WO2004111083A2 - Oxidoreduktase aus pichia capsulata - Google Patents

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WO2004111083A2
WO2004111083A2 PCT/EP2004/005831 EP2004005831W WO2004111083A2 WO 2004111083 A2 WO2004111083 A2 WO 2004111083A2 EP 2004005831 W EP2004005831 W EP 2004005831W WO 2004111083 A2 WO2004111083 A2 WO 2004111083A2
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nadh
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formula
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Antje Gupta
Anke Zimmer
Maria Bobkova
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Iep Gmbh
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    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Definitions

  • the present invention relates to an oxidoreductase, a process for the enantioselective reduction of carbonyl compounds to the corresponding (S) -hydroxy compounds and a process for obtaining the chiral (R) -hydroxy compound.
  • Optically active hydroxy compounds are valuable chiral building blocks with wide application for the synthesis of pharmacologically active compounds, aromatic substances, pheromones, agrochemicals or enzyme inhibitors.
  • HLADH Alcohol dehydrogenase from horse liver
  • YADH Yeast alcohol dehydrogenase
  • Carbonyl reductase from Candida parapsilosis (CPCR) (US 5,523,223 and US
  • Another problem with the use of said carbonyl reductases is the regeneration of the cofactors NADH or NADPH.
  • the known methods use either substrate-coupled coenzyme regeneration, for example with 2-propanol, or enzyme-linked coenzyme regeneration, for example with formate dehydrogenase.
  • the disadvantage of substrate-coupled coenzyme regeneration with isopropanol is the unfavorable equilibrium position and the insufficient enzyme stability compared with the co-substrates used, such as isopropanol.
  • the object of the invention is to provide an oxidoreductase which is characterized by a broad substrate spectrum, high enantioselectivity and high stability to organic solvents. This object is achieved by an oxidoreductase in such a way that it reduces a carbonyl compound to the corresponding (S) -hydroxy compound in the presence of NADH and water.
  • the invention suitably relates to oxidoreductases obtainable from yeasts of the genera Pichia or Candida, in particular from Pichia capsulata.
  • the invention relates to oxidoreductase from Pichia capsulata which has the DNA sequence according to SEQ ID NO: 8 and the amino acid sequence according to SEQ ID NO: 9. These sequences are described in the attached Sequence Listing.
  • the invention relates in one embodiment to oxidoreductase in which more than 70% of the amino acids are identical to the amino acid sequence SEQ ID NO: 9 and which has a specific activity of more than 1 ⁇ mol per mg of protein, based on the conversion of ethyl-4. Chloro-3-oxobutyric acid to (R) -ethyl-4-chloro-3-hydroxybutyric acid.
  • Preferred is an oxidoreductase in which 80% to 99.5%, in particular 90% to 99.5%, especially 99% to 99.5% are identical amino acids to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9.
  • the measurement of the specific activity of the oxidoreductase according to SEQ ID NO: 9 or of its derivatives or analogs as defined below is carried out with the test system described in Example 1.
  • the oxidoreductase according to the invention is characterized in that it has 1 to 40 additional amino acids or 1 to 40 amino acids less than the oxidoreductase having the amino acid sequence SEQ ID NO: 9 and that it has a specific activity of more than 1 ⁇ mol per mg protein on the - A -
  • the invention further relates to the oxidoreductase, which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 and is one-, two-, three-, four- or five-fold modified by a water-soluble polymer and a specific activity is more than 1 .mu.mol per mg protein, based on the reaction of ethyl 4-chloro-3-oxobutyric acid to (R) -ethyl-4-chloro-3-hydroxy-butyric acid.
  • a water-soluble polymer is, for example, polyethylene glycol.
  • the binding of the polyethylene glycol is preferably carried out at the N-terminal end of the protein according to SEQ ID NO: 9.
  • the oxidoreductase according to SEQ ID NO: 9 may also be bound to a solid such as polyethylene, polystyrene, polysaccharide, cellulose or cellulose derivatives.
  • the invention further relates to a protein fragment which represents fragments of the amino acid sequence SEQ ID NO: 9, with a number of 5 to 30 amino acids per fragment. Preference is given to fragments of SEQ ID NO: 9 having a chain length of 6 to 25 amino acids, in particular 8 to 20 amino acids or 10 to 18 amino acids, in particular the amino acid sequence SEQ ID NO: 10. These fragments can be used, for example, to find the oxidoreductase according to the invention from Pichia capsulata or from any other microorganisms.
  • the invention further relates to a fusion protein which is characterized in that it represents the oxidoreductase having the amino acid sequence SEQ ID NO: 9 or fragments of the amino acid sequence SEQ ID NO: 9, having a number of from 5 to 30 amino acids, with another polypeptide am N-terminal or carboxy-terminal end are connected via a peptide bond.
  • Fusion proteins can for example, are more easily separated from other proteins or are expressed in a greater amount in the cells.
  • the invention further relates to an antibody which binds specifically to the oxidoreductase according to SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 10.
  • the production of these antibodies is carried out by known methods by immunization of suitable mammals and subsequent recovery of the antibodies.
  • the antibodies can be monoclonal or polyclonal.
  • the invention also relates to the isolated nucleic acid sequence which codes for the oxidoreductase according to SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10.
  • the invention further relates to an isolated oxidoreductase DNA sequence which catalyzes the reduction of carbonyl compound in the presence of NADH and water to the corresponding (S) -hydroxy compounds, the DNA sequence being selected from the group
  • DNA sequence which has the nucleotide sequence according to SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 7 or the respectively complementary strand
  • b) DNA sequence which with one or hybridizing a plurality of the DNA sequences according to a) or complementary strands, wherein the hybridization is carried out under stringent conditions
  • c) DNA sequence which, due to the degeneracy of the genetic code, encodes a protein represented by one or more of the DNA sequences according to a) or b) is encoded.
  • the invention further relates to a DNA sequence in which more than 70% of the nucleic acid bases are identical to the DNA sequence according to SEQ ID NO: 8 or their complementary strands and which codes for the oxidoreductase, which has a specific activity of more than 1 .mu.mol per mg of protein, based on the reaction of ethyl-4-chloro-3-oxobutyric acid to (R) -ethyl-4-chloro-3-hydroxybutyric acid.
  • Preference is given to DNA sequences in which 80% to 99.5%, in particular 90% to 99.5%, especially 99% to 99.5%, of the nucleic acid bases are identical to the DNA sequence according to SEQ ID NO: 8.
  • the invention further relates to a nucleic acid sequence with 10 to 50 nucleic acid bases, which has a sequence which corresponds to a part or more parts of the DNA sequence according to SEQ ID NO: 8 or their complementary strands.
  • a nucleic acid sequence with 15 to 45 nucleic acid bases, in particular 20 to 40 bases or 30 to 40 nucleic acid bases of said DNA sequences.
  • Said nucleic acid sequences are suitable as molecular samples or as primers for the polymerase chain amplification reaction (PCR).
  • the invention further relates to a cloning vector comprising one or more of the abovementioned nucleic acid or DNA sequences.
  • the invention further relates to an expression vector which is located in a bacterial, insect, plant or mammalian cell and contains one or more of the abovementioned nucleic acid or DNA sequences which are suitably linked to an expression control sequence.
  • the invention further relates to a host cell which is a bacterial, yeast, insect, plant or mammalian cell and has been transformed or transferred with an expression vector.
  • the identities of the aforementioned DNA sequences or amino acid sequence are calculated by summing the number of amino acids or nucleic acid bases that are associated with partial sequences of the respective proteins or DNA sequences are identical, and the sum is divided by the total number of amino acids or nucleic acid bases and multiplied by one hundred.
  • cloning vectors examples include ppCR-Script, pCMV-Script, pBluescript (Stratagene), pDrive cloning Vector (Quiagen, Hilden, Germany), pS Blue, pET Blue, pET LJC vectors (Novagen, Madison, USA) and TA-PCR cloning vectors (Invitrogen, Düsseldorf, Germany).
  • Suitable expression vectors are pKK223-3, pTrc99a, pUC, pTZ, pSK, pBluescript, pGEM, pQE, pET, PHUB, pPLc, pKC30, pRM1 / pRM9, pTrxFus, pAS1, pGEx, pMAL or pTrx.
  • Suitable expression control sequences are, for example, trp-lac (tac) promoter, trp-lac (trc) promoter, lac promoter, T7 promoter or ⁇ pL promoter.
  • the oxidoreductase from Pichia capsulata is a homotetramer with a molecular weight of 34 ⁇ 2 kDa, determined in SDS gel, and a molecular weight of 140 ⁇ 10 kDa, determined by gel permeation chromatography.
  • the temperature optimum of the oxidoreductase is in the range of 40 ° C.
  • the oxidoreductase from Pichia capsulata has a good temperature and pH stability and is stable in the pH range of 5.5 to 8.5 and in the temperature range of 15 ° C to 40 0 C for 5 hours and also shows a high stability in organic solvents.
  • the enzyme can be isolated in particular from yeasts of the genus Pichia and can be detected in the spectrophotometric test by the decrease of NADH at 340 nm in the presence of a corresponding substrate, for example ethyl 4-chloro-3-oxobutyrate or 2-butanone.
  • the oxidoreductase according to the invention from Pichia capsulata was cloned and could be overexpressed in Escherichia coli (E. coli) with activities of 1000 to 10,000 U / g E. coli wet weight.
  • the enzyme is inexpensive and available in large quantities. Sequence comparisons in data sheets indicate that the oxidoreductase according to the invention from Pichia capsulata is a zinc-dependent carbonyl reductase.
  • the invention also relates to a method for obtaining the oxidoreductase from Pichia capsulata.
  • the DNA coding for the oxidoreductase from Pichia capsulata is expressed, for example, in a suitable prokaryotic or eukaryotic microorganism.
  • the oxidoreductase from Pichia capsulata is preferably transformed into an E. coli strain and expressed, in particular in E. coli BL21star (DE3) cells.
  • the oxidoreductase from Pichia capsulata can be obtained, for example, such that the above-mentioned recombinant E. coli cells are cultured, the expression of the oxidoreductase is induced and then after about 10 to 18 hours (h) the cells by sonication or by wet grinding with glass beads in a ball mill (Retsch, GmbH, Haan Germany 10 min, 24 Hz) are open-minded.
  • the resulting cell extract can either be used directly or further purified.
  • the cell extract is centrifuged, for example, and the supernatant obtained is subjected to ion exchange chromatography, for example by ion exchange chromatography in a Q-Sepharose Fast Flow® apparatus (Pharmacia).
  • the invention further relates to a process for the enantioselective reduction of carbonyl compounds to the corresponding (S) -hydroxy compounds, which is characterized in that a) reducing a carbonyl compound in the presence of the oxidoreductase according to one or more of claims 1 to 9, NADH and water to the corresponding (S) -hydroxy compound, and b) isolating the resulting chiral (S) -hydroxy compound.
  • the inventive method has a long service life, an enantiomeric purity of more than 95% of the produced chiral (S) -hydroxy compounds and a high yield based on the amount of carbonyl compound used.
  • NADH is understood to mean reduced nicotinamide adenine dinucleotide.
  • NAD is understood to mean nicotinamide adenine dinucleotide.
  • carbonyl compound is understood as meaning, for example, compounds of the formula IR1-C (O) -R2 (I).
  • the radical R1 stands for, for example
  • alkynyl is straight-chain or branched and optionally contains one, two, three or four triple bonds
  • the radical R2 stands for, for example
  • alkynyl is straight-chain or branched and optionally contains one or two triple bonds, or
  • radicals mentioned under 1) to 4) are unsubstituted or mono-, di- or trisubstituted independently of one another by 20 a) -OH, b) halogen, such as fluorine, chlorine, bromine or iodine, c) -NO 2 or d) -NH 2 .
  • R1-C (OH) -R2 (II) understood, wherein the -OH group is usually in (S) configuration to the carbon atom to which it is attached and R1 and R2 have the meaning as in formula I.
  • aryl refers to aromatic carbon radicals having 6 to 14 carbon atoms in the ring.
  • Examples of (C 6 -C 14 ) aryl radicals are phenyl, naphthyl, 1-naphthyl, 2-naphthyl, biphenylyl, 2-biphenylyl, 3-biphenylyl and 4-biphenylyl, anthryl or fluorenyl.
  • Biphenylyl radicals, naphthyl radicals and in particular phenyl radicals are preferred aryl radicals.
  • halogen is understood to mean an element from the series fluorine, chlorine, bromine or iodine.
  • - (C r C 20 ) -alkyl is understood to mean a hydrocarbon radical whose carbon chain is straight-chain or branched and contains 1 to 20 carbon atoms, for example methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, tert-butyl, pentyl, hexyl, heptyl , Octyl, nonenyl or decanyl.
  • -C 0 -alkyl is understood to mean a covalent bond.
  • - (C 3 -C 7 ) -Cycloalkyr refers to cyclic hydrocarbon radicals such as cyclopropyl, cylobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl or cycloheptyl.
  • - (C 5 -C 14 ) heterocycle means a monocyclic or bicyclic 5-membered to 14-membered heterocyclic ring which is partially saturated or fully saturated. Examples of heteroatoms are N, O and S.
  • Examples of the terms - (C 5 -C 14 ) -heterocycle are radicals which are derived from pyrrole, furan, thiophene, imidazole, pyrazole, oxazole, isoxazole, thiazole, isothiazole, tetrazole, 1, 2,3,5-oxathiadiazole-2-oxides, triazolones, oxadiazolones, isoxazolones, oxadiazolidinediones, triazoles, which are substituted by F, -CN, -CF 3 or -C (O) -O- (C r C 4 ) alkyl, 3-hydroxypyrro-2,4-diones, 5-oxo
  • the radicals are 2- or 3-pyrrolyl, phenylpyrrolyl, such as 4- or 5-phenyl-2-pyrrolyl, 2-furyl, 2-thienyl, 4-imidazolyl, methylimidazolyl, for example 1-methyl-2, -4- or 5-imidazolyl, 1, 3-thiazol-2-yl, 2-pyridyl, 3-pyridyl, 4-pyridyl, 2-, 3- or 4-pyridyl-N-oxide, 2-pyrazinyl, 2- , 4- or 5-pyrimidinyl, 2-, 3- or 5-indolyl, substituted 2-indolyl, for example 1-methyl, 5-methyl, 5-methoxy, 5-benzyloxy, 5-chloro or 4,5-dimethyl-2-indolyl, 1-benzyl-2- or 3-indolyl, 4,5,6,7-tetrahydro-2-indolyl, cyclohepta [b] -5-pyrrol
  • Preferred compounds of the formula I are, for example, ethyl 4-chloroacetoacetate, methyl acetoacetate, ethyl 8-chloro-6-oxooctanoic acid, ethyl 3-oxovalerate, 4-hydroxy-2-butanone, ethyl 2-oxovalerate, ethyl 2-oxo 4-phenylbutyric acid, ethyl pyruvate, ethylphenyl glyoxylate, i-phenyl-propanone, .sup.-dichloroacetophenone, acetophenone, octanone, 3-octanone or 2-butanone.
  • the correspondingly formed S-alcohols are, for example, (R) -ethyl-4-chloro-3-hydroxybutyric acid, ethyl (S) -2-hydroxy-4-phenylbutyric acid, (S) -2-octanol or (R) -ethyl- ⁇ -chloro- ⁇ -hydroxy-octanoic acid.
  • Suitable oxidoreductases are derived, for example, from Pichia capsulata.
  • Oxidoreductase can be used in the process according to the invention either completely purified or partially purified.
  • the method is used with the oxidoreductase according to the invention or with cells containing the inventive Oxidoreductase performed.
  • the cells used can be native, permeabilized or lysed.
  • the cloned oxidoreductase according to SEQ ID NO: 9 is preferably used.
  • the volume activity of the oxidoreductase used is from 100 units / ml (U / ml) to 5000 U / ml, preferably about 500 U / ml.
  • the enzyme unit 1 U corresponds to the amount of enzyme required to react 1 ⁇ mol of the compound of the formula I per minute (min).
  • the invention further relates to a process for the enantioselective reduction of carbonyl compounds to the corresponding (S) -hydroxy compounds, in which
  • the amounts of the carbonyl compounds and oxidoreductases used correspond to the abovementioned amounts in the processes described.
  • Suitable cosubstrates for the process according to the invention are alcohols, such as ethanol, 2-propanol (isopropanol), 2-butanol, 2-pentanol or 2-octanol. These cosubstrates are reacted with the aid of the oxidoreductase according to the invention and NAD to the corresponding ketones and NADH. This leads to the regeneration of NADH's.
  • the amount of cosubstrate for the regeneration of NAD to NADH, such as isopropanol is from 5% to 50% by total volume, preferably from 8% to 20%, especially from 10% to 15%.
  • the invention further relates to a process for the enantioselective recovery of (S) -hydroxy compounds, in which
  • Suitable dehydrogenases are, for example, NADH-dependent alcohol dehydrogenases from baker's yeast, from Candida boidinii or Candida parapsilosis.
  • Suitable cosubstrates for the alcohol dehydrogenase used are alcohols such as ethanol, 2-propanol (isopropanol), 2-butanol, 2-pentanol or 2-octanol.
  • NAD reduction can also be performed by means of formate dehydrogenase (Tishkov et al., J. Biotechnol., Bioeng., 1999, 64, 187-193, pilot-scale production and isolation of recombinant NAD and NADP specific formate dehydrogenase).
  • Suitable cosubstrates of formate dehydrogenase are, for example, salts of formic acid, such as ammonium formate, sodium formate or calcium formate.
  • substrate-coupled coenzyme regeneration with a secondary alcohol such as ethanol, 2-propanol (isopropanol), 2-butanol, 2-pentanol or 2-octanol is used. Therefore, the process is preferably carried out without an additional dehydrogenase.
  • a buffer is preferably added to the water used in the process, for example potassium phosphate, tris / HCl or triethanolamine buffer having a pH of 5 to 10, preferably a pH of 6 to 9. The buffer concentration is from 10 mM to 150 mM.
  • the buffer may additionally contain ions for stabilizing or activating the enzymes, for example zinc ions or magnesium ions.
  • the temperature is for example 10 0 C to 60 0 C, preferably 30 0 C to 55 0 C.
  • the invention further relates to a process for the enantioselective recovery of (S) -hydroxy compounds, in which
  • the preferred organic solvents are, for example, diethyl ether, tertiary
  • the reaction mixture consists of the use of additional solvents of an aqueous phase and an organic phase.
  • the organic phase is formed by a suitable solvent in which the substrate is dissolved or by the water-insoluble substrate itself.
  • the organic phase is 5% to 80% of the total reaction volume, preferably 10% to 40%.
  • the water forms the one liquid phase and the organic solvent forms the second liquid phase.
  • two liquid phases without solid phase are preferred.
  • the two liquid phases are preferably mechanically mixed so that large surfaces are formed between the two liquid phases.
  • the concentration of the cofactor NADH relative to the aqueous phase is 0.01 mM to 1 mM, in particular 0.05 mM to 0.2 mM.
  • the carbonyl compound is used in the inventive method in an amount of 3% to 30% based on the total volume, preferably from 5% to 15%, in particular of 10%.
  • the invention further relates to a process for the enantioselective reduction of carbonyl compounds to the corresponding (S) -hydroxy compounds, in which
  • Suitable cosubstrates for the process are alcohols, such as ethanol, 2-propanol (isopropanol), 2-butanol, 2-pentanol or 2- Octanol. These cosubstrates are converted to the corresponding ketones and NADH with the help of oxidoreductase and NAD. This leads to the regeneration of NADH's.
  • the amount of co-substrate such as isopropnaol for the regeneration of NAD to NADH is 5% to 50%, based on the total volume, preferably 8% to 20% and especially 10% to 15%.
  • the invention further relates to a process for the enantioselective reduction of carbonyl compounds to the corresponding (S) -hydroxy compounds, in which
  • a further stabilizer of the alcohol dehydrogenase is preferably used.
  • Suitable stabilizers are, for example, glycerol, sorbitol, 1,4-DL-dithiothreitol (DTT) or dimethyl sulfoxide (DMSO).
  • the process according to the invention is carried out, for example, in a closed reaction vessel made of glass or metal.
  • the components are transferred individually into the reaction vessel and stirred under an atmosphere of, for example, nitrogen or air.
  • the reaction time is 1 hour to 48 hours, in particular 2 hours to 24 hours.
  • the reaction mixture is worked up.
  • the aqueous phase is separated off and the organic phase is filtered. If appropriate, the aqueous phase can be extracted once more and, like the organic phase, worked up further. Thereafter, if necessary, the solvent is evaporated from the filtered organic phase.
  • the product (R) -ethyl-4-chloro-3-hydroxybutyric acid is obtained with an enantiomeric purity of more than 99% and substantially free of the reactant ethyl-4-chloroacetoacetate.
  • the total yield of the process is after distillation of the product 50% to 95%, based on the starting material used.
  • the invention further relates to a process for obtaining chiral (R) -hydroxy compounds of the formula II,
  • the invention further relates to a process for obtaining chiral (R) - hydroxy compounds of formula II, in which
  • a) a mixture containing the racemic compound of the formula II is incubated with the oxidoreductase according to the invention, NAD and water, b) oxidizing the NADH formed by the oxidoreductase with a cosubstrate to NAD and c) isolating the remaining chiral (R) -hydroxy compound of the formula II.
  • the invention further relates to a process for obtaining chiral (R) -hydroxy compounds of formula II, in which
  • a) a mixture containing the racemic compound of the formula II is incubated with the oxidoreductase according to the invention, NAD and water, b) the NADH formed by the oxidoreductase is oxidized to NAD with a dehydrogenase and a cosubstrate and c) the remaining chiral (R) -Hydroxy compound of the formula II is isolated.
  • the invention further relates to a process for obtaining chiral (R) -hydroxy compounds of formula II, in which
  • a) a mixture containing the racemic compound of the formula II is incubated with the oxidoreductase according to the invention, NAD and water, b) the reactions are carried out in the presence of an organic solvent, c) the NADH formed by the oxidoreductase is admixed with a dehydrogenase and a cosubstrate NAD oxidizes and d) the remaining chiral (R) -hydroxy compound of the formula II is isolated.
  • reaction conditions are essentially the same as in the abovementioned process for the enantiospecific reduction of the keto compounds of the formula I.
  • instead of an enantioselective reduction of the keto compound of the formula I from the racemic mixture of the compound of the formula II only the (S) -hydroxy compound of the formula Il enantioselectively oxidized to the corresponding keto compound. This leaves the (R) -hydroxy compound of the formula II and can be isolated.
  • ketones such as acetone used for the regeneration of the NAD.
  • the acetone and NADH are reacted with the oxidoreductase according to the invention or an additional dehydrogenase to form NAD and isopropanol.
  • the amounts of ketone used are from 5% to 50% based on the total volume, preferably 8% to 20% and in particular from 10% to 15%.
  • yeast extract (3) yeast extract (3), malt extract (3), peptones (5) and glucose (10).
  • the medium was sterilized at 121 0 C and the yeasts were cultured without further pH control at 25 ° C and on a shaker at 160 revolutions per minute (rpm).
  • the supernatant (lysate) obtained after centrifugation for 2 min at 12000 rpm was used in the following activity screening and to determine the enantiomeric excess (ee value).
  • the substrates used were ethyl 4-chloroacetoacetate and 2-chloro-1- (3-chlorophenyl) ethan-1-one.
  • the reaction was followed for 1 min at a wavelength of 340 nm.
  • DSMZ stands for German Collection for Microorganisms and Cell Cultures, Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig
  • 1 U corresponds to the amount of enzyme required to react 1 ⁇ mol of substrate per minute.
  • Example 2 Isolation of an NADH-dependent (S) -specific oxidoreductase from Pichia capsulata
  • the crude extract obtained after centrifugation (7000 rpm) was then further purified by FPLC (fast protein liquid chromatography) and processed.
  • the oxidoreductase according to the invention could be purified in two successive steps by means of ion exchange chromatography on Q-Sepharose Fast Flow (Pharmacia) and Uno Q (Biorad, Kunststoff, Germany).
  • the oxidoreductase was eluted at 0.2 to 0.3 M NaCl.
  • the fractions containing oxidoreductase were combined and concentrated to a suitable volume by ultrafiltration (exclusion limit 10 kDa). Subsequently, the concentrated fractions of the oxidoreductase were further processed and purified by means of Uno Q using the same buffer as mentioned above.
  • the enzyme was eluted at 0.1 M NaCl.
  • Catalase 232 kDa
  • aldolase 158 kDa
  • albumin 69.8 kDa
  • ovalbumin 49.4 kDa
  • the enzyme activity of the oxidoreductase was determined in the test system according to Example 1, (activity screening approach) and the amount of protein was determined according to Lowry et al. Journal of Biological Chemistry, 193 (1951): 265-275 or Peterson et al., Analytical Biochemistry, 100 (1979): 201-220). The quotient of enzyme activity to protein amount gives the specific activity, wherein the conversion of 1 .mu.mol per minute corresponds to 1 unit (U).
  • the molecular weight of the oxidoreductase according to the invention determined by gel permeation was 140 ⁇ 10 kDa in the native state.
  • B ⁇ ispi ⁇ l 3 Determination of the N-terminal sequence of the oxidoreductase according to the invention
  • the enzyme preparation according to Example 2 was separated after gel permeation in 10% sodium dodecylsulfate (SDS) gel and transferred to a polyvinylidene diflouride membrane (PVDF membrane).
  • SDS sodium dodecylsulfate
  • PVDF membrane polyvinylidene diflouride membrane
  • the conspicuous band at about 35-45 kDa was subjected to N-terminal sequencing by Edman degradation (Procise 492 (PE-Biosystems)) to give the following N-terminal sequence: 0
  • the eukaryotic microorganism Pichia capsulata belongs to the family Saccaromycetacea.
  • the genome structure of this organism has an exon-intron 0 arrangement. Therefore, for the identification of the gene sequence encoding the enantioselective oxidoreductase, a cDNA library from the active cells of Pichia capsulata was applied.
  • RNA 1 mg was used for the m-RNA extraction by means of oligo-dT cellulose lo (mRNA RepKit, Qiagen).
  • Oligo 1-Nde I 5 '-GGAATTCCATATGTCTGCTCTCTCCAAAAC-S'
  • Oligo 2-Sph I 5'-CACTGCATGCTGATGTCTGCTCTCTCCAAAAC-S '
  • Oligo 3-Hind III 5'-CCCAAGCTTTCATGGAAGCATAACCAATCTT-3 1
  • Plasmid DNA isolated from clone 2/1 of the expression library of Pichia capsulata served as a template for the polymerase chain reaction.
  • the amplification was carried out in a PCR buffer [10 mM Tris-HCl, (pH 8.0); 50 mM KCl; 10mM MgSO 4 ; 1 mM dNTP mixture (N stands for the bases A, T, C or G); 30 pmol primer and 2.5 ⁇ l Platinum Pfx DNA polymerase (Invitrogen)] with 50 ng template and the following temperature cycles:
  • the resulting PCR product was digested after purification via a 1% agarose gel using endonucleases Nde I and Hind III, or endonucleases Sph I and Hind III, and into the endonuclease-treated backbone of the pET21a vector (Novagen ), or pQE30 vectors (Qiagen). After the transformation of 2 ⁇ l of the ligation mixture into E. coli Top 10 F x cells (Invitrogen)
  • plasmid DNAs of ampicillin-resistant colonies were analyzed by means of a Restriction analysis with endonucleases Nde I and Hind IiI or endonucleases Sph I and Hind III were tested for the presence of an 1100 bp insert.
  • the expression construct pET21-PC # 10 was sequenced.
  • the transcript from Pichia capsulata coding for the oxidoreductase according to the invention has an open reading frame totaling 1026 bp (SEQ ID NO: 8), which corresponds to a protein of 341 amino acids (SEQ ID NO: 9)
  • Competent Escherichia coli StarBL21 (De3) cells were transformed with the expression construct pET21-PC # 10 coding for the oxidoreductase according to the invention.
  • the transformed strain was cultured in LB medium (1% tryptone, 0.5% yeast extract, 1% i5 NaCl) with ampicillin (50 ⁇ g / ml) until an optical density, measured at 500 nm, of 0.5 was reached.
  • Production of the recombinant oxidoreductase protein was started by adding isopropyl thiogalactoside (IPTG) to a final concentration of 1 mM.
  • IPTG isopropyl thiogalactoside
  • the induction batch was incubated for a further 15 h at 25 ° C. and 220 rpm.
  • the achieved enzyme activity was about 6000 U / g cell wet weight.
  • Twenty-five competent Escherichia coli RB791 cells were transformed with the one for the oxidoreductase expression construct pQE30-PC # 12 according to the invention.
  • the transformed strain was cultured in LB medium (1% tryptone, 0.5% yeast extract, 1% NaCl) with ampicillin (50 ⁇ g / ml) until an optical density measured at 500 nm of 0.5 was reached.
  • LB medium 1% tryptone, 0.5% yeast extract, 1% NaCl
  • ampicillin 50 ⁇ g / ml
  • Example 5 Characterization of recombinant oxidoreductase from P. capsulata
  • the buffers listed in Table 3 were prepared. The concentration of the respective buffer components was 50 mM each.
  • the enzymatic reaction was determined in the respective buffer listed in Table 3.
  • NADH was used as cofactor and (S) -methyl-3-hydroxybutyric acid as substrate.
  • a pH optimum of 6.5 to 7 for the reduction reaction and of 7.8 to 8.2 for the oxidation reaction could be determined for the enzyme according to the invention.
  • the determination of the activity of the recombinant oxidoreductase was investigated by storage in the buffer systems mentioned in Table 3.
  • the various buffers (50 mM) in the range of pH 4 to 11 were prepared and the oxidoreductase prepared according to Example 4 was diluted with it. After incubation for 30, 60 and 300 minutes, 10 ⁇ l were taken from the batch and used in the activity test according to Example 1.
  • the enzyme activity was measured in the temperature range from 15 0 C to 70 0 C in Standardmeßanthesis. As can be seen from Table 4, the enzyme has its maximum activity at 45 ° C, then the activity decreases rapidly.
  • the temperature stability for the range of 15 0 C to 70 0 C was determined.
  • a 1:20 dilution of the purified oxidoreductase was incubated for 60 min and 180 min at the respective temperature and then measured at 30 ° C. with the above test mixture.
  • the starting value used was the measured value obtained immediately after dilution of the purified oxidoreductase in potassium phosphate buffer at pH 7.0. This value was also set as 100% in this example.
  • the enzyme is completely stable in a temperature range of 15 0 C to 40 0 C and shows no loss of activity after 3 h incubation. At 55 ° C no enzyme activity is detectable after 30 minutes.
  • the substrate spectrum of the oxidoreductase according to the invention was determined by measuring the enzyme activity with a series of ketones, oxo acids and their esters. For this purpose, the standard measurement approach according to Example 5.1 was used with different substrates The activity with ethyl 4-chloroacetoacetate was set equal to 100% and all other substrates were set in relation to it. For the ee value determination, the following reaction mixture was used for selected substrates.
  • nb does not mean determined As can be seen from Table 5, a broad spectrum of 2- and 3-oxo acid esters as well as aromatic and aliphatic ketones are stereoselectively reduced by the oxidoreductase according to the invention.
  • the enzyme stability of the oxo-reductase from P. capsulata was investigated in the presence of organic solvents.
  • KPP potassium phosphate buffer
  • EtOH means ethanol
  • DSMO means dimethyl sulfoxide
  • oxidoreductase according to the invention is even stabilized in organic water-miscible and water-immiscible solvents compared with incubation in pure buffer.
  • the oxidoreductase according to the invention can therefore be used in a two-phase system, as described in DE 10119274 A1. 5.7 Preparative reactions

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Abstract

Eine NADH abhängige Oxidoreduktase wird aus Hefen, beispielsweise der Gattung Pichia, insbesondere aus Pichia capsulata gewonnen und in einem enzymatisches Verfahren zur enantioselektiven Reduktion organischer Ketoverbindungen zu den entsprechenden (S)-Hydroxyverbindungen und in einem enzymatischen Verfahren zur enantioselektiven Gewinnung von (S)-Hydroxybverbindungen im Zwei-Phasen-System unter Verwendung der isolierten rekombinant überexprimierten Oxidoreduktase aus Pichia capsulata eingesetzt.

Description

Oxidoreduktase aus Pichia capsulata
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Oxidoreduktase, ein Verfahren zur enantioselektiven Reduktion von Carbonylverbindungen zu den entsprechenden (S)- Hydroxyverbindungen und ein Verfahren zur Gewinnung der chiralen (R)- Hydroxyverbindung.
Optisch aktive Hydroxyverbindungen sind wertvolle chirale Bausteine mit breiter Anwendung für die Synthese von pharmakologisch wirksamen Verbindungen, aromatischer Substanzen, Pheromonen, Agrochemikalien oder Enzyminhibitoren.
Die Zahl der für großtechnische Anwendungen in der Biokatalyse geeigneter und in ausreichendem Maße preiswert zur Verfügung stehender Carbonylreduktasen ist dabei sehr begrenzt. Die folgenden NADH abhängigen S-spezifischen Carbonyl-reduktasen sind bekannt:
Alkoholdehydrogenase aus Pferdeleber (HLADH) (Enzyme Engineering, VoI 6, 1982,
Seite 107).
Alkoholdehydrogenase aus Hefe (YADH) (Alcohol dehydrogenases: The Enzymes, (1963) Seiten 25-83. New York: Academic Press),
Carbonylreduktase aus Candida parapsilosis (CPCR) (US 5,523,223 und US
5,763,236),
Carbonylreduktase aus Rhodococcus erythropolis (RECR) (US 5,523,223) und
Norcardia fusca (Biosci. Biotechnol. Biochem.,63 (10) (1999), Seiten 1721-1729), Alkohodehydrogenase aus Candida boidinii (Biochim,. Biophys. Acta 716, (1982),
Seiten 298-307) oder Alkoholdehydrogenase aus Sulfolobus solfataricus (FEMS Microbiology Letters, 170 (1999), Seiten 31-39).
Keine der genannten Carbonylreduktasen hat bisher großtechnisch Anwendung gefunden. Der Hauptgrund hierfür ist neben den oft zu engen Substratspektren oder der geringen Enantioselektivität der Enzyme vor allem die Verfügbarkeit dieser Enzyme. Die meisten der genannten Enzyme konnten bisher nicht in ausreichendem Maße zu günstigen Preisen zur Verfügung gestellt werden.
Ein weiteres Problem bei der Anwendung der genannten Carbonylreduktasen ist die Regenerierung der Cofaktoren NADH oder NADPH. Die bekannten Verfahren verwenden entweder substratgekoppelte Coenzymregenerierung, beispielsweise mit 2-Propanol, oder enzymgekoppelter Coenzymregenerierung, beispielsweise mit Formiatdehydrogenase.
Nachteil der enzymgekoppelten Coenzymregenerierung mit Formiatdehydrogenase ist deren niedrige spezifische Aktivität (4 bis 10 U/mg), daher ist selbst die rekombinante Formiatdehydrogenase vergleichsweise teuer (J. Biotechnol. Bioeng. [1999] 64, Seiten 187-193).
Nachteil der substratgekoppelten Coenzymregeneration mit Isopropanol ist die ungünstige Gleichgewichtslage und die unzureichende Enzymstabilität gegenüber den verwendeten Cosubstraten wie Isopropanol.
Aufgabe der Erfindung ist es, eine Oxidoreduktase zur Verfügung zu stellen, die sich durch ein breites Substratspektrum, hohe Enantioselektivität und durch hohe Stabilität gegenüber organischen Lösungsmitteln auszeichnet. Diese Aufgabe wird durch eine Oxidoreduktase in der Weise gelöst, dass sie in Anwesenheit von NADH und Wasser eine Carbonylverbindung zu der entsprechenden (S)-Hydroxyverbindung reduziert.
Es wurde nun gefunden, dass durch eine neue Oxidoreduktase die genannten Nachteile der Verfahren aus dem Stand der Technik behoben werden können.
Die Erfindung betrifft in zweckmäßiger Weise Oxidoreduktasen, die aus Hefen der Gattungen Pichia oder Candida, insbesondere aus Pichia capsulata gewinnbar sind.
Die Erfindung betrifft in weiterer Ausgestaltung Oxidoreduktase aus Pichia capsulata, die die DNA-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 8 und die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 9 aufweist. Diese Sequenzen sind im anliegenden Sequenzprotokoll beschrieben.
Die Erfindung betrifft in einer Ausführungsform Oxidoreduktase, bei der mehr als 70 % der Aminosäuren identisch sind mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 9 und die eine spezifische Aktivität von mehr als 1 μmol pro mg Protein aufweist, bezogen auf die Umsetzung von Ethyl-4-chlor-3-oxobuttersäure zu (R)-Ethyl-4-chlor-3-hydroxybutter- säure. Bevorzugt ist eine Oxidoreduktase, bei der 80 % bis 99,5 %, insbesondere 90 % bis 99,5 %, speziell 99 % bis 99,5 % identische Aminosäuren zu der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 9 sind. Die Messung der spezifischen Aktivität der Oxidoreduktase gemäß SEQ ID NO: 9 oder seiner wie nachfolgend definierten Derivate oder Analogons erfolgt mit dem Testsystem, das in Beispiel 1 beschrieben wird.
Die erfindungsgemäße Oxidoreduktase zeichnet sich dadurch ist, dass sie 1 bis 40 Aminosäuren zusätzlich oder 1 bis 40 Aminosäuren weniger aufweist als die Oxidoreduktase mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 9 und dass sie eine spezifische Aktivität von mehr als 1 μmol pro mg Protein aufweist, bezogen auf die - A -
Umsetzung von Ethyl-4-chlor-3-oxobuttersäure zu (R)-Ethyl-4-chlor-3-hydroxy- buttersäure. Bevorzugt sind die Oxidoreduktasen, worin 1 bis 25 Aminosäuren, insbesondere 2 bis 20 Aminosäuren, oder bevorzugt 3 bis 10 Aminosäuren mehr oder weniger als in der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 9 vorkommen.
Die Erfindung betrifft desweiteren die Oxidoreduktase, die die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 9 aufweist und ein-, zwei-, drei-, vier- oder fünffach durch ein wasserlösliches Polymer modifiziert ist und eine spezifische Aktivität mehr als 1 μmol pro mg Protein beträgt, bezogen auf die Umsetzung von Ethyl-4-chlor-3-oxobuttersäure zu (R)-Ethyl-4-chlor-3-hydroxy-buttersäure. Ein wasserlösliches Polymer ist beispielsweise Polyethylenglycol. Die Bindung des Polyethylenglycols erfolgt bevorzugt am N-terminalen Ende des Proteins gemäß SEQ ID NO: 9. Die Oxidoreduktase gemäß SEQ ID NO: 9 kann auch an einen Festkörper wie Polyethylen, Polystyrol, Polysaccharid, Cellulose oder Cellulosederivate gebunden sein.
Die Erfindung betrifft ferner ein Proteinfragment, das Fragmente der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 9 darstellt, mit einer Anzahl von 5 bis 30 Aminosäuren je Fragment. Bevorzugt sind Fragmente von SEQ ID NO: 9, mit einer Kettenlänge von 6 bis 25 Aminosäuren, insbesondere 8 bis 20 Aminosäuren oder 10 bis 18 Aminosäuren, insbesondere der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 10. Diese Fragmente können beispielsweise zum Auffinden der erfindungsgemäßen Oxidoreduktase aus Pichia capsulata oder aus beliebig anderen Mikroorganismen eingesetzt werden.
Die Erfindung betrifft ferner ein Fusionsprotein, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es die Oxidoreduktase mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 9 oder Fragmente der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 9 darstellt, mit einer Anzahl von 5 bis 30 Aminosäuren, die mit einem weiteren Polypeptid am N-terminalen oder Carboxy- terminalen Ende über eine Peptidbindung verbunden sind. Fusionsproteine können beispielsweise leichter von anderen Proteinen abgetrennt werden oder werden in einer größeren Menge in den Zellen exprimiert.
Die Erfindung betrifft ferner einen Antikörper, der spezifisch an die Oxidoreduktase gemäß SEQ ID NO: 9 oder SEQ ID NO: 10 bindet. Die Herstellung dieser Antikörper erfolgt nach bekannten Methoden durch Immunisierung von geeigneten Säugetieren und anschließender Gewinnung der Antikörper. Die Antikörper können monoklonal oder polyklonal sein.
Die Erfindung betrifft auch die isolierte Nukleinsäuresequenz, die für die Oxidoreduktase gemäß SEQ ID NO: 9 und SEQ ID NO: 10 kodiert.
Die Erfindung betrifft desweiteren eine isolierte DNA-Sequenz der Oxidoreduktase, die die Reduktion von Carbonylverbindung in Anwesenheit von NADH und Wasser zu den entsprechenden (S)-Hydroxy-verbindungen katalysiert, wobei die DNA-Sequenz ausgewählt wird aus der Gruppe
a) DNA-Sequenz, welche die Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 7 aufweist oder der jeweils komplementäre Strang, b) DNA-Sequenz, welche mit einer oder mehreren der DNA-Sequenzen gemäß a) Oderseinerkomplementären Stränge hybridisiert, wobei die Hybridisierung unter stringenten Bedingungen erfolgt, und c) DNA-Sequenz, welche auf Grund der Degeneration des genetischen Codes, ein Protein kodiert, das durch eine oder mehrere der DNA-Sequenzen gemäß a) oder b) kodiert wird.
Die Bedingungen bei der Hybridisierung sind in Sambrok and Rüssel, Molecular Cloning a laboratory Manual , Vo1 1 , Chapter 1 Protocol 30-32 beschrieben. Die Erfindung betrifft femer eine DNA-Sequenz, bei der mehr als 70 % der Nukleinsäurebasen mit der DNA-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 8 oder deren komplementären Strängen identisch sind und welche die Oxidoreduktase kodiert, die eine spezifische Aktivität von mehr als 1 μmol pro mg Protein aufweist, bezogen auf die Umsetzung von Ethyi-4-chlor-3-oxobuttersäure zu (R)-Ethyl-4-chlor-3-hydroxybutter- säure. Bevorzugt sind DNA-Sequenzen, worin 80 % bis 99,5 %, insbesondere 90 % bis 99,5 %, speziell 99 % bis 99,5 % der Nukleinsäurebasen identisch sind mit der DNA- Sequenz gemäß SEQ ID NO: 8.
Die Erfindung betrifft ferner eine Nukleinsäuresequenz mit 10 bis 50 Nukleinsäurebasen, die eine Sequenz aufweist, die einem Teil oder mehreren Teilen der DNA-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 8 oder deren komplementären Strängen entspricht. Bevorzugt ist eine Nukleinsäuresequenz mit 15 bis 45 Nukleinsäurebasen, insbesondere 20 bis 40 Basen oder 30 bis 40 Nukleinsäurebasen der genannten DNA- Sequenzen. Die genannten Nukleinsäuresequenzen sind geeignet als molekulare Proben oder als Primer für die Polymerase-Ketten-Vervielfältigungsreaktion (PCR).
Die Erfindung betrifft ferner einen Klonierungsvektor, enthaltend eine oder mehrere der obengenannten Nukleinsäure- oder DNA-Sequenzen. Die Erfindung betrifft ferner einen Expressionsvektor, der sich in einer Bakterien-, Insekten-, Pflanzen- oder Säugetierzelle befindet und eine oder mehrere der obengenannten Nukleinsäure- oder DNA-Sequenzen enthält, die in geeigneterweise mit einer Expressionskontrollsequenz verbunden sind. Die Erfindung betrifft ferner eine Wirtszelle, die eine Bakterien-, Hefe-, Insekten-, Pflanzen- oder Säugetierzelle ist und mit einem Expressionsvektor transformiert oder transferiert wurde.
Die Identitäten der vorgenannten DNA-Sequenzen oder Aminosäuresequenz werden dadurch berechnet, dass die Anzahl der Aminosäuren oder Nukleinsäurebasen summiert wird, die mit Teilsequenzen der jeweiligen Proteine oder DNA-Sequenzen identisch sind, und die Summe durch die Gesamtzahl der Aminosäuren oder Nukleinsäurebasen dividiert und mit Hundert multipliziert wird.
Geeignete Klonierungsvektoren sind beispielsweise ppCR-Script, pCMV-Script, pBluescript (Stratagene), pDrive cloning Vector (Quiagen, Hilden, Deutschland), pS Blue, pET Blue, pET LJC-Vektoren (Novagen, Madison, USA) sowie TA-PCR Klonierungsvektoren (Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland).
Geeignete Expressionsvektoren sind beispielsweise pKK223-3, pTrc99a, pUC, pTZ, pSK, pBluescript, pGEM, pQE, pET, PHUB, pPLc, pKC30, pRM1/pRM9, pTrxFus,pAS1 , pGEx, pMAL oder pTrx.
Geeignete Expressionskontrollsequenzen sind beispielsweise trp-lac (tac)-Promotor, trp-lac (trc) promotor, lac-Promotor, T7-Promotor oder λpL-Promotor.
Die Oxidoreduktase aus Pichia capsulata ist ein Homotetramer mit einem Molekulargewicht von 34 ± 2 kDa, bestimmt im SDS-GeI, und einem Molekulargewicht von 140 ± 10 kDa, bestimmt mit Gelpermeationchromatographie. Das Temperaturoptimum der Oxidoreduktase liegt im Bereich von 40 0C bis 45 0C, das pH- Optimum für die Reduktionsreaktion liegt im Bereich von 6,5 bis 7,0 und das pH- Optimum für die Oxidationsreaktion liegt im Bereich von 7.8 und 8,2. Die Oxidoreduktase aus Pichia capsulata weist eine gute Temperatur- und pH-Stabilität auf und ist im pH-Bereich von 5,5 bis 8,5 und im Temperaturbereich von 15 °C bis 40 0C für 5 Stunden stabil und zeigt ferner eine hohe Stabilität in organischen Lösungsmitteln.
Das Enzym ist insbesondere aus Hefen der Gattung Pichia isolierbar und kann im spektrophotometrischen Test über die Abnahme von NADH bei 340 nm in Gegenwart eines entsprechenden Substrates, beispielsweise Ethyl-4-chloro-3-oxobutyrat oder 2- Butanon, nachgewiesen werden. Die erfindungsgemäße Oxidoreduktase aus Pichia capsulata wurde kloniert und konnte in Escherichia coli (E. coli) mit Aktivitäten von 1000 bis 10 000 U/g E. coli Feuchtgewicht überexprimiert werden. Das Enzym ist preiswert und in großen Mengen verfügbar. Sequenzvergleiche in Datenbnaken zeigen auf, dass es sich bei der erfindungsgemäße Oxidoreduktase aus Pichia capsulata um eine Zink abhängige Carbonylreduktase handelt.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Gewinnung der Oxidoreduktase aus Pichia capsulata. Dazu wird die DNA, die für die Oxidoreduktase aus Pichia capsulata kodiert, beispielsweise in einem geeigneten prokaryotischen oder eukaryotischen Mikroorganismus exprimiert. Bevorzugt wird die Oxidoreduktase aus Pichia capsulata in einen E. coli Stamm transformiert und exprimiert, insbesondere in E. coli BL21star (DE3) Zellen.
Die Oxidoreduktase aus Pichia capsulata läßt sich beispielsweise so gewinnen, dass die oben genannten rekombinanten E. coli Zellen kultiviert werden, die Expression der Oxidoreduktase induziert wird und anschließend nach etwa 10 bis 18 Stunden (h) die Zellen durch Ultraschallbehandlung oder durch Naßvermahlung mit Glasperlen in einer Kugelmühle (Retsch, GmbH, Haan Deutschland 10 min, 24 Hz) aufgeschlossen werden. Der erhaltene Zellextrakt kann entweder direkt verwendet werden oder weiter gereinigt werden. Dazu wird der Zellextrakt beispielsweise zentrifugiert und der erhaltene Überstand wird einer lonenaustauschchromatographie unterworfen, beispielsweise durch lonenaustauschchromatographie in einem Q-Sepharose Fast Flow ® Gerät (Fa. Pharmacia).
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur enantioselektiven Reduktion von Carbonylverbindungen zu den entsprechenden (S)-Hydroxy Verbindungen, das dadurch gekennzeichnet ist, dass a) eine Carbonylverbindung in Anwesenheit der Oxidoreduktase gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 9, NADH und Wasser zur entsprechenden (S)-Hydroxyverbindung reduziert, und b) die gebildete chirale (S)-Hydroxyverbindung isoliert wird.
Das erfindungsgemäße Verfahren weist eine hohe Standzeit auf, eine enantiomeren Reinheit von mehr als 95 % der hergestellten chiralen (S)-Hydroxyverbindungen und eine hohe Ausbeute bezogen auf die eingesetzte Menge der Carbonylverbindung.
Unter dem Begriff "NADH" wird reduziertes Nicotinamid-adenin-dinucleotid verstanden. Unter dem Begriff "NAD" wird Nicotinamid-adenin-dinucleotid verstanden.
Unter dem Begriff "Carbonylverbindung" werden beispielsweise Verbindungen der Formel I R1-C(O)-R2 (I) verstanden.
Der Rest R1 steht beispielsweise für
1) -(C1-C2O)-AIKyI, worin Alkyl geradkettig oder verzweigt ist, 2) (C2-C20)-Alkenyl, worin Alkenyl geradkettig oder verzweigt ist und je nach Kettenlänge ein, zwei, drei oder vier Doppelbindungen enthält,
3) -(C2-C20)-Alkinyl, worin Alkinyl geradkettig oderverzweigt ist und gegebenenfalls ein, zwei, drei oder vier Dreifachbindungen enthält,
4) -(C6-C14)-Aryl, 5) -(C1-C8)-Alkyl-(C6-C14)-Aryl,
6) -(C5-C14)-Heterocyclus, der unsubstituiert oder ein- bis dreifach substituiert ist durch Halogen, Hydroxyl, Amino oder Nitro, oder
7) -(C3-C7)-Cycloalkyl, wobei die unter 1 ) bis 7) genannten Reste unsubstituiert sind oder ein-, zwei- oder dreifach substituiert sind, unabhängig voneinander, durch a) -OH, b) Halogen, wie Fluor, Chlor, Brom oder Jod, 5 c) -NO2 oder d) -NH2.
Der Rest R2 steht beispielsweise für
1 ) -(C1-C8)-AIKyI, worin Alkyl geradkettig oder verzweigt ist, lo 2) -(C2-Cg)-AI kenyl, worin Alkenyl geradkettig oder verzweigt ist und je nach Kettenlänge ein, zwei oder drei Doppelbindungen enthält,
3) -(C2-C6)-Alkinyl, worin Alkinyl geradkettig oder verzweigt ist und gegebenenfalls ein oder zwei Dreifachbindungen enthält, oder
4) -(C0-C10)-Alkyl-C(O)-O-(CrC6)-Alkyl, worin Alkyl gerade oder verzweigt ist und i5 unsubstituiert oder ein- bis dreifach substituiert ist durch Halogen, Hydroxyl,
Amino oder Nitro,
wobei die unter 1 ) bis 4) genannten Reste unsubstituiert sind oder ein-, zwei- oder dreifach substituiert sind unabhängig voneinander durch 20 a) -OH, b) Halogen, wie Fluor, Chlor, Brom oder Jod, c) -NO2 oder d) -NH2.
25 Unter dem Begriff chirale "(S)-Hydroxyverbindung" werden beispielsweise Verbindungen der Formel Il
R1-C(OH)-R2 (II) verstanden, wobei die -OH Gruppe in der Regel in (S)-Konfiguration zum Kohlenstoffatom steht, an das sie gebunden ist und R1 und R2 die Bedeutung wie in Formel I haben.
Sollte jedoch in der Nähe des Alkohols eine Carbonylgruppe oder ein Halogenatom stehen, ändert sich die Nomenklatur und die enantioselektiven Alkohole werden dann auch als (R)-Alkohole bezeichnet. Dies ist jedoch nur eine Frage der Nomenklatur, aber ändert nichts an der stereoselektiven Art und Weise wie die erfindungsgemäße Oxidoreduktase die Reduktion durchführt.
Unter dem Begriff Aryl werden aromatische Kohlenstoffreste verstanden mit 6 bis 14 Kohlenstoffatomen im Ring. -(C6-C14)-Arylreste sind beispielsweise Phenyl, Naphthyl, 1-Naphthyl, 2-Naphthyl, Biphenylyl, 2-Biphenylyl, 3-Biphenylyl und 4-Biphenylyl, Anthryl oder Fluorenyl. Biphenylylreste, Naphthylreste und insbesondere Phenylreste sind bevorzugte Arylreste. Unter dem Begriff "Halogen" wird ein Element aus der Reihe Fluor, Chlor, Brom oder Jod verstanden. Unter dem Begriff "-(CrC20)-Alkyl wird ein Kohlenwasserstoffrest verstanden, dessen Kohlenstoffkette geradkettig oder verzweigt ist und 1 bis 20 Kohlenstoffatome enthält beispielsweise Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, tertiär-Butyl, Pentyl, Hexyl, Heptyl, Octyl, Nonenyl oderDecanyl. Unter dem Begriff "-C0-Alkyl" wird eine kovalente Bindung verstanden.
Unter dem Begriff "-(C3-C7)-Cycloalkyr werden cyclische Kohlenwasserstoffreste verstanden wie Cyclopropyl, Cylobutyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl oder Cycloheptyl.
Der Begriff "-(C5-C14)-Heterocyclus" steht für einen monocyclischen oder bicyclischen 5-gliedrigen bis 14-gliedrigen heterocyclischen Ring, der teilweise gesättigt oder vollständig gesättigt ist. Beispiele für Heteroatome sind N, O und S. Beispiele für die Begriffe -(C5-C14)-Heterocyclus sind Reste, die sich von Pyrrol, Furan, Thiophen, Imidazol, Pyrazol, Oxazol, Isoxazol, Thiazol, Isothiazol, Tetrazol, 1 ,2,3,5-Oxathiadiazol- 2-Oxide, Triazolone, Oxadiazolone, Isoxazolone, Oxadiazolidindione, Triazole, welche durch F, -CN, -CF3 oder -C(O)-O-(CrC4)-Alkyl substituiert sind, 3-Hydroxypyrro-2,4- dione, 5-Oxo-1 ,2,4-Thiadiazole, Pyridin, Pyrazin, Pyrimidin, Indol, Isoindol, Indazol, Phthalazin, Chinolin, Isochinolin, Chinoxalin, Chinazolin, Cinnolin, -Carbolin und benz- anellierte, cyclopenta-, cyclohexa- oder cyclohepta-anellierte Derivate dieser Heterocyclen ableiten. Insbesondere bevorzugt sind die Reste 2- oder 3-Pyrrolyl, Phenylpyrrolyl wie 4- oder 5-Phenyl-2-pyrrolyl, 2-Furyl, 2-Thienyl, 4-lmidazolyl, Methyl- imidazolyl, zum Beispiel 1 -Methyl-2-, -4- oder-5-imidazolyl, 1 ,3-Thiazol-2-yl, 2-Pyridyl, 3-Pyridyl, 4-Pyridyl, 2-, 3- oder4-Pyridyl-N-oxid, 2-Pyrazinyl, 2-, 4- oder 5-Pyrimidinyl, 2-, 3- oder 5-lndolyl, substituiertes 2-lndolyl, zum Beispiel 1 -Methyl-, 5-Methyl-, 5- Methoxy-, 5-Benzyloxy-, 5-Chlor- oder 4,5-Dimethyl-2-indolyl, 1-Benzyl-2- oder -3- indolyl,4,5,6,7-Tetrahydro-2-indolyl, Cyclohepta[b]-5-pyrrolyl, 2-, 3-oder4-Chinolyl, 1-, 3- oder4-lsochinolyl, 1-Oxo-1 ,2-dihydro-3-isochinolyl, 2-Chinoxalinyl, 2-Benzofuranyl, 2-Benzo-thienyl, 2-Benzoxazolyl oder Benzothiazolyl oder Dihydropyridinyl, Pyrrolidinyl, zum Beispiel 2-oder3-(N-Methylpyrrolidinyl), Piperazinyl, Morpholinyl, Thiomorpholinyl, Tetrahydrothienyl oder Benzodioxolanyl.
Bevorzugte Verbindungen der Formel I sind beispielsweise Ethyl-4-chloracetoacetat, Methylacetoacetat, Ethyl-8-chloro-6-oxooctansäure, Ethyl-3-oxovaleriat, 4-Hydroxy-2- butanon, Ethyl-2-oxovaleriat, Ethyl-2-oxo-4-phenylbuttersäure, Ethylpyruvat, Ethylphenylglyoxylat, i-Phenyl^-propanon^.S-Dichloracetophenon.Acetophenon^- Octanon, 3-Octanon oder 2-Butanon.
Die entsprechend gebildeten S-Alkohole sind beispielsweise (R)-Ethyl-4-chloro-3- hydroxybuttersäure, Ethyl-(S)-2-Hydroxy-4-phenylbuttersäure, (S)-2-Octanol oder (R)- Ethyl-δ-chlor-θ-hydroxyoctansäure.
Geeignete Oxidoreduktasen stammen beispielsweise aus Pichia capsulata. Die
Oxidoreduktase kann in dem erfindungsgemäßen Verfahren entweder vollständig gereinigt oder teilweise gereinigt eingesetzt werden. Das Verfahren wird mit der erfindungsgemäßen Oxidoreduktase odermitZellen, enthaltend die erfindungsgemäße Oxidoreduktase, durchgeführt. Die eingesetzten Zellen können dabei nativ, permeabilisiert oder lysiert vorliegen. Bevorzugt wird die klonierte Oxidoreduktase gemäß SEQ ID NO: 9 eingesetzt.
Die Volumenaktivität der eingesetzten Oxidoreduktase beträgt von 100 Units/ml (U/ml) bis 5000 U/ml, bevorzugt etwa 500 U/ml.
Je kg umzusetzender Verbindung der Formel I werden 5000 bis 2 000 000 U Oxidoreduktase eingesetzt, bevorzugt etwa 10000- 200000 U. Der Enzymeinheit 1 U entspricht dabei der Enzymmenge die benötigt wird um 1 μmol der Verbindung der Formel I je Minute (min) umzusetzen.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur enantioselektiven Reduktion von Carbonylverbindungen zu den entsprechenden (S)-Hydroxyverbindungen, bei dem
a) eine Carbonylverbindung in Anwesenheit der erfindungsgemäßen Oxidoreduktase, NADH und Wasser zur entsprechenden (S)-Hydroxy- verbindung reduziert wird, b) das durch die Oxidoreduktase gebildete NAD mit einem Cosubstrat zu NADH reduziert und c) die gebildete chirale (S)-Hydroxyverbindung isoliert wird.
Die eingesetzten Mengen der Carbonylverbindungen und Oxidoreduktasen entsprechen den zuvor genannten Mengen in den beschriebenen Verfahren. Geeignete Cosubstrate für das erfindungsgemäße Verfahren sind Alkohole wie Ethanol, 2- Propanol (Isopropanol), 2-Butanol, 2-Pentanol oder 2-Octanol. Diese Cosubstrate werden mit Hilfe der erfindungsgemäßen Oxidoreduktase und NAD zu den entsprechenden Ketonen und NADH umgesetzt. Dadurch kommt es zur Regenerierung des NADH's. Die Menge des Cosubstrats für die Regenerierung von NAD zu NADH wie Isopropanol beträgt von 5 % bis 50 % bezogen auf das Gesamtvolumen, bevorzugt von 8 % bis 20 %, insbesondere von 10 % bis 15 %.
Die Erfindung betrifft desweiteren ein Verfahren zur enantioselektiven Gewinnung von (S)-Hydroxyverbindungen, bei dem
a) eine Carbonylverbindung in Anwesenheit der erfindungsgemäßen Oxidoreduktase, NADH und Wasser zur entsprechenden (S)-Hydroxy- Verbindung reduziert wird, b) das durch die Oxidoreduktase gebildete NAD mit einer Dehydrogenase und einem Cosubstrat zu NADH reduziert und c) die gebildete chirale (S)-Hydroxyverbindung isoliert wird.
Geeignete Dehydrogenasen sind beispielsweise NADH abhängige Alkohol- Dehydrogenasen aus Bäckerhefe, aus Candida boidinii oder Candida parapsilosis. Geeignete Cosubstrate für die eingesetzte Alkohol-Dehydrogenase sind Alkohole wie Ethanol, 2-Propanol (Isopropanol), 2-Butanol, 2-Pentanol oder 2-Octanol.
Ferner kann die NAD-Reduktion auch mittels Formiat-Dehydrogenase (Tishkov et al., J. Biotechnol. Bioeng. [1999] 64, 187-193, Pilot-scale production and isolation of recombinant NAD and NADP specific formate dehydrogenase) durchgeführt werden. Geeignete Cosubstrate der Formiat-Dehydrogenase sind beispielsweise Salze der Ameisensäure wie Ammoniumformiat, Natriumformiat oder Calciumformiat.
Bevorzugt kommt die substratgekoppelte Coenzymregenerierung mit einem sekundären Alkohol wie Ethanol, 2-Propanol (Isopropanol), 2-Butanol, 2-Pentanol oder 2-Octanol zur Anwendung. Daher wird das Verfahren bevorzugt ohne eine zusätzliche Dehydrogenase durchgeführt. Dem im Verfahren eingesetzten Wasser wird bevorzugt ein Puffer zugesetzt, beispielsweise Kaliumphosphat-, Tris/HCI- oder Triethanolamin-Puffer mit einem pH- Wert von 5 bis 10, vorzugsweise einem pH-Wert von 6 bis 9. Die Pufferkonzentration beträgt von 10 mM bis 150 mM.
Der Puffer kann zusätzlich noch Ionen zur Stabilisierung oder Aktivierung der Enzyme enthalten, beispielsweise Zinkionen oder Magnesiumionen.
Die Temperatur beträgt beispielsweise 10 0C bis 60 0C, bevorzugt 30 0C bis 55 0C.
Die Erfindung betrifft desweiteren ein Verfahren zur enantioselektiven Gewinnung von (S)-Hydroxyverbindungen, bei dem
a) eine Carbonylverbindung in Anwesenheit der Oxidoreduktase, NADH und Wasser zur entsprechenden (S)-Hydroxy-verbindung reduziert wird, b) die Reaktionen in Anwesenheit eines organischen Lösungsmittel durchgeführt und c) die gebildete chirale (S)-Hydroxyverbindung isoliert wird.
Die bevorzugten organischen Lösungsmittel sind beispielsweise Diethylether, tertiär-
Butylmethylether, Diisopropylether, Dibutylether, Butylacetat, Heptan, Hexan oder Cyclohexan.
Der Reaktionsansatz besteht beim Einsatz zusätzlicher Lösungsmittel aus einer wässrigen Phase und einer organischen Phase. Die organische Phase wird durch ein geeignetes Lösungsmittel, in dem das Substrat gelöst vorliegt, oder durch das wasserunlösliche Substrat selbst gebildet.
Die organische Phase beträgt dabei 5 % bis 80 % des gesamten Reaktionsvolumens, bevorzugt 10 % bis 40 %. Das Wasser bildet im erfindungsgemäßen Zwei-Phasen-System die eine flüssige Phase und das organische Lösungsmittel bildet die zweite flüssige Phase. Gegebenenfalls kann auch noch eine feste oder weitere flüssige Phase vorliegen, die beispielsweise durch nicht vollständig gelöste Oxidoreduktase und/oder hinzugefügte Enzyme oder durch die Carbonylverbindung entsteht. Bevorzugt sind jedoch zwei flüssige Phasen ohne feste Phase. Die zwei flüssigen Phasen werden bevorzugt mechanisch gemischt, so dass große Oberflächen zwischen den beiden flüssigen Phasen ausgebildet werden.
Die Konzentration des Cofaktors NADH bezogen auf die wässrige Phase beträgt 0,01 mM bis 1 mM, insbesondere 0,05 mM bis 0,2 mM.
Die Carbonylverbindung wird im erfindungsgemäßen Verfahren in einer Menge von 3 % bis 30 % bezogen auf das Gesamtvolumen eingesetzt, bevorzugt von 5 % bis 15 %, insbesondere von 10 %.
Die Erfindung betrifft femer ein Verfahren zur enantioselektiven Reduktion von Carbonylverbindungen zu den entsprechenden (S)-Hydroxyverbindungen, bei dem
a) eine Carbonylverbindung in Anwesenheit der Oxidoreduktase, NADH und
Wasser zur entsprechenden (S)-Hydroxy-verbindung reduziert wird, b) die Reaktionen in Anwesenheit eines organischen Lösungsmittel durchgeführt wird, c) das durch die Oxidoreduktase gebildete NAD mit einem Cosubstrat zu NADH reduziert und d) die gebildete chirale (S)-Hydroxyverbindung isoliert wird.
Die eingesetzten Mengen der Carbonylverbindungen und Oxidoreduktasen entsprechen den zuvor genannten Verfahren. Geeignete Cosubstrate für das Verfahren sind Alkohole wie Ethanol, 2-Propanol (Isopropanol), 2-Butanol, 2-Pentanol oder 2- Octanol. Diese Cosubstrate werden mit Hilfe der Oxidoreduktase und NAD zu den entsprechenden Ketonen und NADH umgesetzt. Dadurch kommt es zur Regenerierung des NADH's.
Die Menge des Cosubstrats wie Isopropnaol für die Regenerierung von NAD zu NADH beträgt 5 % bis 50 %, bezogen auf das Gesamtvolumen, bevorzugt 8 % bis 20 % und insbesondere 10 % bis 15 %.
Die Erfindung betrifft desweiteren ein Verfahren zur enantioselektiven Reduktion von Carbonylverbindungen zu den entsprechenden (S)-Hydroxyverbindungen, bei dem
a) eine Carbonylverbindung in Anwesenheit der Oxidoreduktase, NADH und Wasser zur entsprechenden (S)-Hydroxyverbindung reduziert wird, b) das durch die Oxidoreduktase gebildete NAD mit einer Dehydrogenase und einem Cosubstrat gleichzeitig zu NADH reduziert, c) die Reaktionen in Anwesenheit eines organischen Lösungsmittel durchgeführt und d) die gebildete chirale (S)-Hydroxyverbindung isoliert wird.
Bevorzugt wird im erfindungsgemäßen Verfahren noch ein weiterer Stabilisator der Alkohol-Dehydrogenase eingesetzt. Geeignete Stabilisatoren sind beispielsweise Glycerin, Sorbitol, 1 ,4 -DL-Dithiothreit (DTT) oder Dimethylsulfoxid (DMSO).
Das erfindungsgemäße Verfahren wird beispielsweise in einem geschlossen Reaktionsgefäß aus Glas oder Metall durchgeführt. Dazu werden die Komponenten einzeln in das Reaktionsgefäß übergeführt und unter einer Atmosphäre von beispielsweise Stickstoff oder Luft gerührt. Je nach Substrat und eingesetzter Carbonylverbindung beträgt die Reaktionszeit 1 Stunde bis 48 Stunden, insbesondere 2 Stunden bis 24 Stunden. Anschließend wird das Reaktionsgemisch aufgearbeitet. Dazu wird diewässrige Phase abgetrennt und die organische Phase gefiltert. Die wässrige Phase kann gegebenenfalls noch einmal extrahiert werden und wie die organische Phase weiter aufgearbeitet werden. Danach wird gegebenenfalls das Lösungsmittel aus der gefilterten organischen Phase verdampft. Auf diese Weise wird das Produkt (R)-Ethyl-4- chlor-3-hydroxybuttersäure mit einer Enantiomerenreinheit von mehr als 99 % und im wesentlichen frei vom Edukt Ethyl-4-chloracetoacetat erhalten. Die Gesamtausbeute der Prozesses beträgt nach Destillation des Produktes 50 % bis 95 %, bezogen auf die eingesetzte Eduktmenge.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Gewinnung von chiralen (R)-Hydroxy- verbindungen der Formel II,
R1-C(OH)-R2 (II)
mit den Resten R1 und R2 wie sie zuvor definiert sind. Bei diesem Verfahren wird
a) ein Gemisch, enthaltend die racemische Verbindung der Formel II, mit der erfindungsgemäßen Oxidoreduktase, NAD und Wasser inkubiert und b) die verbliebene chirale (R)-Hydroxyverbindung der Formel Il isoliert.
Hierbei wird die (S)-Hydroxyverbindung der Formel Il zur entsprechenden Ketoverbindung und NADH umgesetzt.
Die Erfindung betrifft desweiteren ein Verfahren zur Gewinnung von chiralen (R)- Hydroxyverbindungen der Formel II, bei dem
a) ein Gemisch, enthaltend die racemische Verbindung der Formel II, mit der erfindungsgemäße Oxidoreduktase, NAD und Wasser inkubiert wird, b) das durch die Oxidoreduktase gebildete NADH mit einem Cosubstrat zu NAD oxidiert und c) die verbliebene chirale (R)-Hydroxyverbindung der Formel Il isoliert wird.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Gewinnung von chiralen (R)-Hydroxy- verbindungen der Formel II, bei dem
a) ein Gemisch, enthaltend die racemische Verbindung der Formel II, mit der erfindungsgemäße Oxidoreduktase, NAD und Wasser inkubiert wird, b) das durch die Oxidoreduktase gebildete NADH mit einer Dehydrogenase und einem Cosubstrat zu NAD oxidiert und c) die verbliebene chirale (R)-Hydroxyverbindung der Formel Il isoliert wird.
Die Erfindung betrifft in weiterer Ausgestaltung ein Verfahren zur Gewinnung von chiralen (R)-Hydroxyverbindungen der Formel II, bei dem
a) ein Gemisch, enthaltend die racemische Verbindung der Formel II, mit der erfindungsgemäße Oxidoreduktase, NAD und Wasser inkubiert wird, b) die Reaktionen in Anwesenheit eines organischen Lösungsmittels durchgeführt und c) die verbliebene chirale (R)-Hydroxyverbindung der Formel Ii isoliert wird.
Ein weiteres erfindungsgemäßes Verfahren zur Gewinnung von chiralen (R)-Hydroxy- verbindungen der Formel Il zeichnet sich dadurch aus, dass
a) ein Gemisch, enthaltend die racemische Verbindung der Formel II, mit der erfindungsgemäße Oxidoreduktase, NAD und Wasser inkubiert wird, b) die Reaktionen in Anwesenheit eines organischen Lösungsmittels durchgeführt, c) das durch die Oxidoreduktase gebildete NADH mit einer Dehydrogenase und einem Cosubstrat zu NAD oxidiert und d) die verbliebene chirale (R)-Hydroxyverbindung der Formel Il isoliert wird.
Die Reaktionsbedingungen sind im wesentlichen dieselben wie im zuvor genannten Verfahren zur enantiospezifischen Reduktion der Ketoverbindungen der Formel I. Es wird jedoch statt einer enantioselektiven Reduktion der Ketoverbindung der Formel I aus dem racemischen Gemisch der Verbindung der Formel Il nur die (S)- Hydroxyverbindung der Formel Il enantioselektiv zur entsprechenden Ketoverbindung oxydiert. Dadurch verbleibt die (R)-Hydroxyverbindung der Formel Il und kann isoliert werden.
Ferner wird im Verfahren anstelle der als Cosubstrate eingesetzten Alkohole wie Ethanol, 2-Propanol (Isopropanol), 2-Butanol, 2-Pentanol oder 2-Octanol, deren entsprechenden Ketone wie Aceton zur Regenerierung des NAD eingesetzt. Beispielsweise wird das Aceton und NADH mit der erfindungsgemäßen Oxidoreduktase oder einer zusätzlichen Dehydrogenase zu NAD und Isopropanol umgesetzt. Die eingesetzten Ketonmengen betragen von 5 % bis 50 % bezogen auf das Gesamtvolumen, bevorzugt 8 % bis 20 % und insbesondere von 10 % bis 15 %.
Die Erfindung wird im folgenden anhand von Beispielen erläutert.
Beispiele
Beispiel 1 : Screening von Hefen nach S-spezifischer Alkoholdehydrogenase
Zum Screening wurde eine Reihe verschiedener Hefestämme in folgendem Medium kultiviert (Angaben jeweils g/l): Hefeextrakt (3), Malzextrakt (3), Peptone (5) und Glucose (10). Das Medium wurde bei 121 0C sterilisiert und die Hefen wurden ohne weitere pH-Regulierung bei 25 °C und auf einem Schüttler bei 160 Umdrehungen pro Minute (rpm) kultiviert. Anschließend wurden 125 mg Zellen mit 800 μl Aufschlusspuffer (100 mM Trieethanolamin (TEA), pH = 7,0) resuspendiert, mit 1 g Glasperlen versetzt und 10 Minuten (min) bei 4 0C in der Kugelmühle aufgeschlossen (Firma Retsch). Der nach 2 min Zentrifugieren mit 12000 rpm erhaltene Überstand (Lysat) wurde im folgenden Aktivitätsscreening und zur Bestimmung des Enatiomerenüberschusses (ee- Wert) eingesetzt. Als Substrate wurden Ethyl-4-chloracetoacetat und 2-Chloro-1-(3- chlorophenyl)ethan-1-on eingesetzt.
Ansatz fürs Aktivitätsscreening:
860 μl 0,1 M KH2PO4/K2PO4 pH = 7,0 1 mM MgCI2 20 μl NADPH oder NADH (10 mM)
20 μl Lysat
100 μl jeweilige Substrat (100 mM)
Die Reaktion wurde 1 min bei einer Wellenlänge von 340 nm verfolgt.
Ansatz für ee-Wert Bestimmung:
20 μl Lysat
100 μl NADH oder NADPH (50 mM)
60 μl Substrat (Ethyl-4-chloracetoacetat 100 mM)
Die Ansätze zur ee-Bestimmung wurden nach 24 Stunden (h) mit Chloroform extrahiert und mittels Gaschromatographie (GC) wurde der Enantiomerenüberschuss bestimmt. Der Enantiomerenüberschuss wird wie folgt berechnet: ee(%) = ((R-Alkohol -S-Alkohol)/(R-Alkohol+ S-Alkohol)) x 100. DSMZ Nr. Mikrorganismen- Ethyl-4-chloracetoacetat name Aktivität in U/g Zellen Wirtsorganismus NADH NADPH ee- Wert ee-Wert
NADH NADPH
1345 Yarrowia lipolytika 0 15 % S
3434 Kluyveromyces 0 6 — thermotolerans
3435 Metschnikowia zobelli 0 12 — —
3795 Kluyveromyces lactis 0 15 80 % S 90 % S
70130 Pichia anomala 0 9 68 % S 90 % S
70169 Pichia 0 8 — — membranefaciens
70277 Pichia angusta 13 4,5 racemat 30 % S
70382 Pichia pastoris 16 16 64 % S 81 % S
70638 Candida magnoliae 2,5 10 — 80 % R
70125 Candida parapsilosis 25 11 52 % R 70 % S
2147 Pichia methanolica 18 27 84 % S 90 % S
C a n d i d a 8 13 94 % S 94 % S methylica
70260 Pichia capsulata 50 5 100 % R
DSMZ steht für Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen, Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig
Definition der Enzymeinheiten: 1 U entspricht der Enzymmenge die benötigt wird um 1 μmol Substrat pro min umzusetzen.
Beispiel 2: Isolierung einer NADH abhängigen (S)-spezifischen Oxidoreduktase aus Pichia capsulata
Zur Isolierung der NADH abhängigen Oxidoreduktase aus Pichia capsulata (P. capsulata) wurde der Mikrorganismus wie unter Beispiel 1 beschrieben kultiviert. Nach Erreichen der stationären Phase wurden die Zellen geerntet und durch Zentrifugieren vom Medium getrennt. Die Enzymfreisetzung erfolgte durch Naßvermahlung mittels Glasperlen, kann aber auch durch andere Aufschlussmethoden erreicht werden. Dazu wurden 10O g P. capsulata mit 400 ml Aufschlusspuffer (100 mM Trieethanolamin, 1 mM MgCI2, pH =7,0) suspendiert und mittels einer French press homogenisiert.
Der nach dem Zentrifugieren (7000 rpm) erhaltene Rohextrakt wurde dann mittels FPLC (fast protein liquid chromatography) weiter gereinigt und aufbereitet.
Die erfindungsgemäße Oxidoreduktase konnte in zwei hintereinander folgenden Schritten mittels lonenaustauschchromatographie an Q-Sepharose Fast Flow (Firma Pharmacia) und Uno Q (Biorad, München, Deutschland) aufgereinigt werden. Dazu wurde das nach dem Zentrifugieren erhaltene Lysat direkt auf eine mit 50 mM Kaliumphosphatpuffer pH = 7,0 äquilibrierte Q-Sepharose FF-Säule aufgetragen und mit steigendem linearen Salzgradienten eluiert. Die Oxidoreduktase wurde dabei bei 0,2 bis 0,3 M NaCI eluiert. Die oxidoreduktase-enthaltenen Fraktionen wurden vereinigt und mittels Ultrafiltration (Ausschlussgrenze 10 kDa) auf ein geeignetes Volumen eingeengt. Anschließend wurde die eingeengten Fraktionen der Oxidoreduktase mittels Uno Q unter Verwendung derselben obengenannten Puffer weiter aufbereitet und gereinigt. Das Enzym wurde dabei bei 0,1 M NaCI eluiert.
Danach wurde das Molekulargewicht der erhaltenen gereinigten Oxidoreduktase mit Hilfe von Gelpermeation (Superdex 200 HR; Pharmacia, 100 mM Trieethanolamin, pH = 7, 0,15 M NaCI ) bestimmt.
Als Molekulargewichtsstandards wurden Catalase (232 kDa), Aldolase (158 kDa), Albumin (69,8kDa) und Ovalbumin (49,4 kDa) verwendet.
Die folgende Tabelle 2 fasst die erhaltenen Ergebnisse zusammen Tabelle 2:
Reinigungsschritt Volumen Aktivität Gesamtaktivität Spezifische Ausbeute [ml] [U/ml] [U] Aktivität
[U/mg]
Rohextrakt 360 2,0 752 0,07 100 %
Q-Sepharose 67 5,3 358 5 47 %
Uno Q 3,5 14 50 41 6,6 %
Die Enzymaktivität der Oxidoreduktase wurde im Testsystem gemäß Beispiel 1 , (Ansatz Aktivitätsscreening) bestimmt und die Bestimmung der Proteinmenge erfolgte gemäß Lowry et al. Journal of Biological Chemistry, 193 (1951): 265-275 oder Peterson et al., Analytical Biochemistry, 100 (1979): 201-220). Der Quotient von Enzymaktivität zu Proteinmenge ergibt die spezifische Aktivität, wobei der Umsatz von 1 μmol pro min 1 Unit (U) entspricht.
Das mittels Gelpermation bestimmte Molekulargewicht der erfindungsgemäßen Oxidoreduktase betrug im nativen Zustand 140 ±10 kDa. Bθispiθl 3: Bestimmung der N-terminalen Sequenz der erfindungsgemäßen Oxidoreduktase
Die Enzympräparation nach Beispiel 2 wurde nach der Gelpermeation im 10 % igen 5 Natriumdodecylsulfat (SDS) Gel aufgetrennt und auf eine Polyvinyliden Diflourid- Membran (PVDF-Membran) übertragen.
Die auffällige Bande bei etwa 35 bis 45 kDa wurde einer N-terminalen Sequenzierung mittels Edman-Abbau (Procise 492 (PE-Biosystems) unterworfen. Es wurde folgende N-terminale Sequenz erhalten: 0
SEQ ID NO: 10
KTQAGYIFKKGA
5
Beispiel 4: Klonierung der Oxidoreduktase aus Pichia capsulata
Der eukaryotische Mikrorganismus Pichia capsulata gehört zu der Familie Saccaromycetacea. Die Genomstruktur dieses Organismus weist eine Exon-Intron 0 Anordnung auf. Daher wurde für die Identifizierung der Gensequenz, die für die enantioselektive Oxidoreduktase kodiert, eine cDNA Bibliothek aus den aktiven Zellen der Pichia capsulata angelegt.
4.1 Präparation der gesamten RNA aus den Zellen von Pichia capsulata. 5
600 mg frische Zellen von Pichia capsulata wurden in 2,5 ml eiskalten LETS (10 mM Tris-HCI, pH = 7,4, 10 mM EDTA, 100 mM LiCI, 0,2 % SDS) Puffer resuspendiert. Zu dieser Zellsuspension wurden 5 ml (etwa 20 g) in Salpetersäure gewaschener Glasperlen, die mit 3 ml Phenol (pH 7.0) equilibriert waren, zugegeben. Der gesamte o Ansatz wurde dann abwechselnd jeweils 30 Sekunden (sec) geschüttelt (Vortex Genie 2, Scientific Industries Inc., New York, USA) und 30 sec auf Eis gekühlt und insgesamt 10 min behandelt. Anschließend wurden weitere 5 ml eiskalter LETS Puffer dazugegeben. Diese Zellsuspension wurde für 5 min bei 11000 g bei 4 0C zentrifugiert. Die wässrige Phase wurde abgenommen und mit dem gleichen Volumen an Phenol: 5 Chloroform: 3-Methyl-1-butanol (24:24:1 ) zweimal extrahiert. Anschließend erfolgte eine Extraktion mit Chloroform. Nach der letzten Extraktion wurde die gesamte erhaltene RNA durch die Zugabe von 1 / 10 VoI von 5 M LiCI bei -20 0C für 4 Stunden präzipitiert.
1 mg der isolierten RNA wurde für die m-RNA Gewinnung mittels Oligo-dT Cellulose lo (mRNA PräpKit, Qiagen) eingesetzt.
Nach der anschließenden Präzipitation wurden 5 μg mRNA für die cDNA Synthese (pBluescript HXR cDNA Library Construction kit, Stratagene) verwendet. Die nach den Angaben des Herstellers konstruierte Bibliothek wurde in XL-10 Gold E. coli i5 transformiert und auf die Aktivität einer (S)-ADH hin untersucht.
Anhand der Extinktionsabnahme mit NADH als Cofaktor und Ethyl-4-chloraceto-acetat als Substrat wurden zwei Klone (2 /1 und 2 / 2) identifiziert und isoliert. Die Sequenzierung über die multiple Klonierungsstelle, der in den Klonen enthaltenden
20 Plasmide mit Primer T7 (SEQ ID NO: 3) und Primer T3 (SEQ ID NO: 4), resultierte in einem Fragment mit der Größe von 1175 bp (SEQ ID NO: 1 ). Dieses Fragment kodiert für ein Fusionsprotein mit 366 Aminosäuren (SEQ ID NO: 2) und besteht aus dem a- Fragment der ß-Galactosidase und der Sequenz der erfindungsgemäßen Oxidoreduktase.
25
4.2 Synthese eines für eine (S)-ADH aus Pichia capsulata kodierendem Volllänge- Transkript mittels PCR (Polymerase chain reaction)
Basierend auf SEQ ID NO: 1 wurden spezifische Primer für eine nachfolgende
30 Klonierung des Volllänge Transkripts in passende Expressionssysteme konstruiert. Dabei wurden 5'-Primer mit einer Erkennungssequenz für Nde I (bzw. Sph I) und 3'- Primer mit einer Erkennungssequenz für Hind III modifiziert (SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 7)
5 Oligo 1-Nde I: 5 '-GGAATTCCATATGTCTGCTCTCTCCAAAAC-S'
Oligo 2-Sph I: 5 '-CACTGCATGCTGATGTCTGCTCTCTCCAAAAC-S'
Oligo 3-Hind III: 5'-CCCAAGCTTTCATGGAAGCATAACCAATCTT-31
10
Plasmid DNA isoliert aus dem Klon 2/1 der Expressionsbibliothek von Pichia capsulata diente als Matrize für die Polymerasen Ketten-Reaktion. Die Amplifikation wurde in einem PCR-Puffer [10 mM Tris-HCI, (pH 8,0); 50 mM KCl; 10 mM MgSO4; 1 mM dNTP Mischung (N steht dabei für die Basen A,T, C oder G); je 30 pMol Primer und 2,5 U i5 Platinum Pfx DNA-Polymerase (Invitrogen)] mit 50 ng Template und folgenden Temperatur-Zyklen durchgeführt:
Zyklus 1 : 94 0 C, 2 min
Zyklus 2 x 30: 94 ° C, 15 sec
20 58 ° C, 30 sec
68 0 C, 75 sec
Zyklus 3: 68 ° C, 7 min
4 ° C,
25 Das resultierende PCR-Produkt wurde nach der Reinigung über ein 1 %iges Agarose Gel mit Hilfe von Endonukleasen Nde I und Hind III, oder mit Endonucleasen Sph I und Hind III verdaut, und in das mit gleichen Endonukleasen behandelte Rückgrat des pET21a Vectors (Novagen), oder pQE30 Vectors (Qiagen) ligiert. Nach der Transformation von 2 il des Ligationsansatzes in E. coli Top 10 Fx Zellen (Invitrogen)
3o wurden Plasmid-DNA's von Ampicillin-resistenten Kolonien mittels einer Restriktionsanalyse mit Endonukleasen Nde I und Hind IiI oder Endonucleasen Sph I und Hind III auf das Vorhandensein eines 1100 bp großen Inserts getestet. Der Expressionskonstrukt pET21-PC#10 wurde sequenziert. Das für die erfindungsgemäße Oxidoreduktase kodierende Transkript aus Pichia capsulata besitzt einen offenen 5 Leserahmen von insgesamt 1026 bp (SEQ ID NO: 8), das einem Protein von 341 Aminosäuren entspricht (SEQ ID NO: 9)
4.3 Expression der erfindungsgemäße Oxidoreduktase aus P. capsulata in Star BL 21 (De3) E. coli Zellen
10
Kompetente Escherichia coli StarBL21(De3) Zellen (Invitrogen) wurden mit dem für die erfindungsgemäße Oxidoreduktase kodierenden Expressionskonstrukt pET21-PC#10 transformiert.
Der transformierte Stamm wurde in LB Medium (1% Tryptone, 0,5 % Hefeextrakt, 1 % i5 NaCI) mit Ampicillin (50 ig/ml) kultiviert, bis eine optische Dichte, gemessen bei 500 nm, von 0,5 erreicht wurde. Die Produktion des rekombinanten Oxidoreduktase Proteins wurde durch Zugabe von lsopropylthiogalaktosid (IPTG) in einer Endkonzentration von 1 mM gestartet. Der Induktionsansatz wurde für weitere 15 h bei 25 0C und 220 rpm inkubiert.
20 Die erreichte Enzymaktivität betrug etwa 6000 U/g Zeilfeuchtmasse.
4.4 Expression der erfindungsgemäße Oxidoreduktase aus P. capsulata in RB791 E. coli Zellen
25 Kompetente Escherichia coli RB791 Zellen wurden mit dem für die erfindungsgemäße Oxidoreduktase Expressionskonstrukt pQE30-PC#12 transformiert. Der transformierte Stamm wurde in LB Medium (1 % Tryptone, 0,5 % Hefeextrakt, 1 % NaCI) mit Ampicillin (50 ig/ml) kultiviert, bis eine optische Dichte, gemessen bei 500 nm von 0,5, erreicht wurde. Die Produktion des rekombinanten Oxidoreduktase-Proteins
3o wurde durch Zugabe von IPTG in einer Endkonzentration von 0,1 mM gestartet. Der Induktionsansatz wurde für weitere 15 Stunden bei 25 0C und 220 rpm inkubiert. Die erreichte Enzymaktivität betrug etwa 1000 U/g Zeilfeuchtmasse.
Beispiel 5: Charakterisierung der rekombinanten Oxidoreduktase aus P. capsulata
5.1 pH- Optimum
Es wurden die in Tabelle 3 aufgeführten Puffer hergestellt. Die Konzentration der jeweiligen Pufferkomponenten betrug jeweils 50 mM.
Tabelle 3 pH-Wert Puffersystem pH-Wert Puffersystem
4 Na-acetat/Essigsäure 7,5 KH2PO4/K2PO4
4,5 Na-acetat/Essigsäure 8 KH2PO4/K2PO4
5 Na-acetat/Essigsäure 8,5 KH2PO4/K2PO4
5,5 KH2PO4/K2PO4 9 Glycin/NaOH
6 KH2PO4/K2PO4 9,5 Glycin/NaOH
6,5 KH2PO4/K2PO4 10 Glycin/NaOH
7 KH,PO4/K2PO4 11 Glycin/NaOH
Meßansatz (30 °C):
870 μl der jeweils in Tabelle 3 genannten Puffersysteme 20 μl NADH IO mM (8,6 mg/ml Wasser) 10 μl Enzym verdünnt
Es wurde etwa 2 bis 3 min inkubiert, danach erfolgte die Zugabe von 100 μl Substratlösung (10OmM Ethyl-4-chlor-3-oxobuttersäure)
Zur Bestimmung des pH-Optimum wurde die enzymatische Reaktion in dem jeweiligen in Tabelle 3 aufgeführten Puffer bestimmt. Zur Bestimmung des pH-Optimums für die Oxidationsreaktion wurde als Cofaktor NADH und als Substrat (S)-Methyl-3- hydroxybuttersäure eingesetzt. Dabei konnte fürdas erfindungsgemäße Enzym ein pH- Optimum von 6,5 bis 7 für die Reduktionsreaktion und von 7,8 bis 8,2 für die Oxidationsreaktion ermittelt werden.
5.2 pH-Stabilität
Die Bestimmung der Aktivität der rekombinanten Oxidoreduktase wurde durch Lagerung in den in Tabelle 3 genannten Puffersystemen untersucht. Dazu wurden die verschiedene Puffer (5OmM) im Bereich von pH 4 bis 11 angesetzt und die gemäß Beispiel 4 hergestellte Oxidoreduktase damit verdünnt. Nach 30, 60 und 300 min Inkubation wurden aus dem Ansatz 10 μl entnommen und im Aktivitätstest gemäß Beispiel 1 eingesetzt.
Ausgangswert ist dabei der Messwert, den man unmittelbar nach Verdünnung (1 :20) des Enzyms in Kaliumphosphatpuffer 50 mM pH = 7.0 erhielt. Dieser Wert entsprach unter den vorgegeben Bedingungen einer Extinktionsänderung von etwa 0,70 /min und wurde als 100%-Wert gesetzt und alle folgenden Messwerte wurden zu diesem Wert ins Verhältnis gesetzt.
Dabei wurde festgestellt, dass die rekombinante Oxidoreduktase aus P. capsulata bei einem pH von 5,5 bis 8,5 stabil ist und für mindestens 5 h ohne wesentlichen Aktivitätsverlust inkubiert werden kann. Inkubationen bei pH-Werten über 9,0 und unter 5,0 führten zu einer sofortigen Desaktivierung des Enzyms. 5.3 Temperatur-Optimum
Zur Bestimmung der optimalen Testtemperatur wurde die Enzymaktivität im Temperaturbereich von 15 0C bis 70 0C im Standardmeßansatz gemessen. Wie aus Tabelle 4 ersichtlich hat das Enzym seine maximale Aktivität bei 45°C, anschließend sinkt die Aktivität rapide ab.
Tabelle 4 Temperatur Aktivität in U/ml Temperatur Aktivität in U/ml
(0C) unverdünntes Enzym (0C) unverdünntes Enzym
15 73 45 176
20 83 50 122
25 128 55 45
30 135 60 0
35 163 65 0
40 170 70 0
5.4 Temperatur-Stabilität
In analoger Weise wie unter Beispiel 5.2 beschrieben wurde die Temperaturstabilität für den Bereich von 15 0C bis 70 0C bestimmt. Dazu wurde jeweils eine 1 :20 Verdünnung der gereinigten Oxidoreduktase für 60 min und 180 min bei der jeweiligen Temperatur inkubiert und anschließend bei 30 0C mit dem obigen Testansatz gemessen. Auch hier wurde als Ausgangswert der Meßwert herangezogen, den man unmittelbar nach Verdünnung der gereinigten Oxidoreduktase in Kaliumphosphatpuffer 50 mM bei pH = 7,0 erhält. Dieser Wert wurde auch in diesem Beispiel als 100%-Wert gesetzt. Das Enzym ist dabei in einem Temperaturbereich von 15 0C bis 40 0C vollkommen stabil und zeigt nach 3 h Inkubation keinerlei Aktivitätsverlust. Bei 55 °C ist bereits nach 30 min keine Enzymaktivität mehr nachweisbar.
5.5 Substratspektrum/Enantiomerenüberschuss
Das Substratspektrum der erfindungsgemäßen Oxidoreduktase wurde durch Messung der Enzymaktivität mit einer Reihe von Ketonen, Oxosäuren und deren Estern bestimmt. Dazu wurde der Standard Messansatz gemäß Beispiel 5.1 mit unterschiedlichen Substraten verwendet Die Aktivität mit Ethyl-4-chloracetoacetat wurde gleich 100% gesetzt und alle anderen Substrate wurden dazu ins Verhältnis gesetzt. Für die ee-Wert-Bestimmung wurden für ausgewählte Substrate folgender Reaktionsansatz verwendet.
100 μl NADH (5O mM)
60 μl Substrat (10O mM)
+ 1 bis 2 U der erfindungsgemäßen Oxidoreduktase
Die Ansätze zur ee- Bestimmung wurden nach 24 h mit Chloroform extrahiert und mittels GC wurde der Enantiomerenüberschuss des resultierenden Alkohols bestimmt.
Tabelle 5
Substrat Relative Stereo- Substrat Relative Stereo¬
Aktivität selektivitä Aktivität selektivität
% t %
Ketone 3-Oxosäureester
1 -Phenyl-2-propanon 24 97 % S Ethyl-4- 100 99 % R
Chloroacotoaceta
I +
2-chloro-1 -(3-chlor- 21 100 % R Methyl 150 97 % S pheny)ethan-1-on acetoacetat
Acetophenon 4 n.b. Ethyl-8-chloro-6- 20 100 % R oxooctansäure
Caprylophenon 0 n.b. Dimethyl-3-Oxo- 3,5 n.b.
1 ,8-octandioicacid
2-Octanon 88 100 % S Ethyl-3- 67 n.b. oxovaleriat
3-Octanon 30 n.b. Ethylacetoacetat 100 99 % S
2-Butanon 99 50 % S
4-Hydroxy-2-butanon 99 90 % S
Ethyl-2-oxovaleriat 41 97 % S 2-Oxovalerian- 0 n.b säure
E t h y I - 2 - o x o - 4 - 76 95 % S 2-Oxo-3-phenyl 0 n.b phenylbuttersäure Propionsäure
Ethylpyruvat 10 100 % S 2-Oxobuttersäure 0 n.b
Ethylphenylglyoxylat 5,2 100 % R
n.b. bedeutet nicht bestimmt Wie aus Tabelle 5 ersichtlich werden von der erfindungsgemäßen Oxidoreduktase ein breites Spektrum 2- und 3- Oxosäureester sowie aromatische und aliphatische Ketone stereoselektiv reduziert.
5.5 Lösungsmittelstabilität
Die Enzymstabilität der Oxioreduktase aus P. capsulata wurde in Anwesenheit von organischen Lösungsmitteln untersucht. Dazu wurde die Oxidoreduktase jeweils 1: 20 mit den angegebenen Lösungsmittelgemischen (bei wasserrmischbaren organischen Lösungsmitteln) verdünnt und bei Raumtemperatur (20 0C bis 24 °C; RT) inkubiert. Anschließend wurden 10 μl der Enzymlösung im Standardtestansatz eingesetzt. Auch hier wurde der Ausgangswert nach Verdünnung im Puffer (Kaliumphosphatpuffer (KPP) 100 mM, pH = 7.0) gleich .100 % gesetzt und alle weiteren Werte zu diesem ins Verhältnis gesetzt.
Bei den nicht mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel erfolgte die Verdünnung ebenfalls in Kaliumphosphatpuffer, es wurde das gleiche Volumen organisches Lösungsmittel zum Ansatz gegeben und der Ansatz wurde bei RT im Thermomixer mit 170 rpm inkubiert. Die Aktivitätsmessung erfolgte aus der wässrigen Phase. Tabelle 6 zeigt die Ergebnisse.
Tabelle 6
Aktivität 8 h 24 h Aktivität 8h 24 h
Puffer 100% 100% Ethylacetat 2 O
KPP 10OmM pH =7
1 mM MgCI2
5 % Isopropanol 77% 77% Butylacetat 53% 28%
10% Isopropanol 72% 72% Diethylether 100% 100 %
20 % Isopropanol 46% 46% Methyl-tert- 100% 100% butylether
30 % Isopropanol 18% 18% Diisopropylether 100% 100%
5 % EtOH 77% 77% Chloroform 51 % 0%
10% EtOH 77% 77% Hexan 60% 20%
20 % EtOH 100% 100% Heptan 74% 43%
30 % EtOH 64% 64% Cyclohexan 85% 70%
10% DSMO 42% 45%
20 % DSMO 30% 30%
EtOH bedeutet Ethanol; DSMO bedeutet Dimethylsulfoxid
Wie aus Tabelle 6 ersichtlich zeigt die Oxidoreduktase aus P. capsulata eine erstaunliche Stabilität gegenüber organischen Lösungsmitteln. Entgegen der gängigen
Lehrmeinung wird die erfindungsgemäße Oxidoreduktase in organischen wassermischbaren, sowie wasserunmischbaren Lösungsmitteln sogar stabilisiert verglichen mit Inkubation im reinen Puffer. Die erfindungsgemäße Oxidoreduktase kann daher in einem Zwei- Phasensystem, wie es in der DE 10119274 A1 beschrieben ist, eingesetzt werden. 5.7 Präparative Umsetzungen
5.7.1 Reduktion von Ethyl-4-Chloracetoacetat zu Ethyl-(R)-4-chlor-3- hydroxybutter- säure
Für den präperativen Ansatz wurde ein Gemisch aus 34 L Puffer (10OmM TEA, pH = 7, 1 mM ZnCI2, 10 % Glycerin), 4 L Isopropanol, 4 L 4-Chloracetoacetat, 4 g NAD und 3,6 Millionen U rekombinante Oxidoreduktase aus Pichia capsulata für 24 h bei Raumtemperatur unter ständiger Durchmischung inkubiert. Nach 24 h waren 99% des eingesetzten 4-Chloracetoacetat reduziert. Das Reaktionsgemisch wurde anschließend mit Ethylacetat extrahiert, das Lösungsmittel mittels Rotationsverdampfer entfernt und das Rohprodukt wurde destilliert. Auf diese Weise wurden 2,8 L (3,4 kg) Ethyl-(R)-4- chlor-3-hydroxybuttersäure mit einem Enantiomerenüberschuss von 99 % gewonnen. Dies entspricht einer Ausbeute von 70 % bezogen auf die eingesetzte Eduktmenge.
5.7.2. Reduktion von 2-Chlor-1-(3-chlorphenyl)ethan-1-on zu (R)-2-Chlor-1-(3- chlorphenyl)ethan-1 -ol
Für den präperativen Ansatz wurde ein Gemisch aus 164 ml Puffer (100 mM TEA, pH = 7, 1 mM ZnCI2, 20 % Glycerin), 16 ml Isopropanol, . 20 g 2-Chlor-1-(3- chlorphenyl)ethan-1-on gelöst in 20 ml Methyl-tert-Butylether (MTBE), 10 mg NAD und 20 000 U rekombinante Oxidoreduktase aus Pichia capsulata für 24 h bei Raumtemperatur unter ständiger Durchmischung inkubiert. Nach 24 h waren 96 % des eingesetzten 2-Chlor-1-(3-chlorphenyl)ethan-1-on's reduziert. Das Reaktionsgemisch wurde anschließend mit Ethylacetat extrahiert und das Lösungsmittel wurde mit dem Rotationsverdampfer entfernt. Auf diese Weise wurden 15 g (R)-2-ChIor-1-(3- chlorphenyl)ethan-1 -ol mit einem Enantiomerenüberschuss von 100 % gewonnen. Dies entspricht einer Ausbeute von 77 % bezogen auf die eingesetzte Eduktmenge.

Claims

Patentansprüche
1. Oxidoreduktase, dadurch gekennzeichnet, dass sie in Anwesenheit von NADH und Wasser eine Carbonylverbindung zur entsprechenden (S)-Hydroxy- Verbindung reduziert.
2. Oxidoreduktase gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass sie aus Hefen der Gattungen Pichia oder Candida, insbesondere aus Pichia capsulata gewinnbar ist.
3. Oxidoreduktase gemäß der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass sie die DNA-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 8 und die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 9 aufweist.
4. Oxidoreduktase, gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass mehr als 70 % der Aminosäuren identisch sind mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 9 und sie eine spezifische Aktivität von mehr als 1 μmol pro mg Protein aufweist, bezogen auf die Umsetzung von Ethyl-4- chlor-3-oxobuttersäure zu (R)-Ethyl-4-chlor-3-hydroxybuttersäure.
5. Oxidoreduktase, gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass 80 % bis 99,5 %, insbesondere 90 % bis 99,5 %, speziell 99 % bis 99,5 % identische Aminosäuren zu der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 9 sind.
6. Oxidoreduktase, gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass sie 1 bis 40 Aminosäuren zusätzlich oder 1 bis 40 Aminosäuren weniger aufweist als die Oxidoreduktase mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 9 und sie eine spezifische Aktivität von mehr als 1 μmol pro mg Protein aufweist, bezogen auf die Umsetzung von Ethyl-4- chlor-3-oxobuttersäure zu (R)-Ethyl-4-chlor-3-hydroxy-buttersäure.
7. Oxidoreduktase, gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass 1 bis 25 Aminosäuren, insbesondere 2 bis 20 Aminosäuren, oder 3 bis 10 Aminosäuren mehr oder weniger als in der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 9 vorkommen.
8. Oxidoreduktase, gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass sie die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 9 aufweist und ein-, zwei-, drei-, vier- oder fünffach durch ein wasserlösliches Polymer modifiziert ist und die spezifische Aktivität mehr als 1 μmol pro mg Protein beträgt, bezogen auf die Umsetzung von Ethyl-4-chlor-3-oxobuttersäure zu (R)- EthyM-chlor-S-hydroxy-buttersäure.
9. Oxidoreduktase, gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das wasserlösliche Polymer Polyethylenglycol ist.
10. Proteinfragment, dadurch gekennzeichnet ist, dass es Fragmente der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 9 darstellt, mit einer Anzahl von 5 bis 30 Aminosäuren je Fragment.
11. Proteinfragment gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass es Fragmente von SEQ ID NO: 9 sind, mit einer Kettenlänge von 6 bis 25
Aminosäuren, insbesondere von 8 bis 20 Aminosäuren, oder 10 bis 18 Aminosäuren, insbesondere der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 10.
12. Fusionsprotein, dadurch gekennzeichnet, dass es die Oxidoreduktase mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 9 oder Fragmente der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 9 enthält, mit einer Anzahl von 5 bis 30 Aminosäuren, die mit einem weiteren Polypeptid am N-terminalen oder Carboxy-terminalen Ende über eine Peptidbindung verbunden ist.
13. Antikörper, dadurch gekennzeichnet, das er spezifisch an die Oxidoreduktase gemäß SEQ ID NO: 9 oder SEQ ID NO: 10 bindet.
14. Isolierte Nukleinsäuresequenz, die für die Oxidoreduktase gemäß SEQ ID NO: 9 und SEQ ID NO: 10 kodiert.
15. Isolierte DNA-Sequenz der Oxidoreduktase, die die Reduktion von Carbonylverbindung in Anwesenheit von NADH und Wasser zu den entsprechenden (S)-Hydroxyverbindungen katalysiert, wobei die DNA-Sequenz ausgewählt wird aus der Gruppe
a) DNA-Sequenz, welche die Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 7 aufweist oder deren jeweils komplementären Strang, b) DNA-Sequenz, welche mit einer oder mehreren der DNA-Sequenzen gemäß a) oder seiner komplementären Stränge hybridisiert, wobei die
Hybridisierung unter stringenten Bedingungen erfolgt, und c) DNA-Sequenz, welche auf Grund der Degeneration des genetischen Codes, ein Protein kodiert, das durch eine oder mehrere der DNA- Sequenzen gemäß a) oder b) kodiert ist.
16. Isolierte DNA-Sequenz, dadurch gekennzeichnet, dass mehr als 70 % der Nukleinsäurebasen mit der DNA-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 8 oder deren komplementären Stränge identisch sind und dass sie die Oxidoreduktase kodiert, die eine spezifische Aktivität von mehr als 1 μmol pro mg Protein aufweist, bezogen auf die Umsetzung von Ethyl-4-chlor-3-oxobuttersäure zu (R)-Ethyl-4- chlor-3-hydroxybuttersäure.
17. Isolierte DNA-Sequenz gemäß Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass 80 % bis 99,5 %, insbesondere 90 % bis 99,5 %, speziell 99 % bis 99,5 % der
Nukleinsäurebasen identisch sind mit der DNA-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 8.
18. Isolierte DNA-Sequenz, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Nukleinsäuresequenz mit 10 bis 50 Nukleinsäurebasen ist, die eine Sequenz aufweist, die einem Teile oder mehreren Teilen der DNA-Sequenz gemäß SEQ
ID NO: 8 oder deren komplementären Strängen entspricht.
19. Isolierte DNA-Sequenz gemäß Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Nukleinsäuresequenz mit 15 bis 45 Nukleinsäurebasen, insbesondere 20 bis 40 Basen, oder 30 bis 40 Nukleinsäurebasen ist.
20. Klonierungsvektor, dadurch gekennzeichnet, dass er eine oder mehrere der Nukleinsäure- oder DNA-Sequenzen gemäß den Ansprüchen 14 bis 19 aufweist.
21. Expressionsvektor, dadurch gekennzeichnet, dass er eine oder mehrere der Nukleinsäure- oder DNA-Sequenzen gemäß der Ansprüche 14 bis 19 enthält und in geeigneter Weise mit einer Expressionskontrollsequenz verbunden ist.
22. Wirtszelle, die eine Bakterien-, Hefe-, Insekten-, Pflanzen- oder Säugetierzelle ist und mit einem Expressionsvektor gemäß Anspruch 21 transformiert oder transferiert wurde.
23. Verfahren zur enantioselektiven Reduktion von Carbonylverbindungen zu den entsprechenden (S)-Hydroxyverbindungen, das dadurch gekennzeichnet ist, dass a) eine Carbonylverbindung in Anwesenheit der Oxidoreduktase gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 9, NADH und Wasser zur entsprechenden (S)-Hydroxyverbindung reduziert und b) die gebildete chirale (S)-Hydroxyverbindung isoliert wird.
24. Verfahren gemäß Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass als Carbonylverbindung eine Verbindung der Formel I
R1-C(O)-R2 (I) eingesetzt wird, mit einem Rest R1 aus 1 ) -(CrC20)-Alkyl, worin Alkyl geradkettig oder verzweigt ist,
2) -(C2-C20)-Alkenyl, worin Alkenyl geradkettig oder verzweigt ist und je nach Kettenlänge ein, zwei, drei oder vier Doppelbindungen enthält,
3) -(C2-C20)-Alkinyl, worin Alkinyl geradkettig oder verzweigt ist und gegebenenfalls ein, zwei, drei oder vier Dreifachbindungen enthält, 4) -(C6-C14)-Aryl,
5) -(CrC8)-Alkyl-(C6-C14)-Aryl,
6) -(C5-C14)-Heterocyclus, der unsubstituiert oder ein- bis dreifach substituiert ist durch Halogen, Hydroxyl, Amino oder Nitro, oder
7) -(C3-C7)-Cycloalkyl,
wobei die unter 1 ) bis 7) genannten Reste R1 unsubstituiert sind oder ein-, zwei- oder dreifach substituiert sind, unabhängig voneinander, durch a) -OH, b) Halogen, wie Fluor, Chlor, Brom oder Jod, c) -NO2 oder d) -NH2 und
mit einem Rest R2 aus
1 ) -(C1 -Cg)-Al kyl, worin Alkyl geradkettig oder verzweigt ist, 2) -(C2-Cg)-AI kenyl, worin Alkenyl geradkettig oder verzweigt ist und je nach Kettenlänge ein, zwei oder drei Doppelbindungen enthält,
3) -(C2-C6)-Alkinyl, worin Alkinyl geradkettig oder verzweigt ist und gegebenenfalls ein oder zwei Dreifachbindungen enthält, oder 4) -(C0-C10)-Alkyl-C(O)-O-(CrC6)-Alkyl, worin Alkyl gerade oder verzweigt ist und unsubstituiert oder ein- bis dreifach substituiert ist durch Halogen, Hydroxyl, Amino oder Nitro,
wobei die unter 1 ) bis 4) genannten Reste R2unsubstituiert sind oder ein-, zwei- oder dreifach substituiert sind, unabhängig voneinander durch a) -OH, b) Halogen, wie Fluor, Chlor, Brom oder Jod, c) -NO2 oder d) -NH2.
25. Verfahren gemäß Anspruch 23 oder 24, dadurch gekennzeichnet, dass
a) eine Carbonylverbindung in Anwesenheit der Oxidoreduktase gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 9, NADH und Wasser zur entsprechenden (S)-Hydroxyverbindung reduziert wird, b) das durch die Oxidoreduktase gebildete NAD mit einem Cosubstrat zu NADH reduziert und c) die gebildete chirale (S)-Hydroxyverbindung isoliert wird.
26. Verfahren gemäß Anspruch 23 oder 24, dadurch gekennzeichnet, dass
a) eine Carbonylverbindung in Anwesenheit der Oxidoreduktase gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 9, NADH und Wasser zur entsprechenden (S)-Hydroxyverbindung reduziert wird, b) das durch die Oxidoreduktase gebildete NAD mit einer Dehydrogenase und einem Cosubstrat zu NADH reduziert und c) die gebildete chirale (S)-Hydroxyverbindung isoliert wird.
27. Verfahren gemäß Anspruch 23 oder 24, dadurch gekennzeichnet, dass
a) eine Carbonylverbindung in Anwesenheit der Oxidoreduktase gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 9, NADH und Wasser zur entsprechenden (S)-Hydroxyverbindung reduziert, b) die Reaktionen in Anwesenheit eines organischen Lösungsmittel durchgeführt und c) die gebildete chirale (S)-Hydroxyverbindung isoliert wird.
28. Verfahren gemäß Anspruch 23 oder 24, dadurch gekennzeichnet, dass a) eine Carbonylverbindung in Anwesenheit der Oxidoreduktase gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 9, NADH und Wasser zur entsprechenden (S)-Hydroxyverbindung reduziert wird, b) die Reaktionen in Anwesenheit eines organischen Lösungsmittel durchgeführt, c) das durch die Oxidoreduktase gebildete NAD mit einem Cosubstrat zu
NADH reduziert, und d) die gebildete chirale (S)-Hydroxyverbindung isoliert wird.
29. Verfahren gemäß Anspruch 23 oder 24, dadurch gekennzeichnet, dass
a) eine Carbonylverbindung in Anwesenheit der Oxidoreduktase gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 9, NADH und Wasser zur entsprechenden (S)-Hydroxyverbindung reduziert wird, b) das durch die Oxidoreduktase gebildete NAD mit einer Dehydrogenase und einem Cosubstrat gleichzeitig zu NADH reduziert, c) die Reaktionen in Anwesenheit eines organischen Lösungsmittel durchgeführt und d) die gebildete chirale (S)-Hydroxyverbindung isoliert wird.
30. Verfahren gemäß Anspruch 25, 26, 28 oder 29, dadurch gekennzeichnet, dass als Cosubstrat Ethanol, 2-Propanol, 2-Butanol, 2-Pentanol oder 2-Octanol eingesetzt wird.
31. Verfahren gemäß Anspruch 26 oder 29, dadurch gekennzeichnet, dass als Dehydrogenase die Bäckerhefe aus Candida boidinii oder Candida parapsilosis eingesetzt wird.
32. Verfahren gemäß Anspruch 26 oder 29, dadurch gekennzeichnet, dass als Dehydrogenase NADH abhängige Formiat-Dehydrogenase und als Cosubstrat ein Salz der Ameisensäure wie Ammoniumformiat, Natriumformiat oder
Calziumformiat eingesetzt wird.
33. Verfahren gemäß Anspruch 27 oder 29, dadurch gekennzeichnet, dass als organische Lösungsmittel Diethylether, tertiär-Butylmethylether, Diisopropylether, Dibutylether, Butylacetat, Heptan, Hexan oder Cyclohexan eingesetzt werden.
34. Verfahren gemäß Anspruch 27 oder 29, dadurch gekennzeichnet, dass die organische Phase 5 % bis 80 % des gesamten Reaktionsvolumens, bevorzugt 10 % bis 40 %, beträgt.
35. Verfahren zur Gewinnung von chiralen (R)-Hydroxyverbindungen der Formel II, R1-C(OH)-R2 (II)
mit einem Rest R1 aus 1 ) -(CrC2o)-Alkyl, worin Alkyl geradkettig oder verzweigt ist, 2) -(C2-C20)-Alkenyl, worin Alkenyl geradkettig oder verzweigt ist und je nach Ketteniänge ein, zwei, drei oder vier Doppelbindungen enthält,
3) -(C2-C20)-Alkinyl, worin Alkinyl geradkettig oder verzweigt ist und gegebenenfalls ein, zwei, drei oder vier Dreifachbindungen enthält, 4) -(C6-C14)-Aryl,
5) -(CrC8)-Alkyl-(C6-C14)-Aryl,
6) -(C5-C14)-Heterocyclus, der unsubstituiert oder ein- bis dreifach substituiert ist durch Halogen, Hydroxyl, Amino oder Nitro, oder
7) -(C3-C7)-Cycloalkyl, wobei die unter 1 ) bis 7) genannten Reste R1 unsubstituiert sind oder ein-, zwei- oder dreifach substituiert sind, unabhängig voneinander, durch a) -OH, b) Halogen, wie Fluor, Chlor, Brom oder Jod, c) -NO2 oder d) -NH2 und
mit einem Rest R2 aus
1 ) -(C^CgJ-Alkyl, worin Alkyl geradkettig oder verzweigt ist,
2) -(C2-C6)-Alkenyl, worin Alkenyl geradkettig oder verzweigt ist und je nach Kettenlänge ein, zwei oder drei Doppelbindungen enthält,
3) -(C2-C6)-Alkinyl, worin Alkinyl geradkettig oder verzweigt ist und gegebenenfalls ein oder zwei Dreifachbindungen enthält, oder
4) -(C0-C10)-Alkyl-C(O)-O-(CrC6)-Alkyl, worin Alkyl gerade oder verzweigt ist und unsubstituiert oder ein- bis dreifach substituiert ist durch Halogen, Hydroxyl, Amino oder Nitro, wobei die unter 1 ) bis 4) genannten Reste R1 unsubstituiert sind oder ein-, zwei- oder dreifach substituiert sind, unabhängig voneinander, durch a) -OH, b) Halogen, wie Fluor, Chlor, Brom oder Jod, c) -NO2 oder d) -NH2 ,
dadurch gekennzeichnet ist, dass
a) ein Gemisch, enthaltend die racemische Verbindung der Formel 11 , mit der
Oxidoreduktase gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 9, NAD und Wasser inkubiert und b) die verbliebene chirale (R)-Hydroxyverbindung der Formel Il isoliert wird.
36. Verfahren zur Gewinnung von chiralen (R)-Hydroxyverbindungen der Formel Il gemäß Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet ist, dass
a) ein Gemisch, enthaltend die racemische Verbindung der Formel II, mit der Oxidoreduktase gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 9, NAD und Wasser inkubiert wird, b) das durch die Oxidoreduktase gebildete NADH mit einem Cosubstrat zu NAD oxidiert und c) die verbliebene chirale (R)-Hydroxyverbindung der Formel Il isoliert wird.
37. Verfahren zur Gewinnung von chiralen (R)-Hydroxyverbindungen der Formel Il gemäß Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet ist, dass
a) ein Gemisch, enthaltend die racemische Verbindung der Formel II, mit der Oxidoreduktase gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 9, NAD und Wasser inkubiert wird, b) das durch die Oxidoreduktase gebildete NADH mit einer Dehydrogenase und einem Cosubstrat zu NAD oxidiert und c) die verbliebene chirale (R)-Hydroxyverbindung der Formel Il isoliert wid.
38. Verfahren zur Gewinnung von chiralen (R)-Hydroxyverbindungen der Formel Il gemäß Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet ist, dass
a) ein Gemisch, enthaltend die racemische Verbindung der Formel Il mit der Oxidoreduktase gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 9, NAD und Wasser inkubiert wird, b) die Reaktionen in Anwesenheit eines organischen Lösungsmittel durchgeführt und c) die verbliebene chirale (R)-Hydroxyverbindung der Formel Il isoliert wid.
39. Verfahren zur Gewinnung von chiralen (R)-Hydroxy-verbindungen der Formel Il gemäß Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet ist, dass
a) ein Gemisch, enthaltend die racemische Verbindung der Formel Il mit der Oxidoreduktase gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 9, NAD und Wasser inkubiert wird, b) die Reaktionen in Anwesenheit eines organischen Lösungsmittel durchgeführt, c) das durch die Oxidoreduktase gebildete NADH mit einer Dehydrogenase und einem Cosubstrat zu NAD oxidiert und d) die verbliebene chirale (R)-Hydroxyverbindung der Formel Il isoliert wird.
40. Verfahren gemäß Anspruch 36, 37 oder 39, dadurch gekennzeichnet, dass als Cosubstrat Aceton eingesetzt wird.
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