－グリコシルイソクエルシトリン、並びにその製造中間体及び副生成物の調製方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2018190378A1 (ja) | 2018-10-18 |
| CN110494564A (zh) | 2019-11-22 |
| EP3611265A1 (en) | 2020-02-19 |
| JP7011649B2 (ja) | 2022-02-10 |
| CN110494564B (zh) | 2024-03-15 |
| US11447765B2 (en) | 2022-09-20 |
| US20200123526A1 (en) | 2020-04-23 |
| EP3611265A4 (en) | 2021-09-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP2826861B1 (en) | Steviol glycosyltransferase and gene encoding same | |
| JP2022047541A (ja) | レバウディオサイドｄおよびレバウディオサイドｍの改良された産生方法 | |
| US20230340429A1 (en) | Steviol glycoside hexose transferase and gene coding for same | |
| EP2862927B1 (en) | Steviol glycosyltransferase and gene encoding same | |
| US10113154B2 (en) | Method for producing steviol glycoside | |
| JP6698028B2 (ja) | モグロール配糖体化酵素およびそれをコードする遺伝子 | |
| JP7011649B2 (ja) | ステビア由来ラムノース合成酵素及び遺伝子 | |
| CN109154010A (zh) | 在重组宿主中生产甜菊醇糖苷 | |
| WO2024010074A1 (ja) | ステビオール配糖体生合成変異酵素とその利用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20200805 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20210817 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20211018 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20211216 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20220105 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20220114 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7011649 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |