KR101345252B1 - 케토 화합물의 거울상이성질체 선택적인 효소적 환원 방법 - Google Patents

케토 화합물의 거울상이성질체 선택적인 효소적 환원 방법 Download PDF

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group

Abstract

본 발명은 2상 시스템으로 수행되며 조효소 재생시 4-메틸-2-펜타놀, 5-메틸-2-헥사놀 및/또는 2-헵타놀을 사용하는, 케토 화합물의 거울상이성질체 선택적인 환원 방법에 관한 것이다.

Description

케토 화합물의 거울상이성질체 선택적인 효소적 환원 방법{METHOD OF ENANTIOSELECTIVE ENZYMATIC REDUCTION OF KETO COMPOUNDS}
본 발명은 카르보닐 환원효소를 이용한 케토 화합물의 거울상이성질체 선택적인 효소적 환원 방법에 관한 것이다.
카르보닐 환원효소(이명: 알코올 탈수소효소, 산화환원효소)는 카르보닐 화합물의 환원 및 이차 알코올의 산화 각각에 대한 촉매제로서 알려져 있다. 이 효소는 조효소(coenzyme), 예컨대 NAD(P)H를 필요로 한다. 락토바실러스 케퍼(Lactobacillus kefir)로부터 수득한 카르보닐 환원효소 및 조효소 NADPH를 이용한 케톤의 환원은, 예컨대 미국 특허 5,342,767에 개시되어 있다. 이들 효소에 의해 케토 화합물을 광학 활성의 하이드록시 화합물로 환원할 수 있다. 예컨대 국제 특허 03/078615에 다른 방법도 개시되어 있다.
광학적으로 활성인 하이드록시 화합물은 약학적으로 활성인 화합물, 방향족 물질, 페로몬, 농업 화합물 및 효소 저해제의 합성에 폭넓게 적용가능한, 매우 쓸모있는 키랄 성분이다. 따라서, 키랄 화합물에 대한 수요가 증가하고 있으며, 향후 라세믹 화합물들을 약학적 제제로 사용하기 어려울 것이므로, 키랄 합성 기법은 특히 약학 산업에서 주목받고 있다.
프로키랄 케토 화합물의 비대칭성 환원은 입체선택적인 촉매 작용의 일 부분으로, 생촉매 작용(biocatalysis)은 화학적인 촉매 작용 대비 강력한 경쟁적인 기술이다. 화학적 비대칭성 수화에는 고독성이며 환경적으로 해로운 중금속 촉매, 극단적이며 따라서 에너지 집약적인 반응 조건 및 다량의 유기 용매가 사용된다. 게다가, 그러한 방법들은 종종 부작용과 부적합한 거울상이성질체 과잉 형성이 특징이다.
자연에서, 프로키랄 케토 화합물의 하이드록시 화합물로의 환원과 그 역반응은 모든 장기에서 일차 대사 및 이차 대사 둘다를 포함한 수많은 생화학적 경로에서 이루어지며, 여러가지 타입의 이차 알코올 탈수소효소 및 산화환원효소에 의해 촉매된다. 이들 효소들은 일반적으로는 보조인자-의존적이다.
프로키랄 케토 화합물을 키랄 하이드록시 화합물로 환원시키는데 생촉매를 이용하는 것에 대한기본적인 타당성은 과거 모델 시스템을 근간으로 반복적으로 입증되었으며, 이때 분리된 산화환원효소와 다양한 전-세포 생물형질전환 시스템 모두가 시험에 사용되었다. 생촉매 접근법은 온건한 반응 조건, 부산물 결핍과 종종 현저하게 나은 수득가능한 거울상이성질체 과잉 측면에서 유익하다. 따라서, 수득가능한 거울상이성질체 과잉, 분해 산물 및 부산물의 형성 뿐만 아니라 산물의 분리 측면에서, 분리된 효소를 이용하는 것이 전 세포를 이용한 방법에 비하여 유리하다. 또한, 전-세포 공정은 특수 장비와 노하우가 필요하기 때문에, 모든 화학 회사에서 이용가능한 것은 아니다.
최근, 유기 용매와 함께 수상/유기상 2상 시스템 중에 분리된 산화환원효소 를 이용하는 것이 매우 효과적이며 또한 고농도(> 5%)에서 실현가능한 것으로 입증되었다. 언급된 시스템에서, 일반적으로 난용성인 환원될 케토 화합물은 유기 용매와 함께 유기상을 형성한다. 또한, 유기 용매는 스스로 부분적으로 배분되어 환원될 케토 화합물로부터 유기상을 형성한다(DE1O119274, DE10327454.4, DE 103 37 401.9, DE 103 00 335.5). 따라서, 대부분의 경우에서 저렴한 수분산성 2-프로판올이 사용되는 이차 알코올의 동시 환원에 의해 조효소가 재생된다.
거울상이성질체 선택성이 높은 적정 R- 및 S-특이적인 산화환원효소 및 탈수소효소의 예는 하기를 포함한다:
칸디다 파랍실로시스(Candida parapsilosis) 유래의 카르보닐 환원효소(CPCR)(미국 특허 5,523,223 및 미국 특허 5,763,236, (Enzyme Microb Technol. 1993 Nov; 15(11):950-8)) 또는 피키아 캡슐라타(Pichia capsulata) ADH 유래의 카르보닐 환원효소(DE 10327454.4);
로도코커스 에리트로폴리스(Rhodococcus erythropolis)(RECR)(미국 특허 5,523,223), 노르카르디아 푸스카(Norcardia fusca)(Biosci. Biotechnol. Biochem., 63(10) (1999), pages 1721-1729; Appl Microbiol Biotechnol. 2003 Sep;62(4):380-6. Epub 2003 Apr 26)) 및 로도코커스 루버(Rhodococcus ruber)(J Org Chem. 2003 Jan 24;68(2):402-6) 유래의 카르보닐 환원효소; 및
락토바실러스 속의 유기체(락토바실러스 케피어(Lactobacillus kefir(US5200335)), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis )(DE 19610984 A1)(Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2000 Dec; 56 Pt 12:1696-8), 락토바실 러스 마이너Lactobacillus minor(DE10119274)) 또는 슈도모나스(Pseudomonas)(US 05385833)(Appl Microbiol Biotechnol. 2002 Aug; 59(4-5):483-7. Epub 2002 Jun 26., J. Org. Chem. 1992, 57, 1532))로부터 유래된 R-특이적인 이차 알코올 탈수소효소.
종래 방법에서 조효소 재생의 개선 및 단순화에 대한 각각의 요구가 있는 실정이다. 대부분의 알코올 탈수소효소 및 산화환원효소는 프로판올 농도 >15 부피%에서 빠르게 불활성화되어, 이후 케토 화합물에 비하여 임의 과잉으로 배치 프로세스에 적용할 수 없는 결과를 만들며, 그로 인해 동량의 케토 화합물로 평형의 역상태를 나타내는 기질과의 만족스럽지 않은 변환을 초래할 수 있다.
본 발명의 목적은 상기한 문제점을 해결하는 것이다.
본 발명은 일반식 I로 표시되는 케토 화합물의 거울상이성질체 선택적인 환원 방법에 관한 것으로,
상기 방법은
(a) 5 중량/부피% 이상의 일반식 I로 표시되는 화합물;
(b) 10 부피% 이상의 4-메틸-2-펜타놀, 5-메틸-2-헥사놀 및/또는 2-헵타놀; 및
(c) 물을 포함하는 2-상 액체 혼합물을,
보조인자의 존재하에 산화환원효소를 처리하여, 일반식 II로 표시되는 키랄 하이드록시 화합물을 형성하는 것을 특징으로 한다:
R1-C(O)-R2 (I)
상기 일반식 I에서,
R1은 각각 독립적으로 -OH, 할로겐, -NO2 및/또는 -NH2로 1, 2 또는 3번 치환 또는 비치환된, 하기 1) 내지 7)의 모이어티 중 하나이고:
1) 알킬이 직쇄 또는 분지쇄인 -(C1-C20)-알킬,
2) 알케닐이 직쇄 또는 분지쇄이며, 선택적으로 최대 4개의 이중 결합을 포함하는, -(C2-C20)-알케닐.
3) 알키닐이 직쇄 또는 분지쇄이며, 선택적으로 최대 4개의 삼중 결합을 포함하는, -(C2-C20)-알키닐,
4) -(C6-C14)-아릴,
5) -(C1-C8)-알킬-(C6-C14)-아릴,
6) -OH, 할로겐, -NO2 및/또는 -NH2로 1, 2 또는 3번 치환되거나 또는 비치환된, -(C5-C14)-헤테로사이클,
7) -(C3-C7)-사이클로알킬,
R2는 각각 독립적으로 -OH, 할로겐, -NO2 및/또는 -NH2로 1, 2 또는 3번 치환 또는 비치환된, 하기 8) 내지 11)의 모이어티 중 하나이다:
8) 알킬이 직쇄 또는 분지쇄인 -(C1-C6)-알킬,
9) 알케닐이 직쇄 또는 분지쇄이며, 선택적으로 최대 3개의 이중 결합을 포함하는, -(C2-C6)-알케닐,
10) 알키닐이 직쇄 또는 분지쇄이며, 선택적으로 2개의 삼중 결합을 포함하는, -(C2-C6)-알키닐,
11) 알킬이 -OH, 할로겐, -NO2 및/또는 -NH2로 1, 2 또는 3번 치환 또는 비치환된 직쇄 또는 분지쇄인, -(C1-C10)-알킬-C(O)-O-(C1-C6)-알킬.
R1-CH(OH)-R2 (II)
상기 일반식 II에서, R1 및 R2는 상기와 동일한 의미이다.
본 발명은, NAD(P)H의 조효소 재생을 위해 수불용성 4-메틸-2-펜타놀, 5-메틸-2-헥사놀 및/또는 2-헵타놀을 이용하여, 고도로 발현된 분리된 알코올 탈수소효소 및 산화환원효소를 이용한 공정을 각각 현저하게 개선시키고 간단화할 수 있다는 사실을 토대로 한다.
본 발명에 따른 방법의 바람직한 변형 방법은, 미생물 기원의 산화환원효소를 사용한다면, 2-상 액체 혼합물은 반응 배치의 총 부피를 기준으로 40 부피% 이상, 특히 40 내지 80 부피%의 4-메틸-2-펜타놀, 5-메틸-2-헥사놀 및/또는 2-헵타놀을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 방법에서, 케토 화합물의 환원은 보조인자 NADH 또는 NADPH와 산화환원효소를 포함하는 수상 및 공동기질(cosubstrate)인 4-메틸-2-펜타놀과 거기에 상당량 용해된 케토 화합물에 의해 형성된 유기상으로 구성되어 있는 2-상 시스템 중에서 수행된다.
NADPH의 조효소 재생은, 특히 난용성 케토 화합물에 대한 용매 또는 추출제로서의 역할을 동시에 수행하는, 공동기질인 4-메틸-2-펜타놀, 5-메틸-2-헥사놀 및/또는 2-헵타놀의 산화에 의해 수행된다.
4-메틸-2-펜타놀, 5-메틸-2-헥사놀 및/또는 2-헵타놀을 용매 및 공동기질로 이용함으로써, 평형의 역상태를 보이는 기질에서 우수한 변환(>90%), 고농도 및 현저하게 짧은 반응 시간을 달성할 수 있다.
전술한 방법은 예컨대 1,1,1-트리플루오로아세톤과 같이 특히 비등점이 낮은 케톤류의 환원에 이로우며, 제조되는 키랄 알코올은 1,1,1-트리플루오로프로판-2-올 경우와 같이 물의 비등점보다 낮은 비등점을 가진다. 이러한 경우, 하이드록시 화합물, 아세톤, 2-프로판올 및 물을 증류에 의해 분리하기 어렵다.
또한, 본 발명에 따라 사용되는 알코올은 사용되고 있는 수많은 산화환원효소를 안정화시키는 것으로 입증되었으며, 일반적으로 다른 수상-유기상의 2-상 시스템에 비하여 효소 소모량이 낮다.
따라서, 기질-커플링된 방법(즉, 케토 기질의 환원 및 4-메틸-2-펜타놀의 산화용 효소)으로, 또는 효소-커플링된 방법으로, 조효소를 재생시킬 수 있다. 효소-커플링된 방법에서, 보조인자 NADH 또는 NADPH의 재생은 제2의 고도로 발현된 분리된 이차 알코올 탈수소효소에 의해 수행된다.
이러한 방법에 의해, 103 - 106의 ttn's(총 턴오버 수, 보조인자 1 mol 당 형성된 산물의 mole)가 수득된다. 대부분의 경우, 유용한 기질 농도는 유의성 있게 5 부피% 이상이다.
공동기질의 농도는 반응 혼합물의 10 내지 90 부피%이며, 바람직하기로는 40 내지 80 부피%이다.
산화환원효소의 효소 소모량은 변환될 케토 화합물의 10000 - 10 Mio U/kg(상한 없음)이다. 효소 단위 1U은 분 당(min) 식 I의 화합물 1 μmol을 반응시키는데 필요한 효소량이다.
용어 "NADH"는 환원된 니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오티드이다. 용어 "NAD"는 니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오티드이다. 용어 "NADPH"는 환원된 니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오티드 포스페이트이다. 용어 "NADP"는 니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오티드 포스페이트이다.
용어 키랄 "하이드록시 화합물"은 식 II의 화합물이다:
R1-C(OH)-R2 (II)
상기 식 II에서, R1 및 R2는 식 I과 동일한 의미이다.
용어 "아릴"은 고리에 6 내지 14개의 탄소 원자를 포함하는 방향족 탄소 모이어티이다. -(C6-C14)-아릴 모이어티는 예를 들면, 페닐, 나프틸, 예컨대, 1-나프틸, 2-나프틸, 바이페닐릴, 예컨대 2-바이페닐릴, 3-바이페닐릴 및 4-바이페닐릴, 안트릴 또는 플루오레닐이다. 바이페닐릴 모이어티, 나프틸 모이어티 및 특히 페닐 모이어티가 바람직한 아릴 모이어티이다. 용어 "할로겐"은 F, Cl, Br 또는 I이다. 용어 "-(C1-C20)-알킬"은, 직쇄 또는 분지쇄형의 1-20개의 탄소 원자를 포함하는 탄소 쇄인 탄화수소 모이어티이며, 예컨대 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 3차 부틸, 펜틸, 헥실, 헵틸, 옥틸, 노네닐 또는 데카닐이다. 용어 "-C0-알킬"은 공유결합이다. 용어 "-(C3-C7)-사이클로알킬"은 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실 또는 사이클로헵틸 등의 사이클형의 탄화수소 모이어티이다. 용어 "-(C5-C14)-헤테로사이클"은 부분적으로 또는 모두 포화된 모노사이클형 또는 바이사이클형의 5원 내지 14원의 헤테로사이클 고리이다. 헤테로원자의 예는 N, O 및 S이다. "-(C5-C14)-헤테로사이클"의 예는 피롤, 푸란, 티오펜, 이미다졸, 피라졸, 옥사졸, 이속사졸, 티아졸, 이소티아졸, 테트라졸, 1,2,3,5-옥사티아디아졸-2-옥사이드, 트리아졸론, 옥사디아졸론, 이속사졸론, 옥사디아졸리딘디온, F, -CN, -CF3 또는 -C(O)-O-(C1-C4)-알킬에 의해 치환된 트리아졸, 3-하이드록시피로-2,4-디온, 5-옥소-1,2,4-티아디아졸, 피리딘, 피라진, 피리미딘, 인돌, 이소인돌, 인다졸, 프탈라진, 퀴놀린, 이소퀴놀린, 퀴녹살린, 퀴나졸린, 신놀린, 카르볼린- 및 벤즈-아닐레이트화된, 사이클로펜타-, 사이클로헥사- 또는 사이클로헵타-아닐레이트화된 상기 헤테로사이클의 유도체로부터 유래된 모이어티이다. 특히, 모이어티 2- 또는 3-피롤릴, 4- 또는 5-페닐-2-피롤릴과 같은 페닐피롤릴, 2-푸릴, 2-티에닐, 4-이미다졸릴, 메틸이미다졸릴, 예를 들면 1-메틸-2, -4- 또는 -5-이미다졸릴, 1,3-티아졸-2-일, 2-피리딜, 3-피리딜, 4-피리딜, 2-, 3- 또는 4-피리딜-N-옥사이드, 2-피라지닐, 2-, 4- 또는 5-피리미디닐, 2-, 3- 또는 5-인돌릴, 치환된 2-인돌릴, 예를 들면 1-메틸, 5-메틸, 5-메톡시-, 5-벤질옥시-, 5-클로로- 또는 4,5-디메틸-2-인돌릴, 1-벤질-2- 또는 -3-인돌릴, 4,5,6,7-테트라하이드로-2-인돌릴, 클로로헵타[b]-5-피롤릴, 2-, 3- 또는 4-퀴놀릴, 1-,3- 또는 4-이소퀴놀릴, 1-옥소-1,2-다이하이드로-3-이소퀴놀릴, 2-퀴녹살리닐, 2-벤조푸라닐, 2-벤조티에닐, 2-벤족사졸릴 또는 벤조티아졸릴 또는 다이하이드로피리디닐, 피롤리디닐, 예를 들면 2- 또는 3-(N-메틸피롤리디닐), 피페라지닐, 모르폴리닐, 티오모르폴리닐, 테트라하이드로티에닐 또는 벤조디옥솔라닐이 바람직하다.
일반식 I의 바람직한 화합물은, 에틸-4-클로로아세토아세테이트, 메틸아세토아세테이트, 에틸-8-클로로-6-옥소옥탄산, 에틸-3-옥소발레리에이트, 4-하이드록시-2-부타논, 에틸-2-옥소발레리에이트, 에틸-2-옥소-4-페닐부탄산, 에틸피루베이트, 에틸페닐글리옥실레이트, 1-페닐-2-프로파논, 2,3-다이클로로아세토페논, 아세토페논, 2-옥타논, 3-옥타논, 2-부타논, 2,5-헥산디온, 1,4-다이클로로-2-부타논, 펜아실 클로라이드, 에틸-4-브로모아세토아세테이트, 1,1-다이클로로아세톤, 1,1,3-트리클로로아세톤, 1,1,1-트리플루오로아세톤 및 1-클로로아세톤이다.
본 발명의 방법에서, 효소는 완전히 정제되거나 또는 부분적으로 정제된 상태로 사용할 수 있으며, 또는 세포에 함유된 상태로 사용할 수 있다. 따라서, 사용되는 세포는 원래 상태 그대로, 투과화된 상태 또는 용혈된 상태(lysed state)로 제공될 수 있다.
변환되는 일반식 I의 화합물 kg 당 산화환원효소 10000 내지 10 Mio U이 사용된다(상한 없음). 효소 단위 1U은 1분 동안 일반식 I의 화합물 1 μmol을 반응시키는데 필요한 효소의 양이다.
거울상이성질체 선택적인 케토 환원용 산화환원효소 이외에도, 추가적인 산화환원효소, 바람직하게는 이차 알코올 탈수소효소를 조효소 재생에 포함시킬 수 있다. 이차 알코올 탈수소효소의 적합한 예는, 써모안에어로븀 브록키(Thermoanaerobium brockii), 클로스트리듐 베이제린키(Clostridium beijerinckii), 락토바실로서 마이너(Lactobacillus minor) 또는 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 피키아 캡슐라타(Pichia capsulata), 칸디다 파랍실로시스(Candida parapsilosis), 로도코커스 에리트로폴리스(Rhodococcus erythropolis) 유래의 이차 알코올 탈수소효소이다.
본 발명의 방법에서, 알코올 탈수소효소는 완전히 정제되거나 또는 부분적으로 정제된 상태로 사용하거나 또는 알코올 탈수소효소가 포함된 전체 세포 상태로 사용할 수 있다. 따라서, 사용되는 세포는 원래 상태 그대로, 투과화된 상태 또는 용혈된 상태(lysed state)로 제공될 수 있다.
완충액, 예컨대 pH가 5 내지 10인, 바람직하기로는 6 내지 9인, 포타슘 포스페이트, 트리스/HCl 또는 트리에타놀아민 완충액을 물에 첨가할 수 있다. 또한, 완충액은 두가지 효소를 안정화시키거나 또는 활성화시키기 위한 이온, 예컨대 락토바실러스 마이너 유래의 알코올 탈수소화효소를 안정화시키기 위한 마그네슘 이온을 포함할 수 있다.
기질은 고체 또는 액체, 수용성 또는 비수용성일 수 있다. 반응중에, 기질은 또한 완전히 또는 불완전하게 용해된 상태로 존재할 수 있다. 반응 배치는 추가적인 유기 용매를 포함할 수 있다. 바람직한 유기용매로는, 예컨대 에틸 아세테이트, 3차 부틸 메틸 에테르, 다이이소프로필 에테르, 헵탄, 헥산 또는 사이클로헥산이나, 이들의 여러가지 조성의 혼합물이 있다.
보조인자 NAD(P)H의 농도는 수상을 기준으로 0.001 mM 내지 1 mM, 특히 0.01 mM 내지 0.1 mM이다.
본 발명의 방법에서, 식 I의 화합물은 예컨대 총 부피를 기준으로 2% - 50%(w/v)로, 바람직하게는 10% - 30%(w/v)로 사용된다.
본 발명에 따른 방법은 예컨대 유리나 금속으로 된 밀폐된 반응 용기에서 수행된다. 이를 위해, 구성 성분들은 각각 반응 용기로 이동되며, 예컨대 질소나 공기 대기하에서 혼합된다. 사용되는 기질과 식 I의 화합물에 따라, 반응 시간은 1시간 내지 96시간, 특히 2시간 내지 24시간이다.
반대로, 본 발명의 방법은 효소-촉매화된 산화 반응에 사용될 수 있다. 반응 조건은 식 I의 케토 화합물의 거울상이성질체 선택적인 상기 환원 공정과 근본적으로 동일하다. 그러나, 이 방법에서, 식 I의 케토 화합물의 거울상이성질체 선택적인 환원 대신, 식 II의 해당 하이드록시 화합물은 이에 사응하는 케토 화합물로 산화된다. 또한, 4-메틸-2-펜타놀, 5-메틸-2-헥사놀 및 5-메틸-3-헵타놀 각각을 사용하는 대신, 이에 값싼 상응하는 케톤류인, 4-메틸-2-펜타논, 5-메틸-2-헥사논 및 5-메탈-3-헵타논 각각을 NAD(P) 재생 공정에 사용한다. 식 II의 라세믹 하이드록시 화합물을 거울상이성질체 선택적인 산화환원효소와 함께 사용한다면, 이 과정에서 식 I의 케토 화합물과 식 II의 라세믹 하이드록시 화합물의 거울상이성질체가 수득된다.
그러나, 상기 방법은 비선택적인 산화환원효소나 또는 거울상이성질체 선택적인 산화환원효소 혼합물을 이용하여, 그것의 라세믹 알코올로부터 접근성이 좋지 않은 케토 화합물을 제조하는데 이용될 수 있다.
이하, 본 발명은 실시예를 들어 더욱 구체적으로 설명된다.
식 I의 화합물의 환원은, 반응 용기에 하기 언급된 성분들을 넣고 완전히 혼합되도록 실온에서 인큐베이션하여, 수행한다.
1. 칸디다 파랍실로시스 유래의 NADH -의존적인 효소를 이용한 (R)-에틸-4- 클로로 -3- 하이드록시부티르산의 합성
성분 양 퍼센트 농도
완충액
100 mM 트리에타놀아민완충액, pH = 7.5; 2 mM ZnCl2, 10% 글리세롤		 1 ml
NAD[M = 663 g/mol] 2 mg 3 μmol 0.3 mM
4-메틸-2-펜타놀 7 ml
에틸-4-클로로아세토아세테이트
(164 g/mol, d=1.2g/ml)		 2 ml = 2.4 g 20%(v/v)
14.6 mmol
효소
=칸디다 파랍실로시스 유래의 S-ADH		 1200 U
부피 10 ml
시스템 2상
조효소 재생 기질-커플링된
인큐베이션 기간 24시간
변환 >99%
ee-수치 >99%
ttn NAD 4866
효소 소모량 500 U/g
반응이 끝난 후, 산물이 함유된 유기상에서 수상을 분리하고, 증류에 의해 4-메틸-2-펜타놀로부터 산물 (R)-에틸-4-클로로-3-하이드록시부티레이트를 정제한다. 이러한 방법으로, (R)-에틸-4-클로로-3-하이드록시부티레이트를 화학적 순도 및 광학적 순도가 높은 형태로 수득할 수 있다.
2. 칸디다 파랍실로시스 유래의 NADH -의존적인 효소를 이용한 S,S- 부탄디올의 합성
성분 양 퍼센트 농도
완충액
100 mM 트리에타놀아민 완충액 pH = 7.5; 2 mM ZnCl2, 10% 글리세롤		 1 ml
NAD[M = 663 g/mol] 1 mg 1.5 μmol 0.15 mM
4-메틸-2-펜타놀 8 ml
4-하이드록시-2-부타논
(M = 88.12 g/mol)		 1 ml 10%(v/v)
효소
=칸디다 파랍실로시스 유래의 S-ADH		 1000 U
부피 10 ml
시스템 2상
조효소 재생 기질-커플링된
인큐베이션 기간 24시간
변환 >90%
ee-수치 >99%
ttn NAD 6630
효소 소모량 500 U/g
반응이 끝난 후, 산물이 함유된 유기상에서 수상을 분리하고, 증류에 의해 4-메틸-2-펜타놀로부터 산물 (S,S)-부탄디올을 정제한다. 이러한 방법으로, (S,S)-부탄디올을 화학적 순도 및 광학적 순도가 높은 형태로 수득할 수 있다.
3. 칸디다 파랍실로시스 유래의 NADH -의존적인 효소를 이용한 2,5-S,S- 헥산디올의 합성
성분 양 퍼센트 농도
완충액
100 mM 트리에타놀아민 완충액
pH = 7.5		 100 ml
NAD[M = 663 g/mol] 100 mg = 0.15 mmol
4-메틸-2-펜타놀 800 ml
2,5-헥산디온
(114 g/mol, d = 1)		 100 ml
= 0.87 mol		 10%(v/v)
효소
=칸디다 파랍실로시스 유래의 S-ADH		 36000 U
부피 1 L
시스템 2상
조효소 재생 기질-커플링된
인큐베이션 기간 24시간
변환 67%
ee-수치 >99.9
ttn NAD 5800
효소 소모량 360 U/g
반응이 끝난 후, 산물이 함유된 유기상에서 수상을 분리하고, 증류에 의해 4-메틸-2-펜타놀로부터 산물/유리물(educt)의 혼합물인 2,5-(S,S)-헥산디올/2,5-헥산디올을 분리한다.
산물인 2,5-(S,S)-헥산디올은 이후의 진공 증류로 유리물 2,5-헥산디온으로부터 분리할 수 있으며, 화합물 순도 > 99%로 수득할 수 있다. 그에 따른 공정의 총 수율은 예컨대 40-60%이다.
4. 피키아 캡슐라타 유래의 NADH -의존적인 효소를 이용한 (R)-2- 클로로 -1-(3-클로로페닐)에탄-1-올의 합성
성분 양 퍼센트 농도
100 mM 트리에타놀아민 완충액 pH = 7; 2 mM ZnCl2, 10% 글리세롤 1 ml
NAD[M = 663 g/mol] 0.5 mg 0.75 μmol
4-메틸-2-펜타놀 8 ml
2-클로로-1-(3-클로로페닐)에탄-1-온
(M = 189 g/mol)		 1 g 5.2 mmol
효소
=피키아 캡슐라타 유래의 S-ADH
(DE10327454.4)		 1000 U
부피 10 ml
시스템 2상
조효소 재생 기질-커플링된
인큐베이션 기간 24시간
변환 >99%
ee-수치 >99%
ttn NAD 6900
효소 소모량 1000 U/g
반응이 끝난 후, 산물이 함유된 유기상에서 수상을 분리하고, 증류에 의해 4-메틸-2-펜타놀로부터 산물 2-클로로-1-(3-클로로페닐)에탄-1-올을 분리한다.
5. NADPH -의존적인 산화환원효소에 의한 8- 클로로 -6- 옥소옥탄산 에틸 에스테르의 S-8-클로로-6- 하이드록시옥탄산 에틸 에스테르로의 환원
성분 양 퍼센트 농도
100 mM 포타슘 포스페이트 완충액 pH = 8.5, 10% 글리세롤 2 ml
NADP[M = 765 g/mol] 0.1 mg 0.13 μmol
4-메틸-2-펜타놀 5 ml
S-8-클로로-6-옥소-옥탄산 에틸 에스테르, 222.71 g/mol 0.5 ml 2.2 mmol
효소
= 락토바실러스 레우테리(Lactobacillus reuteri) 유래의 산화환원효소
DE 103 00 335.5		 240 U
효소
= 써모안에어로븀 브록키 유래의 ADH		 240U
부피 8 ml
시스템 2상
조효소 재생 효소-커플링된
인큐베이션 기간 24시간
변환 90%
ee-수치 97%
ttn NAD 17000
효소 소모량
락토바실러스 레우테리		 480 U/g
효소 소모량
써모안에어로븀 브록키		 480 U/g
6. 3- 옥소발레르산 메틸 에스테르의 S-3- 하이드록시 - 옥소발레르산 메틸 에스테르로의 환원, 피키아 캡슐라타
성분 양 퍼센트 농도
완충액
100 mM 트리에타놀아민 완충액 pH = 7.0 10% 글리세롤		 450 ㎕
NAD[M = 663 g/mol] 0.1 mg
4-메틸-2-펜타놀 450 ㎕
메틸-3-옥소발레리에이트 100 ㎕
효소
=피키아 캡슐라타 유래의 S-ADH
(DE10327454.4)		 50 U
부피 1000 ㎕
시스템 2상
조효소 재생 기질-커플링된
인큐베이션 기간 24시간
변환 95%
ee-수치 >99%
ttn NAD 5300
효소 소모량 500 U/g

Claims (8)

  1. 일반식 I로 표시되는 케토 화합물의 거울상이성질체 선택적인 환원 방법으로서,
    상기 케토 화합물은 비수용성이며,
    상기 방법은
    (a) 5 중량/부피% 이상의 일반식 I로 표시되는 화합물;
    (b) 40 부피% 이상의 4-메틸-2-펜타놀, 5-메틸-2-헥사놀 또는 2-헵타놀로부터 선택된 하나 이상의 성분 ; 및
    (c) 물을 포함하는 2-상 액체 혼합물을,
    보조인자로서 NAD(P)H의 존재하에 산화환원효소를 처리하여 일반식 II로 표시되는 키랄 하이드록시 화합물을 형성하는 것을 포함하는, 케토 화합물의 거울상이성질체 선택적인 환원 방법:
    R1-C(O)-R2 (I)
    R1-CH(OH)-R2 (II)
    상기 일반식 I 및 II에서,
    R1은 각각 독립적으로 -OH, 할로겐, -NO2 또는 -NH2로부터 선택된 그룹으로 1번 내지 3번 치환되거나 또는 비치환된 하기 1) 내지 7)의 모이어티 중 하나이고:
    1) 알킬이 직쇄 또는 분지쇄인 -(C1-C20)-알킬,
    2) 알케닐이 직쇄 또는 분지쇄이며, 선택적으로 최대 4개의 이중 결합을 포함하는, -(C2-C20)-알케닐.
    3) 알키닐이 직쇄 또는 분지쇄이며, 선택적으로 최대 4개의 삼중 결합을 포함하는, -(C2-C20)-알키닐,
    4) -(C6-C14)-아릴,
    5) -(C1-C8)-알킬-(C6-C14)-아릴,
    6) -OH, 할로겐, -NO2 또는 -NH2로부터 선택된 그룹으로 1번 내지 3번 치환되거나 또는 비치환된, -(C5-C14)-헤테로사이클,
    7) -(C3-C7)-사이클로알킬,
    R2는 각각 독립적으로 OH, 할로겐, -NO2 또는 -NH2로부터 선택된 그룹으로 1번 내지 3번 치환되거나 또는 비치환된 하기 8) 내지 11)의 모이어티 중 하나이다:
    8) 알킬이 직쇄 또는 분지쇄인 -(C1-C6)-알킬,
    9) 알케닐이 직쇄 또는 분지쇄이며, 선택적으로 최대 3개의 이중 결합을 포함하는, -(C2-C6)-알케닐,
    10) 알키닐이 직쇄 또는 분지쇄이며, 선택적으로 2개의 삼중 결합을 포함하는, -(C2-C6)-알키닐,
    11) 알킬이 -OH, 할로겐, -NO2 또는 -NH2로부터 선택된 그룹으로 1번 내지 3번 치환되거나 또는 비치환된 직쇄 또는 분지쇄인, -(C1-C10)-알킬-C(O)-O-(C1-C6)-알킬.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 산화환원효소는 미생물 기원의 산화환원효소인 방법.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 산화환원효소는 락토바실러스(Lactobacillus) 속의 락토바실러스 그룹의 박테리아, 또는 피키아(Pichia), 칸디다(Candida), 파키솔렌(Pachysolen), 데바로마이세스(Debaromyces) 또는 이삭센키아(Issatschenkia) 속의 효모로부터 유래된 산화환원효소인 방법.
  4. 삭제
  5. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 2-상 액체 혼합물은 4-메틸-2-펜타놀, 5-메틸-2-헥사놀 또는 2-헵타놀로부터 선택된 하나 이상의 성분을 40 - 80 부피%로 포함하는 것인 방법.
  6. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 2-상 액체 혼합물은 일반식 I의 화합물을 2 내지 50 %(w/v)로 포함하는 것인 방법.
  7. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 일반식 I의 화합물로 에틸-4-클로로아세토아세테이트, 메틸아세토아세테이트, 에틸-8-클로로-6-옥소옥탄산, 에틸-3-옥소발레리에이트, 4-하이드록시-2-부타논, 에틸-2-옥소발레리에이트, 에틸-2-옥소-4-페닐부티르산, 에틸피루베이트, 에틸페닐글리옥실레이트, 1-페닐-2-프로파논, 2,3-다이클로로아세토페논, 아세토페논, 2-옥타논, 3-옥타논, 2-부타논, 1,4-다이클로로-2-부타논, 펜아실 클로라이드, 에틸-4-브로모아세토아세테이트, 1,1-다이클로로아세톤, 1,1,3-트리클로로아세톤, 1,1,1-트리플루오로아세톤 또는 1-클로로아세톤이 사용되는 것인 방법.
  8. 제 6항에 있어서, 상기 2-상 액체 혼합물은 일반식 I의 화합물을 10 내지 50 %(w/v)로 포함하는 것인 방법.
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