WO2004033499A1 - 細胞死誘導剤 - Google Patents

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WO2004033499A1
WO2004033499A1 PCT/JP2003/013063 JP0313063W WO2004033499A1 WO 2004033499 A1 WO2004033499 A1 WO 2004033499A1 JP 0313063 W JP0313063 W JP 0313063W WO 2004033499 A1 WO2004033499 A1 WO 2004033499A1
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antibody
cells
cell
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cell death
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PCT/JP2003/013063
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Shuji Ozaki
Masahiro Abe
Masayuki Tsuchiya
Naoki Kimura
Shigeto Kawai
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Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
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    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation

Definitions

  • the present invention relates to a low-molecular-weight antibody that recognizes HLA.
  • the HLA class I antigen is formed by a 45 kD ⁇ -chain consisting of three domains (o; l, 2, a 3) and a 12 kD two-microglobulin heterodimer.
  • the major role of the HLA molecule is to present to CD8 + T cells an antigen peptide made of about 8 to 10 amino acids produced in the cells, and to induce the immune response and It plays a very important role in immune tolerance.
  • HLA class IA antigen ligation has been observed in lymphocyte cells to inhibit cell proliferation and induce cell death, suggesting the potential of HLA molecules as signaling molecules.
  • Non-Patent Document 4 Apoptosis induced by these two antibodies has been shown to be a caspase-mediated reaction (Non-Patent Document 4), indicating that HLA class IA antigen expressed on lymphocytes is a signal of apoptosis. It is speculated that they are also involved.
  • Non-patent Document 5 the antibody 5 ⁇ 7 against the ⁇ 3 domain of human HLA class IA (Non-patent Document 5) and the antibody RE2 against the ⁇ 2 domain of mouse HLA class IA (Non-patent Document 6) also have an activity. It has been reported that it induces cell death in 12-cell lymphocytes. However, unlike the apoptosis-inducing antibodies MoAb90 and YTH862, cell death induced by these antibodies has not been shown to be mediated by caspases. From this fact, it is speculated that cell death by 5H7 and RE2 is a completely different type of cell death from the conventionally known mechanism of apoptosis.
  • the 2D7 antibody is a mouse monoclonal antibody obtained by immunizing Balb / c mice with human myeloma cells (Non-Patent Document 7). So far, it has been confirmed that the 2D7 antibody binds to the cell surface of various lymphoid tumor cells with high properties, but the antigen recognized by the 2D7 antibody has not been identified.
  • Non-patent document 1 Fayen et al., Int. Immunol 10: 1347-1358 (1998)
  • Non-patent document 2 Genestier et al., Blood 90: 3629-3639 (1997)
  • Non-Patent Document 3 Genestier et al., Blood 90: 726-735 (1997)
  • Non-patent document 6 Matsuoka et al., J. Exp. Med. 181: 2007-2015 (1995)
  • Non-patent document 7 Goto, et al. Blood 84: 1922 (1994) Disclosure of the invention
  • a first object of the present invention is to provide a low-molecular-weight antibody that recognizes HLA class IA.
  • a further object of the present invention is to provide a novel tumor utilizing this low molecular weight antibody. To provide an agent for treating a ulcer or an autoimmune disease.
  • the present inventors For the purpose of identifying the antigen of the 2D7 antibody, the present inventors first synthesized cDNA using a random hexomer from mRNA purified from 2D7 antigen-expressing cells RPMI8226. This was inserted into a retrovirus vector pMX to prepare a retrovirus expression library. The retroviral expression library was transfected into B0SC23 cells and packaged into retrovirus. After that, the obtained virus was used to infect NIH3T3 cells, stained with 2D7 antibody, and analyzed for expression by FACS to screen for 2D7 antigen. Furthermore, cell lysate was adjusted using RPMI8226 cells expressing the 2D7 antigen and U266 cells, and the 2D7 antigen was identified by immunoprecipitation. As a result of these studies, the 2D7 antigen was found to be an HLA class I molecule.
  • the present inventors examined whether the 2D7 antibody had a cell death-inducing activity. Specifically, under 2D7 present in Jurkat cells or in the absence, performs the anti-mouse IgG antibody was added further cultured for 48 hours after, the cell nuclei were stained with H 0e chst33258, fragments of characteristic cell nuclei dead cells Observed force was observed. As a result, in Jurkat cells, almost no cell death-inducing activity was detected with the 2D7 antibody alone, but nuclear fragmentation was observed by cross-linking with the anti-mouse IgG antibody, and cell death was induced. I understood.
  • the induction of cell death by the 2D7 antibody requires cross-linking with an anti-mouse IgG antibody, so that clinical application of the 2D7 antibody to tumors or autoimmune diseases is difficult.
  • the present inventors examined the effect of the reduction of the molecular weight of the 2D7 antibody on cell death induction. Specifically, the gene encoding the variable region of the 2D7 antibody was cloned from the hybridoma, and the 2D7 antibody was diabodyed by a genetic modification technique to examine its effect on cell death-inducing activity.
  • the diabodyized 2D7 antibody showed potent cell death-inducing activity in a very short time and at a low dose without cross-linking with an anti-mouse IgG antibody.
  • the Diabody is positive It had almost no effect on lymphocytes derived from normal peripheral blood or adherent cells, and specifically induced cell death only on various myeloma cells, T-cell leukemia cell lines, and activated lymphocytes. The above results indicate that a low-molecular-weight antibody that recognizes HLA can be used as a cell death inducer.
  • the present invention provides the following [1] to [23].
  • HLA human leukocyte antigen
  • [7] A method for producing an antibody having an increased activity by reducing the molecular weight of an antibody that recognizes HLA.
  • [10] A method for producing an antibody with increased activity by reducing the molecular weight of the 2D7 antibody.
  • the activity is a cell death-inducing activity or a cell growth-inhibiting activity, [7] to [1
  • an antibody comprising the low-molecular-weight antibody according to any one of (1) to (6), the low-molecular-weight antibody produced by the method according to any one of (7) to (12), or the 2D7 antibody as an active ingredient; A cell death inducer.
  • an active ingredient comprising the low-molecular-weight antibody according to any one of (1) to (6), the low-molecular-weight antibody produced by the method according to any one of (7) to (12), or the 2D7 antibody A cell growth inhibitor.
  • an antibody comprising the low-molecular-weight antibody according to any one of (1) to (6), the low-molecular-weight antibody produced by the method according to any one of (7) to (12), or the 2D7 antibody As an antitumor agent.
  • the present invention provides a minibodies that recognize HLA.
  • the minibodies of the present invention are useful in that their activities are increased.
  • the activity refers to a biological action caused by binding of an antibody to an antigen.
  • Specific examples include cell death induction, apoptosis induction, cell proliferation inhibitory, cell differentiation inhibitory, cell division inhibitory, cell proliferation inducing, cell differentiation inducing, cell division inducing, cell periphery Phase regulating action, etc., and preferably a cell death inducing action and a cell growth suppressing action.
  • Cells targeted for the above-mentioned effects are not particularly limited, but blood cells and floating cells are preferable.
  • blood cells include lymphocytes (B cells and T cells), neutrophils, eosinophils, basophils, and monocytes (preferably activated peripheral blood mononuclear cells (peripheral blood). mononuclear cell, PBMC)), myeloma cells, etc., but lymphocytes (B cells, T cells) and myeloma cells are preferred, and T cells or B cells (particularly activated B cells or activated B cells) T cells) are most preferred.
  • Suspended cells are cells that grow in suspension without adhering to the surface of an incubator such as a glass plastic when the cells are cultured.
  • adherent cells adherent cells
  • hematologic tumors hematopoietic tumors
  • hematopoietic tumors hematopoietic tumors
  • specific examples include leukemia, myelodysplastic syndrome, malignant lymphoma, Chronic myelogenous leukemia, plasma cell abnormalities (myeloma, multiple myeloma, macroglobulinemia), myeloproliferative disorders (polycythemia vera, essential thrombocythemia, idiopathic myelofibrosis)
  • autoimmune diseases for example, rheumatism, autoimmune hepatitis, autoimmune thyroiditis, autoimmune bullous disease, autoimmunity Adrenocorticitis, autoimmune hemolytic anemia, autoimmune thrombocytopenic purpura, autoimmune atrophic gastritis, autoimmune neutropenia, autoimmune orchitis, autoimmune cerebrospinal cord Inflammation, Auto
  • HLA means human leukocyte antigen.
  • HLA molecules are classified into class I and class II.
  • HLA-A, B, C, E, F, G, H, J, etc. are known as class I, and HLA-DR, DC! , DP and others are known.
  • the antigen recognized by the antibody of the present invention is not particularly limited as long as it is an HLA molecule, but is preferably a molecule classified into class I, and more preferably HLA-A.
  • the minibody of the present invention full-length antibodies (whole Antibody, for example whole I g G, etc.) an antibody fragment partially deficient in not particularly limited as long as it has antigen-binding ability.
  • the antibody fragment of the present invention is not particularly limited as long as it is a part of a full-length antibody, but preferably contains a heavy chain variable region (VH) or a light chain variable region (VL), and particularly preferably VH And a fragment containing both VL.
  • Specific examples of the antibody fragment include, for example, Fab, Fab, F (ab,) 2, Fv, scFv (single chain Fv), and preferably scFv (Huston, JS et al.). Natl. Acad. Sci.
  • the minibodies of the present invention preferably have a smaller molecular weight than full-length antibodies, but, for example, may form multimers such as dimers, trimers, and tetramers. May be larger.
  • a preferred low molecular weight antibody in the present invention is an antibody containing two or more VHs and two or more VLs of an antibody, and having these variable regions bound directly or indirectly via a linker or the like.
  • the bond may be a covalent bond or a non-covalent bond, and may be both a covalent bond and a non-covalent bond.
  • More preferred low molecular weight antibodies are antibodies comprising two or more VH-VL pairs formed by non-covalent bonding of VH and VL. In this case, an antibody in which the distance between one VH-VL pair and the other VH-VL pair in the minibodies is shorter than the distance in a full-length antibody is preferable.
  • Diabody is a dimer formed by linking two fragments (for example, scFv, etc.) in which a variable region and a variable region are linked by a linker or the like (hereinafter, a fragment constituting Diabody).
  • a fragment constituting Diabody usually contains two VLs and two VHs (P. Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 6444-6448 (1993), EP404097, W093 / 11161, Johnson et al.
  • the bond between the fragments constituting Diabody may be non-covalent or covalent, but is preferably non-covalent.
  • fragments constituting Diabody can be linked to each other with a linker or the like to form a single-chain Diabody (scDiabody). At that time, configure the Diabody When fragments are linked using a long linker of about 20 amino acids, non-covalent bonding between the fragments constituting Diabody existing on the same chain is possible, and a dimer is formed.
  • the fragment constituting Diabody examples include those in which VL and VH are linked, those in which VL and VL are linked, those in which VH and VH are linked, and preferably those in which VH and VL are linked.
  • the linker that binds the variable region to the variable region is not particularly limited, but it is preferable to use a linker that is short enough to prevent non-covalent bonding between the variable regions in the same fragment. .
  • the length of such a linker can be appropriately determined by those skilled in the art, but is usually 2 to 14 amino acids, preferably 3 to 9 amino acids, and particularly preferably 4 to 6 amino acids.
  • the diabody in the present invention may be a diabody having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 in which one or more amino acid sequences are mutated (substitution, deletion, insertion, And / or an additional amino acid sequence, wherein the Diabody is functionally equivalent to the Diabody having the sequence of SEQ ID NO: 6, and the CDR (or variable region) and sequence of SEQ ID NO: 2 Diabody having the amino acid sequence of CDR (or variable region) of No.
  • “functionally equivalent” refers to the target diabody, the diabody having the sequence of SEQ ID NO: 6, or the CDR (or variable region) of SEQ ID NO: 2 and the CDR (or variable region) of SEQ ID NO: 4.
  • variable regions e.g., binding activity to HLA-A, cell death inducing activity, etc.
  • amino acids to be mutated is not particularly limited, it is usually considered to be within 30 amino acids, preferably within 15 amino acids, and more preferably within 5 amino acids (eg, within 3 amino acids).
  • a diabody having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 or a diabody having the CDR (or variable region) sequence of SEQ ID NO: 2 and the CDR (or variable region) of SEQ ID NO: 4 was It may be humanized or chimerized for the purpose of reducing heterologous antigenicity.
  • positions 1 to 134 correspond to the variable region
  • 50 to 54 correspond to CDR1
  • 69 to 85 correspond to CDR2
  • 118 to 134 correspond to CDR3. I do.
  • the 1st to 128th positions correspond to the variable region
  • the 46th to 55th positions are CDR1
  • the 71st to 77th positions are CDR2
  • the 110th to 128th positions are CDR3. Is equivalent to
  • the low molecular weight antibody that recognizes HLA is not particularly limited as long as it specifically binds to HLA and has a biological effect.
  • the minibodies of the present invention can be prepared by methods known to those skilled in the art. For example, as described in Examples, based on the sequence of an antibody recognizing HLA (particularly, the sequence of a variable region or the sequence of a complementary chain determining region (CDR)), a gene recombination technique known to those skilled in the art. It is possible to produce using.
  • sequence of the antibody recognizing HLA a sequence of a known antibody can be used.
  • an anti-HLA antibody is prepared by a method known to those skilled in the art, and It is also possible to obtain and use the antibody sequence. Specifically, for example, it can be performed as follows. The HLA protein or a fragment thereof is used as a sensitizing antigen, and immunized with the usual immunization method, and the obtained immune cells are fused with known parent cells by a conventional cell fusion method, and the conventional screening method is used. Screens monoclonal antibody-producing cells (hybridomas).
  • the antigen can be prepared according to a known method, for example, a method using a paculovirus (W098 / 46777, etc.).
  • Hybridomas can be prepared, for example, according to the method of Milstin et al. (Kohler. G. and Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73: 3-46).
  • immunization may be performed by binding to a macromolecule having immunogenicity such as aluminin.
  • cDNA for the variable region (V region) of the antibody is synthesized from the hybridoma mRNA using reverse transcriptase, and the sequence of the obtained cDNA may be decoded by a known method.
  • the antibody recognizing HLA is not particularly limited as long as it binds to HLA, and a mouse antibody, a rat antibody, a rabbit antibody, a hidge antibody, a human antibody, and the like can be used as appropriate.
  • a recombinant recombinant antibody artificially modified for the purpose of reducing the heterologous antigenicity to humans for example, a chimeric antibody, a humanized antibody and the like can be used.
  • modified antibodies can be produced using known methods.
  • a chimeric antibody is a mammal other than a human, for example, an antibody comprising a heavy chain and a light chain variable region of a mouse antibody and a heavy chain and a light chain constant region of a human antibody.
  • a humanized antibody is also called a reshaped human antibody, and the complementarity determining region (CDR) of a non-human mammal, such as a mouse antibody, is transferred to the complementarity determining region of a human antibody.
  • CDR complementarity determining region
  • This method is also known for its general genetic recombination method. Specifically, the CDR of mouse antibody and the frame of human antibody
  • a DNA sequence designed to link a framework region (FR) is synthesized by PCR from several oligonucleotides that have been prepared so as to have an overlapping portion at the end. The obtained DNA is ligated to DNA encoding the constant region of a human antibody, then inserted into an expression vector, and introduced into a host to produce the same (European Patent Application Publication No.
  • EP 239400 International Patent Application Publication Number W 0 96/02576
  • Human antibody FRs linked via CDRs are selected so that the complementarity-determining regions form a favorable antigen-binding site. If necessary, amino acids in the framework region of the antibody variable region may be substituted so that the complementarity determining region of the reshaped human antibody forms an appropriate antigen-binding site (Sato, L et al., Cancer Res. (1993) 53, 851-856).
  • chimeric antibodies and humanized antibodies may be subjected to chimerization and humanization after being reduced in molecular weight, or may be reduced after being chimerized and humanized.
  • a method for obtaining a human antibody is known.
  • a human lymphocyte is sensitized in vitro with a desired antigen or a cell expressing the desired antigen, and the sensitized lymphocyte is fused with a human myeloma cell such as U266 to obtain a desired human having an antigen-binding activity.
  • Antibodies can also be obtained (see Japanese Patent Publication No. 1-59878).
  • a desired human antibody can be obtained by immunizing a transgenic animal having the entire repertoire of human antibody genes with a desired antigen (International Patent Application Publication Nos.
  • a technique for obtaining a human antibody by panning using a human antibody library is also known.
  • a phage that binds to an antigen can be selected by expressing the variable region of a human antibody as a single-chain antibody (scFv) on the surface of the phage by the phage display method.
  • scFv single-chain antibody
  • a preferred example of the antibody recognizing HLA is the 2D7 antibody.
  • the 2D7 antibody include, but are not limited to, antibodies having the CDR (or variable region) sequence of SEQ ID NO: 2 and the CDR (or variable region) sequence of SEQ ID NO: 4.
  • “functionally equivalent” means that the target antibody is the same as the antibody having the CDR (or variable region) of SEQ ID NO: 2 and the CDR (or variable region) of SEQ ID NO: 4.
  • Activity eg, HLA-A binding activity, cell death inducing activity, etc.
  • amino acids to be mutated is not particularly limited, it is usually considered to be within 30 amino acids, preferably within 15 amino acids, and more preferably within 5 amino acids (eg, within 3 amino acids).
  • the amino acid residue to be mutated is desirably mutated to another amino acid in which the properties of the amino acid side chain are conserved.
  • amino acid side chains include hydrophobic amino acids (A, I, L, M, F, P, W, Y, V) and hydrophilic amino acids (R, D, N, C, E, Q, G , H, K, S, T), amino acids with aliphatic side chains (G, A, V, L, I, P), amino acids with hydroxyl-containing side chains (S, T, ⁇ ), sulfur atoms
  • amino acids (R, K, ⁇ ) with side chains containing bases aromatic Amino acids having a group-containing side chain (H, F, Y, W) can be mentioned (all brackets represent one letter of amino acids).
  • the 2D7 antibody can be chimerized, humanized, or the like by a method known to those skilled in the art. Such a chimeric antibody or a humanized antibody is also included in the 2D7 antibody of the present invention.
  • the antibody of the present invention may be a conjugate antibody bound to various molecules such as polyethylene glycol (PEG), a radioactive substance, and a toxin.
  • PEG polyethylene glycol
  • a radioactive substance such as radioactive substance
  • a toxin such as toxin.
  • Such a conjugated antibody can be obtained by chemically modifying the obtained antibody. Methods for modifying antibodies have been already established in this field.
  • the “antibody” in the present invention also includes these conjugated antibodies.
  • the present invention includes a DNA encoding the antibody of the present invention. It also includes a DNA that encodes an antibody that hybridizes with the DNA under stringent conditions and has an antigen-binding ability and activity.
  • Hybridization technology (Sambrook, J et al., Molecular Cloning 2nd ed., 9.47-9.58, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) is known to those skilled in the art and Conditions can be appropriately selected by those skilled in the art.
  • Hybridization conditions include, for example, low stringency conditions. Low stringency conditions include, for example, 42 post-hybridization washes. (: 0.1 XSSC, 0.1% SDS, preferably 50 ° C., 0.1 ⁇ SSCs 0.1% SDS.
  • More preferred hybridization is high High stringency conditions include, for example, conditions of 65 ° C., 5 XSSC and 0.1% SDS Under these conditions, the higher the temperature, the higher the homology DNA is obtained efficiently Can be expected. However, multiple factors such as temperature and salt concentration can be considered as factors affecting the stringency of the hybridization, and those skilled in the art can realize the same stringency by appropriately selecting these factors. Is possible.
  • the DNA of the present invention is used not only for in vivo and in vitro production of the antibody of the present invention, but also for application to, for example, gene therapy.
  • the DNA of the present invention may be in any form as long as it can encode the antibody of the present invention. That is, whether it is cDNA synthesized from mRNA, genomic DNA, or chemically synthesized DNA. Further, as long as it can encode the antibody of the present invention, DNA having an arbitrary base sequence based on the degeneracy of the genetic code is included.
  • the antibody of the present invention can be produced by a method known to those skilled in the art. Specifically, the DNA of the target antibody is incorporated into an expression vector. At that time, it is incorporated into an expression vector so that the expression is controlled under the control of an expression control region, for example, an enhancer or a promoter. Next, host cells can be transformed with this expression vector to express the antibody. At that time, a combination of an appropriate host and an expression vector can be used.
  • vectors examples include M13-based vectors, pUC-based vectors, pBR322, pBluescript, pCR-Script, and the like. Further, subcloning cDNA, when aimed at cutting out, in addition to the base Kuta one, for example, pGEM- T, pDIRECT, such as P T7 can be mentioned up.
  • an expression vector is particularly useful.
  • an expression vector for example, in the case of expression in Escherichia coli, in addition to having the above-mentioned characteristics such that the vector is amplified in Escherichia coli, the host can be used in E. coli such as J1109, DH5 «, HB101, XLl-Blue, etc.
  • a promoter that can be efficiently expressed in E. coli such as the lacZ promoter (Ward et al., Nature (1989) 341, 544-546; FASEB J.
  • Such vectors include pGEX-5 ⁇ -1 (Pharmacia), “QIAexpress system” (QIAGE N), pEGFP, or pET (in this case, the host expresses T7 RNA polymerase) in addition to the above vectors.
  • BL21 is preferred).
  • the vector may include a signal sequence for polypeptide secretion.
  • a signal sequence for polypeptide secretion a pelB signal sequence (Lei, SP et al J. Bacteriol. (1 87) 169, 4379) may be used when produced in E. coli periplasm.
  • the introduction of the vector into the host cell can be performed using, for example, the chloride calcium method or the electroporation method.
  • a mammalian expression vector for example, pcDNA3 (manufactured by Invitrogen)
  • pEGF-BOS Nucleic Acids. Res.
  • insect cell-derived expression vectors eg, “Bac-to-BAC baculovairus expression system” (GIBC0 BRL), P BacPAK8), plant-derived expression vectors (eg, ⁇ 1, pMH 2), animal virus-derived expression vectors (eg, pHSV, pMV, pAdexLcw), retrovirus-derived expression vectors (eg, pZIPneo), yeast-derived expression vectors (eg, “Pichia Expression Kit” ( manufactured by Invitrogen), pNVll, SP-Q01) , expression vectors derived from Bacillus subtilis (e.g., P PL608, pKTH50) can be mentioned.
  • Bacillus subtilis e.g., P PL608, pKTH50
  • a promoter necessary for expression in cells for example, SV40 promoter (Mulligan et al., Nature (1979) 277, 108) , MMLV-LTR promoter, EFla promoter (MizusMma et al., Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322), CMV promoter, etc. are essential to select for cell transformation. It is more preferable to have a gene (for example, a drug resistance gene that can be identified by a drug (neomycin, G418, etc.)). As a Better with such characteristics, For example, p-image, pDR2, pBK- RSV, P BK_CMV , pOPRSV, pOP13 , and the like.
  • a vector having the DHFR gene complementing the nucleic acid synthesis pathway-deficient CH0 cell is used.
  • pCHOI a vector having the DHFR gene complementing the nucleic acid synthesis pathway-deficient CH0 cell
  • MTX methotrexate
  • the gene expressing the SV40 T antigen is transferred to the chromosome.
  • the origin of replication those derived from poliovirus, adenovirus, sipapipioma virus (BPV) and the like can also be used.
  • the expression vector is used as a selectable marker for aminoglycoside transferase (APH) gene, thymidine kinase (TK) gene, Escherichia coli xanthinjungyun phospholiposyltransferase (Ecogpt) gene for gene copy number amplification in the host cell system. It can contain the dihydrofolate reductase (dhfr) gene and the like.
  • the DNA of the present invention is incorporated into an appropriate vector and, for example, a retrovirus method, a ribosome method, a cationic ribosome method, an adenovirus method, or the like is used. And other methods.
  • a vector to be used for example, an adenovirus vector
  • pAdexlcw and a retrovirus vector (for example, pZIPneo), but are not limited thereto.
  • General genetic manipulation such as insertion of the DNA of the present invention into a vector can be performed according to a conventional method (Molecular Cloning, 5.61-5.63). Administration into a living body may be an ex vivo method or an in vivo method.
  • the present invention also provides a host cell into which the vector of the present invention has been introduced.
  • the host cell into which the vector of the present invention is introduced is not particularly limited, and for example, Escherichia coli and various animal cells can be used.
  • the host cell of the present invention can be used, for example, as a production system for producing or expressing the antibody of the present invention.
  • Production systems for polypeptide production include in vitro and in vivo production systems. in vit Examples of the production system of o include a production system using eukaryotic cells and a production system using prokaryotic cells.
  • animal cells for example, animal cells, plant cells, and fungal cells can be used as hosts.
  • animal cells mammalian cells, for example, CHO (J. Exp. Med. (1995) 108, 945), C0S, 3T3, myeloma, BHK (baby hamster kidney), HeLa, Vero, amphibian cells, for example, African Megafrog oocytes (Valle, et al., Ature (1981) 291, 358-340) or insect cells such as Sf9, Sf21, and Tn5 are known.
  • CH0 cells include dhfr-CHO (Proc. Natl. Acad. Sci.
  • the vector is introduced into the host cells by, for example, a calcium phosphate method, a DEAE dextran method, a method using Cationic ribosome D0TAP (manufactured by Boehringer Mannheim), an electoral poration method, or a lipofection. Is possible.
  • a cell derived from Nicotiana tabacum is known as a polypeptide production system, which may be callus cultured.
  • Fungal cells include yeast, e.g., Saccharomyces ( ⁇ accharowces genus, e.g., Saccharomyces. Cerevisiae) niger) is known.
  • prokaryotic cells When prokaryotic cells are used, there are production systems using bacterial cells.
  • Known bacterial cells include E. coli), for example, it includes JM109, DH5 a, HB101, etc., other, Bacillus subtilis.
  • An antibody can be obtained by transforming these cells with the target DNA and culturing the transformed cells in vitro.
  • Culture according to known methods Can be.
  • a culture solution of animal cells for example, DMEM, MEM, RPMI1640, IMDM can be used.
  • a serum replacement solution such as fetal calf serum (FCS) can be used in combination, or serum-free culture may be performed.
  • FCS fetal calf serum
  • the pH during culturing is preferably about 6-8. Culture is usually performed at about 30 to 40 C for about 15 to 200 hours, and the medium is replaced, aerated, and agitated as necessary.
  • examples of a system for producing a polypeptide in vivo include a production system using animals and a production system using plants.
  • the desired DNA is introduced into these animals or plants, and the polypeptide is produced in the animals or plants and collected.
  • the “host” in the present invention includes these animals and plants.
  • mice When using animals, there are production systems using mammals and insects. Goats, stags, sheep, mice, and mice can be used as mammals (Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993). When a mammal is used, a transgenic animal can be used.
  • the target DNA is prepared as a fusion gene with a gene encoding a polypeptide uniquely produced in milk, such as goat i3 casein. Then, a DNA fragment containing the fusion gene is injected into a goat embryo, and the embryo is transplanted into a female goat.
  • the target antibody can be obtained from the milk produced by the transgenic goat born from the goat that has received the embryo or its progeny. Hormones may be used in transgenic goats as appropriate to increase the amount of milk containing polypeptides produced by transgenic goats (Ebert, KM et al., Bio / Technology (1994) 12,699). -702).
  • silkworms can be used as insects, for example.
  • the target polypeptide can be obtained from the body fluid of the silkworm by infecting the silkworm with a paculovirus into which the target DNA has been introduced (Susumu, M. et a 1., Nature ( 1985) 315, 592-594).
  • plants can be used, for example, tobacco can be used.
  • tobacco When used, the DNA of interest is introduced into a plant expression vector, for example, pMON530, and this vector is introduced into a vector, such as agrobacterium.
  • tobacco for example, Nicotiana tapacum, imcotiana tabacum
  • desired polypeptides can be obtained from the leaves of this tobacco (Julian K. -C. Ma et al., Eur. J. Immunol. (1994) 24, 131-138).
  • the antibody of the present invention thus obtained can be isolated from the host cell or from outside the cell (such as a medium) and purified as a substantially pure and homogeneous antibody.
  • the separation and purification of the antibody may be carried out by using the separation and purification methods used in ordinary antibody purification, and is not limited at all. For example, chromatographic columns, finoletters, ultrafiltration, salting out, solvent precipitation, solvent extraction, distillation, immunoprecipitation, SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, isoelectric focusing, dialysis, recrystallization, etc. If combined, the antibody can be separated and purified.
  • chromatography examples include affinity chromatography, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, gel filtration, reverse phase chromatography, and adsorption chromatography (Strategies for Protein Purification ana Characterization: A Laboratory ourse Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996). These chromatographys can be performed using liquid phase chromatography, for example, liquid phase chromatography such as HPLC and FPLC. The present invention also encompasses highly purified antibodies using these purification methods.
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • EIA enzyme immunoassay
  • RIA radioimmunoassay
  • fluorescence immunoassay can be used.
  • whether or not the antibody of the present invention induces cell death in floating cells is determined by whether or not it induces cell death in Jurkat cells or ARH77 cells as in the Examples. be able to.
  • whether or not the antibody has the ability to induce cell death to adherent cells can be determined by whether or not to induce cell death to HeLa cells as in the Examples.
  • the present invention also provides a cell death inducer or a cell proliferation inhibitor comprising the low molecular weight antibody or the 2D7 antibody of the present invention as an active ingredient.
  • the cell death-inducing activity of the low molecular weight antibody or the 2D7 antibody of the present invention is considered to be particularly effective for activated T cells or B cells. It is considered to be particularly effective in treating and preventing diseases.
  • the present invention also provides a method for treating or preventing a tumor such as cancer (particularly a blood tumor) or an autoimmune disease using the low-molecular-weight antibody or the 2D7 antibody of the present invention.
  • a 2D7 antibody that has not been reduced in molecular weight is used as an active ingredient, it is preferable to crosslink with an anti-IgG antibody or the like.
  • reagents can be bound to the above antibody and used as a conjugate antibody.
  • reagents can include chemotherapeutic agents, radioactive substances, toxins and the like.
  • a conjugate antibody can be prepared by a known method (US5057313, US5156840).
  • the above-mentioned drug can be administered as a pharmaceutical composition formulated by a known pharmaceutical method in addition to direct administration to a patient.
  • a pharmaceutical composition formulated by a known pharmaceutical method in addition to direct administration to a patient.
  • It can be used parenterally in dosage form.
  • pharmacologically acceptable carriers or vehicles specifically, sterile water or physiological saline, vegetable oils, emulsifiers, suspending agents, surfactants, stabilizers, flavoring agents, excipients, vehicles
  • preservatives, binders, etc. as appropriate, they can be mixed in unit dosage forms required for accepted pharmaceutical practice. Therefore, it can be considered to be formulated.
  • the amount of the active ingredient in these preparations is such that a suitable dosage in the specified range can be obtained.
  • Additives that can be incorporated into tablets and capsules include, for example, binders such as gelatin, corn starch, tragacanth gum, and acacia, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, and alginic acid.
  • a suitable leavening agent, a lubricant such as magnesium stearate, a sweetening agent such as sucrose, lactose or saccharin, and a flavoring agent such as peppermint, cocoa oil or tea are used.
  • the unit dosage form is a capsule, the above materials may further contain a liquid carrier such as an oil or fat.
  • Sterile compositions for injection can be formulated according to normal pharmaceutical practice using a vehicle such as distilled water for injection.
  • Aqueous solutions for injection include, for example, saline, isotonic solutions containing dextrose and other adjuvants, such as D-sorbitol, D-mannose, D-mannitol, sodium chloride. It may be used in combination with an agent, for example, an alcohol, specifically, ethanol, a polyalcohol, for example, propylene glycol, polyethylene glycol, a nonionic surfactant, for example, polysorbate 80 (TM), or HC0-50.
  • an agent for example, an alcohol, specifically, ethanol, a polyalcohol, for example, propylene glycol, polyethylene glycol, a nonionic surfactant, for example, polysorbate 80 (TM), or HC0-50.
  • examples of the oily liquid include sesame oil and soybean oil, which may be used in combination with benzyl benzoate or benzyl alcohol as a solubilizing agent.
  • a buffer for example, a phosphate buffer, a sodium acetate buffer, a soothing agent, for example, proforce hydrochloride, a stabilizer, for example, benzyl alcohol, phenol, or an antioxidant.
  • a buffer for example, a phosphate buffer, a sodium acetate buffer
  • a soothing agent for example, proforce hydrochloride
  • a stabilizer for example, benzyl alcohol, phenol, or an antioxidant.
  • the prepared injection solution is usually filled into an appropriate ampoule.
  • Administration to a patient can be performed, for example, by intraarterial injection, intravenous injection, subcutaneous injection, etc., or intranasally, transbronchially, intramuscularly, transdermally, or orally by a method known to those skilled in the art. It can do better.
  • the dose varies depending on the weight and age of the patient, the administration method, and the like, but those skilled in the art can appropriately select an appropriate dose.
  • the compound can be encoded by DNA
  • the DNA may be incorporated into a vector for gene therapy to perform gene therapy. Dosage and administration method depends on patient weight and age 03 013063 1-23-It varies depending on age, symptoms and the like, but those skilled in the art can appropriately select.
  • the dose of the drug of the present invention may vary depending on the administration subject, target organ, symptoms, and administration method. For example, in the case of an injection, an adult (assuming a body weight of 60 kg) usually takes 1 day. It is considered to be from about 0.1 to 1000 mg, preferably from about 1.0 to 50 mg, more preferably from about 1.0 to 20 mg per.
  • the single dose varies depending on the administration target, target organ, symptoms and administration method.
  • it is usually 1 dose for adults (with a body weight of 60 kg).
  • it may be convenient to administer about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg per day by intravenous injection.
  • the dose can be administered in terms of the amount converted per 60 kg body weight or the amount converted per body surface area.
  • Figure 1 is a diagram showing an adapter used in the production of P MX2 vector. Bold portions indicate BstXI recognition sequences.
  • FIG. 2A and FIG. 2B are diagrams showing the expression of the 2D7 antigen in a cell line. Various cells were stained with the 2D7 antibody and their expression was examined. (Solid line: no primary antibody, dotted line: 2D7 antibody)
  • FIG. 3 is a photograph showing immunoprecipitation with the 2D7 antibody.
  • NIH3T3, RPMI8226, and U266 cells were lysed and immunoprecipitated with 2D7 antibody, anti-BST-1 antibody (control), or protein G alone, and the protein was detected by silver staining.
  • RPMI8226 and U266 detected about 12 KD molecules (arrows) that specifically precipitated with the 2D7 antibody. This band was cut out and subjected to a peptide sequence. As a result, it was confirmed that it was 32 microglobulins.
  • FIG. 4 is a diagram showing a flow of the screening. Pooling, DNA preparation, viral packaging, infection of 3T3 cells, screening by FACS was performed as one span (Fig. 4A). By the end of the fourth screening, the number was reduced to about 20 clones. In the fifth screening, 64 64-mouths were inoculated on a 96-well plate each, and pools were formed in vertical and horizontal rows and screened. As a result, 12 candidate clones were narrowed down (Fig. 4B).
  • FIG. 5 is a diagram showing the results of screening by FACS.
  • Figure 5A shows the results of the secondary screening
  • Figure 5B shows the results of the tertiary screening
  • Figure 5C shows the results of the quaternary screening.
  • a retrovirus was prepared from each pool and infected with NIH3T3. Three days later, cells were stained with 2D7 antibody. Clones were narrowed down by progressively reducing the size of the pool at each screening.
  • FIG. 6 shows the results of screening by FACS.
  • Figure 6A shows the results of the fifth screening
  • Figure 6B shows the results of the final screening.
  • columns 3, 4, 6, and 8 and columns E, F, and G contained positive clones.
  • Screening of 12 candidate clones showed that 6 E was a positive clone in the E column.
  • As a result of analyzing the nucleotide sequence of this 6E it was found that the gene encoded HLA class A * 6802.
  • FIG. 7 is a diagram and photographs showing the effect on cells by adding a 2D7 antibody. 48 hours after the addition of the 2D7 antibody (10 ⁇ g / ml), the number of viable cells was counted. Addition of the 2D7 antibody showed little change in cell proliferation (Figure 7A). K562 cells (FIG. 7B), Jurk at cells (FIG. 7C), and RPMI8226 cells (FIG. 7D) were observed 24 hours after antibody addition. The 2D7 antibody induced cell aggregation on Jurkat.
  • FIG. 8 is a photograph showing cell death induction by cross-linking of 2D7 antibody.
  • Jurkat cells were treated with 2D7 antibody and anti-mouse IgG in each combination, and cell nuclei were stained 48 hours later. When the 2D7 antibody and anti-mouse IgG acted simultaneously, nuclear fragmentation due to cell death was observed.
  • FIG. 9 shows the sequence of 2D7 Diabody (2D7DB).
  • FIGS. 1OA and 10B show the structure of 2D7 Diabody.
  • Fig. 10 C Is a photograph showing transient expression in C0S7.
  • FIGS. 11A and 11B show the cytotoxic activity of 2D7DB transiently expressed in C0S7.
  • FIG. 12 shows the cytotoxic activity of 2D7DB transiently expressed in C0S7.
  • K562 cells Fig. 12A
  • Jurkat cells Fig. 12B
  • FIG. 13 shows the cytotoxic activity of 2D7DB transiently expressed in C0S7.
  • RPMI8226 cells Fig. 13A
  • IL-KM3 cells Fig. 13B
  • U266 cells Fig. 13C
  • ARH77 cells Fig. 13D
  • FIG. 14 is a graph showing the growth inhibitory effect of purified 2D7DB.
  • FIG. 15 is a diagram showing cell death induction by purified 2D7DB 48 hours after the induction.
  • ARH77 cells Fig. 15A
  • Jurkat cells Fig. 15B
  • K562 cells Fig. 15C
  • HeLa cells Fig. 15D
  • FIG. 16 is a diagram showing induction of cell death by purified 2D7DB 48 hours after induction.
  • U266 cells FIG. 16A
  • IL- ⁇ 3 cells FIG. 16B
  • FIG. 17 is a diagram showing a time course of cell death induction by 2D7DB (2 ⁇ g / ml). The induction of cell death from 12 hours to 38 hours was examined. The measurement was performed using ARH77 cells (FIG. 17A) and Jurkat cells (FIG. 17B).
  • FIG. 18 is a diagram showing a time course of cell death induction by 2D7DB (2 ⁇ g / ml). The induction of cell death at 3 to 6 hours was examined. ARH77 cells (FIG. 18A) and Jurkat cells (FIG. 18B) were used.
  • FIG. 19 shows the effect of Z-VAD-FMK on cell death by 2D7DB.
  • a RH77 cell was used for 16 hours after the induction.
  • FIG. 20 shows the effect of Z-VAD-FMK on cell death by 2D7DB. Jurkat cells were used and 16 hours after induction.
  • FIG. 21 is a photograph showing that cell death by 2D7DB is not accompanied by DNA fragmentation. This was performed 24 hours after induction of cell death.
  • FIG. 22 shows the results of examining the effect of cytochalasin D on the cell death-inducing activity of 2D7DB. Pretreatment of ARH77 cells with the actin polymerization inhibitor cytochalasin]) resulted in the resistance to cell death induced by 2D7DB.
  • Figure 23 is a photograph showing the results of examining the state of actin and nuclei in cells by immunostaining. After reacting ARH77 cells under the conditions shown in the figure, actin was detected with an anti-actin antibody (red), and cell nuclei were detected with Hoechst33258 (blue). 2 The cells treated with D7DB had lost actin.
  • FIG. 24 shows that 2D7 Diabody suppresses an increase in serum human IgG (hlgG) concentration in a human myeloma mouse model. Data are presented as mean + SEM. There was a significant difference (*: p * 0.05) in the unpaired t. Test between the Vehicle administration group and the 2D7 Diabody administration group.
  • FIG. 25 is a diagram showing that 2D7 Diabody has a life-prolonging effect in a human myeloma mouse model. There was a significant difference (*: p ⁇ 0.05) between the vehicle administration group and the 2D7 Diabody administration group in the General Dani Wilcoxon test.
  • FIG. 26 is a diagram showing an analysis of the effect of 2D7DB on PBMC.
  • PH A-M Fig. 26A
  • ConA Fig. 26B
  • SAC Fig. 26C
  • FIG. 26D shows the results in the absence of mitogen
  • FIG. 26E shows the results in the positive control (ARH77). From the top, the results are shown with 2D7DB not added, 3 hours added calo, and 24 hours added.
  • Human myeloma cell lines (RPMI8226, K562, ARH77), human T-cell leukemia cell lines (Jurkat), FDC-Pl, HCI-16, and 2D7 hybridoma cell lines (Yuki of Tokushima University) are RPMI1640 medium (GIBCO BRL) containing 10% fetal calf serum (FCS).
  • Strain (IL-KM3, U266) is a medium in which 2 ng / ml IL-6 (R & D) was added to the same medium, and Ba / F3 was 2 ng / ml IL-3 (R & D) in the same medium.
  • Dne cultured in a medium supplemented with h3 ⁇ 4).
  • C0S7, 293T, HeLa, NIH3T3 and B0SC23 are DMEM media (GIBCO BRL ⁇ fc ⁇ ) containing 10% FCS, and CH0 is na-MEM media (GIBCO BRL) + 5% FCS or 10% FCS. Cultured.
  • the GFP gene region of the retrovirus vector pMX-GFP that packages the GFP gene into virus particles was cut out with EcoRI-Sail.
  • An adapter having a BstXI site on the sequence (FIG. 1) (synthesizing with an ABI DNA synthesizer, and then using in vitro) was inserted into this region to obtain pMX2.
  • the cDNA, and ⁇ to pMX2 vector cleaved with BstXI, ELECTRO MAX DH10B (GIBCO BRL ne: h3 ⁇ 4) to electroporation - was introduced by Chillon method (2. 5 KV, 200 ⁇ , 25 ⁇ ⁇ ). Then add 1 ml of S0C37. After incubating for 1 hour at C, 1 ml of 40% glycerol / LB + Am was calorie, a part was used for titer check, and the rest was stored at -80 ° C.
  • the obtained library was wound onto two 96-well plates at 200 ⁇ l / well (7% DMS0 / LB + Amp) so that there would be 1000 clones per well, 37.
  • the cells were cultured in C. Inoculate 4 ⁇ l (4000 clones) of this plate into LB medium (4 ml) containing ampicillin in a book. Was. This was used as one pool, and the same operation was performed for the remaining wells. Finally, 24 pools were prepared from the plates. After culturing each pool at 37 ° C, the DNA was prepared (QIAGEN: fc) and used for transfection into packaging cells. Plates used for inoculation were stored at -80 ° C until used for secondary screening.
  • B0SC23 cells which are retrowinores packaging cells, were seeded on a 6-well plate the day before the transfection at 6 ⁇ 10 5 cells / well 2 ml. Transfection was performed in the following procedure. 1 ⁇ l of plasmid DNA from each pool was mixed with 3 ⁇ l of FuGENE 6 Transfection Reagent (Roche Neyring), allowed to stand at room temperature for 20 minutes, and then added to the medium of B0SC23 cells seeded the previous day. After culturing at 37 ° C for 48 hours, the medium was recovered. Centrifuge at 3,000 rpm for 5 minutes and remove the dead cells to remove the virus. PT / JP2003 / 013063
  • NIH3T3 cells seeded on a 6-well plate at 1 ⁇ 10 5 cells / well 2 ml were cultured for 24 hours in 1 ml of Winoleth supplemented with 10 g / ml of poribrene (hexadimethrine bromide; sigma). Thereafter, 1.5 ml of a fresh medium was added, and the cells were further cultured for 48 hours, and then the gene expression was analyzed by FACS.
  • the gel was stained with silver (Daiichi Kagaku) according to the attached manual.
  • the gel after SDS-PAGE was transferred to ProBlott (Applied Biosystems), and Coomassie Blue staining solution (0.1% coomassie blue R-250 in 40% MetOH / l% acetic acid) ) For 1 minute. After washing several times with 50% MetOH, a target band was cut out, washed five times with 1 ml DDW, dried in vacuum, and applied to a peptide sequencer.
  • Each cell was spread on a 96-well plate at 1 ⁇ 10 6 cells / ml in the presence or absence of PMA (50 ng / ml; GIBC0 BRL) and PHA (10 ⁇ ⁇ / ml; GIBC0 BRL).
  • the cells were cultured for 48 hours after adding or not adding 2D7 antibody (10 g / ml) thereto. After the culture, the morphological changes of the cells were observed under a microscope. Viable cells measured, WST-8 (Cell Count Reagent SF; Nacalai tester) was added and after 2 hours at 37 ° C, 0D 45. The relative viable cell count was determined by measuring
  • Total RM was purified from 2D7 hybridoma (provided by the University of Tokushima) using Trizol by an ordinary method. Using 3 g of this RNA as type II, cDNA was synthesized using SMART RACE cDNA Amplification kit (CLONTECH) according to the attached manual. Using this cDNA as type III, variable regions of heavy chain and light chain were amplified by PCR using the following primers.
  • the amplified cDNAs encoding the variable regions were subcloned into pCR-T0P0 vector (manufactured by Invitrogen) and the nucleotide sequences (SEQ ID NOS: 1 and 3) were determined.
  • variable regions (VH, VL) of the heavy chain, light chain, and light chain were amplified using the following primers, respectively, by converting the plasmid into which each variable region cDNA was subcloned into type III.
  • 2D7DB-H1 5'-CCTGAATTCCACCATGCGATGGAGCTGGATCTTTC (SEQ ID NO: 11)
  • 2D7DB-H2 5'-AATTTGGCTACCGCCTCCACCTGAGGAGACTGTGAGAGTGGTGCCCT (SEQ ID NO: 12)
  • 2D7DB-L1 5'-TCCTCAGGTGGAGGCGGTAGCCAAATTGTTCTCACCCAGTCGCCAGC (SEQ ID NO: 13)
  • 2D7DB-L2 5'-ATTGCGGCCGCTTATCACTTATCGTCGTCATCCTTGTAGTCTTTTATCTCCAACTTTGTC CCCGAGCC (SEQ ID NO: 14)
  • VH and VL cDNAs were mixed in a single tube and subjected to a PCR reaction.
  • This PCR product was converted into type III, and the PCR reaction was performed again using 2D7DB-Hl and 2D7DB-L2 as primers, and cDNAs in which VH and VL were ligated with a 5-mer linker (SEQ ID NO: 5) was synthesized.
  • This cDNA was digested with EcoRI-Notl and inserted between EcoRI-Notl of animal cell expression vector PCXND3. After confirming the nucleotide sequence, the construction of 2D7 Diabody expression vector pCXND3-2D7DB was completed.
  • 2D7DB in the culture supernatant was confirmed by Western blot. That is, an equal volume of 2XSDS-PAGE Sample buffer is added to a part of the culture supernatant, and the cells are lys is buffer (0.5% Nonidet P-40, 10 mM Tris, pH 7.6, 150 mM NaCl). , 5 mM EDTA), and the mixture was centrifuged to remove the insolubilized protein to prepare a cell lysate. To this was added an equal volume of 2XSDS-PAGE Sample buffer. After SDS-PAGE, each sample was transferred to a PVDF membrane, and the expression of 2D7 Single chain was detected with an anti-FLAG antibody.
  • CH0 cells 20 g of pCXND3-2D7DB which had been cut with Pvul and linearized was introduced into CH0 cells (DXB11 strain) by the electoporation method as follows.
  • the CH0 cells were washed twice with ice-cold PBS, and then suspended in PBS so as to have a concentration of 1 ⁇ 10 7 cells / ml. This was mixed with 20 / zg of the above plasmid, and an electric pulse (1.5 KV, 25 ⁇ FD) was applied.
  • the cells were diluted at an appropriate ratio, seeded on a 10 cm dish, and cultured in the presence of a final concentration of 500 ⁇ g / ml G418 (GIBCO BRL).
  • the subconfluent 2D7DB high-producing CH0 cell line was removed with Trypsin-EDTA and then transferred to a roller bottle (MEM Q; without nucleotide + 5% FCS 250 ml). After 4 days, the culture was removed and washed twice with PBS. Thereafter, in order to eliminate serum, the culture medium was replaced with 250 ml of CH0-S-SFMII medium (GIBCO BRL) and cultured for 3 days, after which the culture supernatant was recovered. After removing dead cells by centrifugation, this was used for purification through a filter.
  • Single chain Fv was purified as follows. First, the culture supernatant collected on the Anti-Flag M2 column was applied and adsorbed. After washing this with Buffer A (50 mM Tris-HCl pH7 4, 150 mM NaCl, 0.01% Tween 20), single chain Fv was washed with Buffer B (100 mM Glycine H3 5, 0.01% Tween 20). Eluted. The collected sample was immediately neutralized with Tris-HCl pH 8.0 to a final concentration of 25 mM. This was subsequently used for gel filtration purification on a Superde x200HR (26/60) column. The dimer fraction of Single chain Fv was collected in PBS containing 0.01% Tween 20. A part of the collected sample was subjected to SDS electrophoresis and silver staining, and after confirming that the target protein was purified, this was concentrated to obtain a purified 2D7 Diabody sample.
  • Buffer A 50 mM Tris-HCl pH7 4, 150
  • adherent cells In the case of adherent cells (HeLa), the cells were adhered by dispersing the cells on a 6-well plate at 2 ⁇ 10 5 cells / well and culturing overnight. Thereafter, the purified 2D7DB was added to the culture solution.
  • Each cell was plated on a 96-well plate at a cell concentration of 1-2 ⁇ 10 4 cells / well. To this was added 2D7DB to an appropriate concentration, and after culturing for 3 days, the number of cells was measured. The number of viable cells was measured using WST-8. In other words, this reagent is After adding to the cells and incubating at 37 ° C for 1.5 hours, spectrophotometer 0D 45 . The relative viable cell count was determined by measuring. Growth inhibition rate was calculated by (1- (0D 450 of 2D7DB treated cells / OD 450 of 2D7DB untreated cells)) X 100.
  • ARH77 and Jurkat cells are seeded in a 6-well plate at a cell concentration of 2 ⁇ 10 6 cells / well, and purified in each well.2D7DB at a final concentration of 2 / zg / ml.
  • Actinomycin D was added to a final concentration of 1 / g / ml (Fiber 77) or 5 / g / ml (Jurkat) to induce cell death.
  • a 1-well without any addition was used as control.
  • the cells were collected, washed once with PBS, and lysed with lysis buffer (10 mM Tris ⁇ 7.5, 10 mM EDTA, 0.5% Triton X-100). Subsequently, after insoluble protein was removed by centrifugation, this was treated withase A and proteinase K. Thereafter, a portion of this was electrophoresed on an agarose gel to detect chromatin DNA fragmentation.
  • ARH77 cells were seeded on a 24-well plate at a concentration of 5 ⁇ 10 5 cells / well, and cytochalasin D (manufactured by sigma) was added to a final concentration of 20 / xg / ml. A well to which only ethanol was added was used as a control. After culturing for 1 hour, purified 2D7DB was added at each concentration (0, 200, 500, lOOng / ml), and culturing was continued for another 4 hours. Thereafter, the cells were collected and stained with PI to detect the percentage of dead cells.
  • 2D7DB was added at a concentration of 1 ⁇ g / ml to ARH77 cells treated / untreated with cytochalasin D, cultured at 37 ° C for 15 minutes, and then attached to a slide glass by cytospin. After immersing the cells in methanol at -20 ° C for 15 minutes to fix the cells, the cells were blocked with a blocking buffer (3% BSA / PBS) at 4 ° C for 1 hour. Thereafter, 1% BSA / PBS CY3-labeled anti-Akuchin antibody diluted 100-fold in a (sigma Corp.) was reacted at room temperature for 1 hour, the cell nuclei were stained with Ho ec hst33258 subsequently. After several washes with PBS, confocal Cells were observed with a laser scanning microscope (Olympus).
  • 2D7 antigen expression in various animal cells was analyzed by FACS to determine the cell line to be used as a source and the host cell for cDNA expression library production ( Figure 2A and Figure 2A). 2B).
  • very strong expression of the 2D7 antigen was observed in lymphoid tumor cell lines RPMI8226, U266, and Jurkat in human-derived blood cells, but weak expression was observed in K562.
  • Ba / F3, FDC-P1, and HCI-16 which are mouse-derived blood cells, showed very low strength and expression due to differences in species.
  • expression was also observed in C0S7, 293T, and HeLa. Almost no expression was observed in mouse NIH3T3 cells.
  • the cDNA library S0URCE used for expression cloning was RPMI8226 cells, and the host cell used for screening by introducing the expression library was NIH3T3 cells.
  • Cell lysate was prepared from RPMI8226 cells expressing the 2D7 antigen, U266 cells, and NIH3T3 cells not expressing the 2D7 antigen, and immunoprecipitated with the 2D7 antibody.
  • a molecule ( ⁇ 12 kD) force S that was specifically precipitated in RPMI8226, U266 cells was confirmed (FIG. 3).
  • this molecule was not detected by western blot with the 2D7 antibody, it was precipitated with good reproducibility at least with the 2D7 antibody, so it was strongly expected that the molecule was the 2D7 antigen itself or a coprecipitated molecule with the 2D7 antigen.
  • this band was cut out after being stained with a coomassie, and subjected to a peptide sequence.
  • the identity of this 12 kD molecule was found to be / 32 microglobulin (/ 32 M). Since ⁇ 2 ⁇ is one of the class IMHC protein complexes that associate non-covalently with HLA class I, it is considered that 2M was co-precipitated as an HLA complex by the 2D7 antibody.
  • HLA class I contains al, ⁇ 2 domain, ⁇ Pi consists alpha 3 domain that binds / 32M. Since the 2D7 antibody can co-precipitate the molecule, it is expected that the 2D7 antibody recognizes the 1-o; 2 domain of HLA class I as an epitope.
  • CDNA was synthesized by random hexamer from mRNA purified from RPMI8226 expressing 2D7 antigen. This was inserted into a retrovirus vector pMX2 to prepare a retrovirus expression library. Examination of the library titer revealed a total of 6 x 10 6 clones. In addition, 24 clones were randomly picked from this library and the insert size was examined by colony PCR. As a result, it was found that the cDNA average length was about 1.5 kb. Therefore, it was determined that the produced expression library was sufficiently usable for expression clones.
  • FIGS. 4A and 4B show the flow of the following screening.
  • 4,000 independent clones were used as one pool to prepare 24 pools (equivalent to 96,000 clones), and each plasmid was transfected into B0SC23 cells and packaged into a retrovirus.
  • the resulting viruses from each pool were then used to infect NIH3T3 cells.
  • Three days after infection, cells were detached, stained with 2D7 antibody, and analyzed for expression by FACS. As a result, 3 out of 24 pools showed 2D7-positive cells compared to NIH3T3 cells infected with an empty vector-derived virus (control) (pools 4, 13, 21). ).
  • the pool was spread on an LB plate, and one of the 64 mouthpieces was picked up one by one and inoculated in a 96-well plate with 1-well.
  • Eight pools (1 to 8) were prepared using eight clones in the vertical row as one pool, and eight pools (A to H) were prepared using eight clones in the horizontal row as one pool, and the fifth screening was performed.
  • pools 3, 4, 6, and 8 and pools E, F, and G were positive.
  • 12 positive candidate clones could be narrowed down (Fig. 6A).
  • FACS was performed on these 12 clones, and finally 4 positive clones (3F, 4G, 6E, 8G) were identified as a single clone recognized by the 2D7 antibody (Fig. 6B).
  • HLA-A is classified into dozens of haplotypes.
  • haplotype of HLA class I A * 6802 was identified as a 2D7 antigen.
  • the 2D7 antibody was able to recognize a fairly wide range of cell types. Only the haplotype of class I happened to be A * 6802, and the 2D7 antibody was considered to be an antibody that recognizes HLA class I molecules including all haplotypes.
  • K562 and Jurkat cells were seeded in the presence or absence of PHA and PMA, and 2D7 antibody was added thereto at 10 ⁇ g / ml. The cells were observed 24 hours later.As a result, no significant difference was observed in the presence or absence of the 2D7 antibody in K562 cells that were slightly positive for 2D7, but in Jurkat cells that strongly express 2D7, Prominent cell aggregation was observed 2003/013063
  • the DNA encoding the 2D7 variable region was cloned by the 5 ′ RACE method.
  • the nucleotide sequences of the obtained PCR products are as shown in SEQ ID NOs: 1 and 3.
  • a single chain was constructed based on this sequence.
  • the 2D7 single chain is composed of the heavy chain Jedder sequence, the heavy chain variable region, and the light chain variable region with a 5-mer linker (GGGGS) in between, followed by And a cDNA encoding flag-tag (SEQ ID NO: 5).
  • 2D7 Diabody is thought to form the structure shown in Fig. 10B by dimerizing this single chain.
  • the 2D7 Diabody expression vector was transfected into C0S7 cells, and the culture supernatant was collected 3 days later. Perform SDS-PAGE of the culture supernatant and cell lysate, and use anti-Flag-tag antibody As a result of stern blot, it was confirmed that 2D7 single chain was secreted into the culture supernatant (FIG. 10C).
  • This culture supernatant was added to Jurkat cells at a rate of 50%, and several days later, the cells were stained with PI and Annexin V to determine the percentage of dead cells.
  • the addition of the anti-BST-1 antibody and the 2D7 antibody (5 ⁇ g / ml each) alone did not show significant changes in the apoptosis markers. No change was observed in the culture supernatant of C0S7 transfected with the vector alone.
  • a clear induction of cell death was observed (FIG. 11A and FIG. 11B).
  • 2D7DB acts specifically on HLA class IA
  • a similar experiment was performed using K562 cells that are known not to express HLA class IA.
  • 2D7DB showed cell death-inducing activity on Jurkat cells, but had no effect on K562 cells (FIGS. 12A and 12B). This strongly supports that the cell death-inducing activity of 2D7DB is an effect that targets its epitope, HLA class IA.
  • Jurkat cells tended to have a slightly higher sensitivity to 2D7DB in cells stimulated with con A than in other data.
  • the growth inhibitory effect of the purified 2D7DB on various cell lines was analyzed. 3 days after adding 2D7DB at 0, 0.5, 1.0, 2.0 ⁇ g / ml The number of cells was measured. As a result, it was found that these cells inhibited cell growth in a concentration-dependent manner (Fig. 14).
  • 2D7DB had no effect on HeLa cells, adherent cells, under the same conditions, even though these cells stained very well with the 2D7 antibody (Fig. 15D). This suggests that 2D7DB may specifically act only on floating cells such as blood cells.
  • 2D7DB strongly induces cell death, and thus a sufficient drug effect can be expected even with a short half-life in blood. Furthermore, if the w-hole antibody had a strong cell death-inducing activity, there would be a concern about safety due to the long half-life in blood. Can be rearranged.
  • Cytochalasin D (20 ug / ml) or Ethanore only (control ) was added and 1 hour later 2D7DB was added at each concentration. After incubating for 4 hours after addition of 2D7DB, the cells were collected and subjected to PI staining to measure the percentage of dead cells (FIG. 22). As a result, it was found that pretreatment of cells with cytochalasin D abolished the sensitivity to 2D7DB.
  • the human myeloma mouse model was prepared as follows. Prepare ARH77 cells (ATCC) in RPMI1640 medium (GIBCO BRL) containing 10% fetal bovine serum (GIBC0 BRL) at 2.5 x 10 7 ZmL, and prepare the anti-Asialo GM1 antibody the day before. (200 mg L (5 x 10 6 cells / mice)) of the above ARH77 cell suspension was injected into the tail vein of SCID mice (Os, 6 weeks old, CLEA Japan) into which 0.2 mg was administered internally (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) More injected.
  • 2D7diabody was administered, and the concentration was adjusted to 0.8 mg / mL using filter-sterilized PBS (-) to prepare a sample for administration.
  • the antitumor effect of the 2D7diabody on a human myeloma mouse model was evaluated based on the change in the amount of human IgG (M protein) produced by the myeloma cells in the serum of the mouse and the survival time.
  • human IgG M protein
  • serum was collected 24 days after ARH77 cell transplantation, and the amount of human IgG was measured using the ELISA described in (4) above.
  • the serum human IgG (M protein) level was increased to about 74 ⁇ g / mL in the vehicle administration group, while it was significantly lower in the 2D7diabody administration group than in the control group (P ⁇ 0.005, Unpaired t-test) showed that 2D7diabody very strongly suppressed the growth of ARH77 cells ( Figure 24).
  • the 2D7diab 0 dy administration group had a significant survival time compared to the vehicle administration group. was extended.
  • 2D7diabody has an antitumor effect on a human myeloma mouse model.
  • Antitumor effect of 2D7diab 0 dy of the present invention is believed to be based on the cell death induced effects which the antibody has.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • the present invention is expected to provide a low-molecular-weight antibody having a high specific activity.
  • a low-molecular-weight antibody By using such a low-molecular-weight antibody, sufficient drug efficacy can be expected even with a short half-life, and further, it is expected that a difference between drug efficacy and toxicity can be achieved.
  • the overall cost can be reduced, such as by reducing clinical doses and production costs, it is also expected to improve the economic problems that are a problem in the development of antibody drugs.

Abstract

本発明者らは、2D7抗体の抗原を同定することを目的として、2D7抗原のクローニングを行った。その結果、2D7抗原はHLA class I分子であることが示唆された。本発明者らは、この知見に基づき、2D7抗体が細胞死誘導活性を有するか否かを検討した。その結果、2D7抗体をさらに別の抗体でクロスリンクすることで核の断片化が観察され、細胞死が誘導されることが分かった。さらに、2D7抗体のDiabodyは、さらに別の抗体を添加しなくても非常に強力な細胞死誘導活性を有することが判明した。以上の結果は、HLAを認識する抗体の低分子化抗体が細胞死誘導剤として利用できることを示している。

Description

明細書 細胞死誘導剤 本発明は、 HLAを認識する抗体の低分子化抗体に関する。 背景技術
HLA class I抗原は、 3つのドメイン （o; l、 2 , a 3 ) からなる 45KDの α 鎖と、 12KDの 2ミクログロブリンのヘテロダイマーによって形成される。 HLA 分子の主な役割は、 細胞の中で作られる 8〜10程度のァミノ酸でできた抗原ぺプ チドを CD8+T細胞に提示することであり、 これによつて誘導される免疫応答や免 疫寛容に非常に重要な役割を担っている。
また、 HLA class IA抗原の抗体によるライゲーシヨンで、 細胞増殖抑制や細胞 死誘導効果がリンパ球細胞において観察されており、 HLA分子のシグナル伝達分 子としての可能性も示唆されている。
すなわち、 例えばヒト HLA class IAの α 1 ドメインに対する抗体 Β9. 12. 1、 α 2 ドメインに対する抗体 W6/32、 a Z ドメインに対する抗体 TP25. 99, A1. 4は、 活' 14 化リンパ球に対して細胞増殖を抑制するとの報告がある （非特許文献 1 , 2 ) 。 また、 α ΐ ドメインに対する二種類の抗体 MoAb90, YTH862は、 活性ィ匕リンパ球に 対してアポトーシスを誘導することが報告されている （非特許文献 2， 3 , 4 ) 。 この 2つの抗体によって誘導されるアポトーシスはカスパーゼを介した反応であ ることが明らかにされており （非特許文献 4 ) 、 このことからリンパ細胞で発現 する HLA class IA抗原は、 アポトーシスの信号伝達にも関与していると推測され ている。
さらに、 ヒト HLA class IAの α 3 ドメインに対する抗体 5Η7 (非特許文献 5 ) 、 マウス HLA class IAの α 2 ドメインに対する抗体 RE2 (非特許文献 6 ) も、 活性 一 2 - 化リンパ球などに細胞死を誘導することが報告されている。 しかしながら前出の アポト一シス誘導抗体 MoAb90や YTH862とは違い、 これらの抗体によって誘導さ れる細胞死は、 いずれもカスパーゼを介さないことが示されている。 このこと力 ら、 5H7や RE2による細胞死は、 従来知られているアポトーシスの機構とはまつ たく異なるタイプの細胞死であると推測されている。
以上のように、 抗 HLA抗体による細胞増殖抑制、 細胞死誘導作用に関する報告 はこれまで複数なされている。 ただし、 ここで利用されている抗体の分子形態は いずれも IgG抗体、 もしくは F(ab' ) 2、 Fabであり、 また F (ab，）2や Fabのように 抗体を低分子化することで、 細胞死誘導活性が上昇したとの知見は今のところな い。
一方 2D7抗体は、 ヒトミエローマ細胞を Balb/cマウスに免疫して得たマウスモ ノクローナル抗体である （非特許文献 7 ) 。 これまで 2D7抗体が、 種々のリンパ 系腫瘍細胞の細胞表面に高い特性を持って結合することは確認されていたが、 2D7 抗体が認識する抗原については同定されてはいなかった。
なお、 本出願の発明に関連する先行技術文献情報を以下に示す。
〔非特許文献 1〕 Fayen et al. , Int. Immunol 10： 1347 - 1358 (1998) 〔非特許文献 2〕 Genestier et al.， Blood 90: 3629-3639 (1997)
〔非特許文献 3〕 Genestier et al. , Blood 90： 726-735 (1997)
〔非特許文献 4〕 Genestier et al.， J. Biol. Chem. 273： 5060-5066 (1998) 〔非特許文献 5〕 Woodle et al. , J. Immunol. 158 : 2156-2164 (1997)
〔非特許文献 6〕 Matsuoka et al. , J. Exp. Med. 181： 2007-2015 (1995) 〔非特許文献 7〕 Goto, et al. Blood 84： 1922 (1994) 発明の開示
本発明の第一の目的は、 HLA class IAを認識する抗体の低分子化抗体を提供す ることにある。 本発明のさらなる目的は、 この低分子化抗体を利用した新たな腫 瘍または自己免疫疾患の治療剤を提供することにある。
本発明者らは、 2D7抗体の抗原を同定することを目的として、 まず、 2D7抗原発 現細胞 RPMI8226より精製した mRNAから、 ランダムへキサマーにより cDNAを合成 した。 これをレトロウイルスベクター pMXに挿入し、 レトロウイルス発現ライプ ラリーを作製した。 該レトロウイルス発現ライプラリーを B0SC23細胞にトランス フエクトすることでレトロウイルスにパッケージングした。 その後得られたウイ ルスを NIH3T3細胞に感染させ、 2D7抗体で染色した後、 FACSにより発現解析を行 うことで、 2D7抗原のスクリーニングを行った。 さらに、 2D7抗原を発現している RPMI8226細胞、 および、 U266細胞により cell lysateを調整し、 免疫沈降法によ り 2D7抗原の同定を行った。 これらの検討の結果、 2D7抗原は HLA class I分子 であることが判明した。
2D7抗体が認識する分子が HLA class IAであったことから、 本発明者らは、 2D 7抗体が細胞死誘導活性を有する力否かを検討した。 具体的には、 Jurkat細胞に 2D7存在下あるいは非存在下で、 さらに抗マウス IgG抗体を加え培養を行い、 48 時間後、 細胞核を H0echst33258で染色し、 死細胞に特徴的な細胞核の断片化が認 められる力観察した。 その結果、 Jurkat細胞において、 2D7抗体単独ではほとん ど細胞死誘導活性が検出されなかったが、 さらに抗マウス IgG抗体でクロスリン クすることで核の断片化が観察され、 細胞死が誘導されることが分かった。
このように 2D7抗体による細胞死誘導には抗マゥス IgG抗体によるクロスリン クが必要であるため、 腫瘍または自己免疫疾患に対する 2D7抗体の臨床応用は難 しい。 そこで、 本発明者らは、 細胞死誘導に対する 2D7抗体の低分子化の効果を 検討した。 具体的には、 ハイプリドーマより 2D7抗体の可変領域をコードする遺 伝子をクローユングし、 遺伝子改変技術により 2D7抗体の Diabody化を行い、 細 胞死誘導活性に対する効果を検討した。 その結果、 驚くべきことに、 Diabody化 した 2D7抗体は、 抗マウス IgG抗体によるクロスリンクを行わなくても、 非常に 短時間かつ低い用量で強力な細胞死誘導活性を示した。 また、 該 Diabodyは、 正 常末梢血由来リンパ球や、 付着細胞にはほとんど作用せず、 各種ミエローマ細胞 や T細胞白血病細胞株、 活性ィヒリンパ球に対してのみ特異的に細胞死を誘導した。 以上の結果は、 HLAを認識する抗体の低分子化抗体が細胞死誘導剤として利用で きることを示している。
即ち、 本発明は、 以下の 〔1〕 〜 〔2 3〕 を提供するものである。
〔1〕 ヒト白血球抗原 (HLA) を認識する低分子化抗体。
〔 2〕 HLAが HLA class Iである、 〔 1〕 に記載の低分子化抗体。
〔3〕 HLA class Iが HLA- Aである、 〔 2〕 に記載の低分子化抗体。
〔 4〕 2D7抗体の低分子化抗体。
〔5〕 低分子化抗体が Diabodyである 〔1〕 〜 〔4〕 のいずれかに記載の低分 子化抗体。
〔6〕 以下の （a ) 〜 （d ) のいずれかに記載の低分子化抗体。
( a ) 配列番号： 6に記載のァミノ酸配列を有する低分子化抗体。
( b ) 配列番号： 6に記載のァミノ酸配列において 1もしくは複数のァミ ノ酸配列が置換、 欠失、 揷入、 および/または付加したアミノ酸配列 を有する低分子化抗体であって、 （ a )に記載の低分子化抗体と機能的 に同等な低分子化抗体。
( c ) 配列番号： 2の CDRおよぴ配列番号： 4の CDRのァミノ酸配列を有 する低分子化抗体。
( d ) 配列番号： 2の CDRおよび配列番号： 4の CDRのァミノ酸配列にお いて、 1もしくは複数のアミノ酸配列が置換、 欠失、 挿入、 およひブ または付加したアミノ酸配列を有する低分子化抗体であって、 （c ) に記載の低分子化抗体と機能的に同等な低分子化抗体。
〔7〕 HLAを認識する抗体を低分子ィヒすることによって、 活性が上昇した抗体 を製造する方法。
〔 8〕 HLAが HLA class Iである、 〔 7〕 に記載の方法。 〔 9〕 HLA class Iが HLA - Aである、 〔 8〕 に記載の方法。
〔10〕 2D7抗体を低分子化することによって、 活性が上昇した抗体を製造す る方法。
〔11〕 低分子化が Diabody化である、 〔7〕 〜 〔10〕 のいずれかに記載の 方法。
〔12〕 活性が細胞死誘導活性又は細胞増殖抑制活性である、 〔7〕 〜 〔1
1〕 のいずれかに記載の方法。
〔13〕 〔1〕 〜 〔6〕 のいずれかに記載の低分子化抗体、 〔7〕 〜 〔12〕 のいずれかに記載の方法によって製造される低分子化抗体、 または 2D7 抗体を有効成分として含有する、 細胞死誘導剤。
〔14〕 B細胞または T細胞に対する細胞死誘導であることを特徴とする、
〔13〕 に記載の細胞死誘導剤。
〔15〕 B細胞または T細胞が、 活性化 B細胞または活性化 T細胞である、 〔14〕 に記載の細胞死誘導剤。
〔16〕 〔1〕 〜 〔6〕 のいずれかに記載の低分子化抗体、 〔7〕 〜 〔12〕 のいずれかに記載の方法によって製造される低分子化抗体、 または 2D7 抗体を有効成分として含有する、 細胞増殖抑制剤。
〔17〕 〔1〕 〜 〔6〕 のいずれかに記載の低分子化抗体、 〔7〕 〜 〔12〕 のいずれかに記載の方法によって製造される低分子化抗体、 または 2D7 抗体を有効成分として含有する、 抗腫瘍剤。
〔18〕 腫瘍が血液腫瘍である 〔17〕 に記載の抗腫瘍剤。
〔19〕 〔1〕 〜 〔6〕 のいずれかに記載の低分子化抗体、 〔7〕 〜 〔12〕 のいずれかに記載の方法によって製造される低分子化抗体、 または 2D7 抗体を有効成分として含有する、 自己免疫疾患治療剤。
〔20〕 抗体が Diabodyである 〔13〕 〜 〔15〕 のいずれかに記載の細胞死 誘導剤。 〔2 1〕 抗体が Diabodyである 〔1 6〕 に記載の細胞増殖抑制剤。
〔2 2〕 抗体が Diabodyである 〔1 7.〕 または 〔1 8〕 に記載の抗腫瘍剤。
〔2 3〕 抗体が Diabodyである 〔1 9〕 に記載の自己免疫疾患治療剤。
本発明は、 HLAを認識する低分子化抗体を提供する。 本発明における低分子化 抗体は、 活性が上昇している点で有用である。 ここで、 活性とは、 抗体が抗原に 結合することにより生じる生物学的作用をいう。 具体的な例としては、 細胞死誘 導作用、 アポトーシス誘導作用、 細胞増殖抑制作用、 細胞分化抑制作用、 細胞分 裂抑制作用、 細胞増殖誘導作用、 細胞分化誘導作用、 細胞分裂誘導作用、 細胞周 期調節作用などを挙げることができるが、 好ましくは細胞死誘導作用、 細胞増殖 抑制作用である。
細胞死誘導作用、 細胞増殖抑制作用などの上記作用の対象となる細胞は特に限 定されないが、 血球系細胞や浮遊細胞が好ましい。 血球系細胞の具体的な例とし ては、 リンパ球 （B細胞、 T細胞） 、 好中球、 好酸球、 好塩基球、 単球 （好ましく は活性化した末梢血単核球 (peripheral blood mononuclear cell、 PBMC) ) 、 ミエ ローマ細胞などを挙げることができるが、 リンパ球 （B細胞、 T細胞） 、 ミエロー マ細胞が好ましく、 T細胞または B細胞 （特に活性化した B細胞または活性化し た T細胞） が最も好ましい。 浮遊細胞は、 細胞を培養した際、 細胞がガラスゃプ ラスチックなどの培養器の表面に付着することなく、 浮遊状で増殖する細胞であ る。 これに対し、 接着細胞 （付着細胞） とは、 細胞を培養した際、 ガラスやブラ スチックなどの培養器の表面に付着する細胞である。
本発明においては、 上記 HLAを認識する低分子ィ匕抗体を投与することにより、 例えば、 血液腫瘍 （造血器腫瘍） などの腫瘍 （具体的な例として、 白血病、 骨髄 異形成症候群、 悪性リンパ腫、 慢性骨髄性白血病、 形質細胞異常症 （骨髄腫、 多 発性骨髄腫、 マクログロプリン血症） 、 骨髄増殖性疾患 （真性赤血球増加症、 本 態性血小板血症、 特発性骨髄繊維症） など） や自己免疫疾患 （具体的な例として、 リウマチ、 自己免疫性肝炎、 自己免疫性甲状腺炎、 自己免疫性水疱症、 自己免疫 性副腎皮質炎、 自己免疫性溶血性貧血、 自己免疫性血小板減少性紫斑病、 自己免 疫性萎縮性胃炎、 自己免疫性好中球減少症、 自己免疫性精巣炎、 自己免疫性脳脊 髄炎、 自己免疫性レセプター病、 自己免疫不妊、 クローン病、 全身性エリテマト 一デス、 多発性硬化症、 パセドウ病、 若年性糖尿病、 アジソン病、 重症筋無力症、 水晶体性プドウ膜炎、 乾癬、 ベーチェット病など） のような疾患の治療、 予防な どをおこなうことが可能である。
本発明において、 HLAとは、 ヒト白血球抗原を意味する。 HLA分子は class Iと class IIに分類され、 class Iとしては HLA— A、 B、 C、 E、 F、 G、 H、 Jなどが知ら れており、 class IIとしては HLA-DR、 DC！、 DPなどが知られている。 本発明の抗 体が認識する抗原は HLA分子であれば特に制限されないが、 好ましくは class I に分類される分子であり、 より好ましくは HLA- Aである。
本発明において低分子化抗体とは、 全長抗体 (whole antibody, 例えば whole I gG等）の一部分が欠損している抗体断片を含み、 抗原への結合能を有していれば 特に限定されない。 本発明の抗体断片は、 全長抗体の一部分であれば特に限定さ れないが、 重鎖可変領域 (VH) 又は軽鎖可変領域 (VL) を含んでいることが好ま しく、 特に好ましいのは VHと VLの両方を含む断片である。 抗体断片の具体例と しては、 例えば、 Fab、 Fab，、 F(ab，）2、 Fv、 scFv (シングルチェイン Fv) 、 など を挙げることができるが、 好ましくは scFv (Huston, J. S. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. (1988) 85, 5879—5883、 Plickthun 「The Pharmacology of Monoclonal AntibodiesJ Vol. 113， Resenburg及ぴ Moore ¾, Springer Verlag, New York, pp. 269-315, (1994) )である。 このような抗体断片を得るには、 抗体 を酵素、 例えば、 パパイン、 ペプシンなどで処理し抗体断片を生成させるか、 又 は、 これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、 これを発現ベクターに導入し た後、 適当な宿主細胞で発現させればよい （例えば、 Co, M. S. et al. , J. Immu nol. (1994) 152, 2968-2976 ； Better, M. and Horwitz, A. H. , Methods Enzym ol. (1989) 178， 476-496 ； Pluckthun, A. and Skerra, A. , Methods Enzymol. (1989) 178， 497-515 ； Lamoyi, E.， Methods Enzymol. (1986) 121, 652 - 663 ； Rousseaux, J. et al. , Methods Enzymol. (1986) 121, 663-669 ； Bird, R. E. and Walker, B. W.， Trends Biotechnol. (1991) 9, 132-137参照） 。
本発明における低分子化抗体は、 全長抗体よりも分子量が小さくなることが好' ましいが、 例えば、 ダイマー、 トリマー、 テトラマーなどの多量体を形成するこ と等もあり、 全長抗体よりも分子量が大きくなることもある。
本発明において好ましい低分子化抗体は、 抗体の VHを 2つ以上及び VLを 2つ 以上含み、 これら各可変領域を直接あるいはリンカ一等を介して間接的に結合し た抗体である。 結合は、 共有結合でも非共有結合でもよく、 また、 共有結合と非 共有結合の両方でよい。 さらに好ましい低分子化抗体は、 VHと VLが非共有結合 により結合して形成される VH - VL対を 2つ以上含んでいる抗体である。 この場合、 低分子化抗体中の一方の VH-VL対と他方の VH-VL対との間の距離が、 全長抗体に おける距離よりも短くなる抗体が好ましい。
本発明において特に好ましい低分子化抗体は Diabodyである。 Diabodyは、 可 変領域と可変領域をリンカ一等で結合したフラグメント （例えば、 scFv等） （以 下、 Diabodyを構成するフラグメント） を 2つ結合させて二量体ィヒさせたもので あり、 通常、 2つの VLと 2つの VHを含む（P. Holliger et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 6444-6448 (1993)、 EP404097号、 W093/11161号、 Johnson et al. , Method in Enzymology, 203, 88-98， （1991)、 Holliger et al.， Protein Engin eering, 9, 299-305, (1996)、 Perisic et al. , Structure, 2, 1217-1226, (199 4)、 John et al.， Protein Engineering, 12 (7) , 597-604， （1999)、 Holliger et al, . Proc. Natl. Acad. Sci. USA. , 90， 6444-6448, (1993)、 Atwell et al.， Mol. Immunol. 33, 1301-1312, (1996) )。 Diabodyを構成するフラグメント間の結合は 非共有結合でも、 共有結合でよいが、 好ましくは非共有結合である。
また、 Diabodyを構成するフラグメント同士をリンカ一などで結合して、 一本 鎖 Diabody (scDiabody) とすることも可能である。 その際、 Diabodyを構成する フラグメント同士を 20アミノ酸程度の長いリンカ一を用いて結合すると、 同一鎖 上に存在する Diabodyを構成するフラグメント同士で非共有結合が可能となり、 二量体を形成する。
Diabodyを構成するフラグメントは、 VLと VHを結合したもの、 VLと VLを結合 したもの、 VHと VHを結合したもの等を挙げることができるが、 好ましくは VHと VLを結合したものである。 Diabodyを構成するフラグメント中において、 可変領 域と可変領域を結合するリンカ一は特に制限されないが、 同一フラグメント中の 可変領域の間で非共有結合がおこらない程度に短いリンカーを用いることが好ま しい。 そのようなリンカ一の長さは当業者が適宜決定することができるが、 通常 2〜： 14アミノ酸、 好ましくは 3〜9アミノ酸、 特に好ましくは 4〜6アミノ酸であ る。 この場合、 同一フラグメント上にコードされる VLと VHとは、 その間のリン カーが短いため、 同一鎖上の VLと VHの間で非共有結合がおこらず、 単鎖 V領域 フラグメントが形成されない為、 他のフラグメントとの非共有結合による二量体 を形成する。 さらに、 Diabody作製と同じ原理で、 Diabodyを構成するフラグメン トを 3つ以上結合させて、 トリマー、 テトラマーなどの多量体ィ匕させた抗体を作 製することも可能である。
本発明における Diabodyとしては、 配列番号： 6に記載のアミノ酸配列を有す る Diabodyまたは配列番号： 6に記載のァミノ酸配列において 1もしくは複数の アミノ酸配列が変異 （置換、 欠失、 揷入、 および/または付加） したアミノ酸配 列を有する Diabodyであって、 配列番号： 6に記載の配列を有する Diabodyと機 能的に同等な Diabodyや、 配列番号： 2の CDR (又は可変領域） および配列番 号： 4の CDR (又は可変領域） のアミノ酸配列を有する Diabodyまたは配列番 号： 2の CDR (又は可変領域） および配列番号： 4の CDR (又は可変領域） のアミ ノ酸配列において 1もしくは複数のアミノ酸配列が変異 （置換、 欠失、 揷入、 お よび Zまたは付加） したアミノ酸配列を有する Diabodyであって、 配列番号： 2 の CDR (又は可変領域） および配列番号： 4の CDR (又は可変領域） の配列を有す る Diabodyと機能的に同等な Diabodyを例示できるが、 これらに限定されるもの ではない。
ここで 「機能的に同等」 とは、 対象となる Diabodyカ、 配列番号： 6に記載の 配列を有する Diabody、 または配列番号： 2の CDR (又は可変領域） および配列番 号： 4の CDR (又は可変領域） の配列を有する Diabodyと同等の活性 （例えば、 H LA- Aへの結合活性、 細胞死誘導活性など） を有することを意味する。
変異するアミノ酸数は特に制限されないが、 通常、 30アミノ酸以内であり、 好 ましくは 15アミノ酸以内であり、 さらに好ましくは 5アミノ酸以内 （例えば、 3 アミノ酸以内） であると考えられる。
また、 配列番号： 6に記載のァミノ酸配列を有する Diabodyまたは、 配列番 号： 2の CDR (又は可変領域） および配列番号： 4の CDR (又は可変領域） の配列 を有する Diabodyを、 ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として ヒト化、 キメラ化してもよい。
配列番号： 2に記載されているアミノ酸配列で、 1番目〜 134番目が可変領域に 相当し、 50番目〜 54番目が CDR1、 69番目〜 85番目が CDR2、 118番目〜 134番目 が CDR3に相当する。 配列番号： 4に記載されているァミノ酸配列で、 1番目〜 12 8番目が可変領域に相当し、 46番目〜 55番目が CDR1、 71番目〜 77番目が CDR2、 110番目〜 128番目が CDR3に相当する。
本発明において HLAを認識する低分子化抗体は、 HLAに特異的に結合し、 生物 学的作用を有していれば特に制限されない。 本発明の低分子化抗体は、 当業者に 公知の方法により作製することが可能である。 例えば、 実施例に記載されている ように、 HLAを認識する抗体の配列 （特に可変領域の配列や相補鎖決定領域 (CD R) の配列） を基に、 当業者に公知の遺伝子組換え技術を用いて作製することが可 能である。
HLAを認識する抗体の配列は、 既に公知の抗体の配列を用いることが可能であ 'り、 又、 HLAを抗原として、 当業者に公知の方法により抗 HLA抗体を作製し、 そ の抗体の配列を取得して用いることも可能である。 具体的には、 例えば、 以下の ようにして行うことができる。 HLAタンパク質若しくはその断片を感作抗原とし て使用して、 これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、 得られる免疫細胞を通 常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、 通常のスクリーニング法によ り、 モノクロ一ナルな抗体産生細胞 （ハイプリ ドーマ） をスクリ一二ングする。 抗原の調製は公知の方法、 例えばパキュロウィルスを用いた方法 （W098/46777な ど） 等に準じて行うことができる。 ハイブリ ドーマの作製は、 たとえば、 ミルス ティンらの方法 (Kohler. G. and Milstein, C.， Methods Enzymol. (1981) 73： 3-46) 等に準じて行うことができる。 抗原の免疫原性が低い場合には、 アルプミ ン等の免疫原性を有する巨大分子と結合させ、 免疫を行えばよい。 その後、 ハイ プリドーマの mRNAから逆転写酵素を用いて抗体の可変領域 （V領域） の cDNAを 合成し、 得られた cDNAの配列を公知の方法により解読すればよい。
HLAを認識する抗体は、 HLAと結合する限り特に制限はなく、 マウス抗体、 ラッ ト抗体、 ゥサギ抗体、 ヒッジ抗体、 ヒト抗体等を適宜用いることができる。 又、 ヒ トに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝 子組換え型抗体、 例えば、 キメラ （Chimeric) 抗体、 ヒト化 （Humanized) 抗体な ども使用できる。 これらの改変抗体は、 既知の方法を用いて製造することができ る。 キメラ抗体は、 ヒ ト以外の哺乳動物、 例えば、 マウス抗体の重鎖、 軽鎖の可 変領域とヒ ト抗体の重鎖、 軽鎖の定常領域からなる抗体等であり、 マウス抗体の 可変領域をコードする DNAをヒト抗体の定常領域をコードする DNAと連結し、 こ れを発現べクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得ることがで さる。
ヒト化抗体は、 再構成 (reshaped) ヒト抗体とも称され、 ヒト以外の哺乳動物、 たとえばマウス抗体の相ネ甫性決定領域 (CDR; complementarity determining regi on) をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、 その一般的な遺伝子組 換え手法も知られている。 具体的には、 マウス抗体の CDRとヒト抗体のフレーム ワーク領域 (framework region； FR) を連結するように設計した DNA配列を、 末 端部にォーパーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチ ドから PCR法により合成する。 得られた DNAをヒト抗体定常領域をコードする DN Aと連結し、 次いで発現ベクターに組み込んで、 これを宿主に導入し産生させる ことにより得られる （欧州特許出願公開番号 EP 239400、 国際特許出願公開番号 W 0 96/02576参照） 。 CDRを介して連結されるヒト抗体の FRは、 相補性決定領域が 良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。 必要に応じ、 再構成ヒ ト抗体 の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域のフレ ームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい （Sato, L et al. , Cancer Res. (19 93) 53, 851-856)。
これらキメラ抗体ゃヒト化抗体などについては、 低分子化した後にキメラ化ゃ ヒト化等を行ってもよいし、 キメラ化ゃヒト化等を行った後に低分子化を行って もよい。
また、 ヒト抗体の取得方法も知られている。 例えば、 ヒトリンパ球を i 2 vitro で所望の抗原または所望の抗原を発現する細胞で感作し、 感作リンパ球をヒトミ エローマ細胞、 例えば U266と融合させ、 抗原への結合活性を有する所望のヒト抗 体を得ることもできる （特公平 1-59878参照） 。 また、 ヒト抗体遺伝子の全ての レパートリ一を有するトランスジエニック動物を所望の抗原で免疫することで所 望のヒト抗体を取得することができる （国際特許出願公開番号 W0 93/12227, W0 92/03918, W0 94/02602, W0 94/25585, W0 96/34096, W0 96/33735参照） 。 さら に、 ヒ ト抗体ライブラリーを用いて、 パンニングによりヒ ト抗体を取得する技術 も知られている。 例えば、 ヒ ト抗体の可変領域を一本鎖抗体 （scFv) としてファ ージディスプレイ法によりファージの表面に発現させ、 抗原に結合するファージ を選択することができる。 選択されたファージの遺伝子を解析すれば、 抗原に結 合するヒ ト抗体の可変領域をコードする DM配列を決定することができる。 抗原 に結合する scFvの DNA配列が明らかになれば、 当該配列を有する適当な発現べク ターを作製し、 ヒト抗体を取得することができる。 これらの方法は既に周知であ り、 W 92/01047, W0 92/20791, W0 93/06213, W0 93/11236, W0 93/19172, W0 9 5/01438, W0 95/15388を参考にすることができる。
本発明において、 HLAを認識する抗体の好ましい例として 2D7抗体が挙げられ る。 2D7抗体は、 配列番号： 2の CDR (又は可変領域） および配列番号： 4の CDR (又は可変領域） の配列を有する抗体が例示できるが、 これに限定されるもので はなく、 配列番号： 2の CDR (又は可変領域） および配列番号： 4の CDR (又は可 変領域） の配列において 1もしくは複数のアミノ酸配列が変異 （置換、 欠失、 揷 入、 および/または付加） したアミノ酸配列を有する抗体であって、 配列番号： 2の CDR (又は可変領域） および配列番号： 4の CDR (又は可変領域） の配列を有 する抗体と機能的に同等な抗体もまた本発明の 2D7抗体に含まれる。 ここで 「機 能的に同等」 とは、 対象となる抗体が、 配列番号： 2の CDR (又は可変領域） 及 ぴ配列番号： 4の CDR (又は可変領域） の配列を有する抗体と同等の活性 （例え ば、 HLA - Aへの結合活性、 細胞死誘導活性、 など） を有することを意味する。
変異するアミノ酸数は特に制限されないが、 通常、 30アミノ酸以内であり、 好 ましくは 15アミノ酸以内であり、 さらに好ましくは 5アミノ酸以内 （例えば、 3 アミノ酸以内） であると考えられる。 変異するアミノ酸残基においては、 ァミノ 酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に変異されることが望ましい。 例え ばアミノ酸側鎖の性質としては、 疎水性アミノ酸 （A、 I、 L、 M、 F、 P、 W、 Y、 V) 、 親水性アミノ酸 （R、 D、 N、 C、 E、 Q、 G、 H、 K、 S、 T) 、 脂肪族側鎖を有するアミ ノ酸 （G、 A、 V、 L、 I、 P) 、 水酸基含有側鎖を有するアミノ酸 （S、 T、 Υ) 、 硫黄 原子含有側鎖を有するアミノ酸 （C、 M) 、 カルボン酸及びアミド含有側鎖を有す るアミノ酸 （D、 N、 E、 Q) 、 塩基含有側鎖を有するアミノ酸 （R、 K、 Η) 、 芳香族 含有側鎖を有するアミノ酸 （H、 F、 Y、 W) を挙げることができる （括弧內はいず れもアミノ酸の一文字標記を表す） 。 あるアミノ酸配列に対する 1又は複数個の ァミノ酸残基の欠失、 付加及ぴ Z又は他のァミノ酸による置換により修飾された ァミノ酸配列を有するポリぺプチドがその生物学的活性を維持することはすでに 知られている (Mark, D. F. et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81, 5 662-5666 、 Zoller, M. J. & Smith, M. Nucleic Acids Research (1982) 10, 64 87-6500 、 Wang, A. et al. , Science 224, 1431 - 1433 、 Dalbadie-McFarland, G. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982) 79, 6409-6413) 。 また、 抗体の 定常領域などのァミノ酸配列は当業者に公知である。
また、 2D7抗体を当業者に公知の方法でキメラ化、 ヒト化などをすることも可 能であり、 このようなキメラ抗体、 ヒト化等された抗体も本発明の 2D7抗体に含 まれる。
本発明の抗体は、 ポリエチレングリコール （PEG) 、 放射性物質、 トキシン等の 各種分子と結合したコンジュゲート抗体でもよい。 このようなコンジユゲート抗 体は、 得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。 なお、 抗体の修飾方法はこの分野においてすでに確立されている。 本発明における 「抗 体」 にはこれらのコンジュゲート抗体も包含される。
本発明は、 本発明の抗体をコードする DNAを包含する。 又、 該 DNAとストリン ジェントな条件下でハイプリダイズし、 抗原への結合能及び活性を有する抗体を コードする DNAを包含する。 ハイプリダイゼ一シヨン技術（Sambrook, J et al. , M olecular Cloning 2nd ed.， 9. 47-9. 58, Cold Spring Harbor Lab. press, 198 9) は当業者に公知であり、 ハイプリダイゼーシヨンの条件は、 当業者であれば適 宜選択することができる。 ハイブリダィゼーションの条件としては、 例えば、 低 ストリンジェントな条件が挙げられる。 低ストリンジェントな条件とは、 ハイプ リダィゼーシヨン後の洗浄において、 例えば 42。 (：、 0. 1 XSSC、 0. 1%SDSの条件で あり、 好ましくは 50°C、 0. l X SSCs 0. 1%SDSの条件である。 より好ましいハイブ リダイゼーションの条件としては、 高ストリンジェントな条件が挙げられる。 高 ストリンジェントな条件とは、 例えば 65°C、 5 XSSC及ぴ 0. 1%SDSの条件である。 これらの条件において、 温度を上げる程に高い相同性を有する DNAが効率的に得 られることが期待できる。 但し、 ハイプリダイゼーシヨンのストリンジエンシー に影響する要素としては温度や塩濃度など複数の要素が考えられ、 当業者であれ ばこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジエンシーを実現することが 可能である。
本発明の DNAは、 本発明の抗体の i ? vivoや in vitroにおける生産に利用され る他、 例えば、 遺伝子治療などへの応用も考えられる。 本発明の DNAは、 本発明 の抗体をコードしうるものであればいかなる形態でもよい。 即ち、 mR Aから合成 された cDNAであるか、 ゲノム DNAであるか、 化学合成 DNAであるかなどを問わな レ、。 また、 本発明の抗体をコードしうる限り、 遺伝暗号の縮重に基づく任意の塩 基配列を有する DNAが含まれる。
本発明の抗体は当業者に公知の方法により製造することができる。 具体的には、 目的とする抗体の DNAを発現ベクターへ組み込む。 その際、 発現制御領域、 例え ば、 ェンハンサー、 プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組 み込む。 次に、 この発現ベクターにより宿主細胞を形質転換し、 抗体を発現させ ることができる。 その際には、 適当な宿主と発現ベクターの組み合わせを使用す ることができる。
ベクターの例としては、 M13系ベクター、 pUC系ベクター、 pBR322、 pBluescrip t、 pCR- Scriptなどが挙げられる。 また、 cDNAのサブクローニング、 切り出しを 目的とした場合、 上記べクタ一の他に、 例えば、 pGEM- T、 pDIRECT, PT7などが挙 げられる。
本発明の抗体を生産する目的においてベクターを使用する場合には、 特に、 発 現ベクターが有用である。 発現ベクターとしては、 例えば、 大腸菌での発現を目 的とした場合は、 ベクターが大腸菌で増幅されるような上記特徴を持つほかに、 宿主を J1109、 DH5 «、 HB101、 XLl- Blueなどの大腸菌とした場合においては、 大 腸菌で効率よく発現できるようなプロモーター、 例えば、 lacZプロモーター （Wa rdら， Nature (1989) 341, 544-546； FASEB J. (1992) 6, 2422-2427) 、 araBプ 口モーター （Betterら， Science (1988) 240, 1041-1043 ) 、 または T7プロモ 一ターなどを持っていることが不可欠である。 このようなベクターとしては、 上 記ベクターの他に pGEX- 5Χ- 1 (Pharmacia社製） 、 「QIAexpress system] (QIAGE N社製） 、 pEGFP, または pET (この場合、 宿主は T7 RNAポリメラーゼを発現して いる BL21が好ましい）などが挙げられる。
また、 べクターには、 ポリぺプチド分泌のためのシグナル配列が含まれていて もよい。 ポリペプチド分泌のためのシグナル配列としては、 大腸菌のペリプラズ ムに産生させる場合、 pelBシグナル配列 （Lei, S. P. et al J. Bacteriol. (19 87) 169， 4379 ) を使用すればよい。 宿主細胞へのベクターの導入は、 例えば塩 ィ匕カルシウム法、 エレクトロポレーション法を用いて行うことができる。
大腸菌以外にも、 例えば、 本発明のポリペプチドを製造するためのベクターと しては、 哺乳動物由来の発現ベクター （例えば、 pcDNA3 (Invitrogen社製） や、 pEGF-BOS (Nucleic Acids. Res. 1990, 18 (17) , p5322)、 pEF、 pCDM8) 、 昆虫細胞 由来の発現ベクター (例えば 「Bac - to— BAC baculovairus expression system] (GIBC0 BRL社製） 、 PBacPAK8) 、 植物由来の発現ベクター （例えば ρΜΗ1、 pMH 2) 、 動物ウィルス由来の発現ベクター （例えば、 pHSV、 pMV、 pAdexLcw) 、 レト ロウィルス由来の発現ベクター （例えば、 pZIPneo) 、 酵母由来の発現べクタ一 (例えば、 「Pichia Expression Kit」 （Invitrogen社製） 、 pNVll、 SP-Q01) 、 枯草菌由来の発現ベクター （例えば、 PPL608、 pKTH50) が挙げられる。
CH0細胞、 COS細胞、 NIH3T3細胞等の動物細胞での発現を目的とした場合には、 細胞内で発現させるために必要なプロモーター、 例えば SV40プロモーター （Mull iganら， Nature (1979) 277， 108) 、 MMLV - LTRプロモーター、 EFl aプロモータ 一 （MizusMmaら， Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322) 、 CMVプロモータ一な どを持っていることが不可欠であり、 細胞への形質転換を選抜するための遺伝子 (例えば、 薬剤 （ネオマイシン、 G418など） により判別できるような薬剤耐性遺 伝子） を有すればさらに好ましい。 このような特性を有するベタターとしては、 例えば、 p画、 pDR2、 pBK- RSV、 PBK_CMV、 pOPRSV、 pOP13などが挙げられる。
さらに、 遺伝子を安定的に発現させ、 かつ、 細胞内での遺伝子のコピー数の增 幅を目的とする場合には、 核酸合成経路を欠損した CH0細胞にそれを相補する DH FR遺伝子を有するベクタ一 （例えば、 pCHOIなど） を導入し、 メトトレキセート (MTX) により増幅させる方法が挙げられ、 また、 遺伝子の一過性の発現を目的と する場合には、 SV40 T抗原を発現する遺伝子を染色体上に持つ COS細胞を用いて SV40の複製起点を持つベクター （pcDなど） で形質転換する方法が挙げられる。 複製開始点としては、 また、 ポリオ一マウィルス、 アデノウイルス、 ゥシパピ口 一マウィルス （BPV) 等の由来のものを用いることもできる。 さらに、 宿主細胞系 で遺伝子コピー数増幅のため、 発現べクターは選択マーカーとして、 アミノグリ コシドトランスフェラーゼ （APH) 遺伝子、 チミジンキナーゼ （TK) 遺伝子、 大腸 菌キサンチングァユンホスホリポシルトランスフェラーゼ （Ecogpt) 遺伝子、 ジ ヒドロ葉酸還元酵素 （dhfr) 遺伝子等を含むことができる。
一方、 動物の生体内で本発明の DNAを発現させる方法としては、 本発明の DNA を適当なベクターに組み込み、 例えば、 レトロウイルス法、 リボソーム法、 カチ ォニックリボソーム法、 アデノウィルス法などにより生体内に導入する方法など が挙げられる。 用いられるベクターとしては、 例えば、 アデノウイルスベクター
(例えば pAdexlcw) やレトロウイルスベクター（例えば pZIPneo) などが挙げられ るが、 これらに制限されない。 ベクターへの本発明の DNAの揷入などの一般的な 遺伝子操作は、 常法に従って行うことが可能である （Molecular Cloning， 5. 61-5. 63) 。 生体内への投与は、 ex vivo法であっても、 in vivo法であってもよい。 また、 本発明は、 本発明のベクターが導入された宿主細胞を提供する。 本発明 のベクターが導入される宿主細胞としては特に制限はなく、 例えば、 大腸菌や 種々の動物細胞などを用いることが可能である。 本発明の宿主細胞は、 例えば、 本発明の抗体の製造や発現のための産生系として使用することができる。 ポリべ プチド製造のための産生系は、 in vitroおよび vivoの産生系がある。 in vit oの産生系としては、 真核細胞を使用する産生系や原核細胞を使用する産生系が 挙げられる。
真核細胞を使用する場合、 例えば、 動物細胞、 植物細胞、 真菌細胞を宿主に用 いることができる。 動物細胞としては、 哺乳類細胞、 例えば、 CHO (J. Exp. Med. (1995) 108, 945) 、 C0S、 3T3、 ミエローマ、 BHK (baby hamster kidney) 、 HeL a、 Vero、 両生類細胞、 例えばアフリカッメガエル卵母細胞 （Valle, et al. , at ure (1981) 291, 358-340) 、 あるいは昆虫細胞、 例えば、 Sf9、 Sf21、 Tn5が知 られている。 CH0細胞としては、 特に、 DHFR遺伝子を欠損した CH0細胞である dh fr-CHO (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77， 4216—4220) や CHO K - 1 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1968) 60, 1275) を好適に使用することができる。 動物 細胞において、 大量発現を目的とする場合には特に CH0細胞が好ましい。 宿主細 胞へのべクタ一の導入は、 例えば、 リン酸カルシウム法、 DEAEデキストラン法、 カチォニックリボソーム D0TAP (ベーリンガーマンハイム社製） を用いた方法、 エレクト口ポーレーション法、 リポフエクシヨンなどの方法で行うことが可能で ある。
植物細胞としては、 例えば、 ニコチアナ ·タバカム (mcotiana tabacum) 由来 の細胞がポリぺプチド生産系として知られており、 これをカルス培養すればよい。 真菌細胞としては、 酵母、 例えば、 サッカロミセス (^accharowces 属、 例えば、 サッカロミセス .セレビシェ {$acchairomyces cerevisiae 、 糸状菌、 例えば、 ァスぺノレギノレス (Aspergillus 属、 例えば、 アスペスレギノレス ·二ガー (^spergil lus niger) が知られている。
原核細胞を使用する場合、 細菌細胞を用いる産生系がある。 細菌細胞としては、 大腸菌 coli) 、 例えば、 JM109、 DH5 a、 HB101等が挙げられ、 その他、 枯草 菌が知られている。
これらの細胞を目的とする DNAにより形質転換し、 形質転換された細胞を in v itroで培養することにより抗体が得られる。 培養は、 公知の方法に従い行うこと ができる。 例えば、 動物細胞の培養液として、 例えば、 DMEM、 MEM, RPMI1640、 IM DMを使用することができる。 その際、 牛胎児血清 (FCS) 等の血清補液を併用す ることもできるし、 無血清培養してもよい。 培養時の pHは、 約 6〜8であるのが 好ましい。 培養は、 通常、 約 30〜40 Cで約 15〜200時間行い、 必要に応じて培地 の交換、 通気、 攪拌を加える。
一方、 in vivoでポリペプチドを産生させる系としては、 例えば、 動物を使用 する産生系や植物を使用する産生系が挙げられる。 これらの動物又は植物に目的 とする DNA を導入し、 動物又は植物の体内でポリペプチドを産生させ、 回収する。 本発明における 「宿主」 とは、 これらの動物、 植物を包含する。
動物を使用する場合、 哺乳類動物、 昆虫を用いる産生系がある。 哺乳類動物と しては、 ャギ、 プタ、 ヒッジ、 マウス、 ゥシを用いることができる （Vicki Glase r, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993) 。 また、 哺孚し類動物を用いる 場合、 トランスジエニック動物を用いることができる。
例えば、 目的とする DNAを、 ャギ i3カゼインのような乳汁中に固有に産生され るポリペプチドをコードする遺伝子との融合遺伝子として調製する。 次いで、 こ の融合遺伝子を含む DNA断片をャギの胚へ注入し、 この胚を雌のャギへ移植する。 胚を受容したャギから生まれるトランスジエニックャギ又はその子孫が産生する 乳汁から、 目的の抗体を得ることができる。 トランスジエニックャギから産生さ れるポリペプチドを含む乳汁量を増加させるために、 適宜ホルモンをトランスジ エニックャギに使用してもよい （Ebert， K. M. et al. , Bio/Technology (1994) 1 2, 699-702) 。
また、 昆虫としては、 例えばカイコを用いることができる。 カイコを用いる場 合、 目的の DNAを揷入したパキュロウィルスをカイコに感染させることにより、 このカイコの体液から目的のポリペプチドを得ることができる （Susumu, M. et a 1.， Nature (1985) 315， 592-594) 。
さらに、 植物を使用する 、 例えばタバコを用いることができる。 タバコを 用いる場合、 目的の DNAを植物発現用ベクター、 例えば pMON 530に揷入し、 この ベクターをァグロパクテリゥム .ッメファシェンス grokac terium tumefacien s) のようなパクテリアに導入する。 このパクテリアをタバコ、 例えば、 ニコチア ナ.タパカム imcotiana tabacum) に感染させ、 本タバコの葉より所望のポリべ プチドを得ることができる （Julian K. -C. Ma et al. , Eur. J. Immunol. (1994) 24， 131-138) 。
これにより得られた本発明の抗体は、 宿主細胞内または細胞外 （培地など） 力 ら単離し、 実質的に純粋で均一な抗体として精製することができる。 抗体の分離、 精製は、 通常の抗体の精製で使用されている分離、 精製方法を使用すればよく、 何ら限定されるものではない。 例えば、 クロマトグラフィーカラム、 フイノレター、 限外濾過、 塩析、 溶媒沈殿、 溶媒抽出、 蒸留、 免疫沈降、 SDS-ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動、 等電点電気泳動法、 透析、 再結晶等を適宜選択、 組み合わせれ ば抗体を分離、 精製することができる。
クロマトグラフィーとしては、 例えばァフィ二ティークロマトグラフィー、 ィ オン交換クロマトグラフィー、 疎水性クロマトグラフィー、 ゲル濾過、 逆相クロ マトグラフィー、 吸着クロマトグラフィー等が挙げられる （Strategies for Prot ein Purif ication ana Characterization: A Laboratoryし ourse Manual. Ed Dan iel R. Marshak et al. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996) 。 これ らのクロマトグラフィーは、 液相クロマトグラフィー、 例えば HPLC、 FPLC等の液 相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。 本発明は、 これらの精製方法 を用い、 高度に精製された抗体も包含する。
本発明において、 抗体の抗原結合活性 (Antibodies A Laboratory Manual. Ed H arlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988)の測定には公知の手 段を使用することができる。 例えば、 ELISA (酵素結合免疫吸着検定法） 、 EIA (酵素免疫測定法） 、 RIA (放射免疫測定法） あるいは蛍光免疫法などを用いるこ とができる。 本発明において、 本発明の抗体が浮遊細胞に対して細胞死を誘導するか否かは、 実施例と同様に Jurkat細胞又は ARH77細胞に対して細胞死を誘導するか否かによ り判定することができる。 又、 抗体が接着細胞に対して細胞死を誘導する力否か は、 実施例と同様に HeLa細胞に対して細胞死を誘導するか否かにより判定するこ とができる。
また、 本発明は、 本発明の低分子化抗体または 2D7抗体を有効成分として含有 する、 細胞死誘導剤または細胞増殖抑制剤を提供する。 本発明の低分子化抗体ま たは 2D7抗体の細胞死誘導活性は、 活性化された T細胞または B細胞で特に効果 が大きいと考えられるので、 癌などの腫瘍 （特に血液腫瘍） や自己免疫疾患の治 療ゃ予防に特に有効であると考えられる。 このように本発明は、 本発明の低分子 化抗体または 2D7抗体を用いた、 癌などの腫瘍 （特に血液腫瘍） や自己免疫疾患 の治療方法や予防方法も提供するものである。 低分子化されていない 2D7抗体を 有効成分として用いる場合には、 抗 IgG抗体などでクロスリンクすることが好ま しい。
上記抗体には各種試薬を結合してコンジュゲート抗体として使用することもで きる。 このような試薬としては、 化学療法剤、 放射性物質、 トキシンなどを挙げ ることができる。 このようなコンジユゲート抗体は公知の方法により作製するこ とができる （US5057313、 US5156840) 。
上記薬剤は、 直接患者に投与する以外に、 公知の製剤学的方法により製剤化し た医薬組成物として投与を行うことも可能である。 例えば、 必要に応じて糖衣を 施した錠剤、 カプセル剤、 エリキシル剤、 マイクロカプセル剤として経口的に、 あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、 又は懸濁 液剤の 剤の形で非経口的に使用できる。 例えば、 薬理学上許容される担体も しくは媒体、 具体的には、 滅菌水や生理食塩水、 植物油、 乳化剤、 懸濁剤、 界面 活性剤、 安定剤、 香味剤、 賦形剤、 べヒクル、 防腐剤、 結合剤などと適宜組み合 わせて、 一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することに よって製剤化することが考えられる。 これら製剤における有効成分量は指示され た範囲の適当な用量が得られるようにするものである。
錠剤、 カプセル剤に混和することができる添加剤としては、 例えばゼラチン、 コーンスターチ、 トラガントガム、 アラビアゴムのような結合剤、 結晶性セル口 ースのような賦形剤、 コーンスターチ、 ゼラチン、 アルギン酸のような膨化剤、 ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、 ショ糖、 乳糖又はサッカリンのよう な甘味剤、 ペパーミント、 ァカモノ油又はチヱリーのような香味剤が用いられる。 調剤単位形態がカプセルである場合には、 上記の材料にさらに油脂のような液状 担体を含有することができる。 注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のような べヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。
注射用の水溶液としては、 例えば生理食塩水、 ブドウ糖やその他の補助薬を含 む等張液、 例えば D-ソルビトール、 D-マンノース、 D -マンニトール、 塩化ナトリ ゥムが挙げられ、 適当な溶解補助剤、 例えばアルコール、 具体的にはエタノール、 ポリアルコール、 例えばプロピレングリコール、 ポリエチレングリコール、 非ィ オン性界面活性剤、 例えばポリソルベート 80 (TM) 、 HC0 - 50と併用してもよい。 油性液としてはゴマ油、 大豆油があげられ、 溶解補助剤として安息香酸ベンジ ル、 ベンジルアルコールと併用してもよい。 また、 緩衝剤、 例えばリン酸塩緩衝 液、 酢酸ナトリウム緩衝液、 無痛化剤、 例えば、 塩酸プロ力イン、 安定剤、 例え ばべンジルアルコール、 フエノール、 酸化防止剤と配合してもよい。 調製された 注射液は通常、 適当なアンプルに充填させる。
患者への投与は、 例えば、 動脈内注射、 静脈内注射、 皮下注射などのほか、 鼻 腔内的、 経気管支的、 筋内的、 経皮的、 または経口的に当業者に公知の方法によ り行いうる。 投与量は、 患者の体重や年齢、 投与方法などにより変動するが、 当 業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。 また、 該化合物が DNAによりコードされうるものであれば、 該 DNAを遺伝子治療用べクターに組込 み、 遺伝子治療を行うことも考えられる。 投与量、 投与方法は、 患者の体重や年 03 013063 一 2 3 - 齢、 症状などにより変動するが、 当業者であれば適宜選択することが可能である。 本発明の薬剤の投与量は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与 方法によっても異なるが、 例えば注射剤の形では通常成人 （体重 60kgとして） に おいては、 1日あたり約 0. 1から 1000mg、 好ましくは約 1. 0から 50mg、 より好ま しくは約 1. 0から 20mgであると考えられる。
非経口的に投与する場合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投 与方法によっても異なるが、 例えば注射剤の形では通常成人 （体重 60kgとして） においては、 通常、 1日当り約 0. 01から 30mg、 好ましくは約 0. 1から 20mg、 よ り好ましくは約 0. 1から 10mg程度を静脈注射により投与するのが好都合であると 考えられる。 他の動物の場合も、 体重 60kg当たりに換算した量、 あるいは体表面 積あたりに換算した量を投与することができる。 図面の簡単な説明
図 1は、 PMX2ベクターの作製に用いたアダプターを示す図である。 太字部分は BstXI認識配列を示している。
図 2 Aおよぴ図 2 Bは、 2D7抗原の細胞株における発現を示す図である。 2D7抗 体で各種細胞を染色し、 その発現を調べた。 （実線：一次抗体なし、 点線： 2D7 抗体）
図 3は、 2D7抗体による免疫沈降を示す写真である。 NIH3T3, RPMI8226, U266 細胞を可溶ィヒし、 2D7抗体、 抗 BST- 1抗体 （コントロール） ， またはプロテイン G のみで免疫沈降を行い、 銀染色で蛋白を検出した。 RPMI8226， U266で 2D7抗体に より特異的に沈降する約 12KDの分子 （矢印） が検出された。 このパンドを切り出 し、 ペプチドシークェンスを行った結果、 32ミクログロブリンであることが分 力つた。
図 4は、 スクリーニングの流れを示す図である。 プール分け、 DNAの調製、 ゥ ィルスへのパッケージング、 3T3細胞への感染、 FACSによるスクリーニングまで を一つのスパンとして行った （図 4 A) 。 四次スクリーニング終了までに約 20ク ローンにまで絞った。 五次スクリーニングでは、 コ口-一 64個をそれぞれ 96ゥ エルプレートに植菌し、 縦の列、'横の列でプールを作りスクリ一ユングを行った。 その結果、 12個の候補クローンが絞れた （図 4 B) 。
図 5は、 FACSによるスクリーニングの結果を示す図である。 図 5 Aは二次スク リーユングの結果を、 図 5 Bは三次スクリーニングの結果を、 図 5 Cは四次スク リーユングの結果を示している。 各プールよりレトロウイルスを調製後 NIH3T3に 感染させ 3日後に 2D7抗体で細胞を染色した。 スクリーニングごとにプールのサ ィズを徐々に小さくすることでクローンを絞っていった。
図 6は、 FACSによるスクリーニングの結果を示す図である。 図 6 Aは五次スク リーユングの結果を、 図 6 Bは最終スクリーニングの結果を示している。 五次ス クリ一ユングの結果、 3， 4， 6, 8の列、 E， F, Gの列に陽性クローンが含まれているこ とが分かった。 12個の候補クローンをスクリーニングした結果、 Eの列では 6 E が陽性クローンであることが分かつた。 この 6Eの塩基配列を解析した結果 HLA c lassl A*6802をコードしていた。
図 7は、 2D7抗体添加による細胞への影響を示す図及ぴ写真である。 2D7抗体 (10 μ g/ml) 添加後、 48時間後に生細胞数を測定した。 2D7抗体を加えても、 細 胞増殖にほとんど変化が見られなかった （図 7 A) 。 K562細胞 （図 7 B ) 、 Jurk at細胞 （図 7 C) 、 RPMI8226細胞 （図 7 D) をそれぞれ抗体添加 24時間後に観 察した。 2D7抗体は Jurkatに対して細胞凝集を誘導した。
図 8は、 2D7抗体のクロスリンクによる細胞死誘導を示す写真である。 Jurkat 細胞に 2D7抗体， 抗マウス IgGを各組み合わせで作用させ、 48時間後に細胞核を 染色した。 2D7抗体と抗マウス IgGを同時に作用させることにより、 細胞死によ る核の断片化が観察された。
図 9は、 2D7 Diabody (2D7DB) の配列である。
図 1 O Aおよび図 1 0 Bは、 2D7 Diabodyの構造を示した図である。 図 1 0 C は C0S7での一過性発現を示した写真である。
図 1 1 Aおよぴ図 1 1 Bは、 C0S7で一過性に発現させた 2D7DBの細胞傷害活性 を示した図である。
図 1 2は、 C0S7で一過性に発現させた 2D7DBの細胞傷害活性を示した図である。 K562細胞 （図 1 2 A) 、 Jurkat細胞 （図 1 2 B) を用いて行った。
図 1 3は、 C0S7で一過性に発現させた 2D7DBの細胞傷害活性を示した図である。 RPMI8226細胞 （図 1 3 A) 、 IL-KM3 細胞 （図 1 3 B) 、 U266細胞 （図 1 3 C) 、 ARH77細胞 （図 1 3 D) を用いて行った。
図 1 4は、 精製 2D7DBの増殖抑制効果を示したダラフである。
図 1 5は、 誘導 48時間後における精製 2D7DBによる細胞死誘導を示した図であ る。 ARH77細胞 （図 1 5 A) 、 Jurkat細胞 （図 1 5 B) 、 K562細胞 （図 1 5 C) 、 HeLa細胞 （図 1 5 D) を用いて行った。
図 1 6は、 誘導 48時間後における精製 2D7DBによる細胞死 ί誘導を示した図であ る。 U266細胞 （図 1 6 A) 、 IL - ΚΜ3細胞 （図 1 6 B) を用いて行った。
図 1 7は、 2D7DB (2 μ g/ml) による細胞死誘導のタイムコースを示した図であ る。 12時間から 38時間における細胞死誘導を調べた。 ARH77細胞 （図 1 7 A) 、 Jurkat細胞 （図 1 7 B) を用いて行った。
図 1 8は、 2D7DB (2 μ g/ml) による細胞死誘導のタイムコースを示した図であ る。 3時間から 6時間における細胞死誘導を調べた。 ARH77細胞 （図 1 8 A) 、 Ju rkat細胞 （図 1 8 B) を用いて行った。
図 1 9は、 2D7DBによる細胞死に対する Z-VAD- FMKの効果を示した図である。 A RH77細胞を用いて、 誘導後 16時間に行った。
図 2 0は、 2D7DBによる細胞死に対する Z- VAD-FMKの効果を示した図である。 J urkat細胞を用いて、 誘導後 16時間に行った。
図 2 1は、 2D7DBによる細胞死が DNAの断片化に伴わないことを示した写真で ある。 細胞死誘導後 24時間後に行った。 図 2 2は、 2D7DBの細胞死誘導活性に対するサイトカラシン Dの影響を調べた結 果を示す図である。 ARH77細胞をァクチン重合阻害剤であるサイトカラシン])であ. らかじめ処理しておくことにより、 2D7DBによって誘導される細胞死に対して抵抗 性を示すようになった。
図 2 3は、 細胞内のァクチンと核の様子を、 免疫染色によって調べた結果を示 す写真である。 ARH77細胞を図中の条件下で反応させた後、 抗ァクチン抗体でァ クチンを （赤） 、 Hoechst33258で細胞核を （青） 検出した。 2D7DB処理した細胞 はァクチンが消失していた。
図 2 4は、 2D7 Diabodyがヒト骨髄腫マウスモデルにおいて、 血清中のヒト IgG (hlgG) 濃度の上昇を抑制することを示した図である。 データは平均 +SEMで表 す。 Vehicle投与群と 2D7 Diabody投与群との間に、 対応の無い t.検定において 有意差 （* ： pく 0. 05) が存在した。
図 2 5は、 2D7 Diabodyがヒト骨髄腫マウスモデルにおいて、 延命効果を有す ることを示した図である。 Vehicle投与群と 2D7 Diabody投与群との間に、 一般 ィ匕 Wilcoxon検定において有意差 （* ： p <0. 05) が存在した。
図 2 6は、 PBMCに対する 2D7DBの作用を解析した図である。 マイトゲンには PH A - M (図 2 6 A) 、 ConA (図 2 6 B) および SAC (図 2 6 C) を用いた。また、 図 2 6 Dはマイトゲン非存在下での結果を示し、 図 2 6 Eは陽性対照 （ARH77) での 結果を示す。 上から順に、 2D7DB非添加、 3時間添カロ、 24時間添加での結果を示 す。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明を実施例により、 さらに具体的に説明するが本発明はこれら実施 例に制限されるものではな 、。
〔 1〕 細胞株
ヒトミエローマ細胞株 (RPMI8226, K562, ARH77) 、 ヒト T細胞白血病細胞株 (Jurkat) 、 FDC- Pl、 HCI- 16、 及び、 2D7ハイブリドーマ細胞株 （徳島大学由 来） は 10%ゥシ胎児血清 (FCS) を含む RPMI1640倍地 （GIBCO BRL社製） で、 ヒ トミエローマ細胞株 (IL-KM3, U266) は同培地にそれぞれ 2 ng/ml IL- 6 (R & D 社製）を添加した培地で、 Ba/F3は同培地に 2 ng/ml IL- 3 (R & Dネ: h¾)を添加し た培地で培養した。 また C0S7， 293T, HeLa, NIH3T3及ぴ B0SC23は 10%FCSを含 む DMEM倍地 (GIBCO BRL ¾fc¾) で、 CH0はな- MEM倍地 （GIBCO BRL社製） +5%FCS または 10%FCSで培養した。
〔2〕 pMX2ベクターの作製
GFP遺伝子をウィルス粒子中にパッケージングするレトロウィルスべクター pM X-GFPの GFP 伝子領域を EcoRI- Sailで切り出し除いた。 この領域に、 BstXI si teを配列上に持つアダプター （図 1 ) (ABI DNA synthesizerで合成後、 in vitr oでァニーノレさせ使用） を揷入し、 pMX2とした。
〔 3〕 cDNAラィブラリ一の作製
RPMI8226細胞より、 Trisol (GIBCO BRL社製） を用いて定法により Total RNA を精製した。 さらに、 この Total RNA 200 / gから、 MACS mR A Isolation kit (Miltenyi Biotec社製）を用い添付されたマニュアル書に従って mRNAを精製し た。 3. 6 ； z gの m NAを錄型にしてランダムへキサマー （Superscript Choice Sys tem for cDNA Synthesis ; Invitrogen) を用いて cDNAを合成した後、 BstXI ァダ プター （Invitrogen社製） を両末端に連結した。 この cDNAを、 BstXIで切断した pMX2ベクターに揷入し、 ELECTRO MAX DH10B (GIBCO BRLネ： h¾) にエレクトロポレ —シヨン法により導入した （2. 5 KV, 200 Ω、 25 μ Ρ) 。 その後、 1 mlの S0Cを 加え 37。Cで一時間インキュベートし、 40%グリセロール/ LB+Am 1 mlをカロえ、 一部をタイターチエックに使用し、 残りは - 80°Cに保存した。 得られたライブラリ 一を、 1ゥエルあたり 1000クローンになるように 96穴プレート 2枚に 200 μ ΐ/ ゥェル （7%DMS0/LB+Amp) で卷き込み、 37。Cでー晚培養した。 このプレートの 4 ゥエル分 （4000クローン分） をアンピシリン入り LB培地 （4 ml) —本に植菌し た。 これを一つのプールとし、 残りのゥエルについても同様の操作を行い、 最終 的にプレートー枚より 24プールを作製した。 各プールを 37ででー晚培養後 DNA を調整し （QIAGENネ： fc ) 、 パッケージング細胞へのトランスフエクシヨンに用い た。 植菌に使用したプレートは二次スクリーニングで使用するまで- 80°Cに保存し た。
〔4〕 抗体の精製
2D7抗体は、 徳島大から送付された腹水 0. 5 mlを Protein A Hi Trap Affinity column (Amersham Pharmacia ± ) に吸着させたのち、 IgG画分を 0. 1 M Sodiu m Citrate, pH3. 0で溶出し、 回収した。 これをセントリコン （YM- 10; ミリポ ァ） で濃縮したのち PBSにバッファー置換を行い、 最終的にトータル 5. 34 mgの 抗体を得た。 これらを分注して - 20°Cに保存した (濃度 0. 89 /z g/ ^ l) 。
〔 5〕 FACS
付着細胞の場合は 1 m EDTA/PBSで細胞をはがし、 浮遊細胞の場合は遠心回収 後 FACS Buffer (2. 5%FCS, 0. 02%NaN3/PBS) に懸濁し、 2D7抗体 (最終濃度 10 μ g/ml) を含む buffer (5%FCS/ PBS) 中に氷上で一時間おいた。 FACS Buf f erで 洗浄後、 FITC-抗マウス IgG (I脆 unotech社製） 溶液中 （1 : 150， 50 μ ΐ FACS Buf fer) で、 氷上で 30分間反応させ、 これを FACS Bufferで 2回洗浄後、 ELITE (CO ULTER社製）で解析を行つた。
〔6〕 レトロウイノレス感染
(i) レトロウイノレスパッケージング
レトロウイノレスパッケージング細胞である B0SC23細胞は、 トランスフエクショ ン前日に 6X 105 cells/ゥエル 2 mlで 6ゥエルプレートに撒いておいた。 トラン スフエタションは以下の手順で行つた。 各プール由来プラスミ ド DNA 1 μ ζに対 して FuGENE 6 Transfection Reagent (Rocheネ環） 3 μ \を混ぜ室温で 20分置 いた後、 前日撒いておいた B0SC23細胞の培地中に加えた。 その後 37°Cで 48時間 培養後培地を回収した。 3000回転で 5分遠心し死細胞を除いた培養液をウィルス P T/JP2003/013063
- 2 9 - 液として使用した。
(ii) ウイレス感染
前日 1 X 105 cells/ゥエル 2mlで 6ゥエルプレートに撒いた NIH3T3細胞を、 ポ リブレン (hexadimethrine bromide ; sigma) 10 g/mlを添カロしたウイノレス揿 1 ml中で 24時間培養した。 その後フレツシュな培地 1. 5 mlを加えさらに 48時間 培養を行い、 その後遺伝子発現を FACSにより解析した。
〔7〕 免疫沈降
細胞を lysis buffer (0. 5%Nonidet P- 40, 10 mM Tris, pH 7. 6, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM pheny lme thy 1 su 1 f ony 1 fluoride, 5 μ g/ml aprotinin) で溶 解したのち、 遠心して不溶化蛋白を除き cell lysateとした。 これに、 2D7抗体 1 μ §を加え 4°Cで 4時間ィンキュベートし、 引き続き magnetic protein G (BioM ag社製）を加えさらに 1時間ィンキュベートした。 その後免疫複合体を lysis buf ferで 3回 washし SDS- PAGEを行つた。 このゲルを添付のマニュアルに従つて銀 染色 （第一化学） した。 一方ペプチドシークェンスするために、 SDS- PAGE後のゲ ルを ProBlott (Applied Biosystems社製） に転写し、 クマシ一ブルー染色液 (0. l%coomassie blue R - 250 in 40%MetOH/ l%acetic acid) で一分間染色した。 5 0% MetOHで数回洗浄した後目的のパンドを切り出し、 1 ml DDWで 5回洗浄した 後真空乾燥し、 ペプチドシークェンサ一にかけた。
〔 8〕 2D7抗体を用いた細胞増殖ァッセィ
各細胞を 96ゥエルプレートに 1 X 106 cells/mlで PMA (50 ng/ml ; GIBC0 BRL) , PHA (10 μ ΐ/ml ; GIBC0 BRL) 存在下または非存在下で撒いた。 そこに 2D7抗体 (10 g/ml) を添加または非添加後 48時間培養した。 培養後、 細胞の形態変化 を顕微鏡下で観察した。 生細胞数測定は、 WST- 8 (生細胞数測定試薬 SF;ナカライ テスタ） を添加し、 37°Cで 2時間培養後、 0D45。を測定することで相対的な生細胞 数を測定した。
〔9〕 クロスリンクによる細胞死誘導 Jurkat細胞を 8 X 105 cells/ゥエルで 24ゥエルプレートに撒き、 2D7抗体存在 下 （5 μ g/ l) または非存在下で、 さらに抗マウス IgG (Fc)抗体 （Cappel社製） を 10 g/ml添加した。 48時間後に細胞を回収し、 PBSで洗浄後メタノールを 7 0%濃度になるように加え、 - 20°Cで 15分置いた。 細胞を FACS Bufferで数回洗浄 後、 Hoechst33258を 10 g/ml濃度で添加し室温で 30分ィンキュベートした。 再度 FACS Bufferで細胞を洗浄し、 スライドグラスの上に細胞を滴下し蛍光顕微 鏡で核の様子を観察した。
〔1 0〕 2D7可変領域のク口一ユング
2D7ハイプリドーマ （徳島大学より供与） より total RMを Trizolを用いて定 法により精製した。 この RNA 3 gを铸型にして、 SMART RACE cDNA Amplificatio n kit (CLONTECH社製）を用い、 添付のマ二ユアノレに従って cDNAを合成した。 こ の cDNAを铸型にして heavy chain, light chainの可変領域を以下のプライマー を用いて PCR法により増幅を行った。
heavy chain: 5， - CAGGGGCCAGTGGATAGACTGATG (配列番号： 9 )
light chain: 5' - GCTCACTGGATGGTGGGAAGATG (配列番号： 1 0 )
増幅された各可変領域をコードする cDNAは pCR - T0P0 vector (Invitrogen社製） にサブクローユングし塩基配列 （配列番号： 1および 3 ) を決定した。
〔1 1〕 2D7 Diabody発現べクタ一の作製
各可変領域 cDNAをサブクローニングしたプラスミドを铸型にして Heavy chain、 及ぴ、 Light chainの可変領域 (VH, VL) をそれぞれ以下のプライマーにより増幅 した。
Heavy chain
2D7DB-H1 : 5' -CCTGAATTCCACCATGCGATGGAGCTGGATCTTTC (配列番号： 1 1 )
2D7DB-H2 : 5' -AATTTGGCTACCGCCTCCACCTGAGGAGACTGTGAGAGTGGTGCCCT (配列番号： 1 2 )
Light chain P T/JP2003/013063
- 3 1 -
2D7DB-L1: 5' -TCCTCAGGTGGAGGCGGTAGCCAAATTGTTCTCACCCAGTCGCCAGC (配列番号： 1 3 )
2D7DB-L2： 5' -ATTGCGGCCGCTTATCACTTATCGTCGTCATCCTTGTAGTCTTTTATCTCCAACTTTGTC CCCGAGCC (配列番号： 1 4 )
これにより増幅した VH、 VLの各 cDNAを一つのチューブに混合しさらに PCR反 応を行った。 この PCR産物を铸型にして、 今度は 2D7DB - Hl、 2D7DB-L2をプライマ 一にして再度 PCR反応を行い、 VHと VLが 5 merのリンカ一をはさんで連結した c DNA (配列番号： 5 ) を合成した。 この cDNAを EcoRI- Notl切断し、 動物細胞発現 ベクター PCXND3の EcoRI- Notl間に挿入した。 塩基配列を確認し 2D7 Diabody発 現べクタ一 pCXND3- 2D7DBの構築を終了した。
〔1 2〕 C0S7細胞での一過性発現
pCXND3- 2D7DB、 あるいはコントロールとして空のベクター 2 に対してトラ ンスフエクシヨン試薬 (LT-1, MIRUS社製） 6 1を添付のマニュアルに従って混 合し、 無血清培地 (OPTI-MEM, GIBCO BRL) に培地交換した C0S7細胞 （前日に 1 X 105 cells/ゥエルで 6ゥエルプレートに撒いたもの） に添加した。 5時間後に血 清 200 を添加し 2日から 3日間培養した。 その後培地を回収し、 遠心により 死細胞を除去した培養上清を細胞傷害活性の検出実験に用いた。
一方培養上清中の 2D7DBの発現はウェスタンブロットにより確認した。 すなわ ち、 培養上清の一部に等量の 2XSDS- PAGE Sample bufferを加え、 また細胞は lys is buffer (0. 5%Nonidet P- 40， 10 mM Tris, pH 7. 6， 150 mM NaCl, 5 mM EDTA) を加えて溶解したのち、 遠心して不溶化蛋白を除き cell lysateを調整しこれに 等量の 2XSDS- PAGE Sample bufferを加えた。 各サンプルを SDS- PAGE後、 PVDF膜 に転写し、 抗 FLAG抗体で 2D7 Single chainの発現を検出した。
〔1 3〕 2D7 Diabod 産生発現細胞株の樹立
Pvulで切断し直鎖化した pCXND3 - 2D7DB 20 gを CH0細胞 (DXB11株） に以下の ようにエレクト口ポレーション法により導入した。 CH0細胞を ice-cold PBSで 2回洗浄した後 1 X 107 cells/mlになるように PBS に懸濁した。 これに 20 /z gの上記プラスミドを混合し、 電気パルス （1. 5 KV， 25 ^ FD) を与えた。 適当な割合で細胞を希釈し 10 cm dishに撒きこみ、 終濃度 50 0 μ g/ml G418 (GIBCO BRL社製)存在下で培養を行つた。 生育したコロニーを〜 30 クローンほどピックアップし、 それら培養上清中の Diabodyの発現量をゥエスタ ンプロットにより調べた。 最も発現の高かったクローンを 5 nM MTXを含む核酸フ リ一の ΜΕΜ α培地に拡大後、 これを高産生細胞株としてストツクした。
〔1 4〕 2D7 Diabodyの大量精製
T-125フラスコでサブコンフルェントの 2D7DB高産生 CH0細胞株を Trypsin- EDT Aではがした後ローラーボトル （MEM Q; without nucleotide + 5%FCS 250 ml)に 移した。 4日後に培養液を除去し PBSで 2回洗浄した。 その後、 無血清化するた めに CH0-S- SFMII培地 (GIBCO BRL社製） 250 mlに置換し 3日間培養を行った後培 養上清を回収した。 遠心によって死細胞を除去した後フィルターを通してこれを 精製に用いた。
Single chain Fvの精製は以下のとおり行った。 まず、 Anti- Flag M2カラムに 回収した培養上清を Apply し吸着させた。 これを Buffer A (50 mM Tris-HCl pH7 4, 150 mM NaCl, 0. 01%Tween 20)で washした後、 Buffer B (100 mM Glycine H3 5, 0. 01%Tween 20)で Single chain Fvを溶出した。 回収したサンプルは直ちに 終濃度 25 mMになるように Tris-HCl pH8. 0で中和した。 これをひき続き Superde x200HR (26/60)カラムによるゲルろ過精製に用いた。 0. 01 %Tween 20を含む PBS 中で Single chain Fvの dimer fractionを回収した。 回収したサンプルの一部を SDS電気泳動および銀染色を行い、 目的の蛋白が精製されていることを確認した 後これを濃縮し、 2D7 Diabody精製標品とした。
〔1 5〕 2D7 Diabodyによる細胞死誘導実験
各種血球系細胞株の場合は、 2〜5 X 105 cells/ゥエルになるように 24ゥェルプ レートに細胞を撒いた。 これに、 精製した 2D7DBを、 あるいは 2D7DBを一過性に 発現させた C0S7の培養上清を加え細胞死誘導を行った。 2D7DBを一過性に発現さ せた C0S7培養上清を用いた場合はその培養上清の濃度が 50%になるように加え た。 各ゥエルとも培地の量は 0. 8〜1 ml/ゥヱルで行った。 Jurkat細胞に刺激を加 える場合は、 2D7DBの添加時に Con A (WAKO†± )を終濃度 2 μ g/mlになるよう に同時に添加した。
付着細胞 （HeLa) の場合は、 2X 105 cells/ゥェルになるように 6ゥエルプレー トに細胞を撒き一晩培養することで細胞を付着させた。 その後培養液中に精製し た 2D7DBを添カ卩した。
2D7DBを添加し数時間から数日経った後、 浮遊細胞はそのまま細胞を回収し、 付着細胞は 1 mM EDTA/PBSで細胞をはがして回収した後、 ice- cold PBSで細胞を washし、 添付のマニュアルに従ってアポトーシスマーカーである Annexin V、 及 ぴ、 死細胞マーカーである PIで細胞をラベルした （TACS AnnexinV- FITC Apoptos is Detection Kit, TREVIGEN Instructions社製） 。 その後、 flow cytometoryを 用いて染色された細胞の割合を測定した （EPICS ELITE, COULTER) 。
〔1 6〕 Actinomycin Dによる細胞死誘導
各種血球系細胞を 2〜5 X 105 cells/ゥエルになるように 24ゥエルプレ一トに撒 いた。 アポトーシスの初期過程を阻害する目的でカスパーゼ阻害剤 (Z-VAD-FMK, プロメガ） を終濃度 50 Mで添加し 2. 5時間インキュベートした後、 細胞死誘導 を行った。 Actinomycin Dによる細胞死誘導では Actinomycin D (sigma社製） を 1 M g/ml (Jurkat)、 あるいは 5 μ g/ml (ARH77) 添加し、 2D7DBによる細胞死誘 導では精製 2D7DBを 2 g/mlになるように添加した。 細胞死誘導から 16時間後 に細胞を回収し、 Annexin V、 PIで細胞を染色した。
〔1 7〕 2D7 Diabodyを用いた細胞増殖ァッセィ
各細胞を 96ゥエルプレートに 1〜2X 104 cells/ゥエルの細胞濃度で撒いた。 そこに 2D7DBを適当な濃度になるように添加し 3 日培養後細胞数の測定を行つた。 生細胞数の測定は、 WST- 8を用いて行った。 すなわち本試薬を 10 1/ゥエルで細 胞に添加し 37°Cで 1. 5時間培養後、 分光光度計で 0D45。を測定することで相対的な 生細胞数を測定した。 増殖抑制率は、 （1- (0D450 of 2D7DB treated cells / OD450 of 2D7DB untreated cells)) X 100により算出した。
〔1 8〕 DNAの断片化の検出
ARH77、 Jurkat細胞を 2X 106 cells/ゥエルの細胞濃度になるように 6ゥエルプ レートに撒き、 それぞれのゥエルに精製 2D7DBは終濃度 2 /z g/mlで、
Actinomycin Dは終濃度 1 / g/ml (纖 77)、 あるいは 5 / g/ml (Jurkat)になる ように添加することで細胞死誘導を行った。 また何も添加しない 1ゥエルをコン トロールとした。 24時間培養後細胞を回収し PBSで細胞を一回洗浄し、 lysis buffer (10 mM Tris ρΗ7· 5， 10 mM EDTA, 0. 5%Triton X- 100)で溶解した。 引き 続き遠心することで不溶性蛋白を除いた後、 これを R ase A, Proteinase K処理 した。 その後この一部をァガロースゲルで電気泳動を行い、 クロマチン DNAの断 片化を検出した。
〔1 9〕 サイトカラシン Dによる細胞死誘導阻害
ARH77細胞を、 5X105 cells/ゥエル細胞濃度になるように 24ゥエルプレートに播 き、 サイトカラシン D (sigma社製） を終濃度 20 /x g/mlになるように加えた。 また エタノールのみを加えたゥエルをコントロールとした。 1時間培養後、 精製した 2D7DBを各濃度 （0, 200， 500, lOOOng/ml) で加え、 さらに 4時間培養を行った。 その後細胞を回収し、 PIで染色することで死細胞の割合を検出した。
〔2 0〕 2D7DB処理した細胞の抗ァクチン抗体を用いた免疫染色
サイトカラシン D処理/未処理の ARH77細胞に、 2D7DBを 1 μ g/ml濃度で加え、 37°Cで 15分培養した後、 細胞をサイトスピンによりスライドグラス上に付着させ た。 -20°Cのメタノールに 15分浸して細胞を固定した後、 ブロッキングバッファー (3% BSA/PBS) で 4 °C 1時間ブロッキング処理を行った。 その後、 1% BSA/PBS中 で 100倍希釈した CY3標識抗ァクチン抗体 （sigma社製） を室温で 1時間反応させた 後、 引き続いて Hoechst33258で細胞核を染色した。 PBSで数回洗浄した後、 共焦点 レーザー走査型顕微鏡 (オリンパス）で細胞を観察した。
[実施例 1 ] 各種細胞株における 2D7抗原の発現解析
cDNA発現ライプラリー作製のための sourceにすべき細胞株、 および、 宿主に すべき細胞株を決定するため、 各種動物細胞における 2D7抗原の発現を FACSによ り解析した （図 2 Aおよぴ図 2 B ) 。 その結果、 ヒト由来血球系細胞ではリンパ 性腫瘍細胞株 RPMI8226, U266, 及ぴ、 Jurkatで 2D7抗原の非常に強い発現が観察 されたが、 K562では発現が弱いことが分かった。 マウス由来血球細胞である Ba/F 3， FDC-P1, HCI- 16では種の違いによるため力、発現が非常に弱かった。 付着細胞 では、 C0S7， 293T, HeLa においても発現が認められた。 マウス NIH3T3細胞では、 ほとんど発現が見られなかった。
以上の発現パターンから、 発現クローニングに使う cDNAライプラリーの S0URC Eは RPMI8226細胞が、 また発現ライプラリーを導入してスクリーニングに使用す る宿主細胞は NIH3T3細胞が適切であると判断した。
[実施例 2 ] 2D7抗原のクローニング
〔1〕 蛋白質からのクローユング
2D7抗原を発現している RPMI8226細胞、 U266細胞、 および、 2D7抗原を発現し ていない NIH3T3細胞より cell lysateを調製し、 2D7抗体で免疫沈降を行った。 その結果、 RPMI8226, U266細胞で特異的に precipitateされる分子 （〜12kD) 力 S 確認された （図 3 ) 。 この分子は 2D7抗体による western blotでは検出されない が、 少なくとも 2D7抗体では再現良く precipitateされるので、 2D7抗原そのも の、 あるいは、 2D7抗原との共沈分子であることが強く予想された。
そこで、 このパンドをクマシ一染色した後切り出し、 ペプチドシークェンスを 行った。 その結果、 この 12kDの分子の正体は /3 2ミクログロブリン （/3 2M) であ ることが分かった。 β 2Μは HLA class Iと非共有結合で会合するクラス IMHC蛋 白複合体の一つであることから、 2Mは 2D7抗体により HLA複合体として共沈し てきたものと考えられる。 HLA class I は、 抗原提示に必要な a l、 α 2 ドメイン、 及ぴ、 /32Mと結合する α 3 ドメインから成る。 2D7抗体が 分子を共沈できる ことから、 2D7抗体は HLA class Iの 1- o; 2ドメインをェピトープとして認識し ていると予想される。
〔2〕 遺伝子の発現クローニング
2D7抗原発現細胞 RPMI8226より精製した mRNAからランダムへキサマーにより c DNAを合成した。 これをレトロウイルスベクター pMX2に揷入し、 レトロウイルス 発現ライプラリーを作製した。 ライブラリーのタイターを調べた結果、 トータル で 6 X 106 クローンを含んでいることが分かった。 また、 このライプラリーより 24個のクローンをランダムにピックアップしコロニー PCRによりインサートサイ ズを調べた結果、 cDNA average lengthはおよそ 1. 5kbであることが分かった。 従って、 作製した発現ライプラリーは発現クロ一ユングに十分使用可能であると 判断した。
図 4 Aおよぴ図 4 Bに、 以下のスクリーニングの流れを示す。 一次スクリー二 ングでは 4000個の independentなクローンを 1プールとして 24プール（96000ク ローン相当）を作製し、 各プラスミドを B0SC23細胞にトランスフエタトすること でレトロウイルスにパッケージングした。 その後得られた各プール由来ウィルス を NIH3T3細胞に感染させた。 感染 3日後に細胞をはがし、 2D7抗体で染色した後 FACSにより発現解析を行った。 その結果、 空ベクター由来のウィルス （コント口 ール） を感染させた NIH3T3細胞と比較して 2D7陽性細胞が認められたプールが 2 4プール中 3プールで認められた（プール 4、 13、 21)。
次に一次スクリ一エングで陽性だったプール 4、 プール 13を 1000個の indepe ndentなクローンからなるプール 4個に分割し二次スクリーニングを行った。 そ の結果、 各プールから一つずつ、 明らかな陽性プールが認められた （図 5 A、 プ ール 4-4、 プーノレ 13-1) 。 さらにプール 13 - 1を 160個の independentなクローン からなるプール、 21個に分割し、 三次スクリーニングを行い、 二つの陽性プール (図 5 B、 13-1-11、 13-1-21) を同定した。 続いてプール 13-1-11を 20個のクロ ーンからなるプール 8個に分け四次スクリーニングを行い、 陽性プール （図 5 C、 13-1-11-5) を得た。
このプールを LBプレートに広げ 64個のコ口ユーを一つずつ拾いそれぞれを 96 ゥエルプレートに 1ゥエルずっ植菌した。 縦の列 8クローン分を 1プールとして 8プール （1〜8) を、 また横の列 8クローン分を 1プールとして 8プール （A〜 H) を作製し、 五次スクリ一ユングを行った。 その結果、 プール 3， 4, 6, 8及ぴプー ル E, F， Gが positiveであったためこの結果から 12個の positive侯補クローンを 絞ることができた （図 6 A) 。 この 12個について FACSを行い、 最終的に 4つの positiveクローン （3F， 4G, 6E, 8G)が 2D7抗体に認識される単一クローンとして同 定された （図 6 B) 。
このクローンのィンサート部分のシークェンスを読んだ結果、 4つとも Human MHC class I HLA - A - 6802の全長 cDNA配列であることが分かった。
HLA-Aは数十種類ものハプロタイプに分類されている。 今回のクローニングの 結果、 HLA class Iの A*6802というハプロタイプが 2D7抗原として同定された力 2D7抗体はかなり広範な細胞種を認識すること力、ら、 遺伝子ソースとして使った R PMI8226細胞での HLA class Iのハプロタイプがたまたま A*6802だったというだ けであって、 2D7抗体は全てのハプロタイプを含む HLA class I分子を認識する 抗体であると考えられた。
[実施例 3 ] 増殖抑制効果についての検討
2D7抗体が細胞殺傷作用を有しているかを、 数種類の leukemia細胞株 (K562, Jurkat, RPMI8226) を使って調べてみた。 なお、 これら三株での 2D7抗原の発現 量は、 K562 (弱陽性)， Jurakat, RPMI8226 (強陽' 14)であった。
K562, Jurkat細胞を PHAと PMA存在下、 非存在下で撒き、 そこに 2D7抗体を 10 μ g/mlで加えた。 24時間後に細胞を観察した結果、 2D7弱陽性である K562細胞 では 2D7抗体の有無でその形態に目立った差は認められなかったが、 2D7を強く 発現している Jurkat細胞では 2D7抗体の添加により著名な細胞凝集が観察された 2003/013063
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(図 7 Bおよび図 7 C) 。 しかしながら、 2D7抗体添加による増殖抑制は観察さ れなかった （図 7 A) 。 また ΡΗΑ, ΡΜΑ刺激により活性化させた Jurkat細胞におい ても 2D7による増殖抑制は同様に見られなかった。
さらに、 2D7強陽性細胞である RPMI8226細胞においては予想に反して 2D7抗体 を添加しても、 細胞の形態、 増殖に目立った影響を与えなかった （図 7 D) 。 次に、 2D7抗体にさらに抗マウス IgG (Fc)抗体を加え、 抗体をクロスリンクさせ ることで細胞殺傷効果が見られるカゝ調べた。 Jurkat細胞に 2D7抗体存在下、 非存 在下で、 さらに抗マウス IgGを加え培養を行い、 48時間後、 細胞核を Hoechst332 58で染色し死細胞に特長的な細胞核の断片化が認められるカゝ観察した （図 8 ) 。 その結果、 Jurkat細胞において、 2D7をさらに抗体でクロスリンクすることで核 の断片化が観察され、 細胞死が誘導されていることが分かつた。
[実施例 4 ] 2D7抗体可変領域をコードする cDNAのクローニングおよび予想さ れる Diabodyの構造
マウス IgG2bの heavy chain, light chainの定常領域に対するプライマーを作 製し、 5' RACE法により 2D7可変領域をコードする DNAのクローニングを行った。 得られた PCR産物の塩基配列は配列番号： 1および 3に示したとおりである。 続いてこの配列をもとに single chainの構築を行った。 図 9およぴ図 1 O Aに 示すように 2D7 single chainは、 heavy chainのジーダーシークェンス、 heavy chainの可変領域、 そして 5merのリンカ一 （GGGGS) をはさんで light chainの 可変領域、 その後ろに flag - tagをコードする cDNA (配列番号： 5 ) から構成さ れる。 2D7 Diabodyはこの single chainが dimerizeすることで図 1 0 Bに示す ような構造を形成すると考えられる。
[実施例 5 ] 2D7 Diabodyの細胞傷害活性解析
(i) C0S7で一過性に発現させた 2D7 Diabodyの傷害活性
2D7 Diabody発現べクターを C0S7細胞にトランスフエタトし、 3日後に培養上 清を回収した。 培養上清、 及び cell lysateを SDS- PAGEし抗 Flag- tag抗体で we stern blotを行った結果、 培養上清中に 2D7 single chainが分泌されているこ とが確認された （図 1 0 C ) 。
この培養上清を Jurkat細胞に 50%の割合で添加し数日後に細胞を PI、 及び、 A nnexin Vで染色することで死細胞の割合を測定した。 Jurkat細胞は、 抗 BST- 1抗 体、 2D7抗体 （各 5 μ g/ml) を添加しただけではアポトーシスマーカーに大きな 変動は認められなかった。 また、 ベクターのみをトランスフエタトした C0S7の培 養上清でも特に変化は認められなかった。 一方、 2D7DBを発現させた C0S7の培養 上清を加えた Jurkat細胞では、 明らかな細胞死誘導が認められた （図 1 1 Aおよ ぴ図 1 1 B ) 。
次に、 この 2D7DBが HLA class I A特異的に作用していることを調べる目的で、 HLA class I Aを発現していないことが知られている K562細胞を用いて同様の実 験を行った。 その結果、 2D7DBは Jurkat細胞に対しては細胞死誘導活性を認めた ものの、 K562細胞に対しては全く影響を及ぼさなかった （図 1 2 Aおよぴ図 1 2 B ) 。 このことから 2D7DBの細胞死誘導活性はそのェピトープである HLA class I Aを標的にした作用であることが強く支持された。 また、 Jurkat細胞の 2D7DB に対する感受性は con Aで刺激した細胞の方が若干ではあるが高いような傾向が 各データから認められた。
次に他のミエローマ細胞株に対する 2D7DBの作用を解析した。 RPMI8226, IL-KM 3， U266, ARH77をベクターのみをトランスフエタトした培養上清 （コントロー ル） 、 あるいは 2D7DB発現 C0S7培養上清とインキュベートし、 二曰後に Annexin V， PIで二重染色し Flow cytometerで解析した。 その結果いずれの細胞も 2D7DB とのィンキュベートにより顕著に細胞死が誘導されることが明らかになった （図 1 3 A〜図 1 3 D) 。
(ii) 精製した 2D7DBの細胞傷害活性
精製した 2D7DBの各種細胞株 (RPMI8226, ARH77, U266, Jurkat) に対する増殖 抑制効果について解析した。 2D7DBを 0, 0. 5, 1. 0， 2. 0 μ g/mlで添加し 3日後 に細胞数を測定した。 その結果、 これらの細胞に対して濃度依存的に細胞増殖を 抑制することが分かった （図 1 4 ) 。
次に、 精製 2D7DBを添加し 48時間後に細胞死マーカーである PI, Annexin Vで 染めて解析を行った。 その結果、 C0S7で一過性に発現させた 2D7DBを用いた時の 結果と同様に Jurkat、 ARH77に対して濃度依存的に細胞死を誘導し、 K562にはま つたく影響を与えないことが明らかになった （図 1 5 A〜図 1 5 C) 。 また U266, IL-KM3に対しても 2D7DB添加 48時間後に著しい細胞死誘導活性が認められた (図 1 6 Aおよぴ図 1 6 B) 。
一方、 付着細胞である HeLa細胞に対しては、 この細胞は 2D7抗体で非常によく 染色されるにも関わらず、 同条件で 2D7DBは全く影響を及ぼさなかった （図 1 5 D) 。 このことから、 2D7DBは血球系細胞など浮遊細胞にのみ特異的に作用する 可能性が示唆された。
続いて、 2D7DBによる細胞死誘導活性がどれくらいの時間で誘導されるカゝ解析 した。 ARH77, Jurkat細胞に 2D7DBを 2 // g/mlで添カ卩し、 12、 24、 38時間後に細 胞を回収し、 細胞死マ一カーで染色した。 その結果、 いずれの細胞も 12時間後で 既に細胞死が誘導されていることが判った （図 1 7 Aおよぴ図 1 7 B) 。 そこで、 さらに早い時閒 （3時間、 6時間） における細胞死誘導を調べた。 驚いたことに 2 D7DBは添加してから少なくとも 3時間以内に細胞死を誘導することが実験から明 らかになつた （図 1 8 Aおよぴ図 1 8 B ) 。 これらの結果から 2D7DBは非常に強 力な細胞死誘導活性を有することが強く支持された。 このように 2D7DBは強力に 細胞死を誘導するので、 短い血中半減期でも十分な薬効が期待できる。 さらに、 w hole抗体が仮に強力な細胞死誘導活性を有した場合には、 血中半減期の長さから 安全性の問題が懸念されるが、 Diabody化することにより、 そのような問題もク リアされることが考えられる。
次に、 2D7DBによる細胞死がカスパーゼの活性ィ匕を伴って引き起こされる、 い わゆるアポトーシスによるものかどうかについて解析を行った。 図 1 9、 図 2 0 で示すように ARH77, Jurkat細胞をアポトーシス誘導剤である Actinomycin Dで 処理し 16時間後に Annexin V, PIで細胞を染色すると顕著にアポトーシスが誘導 された。 この条件下であらかじめ細胞をカスパーゼ阻害剤である Z-VAD-FMKで 2. 5 時間前処理すると Actinomycin D によるアポトーシスは抑制された。 ところ力 2D7DBによつて誘導される細胞死は Z - VAD- FMKによる前処理を行つてもまったく 阻害されなかった。 これらの結果から、 2D7 Bはカスパーゼを介した通常のアポ トーシスの機構とは異なる別の機構によつて細胞死を誘導していることが明らか になった。
さらにこのことを確認するため、 アポトーシスに伴う最も特徴的生化学的変化 として知られているクロマチン DNAの断片化に関しても解析を行った。
ARH77, Jurkat細胞を 2D7DB (2 μ g/ml)、 あるいは Actinomycin Dで処理し 24 時間後に DNAを回収し、 電気泳動を行った （図 2 1 ) 。 その結果、 アポトーシス 誘導剤である Actinomycin D処理した細胞はいずれもアポトーシスの特徴である DNAの断片化が誘導されていたが、 その一方で、 2D7DB処理した細胞では完全に細 胞死を誘導しうる濃度の 2D7DBを添加しているにも関わらず DNAの断片化は全く 認められなかった。 この結果からも、 2D7DBによる細胞死は、 アポトーシスの特 徴を伴わない未知の細胞死であることが強く支持された。
以上の結果より 2D7DBによる細胞死はこれまで知られている細胞死誘導機構とは 異なる経路を介して引き起こされていることが分かった。 そこで、 2D7DBによる細 胞死誘導のメカニズムを明らかにするため、 さらに解析を行った。 これまでの実 験から、 細胞に 2D7DBを反応させると細胞膜が破壊されている様子が顕微鏡下でし ばしば観察されていた。 このことから、 2D7DBがァクチン骨格系に何らかの影響を 及ぼしていると推測した。 その可能性に関して検討するため、 ァクチン重合阻害 剤 （サイトカラシン D) を細胞に作用させ、 2D7DBの細胞死誘導活性に対する影響 について解析を行った。
ARH77細胞にサイトカラシン D (20ug/ml)を、 またはエタノーノレのみ （コントロー ル） を添加し、 1時間後に 2D7DBを各濃度で加えた。 2D7DB添加から 4時間インキュ ペート後に細胞を回収し、 PI染色を行い死細胞の割合を測定した （図 2 2 ) 。 そ の結果、 サイトカラシン Dであらかじめ細胞を処理することにより、 2D7DBに対す る感受性が消失することが分かった。 この結果から、 2D7DBはその標的分子である HLA - classIAに結合することで、 ァクチンなど細胞骨格系に何らかの作用を及ぼし 細胞死を誘導することが示唆された。
そこで、 2D7DBを作用させた細胞をァクチン抗体で染色し、 2D7DBの添加による 細胞骨格系の動態変化について視覚的な解析を行った。 ARH77細胞に 2D7DBを作用 させ 15分後にメタノールで固定し細胞内のァクチン （赤） の様子を免疫染色によ り調べた（図 2 3 )。 その結果、 2D7DB非処理の像に比べて、 2D7DBにより細胞内ァ クチン骨格系が著しく破綻している様子が観察された。
以上の結果から、 2D7DBによる細胞死は、 HLA classIAに結合した 2D7DBが細胞内 了クチン骨格系を破壊することで引き起こされている可能性が強く示唆された。 これは、 これまで報告されていない、 全く新しいタイプの細胞死誘導機構である。
[実施例 6 ] 2D7 diabodyのヒト骨髄腫モデル動物での薬効試験
( 1 ) ヒト骨髄腫マゥスモデノレの作製
ヒト骨髄腫マウスモデルは以下のように作製した。 ARH77細胞 （ATCC) を 10% ゥシ胎児血清 （GIBC0 BRL社製） を含む RPMI1640培地 （GIBCO BRL社製） で 2. 5 X 107個 ZmLになるように調製し、 あらかじめ前日抗ァシァロ GM1抗体 （和光純 薬社製） 0. 2 mgを 内投与した SCIDマウス （ォス、 6週齢、 日本クレア） に 上記 ARH77細胞懸濁液 200 z L (5 X 106個/マゥス ) を尾静脈より注入した。
( 2 ) 投与抗体の調製
2D7diabodyを投与当 3、 濾過滅菌した PBS (-）を用いて、 0· 8 mg/mLになるよう に調製し、 投与試料とした。
( 3 ) 抗体投与
( 1 ) で作製したヒト骨髄腫マウスモデルに対し、 ARH77細胞移植後 1日目よ り、 1 日 2回、 3日間、 上記 （2 ) で調製した投与試料を 10 mL/kgにて、 尾静脈 より投与した。 陰性対照 （vehicle) として、 濾過滅菌した PBS (-)を同様に 1日 2 回、 3ョ間、 10 mL/kgにて、 尾静脈より投与した。 抗体投与群は 1群 7匹、 veMc le投与群は 1群 8匹で行つた。
( 4 ) マウス血清ヒト IgG定量法
マウス血清中における、 ヒト骨髄腫細胞が産生するヒト IgGの定量は、 以下の ELISAで行った。 0. 1 %重炭酸緩衝液 (pH9. 6) で 1 g/mLに希釈したャギ抗ヒト IgG抗体 （BI0S0URCE社製） 100 Lを 96ゥエルプレート （Nunc社製） に加え、 4 °Cでー晚インキュベーションし、 抗体を固相化した。 ブロッキングの後、 段階 希釈したマウス血清あるいは標品としてヒト IgG (Cappel社製） 100 μ Lを添加 し、 室温にて 1時間インキュベーションした。 洗浄後、 5000倍希釈したアルカリ フォスファターゼ標識抗ヒト IgG抗体 （BI0S0URCE社製） 100 Lを力 [Iえ、 室温に て 1時間インキュベーションした。 洗浄後、 基質溶液を加え、 インキュベーショ ンの後、 MICROPLATE READER Model 3550 (BioRad社製） を用いて 405 nmの吸光 度を測定し、 標品のヒト IgGの吸光度より得られた検量線から、 マウス血清中の ヒ ト IgG濃度を算出した。
( 5 ) 抗腫瘍効果の評価
2D7diabodyのヒト骨髄腫マウスモデルに対する抗腫瘍効果については、 当該骨 髄腫細胞が産生するヒト IgG (Mタンパク質） のマウス血清中の量の変化、 及び 生存期間で評価した。 マウス血清中のヒト IgG量の変化については、 ARH77細胞 移植後 24日目に血清を採取し、 上記 （4 ) で述べた ELISAを用いてヒト IgG量を 測定した。 その結果、 Vehicle投与群では、 血清ヒト IgG (Mタンパク質） 量が約 74 μ g/mLまで上昇しているのに対し、 2D7diabody投与群では対照群に比べ有意に 低く （Pく 0. 005, 対応のない t検定） 、 2D7diabodyが ARH77細胞の增殖を非常に 強く抑制していることが示された （図 2 4 ) 。 一方、 生存期間についても図 2 5 に示すとおり、 2D7diab0dy投与群では vehicle投与群と比較して有意な生存期間 の延長が認められた。
以上より、 2D7diabodyがヒト骨髄腫マウスモデルに対して、 抗腫瘍効果を有す ることが示された。 本発明の 2D7diab0dyの抗腫瘍効果は、 当該抗体が有する細胞 死誘起作用に基づくと考えられる。
[実施例 7 ] PBMCに対する 2D7DBの作用解析
ヒト末梢血単核球 (peripheral blood mononuclear cell, PBMC)に対する 2D7DB の作用を解析した。 健康成人ポランティアの末梢血より比重遠心分離にて PBMCを 精製した。 この PBMCをマイトゲン存在下または非存在下で 24穴プレートに 5 X 1 05 cells /1 mL /ゥエルずっ播いた。 マイトゲンにはフィトへマグルチニン M (P HA- M、 Roche Diagnostics, 終濃度 10 g/mL)、 コンカナパリン A (ConA、 Wako、 終濃度 10 /z g/mL)、 SAC (Pansorbin Cells, Calbiochem, 終濃度 0. 01%)を用いた。 5%∞2ィンキュベータ一にて 37°Cにて 3日間培養し、 培養終了の 24時間前また は 3時間前に 2D7DBを終濃度 2 μ g/mLになるように添加した。 培養終了後に Anne xin V、 PIで二重染色し（Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit I、 Pharming en)フ口一サイトメーター (EPICS XL、 Coulter)にて解析した。なお陽性対照として マイトゲン非存在下にて、 ARH77を 2. 5 X 105 cells /1 mL /ゥエルずつ 24時間培 養し、 PBMCと同様にして 2D7DBと反応させた。
PBMCの場合、 Annexin V · PI共陽性である死細胞の割合はマイトゲン非存在下 では、 29%、 23%、 25% (順に 2D7DB非添加、 3時間添加、 24時間添加、 以下同）、 PHA- M存在下では、 20%、 45%、 42%、 ConA存在下では、 22%、 30%、 34%、 SAC 存在下では、 31%、 38%、 40%であった （図 2 6 A〜図 2 6 D) 。 ARH77 の場合、 16%、 56%、 58%であった （図 2 6 E) 。 以上から 2D7DBは無刺激の PBMCにはほ とんど影響を与えず、 マイトゲンにて活性化した PBMCに短時間で細胞死を誘導す ることが明らかとなった。 産業上の利用の可能性 本発明によって、 高比活性の低分子化抗体を提供できるものと期待される。 該 低分子化抗体を使用することで、 短い半減期でも十分な薬効が期待でき、 さらに、 薬効と毒性の乖離が可能になるものと期待できる。 また、 臨床投与量の低減化お ょぴ生産コストの低減化など、 コスト全体の低減化が図れるので抗体医薬品の開 発上問題になる経済面問題の改善もまた期待される。

Claims

請求の範囲
1 . ヒト白血球抗原 （HLA) を認識する低分子化抗体。
2 . HLAが HLA class Iである、 請求項 1に記載の低分子化抗体。
3 . HLA class Iが HLA- Aである、 請求項 2に記載の低分子化抗体。
4. 2D7抗体の低分子化抗体。
5 . 低分子化抗体が Diabodyである請求項 1〜 4のいずれかに記載の低分子化 f几体。
6 . 以下の （a ) 〜 （d ) のいずれかに記載の低分子ィ匕抗体。
( a ) 配列番号： 6に記載のァミノ酸配列を有する低分子化抗体。
( b ) 配列番号： 6に記載のァミノ酸配列において 1もしくは複数のァミノ 酸配列が置換、 欠失、 挿入、 および/または付カ卩したアミノ酸配列を有 する低分子ィヒ抗体であって、 （ a )に記載の低分子化抗体と機能的に同等 な低分子化抗体。
( c ) 配列番号： 2の CDRおよび配列番号： 4の CDRのァミノ酸配列を有す る低分子化抗体。
( d ) 配列番号： 2の CDRおよび配列番号： 4の CDRのァミノ酸配列にお ヽ て、 1もしくは複数のアミノ酸配列が置換、 欠失、 挿入、 および Zまた は付加したアミノ酸配列を有する低分子化抗体であって、 （c ) に記載 の低分子化抗体と機能的に同等な低分子化抗体。
7 . HLAを認識する抗体を低分子化することによって、 活性が上昇した抗体を 製造する方法。
8 . HLAが HLA class Iである、 請求項 7に記載の方法。
9 . HLA class Iが HLA- Aである、 請求項 8に記載の方法。
1 0 . 2D7抗体を低分子化することによって、 活性が上昇した抗体を製造する 方法。
1 1 . 低分子化が Mabody化である、 請求項 7〜 1 0のいずれかに記載の方法。
1 2 . 活性が細胞死誘導活性又は細胞増殖抑制活性である、 請求項 7〜 1 1の いずれかに記載の方法。
1 3 . 請求項 1〜 6のいずれかに記載の低分子化抗体、 請求項 7〜 1 2のいず れかに記載の方法によって製造される低分子化抗体、 または 2D7抗体を有 効成分として含有する、 細胞死誘導剤。
1 4 . B細胞または T細胞に対する細胞死誘導であることを特徴とする、 請求 項 1 3に記載の細胞死誘導剤。
1 5 . B細胞または T細胞が、 活性化 B細胞または活性ィヒ T細胞である、 請求 項 1 4に記載の細胞死誘導剤。
1 6 . 請求項 1〜 6のいずれかに記載の低分子化抗体、 請求項 7〜 1 2のいず れかに記載の方法によって製造される低分子化抗体、 または 2D7抗体を有 効成分として含有する、 細胞増殖抑制剤。
1 7. 請求項 1〜 6のいずれかに記載の低分子化抗体、 請求項 7〜 1 2のいず れかに記載の方法によって製造される低分子化抗体、 または 2D7抗体を有 効成分として含有する、 抗腫瘍剤。
1 8 . 腫瘍が血液腫瘍である請求項 1 7に記載の抗腫瘍剤。
1 9 . 請求項 1〜 6のいずれかに記載の低分子化抗体、 請求項 7〜 1 2のいず れかに記載の方法によって製造される低分子化抗体、 または 2D7抗体を有 効成分として含有する、 自己免疫疾患治療剤。
2 0 . 抗体が Diabodyである請求項 1 3〜 1 5のいずれかに記載の細胞死誘導 剤。
2 1 . 抗体が Diabodyである請求項 1 6に記載の細胞増殖抑制剤。
2 2 . 抗体が Diabodyである請求項 1 7または 1 8に記載の抗腫瘍剤。
2 3 . 抗体が Diabodyである請求項 1 9に記載の自己免疫疾患治療剤。
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