WO2004104027A1 - アンジオテンシン変換酵素阻害ペプチド含有組成物 - Google Patents

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Definitions

  • the present invention relates to a composition containing an angiotensin converting enzyme (hereinafter, referred to as “ACE”) inhibitory peptide, which is useful for a hypotensive agent, a food for preventing hypertension, and the like.
  • ACE angiotensin converting enzyme
  • Non-Patent Document 1 renin-angiotensin system
  • calixin kinin system a hypotensive enzyme system
  • ACE converts angiotensin I into a potent pressor peptide, angiotensin II, and also has the effect of inactivating bradykinin, a hypotensive peptide. , Deeply involved in increasing blood pressure.
  • a collagenase digest of gelatin [Patent Document 1], a tryptic digest of bovine casein [Patent Document 2-4], a thermolysin digest of zein ( ⁇ -zein) [Patent Document 5], isolated soybean protein ACE inhibitory substances contained in thermolysin hydrolyzate (Patent Document 6), sardine muscle pepsin hydrolyzate (Patent Document 7), or Katsumo thermolysin hydrolyzate (Patent Document 8) have been reported. .
  • soybean peptide obtained by enzymatically hydrolyzing a soybean protein enhances ACE inhibitory activity [Patent Document 6].
  • This soybean peptide is composed mainly of hydrolyzed 7S globulin ( ⁇ -conglycinin) and 11S globulin (glycinin), which are the main proteins of soybean.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Application Laid-Open No. 52-148631
  • Patent Document 2 JP-A-57-15435
  • Patent Document 3 Japanese Patent Publication No. 60-23086
  • Patent Document 4 Japanese Patent Publication No. Sho 60-23087
  • Patent Document 5 JP-A-2-36127
  • Patent Document 6 JP-A-62-169732
  • Patent Document 7 JP-A-3-11097
  • Patent Document 8 Japanese Patent Application Laid-Open No. 4-144696
  • Non-Patent Document l Itoh H, et al., J. Clin Invest, 91, 2268 (1993).
  • an object of the present invention is to provide industrially large quantities of highly active ACE inhibitors from inexpensive raw materials such as by-products discharged in food production.
  • the present inventors found a substrate for obtaining a more active ACE inhibitor in a specific fraction of soybean, and found that the ACE inhibitory activity differs depending on the fraction. Findings were obtained.
  • a hydrolysis product using ⁇ -conglycinin ⁇ glycinin as a substrate which is a major storage protein of soybeans, was decomposed with protease using soybean whey protein, a trace protein in soybean, as a substrate. It has been found that a hydrolyzate having a higher ACE inhibitory activity than that obtained can be obtained. Further, they have found that the ACE inhibitory peptide present in the hydrolyzate is a tripeptide consisting of lectin-derived Leu_Ala_Pro, and completed the present invention.
  • soy whey or a hydrolyzate obtained by allowing a protease to act on soy whey protein or a composition containing an angiotensin converting enzyme inhibitory peptide comprising a fraction thereof,
  • composition according to (1) which is a repeptide
  • composition according to the above (1) wherein the crude protein content per soybean whey or soybean whey protein is 40% by weight or more based on the total solid content.
  • composition according to the above (1) wherein the lectin content per total protein in soy whey or soy whey protein is 10% by weight or more.
  • An antihypertensive agent having an angiotensin converting enzyme inhibitory activity comprising the composition according to the above (1).
  • a health food for lowering blood pressure having angiotensin converting enzyme inhibitory activity comprising the composition according to (1).
  • a method for improving hypertension which comprises providing an effective amount of the composition according to (1) to a mammal in need of improvement of hypertension.
  • Protease is allowed to act on a heat-aggregate formed by heating soy whey or a heat-aggregate obtained by exposing the heat aggregate to a pH of 4 or less to remove soluble matter, and removing insoluble matter to remove soy whey protein protein.
  • the present invention is a composition containing an angiotensin converting enzyme inhibitory peptide, comprising a hydrolyzate obtained by allowing a protease to act on soybean whey or soybean whey protein, or a fraction thereof.
  • angiotensin converting enzyme inhibitory peptide comprising a hydrolyzate obtained by allowing a protease to act on soybean whey or soybean whey protein, or a fraction thereof.
  • soybean whey is one in which most of the main storage proteins of soybeans are removed and other trace proteins are concentrated during or after water extraction from defatted soybeans or soybeans. Specifically, by-products generated during the production of various processed soybean products, such as supernatants after acid precipitation of isolated soybean proteins, washings of concentrated soybean proteins (acid concentrates, etc.), and waste liquids produced during the production of tofu and soy sauce And so on.
  • the following is a general production example of soybean whey, but it is not particularly limited as long as most of the main storage proteins of soybean are removed and other trace proteins are concentrated.
  • the above-mentioned soybean whey usually contains about 15 to 30% by weight of crude protein per total solid content, depending on the preparation method. Its composition differs from the main storage protein of soybeans: 10-20% lectin in total protein, 30-50% nick-type trypsin inhibitor, and others. Minor proteins such as i3 amylase and lipoxygenase are the main components.
  • the composition of ⁇ -conglycinin and glycinin, the main storage proteins in soybeans, is less than 10% of the total protein.
  • the power of using the above-mentioned soybean whey as it is, or the power of using soybean whey protein in which the protein is concentrated can be used.
  • the amount of crude protein per soybean whey or soybean whey protein is preferably at least 15% by weight or more, more preferably 45% by weight or more, even more preferably 75% by weight or more, based on the total solid content. . If the crude protein content is less than 15% by weight, a composition containing a large amount of ACE inhibitory peptide cannot be obtained.
  • soy whey or soy whey protein the higher the content of lectin, which is the main source of the ACE inhibitory peptide, the more preferable soy whey or at least 10% by weight per total protein in soy whey protein, and more preferable. Is suitably contained at least 15% by weight, more preferably at least 20% by weight.
  • the method for obtaining the soybean whey protein is not particularly limited, and is obtained by further removing low-molecular sugars and the like from soybean whey, further removing ash therein, or by removing most of the non-proteins.
  • the degree of purification can be changed according to the purpose, such as those excluded. For example, it is preferable to use a method of recovering denatured heat aggregates by heating as described below, or a method of exposing the heat aggregates to acidity, washing impurities, and concentrating the protein.
  • soy whey is heated, and soy whey protein that aggregates by heating is recovered.
  • the heating temperature was set to a temperature sufficient to soybean whey protein is denatured, preferably carried out in 80- 120 ° C, more preferably 85- 100 o C. If the calo-heat temperature is less than 80 ° C, growth into agglomerates will be insufficient, and if the heating temperature exceeds 120 ° C, coloring due to browning and the like will easily occur. As long as the heating time is long enough to form aggregates, it is sufficient to use a force in the range of 5-60 minutes depending on the temperature.
  • soybean whey when heating soybean whey, if alkaline earth metal ions such as calcium and magnesium are co-existed with 0.02 to 1% by weight based on the amount of soybean whey, precipitation of soybean whey protein is promoted.
  • the soy whey has a ⁇ of 29, preferably ⁇ 56.
  • the resulting soy whey protein has a crude protein content of about 45-55% by weight based on the total solid content. Ash content of about 30% by weight.
  • soybean whey protein of higher purity is obtained by heating at 100 150 ° C, preferably 1 10 120 ° C after heating the medium to ⁇ 6.5-9, preferably ⁇ 78. Gaining power S can.
  • the resulting soy whey protein contains 7585% by weight of crude protein and 10% by weight or less of ash based on the total solid content.
  • the ACE inhibitory peptide-containing composition of the present invention is obtained by hydrolyzing a soybean whey or a soybean whey protein with a protease. Further, the hydrolyzate is further fractionated using a means for fractionating by molecular weight by means such as gel filtration or membrane filtration, or a fractionation means utilizing a adsorptive property such as an adsorption resin or an ion exchange resin. Fractions were collected to obtain fractions.
  • the peptide contained in the hydrolyzate or a fraction thereof has a molecular weight of 100 to 2000, preferably 200 to 1000, and more preferably 200 to 500.
  • the peptide exhibiting ACE inhibitory activity was a tripeptide consisting of the amino acid sequence “Leu-Ala_Pro” as a result of analysis by an amino acid sequencer, and the IC50 value of the ACE inhibition rate was 0.13 / iM. .
  • the tripeptide is derived from lectin among soy whey proteins, and is 0.2 mg or more, preferably 0 mg or more, per lg of total protein in soy whey or a hydrolyzate of soy whey protein or a fraction thereof. Contains 2-10mg.
  • protease As a method of obtaining a hydrolyzate by allowing a protease to act on soybean whey or soybean whey protein, the protease is allowed to act, and then the pH is made acidic (preferably pH4-5), followed by heating to remove the insoluble fraction. A preferred method is to remove and collect the soluble fraction.
  • the protease used is not particularly limited. However, in order to obtain a higher level of ACE inhibitory activity, an endo-type protease derived from a microorganism, plant or animal is preferred. Specifically, a metal protease (thermolysin) is preferred. Etc.), serine proteases (trypsin, chymotrypsin
  • thermolysin Buritisin papain, fusin, bromelain, cathepsin B, etc.
  • aspartic protease pepsin, chymosin, cathepsin D, etc.
  • thermolysin Buritisin papain, bromelain are preferred.
  • the hydrolyzate obtained as described above is further fractionated by molecular weight by means such as gel filtration or membrane filtration, or a fractionation means utilizing the adsorption characteristics of an adsorption resin or an ion exchange resin. And a molecular weight of 200-1000, more preferably 200-500.
  • the ACE inhibitory peptide-containing composition of the present invention exhibits an extremely high level of ACE inhibitory activity as compared with a hydrolyzate prepared from soybean globulin as a main component, for example, isolated soybean protein. Therefore, even with a small amount of soybean curd, it is possible to exert a strong ACE inhibitory effect.
  • the ACE inhibitory peptide-containing composition of the present invention is used as a base material, and is formulated into tablets “liquid”, “granules”, powders and the like by known manufacturing methods using other known raw materials to inhibit ACE. It can be a hypotensive agent having an effect. The administration of this antihypertensive to hypertensive humans is effective in lowering blood pressure.
  • ACE inhibitory peptide-containing composition of the present invention as a basic raw material and other known raw materials, according to a known production method, baked confectionery, candy, gum, snack, tablet, beverage, jelly, etc.
  • Various foods can be manufactured to produce health foods having an ACE inhibitory effect, such as foods for specific health use for lowering blood pressure and health functional foods. It is effective for humans with hypertension to ingest this health food for humans who tend to have high blood pressure to improve hypertension.
  • soybean globulin (glycinin and j3-conglycinin), which is the main storage protein of soybean, was almost absent, and soybean lectin and nick-type trypsin inhibitor were mainly present.
  • the lectin content was estimated from amino acid composition analysis to be 16-20% by weight based on the total protein.
  • Thermolysin at 1% per crude protein content was added to the obtained crude whey protein product, and the mixture was reacted at 50 ° C for 4 hours while maintaining the pH at 7.5 to 8.5.
  • the reaction solution was adjusted to pH 4.5 with hydrochloric acid, heated at 95 ° C. for 20 minutes to stop the reaction, centrifuged (100 g ⁇ 5 minutes), the supernatant was recovered, and the soy whey protein hydrolyzate (ACE Inhibiting peptide-containing composition) was obtained.
  • whey protein was removed, and ⁇ -conglycinin, membrane protein, lipoxygenase, etc. were mainly detected as trace proteins of glycinin and -conglycinin.
  • the crude protein content in the total solid content of the protein was 86% by weight.
  • the isolated soybean protein solution was mixed with thermolysin at 1% per crude protein mass, and reacted at 50 ° C for 4 hours while maintaining the pH at 7.5 or more and 8.5 or less. Adjust the reaction solution to pH 4.5 with hydrochloric acid,
  • the reaction was stopped by heating at 20 ° C for 20 minutes, centrifugation was performed (1000 g ⁇ 5 minutes), and the supernatant was recovered to obtain a separated soybean protein hydrolyzate.
  • Example 1 The ACE inhibitory activity of each hydrolyzate obtained in Example 1 and Comparative Example 1 was measured by a known method ( Cushman-cheung method). Rabbit-derived ACE (manufactured by Sigma) was dissolved in 50 mM borate buffer (PH8.3) to prepare 0.1 Unit / ml. On the other hand, as a substrate, Bz-Gly-His-Leu (manufactured by Sigma) was dissolved in a 50 mM borate buffer (PH8.3) containing NaCl to a concentration of 4.2 mM. Further, as a sample for measuring the inhibitory activity, the concentration of the protein digest was measured by the Lowry method, and a sample having a known concentration was prepared.
  • 150 ⁇ l of the substrate solution, 50 ⁇ l of the sample solution, and 50 ⁇ l of the ACE solution were mixed and reacted at 37 ° C. for 30 minutes.
  • the final concentration in this reaction solution is 2.5 mM substrate and 1300 mM NaC.
  • 250 ⁇ l of 1N hydrochloric acid was added to stop the reaction, 1.5 ml of ethyl acetate was added, and the mixture was stirred for 10 seconds.
  • the mixture was further centrifuged at 3000 G ⁇ 2 minutes, and 1 ml of the ethyl acetate layer was collected.
  • the mixture was heated by a block heater at 120 ° C.
  • ⁇ Ds is the absorbance measured when kneading the sample as described above
  • ODsb is the absorbance measured by adding 250 ⁇ l of 1N hydrochloric acid before reacting the above mixed solution
  • ODc is the absorbance measured when no sample was added to the above mixed solution
  • ODcb was measured by adding 250 ⁇ l of 1N hydrochloric acid to the above mixed solution before reacting the sample without adding the sample. Is the absorbance of the sample.
  • thermolysin 1% per protein
  • the IC50 of the isolated soybean protein hydrolyzate of Comparative Example 1 was 50 / g / ml, whereas the soybean whey protein hydrolyzate of Example 1 was 28 Ai g. / ml, indicating that the soy whey protein hydrolyzate has a remarkably high ACE inhibitory activity even at a lower concentration than the isolated soy protein hydrolyzate.
  • the hydrolyzate using soybean whey protein as a substrate for enzymatic degradation clearly showed higher ACE inhibitory activity.
  • the soy whey protein hydrolyzate obtained in Example 1 was fractionated by gel filtration (FPLC) under the conditions shown in Table 2, and fraction I: Fr. 6-9 and fraction II: Fr. -15, Fraction III: Fr.16-20, Fraction IV: Fr.21-25 Each fraction was collected, evaporated to dryness at 80-100 ° C, and dissolved with 1.5 ml of water. The elution pattern obtained by this FPLC is shown in FIG.
  • Example 2 The fraction ⁇ ⁇ obtained in Example 2 was subjected to gel filtration (FPLC) again under the same conditions as in Example 2, and fractions m_l: Fr. 13-15, III-2: Fr. 16-18, ⁇ - 3: Fr.19-21, III-4: Fractionated into four fractions, Fr.22-24. Each fraction was collected, evaporated to dryness at 80 ° C and dissolved with 1.0 ml of water.
  • FIG. 2 shows the elution pattern of the supernatant of the enzyme digest obtained in Example 1 by FPLC.
  • Table 5 shows the recovery rate of the obtained ⁇ -1—III-4 fractions by the Lowry method
  • Table 6 shows the ACE inhibitory activity of each fraction. As a result, many activities were observed in fraction m_3: Fr.19-21.
  • Example 3 From the ⁇ -3 fraction having strong ACE inhibitory activity obtained in Example 3, an ACE inhibition-related peptide was purified by HPLC using a reversed-phase column.
  • Solvent A: TFAO. 1% water, ⁇ : acetonitrile
  • the concentration of the purified LAP was measured by the TNBS method, and the peak area of reverse phase HPLC per concentration was determined. When 50 ⁇ l of the ⁇ solution was injected, the peak area was about 28000. Based on this, the amount of Leu-Ala-Pro tripeptide contained in the degradation product was calculated from the recovery rate and peak area of each fraction.
  • the content in the supernatant of the degraded product of the IV fraction is 11%, so the content of the present tripeptide derived from the IV fraction per solid protein in the supernatant of the degraded product is 0.39 mg / g (on the degraded product). Clear). Combining those derived from these two fractions, the content of at least 1.06 mg of the present tripeptide per lg of protein solids in the supernatant of the degraded product is obtained.
  • FIG. 1 is an elution pattern of the protein hydrolyzate supernatant of Example 2 by gel filtration (FPLC).
  • FIG. 2 is an elution pattern by gel filtration (FPLC) of fraction III of Example 3.
  • FIG. 3 is an elution pattern of fraction # -3 of Example 4 by reversed-phase HPLC.
  • FIG. 4 is an elution pattern obtained by reversed-phase HPLC at a peak of Example 48 at 14.48 minutes.
  • FIG. 5 is an elution pattern of peak 1 of Example 6 by gel filtration HPLC.

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Abstract

　天然原料よりＡＣＥ阻害活性に優れたペプチド及びその製造法を提供する。 　大豆中の微量蛋白質である大豆ホエー蛋白質を基質にしてプロテアーゼで分解することにより、大豆の主要な貯蔵蛋白質であるβ-コングリシニンやグリシニンを基質としたペプチドよりもＡＣＥ阻害活性が高いペプチドを得られることを見出し、これに基づき本発明を完成するに至った。

Description

明 細 書
アンジォテンシン変換酵素阻害ペプチド含有組成物
技術分野
[0001] 本発明は、血圧降下剤または高血圧予防食品等への利用に有用な、アンジォテン シン変換酵素 (Angiotensin Converting Enzyme,以下「ACE」と称する）阻害ぺプチ ド含有組成物に関する。
背景技術
[0002] 代表的な成人病とされている高血圧症は、年々その患者数が増加しており、以前か らその原因究明および有効な対策について研究がなされて来た。高血圧症の発症 には、レニン'アンジォテンシン系と呼ばれる昇圧酵素系（非特許文献 1)とカリクイン •キニン系と呼ばれる降圧酵素系が重要な役割を果たしている。
[0003] それによると、その酵素系において、 ACEは、アンジォテンシン Iを強力な昇圧ぺプ チドであるアンジォテンシン IIに変換するとともに、降圧ペプチドであるブラジキニンを 不活性化する作用を示し、血圧上昇に深く関与する。
[0004] 従って、 ACEの活性を阻害することは血圧上昇を抑制する作用と密接な相関があ り、この認識に立って、これまで ACE阻害活性を有する種々の物質が検索され、報 告されてきた。
[0005] 例えば、ゼラチンのコラギナーゼ消化物〔特許文献 1〕、牛由来カゼインのトリプシン 分解物〔特許文献 2— 4〕、ゼイン（ γ -ゼイン）のサーモライシン分解物〔特許文献 5〕 、分離大豆蛋白質のサーモライシン分解物〔特許文献 6〕、イワシ筋肉のペプシン分 解物〔特許文献 7〕、あるいはカツォのサ一モライシン分解物〔特許文献 8〕に含まれる ACE阻害物質などが報告されてレ、る。
[0006] また大豆蛋白質を酵素加水分解した大豆ペプチドが ACE阻害活性を高めることも知 られている〔特許文献 6〕。この大豆ペプチドは大豆の主要な蛋白質である 7Sグロブ リン（β -コングリシニン）や 11Sグロブリン（グリシニン）が加水分解されたものを主成 分とするものである。
[0007] 特許文献 1 :特開昭 52— 148631号公報 特許文献 2 :特開昭 57— 15435号公報
特許文献 3：特公昭 60 - 23086号公報
特許文献 4：特公昭 60 - 23087号公報
特許文献 5 :特開平 2 - 36127号公報
特許文献 6 :特開昭 62 - 169732号公報
特許文献 7：特開平 3 - 11097号公報
特許文献 8：特開平 4 - 144696号公報
非特許文献 l : Itoh H， et al.， J. Clin Invest, 91， 2268(1993).
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0008] このように、これまで ACE阻害活性を有するペプチドは、多くの食品素材を原料に 使用して検索され活性があることが報告されているが、高い活性のものを低コストで 調製することを考えた場合、従来の高コストの食品素材では実用化にあたり課題も多 レ、と考えられる。そこで本発明は、食品製造において排出される副産物のような安価 な原料から高活性の ACE阻害物質を工業的に大量に提供することを目的とする。 課題を解決するための手段
[0009] 上記課題に鑑みて、本発明者らはより高活性の ACE阻害物質を得るための基質を 大豆の特定の画分の中に求めたところ、画分によって ACE阻害活性に差異がある 知見が得られた。そしてさらに鋭意研究を行った結果、大豆中の微量蛋白質である 大豆ホエー蛋白を基質にしてプロテアーゼで分解することにより、大豆の主要な貯蔵 蛋白質である β -コングリシニンゃグリシニンを基質とした加水分解物よりも ACE阻害 活性が高い加水分解物を得られることを見出した。そしてさらに、該加水分解物中に 存在する ACE阻害ペプチドがレクチン由来の Leu_Ala_Proからなるトリペプチドであ ることを見出し、本発明を完成するに至ったものである。
[0010] すなわち本発明は、
(1)大豆ホエーもしくは大豆ホエー蛋白にプロテアーゼを作用させた加水分解物又は その分画物からなるアンジォテンシン変換酵素阻害ペプチド含有組成物、
(2)アンジォテンシン変換酵素阻害ペプチドが Leu_Ala_Proのアミノ酸配列からなるト リペプチドである上記 (1)に記載の組成物、
(3)大豆ホエーもしくは大豆ホエー蛋白中の全固形分あたりの粗蛋白質含量が 40重 量％以上である上記 (1)に記載の組成物、
(4)大豆ホエーもしくは大豆ホエー蛋白中の全蛋白質あたりのレクチン含量が 10重量 %以上である上記 (1)に記載の組成物、
(5)加水分解物又はその分画物中に含まれるペプチドの分子量が 100 2000であ る上記 (1)に記載の組成物、
(6)大豆ホエーもしくは大豆ホエー蛋白中の全蛋白質 lgあたりの Leu-Ala-Proのアミ ノ酸配列からなるトリペプチドの含量力 0. 2mg以上である上記 (2)に記載の組成物
(7)上記 (1)に記載の組成物を含有するアンジォテンシン変換酵素阻害作用を有する 血圧降下剤。
(8)上記 (1)に記載の組成物を含有するアンジォテンシン変換酵素阻害作用を有する 血圧降下用健康食品。
(9)上記（1)に記載の組成物の、血圧降下剤又は血圧降下用健康食品製造における 使用。
(10)高血圧の改善に有効量の上記 (1)に記載の組成物を、高血圧の改善が必要な哺 乳動物に与えることを特徴とする高血圧の改善方法。
(11)大豆ホエーを加熱して生ずる加熱凝集物、又は該加熱凝集物を pH4以下にさら して可溶物を除去したものにプロテアーゼを作用させ、不溶物を除去して大豆ホェ 一蛋白加水分解物を得ることを特徴とするアンジォテンシン変換酵素阻害ペプチド 含有組成物の製造法、
(12)大豆ホエー蛋白加水分解物からさらに分子量 200 1000のペプチドを分画す る上記 (11)に記載の組成物の製造法、を提供するものである。
発明の効果
大豆ホエーもしくは大豆ホエー蛋白を加水分解することにより、分離大豆蛋白をカロ 水分解するよりも ACE阻害活性の高レ、、食品由来のペプチド含有組成物を得ること が可能となった。また本発明のペプチドの中に比較的多く認められる ACE阻害活性 の高いトリペプチド Leu-Ala-Proは、天然由来であるので、安全性が高ぐ食品として 使用しても何ら問題ない。さらに本発明には各種大豆製品の副産物を有効利用する ことができるので、低コストでの製造が可能であり、環境の側面においても非常に有 益なものである。
発明を実施するための最良の形態
[0012] 本発明は、大豆ホエーもしくは大豆ホエー蛋白にプロテアーゼを作用させた加水 分解物又はその分画物からなるアンジォテンシン変換酵素阻害ペプチド含有組成 物である。以下本発明について、その実施態様を示す。
[0013] 本発明において大豆ホェ一は、脱脂大豆や大豆から水抽出時又は水抽出後に、 大豆の主要貯蔵蛋白質の大部分が除去され、他の微量蛋白質が濃縮されたもので ある。具体的には各種大豆加工製品の製造時に発生する副産物、すなわち分離大 豆蛋白の酸沈殿後の上清や、濃縮大豆蛋白〔酸コンセントレート等〕の洗浄液、豆腐 やしようゆの製造時に生ずる廃液などが含まれる。以下に大豆ホエーの一般的な製 造例であるが、大豆の主要貯蔵蛋白質の大部分が除去され、他の微量蛋白質が濃 縮される方法であれば、特に限定されるものではない。
[0014] (分離大豆蛋白ホエー）
脱脂大豆フレークを水又は希アルカリ水溶液 (約 pH8— 9)で抽出し、遠心分離に より残渣を除去し、上清を回収して脱脂豆乳を得る。これに塩酸を加えて pH4. 5前 後に調整し、遠心分離によりホェ一画分と酸沈殿画分に分離する。得られた酸沈殿 画分を水分散させ、アルカリ水溶液で中和後、噴霧乾燥して分離大豆蛋白を得る。 副産物としてホェ一画分である分離大豆蛋白ホエーを得る。
[0015] (濃縮大豆蛋白ホエー）
脱脂大豆に水をカ卩え、塩酸で pH4. 5前後に調整しつつ洗浄し、不溶性画分を回 収して中和後、乾燥粉砕し、希酸洗浄による濃縮大豆蛋白（酸コンセントレート）を得 る。副産物として可溶性画分である濃縮大豆蛋白ホエーを得る。
[0016] 上記大豆ホエーには、調製方法にもよるが、通常は粗蛋白質が全固形分あたり約 1 5— 30重量％程度含まれる。その組成は大豆の主要な貯蔵蛋白質とは異なり、全蛋 白質中レクチンが 10— 20%、クニッッ型トリプシンインヒビターが 30— 50%、その他 i3アミラーゼ、リポキシゲナーゼなどの微量蛋白質が主成分となっている。そして大 豆の主要な貯蔵蛋白質である β一コングリシニン及びグリシニンの組成は全蛋白質 中 10%にも満たないものである。
[0017] 本発明の ACE変換酵素阻害ペプチド含有組成物を得るための原料としては、上 記大豆ホエーをそのまま用いる力、、又は蛋白質を濃縮した大豆ホエー蛋白を用いる こと力 Sできる。大豆ホエーもしくは大豆ホエー蛋白中の全固形分あたり粗蛋白質は多 いほど好ましぐ少なくとも 15重量％以上、より好ましくは 45重量％以上、さらに好ま しくは 75重量％以上含有することが適当である。粗蛋白質が 15重量％未満になると ACE阻害ペプチドを多く含有する組成物が得られなレ、。また大豆ホエーもしくは大 豆ホエー蛋白中には、 ACE阻害ペプチドの主要な供給源であるレクチンの含量が 多いほど好ましぐ大豆ホエーもしくは大豆ホエー蛋白中の全蛋白質あたり少なくとも 10重量％以上、より好ましくは 15重量％以上、さらに好ましくは 20重量％以上含有 することが適当である。
[0018] 上記大豆ホエー蛋白を得る方法については特に限定されず、大豆ホエーから低分 子の糖などをさらに除去したもの、さらにそれらの中の灰分を除いたもの、または非蛋 白質を大部分除いたものなど、 目的に合わせて精製度を変えることができる。例えば 下記のように加熱して変性した加熱凝集物を回収する方法やさらに加熱凝集物を酸 性下にさらし、不純物を洗浄して蛋白質を濃縮する方法を用いることが好ましい。
[0019] 以下に大豆ホエー蛋白の好ましい調製方法を示す。例えば大豆ホエーを加熱し、 加熱凝集する大豆ホエー蛋白を回収する。加熱温度は大豆ホエー蛋白が変性する に十分な温度とし、好ましくは 80— 120°C、より好ましくは 85— 100oCで行う。カロ熱温 度が 80度未満であると凝集塊への成長が不十分であり、加熱温度が 120°Cを超える と褐変などによる着色が出やすくなる。加熱時間は凝集物の形成に十分な時間とす ればよぐ温度により異なる力 5— 60分の範囲で行えば十分である。また大豆ホェ 一を加熱する際に、予めカルシウムやマグネシウム等のアルカリ土類金属イオンを大 豆ホエー量に対して 0. 02— 1重量％共存させると大豆ホエー蛋白の沈殿が促進さ れる。加熱を行う際の大豆ホエーの ρΗは 2 9、好ましくは ρΗ5 6とすることが適当 である。得られた大豆ホエー蛋白は全固形分あたり粗蛋白質が 45— 55重量％程度 、灰分が 30重量％程度含有するものである。
[0020] またさらに、上記の加熱凝集させた大豆ホエー蛋白に加水し、塩酸等の酸を用い て pH4以下、より好ましくは pH3以下にさらすことによって、可溶化した灰分等の不純 物を除去する。次に ρΗ6. 5— 9、好ましくは ρΗ7 8に中禾ロ後、 100 150°C、好ま しくは 1 10 120°Cで加熱することによって可溶化させることにより、さらに高純度の 大豆ホエー蛋白を得ること力 Sできる。得られた大豆ホエー蛋白は全固形分あたり粗蛋 白質が 75 85重量％も含有し、灰分が 10重量％以下に低減されたものである。
[0021] 本発明の ACE阻害ペプチド含有組成物は、上記大豆ホエーもしくは大豆ホエー蛋 白にプロテアーゼを作用させ、加水分解物としたものである。またさらに該加水分解 物をゲルろ過、膜ろ過等の手段により分子量で分画する手段、あるいは吸着樹脂や イオン交換樹脂などの吸着特性を利用した分画手段を使用して分画し、特定の画分 を分取することによって、分画物としたものである。
[0022] 該加水分解物又はその分画物に含まれるペプチドの分子量は 100— 2000、好まし くは 200— 1000、さらに好ましくは 200— 500であること力 S適当である。そして、該ぺ プチドにおいて、 ACE阻害活性を示すペプチドは、アミノ酸シーケンサーによる分析 の結果、「Leu-Ala_Pro」なるアミノ酸配列からなるトリペプチドであり、 ACE阻害率の IC50値は 0.13 /i Mである。該トリペプチドは、大豆ホエー蛋白質の内、レクチンに由 来するものであり、大豆ホエーもしくは大豆ホエー蛋白の加水分解物又はその分画 物中の全蛋白質 lgあたり、 0. 2mg以上、好ましくは 0. 2— 10mg含まれる。
[0023] 大豆ホエーもしくは大豆ホエー蛋白にプロテアーゼを作用させ、加水分解物を得る 方法としては、プロテアーゼを作用させた後、 pHを酸性 (好ましくは pH4— 5)にして 加熱し、不溶画分を取り除いて、可溶画分を回収する方法が好ましい。使用するプロ テアーゼとしては特に限定されないが、より高レ、 ACE阻害活性を得るために、微生 物由来、植物由来又は動物由来のエンド型プロテアーゼが好ましぐ具体的には金 属プロテアーゼ（サーモライシンなど）、セリンプロテアーゼ（トリプシン、キモトリブシン
、トロンビン、プラスミン、エラスターゼ、ズブチリシンなど）、チオールプロテアーゼ（パ パイン、フイシン、ブロメライン、カテブシン Bなど）、ァスパラギン酸プロテアーゼ（ぺプ シン、キモシン、カテブシン Dなど）などを用いることができる。特にサーモライシン、ズ ブリチシン、パパイン、ブロメラインが好ましい。
[0024] 上記により得られた加水分解物をさらにゲルろ過、膜ろ過等の手段により分子量で分 画する手段、あるいは吸着樹脂やイオン交換樹脂などの吸着特性を利用した分画手 段を使用し、分子量 200— 1000、より好ましくは 200— 500の分画物として得ること あでさる。
[0025] 本発明の ACE阻害ペプチド含有組成物は、例えば分離大豆蛋白のように大豆グロ ブリンを主要成分とするものから調製した加水分解物に比べ、極めて高レ、 ACE阻害 活性を示す。したがって少量の添カ卩であっても強レ、ACE阻害効果を発揮することが 可能である。
[0026] 本発明の ACE阻害ペプチド含有組成物を基礎原料として使用し、その他公知の原 材料を使用して、公知の製法により、錠剤 '液剤'顆粒剤'粉剤などに製剤化して AC E阻害作用を有する血圧降下剤とすることができる。この血圧降下剤は高血圧症のヒ トに対して投与することが血圧降下に有効である。
[0027] 本発明の ACE阻害ペプチド含有組成物を基礎原料として使用し、その他公知の原 材料を使用して、公知の製法により、焼き菓子、キャンデー、ガム、スナック、タブレツ ト、飲料、ゼリー等の種々の食品を製造して、 ACE阻害作用を有する血圧降下用途 の特定保健用食品、保健機能食品等の健康食品とすることができる。この健康食品 は高血圧症のヒトゃ血圧が高い傾向にあるヒトに摂取させることが高血圧の改善に有 効である。
実施例
[0028] 以下に本発明の実施例を記載するが、本発明は、この実施例にのみ限定されるも のではなぐ本発明の要旨を逸脱しない範囲内において種々変更を加え得ることは 勿論である。
[0029] ◎実施例 1 (大豆ホエー蛋白加水分解物の調製）
脱脂大豆 2kgに 10倍の水（20L)を加え、攪拌しながら塩酸にて pHを 4. 3に調整後 、遠心分離して不溶物を除き、上清 16Lを回収した。
次に消石灰をカ卩えて、 PHを 5. 3に調整し、 95°Cに加熱して不溶化凝集する蛋白 質分を遠心分離にて回収した。得られた沈澱物に水を 2L添加し、塩酸を加えて pH を 2.0に調整し、遠心分離（lOOOg X 5分)で酸可溶性成分を除去した。さらに沈澱物 に 0.2Lの水を加え、 pHを水酸化ナトリウムで 8.5に調整後、 120°C、 10分の加熱を行 レ、、蛋白質を可溶化し、大豆ホエー蛋白を得た。該蛋白の全固形分中の粗蛋白質 含量は 81重量％であった。電気泳動によれば大豆の主要な貯蔵蛋白質である大豆 グロブリン（グリシニンや j3—コングリシニン）はほとんど存在せず、主に大豆レクチンと クニッッ型トリプシンインヒビターが存在した。そのうち、レクチン含量はアミノ酸組成 分析から、全蛋白質あたり 16— 20重量％と推測された。
[0030] 得られたホエー蛋白質粗精製物に粗蛋白質含量あたり 1 %のサーモライシンを添 加し、 pHを 7.5以上 8.5以下に保ちつつ 50°Cで 4時間反応させた。反応液は、塩酸で pHを 4.5に調整し、 95°C、 20分加熱して反応を止め、遠心分離（lOOOg X 5分）を行い 、上澄みを回収し、大豆ホエー蛋白加水分解物 (ACE阻害ペプチド含有組成物）を 得た。
[0031] ◎比較例 1 (分離大豆蛋白加水分解物の調製）
脱脂大豆 2kgに 10倍の水（20L)を加え、攪拌しながら水酸化ナトリウムにて pHを 7.5に調整後、遠心分離（1000g X 5分)して不溶物を除き、脱脂豆乳 17Lを回収した 次に塩酸を加えて、 pHを 4. 5に調整し、不溶化凝集する大豆グロブリン蛋白質を 遠心分離（1000g X 5分）にて回収した。得られた沈澱物に水を 16L添加し、水酸化 ナトリウムを加えて pHを 8.0に調整して溶解した。その後、 120°C、 10分の加熱を行い 、分離大豆蛋白質（主に大豆グロブリン）の溶液とした。電気泳動によれば、ホエー蛋 白質は除去されており、主にグリシニン、 ーコングリシニンのほカ 微量蛋白質とし て、 γ—コングリシニン、膜タンパク質、リポキシゲナーゼなどが認められた。該蛋白の 全固形分中の粗蛋白質含量は 86重量％であった。
[0032] 分離大豆蛋白溶液に粗蛋白質量あたり 1 %のサーモライシンを添カ卩し、 pHを 7.5以 上 8.5以下に保ちつつ 50°Cで 4時間反応させた。反応液を塩酸で pH4.5に調整し、 95
°C、 20分加熱して反応を止め、遠心分離（1000g X 5分）を行い、上澄みを回収し、分 離大豆蛋白加水分解物を得た。
[0033] 実施例 1、比較例 1で得られた各加水分解物の ACE阻害活性を公知の測定法（ Cushman-cheung法）に準じて測定した。ラビット由来 ACE (シグマ社製）を 50mMホウ 酸緩衝液 (PH8.3)に溶解し、 0.1Unit/mlになるように調製した。一方、基質としては、 Bz-Gly-His-Leu (シグマ社製）を 4.2mMになるように NaClを含む 50mMホウ酸緩衝液（ PH8.3)で溶解した。また、阻害活性を測定するサンプルは、ローリー法でタンパク分 解物の濃度を測定し、濃度が既知のものを用意した。それぞれ基質溶液 150 μ 1、サ ンプル溶液 50 μ 1、 ACE溶液 50 μ ΐを混合し、 37°C、 30分反応させた。この反応液中の 最終濃度は、基質 2.5mM、 NaC1300mMである。次いで 1規定の塩酸を 250 μ 1カ卩えて 、反応を停止し、 1.5mlの酢酸ェチルをカ卩えて 10秒間攪拌し、さらに 3000G X 2分間遠 心し、酢酸ェチル層を lml採取した。そしてブロックヒーターにより、 120°C、 30分加熱 し、蒸発乾固させ、これに lmlの蒸留水をカ卩えて、抽出されたヒプリル酸の吸収（ 228nmの吸光度）を測定した。アンジォテンシン変換酵素阻害率は下記の〔1〕式によ つて求めるようにした。但し、〇Dsは上記のようにしてサンプノレをカ卩えて測定したとき の吸光度、 ODsbは上記の混合溶液を反応させる前に 1規定の塩酸を 250 μ 1添加さ せて測定した時の吸光度、 ODcは上記の混合溶液にサンプノレを加えずに測定した 時の吸光度、 ODcbは上記の混合溶液にサンプノレをカ卩えずに反応させる前に 1規定 の塩酸を 250 μ 1添加させて測定した時の吸光度である。
[0034] (数 1)
ODs-ODsb
1 X 100 〔1〕
ODc— ODcb
[0035] そして求められた阻害率から、各サンプルの阻害活性を確認すベぐその分解物の
ACE阻害率が 50%となる濃度（IC50)を求めた。得られた結果を表 1に示す。
[0036] (表 1)各蛋白加水分解物の ACE阻害活性 主要蛋白質 A C E阻害活性 (IC50) 実施例 1 大豆ホェ - レクチン 28 g/ml
蛋白 トリプシンインヒビ夕' 比較例 1 分離大豆 グリシニン 50 / g/ml
蛋白 )3—コングリシニン
[0037] 実験結果より、プロテアーゼは両者ともサーモライシン (対蛋白質当り 1%を添加、
50°C、 4時間）を使用したが、 IC50は比較例 1の分離大豆蛋白加水分解物が 50 / g/mlであるのに対し、実施例 1の大豆ホエー蛋白加水分解物は 28 Ai g/mlであり、大 豆ホエー蛋白加水分解物は、分離大豆蛋白加水分解物に比べて低濃度においても 、顕著に ACE阻害活性が高いことがわかった。このように明らかに酵素分解の基質と して大豆ホエー蛋白を使用した加水分解物の方が高い ACE阻害活性を示した。
[0038] ◎実施例 2 (大豆ホエー蛋白加水分解物のゲル濾過による分画）
実施例 1で得られた大豆ホエー蛋白加水分解物について、表 2の条件にてゲル濾 過（FPLC)による分画を行い、画分 I : Fr. 6-9、画分 II : Fr. 10-15、画分 III : Fr.16-20、 画分 IV: Fr.21-25の 4画分に分画した。各画分を回収し、 80— 100°Cで蒸発乾固し、 1.5mlの水で溶解した。この FPLCによる溶出パターンを図 1に示した。
[0039] (表 2)
ゲル濾過分析条件 分析システム フアルマシア FPLCシステム
カラム Sephadex-LH20 (サイズ： φ 2.2 X 80mm)
溶 媒 10mMリン酸バッファ一 (pH6.8) に EtOHを 50%v八で加えたもの 流 速 2mlZ分
検 出 吸光度 280nm、 感度レンジ 0.2
フラクション容量： 6ml
[0040] 得られた画分 I一 IVのローリー法による回収率を表 3に、また、各画分の ACE阻害率 を表 4に示した。その結果、多くの活性が画分 III:Fr.l6-20に認められ、この画分の分 子量は 1500以下であると推測された。
[0041] (表 3)画分 I一 IVの蛋白質濃度測定 蛋白質濃度 回収率 反応液上澄（チャージ量 5ml) 2.31% (総蛋白質量 116mg)
I ： Fr.6-9 (1.5ml) 1.32% 17%
II ： Fr.10-15 (1.5ml) 3.32% 43%
III： Fr.16-20 (1.5ml) 1.33% 17%
IV ： Fr.21-25 (1.5ml) 0.86% 11%
[0042] (表 4)画分 I一 IVの 20 μ g/mlの濃度における ACE阻害率（％) 画分 II III IV
Fr.6-9 Fr.10-15 Fr.16-20 Fr.21-25
ACE阻害率 （％) 0.4 16.0 55.7 39.2
[0043] ◎実施例 3 (画分 ΠΙのゲル濾過による再分画）
実施例 2で得られた画分 ΠΙについて実施例 2と同じ条件にて再度ゲル濾過（FPLC) を行い、画分 m_l:Fr.13-15、 III-2： Fr.16-18、 ΙΠ- 3:Fr.19-21、 III-4： Fr.22-24の 4 画分に分画した。各画分を収集し、 80 100°Cで蒸発乾固し、 1.0mlの水で溶解した。 実施例 1で得られた酵素分解物上澄みの FPLCによる溶出パターンを図 2に示した。
[0044] 得られた ΙΠ-1— III- 4画分のローリー法による回収率を表 5に、また、各画分の ACE 阻害活性を表 6に示した。その結果、多くの活性が画分 m_3:Fr.19-21に認められた
[0045] (表 5)画分 ΠΙ-1 III- 4の蛋白質濃度測定 蛋白質濃度 回収率
III： (チヤ一ジ量 1.5ml) 1.33¾ (総蛋白質量 20mg)
III-1： Fr. 13-15 (1.0ml) 0.35¾ 18%
II 1-2： Fr. 16-18 (1.0ml) 0.68% 34%
111-3： Fr. 19-21 (1.0ml) 0.90¾ 45%
111-4 : Fr. 22-24 (1.0ml) 0.26¾ 13%
[0046] (表 6)画分 ΠΙ-1— III-4の 20 μ g/mlの濃度における ACE阻害率％ 画分 III-1 III-2 III-3 II 1-4
阻害率 （％) 19.6 49.7 73.1 53.2
[0047] ◎実施例 4 (ΠΙ-3画分の逆相クロマトによる分画）
実施例 3にて得られた ACE阻害活性の強い ΙΠ-3画分から、逆相カラムを用いた HPLCにて ACE阻害関与ペプチドを精製した。
まず、 ΙΠ-3画分の 0.1%溶液を 50 /ilを表 7の条件にて HPLCに供し、図 3の溶出パ ターンに示す通り、 O.D.220nmで検出した。この中で 14.48分のピークに高い ACE阻 害活性を認めたので、このピークを分取した。
[0048] (表 7)
HPLC分析条件 カラム： ODS-80TM I TSKgel (φ4· 6X 250固) /40
溶 媒： A: TFAO.1%水、 Β：ァセトニトリル
グラジェント： 0分から 45分で B溶媒 5%から 90%、 その後 55分まで 90% 流 速： 0.8ml/分
検 出： O.D.220nm
[0049] ◎実施例 5 (14.48分ピーク物質の逆相クロマトによる精製）
次に、 14.48分のピークを採取後、表 8の条件にてさらに HPLCに供し、図 4の溶出パ ターンに示す通り、ピーク 1一 3が検出され、ピーク 1に ACE阻害活性が認められた。 このピークを分取し、表 9に示す条件にてゲルろ過に供したところ、図 5の溶出パター ンに示す通り、分子量 300の単一ピークが得られた。このピーク 1について、アミノ酸シ 一ケンサ一でアミノ酸配列を調べた結果、 Leu-Ala- Pro (以下、「LAP」と略する。）の 配列からなるトリペプチドであることが判明した。 [0050] (表 8)
HPLC分析条件 カラム： 0DS-80TM I TSKgel ( .6X250mm)/40cC
溶 媒： A: TFA0.1%水、 B:ァセトニトリル
グラジェント ： B溶媒 5%で一定
流 速： 0.8ml/分
検 出： O.D.220nm
[0051] (表 9)
HPLC分析条件 カラム： Superdex Peptide ΡΕ (φ7.5X300mm)/20°C 溶 媒： l%SDS'10mMリン酸バッファー pH6.8
流 速： 0.5ml/分
検 出： O.D.220nm
[0052] 精製された LAPの濃度を TNBS法で測定し、濃度当りの逆相 HPLCのピーク面積を 求めると ΙμΜの溶液を 50 μΐ注入した場合、ピーク面積は約 28000を示した。これをも とに各画分の回収率及びピーク面積から分解物中に含まれる Leu-Ala-Proトリべプチ ドの量を計算した。
[0053] III-3画分： 0.1%液 50 μ 1注入でピーク面積 116万であるので、 0.1%液の本トリペプチド の濃度は、 116万 Χ0.7(純度 )÷2·8万 = 29μΜ = 8·7/ι§/ιη1となり、蛋白質固形分当り の含有量は、 8.7mg/g(m-3画分)となる。 III- 3画分の分解物上澄中の含有量は、 7.7% なので、 ΠΙ-3画分由来の本トリペプチドの分解物上澄中の蛋白質固形分当りの含有 量は、 0.67mg/g (分解物上澄)となる。また、 IV画分も Leu-Ala- Proトリペプチドが認め られた。
[0054] IV画分： 0.1%液 50 μ 1注入でピーク面積 110万であるので、 0.1%液の本トリペプチドの 濃度は、 110万 Χ 0.3(純度 )÷2.8万 = 12 /ι Μ = 3.5 μ §/πι1となり、蛋白質固形分当りの 含有量は、 3.5mg/g(IV画分)となる。 IV画分の分解物上澄中の含有量は、 11%なので 、 IV画分由来の本トリペプチドの分解物上澄中の蛋白質固形分当りの含有量は、 0.39mg/g (分解物上澄)となる。この 2画分由来のものを合わせると少なくとも分解物上 澄中の蛋白質固形分 lg当りの本トリペプチドの含有量は、 1.06mgとなる。
図面の簡単な説明
[0055] [図 1]実施例 2の蛋白質加水分解物上澄のゲルろ過（FPLC)による溶出パターンであ る。
[図 2]実施例 3の画分 IIIのゲルろ過（FPLC)による溶出パターンである。
[図 3]実施例 4の画分 ΙΠ-3の逆相 HPLCによる溶出パターンである。
[図 4]実施例 5のピーク 14.48分の逆相 HPLCによる溶出パターンである。
[図 5]実施例 6のピーク 1のゲルろ過 HPLCによる溶出パターンである。

Claims

請求の範囲
[I] 大豆ホエーもしくは大豆ホエー蛋白にプロテアーゼを作用させた加水分解物又はそ の分画物からなるアンジォテンシン変換酵素阻害ペプチド含有組成物。
[2] アンジォテンシン変換酵素阻害ペプチドが Leu-Ala-Proのアミノ酸配列からなるトリぺ プチドである請求項 1に記載の組成物。
[3] 大豆ホエーもしくは大豆ホエー蛋白中の全固形分あたりの粗蛋白質含量が 40重量
%以上である請求項 1に記載の組成物。
[4] 大豆ホエーもしくは大豆ホエー蛋白中の全蛋白質あたりのレクチン含量が 10重量％ 以上である請求項 1に記載の組成物。
[5] 加水分解物又はその分画物中に含まれるペプチドの分子量が 100— 2000である請 求項 1に記載の組成物。
[6] 大豆ホエーもしくは大豆ホエー蛋白中の全蛋白質 lgあたりの Leu-Ala-Proのアミノ酸 配列からなるトリペプチドの含量が、 0. 2mg以上である請求項 2に記載の組成物。
[7] 請求項 1に記載の組成物を含有するアンジォテンシン変換酵素阻害作用を有する血 圧降下剤。
[8] 請求項 1に記載の組成物を含有するアンジォテンシン変換酵素阻害作用を有する血 圧降下用健康食品。
[9] 請求項 1に記載の組成物の、血圧降下剤又は血圧降下用健康食品製造における使 用。
[10] 高血圧の改善に有効量の請求項 1に記載の組成物を、高血圧の改善が必要な哺乳 動物に与えることを特徴とする高血圧の改善方法。
[II] 大豆ホエーを加熱して生ずる加熱凝集物、又は該加熱凝集物を pH4以下にさらして 可溶物を除去したものにプロテアーゼを作用させ、不溶物を除去して大豆ホエー蛋 白加水分解物を得ることを特徴とするアンジォテンシン変換酵素阻害ペプチド含有 組成物の製造法。
[12] 大豆ホエー蛋白加水分解物からさらに分子量 200— 1000のペプチドを分画する請 求項 11に記載の組成物の製造法。
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Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007302655A (ja) * 2006-04-13 2007-11-22 Rohto Pharmaceut Co Ltd 育毛剤
JP2008208096A (ja) * 2007-02-28 2008-09-11 Kanetoku:Kk クラゲタンパク質由来の新規ペプチドとその用途
JP2010248096A (ja) * 2009-04-13 2010-11-04 Rheology Kino Shokuhin Kenkyusho:Kk Ｔｒｐ含有ペプチド
WO2011007612A1 (ja) * 2009-07-13 2011-01-20 不二製油株式会社 経口性抗炎症剤及び経口性抗炎症ペプチド
JP2016521976A (ja) * 2013-05-17 2016-07-28 アール・ジエイ・レイノルズ・タバコ・カンパニー タバコ由来のタンパク質組成物
CN108178785A (zh) * 2017-12-28 2018-06-19 澳优乳业（中国）有限公司 一种具有ace抑制功能的羊乳清蛋白肽及其应用
CN119684403A (zh) * 2024-12-04 2025-03-25 华东师范大学 一种血管紧张素转化酶抑制肽及其筛选方法和应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH07188282A (ja) * 1991-04-19 1995-07-25 Suetsuna Yoko 新規なトリペプチド、その製法およびそれを有効成分と する血圧降下剤
JP2002053595A (ja) * 2000-08-14 2002-02-19 Abo Kenji アンジオテンシン変換酵素阻害物質とその製造法
JP2002179647A (ja) * 2000-12-11 2002-06-26 Kikkoman Corp ニコチアナミン又はニコチアナミン含有物の製造法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS60192599A (ja) * 1983-11-30 1985-10-01 Fuji Oil Co Ltd オリゴペプチド混合物の製造法
JPS61254153A (ja) * 1985-05-02 1986-11-11 Fuji Oil Co Ltd 大豆ホエ−ペプチド混合物の製造法
JPH05246865A (ja) * 1992-03-04 1993-09-24 Kikkoman Corp ニコチアナミンの製造法及びそれを含有する健康食品

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH07188282A (ja) * 1991-04-19 1995-07-25 Suetsuna Yoko 新規なトリペプチド、その製法およびそれを有効成分と する血圧降下剤
JP2002053595A (ja) * 2000-08-14 2002-02-19 Abo Kenji アンジオテンシン変換酵素阻害物質とその製造法
JP2002179647A (ja) * 2000-12-11 2002-06-26 Kikkoman Corp ニコチアナミン又はニコチアナミン含有物の製造法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FUJITA H. ET AL: "Classification and antihypertensive activity of Angiotensin I-Converting enzyme inhibitory peptides derived from food proteins", JOURNAL OF FOOD SCIENCE, vol. 65, 2000, pages 564 - 569, XP002980476 *
YONEKURA M. AND TANAKA A.: "Isolation and Application of Physiologically Active Peptides from Soybean Whey and Okara Proteins", SOY PROTEIN RESEARCH, vol. 6, 2003, pages 88 - 93, XP002980477 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007302655A (ja) * 2006-04-13 2007-11-22 Rohto Pharmaceut Co Ltd 育毛剤
JP2008208096A (ja) * 2007-02-28 2008-09-11 Kanetoku:Kk クラゲタンパク質由来の新規ペプチドとその用途
JP2010248096A (ja) * 2009-04-13 2010-11-04 Rheology Kino Shokuhin Kenkyusho:Kk Ｔｒｐ含有ペプチド
WO2011007612A1 (ja) * 2009-07-13 2011-01-20 不二製油株式会社 経口性抗炎症剤及び経口性抗炎症ペプチド
JP2016521976A (ja) * 2013-05-17 2016-07-28 アール・ジエイ・レイノルズ・タバコ・カンパニー タバコ由来のタンパク質組成物
US11896030B2 (en) 2013-05-17 2024-02-13 R.J. Reynolds Tobacco Company Tobacco-derived protein compositions
CN108178785A (zh) * 2017-12-28 2018-06-19 澳优乳业（中国）有限公司 一种具有ace抑制功能的羊乳清蛋白肽及其应用
CN119684403A (zh) * 2024-12-04 2025-03-25 华东师范大学 一种血管紧张素转化酶抑制肽及其筛选方法和应用

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