KR101275061B1 - 거울상이성질체 선택적인 효소에 의한 케토 화합물의 환원방법 - Google Patents

거울상이성질체 선택적인 효소에 의한 케토 화합물의 환원방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 케토 화합물, 특히 4-할로-3-옥소부티르산 에스테르를 보조인자의 존재하에 R-특이적인 산화환원 효소를 이용하여 상응하는 R-알코올 또는 S-4-할로-3-하이드록시부티르산 에스테르로 환원시키는, 거울상이성질체 선택적인 효소에 의한 환원 방법에 관한 것이다.

Description

거울상이성질체 선택적인 효소에 의한 케토 화합물의 환원 방법{METHOD FOR THE ENANTIOSELECTIVE ENZYMATIC REDUCTION OF KETO COMPOUNDS}
본 발명은 거울상이성질체 선택적인 효소에 의한 케토 화합물의 환원 방법, 특히 4-할로-3-옥소부티르산 에스테르를 상응하는 R-알코올 또는 S-4-할로-3-하이드록시부티르산 에스테르 각각 환원시키는 방법에 관한 것이다.
카르보닐 리덕타제(이명: 알코올 디하이드로게나제, 산화환원 효소)는 각각 카르보닐 화합물의 환원 및 이차 알코올의 산화에 있어 촉매제로서 알려져 있다. 이 효소는 조효소(coenzyme), 예컨대 NAD(P)H를 필요로 한다. 락토바실러스 케퍼(Lactobacillus kefir)로부터 수득한 카르보닐 리덕타제 및 조효소 NADPH를 이용한 케톤의 환원 방법이, 예컨대 US 5,342,767에 개시되어 있다.
광학적으로 활성인 하이드록시 화합물은 약학적으로 활성인 화합물, 방향족 물질, 페로몬, 농업 화합물 및 효소 저해제의 합성에 폭넓게 적용가능한, 매우 쓸모있는 케이론(chiron)이다. 예를 들어, S-4-할로-3-하이드록시부티르산 에스테르는 HMG-CoA 리덕타제 저해제, D-카르니틴 및 기타의 합성에 있어 중요한 중간체이다.
거울상이성질체 선택적인 효소는, 예컨대 4-할로-3-옥소부티르산 에스테르를 상응하는 S-4-할로-3-하이드록시부티르산 에스테르로 환원시킬 수 있는 것으로 알려져 있다. 예로, 하기를 참조할 수 있다:
빵 효모 유래의 리덕타제(D-효소-1, D-효소-2, J. Am. Chem. Soc. 107, 2993-2994, 1985);
스포로볼로마이세스 살모니콜러(Sporobolomyces salmonicolor) 유래의 알데하이드 리덕타네 2(Appl. Environ. Microbiol. 65, 5207-5211, 1999);
칸디다 마세도니엔시스(Candida macedoniensis) 유래의 케토판토텐산 에스테르 리덕타제(Arch. Biochem. Biophys. 294, 469-474, 1992);
게오트리컴 칸디듐(Geotrichum candidum) 유래의 리덕타제(Enzyme Mircrob. Technol. 14, 731-738, 1992);
칸디다 마그놀리(Candida magnoliae) 유래의 카르보닐 리덕타제(WO 98/35025);
클루베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis) 유래의 카르보닐 리덕타제(JP-A Hei 11-187869);
II형 지방산 신테타제의 β-케토아실-아실 캐리어 단백질 리덕타제(JP-A 2000-189170);
피키아 핀란디카(Pichia finlandica) 유래의 (R)-2-옥탄올 디하이드로게나제(EP 1179595 A1);
락토바실러스(Lactobacillus) 속 유기체 유래의 R-특이적인 이차 알코올 디하이드로게나제(Lactobacillus kefir (US5200335), Lactobacillus brevis (DE 19610984 A1)(Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2000 Dec; 56 Pt 12:1696-8), Lactobacillus minor (DE10119274); Pseudomonas (US 05385833)(Appl Microbiol Biotechnol. 2002 Aug; 59(4-5):483-7. Epub 2002 Jun 26., J. Org. Chem. 1992, 57, 1532).
슈도모나스, 락토바실러스 및 피키아 핀란디카(EP 1179595 A1) 유래의 효소 이외에는, 공지된 효소들은 일반적으로 이차 알코올을 기질로서 받아들이지 않아, 이차 알코올의 산화를 촉매하지 못한다.
따라서, 산업적인 효소 환원 공정에서, 상기 효소들은 보조인자 NADH 또는 NADPH의 재생을 책임지는 다른 효소와 커플을 이루어야 한다. 이러한 NAD(P)H 재생에 적합한 효소는 포르메이트 디하이드로게나제, 글루코스 디하이드로게나제, 말레이트 디하이드로게나제, 글리세롤 디하이드로게나제 및 알코올 디하이드로게나제가 있으며, 이들은 바람직하기로는 4-할로-3-옥소부티르산 에스테르의 환원을 위한 효소와 함께 발현된다.
예컨대, 칸디다 마그놀리아(Candida magnoliae) 유래의 카르보닐 리덕타제 유전자 뿐만 아니라 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium) 유래의 글루코스 디하이드로게나제 유전자를 동시에 발현하는, 에셔리키아 콜리(Escherichia coli)의 재조합 세포는, >40%(중량)의 기질 농도에서 실현되는 수성/유기 2상 시스템에서 효율적으로 사용가능한 것으로 입증되었다(Appl Microbiol Biotechnol (2001), 55; 590-595, Ann N Y Acad Sci. 1998 Dec 13; 864:87-95).
락토바실랄레스(Lactobacillales)(Lactobacillus minor; DE 10119274) 그룹 유래의 효소를 이용하는 방법은 지금까지는 2-프로판올을 이용한 기질-커플링된 조효소 재생으로 성공적으로 수행되었으며, 불용성 기질의 재생은 수성/유기 2-상 시스템을 채택함으로써 고농도에서 실현되었다(US 5342767, DE10119274).
2-프로판올 또는 2-부탄올 각각을 이용한 기질-커플링된 조효소 재생을 적용하는 경우, 기본적으로 대부분 효소의 2-프로판올 및 2-부탄올에 대한 낮은 허용성이 한계인 것으로 간주되었다. 통상, 명확하게 10% 미만의 2-프로판올 농도가 사용된다.
종래 기술에서는, 효모 유래의 R-특이적인 산화환원 효소와 2-프로판올 및/또는 2-부탄올을 이용한 기질-커플링된 효소 재생을 이용하는 것에 대한 방법은 알려져 있지 않다.
보조기질(cosubstrate) 2-프로판올의 제한적인 사용으로 인해, 만족스럽지 못한 기질 농도 및 변환율이 수득되었다(Angew Chemie Int Ed Engl 2002, 41: 634-637, Biotechnol Bioeng 2004 Apr 5; 86 (1): 55-62).
최근에는, 2-프로판올이 실질적으로 높은 농도 50-80%(부피)인 경우에서도 여전히 안정적이고, 활성형인, 로도코커스 루버(Rhodococcus ruber) 유래의 S-특이적인, 중쇄 알코올 디하이드로게나제의 분리가 가능해졌다(Biotechnol Bioeng 2004 Apr 5; 86 (1): 55-62), WO 03/078615).
본 발명은 전술한 문제점을 극복하는 것을 목적으로 하며, 본 발명은 일반식 I의 케토 화합물의 거울상이성질체 선택적인 효소에 의한 환원 방법에 관한 것으로,
상기 방법은
(a) 5%(중량/부피) 이상의 일반식 I로 표시되는 화합물;
(b) 15%(부피) 이상의 2-프로판올 및/또는 2-부탄올; 및
(c) 물을 포함하는 단일상의 액체 혼합물에,
보조인자의 존재하에 R-특이적인 산화환원 효소를 처리하여, 일반식 II로 표시되는 키랄 하이드록시 화합물을 형성하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다:
R1-C(O)-R2 (I)
상기 일반식 I에서,
R1은 하기 모이어티 중 하나이며, 하기 1) 내지 7)의 모이어티는 각각 독립적으로 -OH, 할로겐, -NO2 및/또는 -NH2로 1, 2 또는 3번 치환 또는 비치환된 것이고:
1) 알킬이 직쇄 또는 분지쇄인 -(C1-C20)-알킬,
2) 알케닐이 직쇄 또는 분지쇄이며, 선택적으로 최대 4개의 이중 결합을 포함하는, -(C2-C20)-알케닐.
3) 알키닐이 직쇄 또는 분지쇄이며, 선택적으로 최대 4개의 삼중 결합을 포함하는, -(C2-C20)-알키닐,
4) -(C6-C14)-아릴,
5) -(C1-C8)-알킬-(C6-C14)-아릴,
6) -OH, 할로겐, -NO2 및/또는 -NH2로 1, 2 또는 3번 치환되거나 또는 비치환된, -(C5-C14)-헤테로사이클,
7) -(C3-C7)-사이클로알킬,
R2는 하기 모이어티 중 하나이며, 하기 8) 내지 11)의 모이어티는 각각 독립적으로 -OH, 할로겐, -NO2 및/또는 -NH2로 1, 2 또는 3번 치환 또는 비치환된 것임:
8) 알킬이 직쇄 또는 분지쇄인 -(C1-C6)-알킬,
9) 알케닐이 직쇄 또는 분지쇄이며, 선택적으로 최대 3개의 이중 결합을 포함하는, -(C2-C6)-알케닐,
10) 알키닐이 직쇄 또는 분지쇄이며, 선택적으로 2개의 삼중 결합을 포함하는, -(C2-C6)-알키닐,
11) 알킬이 -OH, 할로겐, -NO2 및/또는 -NH2로 1, 2 또는 3번 치환 또는 비치환된 직쇄 또는 분지쇄인, -(C1-C10)-알킬-C(O)-O-(C1-C6)-알킬.
R1-CH(OH)-R2 (II)
상기 일반식 II에서,
R1 및 R2는 상기와 동일한 의미이다.
용어 "아릴"은 고리에 6 내지 14개의 탄소 원자를 갖는 방향족 탄소 모이어티를 포함하는 것을 의미한다. -(C6-C14)-아릴 모이어티의 예는 페놀, 나프틸, 예컨대 1-나프틸, 2-나프틸, 바이페닐릴, 예컨대 2-바이페닐릴, 3-바이페닐릴 및 4-바이페닐릴, 안트릴 또는 플루오레닐이 있다. 바이페닐릴 모이어티, 나프틸 모이어티 및 특히 페닐 모이어티는 바람직하기로는 아릴 모이어티이다. 용어 "할로겐"은 일련의 F, Cl, Br 또는 I 요소를 의미한다. 용어 "-(C1-C20)-알킬"은 탄소쇄가 예컨대 예컨대 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, tert-부틸, 펜틸, 헥실, 헵틸, 옥틸, 노닐 또는 데카닐과 같은 1 내지 20개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분지쇄인 탄화수소 모이어티를 의미한다. 용어 "-C0-알킬"은 공유 결합을 의미한다.
용어 "-(C3-C7)-사이클로알킬"은 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실 또는 사이클로헵틸과 같은 환형의 탄화수소 모이어티를 포함하는 것으로 의미된다. 용어 "-(C5-C14)-헤테로사이클"은 부분적으로 포화되거나 또는 완전히 포화된 모노사이클, 또는 바이사이클 5원 내지 14원성 헤테로사이클 고리를 나타낸다. 헤테로원자의 예는 N, O 및 S이다. 피롤, 퓨란, 티오펜, 이미다졸, 피라졸, 옥사졸, 이속사졸, 티아졸, 이소티아졸, 테트라졸, 1,2,3,5-옥사티아디아졸-2-옥사이드, 트리아졸론, 옥사디아졸론, 이속사졸론, 옥사디아졸리딘디온, F, -CN, -CF3 또는 -C(O)-O-(C1-C4)-알킬로 치환된 트리아졸, 3-하이드록시피롤-2,4-디온, 5-옥소-1,2,4-티아디아졸, 피리딘, 피라진, 피리미딘, 인돌, 이소인돌, 인다졸, 프탈라진, 퀴놀린, 이소퀴놀린, 퀴녹살린, 퀴나졸린, 시놀린, 카르볼린 및 벤즈-아넬레이트된, 사이클로펜타-, 사이클로헥사- 또는 사이클로헵타-아넬레이티드된 상기 헤테로사이클의 유도체로부터 유래된 모이어티는, 용어 "-(C5-C14)-헤테로사이클"의 예이다. 모이어티, 2-피롤릴, 3-피롤릴, 페닐피롤릴, 예컨대 4- 또는 5-페닐-2-피롤릴, 2-푸릴, 2-티에닐, 4-이미다졸릴, 메틸-이미다졸릴, 예컨대 1-메틸-2-, -4-, 또는 -5-이미다졸릴, 1,3-티아졸-2-일, 2-피리딜, 3-피리딜, 4-피리딜, 2-, 3- 또는 4-피리딜-N-옥사이드, 2-피라지닐, 2-, 4-, 또는 5-피리미디닐, 2-, 3- 또는 5-인돌릴, 치환된 2-인돌릴, 예컨대, 1-메틸-, 5-메틸-, 5-메톡시-, 5-벤질옥시-, 5-클로로- 또는 4,5-디메틸-2-인돌릴, 1-벤질-2-, 또는 -3-인돌릴, 4,5,6,7-테트라하이드로-2-인돌릴, 사이클로헵타[b]-5-피롤릴, 2-, 3- 또는 4-퀴놀릴, 1-, 3- 또는 4-이소퀴놀릴, 1-옥소-1,2-디하이드로-3-이소퀴놀릴, 2-퀴녹살리닐, 2-벤조푸라닐, 2-벤조-티에닐, 2-벤조옥사졸릴 또는 벤조티아졸릴 또는 디하이드로피리디닐, 피롤리디닐, 예로 2- 또는 3-(N-메틸피롤리디닐), 피페라지닐, 모르폴리닐, 티오모르폴리닐, 테트라하이드로티에닐 또는 벤조디옥솔라닐이 특히 바람직하다.
본 발명은 각각 R-특이적인 알코올 디하이드로게나제 또는 산화환원 효소가 각각 사용되는 경우, 이들은 2-프로판올 및/또는 2-부탄올을 15%(부피) 보다 높게, 특히 25%(부피) 보다 높은 농도로 사용할 수 있다는 사실을 토대로 한다.
또한, 본 발명은 예컨대 4-할로-3-옥소부티르산 에스테르와 같은 수용성이 낮은 기질을 고농도에서 동질적인 수성/유기 시스템에서, 거울상이성질체 선택적인 방식으로 효소에 의해 환원시킬 수 있는 가능성을 연다.
이는, 예컨대 초기 산물인 S-4-클로로-3-하이드록시부티르산 에틸 에스테르가 이러한 동질적인 반응 혼합물 중에 직접 시안화(cyanidation) 단계에 첨가되어 (R)-4-시아노-3-하이드록시부티르산 에틸 에스테르로 추가적으로 처리될 수 있는(WO 03/097581 A1), 4-클로로아세토아세테이트의 거울상이성질체 선택적인 환원 단계 중에 이루어진다.
용어 "R-선택적인 산화환원 효소" 및 알코올 디하이드로게나제는 각각 예컨대 2-부탄온, 2-옥탄온 또는 바람직하기로는 아세토페논과 같은 비치환된 카르보닐 화합물을, 예컨대 R-2-부탄올, R-2-옥탄올, 또는 R-2-페닐에탄올과 같은 상응하는 R-하이드록시 화합물로 환원시키는 것을 포함하는 것으로 의도된다.
본 발명에 따라 사용되는 R-특이적인 산화환원 효소는 바람직하기로는 락토바실랄레스(Lactobacillales) 군, 특히 락토바실러스(Lactobacillus) 속, 예컨대, 락토바실러스 케퍼(Lactobacillus kefir)(US 5,200,335), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis)(DE　19610984 A1)(Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2000 Dec; 56 Pt 12:1696-8), 락토바실러스 마이너(Lactobacillus minor)(DE10119274), 또는 루코노스톡 카르노섬(Leuconostoc carnosum)으로부터 유래된 미생물체 및 스템(stem)이나, 또는 효소, 특히 피키아(Pichia), 칸디다(Candida), 파키솔런(Pachysolen), 데바로마이세스(Debaromyces) 또는 이작첸키아(Issatschenkia) 속 유래의, 특히 바람직하기로는 피키아 핀란디카(Pichia finlandica)(EP 1 179 595 A1) 유래의 미생물체 및 스템의 효소가 바람직하다.
본 발명에 따른 방법에서, NAD(P)H는 바람직하기로는 보조인자로서 사용된다. 용어 "NADPH"는 환원된 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트이다. 용어 "NADP"는 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트이다.
본 발명에 따른 방법의 일 예는, 박테리아 기원의 산화환원 효소가 사용되는 경우, 단일상의 액체 혼합물은 2-프로판올 및/또는 2-부탄올을 적어도 25%(부피) 이상으로 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 방법의 다른 예는, 단일상의 액체 혼합물은 2-프로판올 및/또는 2-부탄올을 적어도 25 내지 90%(부피)로, 특히 35 내지 70%(부피)로 포함하는 것을 특징으로 한다.
일반식 I의 화합물은 단일상의 액체 혼합물 중에, 바람직하기로는 5 내지 50 %(중량/부피)의 함량으로, 특히 15 내지 50%(중량/부피)로 포함된다.
효모 유래의 산화환원 효소를 사용하는 경우, 상기 단일상의 액체 혼합물은 바람직하기로는 2-프로파올을 적어도 15%(부피) 이상으로 포함한다.
본 발명에 따른 방법에서, 일반식 I의 화합물로서, 에틸-4-클로로아세토아세테이트, 메틸아세토아세테이트, 에틸-3-옥소발레리에이트, 4-하이드록시-2-부탄은, 에틸피루베이트, 2,3-디클로로아세토페논, 1-[3,5-비스(트리플루오로메틸)페닐]에탄-1-온, 아세토페논, 2-옥탄온, 3-옥탄온, 2,5-헥산디온, 1,4-디클로로-2-부탄온, 아세트옥시아세톤, 펜아실클로라이드, 에틸-4-브로모아세토아세테이트, 1,1-디클로로아세톤, 1,1,3-트리클로로아세톤 또는 1-클로로아세톤이 바람직하다.
본 발명에 따른 방법에서, 효소는 완전히 정제된 또는 부분적으로 정제된 상태이거나, 또는 세포내에 포함된 상태로 이용될 수 있다. 그러므로, 사용되는 세포는 천연, 투과화된 또는 용혈(lysed) 상태로 제공될 있다.
산화환원 효소는 10,000 내지 바람직하기로는 1000 million unit(U)으로 반응시킬 식 I의 화합물 1 kg 당 사용할 수 있다. 따라서, 효소 단위 1U은 1분 당 식 I의 화합물 1 μmol을 반응시키는데 필요한 효소 양에 해당된다.
pH 5 내지 10, 바람직하기로는 pH 6 내지 9의 완충액, 예컨대 포타슘 포스페이트, 트리스/HCl 또는 트리에탄올아민 완충액을 물에 첨가할 수 있다.
또한, 완충액은 효소를 안정화시키기 위한 이온류, 예컨대 마그네슘 이온을 포함할 수 있다.
더욱이, 알코올 디하이드로게나제의 기타 안정화제, 예컨대 글리세롤, 소르비톨, 1,4-DL-디티오트레이톨(DTT) 또는 디메틸 설폭사이드(DMSO)를 본 발명의 방법에 사용할 수 있다.
보조인자 NAD(P)H의 농도는 수상을 기준으로 0.001 mM 내지 1 mM이며, 특히 0.01 mM 내지 0.1 mM이다.
온도는, 예컨대 약 10 ℃ 내지 60 ℃이며, 바람직하기로는 20 ℃ 내지 35 ℃이다.
케토 화합물의 변환을 증가시키기 위한 변형 방법으로, 공정 중에 산화된 보조기질을 혼합물로부터 점진적으로 또는 계속적으로 제거하는 단계가 포함된다.
더욱이, 새로운 보조기질, 효소 또는 보조인자를 점진적으로 또는 계속적으로 반응조에 첨가할 수 있다.
본 발명에 따른 방법은 예컨대 유리나 금속으로 제조된 반응 용기내에서 수행된다. 이를 위해, 성분들을 반응 용기로 개별적으로 이동시켜, 예컨대 질소 또는 공기 대기하에서 교반한다. 사용되는 기질 및 일반식 I의 화합물에 따라, 반응 시간은 1 시간에서 96시간으로 지속되며, 특히 2시간 내지 24시간 지속된다.
본 발명의 바람직한 예는 하기 실시예를 들어 보다 상세하게 설명한다.
식 I의 화합물의 환원은 적절하게 수행하여, 하기 언급한 성분들을 반응 용기에 이동시키고, 실온에서 완전하게 혼합하면서 인큐베이션한다. 반응이 종결되면, 수용도에 따라, 반응 수용액으로부터 추출에 의해, 반응 용액으로부터 증류에 의해, 또는 추출 및 증류의 조합에 의해 산물을 분리 및 정제할 수 있다.
하기 실시예들에서 효소는 조추출물의 형태로 사용되었다.
실시예 1: (S)-에틸-4-클로로-3-하이드록시부티르산의 합성
성분 함량 반응 부피% 농도
완충액 (TEA pH = 7, 2 mM MgCl2,) 60 ml
NADP [M = 765 g/mol] 4.8 mg = 6.3 μmol
= 0.015 mM
보조기질, 2-프로판올 200 ml 50%
에틸-4-클로로아세토아세테이트 80 ml = 96 g 20%(v/v)
24%(w/v)		 0.58 mol
효소
= 락토바실러스 마이너 유래 R-ADH
= 1000 U/ml		 60 000 units
(60 ml)
부피 400 ml
인큐베이션 시간 24 h
변환율 >99%
ee-값 >99.9% S
ttn NADP 92 950
효소 소모량 600 000 units/kg
실시예 2: (R)- 메틸 -3- 하이드록시부티르산의 합성
성분 함량 반응 부피% 농도
완충액 (TEA pH = 7, 1 mM MgCl2, 10% 글리세롤) 300 ml
NADP [M = 765 g/mol] 10 mg 13 μmol (0.012 mM)
보조기질, 2-프로판올 400 ml 36.6%
메틸아세토아세테이트
M= 116 g/mol, d= 1.077 g/cm3 		300 ml 27.5% (v/v)
29.6 (w/v)		 2.7 mol
효소
= 락토바실러스 마이너 유래 R-ADH
= 1000 U/ml		 90 000 units
90 ml
부피 1090 ml
인큐베이션 시간 24 h
변환율 99%
ee-값 > 99,9%
ttn NADP 207692
효소 소모량 280 000 U/kg
실시예 3: 에틸-D-락테이트의 합성
성분 함량 반응 부피% 농도
완충액 (TEA pH = 7, 1 mM MgCl2, 10% 글리세롤) 170 ml
NADP [M = 765 g/mol] 40 mg 52 μmol (0.054mM)
보조기질, 2-프로판올 500 ml 52%
에틸피루베이트
M = 117 g/mol, d = 1.045)		 250 ml 26% (v/v)
27.2 (w/v)		 2.2 mol
효소
= 락토바실러스 마이너 유래 R-ADH
= 1000 U/ml		 40 000
부피 960 ml
인큐베이션 시간 48 h
변환율 99%
ee-값 |> 99%
ttn NADP 42 300
효소 소모량 160 000 U/kg
실시예 4: (R)-1,3- 부탄디올의 합성
성분 함량 반응 부피% 농도
완충액(TEA pH = 7, 1 mM MgCl2, 10% 글리세롤) 0.5 ml
NADP [M = 765 g/mol] 0.1 mg 0.13 μmol (0.013 mM)
보조기질, 2-프로판올 4.5 ml 44%
4-하이드록시-2-부탄온
(M =88.12 gmol)		 5 ml 48% (v/v) 0.057 mol
효소 (락토바실러스 마이너 유래 R-ADH),
= 1000 U/ml		 250 U(250 ㎕)
부피 10.25 ml
시스템:
공정 운영*:		 단일상, 아세톤 증류, 2-프로판올의 점진적인 첨가
인큐베이션 시간 24 h
2-프로판올의 총 소모량 13.5 ml
변환율 90%
ee-값 99% R
ttn NADP 438 461
효소 소모량 750 000 U/kg
* 형성된 아세톤은 배치에서 2번 증류시켰으며, 이후, 반응 개시기와 동량의 2-프로판올 및 효소를 반응 혼합물에 다시 첨가하였다. 이러한 방식으로, 기질 농도 48%의 배치에서도 90%의 변환율을 달성할 수 있었다.
실시예 5: R-2-옥탄올의 합성
성분 함량 반응 부피% 농도
완충액(TEA pH = 7, 1 mM MgCl2, 10% 글리세롤) 270 ml
NADP [M = 765 g/mol] 27 mg 35 μmol
(=0.023 mM)
보조기질, 2-프로판올 900 ml 60%
2-옥탄온(128 g/mol, d= 0.8) 300 ml 20% (v/v)
16% (w/v)		 1.87 M
효소 (락토바실러스 마이너 유래 R-ADH),
= 1000 U/ml		 30 000 units (30 ml)
부피 1500
시스템:
공정 운영*:		 단일상, 아세톤 증류, 2-프로판올의 점진적인 첨가
인큐베이션 시간 24 h
2-프로판올의 총 소모량 1350 ml
변환율 97%
ee-값 100% R
ttn NADP 53 000
효소 소모량 200 000 U/kg
* 형성된 아세톤은 배치에서 1번 증류시켰으며, 이후, 반응 개시기와 동량의 2-프로판올 및 효소를 반응 혼합물에 다시 첨가하였다. 이러한 방식으로, 기질 농도 20%의 배치에서도 97%의 변환율을 달성할 수 있었다.
실시예 6: (R,R)-2,5-헥산디올의 합성
성분 함량 반응 부피% 농도
완충액(TEA pH = 6, 1 mM MgCl2, 10% 글리세롤) 100 ml
NADP [M = 765 g/mol] 5 mg 6.5 μmol (0.011mM)
보조기질, 2-프로판올 325 ml 56%
2,5-헥산디온
(114 g/mol, d = 1)		 125 ml 22% (v/v)
22% (w/v)		 1.09 mol
효소 (락토바실러스 마이너 유래 R-ADH),
= 1000 U/ml		 25 000
부피 575 ml
시스템:
공정 운영*:		 단일상, 아세톤 증류, 2-프로판올의 점진적인 첨가
인큐베이션 시간 48 h
2-프로판올의 총 소모량 650 ml
변환율 78%
ee-값 100% R,R
ttn NADP 168 000
효소 소모량 400 000 U/kg
* 형성된 아세톤은 배치에서 1번 증류시켰으며, 이후, 반응 개시기와 동량의 2-프로판올 및 효소를 반응 혼합물에 다시 첨가하였다.
실시예 7: (S)-에틸-4- 클로로 -3- 하이드록시부티르산의 합성
성분 함량 반응 부피% 농도
완충액 (TEA pH = 7, 2 mM MgCl2,) 2 ml
NADP [M = 765 g/mol] 2 mg = 2.6 μmol
= 0.065 mM
보조기질, 2-프로판올 30 ml 65%
에틸-4-클로로아세토아세테이트 8 ml = 9.6 g 17% (v/v)
20% (w/v)		 58 mmol
효소
= 루코노스톡 카르노섬 DSMZ 5576 유래 R-ADH
= 1000 U/ml		 67 00 units (6 ml)
부피 46 ml
인큐베이션 시간 24 h
변환율 >99%
ee-값 >99.9% S
ttn NADP 22 300
효소 소모량 670 000 units/kg
실시예 8: (1R)-1-[3,5-비스(트리플루오로메틸)페닐]에탄-1-올의 합성
성분 함량 반응 부피% 농도
완충액 (TEA pH = 8.5, 2 mM MgCl2,) 200 ㎕
NAD [M = 663 g/mol] 0.05 mg 0.075 μmol
(0.027 mM)
보조기질, 2-프로판올 250 ㎕ 41.6% (v/v)
1-[3,5비스-(트리플루오로메틸)페닐]에탄-1-온
[256.15 g/mol] d=1.422		 100 ㎕ 16.6% (v/v)
효소
= 피키아 핀란디카 유래 R-ADH (EP1179595A1)		 40 units
(0.05 ml)		 0.56 mmol
부피 600 ㎕
인큐베이션 시간 24 h
변환율 99%
ee-값 99.9% R
ttn NAD 약 7500
효소 소모량 285 000 U/kg

Claims (13)

  1. 거울상이성질체 선택적 효소에 의한 일반식 (I)로 표시되는 케토 화합물의 환원 방법으로서, 상기 방법은
    (a) 5%(중량/부피) 이상의 일반식 (I)로 표시되는 화합물;
    (b) 15%(부피) 이상의 2-프로판올, 2-부탄올, 또는 이들의 혼합물; 및
    (c) 물
    을 포함하는 단일상의 액체 혼합물에, 보조인자의 존재하에 R-특이적인 산화환원 효소를 처리하여, 일반식 (II)로 표시되는 키랄 하이드록시 화합물을 형성하는 단계를 포함하며, 상기 보조인자는, 상기 2-프로판올, 2-부탄올, 또는 이들의 혼합물의 산화에 의해 재생되는 것을 특징으로 하는 환원 방법:
    R1-C(O)-R2 (I)
    상기 일반식 (I)에서,
    R1은 하기 모이어티 중 하나로서, 하기 1) 내지 7)의 모이어티는 각각 독립적으로 -OH, 할로겐, -NO2, -NH2, 또는 이들의 조합에 의해 1회, 2회 또는 3회 치환 또는 비치환된 것임:
    1) 알킬이 직쇄 또는 분지쇄인 -(C1-C20)-알킬,
    2) 알케닐이 직쇄 또는 분지쇄이며, 최대 4개의 이중 결합을 포함할 수 있는, -(C2-C20)-알케닐.
    3) 알키닐이 직쇄 또는 분지쇄이며, 최대 4개의 삼중 결합을 포함할 수 있는, -(C2-C20)-알키닐,
    4) -(C6-C14)-아릴,
    5) -(C1-C8)-알킬-(C6-C14)-아릴,
    6) -OH, 할로겐, -NO2, -NH2, 또는 이들의 조합에 의해 1회, 2회 또는 3회 치환되거나 또는 비치환된, -(C5-C14)-헤테로사이클, 및
    7) -(C3-C7)-사이클로알킬;
    상기 일반식 (I)에서, R2는 하기 모이어티 중 하나로서, 하기 8) 내지 11)의 모이어티는 각각 독립적으로 -OH, 할로겐, -NO2, -NH2, 또는 이들의 조합에 의해 1회, 2회 또는 3회 치환 또는 비치환된 것임:
    8) 알킬이 직쇄 또는 분지쇄인 -(C1-C6)-알킬,
    9) 알케닐이 직쇄 또는 분지쇄이며, 최대 3개의 이중 결합을 포함할 수 있는, -(C2-C6)-알케닐,
    10) 알키닐이 직쇄 또는 분지쇄이며, 2개의 삼중 결합을 포함하거나 포함하지 않는, -(C2-C6)-알키닐, 및
    11) 알킬이 -OH, 할로겐, -NO2, -NH2, 또는 이들의 조합에 의해 1회, 2회 또는 3회 치환 또는 비치환된 직쇄 또는 분지쇄인, -(C1-C10)-알킬-C(O)-O-(C1-C6)-알킬;
    R1-CH(OH)-R2 (II)
    상기 일반식 (II)에서, R1 및 R2는 상기 일반식 (I)에서 정의한 것과 동일하다.
  2. 거울상이성질체 선택적 효소에 의한 케토 화합물, 2,5-헥산디온의 환원 방법으로서, 상기 방법은
    (a) 5%(중량/부피) 이상의 2,5-헥산디온;
    (b) 15%(부피) 이상의 2-프로판올, 2-부탄올, 또는 이들의 혼합물; 및
    (c) 물
    을 포함하는 단일상의 액체 혼합물에, 보조인자의 존재하에 R-특이적인 산화환원 효소를 처리하는 단계를 포함하며, 상기 보조인자는, 상기 2-프로판올, 2-부탄올, 또는 이들의 혼합물의 산화에 의해 재생되는 것을 특징으로 하는 환원 방법.
  3. 거울상이성질체 선택적 효소에 의한 케토 화합물, 아세톡시아세톤의 환원 방법으로서, 상기 방법은
    (a) 5%(중량/부피) 이상의 아세톡시아세톤;
    (b) 15%(부피) 이상의 2-프로판올, 2-부탄올, 또는 이들의 혼합물; 및
    (c) 물
    을 포함하는 단일상의 액체 혼합물에, 보조인자의 존재하에 R-특이적인 산화환원 효소를 처리하는 단계를 포함하며, 상기 보조인자는, 2-프로판올, 2-부탄올, 또는 이들의 혼합물의 산화에 의해 재생되는 것을 특징으로 하는 환원 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 일반식 (I)로 표시되는 화합물로서, 에틸-4-클로로아세토아세테이트, 메틸아세토아세테이트, 에틸-3-옥소발레리에이트, 4-하이드록시-2-부탄온, 에틸피루베이트, 2,3-디클로로아세토페논, 아세토페논, 1-[3,5-비스(트리플루오로메틸)-페닐]에탄-1-온, 2-옥탄온, 3-옥탄옥, 1,4-디클로로-2-부탄온, 펜아실클로라이드, 에틸-4-브로모아세토아세테이트, 1,1-디클로로아세톤, 1,1,3-트리클로로아세톤, 또는 1-클로로아세톤을 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R-특이적인 산화환원 효소는 미생물 유래인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 미생물은 락토바실랄레스(Lactobacillales) 군의 세균 또는 효모 유래의 스템(stem)인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 락토바실랄레스(Lactobacillales) 군의 세균은 락토바실러스(Lactobacillus) 속이며, 상기 효모는 피키아(Pichia), 칸디다(Candida), 파키솔런(Pachysolen), 데바로마이세스(Debaromyces) 또는 이삭츠켄키아(Issatschenkia) 속인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 보조인자로서 NAD(P)H가 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단일상의 액체 혼합물은 박테리아 기원의 산화환원 효소를 사용하는 경우, 2-프로판올, 2-부탄올, 또는 이들의 혼합물을 25%(부피) 이상으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단일상의 액체 혼합물은 2-프로판올, 2-부탄올, 또는 이들의 혼합물을 25 내지 90%(부피) 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단일상의 액체 혼합물은 2-프로판올, 2-부탄올, 또는 이들의 혼합물을 35 내지 70%(부피)로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단일상의 액체 혼합물은 제1항에서 정의한 일반식 (I)로 표시되는 화합물을 5 내지 50%(중량/부피)로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단일상의 액체 혼합물은 제1항에서 정의한 일반식 (I)로 표시되는 화합물을 15 내지 50%(중량/부피)로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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