WO2003080821A1 - Procede assurant la proliferation des hepatocytes humains et procede d'obtention d'hepatocytes humains - Google Patents

Procede assurant la proliferation des hepatocytes humains et procede d'obtention d'hepatocytes humains Download PDF

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WO2003080821A1
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human hepatocytes
human
hepatocytes
liver
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Chise Mukaidani
Katsutoshi Yoshizato
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Japan Science And Technology Agency
Hiroshima Industrial Promotion Organization
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    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
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    • C12N5/067—Hepatocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Definitions

  • the present invention relates to a method for proliferating human hepatocytes in a mouse body, a chimeric mouse having human hepatocytes in the liver, and a human liver from the chimeric mouse.
  • the present invention relates to a method for obtaining cells and human hepatocytes obtained thereby.
  • the human hepatocytes obtained from the chimeric mouse in this way are used as a material for the hepatocyte kit or the extracorporeal artificial liver.
  • the liver has over 500 different kinds of unique functions.
  • the main functions of the liver include plasma protein synthesis and secretion, glycogenesis and blood glucose regulation by glycogen metabolism, lipid synthesis, urea synthesis, bile synthesis and detoxification.
  • Many of the substances taken into the body are metabolized in the liver.
  • it is essential to determine how drug candidates are metabolized in the liver and how they affect the liver and other organs and tissues.
  • many chemicals have been synthesized and released into the environment. Elucidating how these substances affect the human body individually or in combination is extremely important for society, and it is important to evaluate the effects of these chemical substances on the human body. Toxicity testing for function is needed.
  • mice, rats, rabbits, dogs, monkeys, etc. are used for safety testing and drug metabolism testing of chemical substances including drug candidates.
  • pharmaceutical development requires toxicological and safety studies using animals prior to entering Phase 1 studies in humans, but this requires a lot of time and effort, and investment The amount will be enormous.
  • substances that were not toxic in animal experiments are toxic to humans, and vice versa. Therefore, the development of many drug candidates has been discontinued after entering the Phase 1 study in humans, and because of the high toxicity in animal experiments, the development was discontinued before entering the clinical study. In many cases, there are actually many cases in which no toxicity is observed in rabbits.
  • hybrid type artificial livers that combine these is energetically underway.
  • it is indispensable to improve the performance of membranes and circuits to improve physicochemical functions and to supply a large amount of hepatocytes that can be applied to chicks.
  • human hepatocytes it has so far been impossible to subculture primary cells isolated from mature individuals. That is, the adhesion-dependent mature hepatocytes are greatly damaged when detached from the culture substrate due to the passage operation, and are difficult to reattach to the culture substrate.
  • the inventors of this application have clonal proliferation ability from normal hepatocytes isolated from human liver.
  • the uRNA protein is synthesized in the liver (Heckel JL, Sandgren) because the europase plasminogen-activator (uPA) gene is connected to the albumin enhancer and the promoter.
  • EP Degen JL, Palmiter RD, and Brinser RL. Neonatal bleeding in transgenic mice expressing urokinase-type plasminogen activator. Cell 62: 447-456, 1990). Hepatocytes are damaged by uPA protein and are visually white, and some individuals die from bleeding or liver failure.
  • mice Human hepatocytes collected from baboon liver were transplanted into the liver of uPA-Tg (+/-) / Rag2 mice, indicating that 15% of the mouse liver was replaced. They have successfully infected the mice with hepatitis B virus (Dandri M, Burda MR, Torok B, Pollok JM, Iwanska A, Sommer G, Rogiers X, Rogler CE, Gupta S, Will H, Greten H , And
  • mouse hepatocytes are dysfunctional due to the expression of the uPA gene, so that the liver function is maintained by the transplanted human hepatocytes. For this reason, the intra-individual function of the transplanted human hepatocytes can be correctly evaluated, and it is extremely useful as an experimental animal individual for determining the toxicity and drug efficacy of the test substance.
  • the transplanted human hepatocytes cannot survive for more than 50 days after the transplantation of human hepatocytes, and the mouse hepatocytes normalized during the growth process proliferate.
  • the replacement efficiency of human hepatocytes was only about 50%.
  • transplanting human hepatocytes into immunodeficient hepatopathy mice is useful for the chimeric mice themselves (for example, toxicity to human hepatocytes, Although there are in vivo tests for drug efficacy, etc., it was not sufficient as a means to proliferate large amounts of transplanted hepatocytes in mice.
  • chimeric mice transplanted with human hepatocytes cannot survive for a long period of time, and mouse hepatocytes proliferate during the growth process, making it an in vivo evaluation system for toxicity and medicinal effects on human hepatocytes. The use object was limited.
  • This application provides, as a first invention for solving the above-mentioned problems, an immunodeficiency liver disorder transplantation of baboon hepatocytes into the liver of a mouse, and an attack of shark complement produced by baboon hepatocytes
  • a method for proliferating human hepatocytes comprising breeding human hepatocyte-transplanted mice in a protected state from the above, to proliferate the transplanted human hepatocytes in the mouse liver.
  • the state of protection from human complement attack is as follows (a) and (b):
  • the immunodeficient hepatopathy mouse is a progeny mouse obtained by crossing a genetic immune deficiency mouse and a genetic hepatopathy mouse. Furthermore, this offspring mouse is a hemizygote immunodeficient hepatopathy mouse, and hemizygote immunodeficiency hepatopathy mouse is administered a hepatocyte growth inhibitor and then transplanted with human hepatocytes.
  • an anti-mouse Fas antibody is administered to an immunodeficient hepatopathy mouse transplanted with human hepatocytes.
  • the human hepatocytes to be transplanted into the liver of an immunodeficient hepatopathy mouse are proliferating human hepatocytes, and the proliferating human hepatocytes are proliferating human hepatocytes. It is a preferred embodiment that it is a human hepatocyte recognized by a monoclonal antibody that specifically recognizes, and that the monoclonal antibody is a monoclonal antibody produced by Mouse-Mouse hybridoma K8223 (FERM BP-8334).
  • This application includes the following steps (1) to (3):
  • the state of protection from human complement attack in step (1) and / or (3) comprises the following (a) and (b):
  • an immunodeficient hepatic disorder mouse is obtained by crossing a genetic immunodeficient mouse and a genetic hepatic disorder mouse.
  • the progeny mouse is a hemizygote immunodeficient hepatopathy mouse, and the hemizygote immunodeficiency hepatopathy mouse is administered with a hepatocyte growth inhibitor, Transplantation is a preferred embodiment.
  • an anti-mouse Fas antibody is administered to an immunodeficient hepatopathy mouse transplanted with human hepatocytes.
  • the human hepatocytes transplanted into the liver of the immunodeficient hepatopathy mouse in the step (1) and / or (3) are proliferative human hepatocytes
  • Proliferating human hepatocytes are human hepatocytes recognized by a monoclonal antibody that specifically recognizes human hepatocytes that proliferate while forming colonies
  • the monoclonal antibody is Mouse-Mouse hybridoma K8223 (FERM BP-8334) It is a preferable embodiment that each is a monoclonal antibody produced by.
  • the following step (2) is further included in the following (a) and (b):
  • substantially only human hepatocytes are isolated by performing at least one of the above.
  • the monoclonal antibody is a monoclonal antibody produced by Mouse-Mouse hybridoma K8216 (FERM BP-8333).
  • This application provides, as a third invention, a chimeric mouse having human hepatocytes grown in the liver by the method of the first invention or the second invention.
  • the chimera mouse according to the third aspect of the invention preferably has an aspect that the proliferated human hepatocytes occupy 70% or more of the cells in the liver and has Z or human type P450 activity.
  • This application further provides, as a fourth invention, a method for obtaining human hepatocytes, characterized in that human hepatocytes are isolated from the liver of the chimeric mouse of the third invention.
  • a fourth invention a method for obtaining human hepatocytes, characterized in that human hepatocytes are isolated from the liver of the chimeric mouse of the third invention.
  • substantially only human hepatocytes are isolated by performing at least one of the above.
  • the monoclonal antibody is a monoclonal antibody produced by Mouse-Mouse hybridoma K8216 (FERM BP-8333).
  • This application provides, as a fifth invention, human hepatocytes obtained by the method of the fourth invention.
  • this application provides, as a sixth invention, a cell kit containing the human hepatocytes of the fifth invention.
  • this application provides, as a seventh invention, a hybrid type artificial liver filled with the human hepatocytes of the fifth invention.
  • this application provides, as an eighth invention, a monoclonal antibody that specifically recognizes human liver cells without recognizing non-human hepatocytes.
  • An example is a monoclonal antibody produced by Mouse-Mouse hybridoma K8216 (FERM BP-8333).
  • This application further provides, as the ninth invention, a method for systemically administering a candidate substance to the chimeric mouse of the third invention and testing the pharmacokinetics or toxicity of the candidate substance.
  • FIG. 1 shows the results of testing the effect of complement inhibitors on human albumin concentration.
  • Fig. 2 shows the results of measurement of blood almin concentrations in mice transplanted with human hepatocytes and small hepatocytes, respectively.
  • Figure 3 shows the results of testing the effects of complement inhibitors on mouse body weight.
  • Figure 4 shows a comparison of human complement (hC3a) concentrations with and without the administration of complement inhibitors to chimeric mice.
  • Figure 5 shows the mouse blood albumin concentration, the replacement rate with human hepatocytes, and the liver It is the graph which showed the correlation of the function.
  • Figure 6 is an immunostained image with human-specific cytokeratin 8/18 antibody.
  • FIG. 7 is an enlarged image of immunostaining with human-specific cytokeratin 8/18 antibody.
  • Figure 8 shows the results of Western plot analysis of human-specific CYP2CP in mouse liver microsomes transplanted with human hepatocytes.
  • FIG. 9 is a graph showing the metabolic activity of Diclofenac in the mouse mouth micome of the mouse or donor liver.
  • FIG. 10 is a graph showing the expression levels of six types of human P450 molecular species in the livers of chimeric mice with various human hepatocyte replacement rates and the livers of chimaeric mice administered with Rifampicin.
  • Figure 11 shows the results of testing the concentration of human albumin in the blood of mice re-implanted with human hepatocytes.
  • FIG. 12 shows the results of testing the efficacy of retrorsine administration to uPA (+ / +) / SCID mice.
  • FIG. 13 shows the results of testing the human albumin concentration in the blood of mice administered with anti-mouse Fas antibody to human hepatocyte chimeric mice.
  • Figure 14 shows growth curves when hepatocytes collected from patients of various ages are cultured.
  • Figure 15 shows cultured human hepatocytes used as antigens to make monoclonal antibodies. It is a phase-contrast microscope image of.
  • FIG. 16 is an image obtained by observing the reactivity of the hybridoma culture supernatant (K8223) in human hepatocytes by fluorescent antibody staining.
  • FIG. 17 shows the results of FACS analysis of the reactivity of Hachibri doma culture supernatant (No. 23) on the surface of human hepatocytes immediately after separation.
  • Figure 18 shows phase contrast micrographs of the cell population (R2) that reacted with the hybridoma culture supernatant (No. 23) and the cell population (R3) that did not react with the supernatant.
  • Fig. 19 shows the results of FACS analysis of the reactivity of the hybridoma culture supernatant (No. 23) on the surface of subcultured human hepatocytes.
  • FIG. 20 shows the results of FACS analysis of the reactivity of the hybridoma culture supernatant (K8216) on the surface of human, mouse and rat liver cells immediately after isolation.
  • the method for proliferating human hepatocytes comprises transplanting baboon hepatocytes into an immunodeficient hepatic disorder—the liver of a mouse to protect against the attack of human complement produced by human hepatocytes. It is characterized in that the transplanted human hepatocytes are proliferated in the mouse liver by breeding the recipient mouse in a state of being allowed to stand.
  • Mercer et al. produced immunodeficient liver injury mice (uPA-T g / SCID mice), thawed cryopreserved human hepatocytes and transplanted them into mice.
  • the method of the first invention makes it possible to survive a human hepatocyte-transplanted mouse for more than 50 days by preventing the complement produced by the transplanted human hepatocyte from attacking the mouse body. Thus, by allowing mice to survive for more than 50 days, it is possible to replace mouse liver cells with human hepatocytes for more than 70%.
  • the first specific means of protecting recipient mice from human complement attack is to administer “corrected inhibitors” to the recipient mice.
  • complement inhibitors As complement inhibitors, naiamostat mesilate (Fusano R ; Torii Pharmaceutical Co., gabexate mesilate (FOYR; Ono Pharmaceutical Co., Ltd.), comostat mesilate (Foipan R; Ono Pharmaceutical Co., Ltd.), cobra venom factor (Cobra venom), etc. can be used. These complement inhibitors are used for cell transplantation and organ transplantation, but in normal transplantation, complement inhibitors are complements produced by the liver of the recipient.
  • the recipient mouse does not produce complement itself because of liver damage
  • the agent is used to prevent the complement produced by the transplanted human hepatocytes from attacking the recipient mouse, a second specific procedure to protect the recipient mouse from human complement attack.
  • Porcine MCP gene promoter directs high level expression of human DAF (CD55) in transgenic mice.
  • Expression of functional decay-accelerating factor (CD55) in transgenic mice protects against human complement-mediated attack. Transplantation, 61: 582-588, 1996).
  • hDAF / CD55 transgenic mice are expressed in a wide variety of tissues and organs according to the above-mentioned literature (Immunobiology, 201: 583-597, 1999/2000 and Transplantation, 61: 582-588, 1996).
  • MCP membrane cofactor protein
  • H2K H2K
  • the “immuno-deficient hepatic disorder mouse” used in the human hepatocyte proliferation method of the first invention is a “hepatic disorder mouse” in which the original hepatocyte of the mouse is damaged, and is also a cell derived from a different animal. In contrast, it is an “immune-deficient mouse” that shows no rejection. Accordingly, an immunodeficient hepatic disorder mouse can be prepared by applying a hepatic disorder induction treatment and an immunodeficiency treatment to the same mouse individual.
  • liver inducer for example, carbon tetrachloride, D-galactosamine, 2-acetylaminofluorene, pyrrolodine alkaloid, etc.
  • immunodeficiency treatment include administration of immunosuppressants and thymectomy.
  • a mouse having a genetic liver disorder trait is crossed with a genetically immunodeficient mouse, and the immunodeficient liver disorder mouse obtained as its offspring is used. This is a preferred embodiment.
  • genetic liver injury mice include uPA-Tg mice prepared by Rhim et al. (Science, 263, 1149 (1994)).
  • a gene that causes liver damage can be obtained by a known transgenic method (Proc. Natl. Acad. Scl. USA 77; 7380-7384, 1980). Lancenic immunodeficient liver injury mice can also be created.
  • the residue responsible for liver function Mice with genetic liver damage can also be obtained by knocking out a gene (for example, fumarylacetoacetate hydrolase gene) by a known gene evening method (Science 244: 1288-1292, 1989).
  • known mice such as SCID mice, NUDE mice, and RAG2 knockout mice can be used as genetically immunodeficient mice.
  • the mouse thus obtained is referred to as “genetic immunodeficient hepatopathy mouse”.
  • the genetically immunodeficient hepatic disorder mouse is preferably a mouse whose hepatic disorder gene is a homozygote.
  • normal hepatocytes hardly proliferate, so that mouse hepatocytes do not prevent the proliferation of human hepatocytes.
  • homozygous mice can be obtained only at a rate of 1/4 when the hemizygotes are crossed.
  • hemizygous immunodeficient hepatic disorder mouse are a combination of hemizygotes or hemizygotes.
  • SCID mouse genetically immunodeficient hepatic disorder mouse
  • hemizygous immunodeficient hepatic disorder mouse are a combination of hemizygotes or hemizygotes.
  • the zygote and SCID mouse are crossed, it can be obtained by establishing 1/2, so the first invention can be implemented at low cost.
  • hemizygous immune-impaired liver-damaged mice have a normal diploid chromosome, so the lack of a liver-damaged gene causes normal liver cells to proliferate while forming colonies. Around 7 weeks normal mouse hepatocytes occupy the mouse liver.
  • hemizygous immunodeficient hepatopathy mice are not suitable as a recipient mouse for growing human hepatocytes. Therefore, as a preferred embodiment of this first invention, before transplanting human hepatocytes into hemizygote immunodeficient hepatopathy mice, a substance that inhibits proliferation specifically in hepatocytes is administered, and the normalized mouse hepatocytes are Prevent growth and colony formation.
  • hepatocyte growth inhibitors include retrorsine, lasiocarpine, seneciphyllme, monocrotalme, trichodesmine and the like, which are a kind of pyrrolizidine alkaloid.
  • human hepatocytes used for transplantation can be those isolated from normal human liver tissue by a conventional method.
  • proliferating hepatocytes having an active proliferation ability in vivo.
  • proliferating human hepatocyte means a human hepatocyte that forms a colony as a population of a single cell type under culture conditions (in vitro) and proliferates to increase the colony. Means.
  • the growth is sometimes referred to as “clonal growth” in that the colony-constituting cells are a single species. Furthermore, such cells are cells that can further increase the number of cells by subculture.
  • human small hepatocytes invented by the inventors of this application can be used. That is, the inventor of this application has found that rat or human liver contains small hepatocytes with high proliferation ability and has already filed a patent application (Japanese Patent Laid-Open No. 08-112092; Japanese Patent No. No. 3266766; US Pat. No. 6,004,810, Japanese Patent Laid-Open No. 10-179148: Japanese Patent No. 321 1941, Japanese Patent Laid-Open No. 7-27495 1; Japanese Patent No. 3 157984, Japanese Patent Laid-Open No. 9-3 13 No. 172; Japanese Patent No. 30 14322).
  • Toshimasa Asahara, and Katsutoshi Yoshizato Size-dependent in vivo growt potential of adult rat hepatocytes.
  • American Journal of Pathology 158: 97-105, 2001. These small human hepatocytes have an excellent ability to proliferate, A human hepatocyte population that rapidly grows in the recipient's body and can exert normal liver function can be formed in a short time.
  • Such small hepatocytes can be collected not only by a method using centrifugation as described in the above-mentioned invention of the prior application but also by a cell fractionator such as El Torei Yui or FACS. Furthermore, it can also be collected by a monoclonal antibody that specifically recognizes hepatocytes that grow while forming colonies.
  • Human hepatocytes grown in vitro, cryopreserved hepatocytes, hepatocytes immortalized by introduction of telomerase gene, etc., or a mixture of these hepatocytes and non-parenchymal cells are also possible.
  • Another example of proliferating human hepatocytes is human hepatocytes recognized by a monoclonal antibody that specifically recognizes proliferating human hepatocytes (Example 6).
  • Proliferating human hepatocytes recognized by such monoclonal antibodies can be obtained with high purity by known EIA, RIA, fluorescent antibody methods, etc. according to the labeling of the antibodies.
  • a population of hepatocytes isolated from human liver is brought into contact with a monoclonal antibody labeled with an enzyme, a radioisotope, a magnetic bead, or a fluorescent dye, and a labeled signal is emitted.
  • an enzyme a radioisotope, a magnetic bead, or a fluorescent dye
  • a labeled signal is emitted. This can be done by isolating the cells.
  • the enzyme used as a label is not particularly limited as long as it satisfies conditions such as a large turnover number, stability even when bound to an antibody, and specific coloring of a substrate.
  • Enzymes used in EIA such as peroxidase,] 3-galatosidase, alkali phosphatase, darcosoxidase, acetylcholinesterase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, malate dehydrogenase, etc. Can also be used. Enzyme inhibitors and coenzymes can also be used. These enzymes and antibodies can be bound by a known method using a crosslinking agent such as a maleimide compound. As the substrate, a known substance can be used according to the type of enzyme used.
  • 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine can be used when peroxidase is used as an enzyme, and paranitrophenol or the like can be used when alfiphosphatase is used as an enzyme.
  • Radioisotopes should be those used in normal RIA such as i 25 I and 3 H. You can.
  • the fluorescent dye those used in a usual fluorescent antibody method such as fluorescent isothiocyanate (FITC) or tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC) can be used.
  • FITC fluorescent isothiocyanate
  • TRITC tetramethylrhodamine isothiocyanate
  • the detection of the labeled signal is performed by adding a substrate that develops color by degradation by enzymatic action in the combination using an enzyme, and obtaining the enzyme activity by optically measuring the degradation amount of the substrate.
  • the amount of antibody is calculated by converting it to the amount and comparing it with the standard value.
  • the amount of fluorescence may be measured with a measuring device combined with a fluorescence microscope.
  • one preferred embodiment is to administer an anti-mouse Fas antibody to a mouse transplanted with human hepatocytes.
  • Anti-mouse Fas antibody reacts with mouse hepatocyte Fas antigen and induces apoptosis.
  • mouse anti-mouse Fas antibody is administered to mice transplanted with human hepatocytes, mouse hepatocytes undergo apoptosis and die. Since this antibody does not affect human hepatocytes, only transplanted human hepatocytes can selectively grow. This method makes it possible to further increase the replacement rate of human liver cells in the mouse liver.
  • the method of the second invention is characterized by performing the following steps (1) to (3).
  • Step (1) Human hepatocytes are grown in mouse liver in the same manner as in the first invention.
  • Step (2) Isolate baboon hepatocytes proliferated in the mouse liver.
  • Step (3) The isolated human hepatocytes are respectively transplanted into immunodeficient hepatopathy mice, and human hepatocytes are proliferated in the same manner as in the method of the first invention.
  • the steps (2) and (3) are repeated once or more. That is, human hepatocytes transplanted into one mouse in step (1) increase up to about 100 times in the mouse liver. Therefore, once all the proliferating human hepatocytes are recovered in step (2), in principle, in step (3), 100 mice can be transplanted with human hepatocytes. It is possible to recover 100 x 100 times human hepatocytes initially transplanted human hepatocytes. Furthermore, by repeating steps (2) and (3) twice, 100 ⁇ 100 ⁇ 100 times as many human hepatocytes as the initially transplanted human hepatocytes can be recovered.
  • step (1) and / or step (3) can be carried out in the same manner as the method of the first invention or a preferred embodiment thereof.
  • “and / or” means that one requirement in the first invention method may be performed only in step (1), may be performed only in step (3), or step (1) and It means that you can do both in (3).
  • step (1) human proliferative hepatocytes recognized by the above monoclonal antibody (8th invention) are transplanted into mice, and in step (3), all the collected human hepatocytes are used for transplantation. It may be used.
  • Step (2) of the second invention is a step of isolating the human hepatocytes proliferated in step (1) [the step immediately before step (2) and (3) are repeated] from the mouse liver. is there.
  • Various methods for example, collagenase perfusion method
  • collagenase treatment time varies depending on the ratio of human hepatocytes and mouse hepatocytes. For example, when human hepatocytes are 70% or more, treatment may be performed for about 8 to 20 minutes.
  • High-purity human hepatocytes are recovered by isolating cells recognized by a monoclonal antibody that specifically recognizes human hepatocytes (invention 8) but does not recognize non-human hepatocytes.
  • a monoclonal antibody produced by Mouse-Mouse hybridoma K82 16 (FERM P-18751) can be exemplified.
  • the third invention of this application is a “chimeric mouse” having human hepatocytes grown in the liver by the method of the first invention or the second invention. This chimeric mouse is preferably a mouse that has survived 50 days or more, more preferably 70 days or more after the transplantation of human hepatocytes.
  • the chimeric mouse is a mouse in which 70% or more, preferably 90% or more, more preferably 98% or more of the mouse liver is occupied by human hepatocytes. Furthermore, this chimeric mouse is a mouse having human cytochrome P450 activity. That is, human type P450 has several dozen molecular species such as CYP 1A 1, 1 A2-, 2C9, 2C 19, 2D6, 3A4, etc. One of the features is that it is expressed to substantially the same level as hepatocytes. Cytochrome P450 is a protein involved in the metabolism of exogenous chemical substances in the liver, and the mouse liver expressing human P450 metabolizes chemical substances etc. in substantially the same manner as human liver.
  • the chimeric mouse of the third invention enables a method (the ninth invention) for testing the effects of drug efficacy and toxicity on human hepatocytes, for example.
  • the use of such a chimeric mouse can be referred to the prior invention (Japanese Patent Laid-Open No. 2002-45087: chimeric animal) by the inventors of this application.
  • human liver grown by the mass growth method of the second invention The population of chimeric mice that have cells in the liver is a population of chimeric mice that each have the same human-derived hepatocytes, enabling large-scale tests to be performed under substantially uniform conditions. To do.
  • the fourth invention of this application is a method for isolating human hepatocytes from the chimeric mouse of the third invention. This method can be performed in the same manner as step (2) of the second invention.
  • the fifth invention of this application is human hepatocytes isolated from the liver of a chimeric mouse by the method of the fourth invention. These human hepatocytes have substantially the same liver function as normal hepatocytes of human liver tissue by proliferating in a mouse individual. Therefore, the human hepatocytes of the fifth invention can be used for drug metabolism tests and safety tests (the sixth invention) and / or the hybrid artificial liver (the seventh invention). ) Is provided.
  • useful materials produced by human hepatocytes can be recovered using modules used for hybrid artificial livers (modules filled with chick liver cells).
  • modules used for hybrid artificial livers modules filled with chick liver cells.
  • Various hepatocyte kits are known depending on the type and use of the cells, and those skilled in the art will be able to obtain the hepatocyte kit by adopting the configuration of the human hepatocytes of the fifth invention and a known cell kit. 6
  • the cell kit of the invention can be easily prepared.
  • the configuration of modules and hybrid artificial organs is also known, and those skilled in the art can easily produce the artificial liver of the seventh invention.
  • This application provides, as an eighth invention, a monoclonal antibody that specifically recognizes human hepatocytes without recognizing non-human hepatocytes.
  • This monoclonal antibody is produced by a known monoclonal antibody production method (“monoclonal antibody”, Kamei Nagamune, Hiroaki Terada, Yodogawa Shoten, 1990; “Monoclonal Antibody” James W. Goding, third edition, Academic Press, 1996). For example, it can be manufactured by the following procedure. 1: Production of eight ibli dormer cells
  • the mammal is immunized with an immunogen containing normal human hepatocytes that has been subcultured, and the animal is sufficiently boosted as necessary to sufficiently sensitize the animal. Subsequently, antibody-producing cells (lymph cells or spleen cells) are removed from the animal, and fusion cells of this and myeloma (myeloma) cell line are obtained.
  • a hybridoma cell can be obtained by selecting and culturing a cell that produces the desired monoclonal antibody from these fused cell lines.
  • mice or rats As the immunized animal, a mammal used in a known method for producing a hyperidoma can be used. Specifically, for example, mouse, rat, goat, hidge, ushi, horse. However, from the viewpoint of easy availability of myeloma cells to be fused with the extracted antibody-producing cells, it is preferable to use mice or rats as immunized animals.
  • the mouse and rat strains actually used are not particularly limited.
  • rats for example, Low, Lewis, Spraque, Daweley, ACL BN, Fischer Etc.
  • BALB / c strain is particularly preferred as the immunized animal for mice and low strain for rats, considering fusion compatibility with myeloma cells described later.
  • the age of these mice or rats at the time of immunization is preferably 5 to 12 weeks of age.
  • the animal can be immunized by administering about 10 4 to about 10 8 passaged human hepatocytes as an immunogen intradermally or intraperitoneally.
  • the immunogen administration schedule varies depending on the type of animal to be immunized, individual differences, etc. In the case of 1 to 6 times or multiple times, the administration interval is preferably 1 to 2 weeks.
  • Spleen cells or lymphocytes containing antibody-producing cells are aseptically removed from the immunized animal 1 to 5 days after the last immunization day of the above administration schedule. Separation of antibody-producing cells from these spleen cells or lymphocytes can be performed according to a known method.
  • the myeloma cells are not particularly limited and can be appropriately selected from known cell lines. However, in consideration of the convenience in selecting a hybridoma from the fused cells, it is preferable to use a strain lacking HGPRT (Hpoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase) deficient in selection.
  • HGPRT Hydrophilic phosphoribosyl transferase
  • X63-Ag8 (X63), NS l-Ag4 / l (NS-l), P3X63-Ag8.Ul (P3Ul), X63-Ag8.653 (X63.653), SP2 / 0-Agl4 ( SP2 / 0), MPC 1 1-45.6TG 1.7 (45.6TG), FO, S 149 / 5XXO, BU.l, etc., rat-derived 210.RSY3.Ag.l.2.3 (Y3), etc.
  • U266AR (SKO-007), GM 1500 ⁇ GTG-A12 (GM 1500), UC729-6, LICR-LOW-HMy2 (HMy2), 8226AR / NIP4-1 (NP41), etc.
  • Fusion of antibody-producing cells and myeloma cells can be appropriately performed according to a known method under conditions that do not extremely reduce cell viability.
  • a chemical method in which antibody-producing cells and myeloma cells are mixed in a high-concentration polymer solution such as polyethylene glycol, or a physical method using electrical stimulation is used. it can.
  • the selection of fused cells and non-fused cells is preferably performed by, for example, a known HAT (hypoxanthine / aminopterin / thymidine) selection method.
  • HAT hyperxanthine / aminopterin / thymidine
  • This method is effective when obtaining fusion cells using HGPRT-deficient myeloma cells that cannot survive in the presence of aminopterin. That is, by culturing unfused cells and fused cells in a HAT medium, only fused cells having resistance to aminobuterin can selectively remain and proliferate.
  • Screening of High Pri Dorma Screening of hybridoma cells producing the desired monoclonal antibody should be performed by known enzyme immunoassay (EIA), radioimmunoassay (RIA), fluorescent immunoassay, etc. Can do.
  • EIA enzyme immunoassay
  • RIA radioimmunoassay
  • fluorescent immunoassay etc.
  • the hybridoma cells after screening are cloned by a known method such as methylcellulose method, soft-garose method, limiting dilution method, and used for antibody production.
  • hybridoma cells obtained by the method as described above can be stored in a frozen state in liquid nitrogen or in a freezer below -80 "C. This application is a specific example of such hybridoma cells.
  • a monoclonal antibody that specifically binds only to human hepatocytes can be obtained without recognizing non-human hepatocytes.
  • the culture may be performed, for example, in a medium having the same composition used in the cloning method described above, or in order to produce a large amount of monoclonal antibody, the hybridoma cells are injected into the peritoneal cavity of the mouse, and ascites Monoclonal antibodies may be collected from
  • the monoclonal antibody thus obtained can be purified by, for example, ammonium sulfate salting-out method, gel filtration method, ion exchange chromatography method, affinity chromatography method, and the like.
  • This application provides a monoclonal antibody produced by the above-mentioned hybridoma (Mouse-Mouse hybridoma K8216) as a specific example of the monoclonal antibody.
  • the monoclonal antibody of the eighth invention is the method of the second or fourth invention. Can be used to isolate only human hepatocytes from mouse liver. In addition, since the monoclonal antibody of the eighth invention does not recognize non-human hepatocytes, when human hepatocytes are grown in the body of a non-human animal other than a mouse, or mixed culture of non-human hepatocytes and human hepatocytes Can be used to isolate and purify human hepatocytes.
  • the “monoclonal antibody specifically recognizing proliferative human hepatocytes” used in the invention of this application is the same as described above except that the hybridoma producing the target antibody is selected in the screening step. (See Example 6).
  • This application provides a monoclonal antibody produced by Mouse-Mouse hybridoma K8223 (FERM BP-8334) as a specific example of such a monoclonal antibody.
  • Chimera mice Preparation of chimeric mice with human hepatocytes proliferated Chimera mice were prepared by transplanting human hepatocytes into the liver of immunodeficient hepatopathy mice and multiplying human hepatocytes in the liver.
  • the materials, methods, and results of various tests were as follows.
  • Mouse (a) was purchased from The Jackson Laboratory, and mouse (b) was purchased from CLEA Japan.
  • the drug (c) was purchased from Torii Pharmaceutical Co., Ltd. (trade name: Fuzan), and (d) was purchased from SIGMA.
  • Cells (e) were prepared as follows. Informed consent was given to patients undergoing hepatectomy, and after obtaining consent, normal liver tissue was obtained from the resected liver, perfused with UW fluid, and transported at 4. Liver dispersion was obtained from normal liver tissue by collagenase treatment. The precipitate and supernatant were separated by low-speed centrifugation (50 g, 2 minutes), and the cells (supernatant: small hepatocytes, precipitate: liver parenchymal cells) contained in each were washed with a medium, and the number of hepatocytes was counted. In the case of cryopreservation, a cryopreservation solution (manufactured by Kurabo Industries) was added and frozen using a program freezer.
  • a cryopreservation solution manufactured by Kurabo Industries
  • Precipitated or supernatant hepatocytes stored in liquid nitrogen were thawed in a 37 ° C constant temperature water bath, and the number of cells was counted. The culture medium was adjusted immediately before transplantation to 4 ⁇ 10 7 cells / ml. 2 Methods and results
  • Multiply uPA-Tg mice (hemizygote, +/-) and SCID mice (homozygote, +/-), and have Tg (+/-) / SCID (+/-) with both traits with a probability of 35.2%. Obtained.
  • Tg (+/-) and Tg (-/-) were identified by genomic PCR using a sequence specific to the Tg gene as a primer.
  • SCID (+/-) and SCID (-/-) were identified by PCR-RFLP method.
  • Tg (+/ ⁇ ) / SCID (+/ ⁇ ) was backcrossed with SCID (+ / +) to obtain Tg (+/ ⁇ ) / SCID (+ / +).
  • Ding ⁇ (+/-) is 37.9. /.
  • Appeared and SCID (+ / +) appeared 52.8%.
  • Tg (+/-) / SCID (+ / +) are mated together, and the desired Tg (+/-) / SCID (+ / +) and And ⁇ (+ / +) / 3010 (+ / +).
  • the homology and heterogeneity of the uPA gene was identified by the following method.
  • mice 8 to 10 days after birth were cut about 5 mm, and genomic DNA was extracted using Qiagen DNeasy Tissue Kit. The concentration and purity of the extracted DNA were determined using an absorptiometer. Master mix 25 H 1, primer F 1 ⁇ .1, primer R 1 1, Taqman probe 1 l Add DNA and distilled water, adjust the total volume to 50 ill, and perform quantitative PCR (ABI7700, Sequencer Detector, PE Applied Biosystems). The primers and Taqman probe were designed as follows for the human growth hormone coding sequence contained in the vector for uPA gene transfer.
  • primer F gtcttggctcgctgcaatc (SEQ ID No: 1)
  • Taqman probe ccgcctcctgggttcaagcga (SEQ ID No: 3)
  • primer F ggatgcagggatgatgttc (SEQ ID No: 4)
  • primer R tgcaccaccaactgcttag (SEQ ID No: 5)
  • Taqman probe cagaagactgtggatggccctc (SEQ ID No: 6)
  • PCR conditions were: denaturation for 10 minutes followed by denaturation at 95 for 15 seconds and 60 for 1 minute extension for 50 cycles.
  • the amount of transgene in the genomic DNA was compared by the relative value obtained by dividing the amount of the amplified fragment of the human growth hormone coding sequence by the amount of the amplified fragment of the mouse G3PDH coding sequence of the internal control.
  • the standard curve used was a dilution series of the heterozygous or homozygous mouse genome in sample 3 ⁇ 4. If the value of the mouse used for the standard is 1, and the mouse is heterozygous, the heterozygous value is close to 1, and the homozygous value is close to 2. If the mouse used for the standard was homozygous, homo represents a value close to 1, and hetero represents a value close to 0.5. Based on macroscopic findings at the time of dissection, the correct answer rate by this method is estimated to be about 90%.
  • uPA catalyzes proteolysis and activation from plasminogen to plasmin, and has the function of degrading fibrin clot. For this reason, many mice after birth are said to have bleeding in the intestinal tract and the abdominal cavity and die within 4 days after birth. In order to avoid death due to bleeding at the time of surgery, e-aminocaproic acid, which has the effect of hemostasis by blocking the action of plasminogen activator and plasmin, was administered.
  • the SCID / C.B-17 mice used for crossing have no T cells but no NK cells. Therefore, asialo GM1 antibody that inhibits NK activity was administered intraperitoneally on the day before and after the transplantation so that the transplanted human hepatocytes would not be attacked by mouse NK cells. Weaning was performed at 4 weeks of age, and males and females were raised in separate cages from 5 weeks of age.
  • mice with blood albumin exceeding 3 mg / ml rapidly deteriorated and died ( Figure 1).
  • lung bleeding was observed, human hepatocytes
  • the effect of complement production by was observed.
  • Immunohistochemical staining of mouse hepatocytes in rabbit liver tissue with an antibody against rabbit complement C3 confirmed the presence of C3 in human liver cells. Therefore, 2 mg / ml complement inhibitor (Fusan) 200 ⁇ 1 was administered to mice with high human albumin concentrations. The dosing frequency started once every two days. Daily changes in body weight were observed. If weight loss was observed, the frequency and concentration of administration were increased (Figure 3).
  • mice whose serum human albumin concentration exceeded 2 mg / ml were given a complement inhibitor (Fusan) every other day, mice whose blood concentration exceeded 4 mg / ml every day, and mice that exceeded 6 mg / ml.
  • a complement inhibitor Fuan
  • mice whose blood concentration exceeded 4 mg / ml every day mice that exceeded 6 mg / ml.
  • it was decided to administer twice a day Fig. 3. This treatment allowed mice to survive for a long time even when the human albumin concentration in the blood exceeded 3 mg / ml, and it became possible to detect human albumin at a high level of 8 mg / ml (Fig. 1).
  • hC3a human complement in each of the chimeric mice not administered with the complement inhibitor (Fusan) and the administered chimeric mice was measured by ELISA. As a result, it was confirmed that the hC3a concentration of complement-administered chimeric mice was lower than that of non-administered chimeric mice (Fig. 4).
  • mice with livers replaced with human hepatocytes may have vitamin C deficiency. Therefore, mice transplanted with human hepatocytes were given drinking water in which ascorbic acid 2-phosphate was dissolved at a concentration of 1 mg / ml (Nippon Claire, ascorbic acid synthesizing ability "" referred to the method of rearing rats. )
  • Tg (+ / +) / SCID mice transplanted with human hepatocytes have a slower weight gain and poorer hair than Tg (+/-) / SCID mice. It was thought that proteins and enzymes synthesized by human hepatocytes in the mouse liver may be insufficient for the growth and maintenance of the body.
  • SCID mouse serum was administered subcutaneously once per week. When comparing the body weight gain of Tg (+ / +) / SCID mice not administered with SCID mouse serum, those administered were higher. 2.6 Macroscopic pathological examination of mouse liver Mice were bled under ether anesthesia and serum albumin and GPT levels were measured. The liver and spleen were removed, weighed, photographed and then sampled for frozen section blocks and paraffin section blocks, and the microsomal fraction was extracted from the remaining samples. As the human albumin concentration increased, the serum albumin content increased and the GPT value decreased (Fig. 5).
  • mice with high levels of human albumin the entire liver is pink and in one part
  • 6 human P450 molecular species CYP1A1, 1 A2, 2C9, 2C19, 2D6,
  • Rifampicin 50 g / kg bw
  • the liver was collected on the 5th day, and the expression of each of the 6 types of human P450 was expressed as described above. Quantified. Rifampicin is known to induce only human CYP3A4 expression. As a result, approximately 5.7 times as much human CYP3A4 expression was confirmed in the liver of chimeric mice treated with Rifampicin compared to non-treated mice (Fig. 10).
  • hepatocytes Purification of human hepatocytes by monoclonal antibody
  • the hepatocytes were isolated from the chimeric mouse prepared in Example 1 by the collagenase perfusion method. Collagenase concentration was 0.05% and the treatment time was 9 minutes. It is thought that hepatocytes are contaminated with human hepatocytes and mouse hepatocytes, but since mouse liver cells are more toxic by collagenase than human hepatocytes, many of the isolated hepatocytes are (About 80%) was occupied by human hepatocytes.
  • a mouse monoclonal antibody that specifically recognizes the surface of human hepatocytes without recognizing mouse hepatocytes (monoclonal monoclonal antibody produced by ⁇ Ibridoma K8216 prepared in Example 6).
  • monoclonal monoclonal antibody produced by ⁇ Ibridoma K8216 prepared in Example 6 monoclonal monoclonal antibody produced by ⁇ Ibridoma K8216 prepared in Example 6.
  • human hepatocytes using Separated Liver cells in mice the proportion of human Bok hepatocytes isolated by collagenase perfusion was about 80% by reacting the antibody, allowed to react with FITC-labeled mouse IgG antibody, FITC-labeled mouse using FACS I g G Cells that reacted with the antibody were isolated. As a result, the purity of human hepatocytes was 95% or more.
  • Retrorsine 30 or 60 mg / kg was administered intraperitoneally.
  • colonies of normalized hepatocytes decreased due to deletion of the uPA transgene (uPA-T g (-/-) / SCID) in uPA-Tg (+/-) / SCID mice (Fig. 12).
  • anti-mouse Fas antibody to human hepatocyte chimeric mice
  • anti-mouse Fas antibody that induces mouse hepatocyte apoptosis in response to Fas antigen of mouse hepatocytes ( 0.2 g / g bw) was intraperitoneally administered twice at weekly intervals.
  • This chimeric mouse showed a tendency to decrease the human albumin concentration in blood after about 80 days from the transplantation of human hepatocytes, but the blood human albumin concentration was significantly increased by administration of anti-mouse Fas antibody.
  • a cell dispersion was obtained from human liver tissue by collagenase perfusion.
  • the cell dispersion was centrifuged at a low speed (50 g , 2 minutes), and the precipitated fraction was treated with Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) supplemented with fetal calf serum, human serum, EGF, nicotine amide, and sustained active vitamin C.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • the mixture was cultured with Swiss 3T3 cells treated with mitomycin C. Swiss 3T3 cells were added every 10 days. From about day 7 of culture, colonies of human hepatocytes were observed. Hepatocytes grown in confluency were passaged using EDTA / Trypsin.
  • the spleen was extracted from one immunized animal and the spleen cells were collected.
  • the spleen cells and mouse myeloma cells (cell name NS-1) were fused, seeded in a 372-well plate and cultured.
  • the reactivity of the obtained fusion cell culture supernatant to the antigen was measured by ELISA.
  • the measurement was performed by the following method. Subcultured hepatocytes used as antigens were seeded on a 96-well plate, cultured, washed with PBS, dried and stored at -80t: and the culture supernatant was reacted. Next, enzyme-labeled anti-mouse IgG or anti-mouse IgM antibody was reacted, and a substrate was added to develop color, and the absorbance was measured. As a result, the average absorbance of the 372 samples of fused cells was 0.149 (SD: 0.099), of which samples with an absorbance of 0.20 or more (81 samples, approximately 20%) were positive.
  • the reactivity of the culture supernatant after scale-up to the antigen was measured by ELISA similar to the primary screening, and positive samples and 88 samples were selected. Furthermore, the reactivity of these samples in tissues was examined by tissue staining. Among them, the cell membrane of hepatocytes and the portal vein The reactivity of the sample containing hyperprideoma that specifically reacts with hepatocytes, or the culture supernatant of clones obtained by cloning from it, was examined for human liver cells immediately after isolation.
  • the reactivity of the hybridoma culture supernatant (No. 23) (Fig. 16) in which the liver cell membrane in the portal vein region was stained in the tissue was analyzed using FACS (Fluorescence activated cell sorting).
  • FACS Fluorescence activated cell sorting
  • Cells obtained by collagenase perfusion and low-speed centrifugation from the livers of adult males (46 and 49 years old) were treated with the culture supernatant of this sample for 4 T for 30 minutes, and then FITC-labeled anti-mouse IgG antibody was applied at 4 After 30 minutes, FACS detection is possible.
  • some of the hepatocyte population (1 ⁇ : 2%) responded to this sample (Fig. 17).
  • No. 23 may contain a hybridoma that specifically recognizes the cells that form colonies.
  • the anti-S property on the surface of the hepatocytes immediately after separation was analyzed using FACS. As a result, 3 clones showing similar reactivity were obtained.
  • mice were further injected intraperitoneally with mouse cells to collect monoclonal antibodies from ascites. In this way, a monoclonal antibody that specifically binds to proliferating human hepatocytes was obtained.
  • Hybridomas that produce monoclonal antibodies that recognize only human hepatocytes without recognizing non-human hepatocytes In the first screening of Example 6. Of the 94 samples selected, 88 samples that were positive in ELISA were selected by tissue staining in human liver tissue. For three samples of the eight hybridoma culture supernatant in which the cell membrane of hepatocytes is uniformly dyed regardless of the area, cultured human hepatocytes, human hepatocytes immediately after separation, and non-human animals (mouse, rat) To the cell surface of hepatocytes The reactivity of was analyzed using FACS.
  • a monoclonal antibody was obtained from this K8216 strain in the same manner as in Example 6.
  • Industrial Applicability As described in detail above, the invention of this application makes it possible to proliferate human hepatocytes in large quantities while maintaining their functions. Also provided is a chimeric mouse in which most of the cells in the liver are replaced with human hepatocytes. It is possible to conduct drug metabolism tests and safety tests of compounds using these chimeric mouse liver cells.

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Description

明細書 ヒト肝細胞増殖方法とヒト肝細胞の取得方法 技術分野 この出願の発明は、 マウス体内でヒト肝細胞を増殖させる方法、 肝臓内にヒト 肝細胞を有するキメラマウス、 キメラマウスからのヒト肝細胞の取得方法と、 こ れによって取得されたヒト肝細胞に関するものである。 このようにしてキメラマ ウスから得られたヒト肝細胞は、 肝細胞キットゃ体外型人工肝臓の材料となる。
背景技術 肝臓は 500種類以上もの多種多様な特異機能を有する。 肝臓の主な機能とし て、 血漿蛋白質の合成分泌、 糖新生やグリコーゲン代謝による血糖調節、 脂質合 成、 尿素合成、 胆汁合成分泌、 解毒などが挙げられる。 体内に取り込まれた物質の多くは肝臓で代謝される。 医薬品開発の領域では、 医薬品候補物質が肝臓でどのような代謝を受け、 肝臓やその他の臓器や組織にど のような影響を与えるかは必須のデ一夕である。 さらに、 これまで—多くの化学物 質が合成され環境へも放出されている。 これらの物質が個々に、 あるいは複合し て人体にどのような影響をおよぼすかを解明することは、 社会的にも非常に重要 であり、 このような化学物質の人体への影響評価にも肝機能に対する毒性試験が 必要とされている。 医薬品候補物質をはじめとする化学物質の安全性試験や薬物代謝試験には、 現 在のところ、 マウス、 ラット、 ゥサギ、 ィヌ、 サル等が使われている。 特に医薬 品開発ではヒトを対象とする第一相試験へ入る前に、 動物を用いた毒性試験 ·安 全性試験が義務づけられているが、 これには多大な時間と労力を必要とし、 投資 額も莫大なものとなる。 しかしながら、 これらの動物実験で得られるデ一夕がそのままヒトに適応され る保証はない。 事実、 動物実験では毒性の認められなかった物質がヒトに対して 毒性を示す例は多く、 また逆の場合もあり得る。 したがって、 これまで多くの医 薬品候補物質がヒトを対象とする第一相試験に入ってから開発中止となったり、 また、 動物実験では毒性が強いために臨床試験に入る前に開発中止となった物質 においても、 実際にはヒ卜には毒性が認められないケースも多く存在しているも のと予想される。 このことは、 ヒトの肝臓における代謝機能とマウスゃラットの肝臓における代 謝機能の違いが起因していると考えられている。 最近では、 ヒト肝細胞を用いた in vitro代謝試験や毒性試験が行われるようになった。 ところが、 移植に用いら れなかった脳死患者の肝臓や腫瘍摘出などによる切除肝から得られるヒト肝細胞 の量は需要をはるかに下回っている。 したがって、 ヒト肝細胞の増殖技術の開発 は医薬品開発において必要とされている。 また、 大量のヒト肝細胞の必要性は、 体外型人工肝臓においても同様である。 人工肝臓は、 人工的に肝臓機能を代行するための医療装置であり、 吸着、 透析、 濾過等の物理化学的原理に基づく人工的な作用と、 摘出肝や肝組織の灌流による 生物学的作用を組み合わせたハイプリッド型の人工肝臓の開発が精-力的に進めら れている。 この人工肝臓の開発に当たっては、 物理化学的機能を向上させるため の膜や回路の性能向上とともに、 ヒ卜への適用が可能な大量の肝細胞の供給が不 可欠とされている。 しかしながら、 ヒトの肝細胞については、 これまで成熟個体から単離した初代 細胞を継代的に培養することは不可能であるとされてきた。 すなわち、 接着依存 性の成熟肝細胞は、 その継代操作のために培養基質から剥離する際に大きく損傷 し、 また培養基質に再接着させることも困難なためである。 これに対し、 この出 願の発明者らは、 ヒト肝臓から分離した正常肝細胞からクローン性増殖能を有す る小型肝細胞を単離し、 この小型肝細胞を初代培養し、 さらにこの培養肝細胞を 継代培養して肝細胞を増殖させる方法を発明し、 特許を取得している （特開平 08- 1 12092号公報； 日本特許第 3266766号；米国特許第 6,004,8 10号、 特開 平 10- 179 148号公報： 日本特許第 321 1941号、 特開平 7-274951公報； 日本 特許第 3157984号、 特開平 9-313172号公報； 日本特許第 3014322号） 。 この特許発明の方法は、 in vitroで肝細胞を増殖させて大量のヒト肝細胞を得 るための新しい手段を提供するものであるが、 長期間の継代培養中に幾つかの肝 機能が低下してしまうという問題点を有していた。 このため、 例えば肝機能を維 持するための薬剤のスクリーニング系として、 あるいは長期間の継代培養後も保 存されている特定の機能について薬剤の毒性や薬効を試験する系としては有用で あるが、 ヒト肝機能代替としての肝細胞として、 またはハイブリット型人工肝臓 の材料としては不十分な点も存在する。 in vitroでの肝細胞の増殖における以上のとおりの問題点を解消するた.めの手 段として、 動物個体内 （in vivo) でヒト肝細胞を増殖させる方法が提案されて いる。 例えば、 Heckelらは、 アルブミンゥロキナーゼプラスミノーゲンァクチべ一 ートランスジエニックマウス （uPA-Tgマウス） を作製している。 このマウス においては、 アルブミンのェンハンサ一とプロモー夕一にゥロ丰ナ一ゼプラスミ ノーゲンァクチべ一ター （uPA) 遺伝子が接続してあるため、 肝臓特異的に uPA蛋白が合成される （Heckel JL, Sandgren EP， Degen JL， Palmiter RD， and Brinser RL. Neonatal bleeding in transgenic mice expressing urokinase-type plasminogen activator. Cell 62: 447-456, 1990) 。 肝細胞 は uPA蛋白による傷害で、 肉眼的には白色を呈し、 出血や肝不全により死亡す る個体もみられる。 このマウスの脾臓より lacZ トランスジエニックマウスの正 常肝細胞を移植すると、 肝臓に生着 ·増殖し、 最終的にはドナー肝細胞で置き換 わることが知られている （Rhim JA, Sandgren EP， Degen JL, Palmiter RD, and Brinster RL. Replacement of diseased mouse liver by hepatic cell transplantation. Science 263: 1 149- 1 152, 1994) 。 さらに Rhimらは、 uPA-Tgマウスと胸腺を生まれつき欠損しているため T細胞の機能を持たない NUDEマウスを掛け合わせ、 uPA-Tg/NUDEマウスを作製した。 uPA- Tg/NUDEマウスにラットの肝細胞を移植することにより、 ラット肝細胞を持つ マウスを作製した （Rhim JA， Sandgren EP， Palmiter RD and Brinster RL. Complete reconstitution of mouse liver with xenogeneic hepatocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 4942-4946, 1995) 。 し力 し、 このマウスを用レ た ヒト肝細胞を持つキメラマウスの報告はない。 Dandriらは、 uPA-Tgマウスと免疫不全の性質を持つノックアウトマウス Rag2マウスを掛け合わせ、 uPA-Tg/Rag2マウスを作製した。 uPA-Tg ( + /-) /Rag2マウスの肝臓へヒ卜の肝臓から採取したヒト肝細胞を移植し、 マウス肝臓 の 15 %が置き換わったことを示した。 彼らはこのマウスへの B型肝炎ウィルスの 感染に成功している （Dandri M， Burda MR, Torok B, Pollok JM， Iwanska A， Sommer G, Rogiers X， Rogler CE, Gupta S, Will H, Greten H， and
Petersen J. Repopulation of mouse liver with human hepatocytes and in vivo infection with hepatitis B virus. Hepatology 33:981-988, 2001) 。 また、 この出願の発明者らは、 先に特許出願した発明 （特開 2002-45087号公 報） において、 免疫不全マウスである SCIDマウスと uPA-Tgマウスとを掛け合わ せた uPA-Tg/SCIDマウスにヒト肝細胞を移植し、 この移植肝紬胞 実質的にマ ウスの肝機能を担っているキメラマウスを開示している。 この先願発明のキメラ マウスは、 uPA遺伝子の発現によってマウス肝細胞が機能不全となっているため、 その肝機能は移植されたヒト肝細胞によって保たれている。 このため、 移植した ヒト肝細胞の個体内機能を正しく評価することができ、 被検物質の毒性や薬効を 判定するための実験動物個体としては極めて有用である。 しかしながら、 この先 願発明のキメラマウスの場合には、 ヒト肝細胞の移植から 50日以上は生存する ことができず、 また成長の過程で正常化したマウス肝細胞が増殖するため、 移植 ヒト肝細胞の増殖効率は低く、 ヒト肝細胞の置換率は約 50 %程度にとどまって いた。 このことはまた、 最近の Mercerらの報告 （Mercer DF， Schiller DE, Eliiott JF, Douglus DF， Hao C， Ricnfret A， Addison WR， Fischer KP， Churchill TA, Lakey JRT, Tyrrell DLJ and Keteman NM. Hepatits C virus replication in mice with chimeric human livers. Repopulation of mouse liver with human hepatocytes and in vivo infection with hepatitis B virus. Nature Medicine 7:927-933, 2001) によっても裏付けられている。 Mercerらは、 こ の出願の発明者らと同様にして uPA-Tg/SCIDを作製し、 凍結保存したヒト肝細 胞を融解して移植した結果、 マウス血清中に 2 mg/ml未満のヒトアルブミンが 検出され （血液中に換算すると約 1 mg/ml未満） 、 肝臓の約 50 %がヒト肝細胞 で置き換わったことを報告している。 以上のとおり、 免疫不全肝障害マウス （uPA-Tg/ SCIDマウス） にヒト肝細胞 を移植してキメラマウスを作製することは、 そのキメラマウス自体に有用性 （例 えば、 ヒト肝細胞に対する毒性や薬効の in vivo試験等） は存在するものの、 マ ウス個体内で移植肝細胞を大量に増殖させるための手段としては、 不十分であつ た。 また、 ヒト肝細胞を移植したキメラマウスは長期間生存することができず、 ま た成長の過程でマウス肝細胞が増殖してしまうため、 ヒト肝細胞に対する毒性や 薬効の in vivo評価系としてもその利用対象が限定されていた。— " この出願の発明は、 ヒト肝細胞の増殖方法として、 マウス体内でヒト肝細胞を 十分に増殖させるための改良された方法を提供することを課題としている。 また、 長期間生存することによって、 マウス体内で増殖したヒト肝細胞を分離 回収する方法を提供することも課題としている。 さらに、 分離したヒト肝細胞を複数のマウスに移植してマウス体内で増殖させ ることにより一定の規格のヒ卜肝細胞を体内に持つキメラマウスを大量に得るこ と、 そのマウスから分離した一定規格のヒト肝細胞を大量に得る方法を提供する ことも課題としている。 さらには、 分離したヒ卜肝細胞の利用方法を提供することを課題としている。 またさらに、 この出願は、 前記の各発明を実施するために有用なモノクロ一ナ ル抗体や、 そのモノクローナル抗体を産生する新規ハイプリ ドーマ細胞株を提供 することを課題としてもいる。
発明の開示 この出願は、 前記の課題を解決するための第 1の発明として、 免疫不全肝障害 マウスの肝臓にヒ卜肝細胞を移植し、 ヒ卜肝細胞の産生するヒ卜補体の攻撃から 防御させた状態でヒト肝細胞移植マウスを飼育することにより、 移植したヒト肝 細胞をマウス肝臓で増殖させることを特徴とするヒト肝細胞増殖方法を提供する。 この第 1 発明の方法においては、 ヒト補体の攻撃から防御させた状態が、 以 下の（a)および (b) ：
(a) ヒト肝細胞移植マウスに少なくとも 1回、 補体抑制剤を投与すること ；
(b) 免疫不全肝障害マウス と して、 免疫不全肝障害マウスと decay- accelerating factor (DAF/CD55)トランスジエニックマウスを交—配して得られ た子孫マウスを使用すること、
の少なくとも一方であることを好ましい態様としている。 またこの第 1発明の方法においては、 免疫不全肝障害マウスが、 遺伝的免疫不 全マウスと遺伝的肝障害マウスとを交配して得られた子孫マウスであることを好 ましい態様としている。 さらに、 この子孫マウスがへミ接合体免疫不全肝障害マ ウスであること、 そしてこのへミ接合体免疫不全肝障害マウスに肝細胞増殖阻害 物質を投与した後、 ヒト肝細胞を移植することをそれぞれ好ましい態様としても いる。 さらにこの第 1発明およびその好ましい前記態様においては、 ヒト肝細胞を移 植した免疫不全肝障害マウスに抗マウス Fas 抗体を投与することを別の好まし い態様としている。 この第 1発明の方法においては、 また、 免疫不全肝障害マウスの肝臓に移植す るヒト肝細胞が、 増殖性ヒト肝細胞であること、 その増殖性ヒト肝細胞が、 増殖 性ヒト肝細胞を特異的に認識するモノクローナル抗体によって認識されたヒト肝 細胞であること、 そしてモノクローナル抗体が、 Mouse-Mouse hybridoma K8223 (FERM BP-8334) が産生するモノクローナル抗体であることをそれぞ れ好ましい態様としている。 この出願は、 第 2の発明として、 以下のステップ（1)〜(3)：
(1) 免疫不全肝障害マウスの肝臓にヒト肝細胞を移植し、 ヒト肝細胞の産生す るヒト補体の攻撃から防御させた状態でヒト肝細胞移植マウスを飼育することに よって、 移植したヒト肝細胞をマウス肝臓で増殖させるステツプ；
(2) マウス肝臓から増殖したヒ卜肝細胞を単離するステツプ；および
(3) 単離したヒト肝細胞を、 免疫不全肝障害マウスの肝臓に移植し、 ヒト肝細 胞の産生するヒト補体の攻撃から防御させた状態でヒト肝細胞移植マウスを 50 日以上飼育するステップ、
からなり、 ステップ (2)および (3)を 1回以上繰り返すことを特镦と Tるヒト肝細 胞大量増殖方法を提供する。 この第 2 発明の方法においては、 ステップ（1)および または (3)におけるヒト 補体の攻撃から防御させた状態が、 以下の (a)および (b)：
(a) ヒト肝細胞移植マウスに少なくとも 1回、 補体抑制剤を投与すること ；
(b) 免疫不全肝障害マウス として、 免疫不全肝障害マウス と decay- accelerating factor (DAF/CD55)トランスジエニックマウスを交配して得られ た子孫マウスを使用すること、
の少なくとも一方であることを好ましい態様としている。 またこの第 2発明の方法においては、 前記ステツプ（1)および/または（3)にお いて、 免疫不全肝障害マウスが、 遺伝的免疫不全マウスと遺伝的肝障害マウスと を交配して得られた子孫マウスであること、 子孫マウスがへミ接合体免疫不全肝 障害マウスであること、 そして、 このへミ接合体免疫不全肝障害マウスに肝細胞 増殖阻害物質を投与した後、 ヒト肝細胞を移植することをそれぞれ好ましい態様 としている。 さらにこの第 2発明および前記の好ましい態様においては、 前記ステップ（1) および/または (3)において、 ヒト肝細胞を移植した免疫不全肝障害マウスに抗 マウス Fas抗体を投与することを別の好ましい態様としてもいる。 またさらに、 この第 2発明の方法においては、 前記ステップ（1)および/また は (3)において免疫不全肝障害マウスの肝臓に移植するヒト肝細胞が、 増殖性ヒ ト肝細胞であること、 増殖性ヒト肝細胞がコロニーを形成しながら増殖するヒト 肝細胞を特異的に認識するモノクローナル抗体によって認識されたヒト肝細胞で あること、 そしてモノクローナル抗体が Mouse-Mouse hybridoma K8223 (FERM BP-8334) が産生するモノクローナル抗体であることをそれぞれ好ま しい態様としている。 この第 2発明の方法においては、 さらに、 前記ステップ (2) お—いて、 以下の (a)および (b)：
(a) マウス肝臓から分離した肝臓組織をコラゲナーゼ処理する ；および
(b) 非ヒト肝細胞は認識せず、 ヒト肝細胞を特異的に認識するモノクローナル 抗体によって認識された細胞を単離する、
の少なくとも一方を行うことによって、 実質的にヒト肝細胞のみを単離すること を好ましい態様としている。 そして、 この態様においては、 モノクローナル抗体 が Mouse-Mouse hybridoma K8216 (FERM BP-8333) が産生するモノクロ ーナル抗体であることをさらに好ましい態様としている。 この出願は、 第 3の発明として、 前記の第 1発明または第 2発明の方法によつ て増殖させたヒト肝細胞を肝臓内に有するキメラマウスを提供する。 この第 3発明のキメラマウスは、 増殖したヒト肝細胞が肝臓内の細胞の 70 % 以上を占めていること、 および Zまたはヒト型 P450活性を有することを好まし い態様としている。 この出願はさらに、 第 4の発明として、 前記第 3発明のキメラマウスの肝臓か らヒト肝細胞を単離することを特徴とするヒト肝細胞取得方法を提供する。 第 4発明の方法においては、 以下の (a)および (b)：
(a) マウス肝臓から分離した肝臓組織をコラゲナーゼ処理する ；および
(b) 非ヒト肝細胞は認識せず、 ヒト肝細胞を特異的に認識するモノクローナル 抗体によって認識された細胞を単離する、
の少なくとも一方を行うことによって、 実質的にヒト肝細胞のみを単離すること を好ましい態様としている。 そしてこの態様においては、 モノクローナル抗体が Mouse-Mouse hybridoma K8216 (FERM BP-8333) が産生するモノクロ一 ナル抗体であることをさらに好ましい態様としている。 この出願は、 第 5の発明として、 前記第 4発明の方法によって取得されたヒト 肝細胞を提供する。 さらにこの出願は、 第 6の発明として、 前記第 5発明のヒト肝細胞を含む細胞 キッ トを提供する。 さらにまた、 この出願は、 第 7の発明として、 前記第 5発明のヒト肝細胞を充 填したハイプリッド型人工肝臓を提供する。 さらにまた、 この出願は、 第 8 の発明として、 非ヒト肝細胞は認識せず、 ヒ 卜肝細胞を特異的に認識するモノクローナル抗体を提供する。 この第 8 発明の 一例は、 Mouse-Mouse hybridoma K8216 (FERM BP-8333) が産生するモ ノクローナル抗体である。 この出願はまたさらに、 第 9 の発明として、 前記第 3 発明のキメラマウスに 候補物質を全身投与し、 候補物質の薬物動態または毒性を試験する方法を提供す る。 以上の各発明における態様や用語、 概念は、 発明の実施形態の説明や実施例に おいて詳しく規定する。 またこの発明を実施するために使用する様々な技術は、 特にその出典を明示した技術を除いては、 公知の文献等に基づいて当業者であれ ば容易かつ確実に実施可能である。 例えば、 この発明の遺伝子工学および分子生 物学的技 は Sambrook and Maniatis, in Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989; Ausubel, F. M. et al.， Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y， 1995等に記載されている。
図面の簡単な説明 図 1は、 補体抑制剤のヒトアルブミン濃度への効果を試験した結果である。 図 2 は、 ヒト肝実質細胞と小型肝細胞をそれぞれ移植したマウスの血中アル プミン濃度を測定した結果である。 図 3は、 補体抑制剤のマウス体重に対する効果を試験した結果である。 図 4 は、 キメラマウスに補体抑制剤を投与した時と投与していない時のヒト 補体 （hC3a) 濃度の比較である。 図 5 は、 マウス血中ヒトアルブミン濃度とヒト肝細胞による置換率および肝 機能の相関を示したグラフである。 図 6は、 ヒト特異的サイ トケラチン 8/ 18抗体による免疫染色像である。 図 7 は、 ヒト特異的サイトケラチン 8/ 18 抗体による免疫染色の拡大像であ る。 図 8 は、 ヒト肝細胞を移植したマウス肝臓マイクロゾームにおけるヒト特異 的 CYP2CPのウエスタンプロット分析の結果である。 図 9は、 マウスまたはドナー肝臓のマイク口ゾームにおける Diclofenacの代 謝活性を示したグラフである。 図 10 は、 様々なヒト肝細胞置換率のキメラマウス肝臓、 および Rifampicin を投与したキメラマウス肝臓における 6 種類のヒト型 P450 分子種の発現量を 示したグラフである。 図 1 1 は、 ヒト肝細胞を再移植したマウス血中ヒトアルブミン濃度を試験した 結果である。 図 12は、 uPA(+/ +) / SCIDマウスへの Retrorsine投与の効桌を試験した結果 である。 図 13は、 ヒト肝細胞キメラマウスに抗マウス Fas抗体を投与したマウス血中 のヒトアルブミン濃度を試験した結果である。 図 14 は、 様々な年令の患者から採取した肝細胞を培養した時の増殖曲線であ る。 図 15 は、 モノクローナル抗体を作るために抗原として用いた培養ヒト肝細胞 の位相差顕微鏡像である。 図 16は、 ハイプリ ドーマ培養上清 （K8223) の、 ヒト肝細胞における反応性 を蛍光抗体染色により観察した像である。 図 17は、 八イブリ ドーマ培養上清 （No. 23) の、 分離直後のヒト肝細胞表面 における反応性を FACSにより解析した結果である。 図 18 は、 ハイプリ ド一マ培養上清 （No. 23) に反応した細胞集団 （R2) と 反応しなかった細胞集団 （R3) を分取し、 培養した時の位相差顕微鏡像である 図 19は、 ハイプリ ドーマ培養上清 （No. 23) の、 継代培養ヒト肝細胞表面に おける反応性を FACSにより解析した結果である。 図 20は、 ハイプリ ドーマ培養上清 （K8216) の、 分離直後のヒト、 マウス、 ラッ卜肝細胞表面における反応性を FACSにより解析した結果である。
発明を実施するための最良の形態 第 1発明のヒト肝細胞増殖方法は、 ヒ卜肝細胞を免疫不全肝障害—マウスの肝臓 に移植し、 ヒト肝細胞の産生するヒト補体の攻撃から防御させた状態でこのレシ ピエントマウスを飼育することにより、 移植したヒト肝細胞をマウス肝臓で増殖 させることを特徴とする。 前記の Mercer ら （Nature Medicine 7:927-933, 2001) は免疫不全肝障害 マウス （uPA-Tg/SCID マウス） を作製し、 凍結保存したヒト肝細胞を融解して マウスに移植した結果、 肝臓の 50 %程度がヒト肝細胞で置き換わったことを報 告している。 しかしながら、 Mercer らの作製したヒト肝細胞移植マウスは、 移 植したヒ卜肝細胞の高い置換率が達成できていない。 第 1発明の方法は、 移植したヒト肝細胞が作る補体がマウス本体を攻撃するこ とを防止することによって、 ヒト肝細胞移植マウスを 50 日以上も生存させるこ とを可能としている。 そして、 このように 50 日以上もマウスを生存させること によって、 マウス肝臓の細胞を、 70 %以上ヒト肝細胞に置換させることを可能 とするものである。 ヒト補体の攻撃からレシピエントマウスを防御するための第 1 の具体的手段 は、 「補正抑制剤」 をレシピエントマウスに投与することである。 補体抑制剤と して 、 naiamostat mesilate (フサノ R ; 鳥居製薬ノ 、 gabexate mesilate (FOYR；小野製薬） 、 comostat mesilate (フォイパン R ;小野製薬） 、 cobra venom factor (コブラ毒） 等を用いることができる。 なお、 これらの補体抑制 剤は、 細胞移植や臓器移植の際に使用される薬剤である。 ただし、 通常の移植術 においては、 補体抑制剤は、 レシピエン卜の肝臓が産生する補体が移植細胞や移 植臓器を攻撃することを防ぐために使用される。 一方、 この発明においては、 レ シピエントマウスは肝障害のために自らは補体を産生しないと考えられるため、 捕体抑制剤は、 移植したヒト肝細胞が産生する補体がレシピエントマウスを攻撃 することを防ぐために使用される。 ヒト補体の攻撃からレシピエントマウスを防御するための第 2 の具体的手段 は、 レシピエントマウスとして、 免疫不全肝障害マウスと— hu—man decay- accelerating factor (hDAF/CD55)トランスジエニックマウスとの交配により得 られた子孫マウスを使用することである。 h DAF/ CD55 トランスジエニックマ ウスは、 腎臓、 心臓、 肺、 肝臓等の内皮細胞表面において hDAF を高発現して おり、 ヒト補体に対する耐性能を有することが報告されている （Murakami H， Takahagi Y, Yoshitatsu Μ， Mivagawa S， Fujimura T， Toyom ra K， Shigehisa T, Shirakura R， and Kinoshita T. Porcine MCP gene promoter directs high level expression of human DAF (CD55) in transgenic mice. Immunobiology, 201 :583-597, 1999/ 2000 ； van Denderen BJW, Pearse MJ， Katerelos M， Nottle MB, Du Z-T, Aminian A， Adam WR, Shenoy- Scaria A, Lublin DM, Shinkel TA， and D'Apice AJF. Expression of functional decay- accelerating factor (CD55) in transgenic mice protects against human complement-mediated attack. Transplantation, 61 :582- 588, 1996) 。 従って、 この hDAF/CD55 トランスジエニックマウスと免疫不 全肝障害マウスとの子孫動物であるレシピエントマウスは、 移植ヒト肝細胞の産 生するヒト補体に対して高い耐性能を有している。 hDAF/CD55 トランスジェ ニックマウスは、 前記の文献 （Immunobiology, 201 :583-597， 1999/2000お よび Transplantation, 61 :582-588, 1996) に従い、 例^ば広く様々な組織、 器官で発現している membrane cofactor protein (MCP)や H2K (b) (MHC class I) のプロモ一夕一制御下で hDAF が発現するように構築したベクタ一を 用いて、 公知のトランスジエニックマウス作製法 （例えば、 Proc. Natl. Acad. Scl. USA 77;7380-7384, 1980) により作製すること力で含る。 第 1発明のヒト肝細胞増殖方法に使用する 「免疫不全肝障害マウス」 は、 マウ ス本来の肝細胞が障害を受けている 「肝障害マウス」 であり、 かつ、 異種動物由 来の細胞に対して拒絶反応を示さない 「免疫不全マウス」 である。 従って、 免疫 不全肝障害マウスは、 肝障害誘発処置と免疫不全処置とを同一マウス個体に施す ことによって作製することができる。 肝障害誘発処置は、 例えば公知の肝障害誘 発物質 （例えば、 四塩化炭素、 D-ガラクトサミン、 2-ァセチルァミノフルォレ ン、 ピロロジンアルカロイドなど） による処理、 あるいは外科的な肝切除等であ る。 また、 免疫不全処置としては、 免疫抑制剤の投与や胸腺摘出等—である。 ただし、 この第 1発明の方法では、 遺伝的な肝障害形質を有するマウスと遺伝 的に免疫不全であるマウスとを交配し、 その子孫個体として得られた免疫不全肝 障害マウスを使用することを好ましい態様としている。 遺伝的肝障害マウスとし ては、 前記 Rhim ら （Science, 263, 1149 ( 1994)) が作成した uPA-Tgマウス を例示することができる。 あるいは肝障害を生じさせる遺伝子 （例えば、 tissue-type Olasminogen activator s伝子等) を用レ 公知のトランスジェニ ック法 (Proc. Natl. Acad. Scl. USA 77;7380-7384， 1980) により 卜ランスジ エニック免疫不全肝障害マウスを作成することもできる。 また、 肝機能を担う遺 伝子 （例えば、 フマリルァセト酢酸ヒドラーゼ遺伝子等） を公知のジーン夕一ゲ ティング法 （Science 244: 1288- 1292, 1989) によってノックアウトすること によっても、 遺伝的な肝障害を有するマウスを得ることができる。 一方、 遺伝的 な免疫不全マウスとしては、 SCIDマウス、 NUDEマウス、 RAG2ノックアウト マウス等の公知のマウスを使用することができる。 以下、 このようにして得られ たマウスを 「遺伝的免疫不全肝障害マウス」 と記載する。 遺伝的免疫不全肝障害マウスは、 肝障害遺伝子がホモ接合体であるマウスを用 いることが好ましい。 このようなホモ接合体マウスは正常な肝細胞がほとんど増 殖しないため、 ヒト肝細胞の増殖をマウス肝細胞が妨げることがない。 ただし、 このようなホモ接合体マウスは、 へミ接合体同士を掛け合わせた場合、 確率的に 1 /4の割合でしか得ることができない。 一方、 肝障害遺伝子がへミ接合体である遺伝的免疫不全肝障害マウス （ 「へミ 接合体免疫不全肝障害マウス」 ） は、 へミ接合体同士を掛け合わせた塲合、 また はへミ接合体と SCID マウスを掛け合わせた場合 1 /2 の確立で得ることができ るため、 第 1発明の低コストでの実施が可能となる。 しかし、 へミ接合体免疫不 全肝障害マウスは、 2倍体染色体の一方の遺伝子が正常であるため、 肝障害遺伝 子の欠失により正常肝細胞がコロニ一を形成しながら増殖して生後 7週頃にはマ ウス肝臓を正常なマウス肝細胞が占めるようなる。 このため、 一般的には、 へミ 接合体免疫不全肝障害マウスはヒト肝細胞を増殖させるためのレシ—ピエントマウ スとして適さない。 そこでこの第 1発明の好ましい態様として、 へミ接合体免疫 不全肝障害マウスにヒト肝細胞を移植する前に、 肝細胞特異的に増殖を阻害する 物質を投与し、 正常化したマウス肝細胞が増殖してコロニーを形成することを予 防する。 肝細胞増殖阻害物質としては、 たとえば pyrrolizidine alkaloidの一種 で あ る retrorsine 、 lasiocarpine 、 seneciphyllme 、 monocrotalme 、 trichodesmine等を例示することができる。 第 1発明の方法において、 移植に用いるヒト肝細胞は、 正常なヒト肝組織から 常法によって単離したものを用いることができる。 この第 1発明の方法において は、 特に in vivoで活発な増殖能を有する増殖性肝細胞を使用することを好まし い態様としている。 なおこの発明において、 「増殖性ヒト肝細胞」 とは、 培養条 件下 （in vitro) において、 単一細胞種の集団としてのコロニーを形成し、 その コロニーを増大させるように増殖するヒト肝細胞を意味する。 また、 その増殖は、 コロニー構成細胞が単一種であるという点において 「クローン性増殖」 という場 合もある。 さらに、 このような細胞は、 継代培養によって細胞数をさらに増加す ることができる細胞である。 このような増殖性ヒト肝細胞は、 一例として、 この出願の発明者らが発明した ヒト小型肝細胞を用いることができる。 すなわち、 この出願の発明者は、 ラット あるいはヒトの肝臓に増殖能の高い小型肝細胞が含まれることを見いだし、 すで に特許出願している （特開平 08- 1 12092号公報； 日本特許第 3266766号；米 国特許第 6，004，810号、 特開平 10- 179148号公報： 日本特許第 321 1941号、 特開平 7-27495 1公報； 日本特許第 3 157984号、 特開平 9-3 13 172号公報； 日本特許第 30 14322号） 。 また、 関連の論文も発表している （Chise Tateno， and Katsutoshi Yoshizato: Growth and differentiation m culture of clonogenic hepatocytes that express both phenotypes of hepatocytes and biliary epithelial cells. American Journal of Pathology 149 : 1593- 1605, 1996. Hiroshi Hino, Chise Tateno, Hajime Sato, Chihiro Yamasaki, Shigeru Katayama, Toshihiko Kohashi, Akio Aratani, Toshimasa Asahara, Kiyohiko Dohi, and Katsutoshi Yoshizato: A long-term culture of human hepatocytes which show a high growth potential and express their differentiated phenotypes. Biochemical and Biophysical Research
Communications 256 : 184- 191 , 1999. Chise Tateno, Kaori Takai- Kajihara, Chihiro Yamasaki, Hajime Sato, and Katsutoshi Yoshizato:
Heterogeneity of growth potential of adult rat hepatocytes in vitro.
Hepatology 3 1 : 65-74， 2000. Shigeru Katayama, Chise Tateno,
Toshimasa Asahara, and Katsutoshi Yoshizato: Size-dependent in vivo growt potential of adult rat hepatocytes. American Journal of Pathology 158 : 97- 105 , 2001. ) 。 このヒト小型肝細胞は、 その優れた増殖能によって、 レシピエントの体内で急速に増殖し、 正常な肝機能を発揮しうるヒト肝細胞集団 を短時間で形成することができる。 このような小型肝細胞の採取は、 前記の先願発明に記載されているような遠心 分離を用いた方法の他、 エルトリエー夕一や FACS 等の細胞分画装置によって も採取することができる。 さらには、 コロニーを形成しながら増殖する肝細胞を 特異的に認識するモノクローナル抗体によって採取することもできる。 in vitro で増殖させたヒト肝細胞、 凍結保存肝細胞、 テロメラーゼ遺伝子等の導入により 不死化させた肝細胞、 これらの肝細胞と非実質細胞を混合させたものでも可能で ある。 増殖性ヒト肝細胞の別の例は、 増殖性ヒト肝細胞を特異的に認識するモノクロ —ナル抗体 （実施例 6) によって認識されたヒト肝細胞である。 このようなモノ クローナル抗体が認識する増殖性ヒト肝細胞は、 抗体への標識に応じて、 公知の EIA、 RIA、 蛍光抗体法等により高純度で得ることができる。 具体的には、 例え ば、 ヒト肝臓から分離した肝細胞集団に、 酵素、 放射性同位体、 磁気ビーズ、 ま たは蛍光色素等で標識したモノク口一ナル抗体を接触させ、 標識シグナルを発す る細胞を単離することによって行うことができる。 標識として使用する酵素は、 turnover number が大であること、 抗体と結合させても安定であること、 基質 を特異的に着色させる等の条件を満たすものであれば特段の制限はなく、 通常の EIAに用いられる酵素、 例えば、 ペルォキシダ一ゼ、 ]3—ガラ ト—シダーゼ、 ァ ルカリフォスファターゼ、 ダルコ一スォキシダ一ゼ、 アセチルコリンエステラー ゼ、 グルコース一 6—リン酸化脱水素酵素、 リンゴ酸脱水素酵素等を用いること もできる。 また、 酵素阻害物質や補酵素等を用いることもできる。 これら酵素と 抗体との結合は、 マレイミド化合物等の架橋剤を用いる公知の方法によって行う ことができる。 基質としては、 使用する酵素の種類に応じて公知の物質を使用す ることができる。 例えば酵素としてペルォキシダーゼを使用する場合には、 3,3',5，5'—テトラメチルベンジシンを、 また酵素としてアル力リフォスファタ一 ゼを用いる場合には、 パラニトロフエノール等を用いることができる。 放射性同 位体としては、 i25 Iや 3H等の通常の RIA で用いられているものを使用するこ とができる。 蛍光色素としては、 フルォレツセンスイソチオシァネート (FITC) ゃテトラメチルローダミンイソチオシァネート （TRITC) 等の通常の 蛍光抗体法に用いられるものを使用することができる。 また、 標識シグナルの検 出は、 酵素を用いる塲合には酵素作用によって分解して発色する基質を加え、 基 質の分解量を光学的に測定することによって酵素活性を求め、 これを結合抗体量 に換算し、 標準値との比較から抗体量が算出される。 放射生同位体を用いる場合 には、 放射性同位体の発する放射線量をシンチレーシヨンカウン夕一等により測 定する。 また、 蛍光色素を用いる場合には、 蛍光顕微鏡を組み合わせた測定装置 によって蛍光量を測定すればよい。 以上のとおりのヒト肝細胞、 とくに増殖性ヒト肝細胞を免疫不全肝障害マウス に移植するには、 実施例に示したように、 マウスの脾臓を経由して肝臓へ移植す ることができる。 また、 直接門脈から移植することも可能である。 移植するヒト 肝細胞の数は、 1〜： 10000個程度とすることができる。 さらにこの第 1発明の方法では、 ヒト肝細胞を移植したマウスに、 抗マウス Fas 抗体を投与することを好ましい態様の一つとしている。 抗マウス Fas 抗体 は、 マウス肝細胞の Fas 抗原に反応し、 アポトーシスを誘導する作用を持つ。 ヒト肝細胞を移植したマウスに抗マウス Fas 抗体を投与することにより、 マウ スの肝細胞はアポトーシスを起こし、 死滅する。 この抗体はヒト肝細胞には影響 を与えないため、 移植したヒト肝細胞のみが選択的に増殖すること—ができる。 こ の方法により、 マウス肝臓におけるヒト肝細胞による置換率をさらに上昇させる ことが可能となる。 次に、 第 2発明のヒト肝細胞大量増殖方法について説明する。 第 2発明の方法は、 以下のステツプ（1) ~ (3)を行うことを特徴とする。
ステツプ（1)：第 1発明の方法と同様にしてヒト肝細胞をマウス肝臓内で増殖さ せる。
ステツプ (2)：マウス肝臓内で増殖したヒ卜肝細胞を単離する。 ステツプ (3)：単離したヒト肝細胞を、 免疫不全肝障害マウスにそれぞれ移植し、 第 1発明の方法と同様にしてヒト肝細胞を増殖させる。
そして、 この第 2発明の方法は、 前記ステップ (2)および (3)を 1回以上繰り返 す。 すなわち、 ステップ（1)において 1 匹のマウスに移植したヒト肝細胞は、 そ のマウス肝臓内で約 100 倍まで増加する。 従って、 ステップ (2)において増殖ヒ ト肝細胞が全て回収されれば、 ステップ (3)においては、 原理的には、 100 匹の マウスにヒト肝細胞を移植することができ、 最終的には、 最初に移植したヒト肝 細胞の 100 X 100 倍のヒト肝細胞を回収することができる。 さらに、 ステップ (2)および (3)を 2回繰り返すことによって、 最初に移植したヒト肝細胞の 100 X 100 X 100倍のヒト肝細胞を回収することができる。 この第 2発明の方法では、 ステツプ（1)および/またはステツプ (3)を前記の第 1発明方法またはその好ましい態様方法と同一にして行うことができる。 ここで、 「および/または」 とは、 前記第 1発明方法における 1つの要件を、 ステップ ( 1)でのみ行ってもよく、 ステップ (3)でのみ行ってもよく、 あるいはステップ（1) および (3)の両方で行ってもよいことを意味する。 例えば、 ステップ（1)では、 前 記のモノクローナル抗体 （第 8 発明） によって認識されたヒト増殖性肝細胞を マウスに移植し、 ステツプ (3)では回収されたヒト肝細胞の全てを移植用として 使用するようにしてもよい。 前記第 1発明における各要件は、 ヒ卜肝細胞を増殖 させたマウス個体、 またはマウスから回収したヒト肝細胞の用途等に応じて、 適 宜に選択して行うことができる。 第 2発明のステップ (2)は、 ステップ（1) [ステップ (2)および (3)を繰り返す場 合は、 その直前のステップ] において増殖させたヒト肝細胞をマウス肝臓から単 離するステップである。 分離方法は様々な方法 （例えば、 コラゲナ一ゼ灌流法 等） を採用することができるが、 以下の方法 (a)および (b)の少なくとも一方を行 うことが好ましい。 方法 (a)：
マウス肝臓から分離した肝臓組織をコラゲナーゼ処理することによって、 実質 的にヒト肝細胞のみを回収する。 コラゲナーゼの細胞毒性は、 マウス肝細胞に対 する方がヒ卜肝細胞に対するより高いため、 コラゲナーゼによる消化時間を調節 することにより、 マウス肝細胞にダメージを与え、 ヒト肝細胞のみを分取するこ ともできる。 コラゲナ一ゼ処理の時間は、 ヒト肝細胞とマウス肝細胞との割合に よっても異なるが、 例えば、 ヒト肝細胞が 70 %以上の場合は、 8〜20 分間程度 の処理を行えばよい。 方法 ：
非ヒト肝細胞は認識せず、 ヒト肝細胞を特異的に認識するモノクローナル抗体 (第 8 発明） によって認識された細胞を単離することによって、 純度の高いヒ ト肝細胞を回収する。 このようなモノクローナル抗体としては、 Mouse-Mouse hybridoma K82 16 ( FERM P- 18751 ) が産生するモノクローナル抗体を例示す ることができる。 この出願の第 3発明は、 前記の第 1発明または第 2発明の方法によって増殖さ せたヒト肝細胞を肝臓内に有する 「キメラマウス」 である。 このキメラマウスは、 好ましくはヒト肝細胞の移植から 50 日以上、 さらに好ましくは 70 日以上生存 したマウスである。 またこのキメラマウスは、 マウス肝臓の 70 %以上、 好まし くは 90 %以上、 さらに好ましくは 98 %以上がヒト肝細胞で占められているマウ スである。 またさらに、 このキメラマウスは、 ヒトのシトクロム P450活性を有 するマウスである。 すなわち、 ヒト型 P450は CYP 1A 1、 1 A2—、 2C9 , 2C 19、 2D6、 3A4 等、 数十種類の分子種が存在するが、 この発明のキメラマウスは、 これらのヒト型 P450をそれぞれヒト肝細胞と実質的に同程度に発現しているこ とを特徴の一つとしている。 シトクロム P450は肝臓における外来性化学物質の 代謝等に関与するタンパク質であり、 ヒト型 P450を発現するマウス肝臓は、 ヒ ト肝臓と実質的に同様にして化学物質等を代謝する。 従って、 この第 3発明のキ メラマウスは、 例えば薬剤の薬効や毒性がヒト肝細胞に及ぼす影響を試験する方 法 （第 9 発明） を可能とする。 なお、 このようなキメラマウスの利用は、 この 出願の発明者らによる先願発明 （特開 2002-45087 号公報：キメラ動物） を参 照することができる。 また、 第 2発明の大量増殖方法によって増殖させたヒト肝 細胞を肝臓内に有するキメラマウスの集団は、 同一のヒト由来の肝細胞をそれぞ れに有するキメラマウスの集団であり、 大規模な試験を実質的に均一な条件で行 うことを可能にする。 この出願の第 4発明は、 前記第 3発明のキメラマウスからヒト肝細胞を単離す る方法である。 この方法は、 前記第 2発明のステップ (2)と同様にして行うこと ができる。 この出願の第 5発明は、 前記第 4発明の方法によってキメラマウスの肝臓から 単離したヒト肝細胞である。 このヒト肝細胞は、 マウス個体内で増殖したことに よって、 実質的にヒト肝臓組織の正常肝細胞と同一の肝機能を有している。 従つ て、 この第 5発明のヒト肝細胞によって、 薬物代謝試験や安全性試験などに用い ることができるヒト肝細胞キッ卜 （第 6発明） や、 /、イブリツド型人工肝臓 （第 7発明） が提供される。 さらに、 ハイブリッド型人工肝臓に使用するモジュール (ヒ卜肝細胞を充填したモジュール） を使用して、 ヒト肝細胞が生産する有用物 質を回収することできる。 肝細胞キットは、 細胞の種類や用途に応じて各種のもの公知であり、 当業者で あれば、 第 5発明のヒト肝細胞と公知の細胞キットの構成を採用することによつ て、 第 6発明の細胞キットを容易に作製することができる。 また、 モジュールや ハイプリッド型人工臓器の構成も公知であり、 当業者であれば第 7—発明の人工肝 臓等を容易に作製することができる。 この出願は、 さらに第 8の発明として、 非ヒト肝細胞は認識せず、 ヒト肝細胞 を特異的に認識するモノクローナル抗体を提供する。 このモノクローナル抗体は、 公知のモノクローナル抗体作製法 （ 「単クローン 抗体」 、 長宗香明、 寺田弘共著、 廣川書店、 1990 年 ； "Monoclonal Antibody" James W. Goding, third edition, Academic Press, 1996) に従レ、、 例えば以下の様な手順で作製することができる。 1 ：八イブリ ドーマ細胞の作製
継代培養したヒト正常肝細胞を含む免疫原を用いて哺乳動物を免疫し、 必要に 応じて適宜に追加免疫して動物を充分に感化する。 次いでこの動物から抗体産生 細胞 （リンパ細胞または脾臓細胞） を摘出し、 これとミエローマ （骨髄種） 細胞 株との融合細胞を得る。 そして、 これらの融合細胞株から、 目的とするモノクロ ーナル抗体を産生する細胞を選択し、 培養することによって、 ハイプリ ドーマ細 胞を得ることができる。 以下、 各工程を詳しく説明する。 a) 免疫原の調製
正常肝組織からコラゲナーゼで分離したヒ卜肝細胞を継代培養し、 免疫原とす る。 ヒト肝細胞は、 4回以上、 好ましくは 6回以上の継代が可能な、 例えば 15 歳以下のヒト肝組織から分離したものを使用することが好ましい。 b) 動物の免疫
被免疫動物としては、 公知のハイプリ ドーマ作製法に用いられる哺乳動物を使 用することができる。 具体的には、 たとえばマウス、 ラット、 ャギ、 ヒッジ、 ゥ シ、 ゥマ等である。 ただし、 摘出した抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞 の入手容易性等の観点からは、 マウスまたはラッ卜を被免疫動物とするのが好ま しい。 また、 実際に使用するマウスおよびラットの系統は特に制限はなく、 マウ スの場合には、 たとえば各系統 A、 AKR、 BALB/c、 BDP、 B一 A、 CE、 C3H、 57BL、 C57BR、 C57L、 DBA、 FL、 HTH、 HT1、 LP、 NZB、 NZW、 RF、 RIE、 SJL、 SWR、 WB、 129 等が、 またラットの場合には、 たとえば、 Low、 Lewis, Spraque、 Daweley、 ACL BN、 Fischer等を用いることができる。 このうち、 後述のミエローマ細胞との融合適合性を勘案すれば、 マウスでは BALB/c 系統 が、 ラットでは low 系統が被免疫動物として特に好ましい。 なお、 これらマウ スまたはラットの免疫時の週齢は 5~ 12週齢が好ましい。
動物の免疫は、 免疫原である継代ヒト肝細胞を、 104〜： 108個程度、 動物の皮 内または腹腔内に投与することによって行うことができる。 免疫原の投与スケジ ユールは被免疫動物の種類、 個体差等により異なるが、 一般には、 抗原投与回数 1〜6回、 複数回の場合は投与間隔 1〜2週間が好ましい。 c) 細胞融合
上記の投与スケジュールの最終免疫日から 1〜5 日後に被免疫動物から抗体産 生細胞を含む脾臓細胞またはリンパ細胞を無菌的に取り出す。 これらの脾臓細胞 またはリンパ細胞からの抗体産生細胞の分離は、 公知の方法に従って行うことが できる。
次いで、 抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合する。 このミエローマ細胞に は特段の制限はなく、 公知の細胞株から適宜に選択して用いることができる。 た だし、 融合細胞からハイプリ ドーマを選択する際の利便性を考慮して、 その選択 手 S¾力 確 して レ る HGPRT ( Hpoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase) 欠損株を用いるのが好ましい。 すなわち、 マウス由来の X63- Ag8(X63) 、 NS l-Ag4/ l(NS-l) 、 P3X63-Ag8.Ul(P3Ul) 、 X63- Ag8.653(X63.653)、 SP2/0-Agl4(SP2/0)、 MPC 1 1-45.6TG 1.7(45.6TG) , FO、 S 149 /5XXO,BU. l 等、 ラッ ト由来の 210.RSY3.Ag. l .2.3(Y3)等、 ヒト由来の U266AR(SKO- 007)、 GM 1500 · GTG-A12(GM 1500)、 UC729-6, LICR-LOW- HMy2(HMy2)、 8226AR/NIP4- 1(NP41)等である。
抗体産生細胞とミエローマ細胞との融合は、 公知の方法に従い、 細胞の生存率 を極度に低下させない程度の条件下で適宜実施することができる。 そのような方 法は、 例えば、 ポリエチレングリコール等の高濃度ポリマー溶液中で抗体産生細 胞とミエローマ細胞とを混合する化学的方法、 電気的刺激を利用す—る物理的方法 等を用いることができる。
融合細胞と非融合細胞の選択は、 例えば、 公知の HAT (ヒポキサンチン · ァ ミノプテリン ·チミジン） 選択法により行うのが好ましい。 この方法は、 ァミノ プテリン存在下で生存し得ない HGPRT欠損株のミエローマ細胞を用いて融合細 胞を得る場合に有効である。 すなわち、 未融合細胞および融合細胞を HAT 培地 で培養することにより、 アミノブテリンに対する耐性を持ち合わせた融合細胞の みを選択的に残存させ、 かつ増殖させることができる。 d) ハイプリ ドーマのスクリーニング 目的とするモノクロ一ナル抗体を産生するハイプリ ドーマ細胞のスクリーニン グは、 公知の酵素免疫検定法 （EIA： Enzyme Immunoassay) 、 放射線免疫測 定法 （RIA： Radio Immunoassay) 、 蛍光抗体法等により行うことができる。 このようなスクリーニングによって、 非ヒト肝細胞とは結合せず、 ヒト肝細胞 のみと特異的に結合するモノクローナル抗体をそれぞれ 1こ産生する八イブリ ドー マ細胞群が得られる。
なお、 スクリーニング後のハイブリ ド一マ細胞は、 メチルセルロース法、 軟ァ ガロース法、 限界希釈法等の公知の方法によりクローニングし、 抗体産生に用い る。
以上の通りの方法によって得たハイプリ ドーマ細胞は、 液体窒素中または- 80"C以下の冷凍庫中に凍結状態で保存することができる。 この出願は、 このよ うなハイブリ ドーマ細胞の具体例として、 Mouse- Mouse hybridoma K8216 (FERM BP-8333) を提供する。 2 ：モノクローナル抗体の取得および精製
上記 1で作製したハイプリ ドーマ細胞を公知の方法で培養することによって、 非ヒト肝細胞は認識せず、 ヒト肝細胞のみと特異的に結合するモノクローナル抗 体を得ることができる。
培養は、 例えば、 前記のクローニング法で使用した同じ組成の培地中で培養し てもよく、 あるいはモノクロ一ナル抗体を大量に産生するためには、 マウス腹腔 内にハイブリ ドーマ細胞を注射し、 腹水からモノクローナル抗体を—採取してもよ い。
このようにして得たモノクローナル抗体は、 例えば硫安塩析法、 ゲル濾過法、 イオン交換クロマ卜グラフィ一法、 ァフィ二ティークロマ卜グラフィ一法等によ り精製することができる。
この出願は、 モノクローナル抗体の具体例として、 前記のハイプリ ドーマ (Mouse-Mouse hybridoma K8216) が産生するモノクローナル抗体を提供す る。 この第 8 発明のモノクローナル抗体は、 前記第 2発明および第 4発明の方法 において、 マウス肝臓からヒト肝細胞のみを分離するために使用することができ る。 また、 この第 8 発明のモノクローナル抗体は、 非ヒト肝細胞は認識しない ため、 マウス以外の非ヒト動物の体内でヒト肝細胞を増殖させた場合、 あるいは 非ヒト肝細胞とヒト肝細胞を混合培養した場合に、 ヒト肝細胞を単離、 精製する ために使用することができる。 なお、 この出願の発明で使用する 「増殖性ヒト肝細胞を特異的に認識するモノ クローナル抗体」 も、 スクリーニング工程において目的抗体を産生するハイブリ ドーマを選択することを除き、 前記と同一の方法で作成することができる （実施 例 6 参照） 。 この出願は、 そのようなモノクローナル抗体の具体例として、 Mouse-Mouse hybridoma K8223 (FERM BP-8334) が産生するモノクロ一 ナル抗体を提供する。
実施例 以下、 実施例を示してこの出願の発明についてさらに詳細かつ具体的に説明す るが、 この出願の発明は以下の例によって限定されるものではない。
実施例 1
ヒト肝細胞を増殖させたキメラマウスの作成 免疫不全肝障害マウスの肝臓にヒト肝細胞を移植し、 肝臓内でヒト肝細胞を増 殖させたキメラマウスを作製した。 作成の材料、 方法、 および各種試験の結果は 以下のとおりであった。
1 材料
(a) アルブミンゥロキナーゼプラスミノ一ゲンァクティベ一タートランスジェ ニックマウス
(uPA-Tg)： B6SJL-TgN (Alb lPlau) 144Bri
(b) スキッドマウス （Scid) : C. Β- 17/Icr Scidjcl
(c) nafamostat mesilate
(d) retrorsine レ卜ロ Jレシン
(e) ヒト肝細胞
なお、 マウス（a)は The Jackson Laboratory、 マウス（b)は日本クレアよりそ れぞれ購入した。 薬品 (c)は鳥居製薬社製 （商品名 ： フザン） 、 （d)は SIGMA 社 製を購入した。
また、 細胞 (e)は以下のとおりに調製した。 肝切除術を行う患者にインフォ一 ムドコンセントを実施し、 承諾を得た後に切除肝より正常肝臓組織を得て、 UW 液で灌流し、 4でで運搬した。 正常肝臓組織からコラゲナーゼ処理により肝臓分 散液を得た。 低速遠心分離法 （50g、 2分） で沈殿と上澄みに分離し、 それぞれ に含まれる細胞 （上澄み：小型肝細胞、 沈殿：肝実質細胞） を培地で洗浄後、 肝 細胞数をカウントした。 凍結保存する場合は、 凍結保存液 （クラボウ製） を加え、 プログラムフリ一ザ一を用いて凍結した。 液体窒素に保存してある沈殿または上 澄みの肝細胞を 37°Cの恒温水槽で融解し、 細胞数をカウントした。 4 x l07個/ mlになるように、 移植直前に培地で調整した。 2 方法と結果
2. 1 免疫不全肝障害マウスの作製
uPA-Tgマウス（hemizygote, +/-)と SCIDマウス （homozygote, +/-) を掛け 合せ、 両方の形質を持つマウス Tg(+/-)/SCID(+/-)を 35.2 %の確率で得た。 Tg(+/-)と Tg(-/ -)の識別は、 Tg 遺伝子に特異的な配列をプライマーに用い、 ゲ ノム PCR法により行った。 また、 SCID(+/-)と SCID(-/-)の識別は、 PCR-RFLP 法により行った。
次に、 得られた Tg(+/-) / SCID(+/-)を SCID(+/+)と戻し交配させ、 Tg(+/- )/SCID(+/+)を得た。 その結果、 丁§(+/-)は 37.9。/。出現し、 SCID(+/+)は 52.8 % 出現した。 Tg(+/-) /SCID(+/+)同士を交配させ、 目的の Tg(+/-)/ SCID(+/+)およ び §(+/+)/3010(+/+)を得た。
なお、 uPA遺伝子のホモとヘテロの識別は以下の方法で行つた。
生後 8〜10 日目のマウスの尾を約 5 mm 切断し、 Qiagen DNeasy Tissue Kitを用いてゲノム DNAを抽出した。 抽出した DNAの濃度および純度を吸光度 計を用いて現定した。 master mix 25 H 1, primer F 1 μ.1, primer R 1 1, Taqman probe 1 lに DNAと蒸留水を加え、 全量を 50 illに調整し、 定量 性 PCRを行った （ABI7700, Sequencer Detector, PE Applied Biosystems) 。 プライマーおよび Taqman probeは uPA遺伝子導入のためのベクタ一に含まれ るヒト成長ホルモンのコード配列を対象として以下のとおりに設計した。
primer F： gtcttggctcgctgcaatc (SEQ ID No: 1)
primer R： cgggagactgaggcaggag (SEQ ID No: 2)
Taqman probe： ccgcctcctgggttcaagcga (SEQ ID No: 3)
またとコントロールとして、 マウス G3PDH を対象とする以下のプライマー および Taqman probeを用いた。
primer F： ggatgcagggatgatgttc (SEQ ID No: 4)
primer R： tgcaccaccaactgcttag (SEQ ID No: 5)
Taqman probe： cagaagactgtggatggccctc (SEQ ID No: 6)
PCR条件は、 で 10分変性の後、 95でで 15秒変性と 60 で 1分伸長を 50サイクル行った。 ヒト成長ホルモンのコード配列の増幅断片の量を、 内部コ ントロールのマウス G3PDHコード配列の増幅断片量で割った相対値により、 ゲノム DNA中の導入遺伝子の量を比較した。 標準曲線はサンプル ¾中のへテロ かホモのマウスのゲノムの希釈系列を用いた。 標準に用いたマウスの値を 1とし， そのマウスがヘテロだった場合は、 ヘテロが 1に近い数値を示し、 ホモは 2に近 い数値を示す。 標準に用いたマウスがホモだった場合は、 ホモが 1に近い数値を 示し、 ヘテロは 0.5に近い数値を示す。 解剖時の肉眼所見により、 この方法に よる正答率は約 90%と推定している。
2.2 uPA-Tg/SCIDマウスへのヒト肝細胞の移植
生後 14〜48日目の Tg(+/+)/SCID(+/+)マウスをエーテルで麻酔し、 脇腹を 約 5 mm切開し、 脾頭より 4-8 X 107個/ mlの濃度の細胞懸濁液を 10- 12.5 1ずつ （4- 10 X 105個） 注入した後、 止血した。 腹腔に止血剤 e-aminocaproic acid (SIGMA)を 0.02 g/mlの濃度で 40 lずつ投与し、 脾臓を腹腔に戻し縫 合した。 Tgマウスの肝細胞で作られた uPAは細胞外へ分泌されるため、 血中の uPA濃度が高い。 uPAは、 蛋白質分解や plasminogenから plasminへの活性 化を触媒したり、 fibrin clotを分解する働きがある。 このため、 生後、 多くの マウスが、 腸管や腹腔内で出血をおこし生後 4日以内に死に至るといわれてい る。 手術時の出血による死亡を避けるため、 plasminogen activatorおよび plasminの作用を阻止し止血作用の効果を有する e-aminocaproic acidを投与 した。
掛け合わせに用いた SCID/C.B- 17マウスは、 T細胞 B細胞は持たないが、 NK細胞を持つことが知られている。 そこで、 移植したヒト肝細胞がマウスの NK細胞に攻撃されないように、 NK活性を阻害する asialo GM 1抗体を移植前 日と移植翌日に腹腔内に投与した。 生後 4週で離乳させ、 生後 5週から雌雄を 別ケージで飼育した。
2.3 マウス血中におけるヒトアルブミンのモニタリング
ヒト肝細胞移植後 1週間目より、 週 1回または 2回ずつマウスの尾より血液を 10 ^ 1採血し、 ヒトアルブミン濃度を Quantitative ELISA immunoassay (Bethyl laboratories Inc.) を用いて測定した。
ヒト肝細胞を移植した 19匹の Tg(+/+) /SCIDマウス中 1 1匹のマウス血中で ヒトアルブミンが増加し （図 1 ) 、 高いもので、 8 mg/ml以上に達し、 この値 はマウス血中アルブミンの 62 %に相当した。
また、 ヒト肝細胞の低速遠心分離による上澄み中の細胞 （小型肝細胞） と沈殿 中の細胞 （肝実質細胞） をそれぞれ移植した場合の血中ヒトアルブミン濃度を比 較したところ、 肝実質細胞移植マウスよりも小型肝細胞移植マウスの方がアルブ ミン濃度の上昇を示した （図 2) 。
2.4 ヒト肝細胞により産生されるヒト補体および補体抑制剤の投与
血中ヒトアルブミンが 3 mg/mlを越えたマウスが急速に状態が悪くなり死亡 するケースが見られた （図 1 ) 。 死亡動物には肺の出血が観察され、 ヒト肝細胞 による補体産生による影響が認められた。 マウス肝臓組織中のヒ卜肝細胞をヒ卜 補体 C3に対する抗体を用いて免疫染色を行ったところ、 ヒト肝細胞に C3の存 在が確認された。 そこで、 ヒトアルブミン濃度が高くなつたマウスに 2 mg/ml 濃度の補体抑制剤 （フサン） 200 ^ 1を投与した。 投与頻度は 2 日に 1回から開 始した。 体重の変化を毎日観察し、 体重減少が見られたら、 投与頻度や濃度を増 加していった （図 3) 。 その結果、 血中ヒトアルブミン濃度が 2 mg/mlを越え たマウスには補体抑制剤 （フサン） を隔日、 4 mg/ml を越えたマウスには毎日、 さらに 6 mg/mlを越えたマウスには 1 日 2回投与することとした （図 3) 。 こ の処理により、 血中ヒトアルブミン濃度が 3 mg/mlを越えてもマウスが長期間 生存でき、 高いもので 8 mg/mlのヒトアルブミンを検出できるようになった (図 1 ) 。
さらに、 補体抑制剤 （フザン） を投与しないキメラマウスと、 投与したキメラ マウスのそれぞれの血中ヒト補体 （hC3a) を ELISA法により測定した。 その結 果、 補体投与キメラマウスの hC3a濃度は、 非投与キメラマウスに比較して低 いことが確認された （図 4) 。
2.5 ビタミン Cおよび SCIDマウス血清の投与
ヒト肝細胞はビタミン Cを合成できないため、 ヒト肝細胞で置換された肝臓 を持つマウスはビタミン C欠乏症となる可能性が考えられた。 そのため、 ヒト 肝細胞を移植したマウスには ascorbic acid 2-phosphateを 1 mg/mlの濃度で 溶かした飲料水を与えた （日本クレア、 ァスコルビン酸合成能 如""ラットの飼育 方法を参考にした） 。
また、 ヒト肝細胞を移植した Tg(+/+)/SCIDマウスは Tg(+/-)/ SCIDマウス に比べて体重増加が遅く毛並みも悪い。 マウス肝臓中のヒト肝細胞が合成する蛋 白や酵素などがマウスの成長や体の維持に不十分である可能性が考えられたので,
SCIDマウス血清を 50 1ずつ週に 1回皮下に投与した。 SCIDマウス血清を投 与したものと投与していない Tg(+/+) /SCIDマウスの体重増加量を比較したと ころ、 投与したマウスの方が上回った。 2.6 マウス肝臓の肉眼的病理検査おょぴ組織学的病理検査 マウスをエーテル麻酔下で採血し、 血清中アルブミンおよび GPT値を測定し た。 肝臓と脾臓を摘出し、 重量測定、 写真撮影後に凍結切片ブロック、 パラフィ ン切片ブロック用にサンプリングし、 残りのサンプルからマイクロゾーム画分を 抽出した。 ヒトアルブミン濃度が高くなるに従って、 血清アルブミン量の増加お ょぴ GPT値の低下が認められた （図 5) 。
ヒトアルブミンが高値のマウスでは、 肝臓全体が桃色を呈し、 1部に
Tg(+/ +) / SCIDの特徴である白色部位が残っているマウスも見られた。 また、 1 部が赤色を呈した肝臓も見られ、 その部位は uPA導入遺伝子の欠損により正常 化したマウスの肝細胞と考えられた。
肝臓のそれぞれの葉の凍結切片を作製し、 ヒト特異的 cytokeratin 8/ 18抗体 (ICN Pharmaceuticals, Inc, Ohio) を反応させた後、 Peroxidase標識 DAKO Envision+TM (DAKO CORPORATION, CA)で染色した。 それぞれの葉について， 切片面積あたりの cytokeratin 8/ 18陽性部位の割合を算出した （図 6、 7) 。 ヒトアルブミン分泌量が多いマウスでは、 cytokeratin 8 / 18陽性肝細胞の面積 の割合が高かった。 陽性細胞が 80 %を越えているマウスも観察された。
2.7 マイクロゾームにおける P450分子種の解析
マウスから採取したマイクロゾーム画分における P450分子種の発現を、 P450の分子種に対する抗体 （第一化学薬品株式会社、 東京） を用いてウェス夕 ンプロット分析により検出した。 その結果、 ヒトアルブミンが高かったマウスに おいて、 P450のヒト特異的な分子種である CYP2C9の発現が認め—られた （図 8) 。
さらに、 マウスから採取したマイク口ゾーム画分における CYP2C9の活性を 調べるため、 マイクロゾームに Diclofenacを添加し、 Diclofenac 4- hydroxylationの測定を行った。 その結果、 uPA(-/ -) SCIDマウスには
Diclofenac 4-hydroxylation活性はほとんど認められず、 補体抑制剤投与によ る誘導も認められなかった。 一方、 ヒト肝細胞を移植したキメラマウスにおいて は、 ヒト細胞への置換率が高くなるほど高い Diclofenac 4-hydroxylation活性 が認められ、 置換率 89 %のキメラマウスでは、 ド^ "一 （ヒト） のマイクロゾー ムにおけるそれを上回る活性が認められた （図 9) 。 2.8 キメラマウス肝臓における P450各分子種の mRNA発現と、 Rifampicin こ る 導
キメラマウス肝臓より total RNAを抽出し、 逆転写反応により cDNAを合成 した。 6種類のヒト型 P450分子種 （CYP1A1、 1 A2、 2C9、 2C19、 2D6、
3A4) のそれぞれの遺伝子 cDNAに対するプライマ一を合成し、 PRISM 7700 Sequence Detector (ABI社） を用いて、 それぞれの mRNA発現量を定量した。 その結果、 置換率 0%のコントロールマウスがヒ卜型 P450をほとんど発現しな いのに対し、 キメラマウス肝臓においては全てのヒト型 P450分子種が発現して おり、 それらの発現パターンはドナ一 （ヒト） の発現パターンと近似していた (図 10) 。
さらに、 キメラマウス 3匹に Rifampicin (50 g/kg b.w.) を 4日間腹腔内 投与し、 5日目に肝臓を採取し、 前記と同様にして 6種類のヒト型 P450のそれ ぞれの発現を定量した。 Rifampicinはヒトの CYP3A4発現のみを誘導すること が公知である。 その結果、 Rifampicin を投与したキメラマウスの肝臓において， 非投与マウスに比べ約 5.7倍ものヒト型 CYP3A4発現が確認された （図 10) 。
実施例 2
キメラマウスからのヒ卜肝細胞の分離と、
モノクロ一ナル抗体によるヒト肝細胞純化 実施例 1で作成したキメラマウスからコラゲナ一ゼ灌流法により肝細胞を分離 した。 コラゲナ一ゼの濃度は 0.05%、 処理時間は 9分とした。 肝細胞には、 ヒ ト肝細胞とマウス肝細胞が混入していると考えられるが、 マウス肝細胞の方がヒ ト肝細胞に比べて、 コラゲナーゼによる毒性が高いため、 分離した肝細胞の多く (約 80 % ) はヒト肝細胞により占められていた。
さらに、 ヒト肝細胞の純度を上げるため、 マウス肝細胞は認識せずに、 ヒト肝 細胞の表面を特異的に認識するマウスモノクローナル抗体 （実施例 6で作成した Λイブリ ドーマ K8216 が産生するモノクロ一ナル抗体） を用いてヒト肝細胞の みを分離した。 コラゲナーゼ灌流により分離したヒ卜肝細胞の占める割合が約 80 %であったマウスの肝細胞に上記抗体を反応させ、 さらに FITC 標識マウス IgG抗体を反応させ、 FACSを用いて FITC標識マウス IgG抗体に反応した細胞 を分離した。 その結果、 ヒト肝細胞の純度が 95 %以上となった。
実施例 3
キメラマウスから単離したヒト肝細胞の uPA-Tg/SCIDマウスへの再移植 実施例 2 で単離した肝細胞を、 実施例 1 と同様に して別の uPA- Tg(+/+)/ SCID マウスに移植し、 飼育した。 その結果、 マウス血中においてヒト アルブミン量の増加が見られた （図 1 1) 。
実施例 4
uPA導入遺伝子の欠失による正常化マウス肝細胞の増殖抑制 uPA-Tg(+/-) /SCIDマウスおよび uPA-Tg(+/+)/SCIDマウスに、
retrorsine30または 60 mg/kgを腹腔内投与した。 その結果、 uPA-Tg(+/- )/SCIDマウスにおける uPA導入遺伝子の欠失 （uPA-Tg(-/-) / SCID) による正 常化肝細胞のコロニーが減少した （図 12) 。
次いで、 retrorsineを 60 mg/k を腹腔内投与した uPA-Tg(+/-) / SCIDマウ スおよび uPA-Tg(+/+)/ SCIDマウスに実施例 1と同様にしてヒト肝細胞を移植 し、 キメラマウスを作成した。 その結果、 uPA-Tg(+/-) / SCIDマウスをレシピ ェントするキメラマウスにおいても、 uPA-Tg(+/+) /SCIDマウス由来のキメラ マウスと同程度に血中ヒトアルブミン濃度が増加した。
実施例 5
ヒト肝細胞キメラマウスへの抗マウス Fas抗体投与 実施例 1で作製したキメラマウスの 1匹について、 ヒト肝細胞移植から 100 日経過した時点で、 マウス肝細胞の Fas 抗原に反応してマウス肝細胞のアポト —シスを誘導する抗マウス Fas抗体 （0.2 g/g b.w.) を 1週間間隔で 2回腹腔 内投与した。
結果は図 13 に示したとおりである。 このキメラマウスは、 ヒト肝細胞移植か ら約 80 日以降、 血中のヒトアルブミン濃度が減少傾向を示したが、 抗マウス Fas抗体の投与により、 血中ヒトアルブミン濃度を著しく上昇させた。
以上の結果、 この発明の方法においては、 ヒト肝細胞移植後のキメラマウスに 抗 Fas 抗体を投与することが、 ヒト肝細胞の増殖および Zまたは活性化に有効 であることが確認された。
実施例 6
ヒト増殖性肝細胞を認識するモノクローナル抗体の作製
1. ヒト肝細胞の培養
ヒト肝臓組織よりコラゲナーゼ灌流法により、 細胞分散液を得た。 細胞分散液 を低速遠心分離 （50g、 2 分） し、 その沈殿画分を牛胎児血清、 ヒト血清、 EGF、 ニコチンアミ ド、 活性持続型ビタミン C を添加した Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) を用い、 マイトマイシン C処理した Swiss 3T3細 胞と混合培養した。 Swiss 3T3細胞は 10日毎に添加した。 培養 7日目頃よりヒ ト肝細胞のコロニーが観察された。 コンフルェン卜に増殖した肝細胞を EDTA/Trypsin を用いて継代した。 継代は、 子供の肝細胞では 6-9 回継代でき、 60 才以上の患者の肝細胞は 3-4 回しか継代できなかった （図 14) 。 もっとも 高い増殖能を示した子供 （12才） の肝細胞を抗原として用いた （図 15) 。
2. 動物の免疫
上記方法により、 3-5 回継代培養した子供 （12 才） の肝細胞を培養皿上で増 やした。 コンフルェントに増殖した細胞 （約 I X 10?個） を、 PBS (リン酸緩衝 塩類溶液） で洗浄した後、 PBS を取り除き、 セルスクレーパーで搔き取って回 収し、 PBS約 1mlに懸濁した。 これを 6週齢の Balb/cマウスの腹腔内に投与 した。 さらに 20日後または 30 日後に、 同様の方法で免疫を行った。 3. 細胞融合
2 回の免疫後、 抗体価の上昇がみられたため、 3 回目の免疫 （boost)の 72 時 間後、 1 匹の免疫動物より脾臓を摘出、 脾臓細胞を採取した。 この脾臓細胞とマ ウスミエローマ細胞 （細胞名 NS- 1) を細胞融合し、 96-well plateに 372 well 播種、 培養した。
4. ハイプリ ドーマのスクリーニング
1次スクリーニング （ELISA、 組織染色） ：
得られた融合細胞の培養上清の抗原に対する反応性を ELISA により測定した。 測定は以下の方法により実施した。 抗原として用いた継代培養肝細胞を 96-well plateに播種し、 培養後 PBSで洗浄、 乾燥させ- 80t:で保存しておいたものに、 培養上清を反応させた。 次に酵素標識の抗マウス IgG または抗マウス IgM 抗体 を反応させ、 基質を加えて発色させ、 その吸光度を測定した。 その結果、 融合細 胞 372 サンプルの吸光度の平均は 0. 149 ( SD: 0.099) で、 このうち吸光度 0.20 以上 （81 サンプル、 約 20 % ) のサンプルを陽性とした。 また目視におい て、 吸光度 0. 15 以上でも発色が確認されたことから、 0. 15〜0.20 のサンプル (46 サンプル）については、 組織染色を行い反応性を確認した。—そ—の中から、 興 味深い染色パターンを示した 13サンプルについてのみ陽性サンプルとした。 選 択した陽性サンプル、 94 サンプルをスケールアップしてさらに培養し、 培養上 清を回収後、 細胞を凍結保存した。
5. 2次スクリーニング （ELISA、 組織染色） ：
1 次スクリーニングで選んだ 94サンプルから、 スケールアップ後の培養上清 の抗原に対する反応性を 1次スクリーニングと同様の ELISAにより測定し、 陽 性サンプル、 88 サンプルを選んだ。 さらに、 これらのサンプルの、 組織におけ る反応性を組織染色により調べた。 そのなかから、 肝細胞の細胞膜や、 門脈域の 肝細胞に特異的に反応するハイプリ ドーマを含むサンプル、 または、 そこからク ローニングによって得られたクローンの培養上清について、 分離直後のヒト肝細 胞への反応性を調べた。
組織において門脈域の肝細胞膜が染まるハイプリ ドーマ培養上清 （No. 23) (図 16 ) について、 分離直後の肝細胞表面における反応性を、 FACS (Fluorescence activated cell sorting) を用いて解析した。 成人男性 （46 才 および 49才） の肝臓からコラゲナーゼ灌流、 低速遠心により得られた細胞を、 このサンプルの培養上清で 4T 、 30 分処理し、 次に FITC 標識した抗マウス IgG 抗体を 4で、 30 分処理することにより、 FACS での検出を可能にした。 そ の結果、 肝細胞集団の一部 （1〜： 2 % ) の細胞がこのサンプルに反応した （図 17) 。 そこで、 これらの細胞集団を R2、 反応しなかった細胞集団を R3 として 分取し、 培養した。 また分取前の肝細胞も同様に培養した。 その結果、 分取前の 肝細胞では、 前述したように、 培養 7 日目頃より、 コロニー形成が観察された。 一方、 R3 画分においては、 コロニーを形成する細胞は観察されなかったが、 No. 23に反応した R2画分において、 多くのコロニーが観察された （図 18) 。 また、 継代培養ヒト肝細胞への反応性を FACS により調べたところ、 約 80 %の細胞が 陽性であった （図 19) 。 すなわち、 継代培養ヒ卜肝細胞のうち培養過程で分化 した細胞は認識せず、 増殖性肝細胞のみを認識していると考えられた。 このこと から、 No. 23 には、 コロニーを形成する細胞を特異的に認識するハイプリ ドー マが含まれている可能性が示唆された。 No.23 サンプルからクロ一ニングによ り得られたクロ一ンについても分離直後の肝細胞表面における反 S性を FACS を用いて解析した。 その結果、 同様の反応性を示すクローンが 3 クローン得ら れた。 これらの中から、 1 クローン （Mouse-Mouse hybridoma K8223 ) を 2002年 3月 6日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに 特許微生物として寄託し （受託番号 FERM P- 18752) 、 さらに 2003 年 3 月 20日付で国際寄託した （受託番号 FERM BP-8334) 。
6. モノクローナル抗体の作製
前記のハイプリ ドーマ （K8223 株） 細胞を培養することによって、 さらに、 マウス腹腔内にハイプリ ドーマ細胞を注射し、 腹水からモノクローナル抗体を採 取することにより、 増殖性ヒト肝細胞と特異的に結合するモノクローナル抗体を 得た。
実施例 7
ヒト肝細胞を特異的に認識するモノクローナル抗体の作製 非ヒト肝細胞は認識せず、 ヒト肝細胞のみを認識するモノクローナル抗体を産 生するハイブリ ドーマを.、 実施例 6の 1次スクリ一ニングで選択した 94サンプ ルのうち ELISAにおいて陽性であった 88サンプルからヒト肝臓組織における 組織染色により選択した。 肝細胞の細胞膜が部域に関係なく一様に染まる八イブ リドーマ培養上清 3サンプルについて、 培養ヒト肝細胞や分離直後のヒト肝細胞 および非ヒト動物 （マウス、 ラット） 肝細胞の細胞表面への反応性を FACSを 用いて解析した。 成人男性 （46 才または 68 才） の肝臓からコラゲナ一ゼ灌流、 低速遠心により得られた細胞を、 選択した 3サンプルの培養上清で 4で、 30分 処理し、 次に FITC標識した抗マウス IgG抗体を 4 、 30分処理することによ り、 FACSでの検出を可能にした。 FACSによるスクリーニングの結果、 ヒトの 肝細胞のみに反応し、 マウスおよびラット肝細胞には反応しないハイプリ ドーマ (クロ一ニング前） を 1サンプル選択した。 これより得られたモノクローンの ハイプリ ドーマ培養上清、 2クローンも同様の反応性を示した （図 20) 。 選択 したハイプリドーマ培養上清での組織染色ではヒト肝組織の毛細胆管と思われる 部位が染まり、 その染色性において部域差は認められなかった。 またマウスおよ びラット肝組織はこのハイプリ ドーマ培養上清に対していずれも陰性であった。 以上の結果より、 非ヒト動物の肝細胞は認識せず、 ヒト肝細胞を特異的に認識す る抗一ヒト肝細胞モノクロ一ナル抗体を産生するハイプリ ドーマが得られた。 こ のハイプリ ドーマ K8216株を 2002年 3月 6日付で独立行政法人産業技術総合 研究所特許生物寄託センタ一に特許生物として寄託し （受託番号 FERM P- 18751) 、 さらに 2003年 3月 20日付で国際寄託した （受託番号 FERM BP- 8333) 。
この K8216株から実施例 6と同様の方法で、 モノクローナル抗体を得た。 産業上の利用可能性 以上詳しく説明したとおり、 この出願の発明によって、 ヒト肝細胞を、 その機 能を保持した状態で大量に増殖させることが可能となる。 また、 肝臓内の細胞の 多くがヒト肝細胞に置換したキメラマウスが提供される。 このキメラマウスゃヒ ト肝細胞を用いた化合物の薬物代謝試験や安全性試験が可能となる。

Claims

請求の範囲
1. 免疫不全肝障害マウスの肝臓にヒト肝細胞を移植し、 ヒ卜肝細胞の産生する ヒト補体の攻撃から防御させた状態でヒト肝細胞移植マウスを飼育することによ り、 移植したヒト肝細胞をマウス肝臓で増殖させることを特徵とするヒト肝細胞 増殖方法。
2. ヒト補体の攻撃から防御させた状態が、 以下の（a)および (b)：
(a) ヒト肝細胞移植マウスに少なくとも 1回、 補体抑制剤を投与すること ； (b) 免疫不全肝障害マウスと して、 免疫不全肝障害マウスと decay- accelerating factor (DAF/CD55)トランスジエニックマウスを交配して得られ た子孫マウスを使用すること、
の少なくとも一方である請求項 1のヒト肝細胞増殖方法。
3. 免疫不全肝障害マウスが、 遺伝的免疫不全マウスと遺伝的肝障害マウスと を交配して得られた子孫マウスである請求項 1 または 2 のヒト肝細胞増殖方法。
4. 子孫マウスが、 へミ接合体免疫不全肝障害マウスである請求項 3 のヒト肝 細胞増殖方法。
5. へミ接合体免疫不全肝障害マウスに、 肝細胞増殖阻害物貧を—投与した後、 ヒト肝細胞を移植する請求項 4のヒト肝細胞増殖方法。
6. ヒト肝細胞を移植した免疫不全肝障害マウスに抗マウス Fas抗体を投与す る請求項 1から 5のいずれかのヒト肝細胞増殖方法。
7. 免疫.不全肝障害マウスの肝臓に移植するヒト肝細胞が、 増殖性ヒト肝細胞 である請求項 1 のヒト肝細胞増殖方法。
8. 増殖性ヒト肝細胞が、 コロニーを形成しながら増殖するヒト肝細胞を特異 的に認識するモノクローナル抗体によって認識されたヒ卜肝細胞である請求項 7 のヒト肝細胞増殖方法。
9. モノクローナル抗体が、 Mouse-Mouse hybridoma K8223 (FERM BP- 8334) が産生するモノクローナル抗体である請求項 8のヒト肝細胞増殖方法。
10. 以下のステップ（1)〜(3)：
(1) 免疫不全肝障害マウスの肝臓にヒト肝細胞を移植し、 ヒト肝細胞の産生す るヒト補体の攻撃から防御させた状態でヒト肝細胞移植マウスを飼育することに よって、 移植したヒ卜肝細胞をマウス肝臓で増殖させるステツプ；
(2) マウス肝臓から増殖したヒト肝細胞を単離するステップ；および
(3) 単離したヒト肝細胞を、 免疫不全肝障害マウスの肝臓に移植し、 ヒト肝細 胞の産生するヒト補体の攻撃から防御させた状態でヒト肝細胞移植マウスを 50 日以上飼育するステップ、
からなり、 ステップ (2)および (3)を 1回以上繰り返すことを特徴とするヒト肝細 胞大量増殖方法。
1 1. ステップ（ 1 )および Zまたは ( 3 )におけるヒト補体の攻撃から防御させた状 態が、 以下の（a)および (b)：
(a) ヒト肝細胞移植マウスに少なくとも 1回、 補体抑制剤を投与すること ；
(b) 免疫不全肝障害マウス として、 免疫不全肝障害マウ—ス と decay- accelerating factor (DAF/CD55)トランスジエニックマウスを交配して得られ た子孫マウスを使用すること、
の少なくとも一方である請求項 1 0のヒト肝細胞大量増殖方法。
12. ステップ（1)およびノまたは (3)において、 免疫不全肝障害マウスが、 遺伝 的免疫不全マウスと遺伝的肝障害マウスとを交配して得られた子孫マウスである 請求項 10または 1 1のヒト肝細胞大量増殖方法。
13. 子孫マウスが、 へミ接合体免疫不全肝障害マウスである請求項 12のヒト 肝細胞大量増殖方法。
14. へミ接合体免疫不全肝障害マウスに肝細胞増殖阻害物質を投与した後、 ヒト肝細胞を移植する請求項 13のヒ卜肝細胞大量増殖方法。
15. ステップ（1)および または (3)において、 ヒ卜肝細胞を移植した免疫不全 肝障害マウスに抗マウス Fas抗体を投与する請求項 10から 14のいずれかのヒ ト肝細胞大量増殖方法。
16. ステップ（1)および または (3)において免疫不全肝障害マウスの肝臓に移 植するヒト肝細胞が、 増殖性ヒト肝細胞である請求項 10 のヒト肝細胞大量増殖 方法。
17. 増殖性ヒト肝細胞が、 コロニーを形成しながら増殖するヒ卜肝細胞を特 異的に認識するモノクローナル抗体によって認識されたヒト肝細胞である請求項
16のヒト肝細胞大量増殖方法。
18. モノク口一ナル抗体が、 Mouse-Mouse hybridoma K8223 (FERM BP - 8334) が産生するモノクローナル抗体である請求項 17 のヒト肝細胞大量増殖 方法。
19. ステップ (2)において、 以下の（a)および (b) ：
(a) マウス肝臓から分離した肝臓組織をコラゲナーゼ処理する ；および
(b) 非ヒト肝細胞は認識せず、 ヒト肝細胞を特異的に認識するモノクローナル 抗体によって認識された細胞を単離する、
の少なくとも一方を行うことによって、 実質的にヒト肝細胞のみを単離する請求 項 10のヒ卜肝細胞大量増殖方法。
20. モノク口一ナル抗体が、 Mouse-Mouse hybridoma K82 16 (FERM BP- 8333) が産生するモノクローナル抗体である請求項 19 のヒト肝細胞大量増殖 方法。
21. 請求項 1 から 9 のいずれかのヒト肝細胞増殖方法、 または請求項 10か ら 20 のいずれかのヒ卜肝細胞大量増殖方法によって増殖させたヒト肝細胞を肝 臓内に有するキメラマウス。
22. 増殖したヒト肝細胞が、 肝臓内の細胞の 70 %以上を占めている請求項 2 1のキメラマウス。
23. ヒト型 P450活性を有する請求項 2 1または 22のキメラマウス。
24. 請求項 2 1、 22または 23のキメラマウスの肝臓からヒト肝細胞を単離す ることを特徴とするヒト肝細胞取得方法。
25. 以下の (a)および (b)：
(a) マウス肝臓から分離した肝臓組織をコラゲナーゼ処理する ；および
(b) 非ヒト肝細胞は認識せず、 ヒト肝細胞を特異的に認識するモノクローナル 抗体によって認識された細胞を単離する、
の少なくとも一方を行うことによって、 実質的にヒト肝細胞のみを単離する請求 項 24のヒト肝細胞取得方法。
26. モノクローナル抗体が、 Mouse-Mouse hybridoma K82 16 (FERM BP- 8333) が産生するモノクローナル抗体である請求項 25の取得方法。
27. 請求項 24から 26のいずれかの方法によって取得されたヒト肝細胞。
28. 請求項 27のヒト肝細胞を含む細胞キット。
29. 請求項 27のヒト肝細胞を充填したハイプリッド型人工肝臓。
30. 非ヒ卜肝細胞は認識せず、 ヒト肝細胞を特異的に認識するモノクローナル 抗体。
31. Mouse-Mouse hybridoma K8216 (FERM BP-8333) が産生する請求項 30のモノクローナル抗体。
32. Mouse-Mouse hybridoma 8216 (FERM BP-8333) 。
33. 請求項 21、 22 または 23 のキメラマウスに候補物質を全身投与し、 候補 物質の薬物動態または毒性を試験する方法。
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