WO2005003770A1

WO2005003770A1 - 生化学反応装置、生化学反応用基板、ハイブリダイゼーション用基板の製造方法及びハイブリダイゼーション方法

Info

Publication number: WO2005003770A1
Application number: PCT/JP2004/009544
Authority: WO
Inventors: Isamu Nakao; Takayoshi Mamine; Masanobu Yamamoto; Minoru Takeda; Motohiro Furuki
Original assignee: Sony Corporation
Priority date: 2003-07-07
Filing date: 2004-07-05
Publication date: 2005-01-13
Also published as: JP4285119B2; US20060166216A1; JP2005030783A; CN1816744B; EP1643250A4; EP1643250A1; CN1816744A; EP1643250B1

Abstract

　本発明に係るバイオアッセイ用基板（１）は、ＣＤ等の光ディスクと同様の主面が円形の平板状の形状を呈している。基板（１）は、中心孔（２）を中心に回転駆動される。基板（１）は、プローブＤＮＡ（検出用ヌクレオチド鎖）とサンプルＤＮＡ（標的ヌクレオチド鎖）とのハイブリダイゼーション反応の場となるウェル（８）が表面（１ａ）に複数個形成されている。基板（１）には、ウェル（８）の下層に透明電極層（４）が形成されている。ハイブリダイゼーション時には、基板（１）の上面（１ａ）側から外部電極（１８）を近接し、透明電極層（４）と外部電極（１８）との間に交流電力を印加して、基板（１）に対して垂直方向の交流電界を与える。

Description

明細書

生化学反応装置、生化学反応用基板、ハイブリダィゼーシヨン用基板の製造方法及びハイブリダィゼーシヨン方法

技術分野

[0001] 本発明は、基板を用いて生化学反応を行う生化学反応装置、 DNAチップ等の生化学反応用基板、ヌクレオチド鎖をハイブリダィゼーシヨンするハイブリダィゼーシヨン方法、並びに、プローブ用のヌクレオチド鎖が固定されたハイブリダィゼーシヨン用の基板製造方法に関する。

本出願は、日本国において 2003年 7月 7日に出願された日本特許出願番号 2003 -193064を基礎として優先権を主張するものであり、この出願は参照することにより、本出願に援用される。

背景技術

[0002] 現在、マイクロアレイ技術によって所定の DNA (全長又は一部）が微細配列されたいわゆる DNAチップ又は DNAマイクロアレイ（以下、 DNAチップと総称する。）と呼ばれる基板が、遺伝子の突然変異、 SNPs (—塩基多型)分析、遺伝子発現頻度解析等に利用されており、創薬、臨床診断、薬理ジエノミタス、法医学その他の分野において広範に活用され始めている。

DNAチップを用いた DNA解析手法は、細胞、組織等力抽出した mRNA ( messenger RNA)を逆転写 PCR (Polymerase Chain Reaction)反応等によって蛍光プローブ dNTPを組み込みながら PCR増幅してサンプル DNAを生成し、そのサンプル DNAを DNAチップ上に固相ィ匕（固定ィ匕）されたプローブ DNAに対して滴下して、プローブ DNAとサンプル DNAとをハイブリダィゼーシヨンさせる。そして、 DNAの 2 重らせん内に蛍光標識剤を挿入し、所定の検出器でその蛍光測定を行う。このことにより、サンプル DNAとプローブ DNAとの塩基配列が同一であるか否かを判別する。ここで、 DNAが負に帯電していることを利用して、固定化されているプローブ DNA の近傍にプラス電極を設けることにより、浮遊しているサンプル DNAをプローブ DN Aの方向に移動させて、ハイブリダィゼーシヨンを高速化させる技術が特開 2001—2 38674号公報に開示されている。

し力ながら、一本鎖 DNAは、溶液中で直鎖状とはならずにランダムコイル状となるので、プローブ DNAとサンプル DNAとを結合するには立体障害が大きぐハイブリダィゼーシヨンを高速に行うことが困難である。浮遊しているサンプル DNAを電界によってプローブ DNAの方向に移動させたとしても、その立体障害の度合いは変わらず高速にハイブリダィゼーシヨンを行うことは困難である。

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

本発明の目的は、このような従来の課題を解決するため、ハイブリダィゼーシヨンを高速に行うことができる生化学反応装置を提供することにある。

本発明の他の目的は、ハイブリダィゼーシヨンを高速に行うとともに構造が簡易な生化学反応用基板を提供することにある。

本発明のさらに他の目的は、ハイブリダィゼーシヨンを高速に行うとともに構造が簡易なハイブリダィゼーシヨン用基板を製造する基板製造方法を提供することにある。本発明のさらに他の目的は、高速で容易にハイブリダィゼーシヨンを行うことができるハイブリダィゼーシヨン方法を提供することにある。

本発明は、基板を用いて生化学反応を行う生化学反応装置であって、生化学反応を行う反応領域と、反応領域に形成された電極を有する基板を保持する保持手段と、基板の上記電極に対向するように配設された外部電極と、基板の電極と外部電極との間に電界を発生させる電界制御手段とを備える。

本発明に係る生化学反応用基板は、生化学反応に用いられる基板である生化学反応用基板であって、生化学反応を行う反応領域と、反応領域内に電界が形成されるように、外部電極との間に電界を発生させる電極とを備えている。

本発明は、ノ、イブリダィゼーシヨン用基板の製造方法であって、平板状の基板表面に対して底面が第 1の官能基で修飾された複数のゥエルを形成し、第 1の官能基と結合する第 2の官能基により一端が修飾されたヌクレオチド鎖を含む溶液を各ゥヱル内に滴下し、平板状の基板に対して垂直方向の交流電界を印加しながら第 1の官能基と第 2の官能基とを結合させ、ヌクレオチド鎖をゥエルの底面に結合させる。この基板製造方法では、プローブ用のヌクレオチド鎖を表面に対して垂直方向の交流電界を与えて垂直方向に伸張及び移動させながら、一端を平板状の基板の表面に接続する。

本発明に係るハイブリダィゼーシヨン方法は、平板状の基板の表面に形成されておりプローブ用のヌクレオチド鎖の一端が底面に結合されたゥヱルの内部に対して、サンプル用のヌクレオチド鎖を含む溶液を滴下し、平板状の基板に対して垂直方向に交流電界を印加しながら、プローブ用のヌクレオチド鎖とサンプル用のヌクレオチド鎖とをハイブリダィゼーシヨンする。

このハイブリダィゼーシヨン方法では、一端を平板状の基板の表面に接続してプローブ用のヌクレオチド鎖をゥエル内に固定化し、平板状の基板の表面に対して垂直方向の交流電界を与えてゥエル内のヌクレオチド鎖を垂直方向に伸張及び移動させる。

本発明の更に他の目的、本発明によって得られる具体的な利点は、以下において図面を参照して説明される実施の形態の説明から一層明らかにされるであろう。図面の簡単な説明

[0004] [図 1]図 1は、本発明に係るバイオアツセィ用基板の平面図である。

[図 2]図 2は、本発明に係るバイオアツセィ用基板の断面図である。

[図 3]図 3は、ノィオアッセィ用基板のゥエルを形成する工程を示した図である。

[図 4]図 4は、ゥエルの底面に修飾される OH基を有するシラン分子を示す図である。

[図 5]図 5は、ゥヱルの底面に結合したプローブ DNAを示す図である。

[図 6]図 6は、ノオアッセィ用基板に対して溶液の滴下制御を説明するための図でめる。

[図 7]図 7は、バイオアツセィ用基板に対して交流電界の印加の方法を説明するための図である。

[図 8]図 8は、本発明に係るバイオアツセィ用基板を用いて DNA解析を行う DNA解析装置を示すブロック部である。

発明を実施するための最良の形態

[0005] 以下、本発明を適用した具体的な実施の形態として、本発明を適用した DNA解析用のバイオアツセィ用基板及びこのバイオアツセィ用基板を用いて DNA解析を行うバイオアツセィ方法について説明をする。

図 1に本発明の実施の形態のバイオアツセィ用基板 1の上面を模式的に表した図を示し、図 2に本発明の実施の形態のバイオアツセィ用基板 1の断面を模式的に表した図を示す。

バイオアツセィ用基板 1の全体形状は、例えば CD (Compact Disk)、 DVD (Digital Versatile Disk)等の光ディスクと同様に、主面が円形とされた平板状となっている。バィォアツセィ用基板 1の主面の中心には、中心孔 2が形成されている。中心孔 2には、当該バイオアツセィ用基板 1が DNA解析装置に装着されたときに、当該バイオアツセィ用基板 1を保持及び回転させるためのチヤッキング機構が揷入される。

バイオアツセィ用基板 1は、図 2に示すように、下層側から、基板層 3と、透明電極層 4と、固相化層 5と、ゥエル形成層 6とから形成されている。なお、バイオアツセィ用基板 1のゥエル形成層 6側の表面を上面 la、基板層 3側の表面を下面 lbというものとする。

基板層 3は、詳細を後述する蛍光標識剤を励起する励起光及び蛍光標識剤の蛍光を透過する材料である。例えば、基板層 3は、石英ガラス、シリコン、ポリカーボネート、ポリスチレン等の材料で形成されている。

透明電極層 4は、基板層 3上に形成された層である。透明電極層 4は、例えば ITO (インジウム-スズ-オキサイド）やアルミニウム等の光透過性がありかつ導電性を有する材料から形成されている。透明電極層 4は、基板層 3上に例えばスパッタリングゃ電子ビーム蒸着等により 250nm程度の厚さに成膜される形成される。

固相化層 5は、透明電極層 4上に形成された層である。固相化層 5は、プローブ D NAの一端を固相化させるための材料から形成されている。本例では、固相化層 5は、シランにより表面修飾可能な Si〇が例えばスパッタリングや電子ビーム蒸着により 5

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Onm程度の厚さに成膜された層とされている。

ゥエル形成層 6は、固相化層 5上に形成された層である。ゥエル形成層 6は、複数のゥエル 8が形成された層である。

ゥヱルは、その内部空間が、プローブ DNA (検出用ヌクレオチド鎖）とサンプル DN A (標的ヌクレオチド鎖）との相互反応の場、具体的には、ハイブリダィゼーシヨン反応の場となる。ゥエル 8は、バイオアツセィ用基板 1の上面 la側に開口したくぼみ状となつており、サンプノレ DNAが含まれた溶液等の液体が滴下されたときにその液体を保留することができる程度の深さ及び大きさとなっている。例えば、ゥエル 8は、開口部力 lOO x m四方の大きさに形成され、深さが程度とされて、底面 11に固相化層 5が露出している。

このようなゥエル形成層 6は、図 3の（a)に示すように、固相化層 5の上に感光性ポリミイド 13をスピンコート等で 5 z m程度の厚さに塗布する（ステップ Sl)。続いて、図 3 の（b)に示すように、塗布した感光性ポリミイド 13上に所定のパターンのフォトマスク 1 4を形成し、このフォトマスク 14用いて感光性ポリミイド 13露光及び現像する (ステツプ S2)。このことにより、図 3の（c)に示すように、ゥエル形成層 6に複数のゥエル 8が形成される（ステップ S3)。

さらに、ゥエル 8は、一端が官能基により修飾されたプローブ DNAが底面 11 (固相化層 5が露出した部分）に結合するように、当該底面 11が官能基により表面修飾されている。例えば、ゥエル 8は、図 4に示すように、 SH基 15を有するシラン分子 16により、底面 l l (SiO力形成されている固相化層 5)が表面修飾されている。このため、ゥ

2

ェノレ 8の底面 11には、例えば SH基で一端が修飾されたプローブ DNAを結合させること力 Sできる。このようにバイオアツセィ用基板 1では、ゥエル 8の底面 11に、プローブ DNAの一端を結合させることができるので、図 5に示すように、底面 11から垂直方向に鎖が伸びるように、プローブ DNA (P)を結合させることができる。

また、バイオアツセィ用基板 1では、図 1に示すように、複数のゥエル 8が、主面の中心から外周方向に放射状に向力複数の列上に、例えば 400 μ m程度の間隔で等間隔に並んで配置されている。

また、バイオアツセィ用基板 1には、バイオアツセィ用基板 1の下面 lb側からレーザ光を照射することにより読み取り可能なアドレスピット 9が形成されている。アドレスピット 9は、バイオアツセィ用基板 1の平面上における各ゥヱル 8の位置を特定するための情報である。アドレスピット 9から情報を光学的に読み取ることによって、複数存在するウエノレ 8のうち、現在レーザ光を照射している位置の 1つのゥヱル 8がどれであるかを特定することが可能となる。このようなアドレスピット 9が設けてあることによって、後述する滴下装置による溶液の滴下位置の制御や、対物レンズによる蛍光検出位置の特定を行うことができる。

以上のようなバイオアツセィ用基板 1では、円板状に形成されているため、光デイスクシステムと同様の再生システムを利用することにより、レーザ光のフォーカシング位置を制御するためのフォーカシンダサーボ制御、半径方向に対するレーザ光の照射位置や滴下装置による滴下位置の制御のための位置決めサーボ制御、並びに、アドレスピット 9の情報検出処理をすることができる。つまり、アドレスピット 9に記録してある情報内容と、そのアドレスピット 9の近傍にあるゥエル 8とを対応させておくことにより、アドレスピット 9の情報を読み出すことで、特定の 1つのゥエル 8に対してのみレーザ光を照射して蛍光が発光しているゥエル 8の位置を特定したり、特定の 1つのゥエル 8 の位置と滴下装置との相対位置を制御して、その特定の 1つのゥエル 8に対して溶液を滴下したりすることができる。

さらに、以上のようなバイオアツセィ用基板 1では、ゥエル 8の上部側から電極を近接させれば当該電極と透明導電層 4との間に平行電界を形成させることができる。そのため、例えば、 DNAのハイブリダィゼーシヨンを行う場合には、ゥエル 8に対して交流電界を与えることによって、ゥヱル内に浮遊する DNAを伸張させてハイブリダィゼーシヨンの進行を促進させることができる。

次に、以上のようなバイオアツセィ用基板 1を用いた DNA解析方法について説明をする。

まず、一端が SH基で修飾されたプローブ DNAが含有した溶液 Sを所定のゥエル 8 に対して滴下する。このとき、 1つのバイオアツセィ用基板 1に対して、複数種類のプローブ DNAが滴下する。だたし、 1つのゥヱル 8内には 1種類のプローブ DNAが入るようにする。なお、各ゥヱル 8にいずれの種類のプローブ DNAを滴下するかは、予めゥエルとプローブ DNAとの対応関係を示す配置マップ等を生成しておき、その配置マップに基づき滴下制御する。

また、溶液 Sの滴下制御は、光ディスクの駆動システムと同様にバイオアツセィ用基板 1を駆動制御することにより行う。すなわち、図 6に示すように、バイオアツセィ用基板 1を上面 laを上にして平行に保持しながら回転駆動するとともに、レーザ光 Vをバィォアツセィ用基板 1の下側（下面 lb側）から照射してアドレスピット 9を検出することによりゥエル 8の位置を特定しながら、滴下位置の制御を行えばよい。

続いて、図 7に示すように、バイオアツセィ用基板 1の上面 la側の外部から、ウエノレ 8の開口部の大きさよりも充分大きい平坦面 18a (例えば直径が 300 μ mの円状の面 )が先端部に形成された探針状の外部電極 18を、所定のゥエル 8に対して上記先端部が覆いかぶるように近接する。続いて、この外部電極 18と透明電極層 4との間に交流電圧を印加して、バイオアツセィ用基板 1の主面に対して垂直方向の交流電界を印加する。例えば、ウエノレ 8内に、 lMV/m、 1MHz程度の交流電界を印加する。このように交流電界を所定のゥエル 8に印加すると、ゥエル 8内の溶液中に浮遊してレ、るプローブ DNA (P)がバイオアツセィ用基板 1の主面に対して垂直方向に伸張するとともに、そのプローブ DNAがバイオアツセィ用基板 1に垂直方向に移動する。このため、予め表面修飾処理がされた底面 11に、そのプローブ DNAの修飾端が結合し、ゥエル 8の底面 11にプローブ DNAを固相化（固定化）することができる。

バイオアツセィ用基板 1の主面に対して垂直な平行電界を印加するためには、外部電極 18の先端部に平坦面 18aが形成され、その平坦面が透明電極層 4と平行であることが望ましい。また、この平坦性を確保するために先端部分にァクセプタ又はドナ一イオンを高ドープした Siや GaAs等の鏡面研磨された半導体ウェハを、探針状の金属の先端部分に取り付けてもよい。半導体ウェハを取り付ける場合には、探針状の金属と半導体ウェハとのショットキーバリアを小さくするとともにォーミックコンタクトを得るために、チタンや金等の材料を介して半導体ウェハを接続するのが望ましい。

交流電界を印加すると一本鎖 DNA (ヌクレオチド鎖）が伸張及び移動する理由は、次のとおりである。すなわち、ヌクレオチド鎖内では、ヌクレオチド鎖の骨格をなすリン酸イオン（陰電荷）とその周辺にある水がイオン化した水素イオン（陽電荷）とによってイオン雲が形成されていると考えられ、これらの陰電荷及び陽電荷により生じる分極ベクトルが、高周波高電圧の印加により全体として一方向を向き、その結果としてヌクレオチド鎖が伸長するためである。さらに、電気力線が一部に集中する不均一電界が印加された場合、ヌクレオチド鎖は、電気力線が集中する部位に向かって移動もする ( euchi Suzuki, Takeshi Yamanashi, Shin—ichi Tazawa, Osamu Kurosawa and Masao Washizu: " Quantitative analysis on electrostatic orientation of DNA in stationary AC electric field using fluorescence anisotropy", IEEE Transaction on Industrial Application, Vol.34,No. l, p.75-83 (1998)参照）。

このように、交流電界を印加すると、プローブ DNAがその電界に平行な方向に伸張して立体障害の少なレ、状態となり、プローブ DNAと底面 11とが結合しやすレ、状態となる。そして、プローブ DNAと底面 11とが結合することにより、ゥエル 8の底面 11にプローブ DNAを固相化（固定化）すること力 Sできる。

続いて、生体力抽出したサンプル DNAが含有した溶液をバイオアツセィ用基板 1 上の各ゥヱル 8に滴下する。

続いて、サンプノレ DNAの滴下後、バイオアツセィ用基板 1の上面 la側の外部から、上記外部電極 18を所定のゥエル 8に対して覆いかぶせるように近接する。続いて、温度を 60度 C程度に維持しながら、外部電極 18と透明電極層 4との間に交流電圧を印加する。すなわち、加熱しながらバイオアツセィ用基板 1の主面に対して垂直方向の交流電界を印加する。例えば、ゥエル 8内に lMV/m、 1MHz程度の交流電界を印加する。

このような処理をすると、サンプル DNAとプローブ DNAとが垂直方向に伸張して立体障害の少ない状態となるとともに、サンプル DNAがバイオアツセィ用基板 1に対して垂直方向に移動する。この結果、互いの塩基配列が相補的な関係にあるサンプル DNAとプローブ DNAとが同一のゥヱル 8内にある場合には、それらがハイブリダィゼーシヨンを起こす。

続いて、ハイブリダィゼーシヨンを起こさせた後に、蛍光標識インタカレータ等をバイオアッセィ用基板 1のゥエル 8内に滴下する。このような蛍光標識剤は、ハイブリダィゼーシヨンを起こしたプローブ DNAとサンプル DNAとの二重らせん間に挿入して結合する。

続いて、バイオアツセィ用基板 1の表面 laを純水等で洗浄し、ハイブリダィゼーションを起こしていないゥヱル 8内のサンプル DNA及び蛍光標識剤を除去する。この結果、ハイブリダィゼーシヨンを起こしたゥエル 8内にのみ、蛍光標識剤が残存することとなる。

続いて、光ディスクの駆動システムと同様にバイオアツセィ用基板 1を駆動制御することにより、ゥエル 8からの蛍光の検出を行う。すなわち、バイオアツセィ用基板 1を保持しながら回転駆動するとともに、レーザ光 Vをバイオアツセィ用基板 1の下側（下面 lb側）から照射してアドレスピット 9を検出することによりゥエル 8の位置を特定する。それと同時に、励起光をバイオアツセィ用基板 1の下側（下面 lb側）から照射して、その励起光に応じて生じる蛍光をやはり下面 lb側から検出する。そして、どのゥヱル 8 力、ら蛍光が発生されているか否力 ^検出する。

続いて、バイオアツセィ用基板 1上の蛍光が発生していたゥエル 8の位置を示すマツプ作成する。そして、その作成したマップ、並びに、各ゥエル 8にどのような塩基配列のプローブ DNAが滴下されていたかを示す配置マップに基づき、サンプル DNAの塩基配列の解析を行う。

以上のようにバイオアツセィ用基板 1を用いた DNA解析方法では、溶液中に浮遊したプローブ DNAを基板 1の表面に対して垂直方向の交流電界を与えて垂直方向に伸張及び移動させながら、一端をゥエル 8の底面 11に接続する。したがって、バイオアッセィ用基板 1に対して垂直に電界を与えるので、例えば、基板上に電極をパタ一二ングして生成しなくてもよいため、非常に簡易的な層構造の電極を用いて、プローブ DNAを固定することができる。

また、以上のようにバイオアツセィ用基板 1を用いた DNA解析方法では、溶液中に浮遊したサンプル DNA及び一端がゥエル 8の底面に固定されたプローブ DNAに対して、垂直方向の交流電界を与えて垂直方向に伸張及び移動させる。したがって、サンプル DNA及びプローブ DNAがともに同方向に伸張及び移動するので、ハイブリダィゼーシヨンが促進する。さらに、このような電界を与えるための電極を基板上に電極をパターニングして生成しなくてもよいため、非常に簡易的な層構造の電極を用いて、プローブ DNAを固定することができる。

なお、本実施の形態では、外部電極 18の形状を探針状として少数のゥエル 8に対してのみ交流電界を与える例を示した力 S、外部電極 18はこのようなものに限られず、ゥエル 8に対して垂直方向の交流電界を与えられればどのような形状であってもよい。例えば、バイオアツセィ用基板 1の主面とほぼ同一の大きさの円板状の電極を用いて、全ゥエル 8に対して同時に交流電界を印加するようにしてもよい。また、本実施の形態では、ノィォアツセィ用基板 1内に透明電極層 4を設けているが、透明電極層 4 を設けずに、下面 lb側の外部から外部電極 18と同様の電極を近接させてゥエル 8に対して垂直方向の電界を与えてもよい。

次に、本発明に係るバイオアツセィ基板 1を用いて DNA解析を行う DNA解析装置 51について、図 8を参照して説明をする。

DNA解析装置 51は、図 8に示すように、上述した外部電極 18と、バイオアツセィ用基板 1を保持して回転をさせるディスク装填部 52と、ハイブリダィゼーシヨンのための各種溶液を貯留するとともにバイオアツセィ用基板 1のゥエル 8にその溶液を滴下する滴下部 53と、バイオアツセィ用基板 1から励起光を検出するための励起光検出部 5 4と、上記の各部の管理及び制御を行う制御部 55とを備えている。

ディスク装填部 52は、ノくィオアッセィ用基板 1の中心孔 2内に挿入して当該バイオアツセィ用基板 1を保持するチヤッキング機構 61と、チヤッキング機構 61を駆動することによりバイオアツセィ用基板 1を回転させるスピンドルモータ 62と有している。ディスク装填部 52は、上面 la側が上方向となるようにバイオアツセィ用基板 1を水平に保持した状態で、当該バイオアツセィ用基板 1を回転駆動する。ディスク装填部 52では、バイオアツセィ用基板 1を水平に保持することによって、ゥエル 8に滴下された溶液が垂れてしまうといった問題を回避することができる。

滴下部 53は、試料溶液 Sや蛍光標識剤を貯留する貯留部 63と、貯留部 63内の試料溶液 Sや蛍光標識剤をバイオアツセィ用基板 1に滴下する滴下ヘッド 64とを有している。滴下ヘッド 64は、水平に装填されたバイオアツセィ用基板 1の上面 laの上方に配置されている。さらに、滴下ヘッド 64は、バイオアツセィ用基板 1のアドレスピットから読み出される位置情報及び回転同期情報に基づいてバイオアツセィ用基板 1との相対位置を半径方向に制御し、サンプノレ DNA (標的ヌクレオチド鎖 T)を含有する試料溶液 Sを所定のゥエル 8の反応領域 8に正確に追従して滴下する構成とされている。また、貯留部 63は、貯留部 63と滴下ヘッド 64との組み合わせは、ハイブリダイゼーシヨンのために使用する試料溶液の数だけある。また、滴下部 53では、ノくィオアッセィ用基板 1上の所定の位置に正確に試料溶液 Sを滴下するために、例えば、いわゆる「インクジェットプリンティング法」に基づく滴下方法が採用されている。「インクジェットプリンティング法」は、滴下ヘッド 64にいわゆるインクジェットプリンタで用いられるインク噴出機構を適用する方法であり、インクジヱットプリンタのようなノズノレヘッドからバイオアツセィ用基板 1に試料溶液 Sを噴射するものである。

励起光検出部 54は、光学ヘッド 70を有している。光学ヘッド 70は、水平に装填されたバイオアツセィ用基板 1の下方側、すなわち、下面 lb側に配置されている。光学ヘッド 70は、例えば、図示していないスレッド機構等により、バイオアツセィ用基板 1 の半径方向に移動自在とされてレ、る。

光学ヘッド 70は、対物レンズ 71と、対物レンズ 71を移動可能に支持する 2軸ァクチユエータ 72と、導光ミラー 73とを有している。対物レンズ 71は、その中心軸がバイオアツセィ用基板 1の表面に対して略垂直となるように 2軸ァクチユエータ 72に支持されている。したがって、対物レンズ 71は、バイオアツセィ用基板 1の下方側から入射された光束を当該バイオアツセィ用基板 1に対して集光することができる。 2軸ァクチユエータ 72は、バイオアツセィ用基板 1の表面に対して垂直な方向、及び、バイオアツセィ用基板 1の半径方向の 2方向に対物レンズ 71を移動可能に支持している。 2軸ァクチユエータ 72を駆動することにより、対物レンズ 71により集光された光の焦点を、バイオアッセィ用基板 1の表面に対して垂直な方向及び半径方向に移動させることができる。したがって、この光学ヘッド 70では、光ディスクシステムにおけるジャストフォーカス制御並びに位置決め制御と同様の制御を行うことができる。

導光ミラー 73は、光路 X上に対して 45° の角度で配置されている。光路 Xは、励起光 P、蛍光 F、サーボ光 V及び反射光 Rが、光学ヘッド 70に対して入射及び出射する光路である。導光ミラー 73には、励起光 P及びサーボ光 Vが光路 X上から入射される。導光ミラー 73は、励起光 P及びサーボ光 Vを反射して 90° 屈折させて、対物レンズ 71に入射する。対物レンズ 71に入射された励起光 P及びサーボ光 Vは、当該対物レンズ 71により集光されてバイオアツセィ用基板 1に照射される。また、導光ミラー 73には、蛍光 F及びサーボ光 Vの反射光 Rが、ノィオアッセィ用基板 1から対物レンズ 71 を介して入射される。導光ミラー 73は、蛍光 F及び反射光 Rを反射して 90° 屈折させて、光路 X上に出射する。

なお、光学ヘッド 70をスレッド移動させる駆動信号及び 2軸ァクチユエータ 72を駆動する駆動信号は、制御部 55から与えられる。

また、励起光検出部 54は、励起光 Pを出射する励起光源 74と、励起光源 74から出射された励起光 Pを平行光束とするコリメータレンズ 75と、コリメータレンズ 75により平行光束とされた励起光 Pを光路 X上で屈折させて導光ミラー 73に照射する第 1のダイクロックミラー 76とを有している。

励起光源 74は、蛍光標識剤を励起可能な波長のレーザ光源を有する発光手段である。励起光源 74から出射される励起光 Pは、ここでは波長が 405nmのレーザ光である。なお、励起光 Pの波長は、蛍光標識剤を励起できる波長であればどのような波長であってもよい。コリメータレンズ 75は、励起光源 74から出射された励起光 Pを平行光束にする。第 1のダイクロックミラー 76は、波長選択性を有する反射鏡であり、励起光 Pの波長の光のみを反射して、蛍光 F及びサーボ光 V (その反射光 R)の波長の光を透過する。第 1のダイクロックミラー 76は、光路 X上に 45° の角度を持って挿入されており、コリメータレンズ 75から出射された励起光 Pを反射して 90° 屈折させ、導光ミラー 73に励起光 Pを照射している。

また、励起光検出部 54は、蛍光 Fを検出するアバランジェフォトダイオード 77と、蛍光 Fを集光する集光レンズ 78と、光学ヘッド 70から光路 X上に出射された蛍光 Fを屈折させてアバランジェフォトダイオード 77に照射する第 2のダイクロックミラー 79とを有している。

アバランジェフォトダイオード 77は、非常に感度の高い光検出器であり、微弱な光量の蛍光 Fを検出することが可能である。なお、アバランジェフォトダイオード 77により検出する蛍光 Fの波長は、ここでは 470nm程度である。また、この蛍光 Fの波長は、蛍光標識剤の種類により異なるものである。集光レンズ 78は、アバランジェフォトダイオード 77上に蛍光 Fを集光するためのレンズである。第 2のダイクロックミラー 79は、光路 X上に 45° の角度を揷入されているとともに、導光ミラー 73側から見て第 1のダイクロックミラー 76の後段に配置されている。したがって、第 2のダイクロックミラー 79 には、蛍光 F、サーボ光 V及び反射光 Rが入射し、励起光 Pは入射しない。第 2のダイクロックミラー 79は、波長選択性を有する反射鏡であり、蛍光 Fの波長の光のみを反射して、サーボ光（反射光 R)の波長の光を透過する。第 2のダイクロックミラー 79は、光学ヘッド 70の導光ミラー 73から出射された蛍光 Fを反射して 90° 屈折させ、集光レンズ 78を介してアバランジェフォトダイオード 77に蛍光 Fを照射する。

アバランジェフォトダイオード 77では、このように検出した蛍光 Fの光量に応じた電気信号を発生し、その電気信号を制御部 55に供給する。

また、励起光検出部 54は、サーボ光 Vを出射するサーボ光源 80と、サーボ光源 80 力出射されたサーボ光 Vを平行光束とするコリメータレンズ 81と、サーボ光 Vの反射光 Rを検出するフォトディテクト回路 82と、非点収差を生じさせてフォトディテクト回路 82に対して反射光 Rを集光するシリンドリカルレンズ 83と、サーボ光 Vと反射光とを分離する光セパレータ 84とを有してレ、る。

サーボ光源 80は、例えば 780nmの波長のレーザ光を出射するレーザ光源を有する発光手段である。なお、サーボ光 Vの波長は、アドレスピットが検出できる程度の波長であり、励起光 P及び蛍光 Fの波長と異なっていれば 780nmに限らずどのような波長であってもよい。コリメータレンズ 81は、サーボ光源 80から出射されたサーボ光 V を平行光束にする。平行光束とされたサーボ光 Vは光セパレータ 84に入射される。フォトディテクト回路 82は、反射光 Rを検出するディテクタと、検出した反射光尺からフォーカスエラー信号、位置決めエラー信号、及びアドレスピットの再生信号を生成する信号生成回路とを有している。反射光 Rは、サーボ光 Vがバイオアツセィ用基板 1で反射して生成された光であるので、その波長は、サーボ光と同一の 780nmである。

なお、フォーカスエラー信号は、対物レンズ 71により集光された光の合焦位置と、バイオアツセィ用基板 1の基板層 3との位置ずれ量を示すエラー信号である。フォーカスエラー信号が 0となったときに、対物レンズ 71とバイオアツセィ用基板 1との間の距離が最適になる。位置決めエラー信号は、所定のゥエル 8の位置と、焦点位置とのディスク半径方向に対する位置ずれ量を示す信号である。位置決めエラー信号が 0 となったときに、サーボ光 Vのディスク半径方向に対する照射位置が任意のゥヱル 8 に一致したこととなる。アドレスピットの再生信号は、バイオアツセィ用基板 1に記録されているアドレスピットに記述されている情報内容を示す信号である。この情報内容を読み出すことにより、現在サーボ光 Vを照射しているゥエル 8を特定することができる。

フォトディテクト回路 82は、反射光 Rに基づき生成されたフォーカスエラー信号、位置決めエラー信号及びアドレスピットの再生信号を制御部 55に供給する。

シリンドリカルレンズ 83は、フォトディテクト回路 82上に反射光 Rを集光するとともに非点収差を生じさせるためのレンズである。このように非点収差を生じさせることによりフォトディテクト回路 82によりフォーカスエラー信号を生成させることができる。

光セパレータ 84は、偏向ビームスプリッタからなる光分離面 84aと 1/4波長板 84b により構成されている。光セパレータ 84では、 1/4波長板 84bの逆側から入射された光を光分離面 84aが透過し、その透過光の反射光が 1Z4波長板 84側から入射された場合には光分離面 84aが反射する機能を有している。光セパレータ 84は、光分離面 84aが光路 X上に 45° の角度を挿入されているとともに、導光ミラー 73側から見て第 2のダイクロックミラー 79の後段に配置されている。したがって、光セパレータ 84 では、コリメータレンズ 81から出射されたサーボ光 Vを透過して光学ヘッド 70内の導光ミラー 73に対してそのサーボ光 Vを入射させているとともに、光学ヘッド 70の導光ミラー 73から出射された反射光 Rを反射することにより 90° 屈折され、シリンドリカノレレンズ 83介してフォトディテクト回路 82に反射光 Rを照射する。

制御部 55は、励起光検出部 54により検出されたフォーカスエラー信号、位置決めエラー信号及びアドレスピットの再生信号に基づき、各種のサーボ制御を行う。

すなわち、制御部 55は、フォーカスエラー信号に基づき光学ヘッド 70内の 2軸ァクチユエータ 72を駆動して対物レンズ 71とバイオアツセィ用基板 1との間の間隔を制御し、フォーカスエラー信号が 0となるようにサーボ制御を行う。また、制御/サーボ部 55 は、位置決めエラー信号に基づき光学ヘッド 70内の 2軸ァクチユエータ 72を駆動して対物レンズ 71をバイオアツセィ用基板 1の半径方向に移動制御し、フォーカスエラ一信号が 0となるようにサーボ制御を行う。また、制御部 55は、アドレスピットの再生信号に基づき光学ヘッド 70のスレッド移動制御を行って光学ヘッド 70を所定の半径位置に移動し、目的のゥエル位置に対物レンズ 71を移動させる。

また、制御部 55は、ノ、イブリダィゼーシヨン時に、交流電力発生部 31を制御し、電力の供給の制御も行う。

以上のような構成の DNA解析装置 51では、次のような動作を行う。

DNA解析装置 51は、バイオアツセィ用基板 1を回転させながら、ゥエル 8上にサンプル DNAが含有した溶液を滴下し、プローブ DNAとサンプル DNAとを相互反応（ハイブリダィゼーシヨン）させる。ハイブリダィゼーシヨン時には上述した電界の制御も行う。また、ハイブリダィゼーシヨン処理の済んだバイオアツセィ用基板 1上に、蛍光標識剤を含んだバッファ溶液を滴下する。

また、 DNA解析装置 51は、蛍光標識剤が滴下された後のバイオアツセィ用基板 1 を回転させ、励起光 Pを当該バイオアツセィ用基板 1の下面 lb側から入射させてゥェノレ 8内の蛍光標識剤に照射し、その励起光 Pに応じてその蛍光標識剤から発生した蛍光 Fをバイオアツセィ用基板 1の下方から検出する。

ここで、 DNA解析装置 51では、励起光 Pとサーボ光 Vとを同一の対物レンズ 71を介してバイオアツセィ用基板 1に照射している。そのため、 DNA解析装置 51では、サーボ光 Vを用いたフォーカス制御、位置決め制御並びにアドレス制御を行うことによって、励起光 Pの照射位置、すなわち、蛍光 Fの発光位置を特定することが可能となり、その蛍光の発光位置からサンプル DNAと結合したプローブ DNAを特定することができる。

なお、本発明は、図面を参照して説明した上述の実施例に限定されるものではなく、添付の請求の範囲及びその主旨を逸脱することなぐ様々な変更、置換又はその同等のものを行うことができることは当業者にとって明らかである。

産業上の利用可能性

本発明に係る生化学反応装置では、生化学反応を行う反応領域と、反応領域に形成された電極を有する基板に対して、電極を近接させて上記反応領域に平行電界を形成させる。そのため、例えば、ヌクレオチド鎖のハイブリダィゼーシヨンを行う場合には、ゥエルに対して交流電界を与えることによって、ゥエル内に浮遊するヌクレオチド鎖を伸張させてハイブリダィゼーシヨンの進行を促進させることができる。本発明に係る生化学反応用基板では、反応領域内に電界が形成されるように、外部電極との間に電界を発生させる電極とを備えている。したがって、この生化学反応用基板では、反応領域に電極を近接させれば反応領域に平行電界を形成させることができる。そのため、例えば、ヌクレオチド鎖のハイブリダィゼーシヨンを行う場合には、ゥエルに対して交流電界を与えることによって、ゥエル内に浮遊するヌクレオチド鎖を伸張させてハイブリダィゼーシヨンの進行を促進させることができる。

本発明に係る基板製造方法では、プローブ用のヌクレオチド鎖を表面に対して垂直方向の交流電界を与えて垂直方向に伸張及び移動させながら、一端を平板状の基板の表面に接続する。したがって、この基板製造方法では、平板状の基板に対して垂直に電界を与えるので、非常に簡易的な構成の電極を用いて、高速にプローブ用のヌクレオチド鎖を基板に固定することができる。

本発明に係るハイブリダィゼーシヨン方法では、一端を平板状の基板の表面に接続してプローブ用のヌクレオチド鎖をゥエル内に固定化し、平板状の基板の表面に対して垂直方向の交流電界を与えてゥエル内のヌクレオチド鎖を垂直方向に伸張及び移動させる。したがって、このハイブリダィゼーシヨン方法では、平板状の基板に対して垂直に電界を与えるので、非常に簡易的な構成の電極を用いて、高速にハイブリダィゼーシヨンを行うことが可能となる。

Claims

請求の範囲

[1] 1.基板を用いて生化学反応を行う生化学反応装置において、

上記生化学反応を行う反応領域と、上記反応領域に形成された電極を有する基板を保持する保持手段と、

上記基板の上記電極に対向するように配設された外部電極と、

上記基板の上記電極と上記外部電極との間に電界を発生させる電界制御手段とを備える生化学反応装置。

[2] 2.上記基板の上記電極は、上記反応領域の下層に形成された導電層であり、上記外部電極は、上記導電層と平行な平面を有することを特徴とする請求の範囲第 1項記載の生化学反応装置。

[3] 3.上記電界制御手段は、上記電極と上記外部電極との間に交流電界を発生させることを特徴とする請求の範囲第 1項記載の生化学反応装置。

[4] 4.上記電極は、探針状に形成されていることを特徴とする請求の範囲第 1項記載の生化学反応装置。

[5] 5.上記電極は、ァクセプタ又はドナーイオンがドープされた半導体力構成されていることを特徴とする請求の範囲第 1項記載の生化学反応装置。

[6] 6.生化学反応に用いられる基板である生化学反応用基板において、

上記生化学反応を行う反応領域と、

上記反応領域内に電界が形成されるように、外部電極との間に電界を発生させる電極と

を備えていることを特徴とする生化学反応用基板。

[7] 7.上記生化学反応は、ヌクレオチド鎖のハイブリダィゼーシヨン反応であり、

上記反応領域は、上記ヌクレオチド鎖を固定可能な内部処理がされている表面層を有し、

上記電極は、上記表面層の下層に形成された導電層であることを特徴とする請求の範囲第 6項記載の生化学反応用基板。

[8] 8.上記反応領域は、当該基板上に配設されたゥエルであり、

上記表面層は、上記ゥエルの底面に形成され、上記導電層は、上記ゥエル内において、上記外部電極との間の電界が、上記表面層に対して略垂直方向に形成されるように、上記ゥエルの下層に形成されることを特徴とする請求の範囲第 7項記載の生化学反応用基板。

[9] 9.上記導電層は、上記表面層に対向する位置に配置された電極との間に電界を形成させることを特徴とする請求の範囲第 7項記載の生化学反応用基板。

[10] 10. 当該基板は円板状であり、読み取り制御情報が記録されていることを特徴とする請求の範囲第 6項記載の生化学反応用基板。

[11] 11.上記導電層は、光透過性を有することを特徴とする請求の範囲第 7項記載の生化学反応用基板。

[12] 12.平板状の基板表面に対して、底面が第 1の官能基で修飾された複数のゥエルを形成し、

上記第 1の官能基と結合する第 2の官能基により一端が修飾されたヌクレオチド鎖を含む溶液を各上記ゥエル内に滴下し、

平板状の基板に対して垂直方向の交流電界を印加しながら上記第 1の官能基と第 2の官能基とを結合させ、上記ヌクレオチド鎖を上記ゥエルの底面に結合させることを特徴とするハイブリダィゼーシヨン用の基板製造方法。

[13] 13.上記平板状の基板には、上記ゥエルの下層に導電性材料からなる電極膜が形成されており、

上記基板表面に対して外部電極を近接させ、当該外部電極と上記電極膜との間に交流電力を加えることにより、上記平板状の基板に対して垂直方向に交流電界を印加する

ことを特徴とする請求の範囲第 12項記載のハイブリダィゼーシヨン用基板の製造方法。

[14] 14.上記外部電極は、ァクセプタ又はドナーイオンがドープされた半導体から構成されることを特徴とする請求の範囲第 12項記載のハイブリダィゼーシヨン用の基板製造方法。

[15] 15.平板状の基板の表面に形成されておりプローブ用のヌクレオチド鎖の一端が底面に結合されたゥエルの内部に対して、サンプル用のヌクレオチド鎖を含む溶液を滴下し、

上記平板状の基板に対して垂直方向に交流電界を印加し、上記プローブ用のヌクレオチド鎖と上記サンプル用のヌクレオチド鎖とをハイブリダィゼーシヨンすることを特徴とするハイブリダィゼーシヨン方法。

[16] 16.上記平板状の基板には、上記ゥエルの下層に導電性材料からなる電極膜が形成されており、

ことを特徴とする請求の範囲第 15項記載のハイブリダィゼーシヨン方法。

[17] 17.上記外部電極は、ァクセプタ又はドナーイオンがドープされた半導体力構成されることを特徴とする請求の範囲第 15項記載のハイブリダィゼーシヨン方法。