WO2004037236A1

WO2004037236A1 - β−クリプトキサンチンを有効成分とする骨形成促進剤

Info

Publication number: WO2004037236A1
Application number: PCT/JP2003/013561
Authority: WO
Inventors: Masayoshi Yamaguchi
Original assignee: KEMIN FOODS, L. C. d/b/a KEMIN HEALTH, L. C.; Ehime Beverage Inc.
Priority date: 2002-10-25
Filing date: 2003-10-23
Publication date: 2004-05-06
Also published as: JPWO2004037236A1; US20060106115A1; EP1568364A1; JP3892014B2; CA2503557C; CA2503557A1; EP1568364A4; US8148431B2; EP1568364B1

Abstract

　積極的に骨形成を促進して骨疾患を予防・治療することができる顕著な効果を有する骨形成促進剤や、骨形成促進作用と骨吸収抑制作用の両作用を有する骨粗鬆症等の骨疾患の予防・治療薬や、骨形成促進作用と骨吸収抑制作用の両作用を有する化合物をリード化合物とする骨疾患に対する予防・治療のための有効成分のスクリーニング方法を提供するものである。温州みかんの表皮と果肉に多く存在するβ−クリプトキサンチンに骨形成促進作用及び骨疾患治療作用があることを確認し、β−クリプトキサンチンやその組成物を、骨形成促進剤、骨疾患の予防・治療薬、骨疾患の予防・治療用機能性食品又は食品素材、飼料用組成物とする。

Description

^一クリプトキサンチンを有効成分とする骨形成促進剤技術分野

本発明は、 ^—クリプトキサンチンを有効成分とする骨形成促進剤や骨粗鬆症等の骨疾患の予防 · 治療薬、 —クリプ卜キサンチンを添加した骨粗鬆症等の骨疾患の予防 ·明治療用機能性食品又は食品素材や飼料用組成物、 ]3—クリプトキサンチンを細リード化合物とする骨形成促進又は骨疾患に対する予防 ·治療のための有効成分をスクリーニングする方法等に関する。背景技術

骨代謝、骨形成不全により、骨中のカルシウム量の減少などが生じて、種々の骨疾患が起こると考えられている。骨疾患の代表として骨折、骨軟化症、骨減少症、骨粗鬆症、腰背痛等がある。特にこれら骨疾患の中でも骨粗鬆症は、加齢による骨吸収と骨形成のバランスが崩れることで、相対的に骨吸収が優位となるために骨量の減少が起こり、骨の微細構造の変化により骨の強度が低下し、骨折が起こりやすくなる病態を示す。特に女性の場合には、閉経や卵巣摘除などにより骨量の減少は急速に起こる。骨粗鬆症になると、骨折したり、激しい痛みなどを伴うだけでなく、特に老人の寝たきりの原因ともなるため、高齢化社会における生活の質の向上という観点からも、有効な治療法が求められている。骨粗鬆症は発症してから治療するのは困難であることから、予防に努めることが重要であり、若年期から骨量を増やすことが不可欠で、日常的に骨形成に必要な栄養成分や、骨形成を促進する食品を積極的に摂取するようにしなければならないことが深く認識されるようになった。骨を強化する食品としては、現在、主にカルシウムやマグネシウム、ビタミン Dが利用されている。また、カルシウムの腸管からの吸収を促進するカゼィンホスホペプチドなども利用されている。

骨粗鬆症等の骨疾患の治療薬としては、活性型ビタミン D 3や女性ホルモン（エストロゲン）、カルシトニン、ィプリフラボン類が臨床に用いられ、最近になって、ビタミン K 2に代表されるポリイソプレノイド誘導体の破骨細胞形成抑制作用に基づく抗骨粗鬆症剤（特開平 7 - 2 1 5 8 4 9号公報）も開発されている。また、カゼインホスホペプチド及びゲニスティンを有効成分として含有する骨強化剤（特開 2 0 0 1 — 3 0 2 5 3 9号公報）、サポニン、ダイジン、ダイゼィン、ゲニスチン及びゲニスティンを主たる有効成分とする骨形成促進及び抗骨粗鬆症組成物 (特開 2 0 0 0 - 1 9 1 5 2 6号公報）、ヮサビ抽出物を有効成分とし、抗骨粗鬆症作用を発揮する骨量増進組成物（特開平 1 0— 2 7 9 4 9 2 号公報）、ァセキサム酸亜鉛を有効成分とする骨疾患治療剤（特開平 1 0 - 2 1 8 7 6 7号公報）、イソフラボンを主たる有効成分とする骨形成促進及び骨塩量減少防止用組成物（特開平 1 0— 1 1 4 6 5 3号公報）、ビ夕ミン K 2と亜鉛を共に強化した抗骨粗鬆症組成物（特開平 1 0— 3 6 2 5 6号公報）なども知られている。

他方、 i3—クリプトキサンチン（ β -cryptoxanthine；分子量 5 5 2 ) はエタノール溶解性のカロテノィドとして知られ、カンキッ類の中では温州みかんに圧倒的に多く含まれ、果実 1個に l〜 2 mg含まれている。この^ークリプトキサンチンは、栄養成分としてプロビタミン Aの特性を備えているだけでなく、最近の抗癌性物質の研究においては、人参等の緑黄色野菜に含有されているカロチノィドである ]3—力ロチンよりも高い抗癌作用を有することが明らかになり関心を集めている（Biol. Pharm. Bull. 18, 2, 227, 1995) ₀ このように jS—クリブトキサンチンは発癌抑制成分として重要であることから、 ]3—クリプトキサンチンを強化した柑橘系統ゃ柑橘加工食品の開発に役立てるため、温州みかんに匹敵する i3—クリプトキサンチン含量の高品質柑橘類作出や、 j3—クリブトキサンチンを合成する遺伝子の単離（特開平 1 1 一 1 5 5 5 7 7号公報、特開平 1 1一 4 6 7 7 0号公報）や、 β —クリプトキサンチンを柑橘類から大量に分離する技術の開発などが行われている。

また、 /3—クリプトキサンチンの温州みかん等の柑橘類からの分離法はよく知られており（岡山大農学報 69， 17-25 , 1987、東京医科大学紀要 18，卜 7， 1992、 Journal of Food Biochemistry. , 18, 273-283, 1995)、最近、みかん果汁を圧搾して得られた原料沈澱物等から —クリプトキサンチンを含有する溶剤抽出分を得、これを加水分解した後、この加水分解物を一次展開溶媒と共に平均粒子径 1 0〜 8 0 mのシリカ粉末が充填された第 1カラムに線速度 2 c m/分以上の流速で導入して ]3 -クリブトキサンチンを含むフラクションを分離し、脱溶媒した後に、この分離物を二次展開溶媒と共に平均粒子径 1 0〜 8 0 のォクタデシルシランシリカが充填された第二カラムに線速度 2 c mZ分以上の流速で導入して、 β -クリプトキサンチンを 9 5重量％以上の量で含有するフラクションを分離する高純度 /3—クリプトキサンチンの製造方法（特開 2 0 0 0 - 1 3 6 1 8 1号公報）や、柑橘類の果実を搾汁、ろ過又は篩別後、遠心分離して得られる沈殿物に酵素剤を添加して凍結し、解凍した後、脱水することを特徴とするカロチノィド高含有パルプの製造方法、上記カロチノィド高含有パルプを加水して脱水する操作を繰り返した後乾燥、粉砕するカロチノイド、 i3—クリプトキサンチン等の含有率が増強されたカロチノイド高含有パルプ及びその粉末の製造方法（特開 2 0 0 0 - 2 3 6 3 7号公報）が提案されている。さらに、リード化合物の活性の可能性のある類似体を迅速に検索するための方法として、ラジカルを一時的にかさ高い空間保持基に結合し、ラジカルの 3 Dモデルをコンビナトリアルゴーストデ一夕べ一スに登録し、ゴーストデータベース内のアクセス可能な任意の分子構造について、ファーマコホア型の物理的性質の特色を示す任意の原子を検出し；各分子構造中に検出されたファ一マコホアの対について、この分子の全立体構造に関係する原子の間のすべての距離を計算して、距離分布密度を作成し；ファーマコホアの対のすべての距離分布密度を含む立体構造フィンガ一プリントベクターを作成し；ファーマコホア特色の相対的重要性を説明する、各分子フィンガープリントのための評点機能を定義し；リ一ド化合物のフィンガープリントを作成し、リ一ド化合物が最大になる上記評点機能により、これらのフィンガ一プリントを可能性あるライブラリーの各フィンガープリントと比較し、そして評点機能により特定の閾値未満の評点値が得られる、可能性あるライブラリーの分子を検索することにより、 3 D多重立体構造フィンガープリントの大きなデータべ —スから、化学的に可能なコンビナ卜リアル生成物を作成及びスクリ一ニングする方法が知られている（特表 2 0 0 1— 5 2 1 9 4 3号公報）。骨粗鬆症に代表される骨疾患において我が国で現在認可されている 8 種の治療剤は総て骨吸収抑制剤（骨が溶けるのを抑制する）であり、唯ーメバロン酸合成阻害剤であるスタチンに骨形成促進作用があると報じられたが、遺伝子レベルの知見であり、実際には、骨形成促進効果は弱いものであった。本発明の課題は、積極的に骨形成を促進して骨疾患を予防 ·治療することができる顕著な効果を有する骨形成促進剤や、骨形成促進作用と骨吸収抑制作用の両作用を有する骨粗鬆症等の骨疾患の予防 ·治療薬や、骨形成促進作用と骨吸収抑制作用の両作用を有する化合物をリード化合物とする骨疾患に対する予防 · 治療のための有効成分のスクリ一ニング方法等を提供することにある。

本発明者らは、温州みかんの表皮と果肉に多く存在する )3—クリブトキサンチンに骨形成促進作用及び骨疾患の予防 ·治療作用があることを見い出した。すなわち、 ]3—クリプトキサンチンを含む培養液中で大腿骨の骨幹部と骨幹端部組織を培養し、その骨組織中のカルシウム量、骨石灰化促進酵素の発現量、骨組織中の細胞数指標となる D N A量を測定し、いずれにおいても有意な上昇を確認し、 i3—クリプトキサンチンが、大腿骨組織の海綿骨（骨幹端部組織）及び皮質骨（骨幹部組織）におけるタンパク質合成を増進し、骨形成を増大することを見い出した。また、骨塩溶解（骨吸収）作用を有し、老化による骨粗鬆症病態発症の生理的役割を果たしている副甲状腺ホルモン（P T H ) と i6—クリプトキサンチンの共存下で骨組織を培養し、骨幹部組織及び骨幹端部組織のカルシゥム量の減少を有意に抑制しうることを確認した。さらに、 0—クリプトキサンチンをラットに経口投与したところ、骨幹部と骨幹端部組織中のカルシウム量、骨石灰化促進酵素の発現量、骨組織中の細胞数指標となる D N A量のいずれにおいても有意な上昇を示し、；3—クリプトキサンチンを経口投与することにより、骨量増進効果がもたらされることを確認した。これらのことから、 |3 _クリプトキサンチンが、骨形成を増進すると共に、骨吸収を抑制することにより、骨塩量を保持 ·増進する効果を発揮し、抗骨粗鬆症因子として機能することを明らかにした。そして、このような組織培養系で確認された効果は、経験的に経口実験でもほぼ 1 0 0 %有効性が確認されている。本発明はこれら知見に基づいて完成するに至ったものである。発明の開示

すなわち本発明は、 /3—クリプトキサンチンを有効成分とすることを特徴とする骨形成促進剤（請求項 1 ) や、 /3—クリプトキサンチン含有組成物を有効成分とすることを特徴とする骨形成促進剤（請求項 2 )や、 /3—クリプトキサンチン含有組成物が、温州みかんの処理物であることを特徴とする請求項 2記載の骨形成促進剤（請求項 3 ) や、 ]3—クリプトキサンチンを有効成分とすることを特徴とする骨疾患の予防 ·治療薬 (請求項 4 ) や、 0 —クリプトキサンチン含有組成物を有効成分とすることを特徴とする骨疾患の予防，治療薬（請求項 5 ) や、 /3—クリブトキサンチン含有組成物が、温州みかんの処理物であることを特徴とする請求項 5記載の骨疾患の予防 ·治療薬（請求項 6 ) や、骨疾患が骨粗鬆症であることを特徴とする請求項 4〜 6のいずれか記載の骨疾患の予防 ·治療薬（請求項 7 ) や、 β -クリブトキサンチンを添加したことを特徴とする骨疾患の予防 ·治療用機能性食品又は食品素材（請求項 8 ) や、 —クリプトキサンチン含有組成物を添加したことを特徴とする骨疾患の予防 ·治療用機能性食品又は食品素材（請求項 9 ) や、 /3—クリプトキサンチン含有組成物が、温州みかんの処理物であることを特徴とする請求項 9記載の骨疾患の予防 ·治療用機能性食品又は食品素材（請求項 1 0 ) や、骨疾患が骨粗鬆症であることを特徴とする請求項 8〜 1 0のいずれか記載の骨疾患の予防 ·治療用機能性食品又は食品素材（請求項 1 1 ) に関する。

また本発明は、 /3—クリプトキサンチンを配合したことを特徴とする飼料用組成物（請求項 1 2 ) や、 /3—クリプトキサンチン含有組成物を配合したことを特徴とする飼料用組成物（請求項 1 3 ) や、 /3—クリプトキサンチン含有組成物が、温州みかんの処理物であることを特徴とする請求項 1 3記載の飼料用組成物（請求項 1 4 ) や、 /3—クリプトキサンチンをリード化合物とすることを特徴とする骨形成促進又は骨疾患に対する予防 ·治療のための有効成分をスクリーニングする方法（請求項

1 5 ) や、骨疾患が骨粗鬆症であることを特徴とする請求項 1 5記載の骨形成促進又は骨疾患に対する予防 ·治療のための有効成分をスクリ一ニングする方法（請求項 1 6 ) や、請求項 1 5又は 1 6記載のスクリ一ニングする方法により得られることを特徴とする /3—クリプトキサンチンをリード化合物とした骨形成促進剤又は骨疾患の予防 ·治療剤（請求項 1 7 ) や、骨疾患が骨粗鬆症であることを特徴とする請求項 1 7記載の ]3—クリプトキサンチンをリード化合物とした骨形成促進剤又は骨疾患の予防 ·治療剤（請求項 1 8 ) に関する。図面の簡単な説明

第 1図は、本発明の /3—クリプトキサンチンの骨幹部組織における骨カルシウム量の測定結果を示す図である。

第 2図は、本発明の ]3—クリプトキサンチンの骨幹部組織における骨アル力リ性ホスファターゼ活性の測定結果を示す図である。

第 3図は、本発明の —クリプトキサンチンの骨幹部組織における骨 D N A量の測定結果を示す図である。

第 4図は、本発明の ) 3—クリプトキサンチンの骨幹端部組織における骨カルシウム量の測定結果を示す図である。

第 5図は、本発明の —クリブトキサンチンの骨幹端部組織における骨アルカリ性ホスファターゼ活性の測定結果を示す図である。

第 6図は、本発明の β—クリプトキサンチンの骨幹端部組織における骨 D N Α量の測定結果を示す図である。

第 7図は、本発明の i3—クリプトキサンチンとタンパク合成阻害剤との共存下における骨幹部組織での骨カルシウム量の測定結果を示す図である。

第 8図は、本発明の jS —クリプトキサンチンとタンパク合成阻害剤との共存下における骨幹部組織での骨アル力リ性ホスファタ一ゼ活性の測定結果を示す図である。

第 9図は、本発明の 0 _クリプトキサンチンとタンパク合成阻害剤との共存下における骨幹部組織での骨 D N A量の測定結果を示す図である第 1 0図は、本発明の ) 3—クリプトキサンチンとタンパク合成阻害剤との共存下における骨幹端部組織での骨カルシウム量の測定結果を示す図である。

第 1 1図は、本発明の jS —クリプトキサンチンとタンパク合成阻害剤との共存下における骨幹端部組織での骨アル力リ性ホスファタ一ゼ活性の測定結果を示す図である。

第 1 2図は、本発明の一クリプトキサンチンとタンパク合成阻害剤との共存下における骨幹端部組織での骨 D N A量の測定結果を示す図である。

第 1 3図は、本発明の i3—クリプトキサンチンと j8—カロテンとの共存下、及び) 3—クリプトキサンチンとキサンチンの共存下における骨幹部組織での骨カルシウム量の測定結果を示す図である。

第 1 4図は、本発明の；3—クリブトキサンチンと /3—カロテンとの共存下、及び i3—クリプトキサンチンとキサンチンとの共存下における骨幹端部組織での骨カルシウム量の測定結果を示す図である。

第 1 5図は、本発明の 3 —クリプトキサンチンと副甲状腺ホルモンとの共存下における骨幹部組織での骨カルシウム量の測定結果を示す図である。

第 1 6図は、本発明の i3—クリプトキサンチンと副甲状腺ホルモンとの共存下における骨幹端部組織での骨カルシウム量の測定結果を示す図である。

第 1 7図は、本発明の j3—クリプトキサンチンとプロスタグランジン E ₂との共存下における骨幹部組織での骨カルシウム量の測定結果を示す図である。

第 1 8図は、本発明の i3—クリプトキサンチンとプロスタグランジン E ₂との共存下における骨幹端部組織での骨カルシウム量の測定結果を示す図である。

第 1 9図は、本発明の /3—クリプトキサンチンをラットに経口投与したときの骨幹部組織における骨カルシウム量の測定結果を示す図である第 2 0図は、本発明の /3 —クリプトキサンチンをラットに経口投与したときの骨幹部組織における骨アルカリ性ホスファターゼ活性の測定結果を示す図である。

第 2 1図は、本発明の /3 —クリプトキサンチンをラットに経口投与したときの骨幹部組織における骨 D N A量の測定結果を示す図である。第 2 2図は、本発明の /3—クリプトキサンチンをラットに経口投与したときの骨幹端部組織における骨カルシウム量の測定結果を示す図である。

第 2 3図は、本発明の i3 —クリプトキサンチンをラットに経口投与したときの骨幹端部組織における骨アルカリ性ホスファターゼ活性の測定結果を示す図である。

第 2 4図は、本発明の |3 —クリプトキサンチンをラットに経口投与したときの骨幹端部組織における骨 D N A量の測定結果を示す図である。発明を実施するための最良の形態

本発明の骨形成促進剤としては、）3—クリプトキサンチンや j3—クリプトキサンチン含有組成物を有効成分とするものであれば特に制限されるものではなく、また、本発明の骨疾患の予防 ·治療薬としては、 ]3— クリプトキサンチンや 3—クリプトキサンチン含有組成物を有効成分とするものであれば特に制限されるものではなく、また、本発明の骨疾患の予防 ·治療用機能性食品又は食品素材としては、 /3—クリプトキサンチンや j3—クリプトキサンチン含有組成物を添加した、骨疾患の予防 - 治療に用いられる、骨疾患の予防 · 治療機能を有する食品や食品素材であれば特に制限されるものではなく、さらに、本発明の飼料用組成物としては、 /3—クリプトキサンチンや /3—クリプトキサンチン含有組成物を配合したものであればどのようなものでもよく、上記骨疾患としては、骨折、骨軟化症、骨減少症、骨粗鬆症、腰背痛等を挙げることができ、中でも、閉経後骨粗鬆症、エストロゲン欠乏性骨粗鬆症、老人性骨粗鬆症、ステロイド誘発骨粗鬆症等の骨粗鬆症や骨軟化症などの代謝性骨疾患を好適に例示することができる。

3—クリプトキサンチンや )3—クリプトキサンチン含有組成物の製法としては、柑橘類から抽出 · 生成する方法や、 0—クリプトキサンチン産生酵素をコードする遺伝子を利用する方法など公知の方法を含め特に制限されないが、その給源として、 1個当たり l〜 2 m g含まれ、ォレンジ類、グレープフルーツ、レモンなど他の柑橘類の 6 0倍以上の ]3— クリプトキサンチンを含有する温州みかんを用いることが好ましく、温州みかんの中でも、果皮（フラベド） 1 0 0 g当たり約 8 m g、果汁 1 0 0 g当たり約 1 m gの 3—クリプトキサンチンを含有する杉山温州等の高 /3—クリプトキサンチン含有品種の温州みかんや、温州みかんとの交配により作出された高 /3—クリプトキサンチン含有品種を用いることが好ましい。ここで、）3—クリプトキサンチン含有組成物とは、人為的に β —ク、 Jプトキサンチン含量が高められた β —クリプトキサンチンの混在物をいう。また、温州みかんを処理して ]3—クリプトキサンチン含有組成物を得る方法としては特に制限されず、例えば、前述の特許文献

1 0や特許文献 1 1の他、非特許文献 2〜 4記載の処理方法を挙げることができる。

]3—クリプトキサンチンや /3—クリプトキサンチン含有組成物を、骨疾患の予防 ·治療薬等の医薬品として用いる場合は、薬学的に許容される通常の担体、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、 p H緩衝剤、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張剤などの各種調剤用配合成分を添加することができる。また、これらに加えて、上述した公知の骨形成促進作用及び Z又は骨吸収抑制作用を有する物質や、カルシウム、マグネシゥム、リン等のミネラルを併用することができる。これら予防若しくは治療剤は、経口的又は非経口的に投与することができる。すなわち通常用いられる投与形態、例えば粉末、顆粒、カプセル剤、シロップ剤、懸濁液等の剤型で経口的に投与することができ、あるいは、例えば溶液、乳剤、懸濁液等の剤型にしたものを注射の型で非経口投与することができる他、スプレー剤の型で鼻孔内投与することもできるが、経口的に投与することが好ましい。投与量は、予防か治療かの投与目的、骨疾患の種類や重篤度、患者の年齢等に応じて適宜選定することができる。

β —クリプトキサンチンや β —クリプトキサンチン含有組成物を添加した、骨疾患の予防 '治療に用いられる、骨疾患の予防 ·治療機能を有する食品や食品素材の種類としては特に制限されず、例えば、ョーダルト、ドリンクヨーグルト、ジュース、牛乳、豆乳、酒類、コ一ヒー、紅茶、煎茶、ウーロン茶、スポーツ飲料等の各種飲料や、プリン、クッキ ―、パン、ケーキ、ゼリー、煎餅などの焼き菓子、羊羹などの和菓子、冷菓、チューインガム等のパン ·菓子類や、うどん、そば等の麵類や、かまぼこ、ハム、魚肉ソ一セージ等の魚肉練り製品や、みそ、しょう油、ドレッシング、マヨネーズ、甘味料等の調味類や、チーズ、バタ一等の乳製品や、豆腐、こんにゃく、その他佃煮、餃子、コロッケ、サラダ等の各種総菜を挙げることができる。これら食品や食品素材には、上述した公知の骨形成促進作用及び/又は骨吸収抑制作用を有する物質や、力ルシゥム、マグネシウム、リン等のミネラルを併用してもよい。

_クリプトキサンチンや ]3—クリプトキサンチン含有組成物を配合した飼料用組成物は、ブ夕、ゥシ、ニヮトリ等の家畜 ·家禽や、ィヌ、ネコ等のペット、養殖魚介類の飼育等に有利に用いることができ、かかる飼料用組成物には、上述したィプリフラボン類等の公知の骨形成促進作用及び/又は骨吸収抑制作用を有する物質や、カルシウム、マグネシゥム、リン、鉄、亜鉛、マンガン、銅等のミネラルを併用することがでさる。

本発明の骨粗鬆症等の骨疾患に対する予防 ·治療のための有効成分をスクリ一ニングする方法としては、；3—クリプトキサンチンをリ一ド化合物とするスクリ一ニング方法であれば特に制限されるものではなく、かかる i3—クリプトキサンチンをリ一ド化合物とするスクリ一ニング方法により、さらに効力の高い骨形成促進剤や骨疾患の予防 ·治療剤の開発が可能になる。 i3—クリプトキサンチンをリード化合物とした骨形成促進剤や骨疾患の予防 ·治療剤のスクリーニングを行うには、例えば上述の特許文献 1 2に記載された方法等のコンビナトリアルケミストリーの手法を用いれば効率よく行うことができる。また、コンビナトリアルケミストリーの手法を用いなくとも、古典的な構造活性相関の手法を用いて /3—クリプトキサンチンをリード化合物とする骨形成促進剤ゃ骨疾患の予防 ·治療剤のスクリーニングを行うこともできる。そして、 /3— クリプトキサンチンをリード化合物とするスクリーニング方法により得られる骨形成促進剤や骨疾患の予防 ·治療剤も本発明に含まれる。以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。

実施例 1 [方法]

(ラット骨組織片の培養）

ラット（ウィスター系雄性； 4〜 5週齢）（日本 S L C (株）から購入、固形飼料オリエンタル酵母（M F ) ) をエーテル麻酔下に大腿骨を無菌的に摘出し、大腿骨は 0 . 2 5 Mの蔗糖液で洗浄後、骨幹部（皮質骨）と骨幹端部（海綿骨）に分け、 —クリプトキサンチン等を含有する培養液（ダルベッコ変法 5 %グルコース含有培養液、無血清培養液）中で、上記骨組織片を 3 7 °Cの条件下で 4 8時間、 5 % C 0 ₂— 9 5 % a i r のインキュベータ一中で培養した。また、 j3—クリプトキサンチンはェクストラシンテース社製「/3—クリプトキサンチン」を、シクロへキシイミドはシグマ社製「シクロへキシイミド」を、 _カロテンはシグマ社製「/9一力口テン」を、キサンチンはシグマ社製「キサンチン」を、副甲状腺ホルモンはシグマ社製「副甲状腺ホルモン」を、プロス夕ダランジン E ₂はシグマ社製「プロスタグランジン E ₂」を用いた。なお、 β ークリプトキサンチン等を添加することなく、培養液のみで培養した場合を対照とした。

(骨カルシウムの測定）

骨組織中のカルシウム量を測定した。インキュベータ一中で培養した後、組織片を 0 . 2 5 Μ蔗糖溶液で洗浄、乾燥後、骨重量を測定した。その後、組織片に濃硝酸を加えて 1 2 0 °Cで 1 2時間灰化し、原子吸光分光光度計（パ一キンエルマ一社製「パーキンエルマ一 3 0 3」）を用いて骨カルシウム量を定量した。

(アル力リ性ホスファターゼ活性の測定）

骨の石灰化の促進に関する最も重要な酵素であるアル力リ性ホスファ

3 夕一ゼの発現量を調べた。インキュべ一ター中で培養した後、組織片を

0. 2 5Mの蔗糖液で洗浄し、 6. 5mMのパルピタール緩衝液（pH 7. 4) 3m l中で破碎し、超音波処理した。この液を遠心分離して上清を酵素液として Walter及び Schuttの方法（in Method of Enzymatic Analysis, Voll-2, p856, Academic Press, New York, 1965) に従って測定した。すなわち、 p—ニトロフエニール燐酸を基質として、ジェタノールアミン緩衝液（ p H 9. 8 ) 2m l に酵素液 0. 0 5m l を添加し、 3 7 °Cで 3 0分間インキュベーションし、 0. 0 5 の &〇1^を 1 0 m l添加した後、分光光度計を用いて吸光度（40 5 nm) を測定し、骨に対する治療剤及び骨に対する作用の知られている化合物の骨アル力リ性ホスファタ一ゼ活性を調べた。

(DNA量の定量）

骨組織中の細胞数の指標として、 DNA量を定量した。インキュべ一タ一中で培養した後、組織片を 0. 2 5 Mの蔗糖溶液で洗浄し、湿重量を測定した。その後、 0. 1 Nの N a OH 4 m 1 中で粉砕して、 4°Cで 24時間浸透させた。この液を遠心分離し、上清を試料として Ceriotti らの方法（J.Biol. Chem.， 241： 34-77, 1951) に従って定量した。即ち、試料 2 m 1 に濃塩酸 1 m 1及び 0. 04 %のインドール溶液 1 m 1 を添加し沸騰水中で 1 0 0 °Cに加熱後、急冷して、クロ口ホルム 4m lで抽出し、クロ口ホルム層を採取して、分光光度計（4 9 0 nm) を用いて骨中の D N A量を測定した。

(ラットへの j6—クリプトキサンチンの経口投与）

ラット（ウィスター系雄性； 4〜 5週齢）に、）3—クリプトキサンチンをコーン油に溶解した 3種類の濃度の 3—クリプトキサンチン溶解液 ( 1 0， 2 5及び 5 0 gZm 1 コーン油）を、骨ゾンデを用いてラット体重 1 0 0 g当たり 1 日 1回、 7日間経口投与した。最終投与の 24

4 時間目に屠殺し、大腿骨を摘出し、筋肉等を取り除き、骨幹部（diaphysis) と骨幹端部（metaphysis) に分けて、骨成分を測定した。

実施例 2 [結果]

(]3—クリプトキサンチンの骨形成増進作用の発現）

；6—クリプトキサンチンの骨成分増加効果について調べた。 /3—クリプトキサンチン（ 1 0 _⁸〜 1 0 -⁵M) を含有する上記培養液中で、大腿骨の骨幹部と骨幹端組織を 4 8時間培養した。骨組織中のカルシウム量、アル力リ性ホスファタ一ゼ治性 (骨石灰化促進酵素）及びデォキシリポ核酸（DNA ；骨組織中細胞数の指標）量を実施例 1記載の方法で測定した。結果を表 1及び第 1図〜第 6図に示す。なお、それぞれの試験群は 6〜 8回ずつ測定し、平均値及び標準誤差で示した。また、有意差検定には Student' s t-tes tを用いて求め、対照と比較して P値が 0 · 0 1以下（* *) 又は 0. 0 5以下（*) であれば統計学的に有意差ありとした。その結果、クリプトキサンチン（ 1 0 -⁸〜 1 0— ⁵M) は、骨幹部及び骨幹端部組織のカルシウム量の有意な増加をひき起こした。また、クリプトキサンチン（ 1 0— ⁸〜； L 0— ⁵M) は、骨幹部アルカリ性ホスファタ一ゼ活性を有意に増加させ、クリプトキサンチン（ 1 0一 ⁷ 〜 1 0— ⁵M)は、骨幹端部の本酵素活性の上昇をひき起こした。さらに、骨幹部組織及び骨幹端部組織 DN A量は、クリプトキサンチン（ 1 0 - 7 〜 1 0— ⁵M) の存在下で有意に増加した。

5 (表 1 )

(夕ンパク質合成阻害剤の影響）

jS—クリプトキサンチンの骨成分増加効果の発現に及ぼすタンパク質合成阻害剤の影響について調べた。タンパク質合成阻害剤としては、真核細胞の 6 0 Sリボゾームに作用し、ぺプチド鎖延長における転移反応を阻害するシクロへキシイミドを用いた。 3—クリプトキサンチン（ 1 0 — ⁶ M) の存在下、シクロへキシイミド（ 1 0 — ⁶ M) の存在下、 β — クリプトキサンチン（ 1 0 — ⁶ Μ) とシクロへキシイミド（ 1 0 — ⁶ Μ) の共存下における、骨組織中のカルシウム量、アル力リ性ホスファタ一ゼ活性及び D N Α量を測定した。結果を表 2及び第 7図〜第 1 2図に示

6 3561 す。それぞれの試験群は 6回ずつ測定し、平均値及び標準誤差で示した。また、有意差検定には Student' s t- tes t を用いて求め、対照と比較して P値が 0. 0 1以下（*) であれば統計学的に有意差ありとした。 β 一クリプトキサンチン（ 1 0 _⁶Μ) の存在下で増加した骨幹部及び骨幹端部組織におけるカルシウム量、骨アル力リ性ホスファターゼ活性及び骨 D Ν Α量はシクロへキシイミド（ 1 0— ⁶M) の存在下で有意に低下した。これらの結果は、 i3—クリプトキサンチンが、大腿骨組織の海綿骨 (骨幹端部組織）及び皮質骨（骨幹部組織）において、そのタンパク質合成を増進することにより、骨形成を増大していることを明らかにしている。

(表 2) 骨幹部組織

対照ークリブ卜キサンチンシクロへキシイミドシクロへキシイミド +クリプ卜キサンチン

ΊΟ一⁶ M 10"⁶Μ 10— ⁶Μ

骨カルシウム蠆

225.0±5.01

(mg/g 275.1±4.50* 204.0± 15.59 192.6±9.00

乾燥重置）

骨アルカリ性ホスファターゼ活性 560.は 8.9

^nmol/minZmg 691, 5± 11.2* 534.5±64.2 530.0±10.0

蛋白質)

骨 DNA量

1,403± 0.065

(mgZg 1.800± 0.025* 1.299±0.127 1.402± 0.133

骨湿重量）骨幹端部組織

対照 β—クリブ卜キサンチンシクロへキシイミドシクロへキシイミド +クリプ卜キサンチン

10"⁶Μ 10一⁶ Μ Ί 0"⁶Μ

骨カルシウム量

178.0+5.11 6.4±2.81 168.0± 10.67

(mgZg 220.0±3.25* 15

乾燥重量）

骨アルカリ性ホスファターゼ活性 898.1±11.3

(nm 116 .8±21.1 957.0±37.0

ol/min/mg 8.2土 30.1* 948

蛋白質）

骨 DNA量

3.020± 0.049

(mg/g^湿重虽） 5.401± 0.188* 3.001± 0.454 3.499± 0.259 (比較例）

]3—クリプトキサンチンに代えて、 j3—力口テン（ ]3— carotene) とキサンチン（xantine； 2, 6- dihydroxypurine) の骨カルシウム量に及ぼす効果について調べた。）3—カロテンの 1 0— ⁷M及びキサンチンの 1 0 一⁶ Mをそれぞれ培養液中に存在させ、実施例 1記載の方法で、骨幹部あるいは骨幹端部組織を 48時間培養した後、骨組織中のカルシウム量を測定した。結果を表 3及び第 1 3図、第 1 4図に示す。表 3中の各値は 6〜 8匹のラッ卜の平均値土標準誤差を示す。表 3から明らかなように、 iS—カロテンゃキサンチンでは、骨組織中カルシウム量の有意な増加効果は発現することがなかった。

(表 3)

( J3—クリプ骨吸収抑制作用の発現）

J3—クリプトキサ骨塩溶解抑制効果について調べた。副甲状腺ホルモン（parathyroid hormone; P TH)は、副甲状腺から分泌され、骨塩溶解（骨吸収）作用を発揮するペプチドホルモンで、老化に伴った骨粗鬆症の発現に病態生理的役割を果たしている。同様に、プロスタグランジン E ₂も生理的な骨塩溶解をひき起こすことが知られている。そこで、大腿骨の骨幹部及び骨幹端部組織を 1 0—⁷Mの P THの存在下、又は 1 0 _⁵Mのプロスタグランジン E ₂の存在下で 48時間培養した後，骨組織中のカルシウム量を測定した。また、これらと i3—クリプトキサンチン（ 1 0— ⁸〜 1 0— ⁶M) の共存下で、同様に培養した後、骨組織中のカルシウム量を測定した。結果を表 4及び第 1 5図〜第 1 8図に示す。それぞれの試験群は 6〜 8回ずつ測定し、平均値及び標準誤差で示した。また、有意差検定には Studen s t-testを用いて求め、対照と比較して P値が 0. 0 1以下（*)、又は P THやプロスタグランジン E ₂単独と比較して P値が 0. 0 1以下（#) であれば統計学的に有意差ありとした。 P TH存在下で骨組織を培養すると、骨幹部及び骨幹端部組織のカルシウム量が有意に減少した。この減少は、 ]3—クリプトキサンチン（ 1 0— ⁸〜 1 0 -⁶M) の存在下で有意に抑制された。同様に、生理的な骨塩溶解をひき起こすプロスタグランジン E ₂ ( 1 0— ⁵M) においても、骨組織中カルシウム量の有意な減少がひき起こされたが、この減少は ]3—クリプトキサンチン（ 1 0 _⁸〜 1 0 -⁶M) の存在下で完全に抑制された。

以上の結果より、 j3—クリプトキサンチンは、骨形成を増進 ·促進するとともに、骨吸収を抑制することにより、骨塩量を保持 ·増進する効果を発揮し、抗骨粗鬆症因子として機能することが確かめられた。 (表 4)

(ラットに /3—クリプトキサンチン経口投与による骨成分の増加）ラットに ]3—クリプトキサンチンを経口投与したときに骨成分が増加するかどうか調べた。）3—クリプトキサンチンを 7日間投与（ 1 0 2 5 , 5 0 g/ 1 0 0 g体重 · 日）した後、骨組織中のカルシウム量、アルカリ性ホスファタゼ治性（骨石灰化促進酵素）及びデォキシリポ核酸（DN A ；骨組織中細胞数の指標）量を実施例 1記載の方法で測定した。結果を表 5及び第 1 9図〜第 24図に示す。なお、それぞれの試験群は 6回ずつ測定し、平均値及び標準誤差で示した。また、有意差検定には Student' s t- test を用いて求め、対照と比較して P値が 0. 0 1以下（*) であれば統計学的に有意差ありとした。その結果、骨幹部及び骨幹端部組織のカルシウム量は、一クリプトキサンチンの投与（ 1 0 , 2 5， 5 0 g/ 1 0 0 g体重 ' 日）により、有意に増加した。骨幹部及び骨幹端部組織のアル力リホスファタ一ゼ活性（骨石灰化促進酵素）は、 β -クリプトキサンチンの投与（ 1 0， 2 5 , 5 0 g/ 1 0 0 g体重 · 日）により、有意に増加した。骨組織中 DNA量（骨組織中の細胞数の指標）は、骨幹部においては、 jS—クリプトキサンチンの投与（2 5及び 5 0 z gZ l O O g体重 · 日）で有意に増加し、骨幹端部では、 β -クリプトキサンチンの投与（ 1 0， 2 5， 5 0 /2 g/ 1 0 0 g体重 · 日）で有意に増加した。

以上のことより、；8—クリプトキサンチンは、経口投与することにより、骨成分量を増加し、骨量増進効果を有することが確認できた。このことから、 /3—クリプトキサンチンは、骨形成促進剤として有用であり、骨粗鬆症の予防と治療に有効であると考えられる。

2 (表 5 )

産業上の利用可能性

本発明によると、 i3—クリプトキサンチンを有効成分とすることで、積極的に骨形成を促進して骨疾患を予防 ·治療することができる顕著な効果を有する骨形成促進剤や、骨形成促進作用と骨吸収抑制作用の両作用を有する骨粗鬆症等の骨疾患の予防'治療薬を提供することができる。

Claims

請求の範囲

I . j3—クリプトキサンチンを有効成分とすることを特徴とする骨形成促進剤。

2 . i3—クリプトキサンチン含有組成物を有効成分とすることを特徴とする骨形成促進剤。

3 . 0—クリプトキサンチン含有組成物が、温州みかんの処理物であることを特徴とする請求項 2記載の骨形成促進剤。

4 . /3—クリプトキサンチンを有効成分とすることを特徴とする骨疾患の予防 ·治療薬。

5 . β 一クリプトキサンチン含有組成物を有効成分とすることを特徴とする骨疾患の予防 ·治療薬。

6 . 3—クリプトキサンチン含有組成物が、温州みかんの処理物であることを特徴とする請求項 5記載の骨疾患の予防 ·治療薬。

7 . 骨疾患が骨粗鬆症であることを特徴とする請求項 4〜 6のいずれか記載の骨疾患の予防 ·治療薬。

8 . iS—クリプトキサンチンを添加したことを特徴とする骨疾患の予防 ·治療用機能性食品又は食品素材。

9 . ；6—クリプトキサンチン含有組成物を添加したことを特徴とする骨疾患の予防 ·治療用機能性食品又は食品素材。

1 0 . ^—クリプトキサンチン含有組成物が、温州みかんの処理物であることを特徴とする請求項 9記載の骨疾患の予防 ·治療用機能性食品又は食品素材。

I I . 骨疾患が骨粗鬆症であることを特徴とする請求項 8〜 1 0のいずれか記載の骨疾患の予防 ·治療用機能性食品又は食品素材。

1 2 . j3 —クリプトキサンチンを配合したことを特徴とする飼料用組成物。

1 3 . ;6—クリプトキサンチン含有組成物を配合したことを特徴とする飼料用組成物。

1 4 . )3—クリプトキサンチン含有組成物が、温州みかんの処理物であることを特徴とする請求項 1 3記載の飼料用組成物。

1 5 . 0—クリプトキサンチンをリード化合物とすることを特徴とする骨形成促進又は骨疾患に対する予防 ·治療のための有効成分をスクリ一ニングする方法。

1 6 . 骨疾患が骨粗鬆症であることを特徴とする請求項 1 5記載の骨形成促進又は骨疾患に対する予防 ·治療のための有効成分をスクリ一ニングする方法。

1 7 . 請求項 1 5又は 1 6記載のスクリ一ニングする方法により得られることを特徴とする ]3—クリプトキサンチンをリード化合物とした骨形成促進剤又は骨疾患の予防 ·治療剤。

1 8 . 骨疾患が骨粗鬆症であることを特徴とする請求項 1 7記載の i3— クリプトキサンチンをリ一ド化合物とした骨形成促進剤又は骨疾患の予防 ·治療剤。