KR20220035926A - 간세포 생성을 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

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레이몬드 디. 히키
마이클 씨. 홈즈
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Abstract

본 개시내용은 인간 간세포와 같은 간세포의 생체내 생성을 위한 방법 및 조성물, 뿐만 아니라 예를 들어 이를 필요로 하는 대상체에게 간세포를 투여하는 것을 수반하는 방법을 포함하는 간세포에 대한 용도, 이러한 간세포를 포함하는 조성물 등의 분야이다.

Description

간세포 생성을 위한 방법 및 조성물
관련 출원의 교차 참조
본 출원은 2019년 7월 26일에 출원된 미국 임시출원 제62/879,142호 및 2020년 3월 26일에 출원된 미국 임시출원 제63/000,169호의 이익을 주장하며, 이의 개시내용은 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다.
기술분야
본 개시내용은 임상 용도를 위해 인간 간세포(hepatocyte)를 생성하고 사용하는 방법을 포함하는 인간 간세포 분야에 관한 것이다.
인간 간세포는 전임상 약물 개발 동안 제약 산업에 의해 널리 사용된다. 실제로 FDA는 약물 개발의 일환으로 이들의 사용을 의무화하였다. 약물 대사 및 기타 연구의 경우, 간세포는 일반적으로 사체 장기 기증자로부터 단리되어 검사가 수행될 장소로 운송된다. 사체 공급원으로부터의 간세포의 상태(생존력 및 분화 상태)는 매우 다양하며 많은 세포 제제는 한계 품질이다. 고품질 인간 간세포의 이용 가능성은 조직 배양에서 유의하게 확장될 수 없다는 사실로 인해 더욱 제한된다(문헌[Runge et al. (2000) Biochem. Biophys. Res. Commun. 274:1-3; Cascio et al. (2001) Organs 25:529-538]). 플레이팅 후, 세포는 생존하지만 분열하지 않고 빠르게 대사 기능을 잃는다. 마우스와 같이 쉽게 이용 가능한 포유동물 종의 간세포는 대사 효소의 보체가 다르고 유도 연구에서 다르게 반응하기 때문에 약물 시험에 적합하지 않다. 불멸의 인간 간 세포(간종) 또는 태아 간모세포도 완전히 분화된 성체 세포에 대한 적절한 대체물이 아니다. 인간 간세포는 미생물학 분야의 연구에도 필요하다. 간염을 유발하는 바이러스와 같은 많은 인간 바이러스는 다른 세포 유형에서 복제할 수 없다.
현재, 동소 간 이식은 간 질환에 대해 이용 가능한 유일한 치료법으로 남아 있다. 그러나, 이 치료법은 고품질 간의 열악한 이용 가능성으로 인해 엄격하게 제한된다. 인간 간세포는 배양에서 유의하게 확장될 수 없다. 배양된 줄기 세포로부터 유래된 간세포는 미성숙하고 일반적으로 완전한 기능이 결여되어 있다. 따라서, 오늘날 사용되는 모든 간세포는 사체 또는 수술표본과 같은 인간 기증자로부터 유래되어 간세포 이용 가능성을 크게 제한한다. 최근, FAH, RAG-1 또는 RAG-2, 및 IL-2Rγ(Fah-/-, Rag1-/- 또는 Rag2-/-, Il2rg-/- [FRG])가 결핍된, 유전성 티로신혈증 유형 1 동물 모델을 포함하여 간세포 확장을 위한 동물(생체내 생물 반응기로서의 동물)의 사용이 설명되었다. 예를 들어, 미국 특허 제8,569,573호(마우스); 미국 특허 제9,000,257호(돼지) 및 미국 특허출원공개 제20160249591호(래트) 참조. 그러나, 현재 이러한 동물 생물반응기에 이식된 간세포의 최대 약 15%만 이식 후 생존하고 생착(숙주 간에서 재증식)할 수 있다. 또한, 이러한 Fah 결핍 동물은 푸마릴아세토아세테이트의 축적을 방지하기 위해 티로신 이화작용 경로를 차단하기 위해 NTBC(2-니트로-4-트리플루오로-메틸-벤조일)-1,3-시클로헥산디온(니티시논이라고도 함)을 사용한 치료를 필요로 한다. 잘 특성화된 기능적 간세포의 낮은 수율로 인해 현재까지 생물반응기 확장된 인간 간세포를 사용한 인간 이식은 보고되지 않았다.
생체내 생물반응기에 이식된 인간 간세포의 향상된 재증식, 생착, 생존 및/또는 확장을 위한 방법 및 조성물이 본원에 개시되어 있다. 또한 인간 대상체에서 간 질환의 치료 및/또는 예방에서의 용도를 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 용도를 위한 이들 확장된 간세포의 단리된 집단이 본원에 기재되어 있다.
한 양태에서, 간세포 생성 방법으로서, 간세포 생성 세포가 동물에서 확장되도록 살아있는 동물에게 간세포를 생성하는 생체외 조작된 세포(예를 들어, 줄기 세포, 간세포 전구 세포, 간세포 유사 세포, 성숙 또는 유약 간세포 등)를 투여하고 동물로부터 확장된 간세포를 단리하는 것을 포함하는 방법이 본원에 기재되어 있다. 특정 실시형태에서, 생체외 조작은 단리된 간세포 생성 세포(예를 들어, 인간 간세포)를 간세포의 건강, 성장, 재생, 생존 및/또는 생착을 촉진하는 하나 이상의 제제로 처리(배양)하고, 처리된 세포를 임의의 적합한 동물 생물반응기(예를 들어, FAH 결핍 동물, 예컨대 돼지 또는 설치류를 포함하나 이에 제한되지 않는 유전적으로 변형된 동물)에 이식(예를 들어, 비장 또는 간으로의 주사를 통해)하는 것을 포함한다. 특정 실시형태에서, 세포가 처리되는 하나 이상의 제제는 항체, 예를 들어 하나 이상의 c-MET(티로신-단백질 키나제 Met 또는 간세포 성장 인자 수용체로도 지칭됨) 및/또는 표피 성장 인자(EGFR) 항체를 포함하며, 이는 인간 세포에 특이적일 수 있거나 둘 이상의 종과 교차 반응성일 수 있다. 특정 실시형태에서, 10% 초과, 15% 초과, 40% 이상, 50% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 및 90% 이상의 재증식 비율이 동물 생물반응기에서 달성된다. 특정 실시형태에서, 이식된 세포로부터 유래된 간 세포 대 내인성 간 세포의 비는, 예를 들어, 1:1 이상, 2:1 이상, 3:1 이상, 4:1 이상, 5:1 이상, 6:1 이상, 7:1 이상, 8:1 이상, 9:1 이상, 10:1 이상 등을 포함하나 이에 제한되지 않는, 1:1, 2:1, 3:1 이상이다. 특정 실시형태에서, 처리된 세포를 동물 생물반응기에 이식한 후 수득된 재증식된 세포는 처리되지 않은 세포의 이식으로부터 유래된 세포보다 더 건강하다(임의의 적합한 정성적 또는 정량적 분석에 의해 측정 시). 특정 실시형태에서, 재증식은 수주(예를 들어, 2 내지 16, 2 내지 14, 또는 2 내지 12주 또는 그 사이의 임의의 시간), 수개월(1 내지 12개월 또는 그 사이의 임의의 시간) 또는 수년(1 내지 5년 이상) 내에 달성된다. 특정 실시형태에서, 재증식율은 간세포 생성 세포가 간세포의 성장, 재생, 생존 및/또는 생착을 촉진하는 적어도 하나의 제제(예를 들어, 하나 이상의 c-MET 및/또는 EGFR 항체)로 이식 전에(및/또는 후에) 처리되지 않은 것에서 비율이 달성되기 몇 주(예를 들어, 2 내지 16주, 2 내지 14주, 또는 2 내지 12주 또는 그 사이의 임의의 시간) 전에 달성된다.
생체외 조작의 임의의 방법에서, 간세포 생성 세포(예를 들어, 줄기 세포, 간세포 전구 세포, 간세포 유사 세포, 성숙 또는 유약 간세포)는 상업적 공급원으로부터 수득되거나 살아있는 대상체 또는 사체로부터 단리될 수 있다. 또한, 간세포 생성 세포는 임의의 배지에서 배양될 수 있으며, 일부 실시형태에서, 배양 배지는 HBM 간세포 기본 배지 및 HCM Single™ Quots™ 키트(Lonza)의 1:1 혼합 완성물, 5% FBS 및 10 uM ROCK 억제제를 포함한다.
특정 양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 간세포 생성 세포의 생체외 조작은 배양된 간세포에 간세포의 성장, 재생, 생존 및/또는 생착을 촉진하는 하나 이상의 제제(예를 들어, 하나 이상의 c-MET 항체)를 첨가하고 간세포와 제제의 혼합물을 예를 들어 1분 내지 2일(그 사이의 임의의 시간), 1 내지 24시간(그 사이의 임의의 시간), 1 내지 4시간(그 사이의 임의의 시간) 등을 포함하는 일정 기간 동안 배양하는 것을 포함한다. 특정 실시형태에서, 세포(예를 들어, 간세포) 및 제제(예를 들어, c-MET 및/또는 EGFR 항체)는 1시간 동안 배양되고, 선택적으로 배양 중 락킹(rocking)하며, 이는 제제에 대한 간세포의 노출을 최대화하는 데 도움이 될 수 있다.
본원에 기재된 임의의 방법에서, 생체외 조작된 간세포 생성 세포를 수집하고 확장을 위해 적합한 동물 생물반응기에 투여한다. 특정 실시형태에서, 동물 생물반응기는 유전적으로 변형된 동물, 예를 들어, 하나 이상의 유전자 표적이 녹아웃(knocked out) 및/또는 녹다운(knocked-down)되는 것을 포함하여, 예를 들어 하나 이상의 유전자 표적이 재조합적으로 변형된 동물을 포함한다. 특정 실시형태에서, 다중 유전자는 동물 생물반응기에서 변형(예를 들어, 녹다운 및/또는 활성화)된다. 특정 실시형태에서, 동물 생물반응기는 푸마릴아세토아세테이트 가수분해효소(FAH)의 생성 또는 기능의 결핍을 부여하는 유전적 변형을 포함한다. 이러한 동물은 fah 결핍 동물(예를 들어, 래트, 마우스 또는 돼지와 같은 FRG 동물을 포함하나 이에 제한되지 않음)으로 지칭될 수 있다. FAH 결핍은 fah 유전자위의 유전적 변형을 반드시 필요로 하지는 않는다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 동물 생물반응기는 fah 유전자 발현을 조작하는 유전자가 변형된 유전적으로 조작된 동물을 포함하며 변형된 유전자는 fah 유전자, 예를 들어 fah 발현을 변형하는 fah의 상류 유전자가 아니다. 간세포 생성 세포는 임의의 적합한 수단을 사용하여, 선택적으로 비장내 주사, 간문맥내 정맥 주사 또는 동물 생물반응기의 간에 직접 주사를 통해 생물반응기에 도입(이식, 주사, 삽입(implant) 등)될 수 있다. 특정 실시형태에서, 간세포 생성 세포는 FRG 돼지, 래트 또는 마우스에 이식된다. 일부 경우에, 처리된 세포를 포함하는 동물은 확장 기간 동안 NTBC 온/오프 사이클링될 수 있다. 하나 이상의 제제(예를 들어, 항체)로 처리된 이식된 간세포 생성 세포는 미처리 간세포(즉, 본원에 기재된 바와 같이 생체외 조작되지 않은 간세포)로 이식된 동물과 비교하여 생물반응기에서 증가된(예를 들어, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상) 생존 및/또는 생착 또는 이식을 받지 않은 동물에 비해 증가된 재증식률을 나타낼 수 있다. 증가된 생착 및 생존은 미처리 간세포의 이식과 비교하여 동물 생물반응기에서 주어진 재증식 백분율에 도달하기 위해 생착된 세포에 필요한 세포 주기/세포 분열의 수를 감소시킨다. 이론에 구속되지 않고, 더 적은 세포 주기/세포 분열을 겪은 일부 간세포는 더 건강하고, 더 안정적이고/거나 더 내구성이 있는 간세포, 예를 들어 유전적으로 더 안정하고/거나 내구성이 있는 자손일 수 있거나 이를 생성할 수 있다. 세포 건강, 안정성 및/또는 내구성의 다양한 측정은 이러한 증가된 안정성 및/또는 내구성(예를 들어, 더 긴 텔로미어 길이를 나타내는 확장된 간세포, 세포 증식 분석 등)을 정량적으로 또는 정성적으로 나타내기 위해 사용될 수 있다.
특정 실시형태에서, 생체외 조작된 간세포 생성 세포는 14 내지 112일 또는 28 내지 112일(2 또는 4 내지 16주) 또는 그 사이의 임의의 시간, 선택적으로 14 내지 56일 또는 28 내지 56일(2 또는 4 내지 8주)의 기간 동안 동물 생물반응기에서 확장되고, 그 후에 수확(수집)된다. 특정 실시형태에서, 동물 생물반응기에서 생성된 간세포는 동물 생물반응기에 이식한 후 8주까지 수확되며, 간세포는 동물의 총 간세포 집단의 50% 초과, 60% 초과, 70% 초과, 또는 80% 내지 100%로 확장(재증식)되었다. 일부 경우에, 8주까지의 수확은 동물에게 극적으로 스트레스를 줄 수 있는 추가의 NTBC 사이클링과 긴 NTBC-오프 사이클(14일 또는 21일)에 대한 필요성을 제거한다. 이론에 얽매이지 않고, 일부 경우에 긴 NTBC-오프 사이클을 생략함으로써 동물 생물반응기의 건강, 결과적으로 생성된 간세포(예를 들어, 인간 간세포)의 건강, 수, 품질, 안정성 및/또는 내구성이 개선될 수 있다.
특정 실시형태에서, 1차 인간 간세포(primary human hepatocyte)는 동물(예를 들어, 래트, 마우스, 돼지, 토끼 등) 생물반응기에 투여(이식)되고 동물의 간의 적어도 40% 재증식이 선택적으로 투여 후 4 내지 16주까지 달성된다(예를 들어, NTBC 사이클링). FRG 동물 간으로부터 정제된 재증식된 인간 간세포는 시험관내에서 성숙한 간 기능과 FRG 동물(예를 들어, 마우스, 래트, 돼지, 토끼 등)에 이식한 후 생체내에서 효율적인 생착 및 확장을 포함하는 강력한 생체내 효능을 보여준다. 따라서, 본원에 기재된 FRG 동물 생물반응기는 환자에게 이식하기에 적합한 고품질 1차 인간 간세포를 생성하고, 이에 의해 간 질환이 있는 대상체에 치료 이점(및 간 이식에 대한 대안)을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본원에 기재된 임의의 방법은 동물 생물반응기로부터 수집된 확장된 간세포의 생체외 조작, 예를 들어 간세포의 성장, 재생, 생존 및/또는 생착을 촉진하는 하나 이상의 제제, 선택적으로 하나 이상의 c-MET 항체와 확장된 간세포의 배양(인큐베이팅)을 추가로 포함할 수 있다. 추가의 생체외 조작은 또한 공지된 기술을 사용하여 간세포에 하나 이상의 유전적 변형을 도입하는 것을 포함할 수 있다.
또 다른 양태에서, 본원에 기재된 임의의 방법은 예를 들어 동물 생물반응기로부터 수집되고 추가로 생체외 조작되는 간세포를 추가 확장을 위해 동일하거나 상이한 동물 생물반응기에 도입함으로써 연속 이식을 수행하기 위해 단계를 1회 또는 그 이상 반복하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 방법의 단계는 1, 2, 3, 4회 또는 그 이상 반복될 수 있다.
또 다른 양태에서, 간 질환 또는 장애의 치료 및/또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 하나 이상의 간 질환 또는 장애를 치료 및/또는 예방하는 방법이 본원에 기재되어 있으며, 이 방법은 확장된 간세포(동물로부터 수집되고 추가의 생체외 조작이 있거나 없음)를 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함한다. 특정 실시형태에서, 총 간세포 질량의 대략 1% 내지 25%를 나타내는 1x107 내지 5x108 세포/kg은 만성 간 질환, 예컨대 간경변, 알콜성 간염, 간성 뇌병증, 급성-온-만성 간부전(ACLF: acute-on-chronic liver failure), 약물 또는 중독 유발 간부전 및/또는 하나 이상의 선천성 대사성 간 질환을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 인간 간 질환에 대한 임상에서의 이식을 위해 사용될 것이다.
또 다른 양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 생체외 조작된 간세포를 포함하는 동물 생물반응기가 본원에 기재된다. 특정 실시형태에서, 동물 생물반응기는 fah 결핍 동물(예를 들어, 래트, 마우스 또는 돼지)이다. 특정 실시형태에서, 간세포를 포함하는 동물 생물반응기는 NTBC로 처리(예를 들어, NTBC 사이클링)된다. NTBC-오프 사이클은 fah 결핍 동물에서 선택압을 제공하고 이식된 인간 간세포의 재증식(생착, 생존 및/또는 확장)을 촉진한다. 특정 실시형태에서, 50% 초과, 60% 초과, 70% 초과, 또는 80% 내지 100%의 인간 간세포 재증식율이 동물 생물반응기에서 생착, 생존 및/또는 확장하는 생체외 조작된 간세포에 의해 동물 생물반응기에서 달성된다. 특정 실시형태에서, 50 내지 70% 초과의 인간 간세포 재증식율이 8 내지 16주(또는 그 사이의 임의의 값)까지, 예를 들어 70%의 재증식율이 8 내지 12주(또는 그 사이의 임의의 값)까지 달성된다. 예를 들어, 도 3b 참조.
또 다른 양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 방법을 사용하여 생성된 간세포 집단이 본원에 기재된다. 특정 실시형태에서, 확장된 간세포의 집단은 본원에 기재된 바와 같이(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 제제로) 생체외 처리된 간세포가 투여된 동물 생물반응기로부터 단리된 간세포(예를 들어, 인간 간세포)를 포함한다. 본원에 기재된 바와 같은 확장된 간세포를 포함하는 단리된 집단은 대상체에서 간 질환의 생체외 치료에 사용될 수 있고/있거나 생체외 처리로서 사용 전에(예를 들어, 본원에 기재된 방법의 추가 라운드를 통해) 추가로 생체외 조작될 수 있다. 생물반응기 및/또는 간세포의 집단을 포함하는 대상체는 선택적으로 생물반응기 및/또는 대상체에서 세포의 생착 및/또는 확장을 추가로 향상시키기 위해 하나 이상의 제제(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 제제)로 추가 처리될 수 있다. 특정 실시형태에서, 생물반응기 및/또는 대상체에 본원에서 치료되는 바와 같은 간세포와 순차적으로(임의의 순서로) 및/또는 동시에 하나 이상의 c-MET 항체(작용제)가 선택적으로 투여된다.
또 다른 추가 양태에서, 인간 대상체에서 간세포를 확장시키는 방법으로서, 본원에 기재된 바와 같은 동물 생물반응기에서 생성된 인간 간세포를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법이 본원에 제공된다. 특정 실시형태에서, 간세포(본원에 기재된 바와 같은 간세포를 포함하는 조성물 포함)는 간문맥 주입을 통해 투여된다. 일부 경우에, 간세포는 제대 정맥 주입, 직접 비장 캡슐 주사, 비장 동맥 주입, 또는 복강내 주사를 통해 투여될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이 수득된 간세포는 대상체에 투여하기 전에 캡슐화되거나 캡슐화되지 않을 수 있다. 본원에 기재된 임의의 방법에서 본원에 기재된 간세포는 이식된 간세포의 최대 10% 내지 15%가 생체내 생착되는 다른 방법에 의해 생성된 간세포보다 더 효율적으로 대상체에서 생착, 생존 및/또는 확장된다. 특정 실시형태에서, 환자에 이식된 간세포의 5% 내지 50% 초과(또는 이들 사이의 임의의 값), 60% 초과, 70% 초과, 또는 80% 내지 100%가 시간이 지남에 따라 환자에서 생착, 생존 및/또는 확장된다. 일부 경우에, 본원에 기재된 간세포는 대상체에서 보다 효율적으로 생착, 생존 및/또는 확장하며, 예를 들어, 다른 방법보다 적어도 1.1배 또는 그 이상, 예를 들어, 적어도 1.2배, 적어도 1.3배, 적어도 1.4배, 적어도 1.5배, 적어도 1.6배, 적어도 1.7배, 적어도 1.8배, 적어도 1.9배, 적어도 2배, 또는 적어도 2.5배이다. 일부 경우에, 본원에 기재된 간세포는 대상체에서 다른 방법보다 더 효율적으로, 예를 들어, 적어도 10% 더 효율적으로, 예를 들어, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100%, 또는 적어도 150% 더 효율적으로 생착, 생존 및/또는 확장한다. 본원에 기재된 임의의 방법에서, 임의의 기간(2 내지 16주, 2 내지 14주, 2 내지 12주, 1 내지 12개월 또는 그 이상을 포함하나 이에 제한되지 않음)에 걸친 대상체에 대한 투여 후, 본원에 기재된 바와 같은 간세포는 대상체의 간에 있는 총 세포 수의 적어도 5%, 적어도 10% 또는 그 이상을 구성한다.
또 다른 양태에서, 간 질환의 치료 및/또는 예방을 필요로 하는 인간 대상체에서 간 질환을 치료 및/또는 예방하는 방법으로서, 기재된 바와 같은 확장된 인간 간세포의 집단을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법이 본원에 제공된다. 따라서, 본원에 기재된 방법은 건강한 간세포를 제공함으로써 임상에서 간세포 치료를 위해 그리고 단독 요법으로서 사용될 수 있으며, 이는 향상된 생착 및/또는 재증식 프로파일로 인해 신선한 또는 동결보존된 간세포를 사용하는 현재 방법보다 더 효율적인 질환 치료 및/또는 예방을 결과한다. 투여는 정맥내(예를 들어, 간문맥), 복강내, 망낭내, 하나 이상의 기관 또는 조직(예를 들어, 간, 비장, 림프절 등)으로의 이식 및/또는 삽입을 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 적합한 수단에 의해 수행될 수 있다.
대상체를 수반하는 본원에 기재된 임의의 방법에서, 방법은 대상체에서 간세포의 성장, 재생, 생존 및/또는 생착을 촉진하는 하나 이상의 제제(예를 들어, 항체, 소분자, 핵산(DNA 및/또는 RNA) 등)를 투여하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 하나 이상의 제제는 c-MET 항체, 선택적으로 인간 특이적인 것을 포함한다. 하나 이상의 제제는 1, 2회 또는 그 이상 투여될 수 있고 간세포와 함께 및/또는 다른 시간에 투여될 수 있다.
뿐만 아니라, 대상체에 확장된 간세포의 투여를 수반하는 임의의 생체외 방법은 예를 들어 임의의 시간 간격(들)에서 본원에 기재된 바와 같은 확장된 간세포의 반복 투여(2, 3, 4, 5, 6, 7회 또는 그 이상의 투여)를 포함하는 방법의 하나 이상의 단계를 반복하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
본원에 기재된 방법 및 조성물에 의해 치료될 수 있는 질환 및 장애는 크리글러-나자르 증후군 유형 1; 가족성 고콜레스테롤혈증; 인자 VII 결핍증; 인자 VIII 결핍증(혈우병 A); 페닐케톤뇨증(PKU); 글리코겐 축적 질환 유형 I; 영아 레프섬병; 진행성 가족성 간내 담즙정체 유형 2; 유전성 티로신혈증 유형 1; 및 다양한 요소 사이클 결함; 급성 약물 유발 간부전이 있는 청소년 및 성인 환자를 포함하는 급성 간부전; 바이러스 유발 급성 간부전; 특발성 급성 간부전; 버섯 중독 유발 급성 간부전; 수술 후 급성 간부전; 임신의 급성 지방간으로 인한 급성 간부전; 간경변을 포함하는 만성 간 질환; 알코올 소비, 약물 섭취 및/또는 B형 간염 플레어 업(flare up)과 같은 급성 사건 중 하나로 인한 급성-온-만성 간 질환을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 따라서, 본원에 기재된 방법 및 조성물을 사용하여 치료 및/또는 예방될 수 있는 간 질환은 이식된(조작된) 세포가 내인성 간세포가 손상/질환에 걸린 간에 이식 후 손상되지 않았거나 손상될 것으로 예상되지 않는 간 질환("내인성 간 질환"으로도 지칭됨)뿐만 아니라 이식된(조작된) 세포와 내인성 간세포가 둘 다 예를 들어 외인성 요인에 의해 손상/질환에 걸리거나 영향을 받을 수 있는 간 질환("외인성 간 질환"으로도 지칭됨)을 포함한다.
하기를 포함하는 간세포 생성 방법이 본원에 기재된다: 간세포 생성 세포를 성장, 재생, 생존 및/또는 생착을 촉진하는 하나 이상의 제제(예를 들어, c-MET 및/또는 EGFR, 선택적으로 소분자 또는 항체와 같은 성장 인자 수용체에 특이적으로 결합하는 작용제)와 생체외에서 접촉시켜 간세포 생성 세포(예를 들어, 1차 인간 간세포)를 조작하는 것; 생체외 조작된 세포를 생착에 적합한 조건 하에 생체내 생물반응기로 이식하는 것; 및 생착된 세포를 생물반응기에서 확장된 간세포 집단으로 확장하기에 적합한 조건 하에 생체내 생물반응기를 유지하고, 선택적으로 생체외 조작이 결여된 상응하는 방법에 비해 확장된 세포의 생착 및/또는 재증식 효율을 적어도 10% 증가시키는 것. 특정 실시형태에서, 간세포 생성 세포 및 하나 이상의 제제는 용기 내에 함유되고 배양은 용기를 진탕(agitation)하는 것을 포함하고, 선택적으로 진탕은 락킹을 포함한다. 본원에 기재된 임의의 방법은 예를 들어 선택적으로 원심분리 및/또는 흡인을 통해 하나 이상의 제제를 제거하고/하거나 생체외 조작된 세포를 단리함으로써, 이식 전에, 생체외 조작된 세포로부터 하나 이상의 제제를 분리하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 본원에 기재된 임의의 방법은 확장된 간세포를(예를 들어, 생물반응기로부터) 단리하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 본원에 기재된 임의의 방법에서, 생착된 세포는 약 2 내지 16주의 기간 동안 확장된다. 본원에 기재된 임의의 방법에서, 확장된 간세포는 생체내 생물반응기의 총 간세포 집단의 적어도 50%를 구성한다. 생체내 생물반응기는 포유동물일 수 있고 선택적으로 내인성 간 손상을 가질 수 있고/있거나 면역억제될 수 있고, 선택적으로, FAH 결핍, IL-2Rγ 결핍, RAG1 결핍, RAG2 결핍을 포함하는 마우스, 래트 또는 돼지 생물반응기, 또는 이들의 임의의 조합(예를 들어, FAH, RAG1 및/또는 RAG2, 및 IL-2Rγ 결핍(FRG)을 포함하는 설치류 또는 돼지)일 수 있다.
또 다른 양태에서, 간 질환에 대하여 대상체를 치료하는 방법으로서, 하기를 포함하는 방법이 본원에 기재된다: 간세포를 생성하는 생체외 조작된 세포를 생체내 생착 및 확장에 효과적인 양으로 대상체에게 투여하여 대상체에서 간 질환을 치료하는 것. 생체외 조작된 세포는 본원에 기재된 임의의 방법 또는 시스템에 의해, 예를 들어 간세포 생성 세포를 성장, 재생, 생존 및/또는 생착을 촉진하는 하나 이상의 제제와 배양하고 대상체에 투여하기 전에 생체내 생물반응기에서 생체외 조작된 세포를 확장함으로써 생성된다. 치료될 수 있는 간 질환(들)은, 간경변; 급성-온-만성 간부전(ACLF); 약물 또는 중독 유발 간부전; 선천성 대사성 간 질환; 크리글러-나자르 증후군 유형 1; 가족성 고콜레스테롤혈증; 인자 VII 결핍증; 인자 VIII 결핍증(혈우병 A); 페닐케톤뇨증(PKU); 글리코겐 축적 질환 유형 I; 영아 레프섬병; 진행성 가족성 간내 담즙정체 유형 2; 유전성 티로신혈증 유형 1; 요소 사이클 결함; 급성 간부전; 급성 약물 유발 간부전; 바이러스 유발 급성 간부전; 특발성 급성 간부전; 버섯 중독 유발 급성 간부전; 수술 후 급성 간부전; 임신의 급성 지방간으로 인한 급성 간부전; 알코올성 간염, 간성 뇌병증, 간경변증을 포함하는 만성 간 질환; 및/또는 알콜 소비, 약물 섭취 및/또는 B형 간염 플레어 업 유발 급성-온-만성 간 질환을 포함하나 이에 제한되지 않는, 유전성 장애, 간부전, 효소 결핍으로 인한 간 질환을 포함하지만 반드시 이에 제한되지는 않는다. 본원에 기재된 임의의 방법은 선택적으로 본원에 기재된 바와 같이 생체외 조작되지 않은 세포가 선택적으로 투여된 생체외 조작된 세포가 투여되지 않은 비교 대상체의 생존과 비교하여 대상체의 연장된 생존을 결과할 수 있다.
유전성 장애, 간부전, 효소 결핍으로 인한 간 질환, 예컨대: 간경변; 급성-온-만성 간부전(ACLF); 약물 또는 중독 유발 간부전; 선천성 대사성 간 질환; 크리글러-나자르 증후군 유형 1; 가족성 고콜레스테롤혈증; 인자 VII 결핍증; 인자 VIII 결핍증(혈우병 A); 페닐케톤뇨증(PKU); 글리코겐 축적 질환 유형 I; 영아 레프섬병; 진행성 가족성 간내 담즙정체 유형 2; 유전성 티로신혈증 유형 1; 요소 사이클 결함; 급성 간부전; 급성 약물 유발 간부전; 바이러스 유발 급성 간부전; 특발성 급성 간부전; 버섯 중독 유발 급성 간부전; 수술 후 급성 간부전; 임신의 급성 지방간으로 인한 급성 간부전; 알코올성 간염, 간성 뇌병증, 간경변증을 포함하는 만성 간 질환; 및/또는 알콜 소비, 약물 섭취 및/또는 B형 간염 플레어 업 유발 급성-온-만성 간 질환을 포함하나 이에 제한되지 않는 하나 이상의 간 질환의 치료를 위한 약제의 제조를 포함하여 간 질환의 치료를 위한 본원에 기재된 바와 같은 임의의 방법에 의해 생성된 세포(및 이들 세포를 함유하는 조성물)를 포함하는 본원에 기재된 바와 같은 세포(예를 들어, 세포의 집단 및 이들 세포를 포함하는 조성물)의 용도가 또한 제공된다.
또 다른 양태에서, 간세포 생성 세포(예를 들어, 인간 간세포) 및/또는 간세포의 성장, 재생, 생존 및/또는 생착을 촉진하는 적어도 하나의 제제를 포함하고, 선택적으로 본 개시내용의 방법을 수행하고 본원에 기재된 조성물을 생성하기 위한 지침을 포함하는 키트가 본원에 제공된다. 특정 실시형태에서, 간세포는 본원에 기재된 바와 같은 확장된 간세포이다.
이들 및 다른 양태는 전체 개시내용에 비추어 당업자에게 용이하게 명백할 것이다.
도 1은 HGF/c-MET 신호전달 경로를 도시하는 문헌[Lee, et al. (2015) Immunotargets Ther. 4:35-44]로부터 개작된 개략도이다. 도면에서 사용된 약어는 다음과 같다: "AKT"는 Ak 균주 형질전환을 지칭하고; 단백질 키나제 B; "c-MET"는 간엽 상피 전이 인자를 지칭하고; 간세포 성장 인자 수용체; "GRB2"는 성장 인자 수용체-결합 단백질 2를 지칭하고; "GAB1"은 GRB2-연관 결합 단백질 1을 지칭하고; "HGF"는 간세포 성장 인자를 지칭하고; "mTOR"은 라파마이신의 포유동물 표적을 지칭하고; "MAPK"는 미토겐-활성화 단백질 키나제를 지칭하고; "PI3K"는 포스파티딜이노시톨-4,5-비스포스페이트 3-키나제를 지칭하고; "STAT3"은 전사 3의 신호 변환기 및 활성화제를 지칭한다.
도 2a 내지 도 2f는 FRG 마우스에서 증가된 수준의 생착 및 확장을 유도하는 c-MET 작용제 항체를 사용한 1차 인간 간세포(PHH)의 생체외 조작을 도시한다. 도 2a는 c-MET 항체 조작이 있거나(개방 원) 없는(음영 원) 1차 인간 간세포 이식 1주 후 FRG 마우스 간에서 FAH 양성(FAH+) 인간 간세포의 백분율을 도시한다. 각 데이터 포인트는 단일 동물을 나타낸다. 도 2b는 이식 1주 후에 표시된 상태의 FRG 마우스 간의 FAH 면역조직화학 이미징의 예를 도시한다. FAH+ 인간 간세포의 더블릿(doublet)은 c-MET 항체 처리 간세포가 이식된 간에서 2주차에만 관찰되었다. 왼쪽 이미지는 C-MET 항체를 처리하지 않은 세포를 이식한 후 결과를 보여주고("무 Ab 대조군"), 오른쪽 이미지는 c-MET 항체를 처리한 세포를 이식한 후 결과를 보여준다("c-MET Ab"). 도 2c는 c-MET 항체로 처리된 세포(개방 원) 또는 처리하지 않은 세포(음영 원)의 이식 2주 후 FRG 마우스에서 FAH 양성 인간 간세포의 백분율(상단 그래프) 및 혈액에서 측정된 인간 알부민 수준(하단 그래프)을 도시한다. 각 데이터 포인트는 단일 동물을 나타낸다. 도 2d는 이식 2주 후에 표시된 조건의 FRG 마우스 간의 FAH 면역조직화학의 예를 도시한다. 도 2e는 이식 4주 후에 FRG 마우스에서 FAH 양성 인간 간세포의 백분율(상단 그래프) 및 혈액에서 측정된 인간 알부민 수준(하단 그래프)을 도시한다. 각 데이터 포인트는 단일 동물을 나타낸다(음영 원은 c-MET 항체로 처리되지 않은 세포를 받은 대조군 동물을 나타내고 개방 사각형은 c-MET 항체로 처리된 세포를 받은 동물을 나타냄). 도 2f는 이식 4주 후에 표시된 조건의 세포가 투여된 FRG 마우스 간의 FAH 면역조직화학의 예를 도시한다. 상단 이미지는 C-MET 항체로 처리되지 않은 세포의 이식 후 결과를 나타내고("무 Ab 대조군") 하단 이미지는 c-MET 항체로 처리된 세포 이식 후 결과를 나타낸다("c-MET Ab").
도 3은 FRG 마우스에서 증가된 수준의 재증식을 유도하는 c-MET 작용제 항체를 사용한 1차 인간 간세포의 생체외 조작을 도시한다. FRG 마우스에서 간세포 생성의 현재 방법은 이식 4주 후에 약 1% 미만의 간 재증식(예를 들어, 약 20-50 μg/mL 인간 알부민(hALB)) 및 약 8주 후에 약 1 내지 5%의 간 재증식(예를 들어, 200-500 μg/mL hALB)에 해당하는 이식 후 세포 생착 수준을 수반한다. FRG 마우스는 약 20 내지 95%의 간 재증식에 도달하는 것으로 관찰되었다(예를 들어, 2000 내지 5000+ μg/mL hALB); 그러나, 이 범위는 일반적으로 약 12+ 주 후 까지 수득되지 않는다. 도 3은 표시된 바와 같이 처리된 세포가 투여된 마우스로부터 취한 간 절편의 예시적인 FAH 면역조직화학을 통한 FRG 마우스 간에 이식 8주 후의 FAH+ 인간 간세포 재증식을 도시한다. 비교를 위해, 왼쪽 패널("no Ab 대조군")은 이식 전에 현재 방법을 사용하여 처리된 인간 간세포가 이식된 FRG 마우스 간을 도시한다(즉, 본원에 기재된 바와 같은 생체외 조작 없음). 중간 패널("c-MET Ab_1") 및 오른쪽("c-MET Ab_2") 패널은 본원에 기재된 바와 같이 이식 전에 생체외 조작된 인간 간세포가 이식된 FRG 마우스 간 결과를 도시한다. 구체적으로, 간세포를 지시된 바와 같이 2개의 상이한 c-MET 작용제 항체 중 하나로 처리하였다(즉, "Ab_1" 또는 "Ab_2"). 또한 각 패널 아래에는 마우스 간에서 재증식된 FAH+ 인간 간세포의 백분율(IHC에 의해 평가됨) 및 혈액에서 측정된 인간 알부민 수준(ELISA에 의함)이 표시된다. 도시된 바와 같이, 본원에 기재된 간세포의 생체외 조작은 본원에 기재된 생체외 조작을 받지 않은 간세포를 받은 동물에서 ~17% 미만의 재증식과 비교하여 이식된 간세포로 ~90%의 재증식을 결과하였다. 또한 인간 알부민 수준은 c-MET 항체로 처리되지 않은 간세포를 받은 대조군 동물과 비교하여 생체외 조작된 간세포를 받은 동물에서 유의하게 증가된 것으로 나타났다.
도 4는 EGFR 작용제 항체를 사용한 1차 인간 간세포의 생체외 조작이 FRG 마우스에서 증가된 수준의 생착 및 확장을 유도함을 나타내는 그래프를 도시한다. 본원에 기재된 바와 같은 EGFR 작용제 항체로 생체외 조작되었거나 조작되지 않은(도시되지 않음) 인간 간세포의 이식 4주 후(왼쪽 그래프) 및 8주 후(오른쪽 그래프) FRG 마우스의 혈액에서 인간 알부민 수준이 측정되었다. 각 그래프는 EGFR 항체로 처리되지 않은 세포 이식 후 결과("무 Ab 대조군") 및 EGFR 항체로 처리된 세포 이식 후 결과("EGFR Ab")를 도시한다. 각 데이터 포인트는 단일 동물을 나타낸다.
도 5는 c-MET 및 EGFR 작용제 항체 둘 다를 사용한 1차 인간 간세포의 생체외 조작이 FRG 마우스에서 증가된 수준의 생착 및 확장을 유도한다는 것을 나타내는 그래프를 도시한다. 항체로 처리되지 않은 인간 간세포가 이식된 FRG 마우스("무 Ab 대조군"로 표시된 음영 원)에서 FAH 양성 인간 간세포의 백분율(왼쪽 그래프) 및 혈액에서 측정된 인간 알부민 수준(오른쪽 그래프); c-MET 항체 단독으로 생체외 조작된 인간 간세포("c-MET Ab"로 표시된 개방 원); 또는 c-MET 및 EGFR 항체("c-MET+EGFR Ab"로 표시된 점선 테두리가 있는 개방 원)가 제공된다(이식 2주 후). 각 데이터 포인트는 단일 동물을 나타낸다. 그룹들 간 t-검정: * p<0.05; ** p<0.01.
도 6은 설치류(예를 들어, 마우스 또는 래트) 생물반응기에서 본원에 기재된 바와 같은 간세포의 예시적인 생체외 조작을 도시하는 개략도이다. 도시된 바와 같이, 인간 간세포는 설치류 생물반응기에 이식하기 전 및/또는 후에 생체외 조작될 수 있다. 생물반응기에서의 확장 후, 일부 경우에, 확장된 간세포는 예를 들어 성인 및/또는 소아 대상체를 포함하는 대상체에게 투여될 수 있다. 도시된 바와 같이, 간세포는 추가 확장을 위해 동물 생물반응기에 연속적으로 이식되거나 이식되지 않을 수 있다(추가 라운드의 생체외 조작이 있거나 없음). 또한, 예를 들어 간 질환과 같은 병태에 대하여 대상체를 치료하기 위해 이를 필요로 하는 대상체, 예컨대 도시된 바와 같은 인간 대상체에게 확장된 간세포를 투여하기 전에 수행될 수 있거나 수행되지 않을 수 있는 생체외 조작이 도시되어 있다.
동소 간 이식은 간 질환에 대한 유일한 치료법으로 남아 있다. 간세포 이식은 급성 및 만성 간 질환에 대한 잠재적인 대체 요법이다; 그러나, 고품질 간의 가용성이 낮고 간으로부터 수득된 낮은 수율로 인해 기능성 간세포를 수득하는 것은 어렵다.
다양한 목적을 위한 간세포 확장을 비롯한 생성 방법이 본원에 개시되어 있다. 일부 경우에서, 본 방법은 동소 간 이식에 적합한 인간 간세포를 포함하여 이를 필요로 하는 대상체로의 이식에 적합한 인간 간세포의 생성 및/또는 확장을 제공한다. 본원에 기재된 방법에 따라 생성된 인간 간세포를 비롯한 간세포는 주입 전에 정제, 동결보존 및/또는 광범위하게 특성화될 수 있다. 다른 용도 중에서, 본원에 기재된 방법에 따라 생성된 간세포는 하나 이상의 중증 간 질환이 있는 환자에게 주문형 요법을 제공할 수 있다.
또한, 본원에 기재된 방법에 따라 생성 및/또는 확장된 간세포를 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 조성물 및 방법은 하나 이상의 간 장애가 있는 환자에게 이식하기에 적합한 인간 간세포를 함유하고 생성한다. 일부 경우에, 본원에 기재된 바와 같이 대상체에 투여되는 조성물은 대상체 내에서 이러한 세포의 생착 및/또는 확장을 향상시키도록 생체외 조작된 간세포 생성 세포를 포함할 것이다. 일부 경우에, 본원에 기재된 바와 같이 대상체에게 투여되는 조성물은 생물반응기 내에서 이러한 세포의 생착 및/또는 확장을 향상시키기 위한 생체외 조작 후 생체내 생물반응기에서 확장된 간세포 집단을 포함할 것이다. 이와 같이, 생착 및/또는 확장을 향상시키기 위한 생체외 조작은 예를 들어 생물반응기에서 확장 전, 대상체로 이식하기 전, 생물반응기에서 확장 전 그리고 대상체로 이식하기 전 등을 포함하여 본원에 기재된 방법의 다양한 시점에서 이용될 수 있다.
일부 경우에, 본원에 기재된 방법은 생체내 생물반응기에서 외인성 간세포의 확장을 수반하며, 여기서 외인성 간세포는 40% 초과, 50% 또는 그 이상, 55% 또는 그 이상, 60% 또는 그 이상, 65% 또는 그 이상, 70% 또는 그 이상, 75% 또는 그 이상, 80% 또는 그 이상, 85% 또는 그 이상, 90% 또는 그 이상, 또는 95% 또는 그 이상의 재증식율을 달성하여 숙주 간을 재증식한다. 일부 경우에, 재증식된 간(예를 들어, FGR 설치류 간)은 80% 초과의 재증식된 간세포를 포함할 수 있으며(예를 들어, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상 포함), 반면 100% 재증식은 외인성 이식된 간세포 생성 세포로부터 완전히 유래된 간세포 집단을 갖는 간(즉, 숙주 유래 간세포가 없음)을 나타낸다. 또한, 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 현재 방법보다 더 신속하게 이러한 인간 간세포를 다량으로 생성하며, 예를 들어, 생착 후 8주에 20% 미만의 재증식율이 달성되는 현재 방법과 비교하여 8주까지 40%, 60%, 80% 또는 그 이상의 재증식율 달성을 포함한다. 따라서, 본 개시내용은 간 질환(들)이 있는 환자의 치료를 위한 잘 특성화되고 성숙한 기능적 인간 간세포의 공급원을 제공한다.
일 양태에서, 간세포의 생성, 특히 간세포 생성 세포를 동물 생물반응기로 이식한 후 인간 간세포의 확장을 위한 조성물 및 방법이 본원에 개시되어 있다.
본 개시내용은 다음을 포함하나 이에 제한되지 않는 현재 사용되는 프로토콜 및 조성물과 비교하여 유의하며 예상치 못한 이점을 제공한다: (1) 동물 생물반응기(예를 들어, FRG 동물)에서 간세포의 유의하게 향상된 생존, 생착 및/또는 재증식; (2) 최적의(70 내지 90%) 재증식을 달성하기 위해 동물에서 필요한 시간 감소(이에 의해 동물 시설 및/또는 동물에 투여되는 시약과 관련된 비용 절감); (3) 이식에 필요한 간세포 수 감소(간세포 수득과 관련된 비용 절감); (4) 동물 생물반응기에서 NTBC 사이클링의 필요성 감소(이에 의해 동물 생물반응기의 건강 및 수득된 간세포의 품질 개선); (5) 클론 확장 동안 세포 분열의 수를 감소시켜 생물반응기에서 확장된 간세포의 증식 가능성 유지; (6) 동물 생물반응기로부터 요구되는 세포 정제의 양 감소(예를 들어, 수확 시 생물반응기에 존재하는 원하는 세포의 백분율을 증가시킴으로써); (7) 동물 생물반응기로부터 정제된 간세포의 품질(예를 들어, 세포의 알부민 생성 수준, 정제된 세포의 세포 생존력 및/또는 플레이팅성(platability) 검정에 의해 결정) 증가 및/또는 (8) 간 재생을 촉진하기 위해 항체의 반복 투여로 환자를 직접 치료함으로써 간 질환에 대한 단독 항체 치료로서의 가능성을 제공; (9) 생물반응기 및 임상에서 인간 간세포 재증식을 추가로 개선하기 위해 제제의 생체외 조작 및 생체내 투여를 조합할 가능성을 제공; 및/또는 (10) 생체외 조작된 간세포 생성 세포를 받은 대상체에서 증가된 재증식을 특징으로 하는 간 질환에 대한 세포 치료를 개선하여 치료 결과를 향상시킴.
따라서, 생체외 조작으로서 본원에 기재된 방법 및 조성물은 동물(예를 들어, 설치류 또는 돼지) 생물반응기에서 인간 간세포 재증식을 개선할 수 있다. 또한, 생물반응기로부터의 단리 후, 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 간세포는 간 질환의 치료 및/또는 예방을 위해 인간 대상체에 투여될 때 증가된 기능성 및 재증식 효율을 나타내어 일치하는 개선을 제공한다.
일반 사항
본원에 개시된 조성물의 제조 및 사용뿐만 아니라 방법의 실행은 달리 지시되지 않는 한 분자 생물학, 생화학, 염색질 구조 및 분석, 컴퓨터 화학, 세포 배양, 재조합 DNA 및 관련 분야의 당해 분야의 기술 내에 있는 통상적인 기술을 사용한다. 이러한 기술은 문헌에 충분히 설명되어 있다. 예를 들어, 문헌[Sambrook et al. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 and Third edition, 2001]; 문헌[Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, 1987 and periodic updates]; 문헌[the series METHODS IN ENZYMOLOGY, Academic Press, San Diego]; 및 문헌[METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol. 119, "Chromatin Protocols" (P.B. Becker, ed.) Humana Press, Totowa, 1999] 참조.
정의
본원에 사용된 용어 "생물반응기, "동물 생물반응기" 및 "생체내 생물반응기"는 일반적으로 간세포 생성 세포와 같은 외인성 세포가 생착 및 확장을 위해 도입되어 도입된 세포로부터 생성된 확장된 간세포의 집단과 같은 세포 및/또는 그 자손의 확장된 집단을 생성하는 살아있는 비-인간 동물을 지칭한다. 외인성 세포, 예컨대 간세포 생성 세포를 생물반응기에 도입하는 것은 일반적으로 이종이식을 수반할 것이며, 따라서 이식된 외인성 세포는 일부 경우에 이종이식편, 예를 들어, 인간-대-설치류 이종이식편, 인간-대-마우스 이종이식편, 인간-대-래트 이종이식편, 인간-대-돼지 이종이식편, 마우스-대-래트 이종이식편, 래트-대-마우스 이종이식편, 설치류-대-돼지 이종이식편 등으로 지칭될 수 있다. 일부 경우에, 생물반응기로의 동종이식, 예를 들어 설치류-대-설치류, 돼지-대-돼지 등의 동종이식이 수행될 수 있다. 본원에서 보다 상세하게 논의되는 바와 같이, 생물반응기는 생착 및/또는 확장을 촉진하기 위해 도입된 외인성 간세포 생성 세포와 같은 도입된 외인성 세포에 선택적 이점을 부여하도록 예를 들어 유전적으로 및/또는 약리학적으로 구성될 수 있다. 생물반응기는 일부 경우에 예를 들어 본원에 더 상세히 기재된 바와 같은 유전적 및/또는 약리학적 면역 억제를 통한 것을 포함하나 이에 제한되지 않는 도입된 외인성 세포의 거부를 방지하도록 구성될 수 있다.
용어 "생체외"는 유기체로부터 수득된 샘플(예를 들어, 조직 또는 세포 등)에서 또는 이에 대해 수행된 처리, 실험 및/또는 측정을 지칭하기 위해 사용되며, 처리, 실험 및/또는 측정은 유기체 외부 환경에서 수행되는 것이다. 따라서, 세포에 적용되는 용어 "생체외 조작"은 세포 배양, 세포에 대한 하나 이상의 유전적 조작 및/또는 세포를 유기체(예를 들어, 동물 생물반응기 또는 인간 대상체)에 다시 배치할 때 성장, 재생, 생존 및/또는 생착을 촉진하는 하나 이상의 제제에 세포를 노출시키는 것을 포함하나 이에 제한되지 않는 유기체 외부의 세포(예를 들어, 간세포)의 임의의 처리를 지칭한다. 따라서, 생체외 조작은 예를 들어 이러한 세포가 동물 또는 이의 기관(예를 들어, 간)으로부터 수득된 후 및 이러한 세포가 동물, 예컨대 동물 생물반응기 또는 이를 필요로 하는 대상체에 이식되기 전 동물 외부에서 수행되는 세포의 치료를 지칭하기 위해 본원에서 사용될 수 있다. "생체외"와 대조적으로, 본원에 사용된 용어 "생체내"는 동물, 또는 이의 기관 내에 있는 세포, 예컨대 예를 들어 대상체 내의 세포의 생성 및/또는 대상체로의 세포의 이식으로 인해 대상체 또는 이의 간 내에 있는 세포(예를 들어, 간세포)를 지칭할 수 있다.
용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 중합체를 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용된다. 이 용어는 또한 하나 이상의 아미노산이 상응하는 자연 발생 아미노산의 화학적 유사체 또는 변형된 유도체인 아미노산 중합체에 적용된다.
용어 "항체"는 면역글로불린 유전자 또는 면역글로불린 유전자의 단편에 의해 실질적으로 코딩되는 하나 이상의 폴리펩티드를 포함하는 단백질(또는 단백질 복합체)을 지칭한다. 인식된 면역글로불린 유전자는 카파, 람다, 알파, 감마, 델타, 엡실론 및 뮤 불변 영역 유전자뿐만 아니라 수많은 면역글로불린 가변 영역 유전자를 포함한다. 경쇄는 카파 또는 람다로 분류된다. 중쇄는 감마, 뮤, 알파, 델타 또는 엡실론으로 분류되며, 이는 면역글로불린 부류 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE를 각각 정의한다.
기본 면역글로불린(항체) 구조 단위는 일반적으로 사량체이다. 각각의 사량체는 2개의 동일한 폴리펩티드 사슬 쌍으로 구성되며, 각 쌍은 하나의 "경쇄"(약 25 kDa) 및 하나의 "중쇄"(약 50 내지 70 kDa)를 갖는다. 각 사슬의 N-말단은 항원 인식을 주로 담당하는 약 100 내지 110개 또는 그 이상의 아미노산의 가변 영역을 정의한다. 용어 "가변 경쇄"(VL) 및 "가변 중쇄"(VH)는 각각 이들 경쇄 및 중쇄를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "항체"는 온전한 면역글로불린뿐만 아니라 다수의 잘 특성화된 단편을 포함한다. 예를 들어, 표적 단백질(또는 단백질 또는 융합 단백질 내의 에피토프)에 결합하는 Fab, Fv 및 단일쇄 Fv(scFv)는 또한 해당 단백질(또는 에피토프)에 대한 특이적 결합제일 것이다. 이들 항체 단편은 다음과 같이 정의된다: (1) Fab, 전체 항체를 효소 파파인으로 분해하여 온전한 경쇄 및 하나의 중쇄의 일부를 생성함으로써 생성된 항체 분자의 1가 항원 결합 단편을 함유하는 단편; (2) Fab', 전체 항체를 펩신으로 처리한 후 환원하여 온전한 경쇄 및 중쇄의 일부를 생성함으로써 수득된 항체 분자의 단편; 항체 분자당 2개의 Fab' 단편이 수득됨; (3) (Fab')2, 후속 환원 없이 전체 항체를 효소 펩신으로 처리하여 수득된 항체의 단편; (4) F(ab')2, 2개의 이황화 결합에 의해 함께 고정된 2개의 Fab' 단편의 이량체; (5) Fv, 2개의 사슬로 표현되는 경쇄의 가변 영역 및 중쇄의 가변 영역을 함유하는 유전적으로 조작된 단편; 및 (6) 단일 사슬 항체, 유전적으로 융합된 단일 사슬 분자로서 적합한 폴리펩티드 링커에 의해 연결된 중쇄의 가변 영역, 경쇄의 가변 영역을 함유하는 유전적으로 조작된 분자. 이러한 단편의 제조 방법은 일상적이다(예를 들어, 문헌[Harlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, CSHL, New York, 1999] 참조).
항체는 단일클론 또는 폴리클론일 수 있다. 단지 예로서, 단일클론 항체는 Kohler 및 Milstein(문헌[Nature 256:495-97, 1975])의 고전적 방법 또는 이의 유도 방법에 따라 뮤린 하이브리도마로부터 제조될 수 있다. 단일클론 항체 생성에 대한 자세한 절차는 문헌[Harlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, CSHL, New York, 1999]에 기재되어 있다. 항체는 또한 예를 들어 낙타과 중쇄 전용 항체, 나노바디 등과 같으나 이에 제한되지 않는 "중쇄 전용" 항체 또는 이의 유도체일 수 있다. 본원에 사용된 용어 "나노바디"는 예를 들어 VHH 및 불변 도메인(예를 들어, CH2 및 CH3)을 함유할 수 있는 자연 발생 중쇄 항체로부터 유래된 가장 작은 항원 결합 단편 또는 단일 가변 도메인(VHH)을 지칭한다. 나노바디는 경쇄 폴리펩타이드가 없는 면역글로불린이 발견되는 낙타과(예를 들어, 문헌[Hamers-Casterman et al., 1993; Desmyter et al., 1996] 참조)에서 볼 수 있는 중쇄 전용 항체로부터 유래될 수 있다. "낙타과"는 구세계 낙타과(쌍봉낙타(Camelus bactrianus) 및 단봉낙타(Camelus dromedarius))와 신세계 낙타과(예를 들어, 라마 파코스(Llama paccos), 라마 글라마(Llama glama), 라마 구아니코에(Llama guanicoe) 및 라마 비쿠냐(Llama vicugna))를 포함한다. 중쇄 항체는 또한 연골 어류 항체, 예컨대 IgNAR 항체 및 그의 단편, 예컨대 VNAR 단편으로부터 수득되거나 유래될 수 있다. 단일 도메인 항체(sdAb)는 나노바디 또는 VHH 항체로 지칭될 수 있고 이러한 항체는 예를 들어 중쇄 항체, 다중 사슬 항체(예를 들어, 마우스, 토끼 또는 인간 항체)의 조작, VH 도메인 라이브러리 스크리닝 등을 비롯한 다양한 수단을 통해 유도될 수 있다.
용어 "샘플" 및 "생물학적 샘플"은 대상체의 세포, 조직 또는 체액, 예컨대 말초 혈액, 혈청, 혈장, 뇌척수액, 골수, 소변, 타액, 조직 생검, 수술표본, 및 부검 물질로부터 수득된 물질을 지칭한다. 샘플은 또한 간 조직 샘플과 같으나 이에 제한되지 않는 조직 샘플을 지칭할 수 있다. 조직 샘플은 예를 들어 온전한 조직으로서, 조직 절편으로서, 균질화된 조직으로서, 조직으로부터 수득된 해리된 및/또는 정제된 세포 등을 포함하는 다양한 상태로 보관 및/또는 사용될 수 있으며, 이는 예를 들어, 외과적 절제, 절단, 균질화, 해리, 정제 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 기술에 따라 제조될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같이, 본원에 사용된 용어 "수집"은, 예를 들어 확장된 인간 간세포를 지칭하는 바와 같이, 단리된 인간 간세포 또는 다른 간세포 생성 세포가 주입되거나 이식된 동물(예를 들어, 마우스, 래트 또는 돼지 생물반응기)로부터 확장된 간세포를 제거하는 과정을 지칭한다. 일부 경우에, 세포, 예를 들어 생체외 조작된 세포의 이식을 받는 비-인간 동물은 또한 수용 동물로 지칭될 수 있다. 일부 경우에, 예를 들어 확장된 간세포의 이식을 받는 인간 대상체는 치료 대상체, 수용자 등으로 지칭될 수 있다. 수집은 선택적으로 비-간세포 유형(예를 들어, 혈액 세포, 간외 면역 세포, 혈관 세포 등), 비-간세포 간 세포(예를 들어, 간 성상 세포, 쿠퍼 세포, 및 간 시누소이드 내피 세포)를 포함하나 이에 제한되지 않는 다른 세포 유형으로부터 간세포를 분리하는 것을 포함한다.
본원에 사용된 "동결보존된"은 77K 또는 -196℃(액체 질소의 끓는점)와 같은 낮은 영하 온도로 냉각시킴으로써 보존되거나 유지된 세포(예컨대 간세포) 또는 조직을 지칭한다. [ADDED TRANSLATION TO OTHER SEGMENT] 이러한 낮은 온도에서 세포 사멸을 야기할 수 있는 생화학적 반응을 포함하는 임의의 생물학적 활동이 효과적으로 중단된다. 동결보존 및 동결보존된 세포 해동의 유용한 방법, 뿐만 아니라 이와 관련된 공정 및 시약은, 예를 들어 미국 특허 제10370638호; 제10159244호; 제9078430호; 제7604929호; 제6136525호; 및 제5795711호(이의 개시내용은 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함됨)에 기재된 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 대조적으로, 세포와 관련하여 본원에 사용된 용어 "신선한"은 동결보존되지 않은 세포를 지칭할 수 있고, 예를 들어 대상체 또는 그 기관에서 수집한 후 직접 수득 및/또는 사용(예를 들어, 이식, 배양 등)되었을 수 있다.
용어 "생존"은 동물에 이식된 후 계속 생존하는 세포를 지칭하는 데 사용되며, 일반적으로 동물에 세포를 투여(예를 들어, 주사)한 후 생착되는 세포를 포함한다. 세포 생존은 직접적인 평가(예를 들어, 관심 있는 세포를 함유하거나 함유할 것으로 예상되는 샘플에서 세포 생존력의 정성적 또는 정량적 측정) 및 간접적 평가(예를 들어, 동물 또는 인간 대상체에서 생존 세포의 존재에 대한 하나 이상의 기능적 결과에 대한 정성적 또는 정량적 측정)를 포함하는 다양한 방법을 사용하여 평가될 수 있다. 세포(예를 들어, 간세포) 생존의 유용한 직접 및 간접 판독은 세포 계수(예를 들어, 혈구계, 면역조직화학, 유세포 분석 등을 통해), 분비된 인자 또는 바이오마커의 측정(예를 들어, 단백질(예를 들어, 알부민) ELISA, 웨스턴 블롯 등을 통해), 수용자의 건강 평가(예를 들어, 바이탈 측정, 기능 시험(예를 들어, 간 기능 시험) 등에 의해) 등을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 용어 "생존"은 또한 대상체, 예를 들어 간 질환이 있는 대상체 또는 그의 동물 모델이 일부 치료, 개입 및/또는 도전, 예컨대 예를 들어, 대상체에 대한 세포(예를 들어, 간세포)의 투여 또는 이식, 대상체에 대한 질환(예를 들어, 간 질환) 유발 제제의 투여, 질환의 발병을 억제, 지연, 방지 또는 예방하는 제제의 중단 후에 계속 생존하는 기간을 지칭하기 위해 본원에서 사용된다. 대상체를 지칭하는 생존은 또한 일부 치료, 개입 및/또는 도전 후 주어진 기간 동안 생존하는 집단(예를 들어, 대조군 또는 치료 그룹)의 부분(예를 들어, 백분율)으로 표현될 수 있다. 생물의학 분야의 숙련자는 생존이 세포 또는 대상체에 속하는지를 쉽게 식별할 것이다.
용어 "생착"은 동물에 세포 또는 조직을 삽입하는 것을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, 수용 동물에서 인간 간세포의 생착은 투여(예를 들어, 주사) 후 수용 동물에서 인간 간세포가 삽입되는(예를 들어, 간에) 과정을 지칭한다. 특정 조건 하에서 생착된 인간 간세포는 수용 동물에서 확장될 수 있다. 본원에 사용된 용어 인간 간세포 "확장"은 인간 간세포의 수가 증가하도록 세포 분열이 일어나도록 하는 과정을 지칭한다. 용어 "생체내 확장"은 외인성 세포의 세포 분열이 살아있는 숙주(예를 들어, 비-인간 동물 생물반응기, 예컨대 설치류(예를 들어, 마우스 또는 래트) 생물반응기, 돼지 생물반응기, 래트 생물반응기 등) 내에서 일어나도록 하여 외인성 세포의 수가 살아있는 숙주 내에서 증가하도록 하는 과정을 의미한다. 예를 들어, 비-인간 동물 생물반응기에 이식된 인간 간세포는 생물반응기 내의 인간 간세포의 수가 증가하도록 생물반응기 내에서 생체내 확장을 겪을 수 있다.
용어 "재증식"은 일반적으로 동물(예를 들어, 생물반응기 및/또는 대상체)에 도입된 후 생착, 생존 및 확장하는 세포를 지칭한다. 따라서, 용어는 동물의 간에서 확장 및 증식하는 인간 간세포를 포함하여 동물에서 확장 및 증식하는 생착된 세포를 포함한다. 재증식 및 그 향상은 효율성 측면에서 설명될 수 있으며, 예를 들어, 재증식율이 향상된 세포는 생착, 세포 생존, 증식 또는 이들의 일부 조합의 개선 또는 개선들로 인해 결과될 수 있는 증가된 증식 효율을 갖는다고 말할 수 있는 경우를 포함한다. 재증식은 동물에 투여한 후 비율, 예를 들어 총 간 세포의 백분율 또는 이의 하위 집단(예를 들어, 총 간세포의 백분율) 및/또는 총 간 부피의 백분율로 지칭될 수 있다. 구체적으로 이식된 간세포와 관련하여, 재증식 수준은, 달리 명시되지 않는 한, 일반적으로 숙주 간 세포 또는 이의 하위집단(예를 들어, 숙주 간세포)에 대한 이식으로부터 유래된 숙주 간에 존재하는 간세포(즉, 생존하고 생착된 이식된 세포와 그 자손)의 비율을 의미할 것이다. 이 비율은 백분율로 표시될 수 있으며, 예를 들어, 여기서 50% 재증식은 절반은 이식 유래 및 절반은 숙주 유래 세포로 구성된 숙주 간을 나타내는 반면 100% 재증식은 이식 유래 간세포만을 갖는 숙주 간을 나타낸다. 대안적으로, 이 비는 이식된 세포로부터 유래된 세포 대 내인성 세포로부터 유래된 세포의 비(예를 들어, 1:1, 2:1, 3:1 등)로 지칭될 수 있다. 재증식은 일반적으로 세포가 동물에서 생착 및 확장하기에 충분한 기간(2 내지 16주, 2 내지 14주, 또는 2 내지 12주(그 사이의 임의의 시간), 1 내지 12개월(그 사이의 임의의 시간), 또는 1년 또는 그 이상을 포함하나 이에 제한되지 않음) 후에 결정된다. 일부 경우에, 재증식은 이식 2 내지 6주, 6 내지 12주, 4 내지 8주, 6 내지 10주, 8 내지 12주, 10 내지 14주, 12 내지 16주, 14 내지 18주, 2 내지 4주, 2 내지 6주, 6 내지 8주, 8 내지 10주, 10 내지 12주, 12 내지 14주, 14 내지 16주, 16 내지 18주, 18 내지 20주, 1 내지 2주, 2 내지 3주, 3 내지 4주, 4 내지 5주, 5 내지 6주, 6 내지 7주, 7 내지 8주, 8 내지 9주, 9 내지 10주, 10 내지 11주, 11 내지 12주, 12 내지 13주, 13 내지 14주, 14 내지 15주, 15 내지 16주, 17 내지 18주, 18 내지 19주, 19 내지 20주, 약 1주, 약 2주, 약 3주, 약 4주, 약 5주, 약 6주, 약 7주, 약 8주, 약 9주, 약 10주, 약 11주, 약 12주, 약 13주, 약 14주, 약 15주, 약 16주, 약 17주, 약 18주, 약 19주, 또는 약 20주 후에 측정된다. 일부 경우에, 예를 들어 제1 그룹(예를 들어, 생체외 조작된 세포를 받는 그룹)에서의 재증식을 제2 그룹(예를 들어, 생체외 조작되지 않은 세포를 받는 그룹)과 비교하는 경우, 재증식은 특정 시점까지 특정 수준(예를 들어, 이식 후 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 9주, 10주, 11주, 12주, 13주, 14주, 15주, 16주, 17주, 18주, 19주, 또는 20주 또는 그 이상까지 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 또는 적어도 90% 또는 그 이상)에 도달한 것으로 표현될 수 있다.
직접 및 간접 평가를 비롯한 다양한 방법을 사용하여 재증식이 평가될 수 있다. 유용한 직접 평가에는 예를 들어 이러한 세포를 함유하거나 함유할 것으로 예상되는 샘플에서 외인성 유래 세포의 존재에 대한 정성적 또는 정량적 측정이 포함될 수 있다. 일부 경우에, 세포, 특히 간세포와 관련하여 본원에 사용된 용어 "외인성 유래"는 집합적으로 숙주 유기체에 이식된 세포 및 이러한 이식된 세포의 임의의 자손을 지칭한다. 따라서, 외인성 유래 세포는 숙주에 이식된 초기 간세포 생성 세포뿐만 아니라 이러한 세포의 확장 동안 생성된 임의의 간세포를 지칭할 수 있다. 외인성 유래 세포는 예를 들어 외인성 유래 세포에서 특이적으로 존재하거나 발현되는 유전자 또는 유전자 생성물(예컨대, 예를 들어, FAH 결핍(예를 들어, fah -/- ) 숙주에 이식된 세포에서 발현된 fah 유전자, FAH mRNA 또는 FAH 단백질)에 대한 염색 또는 표지를 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 방법에 의해 확인될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 재증식의 수준은 간 또는 이의 샘플에서 세포 또는 간세포의 총량(예를 들어, 반대 염색, 핵 및/또는 세포질 라벨링/계수 등에 의해 결정됨)에 대한 간 또는 이의 샘플에서 이식 유래 간세포의 양(예를 들어, 인간 FAH+ 면역조직화학(IHC)에 의해 결정됨)의 비를 계산함으로써 결정될 수 있다(선택적으로 백분율 또는 비로 표시됨).
재증식에 대한 유용한 간접 평가는, 세포 계수(예를 들어, 혈구계, IHC, 유세포 분석 등을 통해), 분비된 인자 또는 바이오마커 측정(예를 들어, 단백질(예를 들어, 알부민) ELISA, 웨스턴 블롯 등을 통해), 이식된 세포의 건강 평가(예를 들어, MTT와 같은 효소 분석, 이미징 방법 또는 세포 건강을 정량적으로 측정할 수 있는 실시간 플레이트 기반 분석과 같은 세포 증식 분석을 통해), 및/또는 동물 생물반응기 및/또는 수용자의 건강 평가(예를 들어, 바이탈 측정, 기능 시험(예를 들어, 간 기능 시험) 등) 등을 포함하나 이에 제한되지 않는, 예를 들어 동물 또는 인간 대상체에서 재증식 세포 유형의 존재의 하나 이상의 기능적 결과의 정성적 또는 정량적 측정을 포함할 수 있다.
재증식(예를 들어, 간세포 재증식)의 직접 및 간접 판독은, 예를 들어 세포 계수(예를 들어, 혈구계, IHC, 유세포 분석 등을 통해), 세포 염색(예를 들어, 핵 염료, 세포질 염료, 조직학적 염색 등을 포함하는 비색 또는 형광 염료 사용), 세포 표지(예를 들어, 검출 가능한 항체 등과 같은 검출 가능한 특이적 결합제의 사용을 통해), 하나 이상의 분비된 인자 또는 바이오마커 측정(예를 들어, 단백질(예를 들어, 알부민) ELISA, 웨스턴 블롯 등을 통해), 핵산 검출 및/또는 정량화(예를 들어, DNA 또는 RNA, 예를 들어 계내(in situ) 혼성화, qPCR, 시퀀싱 등을 통해), 수용자의 건강 평가(예를 들어, 바이탈 측정, 기능 시험(예를 들어, 간 기능 시험) 등), 생존 분석 등을 포함하나 이에 제한되지 않는, 다양한 분석 또는 이들의 조합을 사용할 수 있다.
용어 "간세포"는 일반적으로 간의 세포질 질량의 70 내지 80%를 구성하는 세포 유형을 지칭한다. 간세포는 단백질 합성, 단백질 저장 및 탄수화물의 변형, 콜레스테롤, 담즙염 및 인지질의 합성, 및 외인성 및 내인성 물질의 해독, 변형 및 배설에 관여한다. 간세포는 또한 담즙의 형성과 분비를 개시한다. 간세포는 혈청 알부민, 피브리노겐 및 응고 인자의 프로트롬빈 그룹을 제조하며 리포단백질, 세룰로플라스민, 트랜스페린, 보체 및 당단백질 합성의 주요 부위이다. 또한, 간세포는 약물 및 살충제와 같은 외인성 화합물 및 스테로이드와 같은 내인성 화합물을 대사, 해독 및 비활성화하는 능력을 갖는다.
용어 "대상체" 및 "대상체들"은 는 상호 교환적으로 사용되며 인간 대상체 및 비-인간 영장류와 같은 포유동물 뿐만 아니라 토끼, 개, 고양이, 래트, 마우스, 돼지 및 기타 동물과 같은 실험 동물을 지칭한다. 따라서, 본원에 사용된 용어 "대상체" 또는 "대상체들"은 본원에 기재된 세포가 투여될 수 있는 임의의 포유동물 대상체 또는 대상체를 의미한다. 본 개시내용의 대상체는 간 질환 또는 장애를 갖는 대상체를 포함하며, 이러한 질환 또는 장애를 갖는 성인 또는 청소년 인간 대상체를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "치료하는" 및 "치료"는 증상의 중증도 및/또는 빈도의 감소, 증상 및/또는 근본 원인의 제거, 증상 및/또는 그 근본 원인의 발생 예방, 및/또는 손상의 개선 또는 복구를 지칭한다. 임의의 간 장애 또는 질환은 본원에 기재된 조성물 및 방법을 사용하여 치료될 수 있다. 따라서, "치료하는" 및 "치료"는 다음을 포함한다:
(i) 특히, 포유동물이 병태에 걸리기 쉽지만 아직 가지고 있는 것으로 진단되지 않은 경우, 질환 또는 병태가 포유동물에서 발생하는 것을 예방하는 것;
(ii) 질환 또는 병태의 억제, 즉 발병 저지;
(iii) 질환 또는 병태의 완화, 즉 질환 또는 병태의 퇴행 유발; 및/또는
(iv) 질환 또는 병태로 인한 증상의 경감 또는 제거, 즉 근본적인 질환 또는 병태를 다루거나 다루지 않고 통증을 완화하는 것.
본원에 사용된 용어 "질환" 및 "병태"는 상호교환적으로 사용될 수 있거나 특정 질병 또는 병태가 알려진 원인 인자를 갖지 않을 수 있고(병인이 아직 밝혀지지 않았기 때문에) 따라서 이는 아직 질환으로 인식되지 않고 바람직하지 않은 병태 또는 증후군으로만 인식된다는 점에서 상이할 수 있으며, 여기서 다소 특정한 일련의 증상이 임상의에 의해 확인되었다.
"약학 조성물"은 생물학적 활성 화합물 및/또는 세포를 포유동물, 예를 들어 인간에게 전달하기 위한 본 개시내용의 화합물 및/또는 세포 및 당업계에서 일반적으로 허용되는 매질의 제형을 지칭한다. 이러한 매질은 모든 약학적으로 허용되는 담체, 이를 위한 희석제 또는 부형제를 포함한다.
"유효량" 또는 "에 유효한 양"은, 투여될 때(예를 들어, 포유동물, 예를 들어, 인간 또는 포유동물 세포, 예를 들어, 인간 세포에), 표시된 결과(예를 들어, 생착, 확장, 치료 등)에 영향을 미치기에 충분한 화합물 및/또는 세포의 양을 지칭한다. 예를 들어, "유효량", 예컨대 "치료적 유효량"은 포유동물, 예를 들어 인간에게 투여될 때 포유동물, 예를 들어 인간에서의 치료를 수행하기에 충분한 본 개시내용의 화합물 및/또는 세포의 양을 지칭한다. "치료적 유효량"을 구성하는 본 개시내용의 조성물의 양은 화합물 및/또는 세포, 병태 및 그의 중증도, 투여 방식, 및 치료될 포유동물의 연령에 따라 달라질 것이지만, 당업자는 자신의 지식과 본 개시내용을 고려하여 일상적으로 결정할 수 있다.
간세포 생성 세포의 생체외 조작
간세포를 생성할 수 있는 임의의 세포는 본원에 기재된 바와 같이 생체외 조작(성장, 재생, 생존 및/또는 생착을 촉진하는 하나 이상의 제제에 대한 노출)될 수 있다. 간세포 생성 세포의 예는 유도 만능 줄기 세포(iPSC), 간세포 유사 세포(HLC), 예를 들어 iPSC, 줄기 세포, 간세포 전구 세포, 및/또는 성숙 또는 유약 간세포로부터 생성된 것을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
특정 실시형태에서, 간세포 생성 세포는 예를 들어 인간 공여자로부터 임의의 공급원에 대한 표준 기법을 사용하여 단리된 간세포를 포함한다. 특정 실시형태에서, 간세포는 신선한 PHH 또는 동결보존된 PHH를 포함하는 스크리닝된 사체 공여자로부터 단리된 1차 인간 간세포(PHH)이다.
간세포 생성 세포는 동결된 경우 해동되고 임의의 적합한 용기 또는 배양 용기에 배치된다. 임의의 배양 배지가 사용될 수 있다. 특정 실시형태에서, 배양 배지는 간세포 기본 배지, FBS 및/또는 ROCK 억제제, 예를 들어 간세포 기본 배지 및 Lonza HCM™ Single Quots™의 1:1 혼합물, 5% FBS 및 10 μM Rho 키나제(ROCK) 억제제를 포함한다. 예를 들어, Liebovitz L-15, 최소 필수 배지(MEM), DMEM/F-12, RPMI 1640, Waymouth의 MB 752/1 윌리엄스 배지 E, H 1777, 간세포 해동 배지(HTM), 동결보존된 간세포 리커버리 배지(CHRM®), 인간 간세포 배양 배지(Millipore Sigma), 인간 간세포 플레이팅 배지(Millipore Sigma), 인간 간세포 해동 배지(Millipore Sigma), Lonza HCM™, Lonza HBM™, HepatoZYME-SFM(Thermo Fisher Scientific), Cellartis 파워 1차 HEP 배지(Cellartis) 등을 포함하지만 이들에 제한되지 않는 다양한 간세포 호환 배양 배지가 이용 가능하다. 다양한 배양 보충물 및/또는 기질이 예를 들어 Lonza Single Quots™ 보충물, HepExtend™ 보충물, 소 태아 혈청, ROCK 억제제, 덱사메타손, 인슐린, HEGF, 하이드로코르티손, L-글루타민, GlutaMAX™, 완충제(예를 들어, HEPES, 중탄산나트륨 완충제 등), 트랜스페린, 셀레늄 복합체, BSA, 리놀레산, 콜라겐, 콜라게나제, Geltrex™, 메틸셀룰로오스, 디메틸 설폭사이드, 히알루로니다제, 아스코르브산, 항생제 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 원하는 배지에 포함되거나 제외될 수 있다. 간세포 호환 배지는 일반 사용일 수 있거나 1차, 2차 또는 불멸화 간세포를 위해 특별히 제형화될 수 있으며 이러한 배지는 혈청 또는 성장 인자를 함유할 수 있거나 무-혈청, 무-성장 인자, 또는 최소/감소된 성장 인자로 구성될 수 있다.
신선하게 해동된 간세포 생성 세포(예를 들어, 인간 간세포)는 그 다음 간세포의 생존, 재생 및/또는 생착을 촉진하는 하나 이상의 제제의 존재 하에 부드러운 락킹에 의해 간단히 생체외 조작된다. 간세포 재생에 관여하는 모든 분자(들)가 표적이 될 수 있으며, 유용한 시약은 항체 및/또는 핵산(DNA 및/또는 mRNA와 같은 RNA) 및/또는 HGF/c-MET, EGF/EGFR, WNT, TGFβ, HIPPO, 텔로미어 신장 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 신호 전달 경로를 조절하는 소분자를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 뿐만 아니라, 간세포 재생에 관여하는 임의의 분자를 표적으로 하는 하나 이상의 항체 또는 소분자를 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 적합한 제제(들)가 본원에 기재된 바와 같은 간세포의 생체외 조작에 사용될 수 있으며, 예를 들어, HGF/c-MET 신호 전달 경로, EGF/EGFR 신호 전달 경로, WNT 신호 전달 경로, TGFβ 신호 전달 경로, HIPPO 신호 전달 경로, 텔로미어 신장 등의 하나 이상의 성분을 표적으로 하는 하나 이상의 항체 또는 소분자를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
특정 실시형태에서, 제제는 하나 이상의 항체, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같이 처리되지 않은 세포/동물과 비교하여 세포(예를 들어, 간세포)의 간세포 생존, 성장, 재생 및/또는 생착을 자극하는 작용제 항체를 포함한다. 일부 경우에, 수용체를 표적화함으로써 간세포 생존, 성장, 재생 및/또는 생착을 자극하는 작용제 항체 시약은 예를 들어 수용체의 천연 리간드와 비교하여 연장된 작용제 활성을 가질 수 있다. 일부 경우에, 작용제 항체 활성화는 예를 들어 간세포 또는 간세포 생성 세포가 예를 들어 생체내 생물반응기 또는 대상체 내로 이식된 후를 포함하는 간세포 또는 간세포 생성 세포가 작용제 항체를 함유하는 배지에서 분리된 후 상당한 기간 동안 지속될 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에, 작용제 항체의 투여로 인한 경로 활성화는, 예를 들어 항체-함유 배지의 제거 후 2시간 이상, 3시간 이상, 4시간 이상, 5시간 이상, 6시간 이상, 7시간 이상, 8시간 이상, 9시간 이상, 10시간 이상, 11시간 이상, 또는 12시간 이상, 또는 1일 이상을 포함하는, 항체-함유 배지의 제거 후 1시간 이상 동안 지속될 수 있다. 이에 비해, 간세포 또는 간세포 생성 세포와 수용체의 천연 리간드와의 접촉으로 인한 경로 활성화는 1시간 이하로만 지속된다. 따라서, 일부 경우에, 작용제 항체로 인한 경로 활성화는, 상응하는 리간드의 투여 및 제거 후 관찰되는 경로 활성화에 비해 예를 들어, 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 적어도 10배, 적어도 12배, 적어도 14배, 적어도 16배, 적어도 18배, 또는 적어도 20배 또는 그 이상 더 오래를 포함하나 이에 제한되지 않는, 수용체 리간드로 인한 경로 활성화에 비해 2배 또는 그 이상 더 오래 지속될 수 있다. 경로 활성화는 예를 들어 다운스트림/이펙터 유전자의 상향조절/발현, 하나 이상의 경로 성분의 번역 후 변형(예를 들어, 인산화), 다량체화(예를 들어, 이량체화), 하나 이상의 경로 성분의 전위 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 수단에 의해 검출 및/또는 측정될 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에, HGF/c-MET 경로 활성은 하나 이상의 HGF/c-MET 다운스트림 이펙터의 발현을 분석하거나 c-MET 활성화로 인한 번역 후 변형(예를 들어, GAB1의 티로신 인산화(pY GAB1))을 분석함으로써 검출 및/또는 측정될 수 있다. 일부 경우에, EGFR 경로 활성화는 하나 이상의 EGFR 다운스트림 이펙터의 발현을 분석하거나 EGFR 활성화로 인한 번역 후 변형(예를 들어, EGFR c-말단 꼬리에서의 티로신 인산화)을 분석함으로써 검출 및/또는 측정될 수 있다.
특정 양태에서, 하나 이상의 항체는 HGF/c-MET의 작용제(c-MET 항체)이다. 도 1에 도시된 바와 같이, HGF/c-MET 신호전달은 간세포 재생의 핵심 조절자이며 간세포에서 c-MET 신호전달의 활성화는 다운스트림에서 전-생존(pro-survival) 및 전-증식(pro-proliferation) 효과를 유도한다. HGF/c-MET 신호전달의 활성화는 리간드 결합 및 수용체의 이량체화를 포함한다. c-MET에 대한 2가 단일클론 항체는 이 신호전달을 활성화하고 작용제로 작용하는 것으로 나타났다(예를 들어, 문헌[Ohashi et al. (2000) Nat Med. 6(3):327-31]; 문헌[Yuan et al. (2019) Theranostics 9(7):2115-2128] 참조). 또한, 연구에서는 생체내 c-MET 항체의 반복적인 주사가 마우스에서 이식된 인간 간세포의 재증식을 개선할 수 있음을 보여주었지만(예를 들어, 문헌[Ohashi et al. (2000) Nat Med. 6(3):327-31; Yuan et al. (2019) Theranostics 9(7):2115-2128] 참조), 본원에 기재된 바와 같은 생체외 조작이 동물에 세포를 투여한 후 동물 생물반응기에서 간세포 재증식을 향상시킨다는 것은 놀랍고 예상치 못한 것이다. 게다가, 관찰된 재증식의 향상이 동물 생물반응기 자체에 c-MET 항체가 없는 경우에도 지속된다는 것은 또한 놀랍고 예상치 못한 것이다(즉, 관찰된 재증식의 향상은 동물 생물반응기에 작용제의 투여를 필요로 하지 않음). 뿐만 아니라, 본원에 기재된 바와 같은 생체외 조작된 간세포의 이식이 기재된 바와 같은 생체외 조작되지 않은 간세포의 이식과 비교하여 간 질환이 있는 대상체의 치료를 향상시킨다는 것은 또한 놀랍고 예상치 못한 것이다.
다른 실시형태에서, 작용제 항체는 EGFR을 표적으로 한다. EGFR은 EGF, TGFα 등을 포함하는 리간드에 대한 막관통 티로신 키나제 수용체이다. EGFR은 성인 간의 간세포에서 가장 많이 발현되며 간 기능 유지에 중요한 역할을 하며 간 복구 및 재생에 필수적이다. EGFR에 대한 2가 모노클로날 항체는 작용제로 기능할 수 있고 세포 생존 및 증식을 위한 다운스트림 신호전달을 활성화할 수 있다. EGFR 항체는 상업적으로 이용 가능하다.
다른 실시형태에서, 작용제 항체는 WNT/β-카테닌 신호전달을 표적으로 한다. WNT/β-카테닌 신호전달은 세포 증식, 분화, 이동 및 아포토시스를 조절함으로써 다수의 발달 과정 및 조직 재생에 관여한다. WNT/β-카테닌 신호전달은 WNT 리간드가 Frizzled 수용체의 세포외 도메인에 결합하고 리포단백질 수용체 관련 단백질(LRP)-5/6의 공동 수용체와 상호작용할 때 활성화된다. 수용체를 안정화시키는 Frizzled 또는 LRP-5/6에 대한 항체는 작용제 항체로 기능하고 신호 전달을 활성화할 수 있다.
항체의 조합이 사용될 수 있다. 상업적으로 입수 가능한 항체가 사용될 수 있다.
하나 이상의 상이한 유형의 제제(예를 들어, 항체)가 본원에 기재된 생체외 조작 방법에서 사용될 수 있다. 특정 실시형태에서, 동일한 표적에 대하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 상이한 항체(예를 들어, 상이한 c-MET 항체)가 사용된다. 다른 실시형태에서, 하나의 표적에 대한 하나 이상의 항체(예를 들어, c-MET)는 하나 이상의 추가 표적(예를 들어, EGFR)에 대한 하나 이상의 항체와 조합으로 사용된다.
하나 이상의 항체 및/또는 소분자(예를 들어, 작용제 항체, 소분자 작용제)는 한 종(예를 들어, 인간)에 대해 특이적일 수 있거나 대안적으로 다른 종(예를 들어, 마우스, 래트, 돼지 등)과 교차 반응할 수 있다. 일부 실시형태에서, 작용제 항체(예를 들어, c-MET 및/또는 EGFR 항체)는 인간 c-MET에 특이적이며 종간 교차 활성을 갖지 않는다(예를 들어, 마우스 c-MET 또는 EGFR과 교차 반응하지 않고, 래트 c-MET 또는 EGFR과 교차 반응하지 않고, 설치류 c-MET 또는 EGFR과 교차 반응하지 않고, 돼지 c-MET 또는 EGFR과 교차 반응하지 않고, 비-인간 포유동물 c-MET 또는 EGFR 등 및 이들의 조합과 교차 반응하지 않는다). 본원에 사용된 "인간 c-MET 특이적 작용제" 및 "인간 c-MET에 특이적인" 작용제는 비-인간(예를 들어, 설치류, 돼지 등) c-MET에 실질적으로 결합하지 않고/않거나 비-인간 HGF/c-MET 신호 전달을 실질적으로 활성화 또는 향상시키지 않으면서 인간 HGF/c-MET 신호 전달을 특이적으로 활성화 또는 향상시키고(예를 들어, c-MET 및/또는 GAB1의 인산화 또는 기타 경로 활성 판독으로 측정됨) 인간 c-MET에 특이적으로 결합하는 제제를 지칭한다. 본원에 사용된 "인간 EGFR 특이적 작용제" 및 "인간 EGFR에 특이적인" 작용제는 비-인간(예를 들어, 설치류, 돼지 등) c-MET에 실질적으로 결합하지 않고/않거나 비-인간 HGF/c-MET 신호 전달을 실질적으로 활성화 또는 향상시키지 않으면서 인간 EGF/EGFR 신호 전달을 특이적으로 활성화 또는 향상시키고(예를 들어, EGFR의 인산화 및/또는 다운스트림 이펙터 활성화 또는 경로 활성의 기타 판독에 의해 측정됨) 인간 EGFR에 특이적으로 결합하는 제제를 지칭한다.
하나 이상의 항체, 핵산 및/또는 소분자는 배양 배지에 첨가하는 것을 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 방식으로 간세포 생성 세포에 첨가될 수 있다. 또한, 항체, 핵산 및/또는 소분자의 임의의 농도가 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 항체는, 예를 들어 10 ng/mL 내지 1 mg/mL, 25 ng/mL 내지 1 mg/mL, 50 ng/mL 내지 1 mg/mL, 75 ng/mL 내지 1 mg/mL, 100 ng/mL 내지 1 mg/mL, 250 ng/mL 내지 1 mg/mL, 500 ng/mL 내지 1 mg/mL, 750 ng/mL 내지 1 mg/mL, 1 μg/mL 내지 1 mg/mL, 5 μg/mL 내지 1 mg/mL, 10 μg/mL 내지 1 mg/mL, 25 μg/mL 내지 1 mg/mL, 50 μg/mL 내지 1 mg/mL, 75 μg/mL 내지 1 mg/mL, 10 ng/mL 내지 750 μg/mL, 25 ng/mL 내지 750 μg/mL, 50 ng/mL 내지 750 μg/mL, 75 ng/mL 내지 750 μg/mL, 100 ng/mL 내지 750 μg/mL, 250 ng/mL 내지 750 μg/mL, 500 ng/mL 내지 750 μg/mL, 750 ng/mL 내지 750 μg/mL, 1 μg/mL 내지 750 μg/mL, 5 μg/mL 내지 750 μg/mL, 10 μg/mL 내지 750 μg/mL, 25 μg/mL 내지 750 μg/mL, 50 μg/mL 내지 750 μg/mL, 75 μg/mL 내지 750 μg/mL, 10 ng/mL 내지 500 μg/mL, 25 ng/mL 내지 500 μg/mL, 50 ng/mL 내지 500 μg/mL, 75 ng/mL 내지 500 μg/mL, 100 ng/mL 내지 500 μg/mL, 250 ng/mL 내지 500 μg/mL, 500 ng/mL 내지 500 μg/mL, 750 ng/mL 내지 500 μg/mL, 1 μg/mL 내지 500 μg/mL, 5 μg/mL 내지 500 μg/mL, 10 μg/mL 내지 500 μg/mL, 25 μg/mL 내지 500 μg/mL, 50 μg/mL 내지 500 μg/mL, 75 μg/mL 내지 500 μg/mL, 10 ng/mL 내지 250 μg/mL, 25 ng/mL 내지 250 μg/mL, 50 ng/mL 내지 250 μg/mL, 75 ng/mL 내지 250 μg/mL, 100 ng/mL 내지 250 μg/mL, 250 ng/mL 내지 250 μg/mL, 500 ng/mL 내지 250 μg/mL, 750 ng/mL 내지 250 μg/mL, 1 μg/mL 내지 250 μg/mL, 5 μg/mL 내지 250 μg/mL, 10 μg/mL 내지 250 μg/mL, 25 μg/mL 내지 250 μg/mL, 50 μg/mL 내지 250 μg/mL, 75 μg/mL 내지 250 μg/mL, 10 ng/mL 내지 100 μg/mL, 25 ng/mL 내지 100 μg/mL, 50 ng/mL 내지 100 μg/mL, 75 ng/mL 내지 100 μg/mL, 100 ng/mL 내지 100 μg/mL, 250 ng/mL 내지 100 μg/mL, 500 ng/mL 내지 100 μg/mL, 750 ng/mL 내지 100 μg/mL, 1 μg/mL 내지 100 μg/mL, 5 μg/mL 내지 100 μg/mL, 10 μg/mL 내지 100 μg/mL, 25 μg/mL 내지 100 μg/mL, 50 μg/mL 내지 100 μg/mL, 75 μg/mL 내지 100 μg/mL, 10 ng/mL 내지 75 μg/mL, 10 ng/mL 내지 50 μg/mL, 10 ng/mL 내지 25 μg/mL, 10 ng/mL 내지 10 μg/mL, 10 ng/mL 내지 5 μg/mL, 10 ng/mL 내지 1 μg/mL, 10 ng/mL 내지 750 ng/mL, 10 ng/mL 내지 500 ng/mL, 10 ng/mL 내지 250 ng/mL, 10 ng/mL 내지 100 ng/mL, 10 ng/mL 내지 75 ng/mL, 10 ng/mL 내지 50 ng/mL, 10 ng/mL 내지 25 ng/mL, 50 ng/mL 내지 50 μg/mL, 50 ng/mL 내지 10 μg/mL, 50 ng/mL 내지 5 μg/mL, 50 ng/mL 내지 1 μg/mL, 100 ng/mL 내지 50 μg/mL, 100 ng/mL 내지 10 μg/mL, 100 ng/mL 내지 5 μg/mL, 100 ng/mL 내지 1 μg/mL, 500 ng/mL 내지 50 μg/mL, 500 ng/mL 내지 10 μg/mL, 500 ng/mL 내지 5 μg/mL, 500 ng/mL 내지 1 μg/mL, 1 μg/mL 내지 50 μg/mL, 1 μg/mL 내지 40 μg/mL, 1 μg/mL 내지 30 μg/mL, 1 μg/mL 내지 20 μg/mL, 1 μg/mL 내지 10 μg/mL, 5 μg/mL 내지 50 μg/mL, 5 μg/mL 내지 40 μg/mL, 5 μg/mL 내지 30 μg/mL, 5 μg/mL 내지 20 μg/mL 등을 포함하나 이에 제한되지 않는, 10 ng/mL 이하 내지 1 mg/mL 이상 범위의 농도에서 사용된다.
특정 실시형태에서, 간세포(예를 들어, 신선하게 해동됨)는 하나 이상의 항체(예를 들어, c-MET 및/또는 EGFR 항체)와 배양되고, 이 항체/항체들은 임의의 유효 농도(들)이다. 특정 실시형태에서, 간세포 생성 세포(예를 들어, 신선하게 해동된 인간 간세포)는 하나 이상의 c-MET 항체와 배양되고, 이 항체/항체들은 예를 들어 10 μg/mL를 포함하여 본원에 개시된 개별 값 및 범위를 포함하는 약 10 ng/mL 이하 내지 1 mg/mL 이상, 또는 이들 사이의 임의의 값의 농도이다. 특정 실시형태에서, 간세포 생성 세포(예를 들어, 신선하게 해동된 인간 간세포)는 하나 이상의 EGFR 항체와 배양되고, 이 항체/항체들은 예를 들어 10 μg/mL를 포함하여 본원에 개시된 개별 값 및 범위를 포함하는 약 10 ng/mL 이하 내지 1 mg/mL 이상, 또는 이들 사이의 임의의 값의 농도이다. 다른 실시형태에서, 간세포 생성 세포(예를 들어, 신선하게 해동된 인간 간세포)는 하나 이상의 c-MET 및 하나 이상의 EGFR 항체와 배양되고, 이 항체/항체들은 본원에 기재된 농도를 포함하여 동일하거나 상이한 농도이고, 각각의 항체는 각 항체 유형에 대해 약 10 μg/mL의 농도이다.
본원에 기재된 바와 같은 생체외 조절에 사용되는 작용제 항체는 효능이 다양할 수 있고, 일부 경우에, 생체외 조절에 사용되는 항체의 농도는 그에 따라 조정될 수 있다. 본 발명의 방법에 사용되는 유용한 작용제 항체는, 예를 들어 0.001 μg/mL 내지 1 μg/mL, 0.001 μg/mL 내지 0.75 μg/mL, 0.001 μg/mL 내지 0.5 μg/mL, 0.001 μg/mL 내지 0.25 μg/mL, 0.001 μg/mL 내지 0.1 μg/mL, 0.001 μg/mL 내지 0.075 μg/mL, 0.001 μg/mL 내지 0.05 μg/mL, 0.001 μg/mL 내지 0.025 μg/mL, 0.005 μg/mL 내지 1 μg/mL, 0.005 μg/mL 내지 0.75 μg/mL, 0.005 μg/mL 내지 0.5 μg/mL, 0.005 μg/mL 내지 0.25 μg/mL, 0.005 μg/mL 내지 0.1 μg/mL, 0.005 μg/mL 내지 0.075 μg/mL, 0.005 μg/mL 내지 0.05 μg/mL, 0.005 μg/mL 내지 0.025 μg/mL, 0.01 μg/mL 내지 1 μg/mL, 0.01 μg/mL 내지 0.75 μg/mL, 0.01 μg/mL 내지 0.5 μg/mL, 0.01 μg/mL 내지 0.25 μg/mL, 0.01 μg/mL 내지 0.1 μg/mL, 0.01 μg/mL 내지 0.075 μg/mL, 0.01 μg/mL 내지 0.05 μg/mL, 또는 0.01 μg/mL 내지 0.025 μg/mL를 포함하나 이에 제한되지 않는, 예를 들어 0.001 μg/mL 이하 내지 1 μg/mL 이상 범위의 절반 최대 유효 농도(EC50)를 가질 수 있다. 대상체 작용제 항체의 EC50은 예를 들어 관련 항원(예를 들어, c-MET 및/또는 EGFR) 등을 발현하는 세포를 사용한 유세포 결합 분석에서의 적정을 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 편리한 수단에 의해 결정될 수 있다.
간세포 생성 세포 및 하나 이상의 항체/소분자는 임의의 적합한 조건 하에 임의의 기간(수분, 수시간 또는 수일 포함) 동안 함께 배양될 수 있다. 배양 시간 및 조건은 유용한 배양 시간이 일반적으로 표적 경로의 활성화에 충분한 경우 다양할 것이며, 여기서 예를 들어, 경로 활성화의 충분성은 경로 활성화의 다양한 판독값 중 임의의 것을 사용하여 평가될 수 있으며, 여기에는 예를 들어 본원에 기재된 임의의 이러한 분석이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 특정 실시형태에서, 배양물은 예를 들어 15분, 30분, 45분, 1시간, 2시간, 3시간, 15분 내지 4시간, 30분 내지 4시간, 45분 내지 4시간, 1 내지 4시간, 15분 내지 3시간, 30분 내지 3시간, 45분 내지 3시간, 1 내지 3시간, 15분 내지 2.5시간, 30분 내지 2.5시간, 45분 내지 2.5시간, 1 내지 2.5시간, 15분 내지 2시간, 30분 내지 2시간, 45분 내지 2시간, 1 내지 2시간 등을 포함하는 1 내지 180분 또는 240분 이상 동안 배양된다. 배양은 진탕 수단이 다양할 수 있는 배양 배양물의 진탕을 포함할 수 있다. 예를 들어, 간세포 생성 세포 및 하나 이상의 제제가 용기(예를 들어, 세포 배양 용기, 튜브, 바이알 등) 내에 포함될 수 있고 배양은 예를 들어 락킹, 쉐이킹, 회전, 장동(nutation) 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 용기의 다양한 진탕을 포함할 수 있다.
간세포 확장/재증식
본원에 기재된 간세포 생성 세포의 생체외 조작 후, 일부 경우에, 세포는 이어서 생체내 생물반응기에서 간세포의 확장을 위해 동물(예를 들어, 마우스, 래트, 돼지 등)에 투여된다.
본원에 기재된 간세포 확장에 적합한 동물 생물반응기는 당업계에 공지되어 있다. 특정 실시형태에서, 동물은 하나 이상의 유전자위에서 유전적으로 변형된다. 유전적 변형은 하나 이상의 유전자위 또는 하나 이상의 표적 유전자의 활성화가 결핍된 동물을 생성하기 위한 녹아웃 또는 녹다운을 포함할 수 있다. 유전적 변형은 여러 유전자위에서 임의의 조합으로 이루어질 수 있다(하나 이상의 억제 변형 및/또는 하나 이상의 활성화 변형). 생체내 생물반응기에서 유용한 유전적 변형은 면역 유전자(예를 들어, 면역결핍을 결과함), 간 기능 유전자(예를 들어, 간 기능 결핍을 결과함), 대사 유전자(예를 들어, 대사 결핍을 결과함), 아미노산 이화작용 유전자(예를 들어, 아미노산 이화작용 결핍을 결과함) 등을 비롯한 다양한 유전자의 변형을 포함할 수 있다.
특정 양태에서, 예를 들어 미국 특허 제8,569,573호; 미국 특허 제9,000,257호 및 미국 특허출원공개 제20160249591호(이의 개시내용은 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함됨)에 기재된 바와 같이, 유전적으로 변형된 동물은 푸마릴아세토아세테이트 가수분해효소(fah) 결핍 동물이다. FAH는 티로신 이화작용의 마지막 단계를 촉매하는 대사 효소이다. Fah 유전자의 동형접합 결실을 갖는 동물은 변경된 간 mRNA 발현 및 심각한 간 기능장애를 나타낸다. Fah 유전자의 점 돌연변이는 또한 간부전 및 출생 후 치사율을 유발하는 것으로 나타났다. Fah가 결핍된 인간은 간 질환 유전성 티로신혈증 유형 1(HT1)이 발병하고 간부전이 발병한다. Fah 결핍은 강력한 산화제인 푸마릴아세토아세테이트의 축적으로 이어지며 이는 궁극적으로 Fah가 결핍된 간세포의 세포 사멸로 이어진다. 따라서, Fah 결핍 동물은 기능적인 fah 유전자를 포함하는 인간을 비롯한 다른 종의 간세포로 재증식될 수 있다. GenBank 데이터베이스와 같은 다양한 종에 대한 Fah 게놈, mRNA 및 단백질 서열을 공개적으로 사용할 수 있다(예를 들어, Gene ID 29383(래트 Fah); Gene ID 14085(마우스 Fah); Gene ID 610140(개 FAH); Gene ID 415482(닭 FAH); Gene ID 100049804(말 FAH); Gene ID 712716(히말라야 원숭이 FAH); Gene ID 100408895(마모셋 FAH); Gene ID 100589446(긴팔 원숭이 FAH); Gene ID 467738(침팬지 FAH); 및 Gene ID 508721(소 FAH) 참조). 이러한 동물은 유전적으로 변형된 fah 유전자위를 포함할 수 있으며 예를 들어 이러한 동물(예를 들어, 마우스, 돼지 또는 래트)이 FAH, RAG-1 또는 RAG-2, 및 IL-2Rγ가 결핍된 경우를 포함하여(일부 경우에는 FRG 마우스, FRG 돼지 또는 FRG 래트와 같은 "FRG" 동물로 지칭됨) 다른 유전자위에서 추가의 유전적 변형을 포함할 수 있거나 포함하지 않을 수 있다.
유용한 유전적 변형은 또한 예를 들어 면역계의 특정 분자 또는 세포 성분의 결핍, 면역계의 특정 분자 또는 세포 성분의 기능성 등으로부터 면역결핍을 결과하는 변형을 포함한다. 일부 경우에, 유용한 유전적 변경은 재조합 활성화 유전자 1(Rag1) 유전자의 유전적 변경을 포함한다. Rag1은 면역글로불린 V(D)J 재조합의 활성화에 관여하는 유전자이다. RAG1 단백질은 DNA 기질의 인식에 관여하지만 안정적인 결합 및 절단 활성은 또한 RAG2를 필요로 한다. Rag-1 결핍 동물은 성숙한 B 및 T 림프구가 없는 것으로 나타났다. 일부 경우에, 유용한 유전적 변경은 재조합 활성화 유전자 2(Rag2) 유전자의 유전적 변경을 포함한다. Rag2는 면역글로불린과 T 세포 수용체 유전자위의 재조합에 관여하는 유전자이다. Rag2 유전자가 결핍된 동물은 V(D)J 재조합을 겪을 수 없어 기능적 T 세포와 B 세포가 완전히 상실된다(예를 들어, 문헌[Shinkai et al. Cell 68:855-867, 1992] 참조). 일부 경우에, 유용한 유전적 변경은 인터류킨 수용체(Il2rg)의 공통 감마 사슬의 유전적 변경을 포함한다. Il2rg는 인터류킨 수용체의 공통 감마 사슬을 코딩하는 유전자이다. Il2rg는 IL-2, IL-4, IL-7 및 IL-15를 비롯한 여러 인터류킨에 대한 수용체의 구성 요소이다(예를 들어, 문헌[Di Santo et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:377-381, 1995] 참조). Il2rg가 결핍된 동물은 B 세포 및 T 세포 감소를 나타내고 자연 킬러 세포가 결핍되어 있다. Il2rg는 인터류킨-2 수용체 감마 사슬이라고도 한다.
일부 경우에, 예를 들어 면역억제가 하나 이상의 면역억제제의 투여를 통해 달성되는 경우를 포함하여 동물은 면역억제될 수 있다. 동물에서 면역억제를 달성하는데 효과적인 임의의 적합한 면역억제제 또는 제제들이 사용될 수 있다. 면역억제제의 예에는 FK506, 사이클로스포린 A, 플루다라빈, 미코페놀레이트, 프레드니손, 라파마이신 및 아자티오프린이 포함되나 이에 제한되지는 않는다. 면역억제제의 조합도 투여될 수 있다. 일부 경우에, 유전적 면역결핍 대신 면역억제제가 사용된다. 일부 경우에, 면역억제제가 유전적 면역결핍과 조합으로 사용된다.
본원에 요약된 바와 같이, 유전적으로 변형된 동물은 하나 이상의(즉, 조합) 유전적 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 이러한 동물은 rag1 유전적 변형, rag2 유전적 변형, IL2rg 유전적 변형을 포함할 수 있거나, 이러한 동물은 rag1 또는 rag2 유전적 변형 및 Il2rg 유전자의 유전적 변경을 포함할 수 있어 유전자 변경은 상응하게 기능적 RAG1 단백질, RAG2 단백질, IL-2rg 단백질, 또는 RAG-1/RAG-2 단백질 및 IL-2rg 단백질의 발현 손실을 결과할 수 있다. 한 예에서, 하나 이상의 유전적 변경은 Rag2 유전자의 유전적 변경 및 Il2rg 유전자의 유전적 변경을 포함한다. 한 예에서, 하나 이상의 유전적 변경은 Rag1 유전자의 유전적 변경 및 Il2rg 유전자의 유전적 변경을 포함한다. 일부 경우에, 유용한 유전적 변경은 예를 들어 SCID, NOD, SIRPα, 퍼포린, 또는 누드를 포함한다. 변경된 유전자위는 유전적 무효(즉, 녹아웃) 또는 해당 유전자위에서 유전자 생성물의 결핍을 결과하는 기타 변형일 수 있다. 면역계의 특정 세포(예컨대 대식세포 또는 NK 세포)도 고갈될 수 있다. 특정 세포 유형을 고갈시키는 임의의 편리한 방법이 사용될 수 있다.
유도성 손상, 선택적 색전증, 일과성 허혈, 레트로르신, 모노크로톨린, 티오아세트아미드, 감마선 조사, 사염화탄소 및/또는 유전적 조작을 포함하나 이에 제한되지 않는, 간세포 이종이식편에 대한 선택적 성장 이점을 생성하는 다양한 간 손상 모델이 간세포 생착 및 확장을 용이하게 하기 위해 동물 생물반응기(예를 들어, 래트, 마우스, 토끼, 돼지)에서 사용될 수 있음이 이해될 것이다(예를 들어, Fah 파괴, uPA, TK-NOG(문헌[Washburn et al., Gastroenterology, 140(4):1334-44, 2011]), 알부민 AFC8, 알부민 디프테리아 독소, 윌슨병 등). 간 손상 기술의 조합이 또한 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 동물은 이종 간세포의 주사 전에 유로키나제 유전자(예를 들어, 유로키나제 플라스미노겐 활성화제(uPA))를 코딩하는 벡터(예를 들어, Ad 벡터)가 투여된다. 간세포에서 uPA의 발현은 간 손상을 유발하여 이식 시 간세포 이종이식편의 선택적 확장을 허용한다. 한 실시형태에서, 유로키나제 유전자는 인간 유로키나제이고 분비되거나 분비되지 않을 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제8,569,573호; 제9,000,257호 및 미국 특허출원공개 제20160249591호 참조.
일부 경우에, TK-NOG 간 손상 모델(즉, 알부민 티미딘 키나제 형질전환-NOD-SCID-인터류킨 공통 감마 사슬 녹아웃)이 본원에 기재된 바와 같은 동물 생물반응기로서 사용될 수 있다. TK-NOG 동물에는 간시클로비르 투여에 의해 조건적으로 활성화될 수 있는 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제 간독성 이식유전자가 포함된다. 간시클로비르의 투여 동안 이식유전자의 활성화로 인한 간 손상은 간세포 이종이식편에 선택적 이점을 제공하여 본원에 기재된 바와 같은 이식된 간세포의 확장을 위한 생체내 생물반응기로서 이러한 동물의 사용을 용이하게 한다.
일부 경우에, AFC8 간 손상 모델(알부민 프로모터에 의해 구동되는 FKBP-카스파제 8 유전자를 갖는 것으로 특징지어짐)은 본원에 기재된 바와 같은 동물 생물반응기로서 사용될 수 있다. AFC8 동물에는 AP20187의 투여에 의해 조건적으로 활성화될 수 있는 FK508-카스파제 8 융합 간독성 이식유전자가 포함된다. AP20187의 투여 동안 이식유전자의 활성화로 인한 간 손상은 간세포 이종이식편에 선택적 이점을 제공하여 본원에 기재된 바와 같은 이식된 간세포의 확장을 위한 생체내 생물반응기로서 이러한 동물의 사용을 용이하게 한다.
일부 경우에, NSG-PiZ 간 손상 모델(면역결핍(NGS)과 조합된 α-1 항트립신(AAT) 결핍을 갖는 것으로 특징지어짐)이 본원에 기재된 바와 같은 동물 생물반응기로서 사용될 수 있다. NSG-PiZ 동물은 AAT의 분비를 손상시켜, 잘못 접힌 PiZ 돌연변이 AAT 단백질이 축적되어 간세포 손상을 촉발한다. 이러한 간 손상은 간세포 이종이식편에 선택적 이점을 제공하여 본원에 기재된 바와 같은 이식된 간세포의 확장을 위한 생체내 생물반응기로서 이러한 동물의 사용을 용이하게 한다. 면역결핍은 동물이 상당한 거부 없이 이종이식편을 수용할 수 있게 한다.
일부 경우에, 이식된 세포를 보조하는 수용자의 간 능력을 개선하기 위해 간세포 생성 세포의 이식을 받기 전에 동물은 사전 컨디셔닝될 수 있다. 예를 들어, 조사 사전 컨디셔닝(예를 들어, 부분 간 조사), 색전형성 사전 컨디셔닝, 허혈성 사전 컨디셔닝, 화학적/바이러스성 사전 컨디셔닝(예를 들어, uPA, 시클로포스파미드, 독소루비신, 산화질소, 레트로르신, 모노크로탈린, 독성 담즙염, 사염화탄소, 티오아세트아미드 등 사용), 간 절제 사전 컨디셔닝 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 사전 컨디셔닝 요법이 사용될 수 있다. 일부 경우에, 간세포 생성 세포는 사전 컨디셔닝 없이 도입될 수 있고/있거나 절차는 예를 들어 본원에 기재된 것들 중 하나 이상을 포함하는 사전 컨디셔닝 요법 또는 특정 시약 중 하나, 모두 또는 일부 조합을 구체적으로 배제할 것이다. 일부 경우에, NTBC의 중단을 통한 간 손상 유도 또는 간시클로비르 또는 AP20187의 투여가 사전 컨디셔닝에 사용될 수 있다. 사용되는 경우, 사전 컨디셔닝은 예를 들어, 적어도 이식 전 적어도 6시간, 적어도 12시간, 적어도 24시간, 적어도 36시간, 적어도 48시간, 적어도 60시간, 적어도 72시간, 적어도 4일, 적어도 5일, 적어도 6일, 적어도 1주, 또는 적어도 2주를 포함하여 간세포 생성 세포의 이식 전 수시간, 수일 또는 수주 또는 그 이상을 포함하는 특정 시간에 수행될 수 있다.
동물의 임의적인 사전-컨디셔닝(예를 들어, uPA 사용) 후(예를 들어, 사전-컨디셔닝 24시간 후), 이종 간세포는 임의의 적합한 수단을 통해 동물에게 전달될 수 있다. 특정 실시형태에서, 본원에 기재된 바와 같은 간세포는 간에 직접(예를 들어, 간문맥 주사를 통해) 및/또는 비장내 주사(간세포는 혈관계를 통해 이동하여 간에 도달할 것임)를 통해 투여된다. 특정 실시형태에서, 선택적으로 아데노바이러스 uPA(예를 들어, 1.25x109 PFU/25g의 마우스 체중)로 사전-컨디셔닝된(예를 들어, 투여 24시간 전에) 1x105 내지 1x109(예를 들어, 5x105/마우스, 5 내지 10x106/래트 등) 간세포가 FRG 동물에 도입된다. 생물반응기에 도입된 간세포 생성 세포의 수는 다양할 것이며, 예를 들어 세포를 수용하는 동물의 종 및 크기를 비롯한 다양한 요인에 따라, 예를 들어, 1x105 내지 1x109, 1x106 내지 1x109, 1x107 내지 1x109, 1x108 내지 1x109, 1x105 내지 1x106, 1x105 내지 1x107, 1x105 내지 1x108, 1x106 내지 1x107, 1x107 내지 1x108, 1x106 내지 1x108 등을 포함하나 이에 제한되지 않는, 1x105 이하 내지 1x109 이상 범위일 수 있다. 일부 경우에, 투여되는 세포의 수는 예를 들어, 0.5x109 이하, 1x108 이하, 0.5x108 이하, 1x107 이하, 0.5x107 이하, 1x106 이하, 0.5x106 이하, 1x105 이하 등을 포함하는 1x109 이하일 수 있다.
또한, 면역 억제 약물은 이종이식된 이종 간세포로부터의 동물(예를 들어, 마우스, 돼지 또는 래트)에서 숙주 대 이식편 반응을 제거하기 위해 이식 전, 이식 동안 및/또는 이식 후에 동물에게 선택적으로 제공될 수 있다. 일부 경우에, 정의된 기간 동안 동물에서 면역 억제제를 사이클링 오프함으로써, 간 세포는 정지되고 생착된 세포는 내인성 간세포(예를 들어, 마우스, 돼지 또는 래트 간세포) 를 이종 간세포(예를 들어, 인간 간세포)로 대체하는 증식 이점을 갖게 될 것이다. 인간 간세포의 경우, 이는 인간화된 간 수준이 높은 동물을 생성한다. 이종 간세포 재증식 수준은 예를 들어 이식된 동물의 간 절편의 면역조직화학과 선택적으로 상관 관계가 있는 인간 혈청 알부민 수준의 정량화를 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 수단을 통해 결정될 수 있다.
일부 실시형태에서, 간 질환의 발병을 억제, 지연, 방지 또는 예방하는 제제는 투여된 간세포의 확장 기간 동안 동물 생물반응기에 투여된다. 이러한 제제의 투여는 건강한(예를 들어, FAH-발현) 이종 간세포에 의한 동물 생물반응기(예를 들어, 마우스, 래트, 또는 돼지 생물반응기)의 재증식 전에 동물 생물반응기(예를 들어, 마우스, 래트, 또는 돼지 생물반응기)의 간 기능장애 및/또는 사망을 방지(또는 예방)한다. 제제는 생물반응기와 관련된 질환 모델에서 간 질환을 억제하는 임의의 화합물 또는 조성물일 수 있다. 이러한 제제 중 하나는 2-(2-니트로-4-트리플루오로-메틸-벤조일)-1,3 시클로헥산디온(NTBC)이지만, 메틸-NTBC와 같은 페닐피루베이트 디옥시게나제의 다른 약리학적 억제제가 사용될 수 있다. NTBC는 Fah 결핍 동물의 간 질환 발병을 조절하기 위해 투여된다. Fah 결핍 동물 생물반응기에서 간세포 이종이식편의 확장을 촉진하면서, 치명적인 간 기능 장애를 방지하기 위해 필요에 따라 용량, 투여 일정 및 투여 방법이 조정 및/또는 사이클링될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 바와 같은 간세포 이식 후 적어도 2일, 적어도 3일, 적어도 4일, 적어도 5일 또는 적어도 6일 동안 Fah 결핍 동물에 NTBC가 투여된다. 일부 실시형태에서, Fah 결핍 동물에 적어도 약 1주, 적어도 약 2주, 적어도 약 3주, 적어도 약 4주, 적어도 약 1개월, 적어도 약 2개월, 적어도 약 3개월, 적어도 약 4개월, 적어도 약 5개월, 또는 적어도 약 6개월 동안 NTBC가 추가로 투여된다. 일부 실시형태에서, NTBC(또는 간 보호 효과를 갖는 또 다른 화합물)는 간세포 이식 후 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일 또는 약 7일에 중단된다.
Fah 결핍 동물에 투여되는 NTBC의 용량은 다양할 수 있다. 일부 실시형태에서, 용량은 1 일당 약 0.5 mg/kg 내지 약 30 mg/kg, 예를 들어, 1 일당 약 1 mg/kg 내지 약 25 mg/kg, 1 일당 약 10 mg/kg 내지 약 20 mg/kg, 또는 1 일당 약 20 mg/kg이다. NTBC는 음용수, 음식 또는 주사와 같으나 이에 제한되지 않는 임의의 적합한 수단에 의해 투여될 수 있다. 한 실시형태에서, 음용수 중에 투여되는 NTBC의 농도는 약 1 내지 약 30 mg/L, 예를 들어, 약 10 내지 약 25 mg/L, 약 15 내지 약 20 mg/L, 또는 약 20 mg/L이다. 특정 실시형태에서, NTBC 투여는 이식 전부터 이식 후 4 내지 8주 이상까지로 주기적이다. 뿐만 아니라, 본원에 기재된 방법을 사용하면 약 8주까지 동물 생물반응기에서 인간 간세포의 70 내지 90% 인간화(재증식) 비율이 발생하므로, 잠재적으로 유해한 장기간(예를 들어, 14일 또는 그 이상) NTBC 중단(즉, NTBC 오프)에 대한 필요성이 제거된다.
하기에 보다 상세히 기재된 바와 같은 동물 생물반응기, 또는 대상체는 또한 생체외 조작된 간세포의 투여 전, 투여 동안 및/또는 투여 후에 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 제제(예를 들어, c-MET 작용제(예를 들어, c-MET 항체, 소분자, HGF 폴리펩티드, 또는 이의 유도체), EGFR 작용제(예를 들어, EGFR 항체, 소분자, EGF 폴리펩티드, 또는 이의 유도체) 등)로 치료될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Ohashi et al. (2000) Nat Med. 6(3):327-31; Yuan et al. (2019) Theranostics 9(7):2115-2128] 참조. 일부 경우에, 본원에 기재된 방법은 생체외 조작된 간세포의 투여 전, 투여 동안 및/또는 투여 후에 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 제제(예를 들어, c-MET 작용제(예를 들어, c-MET 항체, 소분자, HGF 폴리펩티드, 또는 이들의 유도체), EGFR 작용제(예를 들어, EGFR 항체, 소분자, EGF 폴리펩티드, 또는 이들의 유도체) 등)를 동물 생물반응기 또는 대상체에 투여하는 것을 구체적으로 배제할 수 있으며, 제제(들)이 생체외 변형된 간세포의 투여 전, 투여 동안 및/또는 투여 후에 생물반응기 또는 대상체에 존재하지 않게 한다.
본원에 기재된 바와 같이 조작된 이식된 간세포 생성 세포로부터 유래된 확장된 간세포는 이식 후 7 내지 180일(또는 그 사이의 임의의 날) 또는 그 이상을 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 기간 후에 동물 생물반응기로부터 수집될 수 있다. 특정 실시형태에서, 확장된 간세포는 이식 후 28 내지 56일(또는 그 사이의 임의의 날)에 수집된다. 일부 경우에, 간세포는 1주, 2주 또는 그 전, 3주 또는 그 전, 4주 전, 4주 또는 그 전, 5주 또는 그 전, 6주 또는 그 전, 7주 또는 그 전, 8주 전, 8주 또는 그 전, 9주 또는 그 전, 10주 또는 그 전, 11주 또는 그 전, 12주 전, 12주 또는 그 전, 13주 또는 그 전, 14주 전, 또는 14주 또는 그 전에 수집된다.
뿐만 아니라, 확장된 간세포는 다수의 기술 중 임의의 하나를 사용하여 동물로부터 수집될 수 있다. 예를 들어, 간세포는 동물의 간의 효소적 소화에 의해 수집된 다음, 부드러운 다지기, 여과 및 원심분리가 이어질 수 있다. 뿐만 아니라, 간세포는 생착된 간세포 종의 세포 유형을 특이적으로 인식하는 항체를 사용하는 것과 같은 다양한 방법을 사용하여 다른 세포 유형, 조직 및/또는 파편으로부터 분리될 수 있다. 이러한 항체에는 항-인간 HLA-A, B, C와 같은 클래스 I 주요 조직적합성 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 포함되나 이에 제한되지 않는다(문헌[Markus et al. (1997) Cell Transplantation 6:455-462]). 항체 결합 간세포는 이어서 패닝(panning)(고체 매트릭스에 부착된 단일클론 항체 사용), 형광 활성화 세포 분류(FACS), 자기 비드 분리 등에 의해 분리될 수 있다. 간세포를 수집하는 대체 방법도 사용될 수 있다.
일부 경우에, 수집된 간세포는 추가 동물 생물반응기에 1회 또는 그 이상 연속적으로 이식될 수 있다. 예를 들어, 도 6 참조. 연속 이식은 예를 들어 모든 연속 이식에 래트, 돼지, 마우스 또는 토끼를 사용하거나 대안적으로(하나 이상의 래트에서, 하나 이상의 돼지에서) 연속 이식에 적합한 동물 생물반응기의 임의의 조합을 사용하여 동일하거나 상이한 종의 동물에서 2, 3, 4회 또는 그 이상 수행될 수 있다.
뿐만 아니라, 동물 생물반응기로부터 간세포를 수집한 후, 간세포는 대상체에 투여하기 전에 본원에 기재된 바와 같이 추가의 생체외 조작(예를 들어, 하나 이상의 작용제, 예컨대 작용제 항체, 소분자, 폴리펩티드, 등과 배양)될 수 있다. 수집되고 선택적으로 단리된 확장된 간세포는 신선하게 사용될 수 있거나 사용 전에 동결보존될 수 있다.
조성물
또한, 본원에 기재된 바와 같이 조작된 간세포 생성 세포 및 이들 세포로부터 생성된 간세포를 포함하는 조성물이 본원에 기재된다.
따라서, 동물에서 생착, 생존 및 확장하는 생체외 조작 간세포에 의해 동물 생물반응기에서 임의의 기간(예를 들어, 8-16주 또는 그 이상) 동안 40% 초과, 50% 초과, 60% 초과, 70% 초과, 80% 초과, 또는 80% 내지 100%의 간세포(예를 들어, 인간 간세포) 재증식율이 달성되도록 본원에 기재된 바와 같이 생체외 처리된 간세포 생성 세포로부터 유래된(확장된) 간세포(예를 들어, 인간 간세포)의 집단을 포함하는 살아있는 비-인간 동물(예를 들어, 비-인간 포유동물, 설치류, 마우스, 래트, 돼지 등)이 본원에 제공된다. 특정 실시형태에서, 일반적으로 최대 30%의 재증식이 동일한 기간에 달성되는 현재의 방법과 비교하여 70% 초과의 재증식이 8주까지 달성된다. 이는 수주의 NTBC 사이클링을 제거함으로써 동물 생물 반응기의 건강을 크게 개선한다. 또한, 본원에 기재된 바와 같이 처리된 이식된 세포로부터 유래된 재증식된 세포의 건강, 생존성, 내구성 및/또는 생착은 또한 미처리 이식된 세포와 비교하여 개선된다.
일부 경우에, 예를 들어 이식 후 13주 이하, 12주 이하, 11주 이하, 10주 이하, 9주 이하, 또는 8주 이하를 포함하여 14주 전 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70% 또는 그 이상 외인성(즉, 이종이식편 유래) 간세포(예를 들어, 인간 간세포)이거나 이로 재증식된 간세포 집단을 갖는 비-인간 생체내 생물반응기(예컨대 비-인간 포유동물 또는 설치류, 예를 들어, 마우스 또는 래트, 또는 돼지), 또는 이의 간이 본원에 제공된다. 또한, 예를 들어, 이식 후 13주 이하, 12주 이하, 11주 이하, 10주 이하, 9주 이하, 또는 8주 이하를 포함하여 14주 전 적어도 1x109 외인성(즉, 이종이식편 유래) 생착된 및 확장된 간세포(예를 들어, 인간 간세포)를 포함하는 비-인간 생체내 생물반응기(예컨대 비-인간 포유동물 또는 설치류, 예를 들어, 마우스 또는 래트, 또는 돼지), 또는 이의 간이 제공된다. 또한, 적어도 30 내지 50x109 외인성(즉, 이종이식편 유래) 생착된 및 확장된 간세포(예를 들어, 인간 간세포)를 포함하는 돼지 생체내 생물반응기 또는 이의 간이 제공된다.
일부 경우에, 이식 후 동일한 시점에 상응하는 생물반응기에 존재하는 상응하는 외인성 유래 비-생체외 조작된 간세포 집단보다 더 큰 이식 후 시점에서 외인성 유래(즉, 이종이식편) 생체외 조작된 간세포 집단(예를 들어, 인간 간세포 집단)을 갖는 비인간 생체내 생물반응기(예컨대 비-인간 포유동물 또는 설치류, 예를 들어, 마우스 또는 래트, 또는 돼지) 또는 이의 간이 제공된다. 일부 경우에, 생체외 조작된 외인성 유래 간세포 집단은 상응하는 비-생체외 조작된 외인성 유래 간세포 집단보다 적어도 1.1배, 예를 들어, 적어도 1.2배, 적어도 1.3배, 적어도 1.4배, 적어도 1.5배, 적어도 1.6배, 적어도 1.7배, 적어도 1.8배, 적어도 1.9배, 적어도 2배, 또는 적어도 2.5배 더 크다. 일부 경우에, 생체외 조작된 외인성 유래 간세포 집단은 상응하는 비-생체외 조작된 외인성 유래 간세포 집단보다 적어도 10%, 예를 들어, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100%, 또는 적어도 150% 더 크다. 상응하는 외인성 유래 비-생체외 조작된 간세포 집단과 비교하여 생체외 조작된 간세포 집단의 크기에서 이러한 향상은 임의의 편리한 시점, 예를 들어, 이식 후 2주 이하 이상, 이식 후 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 10주, 12주, 14주, 또는 16주, 또는 그 사이 또는 이전 또는 이후의 모든 시점에서 평가될 수 있다.
상술한 바와 같이, 간세포의 생체내 생성을 위해 임의의 적합한 동물 생물반응기가 사용될 수 있다. 비-인간 포유동물 생물반응기가 사용에 적합하다. 특정 실시형태에서, 동물은 마우스 또는 래트와 같은 설치류이다. 다른 실시형태에서, 동물은 돼지이다. 살아있는 동물 생물반응기는 면역억제/면역손상될 수 있고, 간 손상을 겪었거나 및/또는 상술한 바와 같이 NTBC로 치료(예를 들어, NTBC 치료 사이클링)될 수 있다.
특정 실시형태에서, 본원에 기재된 바와 같은 간세포를 포함하는 조성물은 캡슐화된 간세포를 포함한다. 단리되고 확장된 간세포는 일반적으로 대상체에 투여하기 전에 임의의 방법을 사용하여 캡슐화될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Jitraruch et al. (2014) PLOS One 9:10; Dhawan et al. (2019) J Hepatol. doi: 10.1016/j.jhep.2019.12.002; Bochenek et al. (2018) Nature Biomedical Engineering 2:810-821] 참조. 반투과성 하이드로겔 내의 세포 캡슐화는 전신 면역억제가 필요 없는 세포 기반 요법을 위한 국소 면역 격리 전략을 나타낸다. 하이드로겔 구체는 동종 세포를 거부하는 면역 세포를 배제하면서 세포 기능에 필요한 기질, 영양소 및 단백질의 확산을 용이하게 한다. 알지네이트 구체는 이 음이온성 다당류가 세포 친화적인 조건에서 2가 양이온의 존재 하에 하이드로겔을 형성하기 때문에 가장 널리 조사된 세포 캡슐화 재료 중 하나이다.
또한 본원에 기재된 바와 같은 방법에 의해 생성된 간세포의 집단으로 시딩 및/또는 재증식된 탈세포화된 간 또는 기타 무세포화된 스캐폴드(천연 및 합성 스캐폴드 포함)가 본원에 제공된다. 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 생체외 조작된 간세포 생성 세포의 집단은 탈세포화된 간, 또는 이의 일부 또는 다른 무세포화된 스캐폴드에(다른 보조 세포 유형과 함께 또는 없이) 도입될 수 있으며, 이는 생체외 조작된 간세포 생성 세포로부터 생성된 간세포에 의해 탈세포화된 간, 또는 이의 일부의 재증식에 충분한 조건 하에 후속적으로 유지된다.
간, 예컨대 인간 간 또는 돼지와 같은 비-인간 포유동물 간, 또는 이의 일부가 수득될 수 있고, 선택적으로 외과적으로 처리될 수 있다(예를 들어, 간의 하나 이상의 부분 또는 엽(들)을 단리하기 위해). 간 또는 이의 일부는 이어서 예를 들어 기계적 세포 손상, 동결/해동, 캐뉼러 삽입 및 하나 이상의 탈세포화 시약(예를 들어, 하나 이상의 프로테아제(예를 들어, 트립신), 하나 이상의 뉴클레아제(예를 들어, DNase), 하나 이상의 계면활성제(예를 들어, 소듐 도데실 설페이트, Triton X-100 등)), 하나 이상의 저장성 시약, 하나 이상의 고장성 시약의 역행성 확산(retrograde profusion) 및 이들의 조합 등을 포함하는 임의의 편리하고 적절한 수단에 의해 탈세포화된다. 탈세포화된 간 또는 이의 일부는 간세포-적합성 배지에 저장 및/또는 미리 침지될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 생체외 조작된 간세포 생성 세포를 함유하는 세포 현탁액은 이어서 예를 들어 주사, 관류, 국소 적용(예를 들어, 한 방울씩(drop-by-drop)), 또는 이들의 조합과 같은 임의의 편리한 메커니즘에 의해 탈세포화된 간 또는 이의 일부에 적용될 수 있다. 일부 경우에, 생체외 조작된 간세포 생성 세포는, 예를 들어 50 μL당 1 내지 2 x106 세포를 포함하나 이에 제한되지 않는, 예를 들어 50 μL당 1x105 이하 내지 1x107 이상의 세포 농도를 포함하는, 임의의 편리하고 적절한 농도로 준비된 스캐폴드에 시딩하기 위해 세포 현탁액에 존재할 수 있다. 시딩된 탈세포화된 간, 이의 일부 및/또는 기타 무세포화된 스캐폴드는 도입된 세포의 생착/부착 및/또는 확장을 위한 적합한 조건 하에 유지될 수 있으며, 이러한 조건에는 적절한 습도, 온도, 기체 교환, 영양소 등이 포함될 수 있다. 일부 경우에, 시딩된 간, 이의 일부 및/또는 기타 무세포화된 스캐폴드는 5% CO2로 약 37℃의 습한 환경에서 적합한 배양 배지에서 유지될 수 있다. 시딩된 및/또는 생성된 간세포의 탈세포화된 간, 이의 일부 또는 기타 무세포화된 스캐폴드에 부착 및/또는 확장 후, 물질은 예를 들어 간 기능 감소 및/또는 간 질환이 있는 인간 대상체과 같은 이를 필요로 하는 대상체로의 이식을 포함하는 다양한 용도에 사용될 수 있다. 인간 간을 포함하는 간의 탈세포화 및 간세포 수용 무세포 스캐폴드의 생성과 관련된 방법 및 시약은 예를 들어 문헌[Mazza et al. Sci Rep 5, 13079 (2015)]; 문헌[Mango et al. Adv. Funct. Mater. 2000097 (2020)]; 문헌[Shimoda et al. Sci Rep 9, 1543 (2019)]; 문헌[Croce et al. Biomolecules. 2019, 9(12):813]; 및 미국 특허 제10,688,221호(이의 개시내용은 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함됨)에 기재되어 있다.
또한, 본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같은 방법에 의해 생성된 간세포의 집단(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이 생성된 확장된 간세포를 포함하는 약학 조성물)을 제공한다. 특정 실시형태에서, 간세포의 단리된 집단은 설치류 생물반응기(마우스 또는 래트)로부터 동물당 1000만 내지 20억 인간 간세포(예를 들어, 설치류당 적어도 5억, 설치류당 적어도 7억 5천만, 설치류당 적어도 10억 등을 포함)로 동물 생물반응기로부터 수집된다. 특정 실시형태에서, 간세포의 단리된 집단은 돼지 생물반응기로부터 동물당 100 내지 500억 인간 간세포(예를 들어, 돼지당 적어도 100억, 돼지당 적어도 200억, 돼지당 적어도 300억 등 포함)로 동물 생물반응기로부터 수집된다. 본원에 기재된 바와 같은 확장된 간세포의 단리된 집단은 대상체에서 간 질환의 생체외 치료에 사용될 수 있고/있거나 하나 이상의 간 질환에 대한 생체외 치료로서 사용하기 전에 추가로 생체외 조작될 수 있다(예를 들어, 본원에 기재된 방법의 추가 라운드를 통해).
본원에 기재된 바와 같은 방법에 의해 생성된 간세포의 집단 및 이의 약학 조성물은 적절한 용기(예를 들어, 배양 용기, 튜브, 플라스크, 바이알, 크라이오바이알, 바이알-백 등)에 존재할 수 있으며 적합한 전달 방법 및/또는 장치를 사용하여 사용(예를 들어, 대상체에게 투여)될 수 있다. 이러한 간세포의 집단 및 약학 조성물은 제조될 수 있고/있거나 신선하게 사용될 수 있거나 동결보존될 수 있다. 일부 경우에, 간세포의 집단 및 이의 약학 조성물은, 예를 들어 세포가 적합한 희석제 및/또는 원하는 전달 농도(예를 들어, 단위 투여 형태) 또는 원하는 전달 농도로 쉽게 희석될 수 있는 농도(예들 들어, 적합한 희석제 또는 배지에 의해)로 존재하는 경우를 포함하는, "즉시 사용 가능한" 형식으로 제조될 수 있다. 간세포의 집단 및 이의 약학 조성물은 주사기, 주입 백과 같으나 이에 제한되지 않는 전달 장치 또는 원하는 전달 메커니즘 또는 원하는 전달 경로와 양립할 수 있는 장치에서 제조될 수 있다.
적용
본원에 기재된 간세포는 임의의 간 질환 또는 장애의 치료 및/또는 예방에 사용될 수 있다. 예를 들어, 간세포의 도입에 의해 환자의 간 조직을 재구성하는 것은 대상체의 간을 야생형 세포로 재증식시켜 이러한 병태에 대한 영구 치료를 포함하여 임의의 간 병태(들)(예를 들어, 급성 간부전, 만성 간 질환 및/또는 대사성 또는 일유전자성 질환)가 있는 환자를 위한 잠재적인 치료 옵션이다. 간세포 재구성은 예를 들어 유전자 치료를 위해 유전적으로 변형된 간세포를 도입하거나 질환, 물리적 또는 화학적 손상 또는 악성 종양의 결과로 손실된 간세포를 대체하는 데 사용될 수 있다. 또한, 확장된 인간 간세포는 인공 간 보조 장치를 이식하는 데 사용될 수 있다. 동물(예를 들어, 래트, 마우스, 토끼 등)에서 이종 간세포를 이식 및 확장하는 특정 방법 및 확장된 이종 간세포의 의학적 용도가 본원에 제공된다. 생체외 조작된 간세포는 생체내 생물반응기에서 사전 확장과 함께 또는 사전 확장 없이 이를 필요로 하는 대상체에게 투여될 수 있다.
본원에 기재된 방법 및 조성물은 또한 인간 대상체에 이식된 후 간세포 확장에 적용될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 동물 생물반응기로부터 수득된 생체외 조작된 확장된 간세포는 공지된 방법을 사용하여(예를 들어, 정맥내로) 인간 대상체에게 투여될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Dhawan et al, Nat Rev Gastroenterol Hepatol, 7:288-98, 2010; Forbes et al, Hepatology, 62: S157-S169, 2015] 참조. 이식된 간세포는 다른 방법에 의해 생성된 간세포보다 더 효율적으로 대상체에서 재증식된다. 특정 실시형태에서, 대상체에서 5 내지 10% 또는 그 이상의 재증식율이 달성되며, 이는 치료적으로 유효하기에 충분하다.
대조적으로, 일부 경우에, 본원에 기재된 방법은 생체외 변형된 간세포의 투여 전, 투여 동안 및/또는 투여 후에 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 제제(예를 들어, c-MET 작용제(예를 들어, c-MET 항체, c-MET 작용제 소분자, HGF 폴리펩티드, 또는 이들의 유도체), EGFR 작용제(예를 들어, EGFR 항체, EGFR 작용제 소분자, EGF 폴리펩티드, 또는 이들의 유도체) 등)를 대상체에 투여하는 것을 구체적으로 배제할 수 있으며(이러한 간세포가 생체내 생물 반응기에서 먼저 확장되는지 여부와 관계없이), 제제(들)이 생체외 변형된 간세포의 투여 전, 투여 동안 및/또는 투여 후에 대상체에 존재하지 않게 한다. 따라서, 본원에 기재된 방법은 치료 동안 임의의 시점에서 대상체가 간세포의 생체외 조작 동안 사용된 시약을 투여받지 않는 치료를 포함한다.
본원에 기재된 조성물 및 방법은 본원에 제공된 생체외 확장된 간세포가 치료에 직접 사용될 수 있는 동물 생물반응기에서 생성된 최초의 간세포이기 때문에 인간 대상체에서 간 질환을 치료 및/또는 예방하는 신규 방법을 제공한다. 이 놀랍고 예상치 못한 단독 사용은 동물 생물반응기에서 생체외 조작된 간세포의 상당히 증가된 확장 및/또는 생착 및/또는 환자로의 이식 시 이들의 증가된 확장 및/또는 생착 가능성의 결과이다. 따라서, 본원에 기재된 방법은 단독 치료를 포함하여 건강한 간세포를 제공함으로써 임상에서 간세포 치료를 위해 사용될 수 있으며, 이는 향상된 생착 프로파일로 인해 현재 방법보다 더 효율적인 질환 치료 및/또는 예방을 결과한다.
본원에 기재된 바와 같은 간세포 및 본원에 기재된 바와 같은 간세포를 포함하는 조성물은 임의의 적합한 수단에 의해 대상체 및 임의의 부분, 기관, 조직 또는 대상체에 투여될 수 있다. 투여 수단의 비제한적인 예는 간문맥 주입, 제대 정맥 주입, 직접 비장 캡슐 주사, 비장 동맥 주입, 망낭 주입 및/또는 복강내 주사(주입, 이식)을 포함한다. 특정 실시형태에서, 조성물은 복강내 공간 및/또는 망낭 주입에 의해 이식되는 캡슐화된 간세포를 포함한다. 특정 실시형태에서, 조성물은 본원에 기재된 바와 같이 간세포로 시딩 및/또는 증식되고 이를 필요로 하는 대상체에 외과적으로 이식되는, 예를 들어 합성 스캐폴드, 탈세포화된 간 등을 포함하는 무세포화된/탈세포화된 스캐폴드를 포함한다.
본원에 기재된 바와 같은 간세포의 투여 전 및/또는 후에, 환자는 또한 대상체에서 간세포의 성장, 재생, 생존 및/또는 생착을 촉진하는 하나 이상의 제제(예를 들어, 항체, 소분자, RNA 등)로 치료될 수 있다. 특정 실시형태에서, 환자는 적어도 하나의 c-MET 항체, 선택적으로 인간 특이적인 것으로 치료될 수 있다. 하나 이상의 제제는 환자에게 1, 2, 3, 4, 5회 또는 그 이상 투여될 수 있고 간세포와 함께 및/또는 다른 시간에 투여될 수 있다. 일부 경우에, 본원에 기재된 간세포의 투여 전 및/또는 후에, 환자는 대상체에서 간세포의 성장, 재생, 생존 및/또는 생착을 촉진하는 하나 이상의 또는 임의의 추가 제제(예를 들어, 항체, 소분자, RNA 등)로 치료되지 않을 수 있다. 따라서, 일부 경우에, 투여된 간세포는 병태에 대하여 대상체를 치료하기 위해 대상체에게 투여되는 유일한 활성제일 수 있다.
대상체(환자)에 대한 투여(이식)에 더하여 또는 이에 대한 대안으로서, 본원에 기재된 간세포는 간 질환이 있는 대상체를 치료하는 데 유용한 장치 또는 조성물에 간세포를 공급하기 위해 사용될 수도 있다. 본 개시내용의 간세포가 사용될 수 있는 이러한 장치 또는 조성물의 비제한적인 예는 생체 인공 간(BAL)(급성 간부전으로 고통받는 대상체를 위한 체외 보조 장치) 및/또는 탈세포화된 간(대상체에서 간 기능을 제공하기 위한 재세포화 기관 스캐폴드)을 포함한다. 예를 들어, 문헌[Shaheen et al. (2019) Nat Biomed Eng. doi: 10.1038/s41551-019-0460-x]; 문헌[Glorioso et al. (2015) J Hepatol 63(2):388-98] 참조.
뿐만 아니라, 대상체에 간세포를 투여하는 것을 수반하는 생체외 방법 중 임의의 것은 예를 들어 임의의 시간에 본원에 기재된 바와 같은 간세포 및/또는 제제의 반복 투여를 포함하는 방법의 하나 이상의 단계를 반복하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
본원에 기재된 방법 및 조성물에 의해 치료될 수 있는 질환 및 장애는 크리글러-나자르 증후군 유형 1; 가족성 고콜레스테롤혈증; 인자 VII 결핍증; 글리코겐 축적 질환 유형 I; 영아 레프섬병; 진행성 가족성 간내 담즙정체 유형 2; 유전성 티로신혈증 유형 1; 및 다양한 요소 사이클 결함; 급성 약물 유발 간부전이 있는 청소년 및 성인 환자를 포함하는 급성 간부전; 바이러스 유발 급성 간부전; 특발성 급성 간부전; 버섯 중독 유발 급성 간부전; 수술 후 급성 간부전; 임신의 급성 지방간으로 인한 급성 간부전; 간경변을 포함하는 만성 간 질환; 알코올 소비, 약물 섭취 및/또는 B형 간염 플레어와 같은 급성 사건 중 하나로 인한 급성-온-만성 간 질환을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 따라서, 환자는 이러한 간 질환 또는 기타 간 질환 중 하나 이상을 가질 수 있다.
일부 경우에, 본원에 기재된 방법에 따라 치료되는 질환 및 장애는 간세포 특이적(간세포 고유) 기능장애를 포함할 수 있다. 예를 들어, 기능장애 및 질환 및/또는 장애의 병인은 대상체 내에 존재하는 내인성 간세포의 기능장애로 인한 것일 수 있거나 주로 이에 기인할 수 있다. 일부 경우에, 간세포 특이적 기능장애는 유전적이거나 대상체에 의해 유전될 수 있다. 일부 경우에, 질환 또는 장애의 병인은 간세포 이외의 세포 유형을 실질적으로 포함하지 않는다. 일부 경우에, 질환 또는 장애는 간 기능 감소, 간 질환(급성 또는 만성), 또는 내인성 간세포에서 유래하는 기타 불리한 병태를 결과한다. 따라서, 일부 경우에, 예를 들어 질환이 내인성 간세포 집단에 고유한 경우, 효과적인 치료는 본원에 기재된 바와 같은 간세포로의 대체, 보충, 이식 또는 재증식을 포함할 수 있다. 이론에 얽매이지 않고, 간세포 고유 질환/장애에서 내인성 간세포의 대체 및/또는 보충은 이식된 간세포에 부정적인 영향을 미치는 질환/장애 없이 상당한 임상 개선을 결과할 수 있다. 예를 들어, 대상체가 간세포 기능에 영향을 미치는 유전적 장애를 갖는 경우(예를 들어, 간세포 내 아미노산 대사, 예컨대 고티로신혈증), 동종이형 이식된 간세포는 본질적으로 대상체 내의 질환/장애의 존재에 의해 영향을 받지 않을 수 있다. 따라서, 이식된 간세포는 대상체 내에서 실질적으로 생착, 생존, 확장 및/또는 재증식되어 상당한 긍정적인 임상 결과를 결과할 수 있다.
간세포 특이적(간세포 고유) 기능장애를 특징으로 하는 질환 및 장애는 간세포 특이적이지 않고 간세포 외인성 인자를 수반하는 병인을 갖는 질환 및 장애와 대조될 수 있다. 간세포 외인성 인자 및/또는 병인을 갖는 질환의 예는 예를 들어 알콜성 지방간염, 알콜성 간 질환(ALD), 간 지방증/비알콜성 지방간 질환(NAFLD) 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 간세포 외인성 질환은 알콜, 식단, 감염 등과 같은 내인성 간세포 외부에서 유래되거나 외부에서 간 손상을 수반한다.
간세포 고유 질환 및 간세포 관련 질환의 예는 간 관련 효소 결핍증, 간세포 관련 수송 질환 등을 포함한다. 이러한 간 관련 결핍증은 후천성 또는 유전성 질환일 수 있으며 대사 질환(예를 들어, 간 기반 대사 장애)을 포함할 수 있다. 유전성 간 기반 대사 장애는 예를 들어 문헌[Ishak, Clin Liver Dis (2002) 6:455-479]에 기재된 질환과 같으나 이에 제한되지 않는 "간의 유전성 대사 질환"으로 지칭될 수 있다. 간 관련 결핍증은 일부 경우에 급성 및/또는 만성 간 질환을 유발할 수 있으며, 예를 들어 급성 및/또는 만성 간 질환이 치료되지 않고 방치되거나 불충분하게 치료된 경우 결핍의 결과인 경우를 포함한다. 유전성 간 관련 효소 결핍증, 간세포 관련 수송 질환 등의 비제한적인 예는 크리글러-나자르 증후군 유형 1; 가족성 고콜레스테롤혈증, 인자 VII 결핍증, 글리코겐 축적 질환 유형 I, 영아 레프섬병, 진행성 가족성 간내 담즙정체 유형 2, 유전성 티로신혈증(예를 들어, 유전성 티로신혈증 유형 1), 유전적 요소 사이클 결함, 페닐케톤뇨증(PKU), 유전성 혈색소증, 알파-I 항트립신 결핍증(AATD), 윌슨병 등을 포함한다. 적어도 일부 간 표현형, 병리 및/또는 간 관련 증상(들)을 갖는 대사 질환을 포함하는 간의 유전성 대사 질환의 비제한적 예는 5-베타-환원효소 결핍증, AACT 결핍증, 아르스코그 증후군, 아베타지질단백혈증, 부신백질이영양증, 알퍼스 질환, 알퍼스 증후군, 알파-1-항트립신 결핍증, 항트롬빈 III 결핍증, 아르기나제 결핍증, 아르지닌숙신산뇨, 동맥간 이형성증, 자가면역 림프증식성 증후군, 양성 재발성 담즙정체, 베타 지중해빈혈, 블룸 증후군, 버드-키아리 증후군, 탄수화물 결핍 당단백질 증후군, 세라미다제 결핍증, 세로이드 리포푸신증, 콜레스테롤 에스테르 축적 질환, 콜레스테릴 에스테르 축적 질환, 만성 육아종, 만성 C형 간염, 크리글러-나자르 증후군, 낭포성 섬유증, 시스틴증, 당뇨병, 듀빈-존슨 증후군, 풍토성 티롤산 간경변증, 적혈구 조혈 프로토포르피린증, 파브리병, 가족성 고콜레스테롤혈증, 가족성 지방간염, 피브리노겐 축적병, 갈락토스혈증, 강글리오시드증, 고셔병, 유전적 혈색소침착증, 글리코겐증 유형 1a, 글리코겐증 유형 2, 글리코겐증 유형 3, 글리코겐증 유형 4, 육아종성 질환, 간 가족성 아밀로이드증, 유전성 과당 불내증, 유전성 구상적혈구증, 헤르만스키-푸들락 증후군, 호모시스틴뇨증, 고옥소산뇨증, 저베타지질단백혈증, 저섬유소원혈증, 임신의 간내 담즙정체, 라포라병, 리포아미드 탈수소효소 결핍증, 리포단백 장애, 모리악 증후군, 이색성 백질영양증, 미토콘드리아 세포병증, 나바호족 신경간병증, 니만-픽병, 비증후군성 담관 결핍, 북미 인디언 소아 간경변증, 오르니틴 트랜스카르바밀라아제 결핍증, 부분 지방이영양증, 피어슨 증후군, 지연성 피부 포르피린증, 진행성 가족성 간내 담즙정체, 진행성 가족성 간내 담즙정체 유형 1, 진행성 가족성 간내 담즙정체 유형 2, 단백질 C 결핍증, 슈와흐만 증후군, 탕헤르병, 혈소판감소성 자반병, 총지방이영양증, 유형 1 글리코겐증, 티롤산 간경변증, 티로신혈증, 요소 사이클 장애, 정맥폐쇄성 질환, 윌슨병, 월만병, X-연관 고IgM 증후군, 및 젤위거 증후군을 포함한다.
본원에 기재된 방법에 따른 대상체의 치료는 예를 들어 연장된 생존, 지연된 질환 진행(예를 들어, 지연된 간부전), 간부전의 예방, 간 기능 개선 및/또는 정상화, 아미노산 수준 개선 및/또는 정상화, 암모니아 수준 개선 및/또는 정상화, 알부민 수준 개선 및/또는 정상화, 빌리루빈 개선 및/또는 정상화, 표현형 번성 실패로부터의 회복, 무기력 감소, 둔감 감소, 발작 감소, 황달 감소, 혈청 포도당 개선 및/또는 정상화, INR 개선 및/또는 정상화, 소변 검사 결과 개선 및/또는 정상화 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 임상적 이점 및/또는 측정 가능한 결과를 가져올 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에, 본원에 기재된 바와 같이 생체외 조작된 간세포와 같은 간세포 생성 세포의 투여는, 예를 들어 치료 표준에 따라 치료된 및/또는 본원에 기재된 바와 같이 생체외 조작되지 않은 간세포 생성 세포가 투여된 대상체와 비교하여, 간부전을 결과하는 간 질환 및/또는 병태를 갖는 대상체의 생존을 5% 이상 증가시킨다. 이러한 대상체에서 관찰된 향상된 생존 수준은 다양할 수 있으며, 예를 들어, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60% 또는 그 이상의 생존 증가를 포함하나 이에 제한되지 않는, 적어도 5% 내지 60% 또는 그 이상의 증가 범위일 수 있다. 일부 경우에, 본원에 기재된 바와 같이 생체외 조작된 간세포 생성 세포가 투여된 대상체는 질환 진행의 지연 및/또는 하나 이상의 질환 증상의 발병(예를 들어, 간부전 및/또는 그에 기인하는 임의의 증상(들)을 포함하나 이에 제한되지 않음)을 경험할 수 있다. 질환 진행 및/또는 증상 발병의 이러한 지연은, 예를 들어 적어도 1주, 적어도 1개월, 적어도 2개월, 적어도 3개월, 적어도 4개월, 적어도 5개월, 적어도 6개월, 적어도 1년 또는 그 이상을 포함하나 이에 제한되지 않는, 수일, 수주, 수개월 또는 수년 또는 그 이상 동안 지속될 수 있다. 환자에게 투여된 본원에 기재된 간세포는 시간이 지남에 따라 환자에게 유익한 치료 반응을 일으킨다.
하기 실시예는 본 개시내용의 예시적인 실시형태에 관한 것이다. 이는 단지 예시의 목적을 위한 것이며 다른 항체, 핵산(예를 들어, DNA 및/또는 RNA) 또는 소분자(c-MET 이외)도 사용될 수 있음이 이해될 것이다.
실시예
실시예 1: c-MET 항체의 특성화
상업적으로 입수한 c-MET 항체를 시험관내에서 HepG2 및 1차 인간 간세포(PHH)에서의 신호전달 활성화에 대해 평가하였다. 특히, 세포를 표준 조건 하에서 상업적으로 입수한 항체와 2시간 동안 배양하고 FACS 분석 및 웨스턴 블롯으로 평가하였다. FACS에 의해 천연 인간 c-MET 수용체를 인식하고 인간 간 세포에서 HGF/c-MET 신호전달 경로를 활성화하는 항체를 c-MET 작용제 항체로서 특성화하였다.
또한, 항체 동역학은 하기와 같이 세척 분석에 의해 평가되었다. HepG2 세포를 1시간 동안 c-MET 항체(10 μg/mL)(또는 HGF 대조군(100 ng/mL))와 함께 또는 이것 없이 아고나이즈(agonize)하였다. 항체를 샘플에 유지하거나 세척하고 샘플을 처리 후 1시간, 2.5시간, 5시간, 1일, 2일 및 5일 시점에 취하였다.
결과는 1시간 동안 c-MET 작용제 항체 또는 HGF(100 ng/mL)를 사용한 처리가 c-MET/GAB1 신호전달 경로를 고도로 활성화함을 보여주었다. 뿐만 아니라, 작용제 유지 및 작용제 세척 조건 둘 모두에서, c-MET 항체 처리로 인한 신호 전달 활성화가 HGF로 처리된 샘플에서 관찰된 신호 전달 활성화보다 시간이 지남에 따라 훨씬 더 내구성이 있었다(예를 들어, 유지 샘플의 경우 최대 5일, 세척 샘플의 경우 최대 2일)는 것이 예기치 않게 발견되었다.
이러한 결과는 c-MET 작용제 항체 치료가 각각의 작용제가 세포와 배양물에 남아 있을 때 및 초기 배양 시간 후에 세척/제거될 때 둘 모두에서 연장되고 보다 지속적인 경로 활성화(예를 들어, HGF-유도 경로 활성화와 비교하여)를 제공할 수 있음을 입증한다.
실시예 2: 간세포의 생체외 조작
FRG 동물에 이식하기 전에 1차 인간 간세포를 생체외에서 조작하고, 이식된 간세포의 확장 및 생착에 대한 c-MET 항체 생체외 조작의 효과를 다음과 같이 평가하였다.
BD로부터 1차 간세포를 수득하고 -80℃에서 저장하였다. 간세포 배지는 다음과 같이 제조되었다: 간세포 기본 배지(Lonza) 및 HCM Single™ Quots™의 1:1 혼합물, 5% FBS 및 10 uM ROCK 억제제. 이들 실험을 위해, c-MET 항체는 Sino Biological(c-MET Ab #1) 및 R&D Systems(c-MET Ab #2)으로부터 상업적으로 입수되었다. EGFR 항체는 Sino Biological로부터 상업적으로 입수되었다.
이식 당일(0일차), 동결보존된 1차 인간 간세포를 해동하고 하기 프로토콜에 따라 제조하였다:
(1) 1 x 50 ml 간세포 해동 배지(Thermo)를 37℃로 가온시킨다. 37℃ 수조에서 동결보존된 인간 간세포를 신속하게 해동하고 간세포를 간세포 해동 배지(Thermo)로 옮긴다.
(2) 세포 현탁액을 실온에서 10분 동안 100 g에서 원심분리하여 세포 펠렛을 형성한 다음 상청액을 버린다.
(3) 소용돌이에 의해 세포 펠렛을 부드럽게 재현탁시킨 다음 47 ml 간세포 배지를 첨가한다.
(4) 세포 현탁액을 실온에서 4분 동안 80 g에서 원심분리하여 세포 펠렛을 형성한 다음 상청액을 버린다.
(5) 소량의 간세포 배지에서 소용돌이에 의해 세포 펠렛을 부드럽게 재현탁시킨다(세포 로트에 따라 다름, 추정 세포 밀도를 1.0 내지 2.0x106 세포/ml까지).
(6) 생존 간세포와 죽은 간세포의 수를 결정하기 위해 트리판 블루 염색을 사용하여 혈구계에서 수동 세포 계수를 수행한다.
(7) 간세포 배지에서 생존 간세포의 농도를 1.0x106 세포/ml로 조정한다.
(8) 2 ml/웰(세포 밀도 1.0x106 세포/ml)에서 6웰 초저 부착 플레이트에 각 그룹 및 플레이트 세포에 대하여 세포 및 원하는 농도의 항체를 혼합한다. 배양기 내부의 락킹 플랫폼에 플레이트를 위치시키고 1 내지 2시간 동안 락킹한다.
(9) 락킹 과정 동안 30분마다 수동으로 부드럽게 흔들어 혼합한다.
(10) 락킹 후, 세포를 15 ml 튜브에 옮긴다.
(11) 80 g에서 4분 동안 스핀다운한다.
(12) 상청액을 흡인한다(결합되지 않은 항체 제거).
(13) 동물 이식당 100 ul 분취량으로 DNase(2 ug/ml)가 포함된 간세포 배지에서 간세포를 부드럽게 재현탁하고 각각의 분취량을 이식을 위해 개별 튜브에 넣는다. 이식까지 세포를 얼음에서 보관한다.
실시예 3: 생체내 생물반응기에서의 간세포의 생성
실시예 2에서 전술한 바와 같이 제조된 인간 간세포를 표준 이식 프로토콜에 따라 비장내 주사를 통해 FRG 마우스에 이식하였다. 미국 특허 제8,569,573호(이의 개시내용은 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함됨)에 기재된 바와 같이 NTBC 사이클링 요법에 따라 마우스는 NTBC 온/오프 사이클링되었다.
미국 특허 제8,569,573호(이의 개시내용은 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함됨)에 기재된 바와 같이 이식 후 1, 4 및 8주에 간을 수확하고 이식된 인간 간세포의 재증식을 FAH IHC 및 인간 알부민 ELISA에 의해 평가하였다.
도 2a 내지 도 5에 도시된 바와 같이, 간세포의 생체외 조작은 FRG 동물에서 생착 및 확장 수준을 증가시켰다. 특히, c-MET 작용제 항체를 사용한 생체외 조작은 현재 절차(즉, 본원에 기재된 생체외 조작이 없는 절차)를 사용하여 수득된 5 내지 30% 재증식 범위와 비교하여 8주에 70 내지 90% 재증식에 도달함으로써 이식된 인간 간세포의 생체내 재증식 동역학을 극적으로 개선하였다.
도 2a 및 도 2b는 FAH IHC에 의한 정성적(도 2b) 및 정량적(도 2a) 평가를 사용하여, 생체외 조작을 받지 않은 간세포를 받은 동물("무 Ab 대조군")과 비교하여, 작용성 c-MET 항체의 적용에 의해 생체외 조작된 간세포를 받은 동물("c-MET Ab")에서 이식 1주 후에 증가된 생착 및 확장을 입증한다. 도 2c 및 도 2d는 유사하게 생체외 조작되지 않은 간세포를 받은 동물과 비교하여 생체외 조작된 간세포를 받은 동물에서 이식 2주 후에 증가된 간세포 재증식을 입증한다. 특히, 이러한 결과는 FAH IHC에 의해 c-MET Ab 그룹에서 간세포의 수가 증가할 뿐만 아니라(도 2c, 상단 그래프, 및 도 2d), 대조군과 비교하여 c-MET Ab 그룹에서 더 높은 인간 알부민 수준에 의해 측정된 바와 같이 기능적 재증식도 향상되었음을 보여준다(도 2c, 하단 그래프). 도 2e 및 도 2f는 대조군과 비교하여 c-MET 작용제 항체로 생체외 조작된 간세포를 받은 동물에서 이식 4주 후에 계속되는 재증식의 향상을 추가로 입증한다(FAH IHC(도 2e, 상단 그래프, 및 도 2f) 및 인간 알부민 ELISA(도 2e, 하단 그래프)에 의해 측정되는 바와 같음). 이식 4주 후 및 6주 후에 인간 알부민 ELISA에 의해 정량화된 추가 연구에서는 대조군(즉, 생체외 조작되지 않은) 간세포를 처리하지 않은 동물과 비교하여 c-MET 작용제 항체로 생체외 조작 처리된 간세포를 받은 마우스에서 평균적으로 약 2배 이상의 증가의 재증식율이 추가로 입증되었다. 예를 들어, 이러한 추가 연구에서는 평균 인간 알부민 수준이 이식 4주 후에 생체외 조작되지 않은 간세포를 받은 대조군에서 58 μg/mL인 것과 비교하여, c-Met 작용제 항체 생체외 조작된 간세포를 받은 마우스에서는 통계적으로 유의한 차이(p=0.0076)로 388 μg/mL인 것으로 나타났다.
도 3에 나타낸 예시적인 결과는 이식 8주 후에 미처리 인간 간세포의 이식을 받은 대조군 동물 생물반응기가 FAH+ 인간 간세포의 17% 미만의 재증식율을 가졌고 이 동물에서의 인간 알부민 수준은 4000 μg/mL 미만이었음을 입증한다(왼쪽 패널, "무 Ab 대조군"). 대조적으로, FAH+ 인간 간세포 재증식의 ~90% 수준은 c-MET 작용제 항체로 처리된 인간 간세포로 이식된 동물에서 달성되었다(중간("c-MET Ab_1") 및 오른쪽("c-MET Ab_2") 패널). 또한, 이러한 생체외 조작된 동물에서 14,000 μg/mL 이상의 인간 알부민 수준이 관찰되었다. 추가 연구에서, FAH 간 IHC 및 혈액 인간 알부민 ELISA에 의한 이식 8주 후에서의 정량화는 c-MET 작용제 처리 간세포를 받은 여러 동물에서 70% 이상의 재증식 수준 및 4000 μg/mL 이상의 인간 알부민 수준을 보여주었다. 평균적으로, 재증식(예를 들어, FAH 간 IHC 및/또는 혈액 인간 알부민 ELISA로 측정)은 c-MET 작용제 항체로 생체외에서 조작되지 않은 간세포를 받은 동물과 비교하여 c-MET 작용제 항체 생체외 조작된 간세포를 받은 동물에서 이식 8주 후에 약 2배 이상 향상되었다.
도 4에 도시된 바와 같이, EGFR 항체를 사용한 세포의 생체외 조작은 또한 이식 4주 후 및 8주 후 모두에서 처리되지 않은 세포와 비교하여 재증식을 개선하였다. 별도의 연구에서, 생체외 조작되지 않은 인간 간세포를 받은 대조군 마우스와 비교하여 EGFR 항체 생체외 조작된 인간 간세포를 받은 마우스에서 이식 2주 후만에 증가된 수준의 재증식이 또한 관찰되었다. 특히, 인간 알부민 수준이 100 μg/mL 이상인 마우스는 EGFR 항체 생체외 조작된 그룹에서 2주에 검출되었고 이 그룹의 평균은 모든 동물이 50 μg/mL 미만의 인간 알부민 수준을 갖는 비-생체외 조작된 그룹과 비교하여 > 2배 더 높다.
도 5에 도시된 바와 같이, 이식 전에 c-MET + EGFR 항체로 처리된 세포는 또한 2주에 알부민 생성 수준 및 FAH IHC에 의해 결정된 바와 같이 처리되지 않은 세포와 비교하여 동물 생물반응기에서 인간 간세포의 생착 및 확장을 유의하게 증가시켰다. 또한, c-MET 및 EGFR 항체 둘 모두로 생체외 처리된 세포에 의한 최대 및 평균 재증식 모두는 c-MET 항체 단독으로 생체외 처리된 세포를 받은 동물에서 관찰된 상응하는 재증식 수준보다 2주에 더 컸다.
래트 FRG 동물은 또한 간세포(예를 들어, 인간 간세포)의 생성(즉, 확장)을 위한 생체내 생물반응기로서 사용되어 왔다. 이러한 방법에서, 인간 간세포는 실시예 2에서 상기 기재된 바와 같이 처리되고 온/오프 NTBC 사이클링된 래트에 투여된다(예를 들어, 마우스에 대해 상기 기재된 바와 같은 NTBC 사이클링과 유사함). 1차 인간 간세포를 포함하는 인간 간세포는, 예를 들어 c-MET 작용제(예컨대 c-MET 작용제 항체), EGFR 작용제(예컨대 EGFR 작용제 항체) 등을 포함하는, 간세포의 성장, 재생, 생존 및/또는 생착 및 이식을 촉진하는 적어도 하나의 제제와의 접촉에 의해 생체외 조작될 수 있다. 래트 간을 이식 2, 4, 8, 12 및/또는 16주 후에 수확하고 이식된 간세포에 의한 재증식에 대해 평가하였다. 예를 들어, 수확된 래트 간은 상기 기재된 바와 같이 인간 FAH 발현과 같은 인간 단백질 발현에 대해 평가될 수 있다. 일부 경우에, 예를 들어 이식된 세포에 의한 재증식 수준의 대리 측정으로서 인간 알부민 정량화의 사용을 통해 재증식에 대한 연구 중 평가를 위해 살아있는 래트로부터 혈액 샘플을 수득할 수 있다. 선택적으로, 래트는 또한 이식 전, 이식 동안 및/또는 이식 후에 c-MET 및/또는 EGFR 항체로 1회 이상 처리된다.
c-MET 항체에 대한 노출을 포함하는 생체외 조작은 FRG 래트에서 생착 및 확장 수준을 증가시켜 이식 8 내지 16주 후까지 적어도 50-70% 또는 그 이상의 재증식을 달성한다.
본원에 기재된 바와 같이, FRG 설치류 모델에서 인간 간세포 재증식의 FAH IHC 정량화를 다음과 같이 수행하였다. FAH 양성 세포에 대해 염색된(FAH 특이적 항체에 의해) IHC 슬라이드를 Pannoramic Midi II 슬라이드 스캐너로 스캔하였다. 스캔된 슬라이드는 CaseViewer 소프트웨어, CellQuant 모듈을 사용하여 분석되었다. 모듈 속성 및 측정 매개변수 아래에 표준 시나리오가 구축되었다. 세포는 세포질의 폭과 세포질의 염색 강도로 정의되었다. 세포 검출은 색상 디콘볼루션, 세포질에서 양성을 나타내는 색원체 및 음성을 나타내는 대조염색을 통해 수행되었다. FAH 양성 세포는 염색 강도(0, +1, +2 또는 +3)로 정의되었으며, 여기서 0은 검출된 양성 강도가 없고 +3은 강한 양성 강도가 검출됨을 나타낸다. 필요한 경우 점수를 조정했다. 재증식율은 검출된 총 세포에 대한 세포 +3(강한 FAH 양성)의 백분율로서 결정되었다(상기 기재된 세포 검출 기준에 기초함).
실시예 4: 생체외 조작된 인간 간세포의 이식에 의한 간 질환의 향상된 구조
FRG 래트는 NTBC의 부재 하에 인간 환자에서 치료되지 않은 유형 1 유전성 티로신혈증으로 인한 것으로 관찰되는 간부전을 반복하기 때문에 간 질환의 임상적으로 관련된 모델로서 FRG 래트를 이 연구에서 사용하였다. 따라서, 대안적 개입이 없는 경우 인간 질환을 모델링하는 FRG 래트는 간부전이 발병하고 궁극적으로 사망한다. 이 모델에서 생체내 간부전을 치료하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 생체외 조작된 인간 간세포의 능력을 시험하기 위해, FRG 래트에게 (1) c-MET 항체 작용제로 생체외 조작된 1차 인간 간세포 또는 (2) c-MET 항체 작용제로 생체외 조작되지 않은 대조군 1차 인간 간세포의 세포 치료 용량을 투여하였다. 이식된 동물은 본원에 기재된 관찰 과정 전반에 걸쳐 NTBC 보충없이 유지되었고 동물 생존은 질환 진행의 마커로서 분석되었다. 이식 7일 후까지 생체외 조작되지 않은 간세포로 처리된 그룹에서 25%의 생존율과 비교하여 c-MET 작용제 항체 생체외 조작된 간세포를 받은 래트 그룹에서 91.7%의 생존율이 관찰되었다. 이 연구는 본원에 기재된 생체외 조작된 인간 간세포의 투여가 인간 질환의 설치류 모델에서 간부전을 효과적으로 치료한다는 것을 입증한다. 이들 데이터는 생체외 조작된 인간 간세포의 투여가 본원에 기재된 바와 같은 생체외 조작을 받지 않은 간세포를 포함하는 매칭된 대조군 치료와 비교하여 생존을 향상시키고 질환 진행을 지연시킴을 보여준다.
실시예 5: 생체외 치료
예를 들어 실시예 3에서와 같이 본원에 기재된 동물 생물반응기에서 제조된 인간 간세포를 포함하는 약학 조성물은 표준 프로토콜을 사용하여 하나 이상의 간 질환 또는 장애가 있는 인간 대상체에 이식된다.
일부 경우에, 이식 전에, 동물 생물반응기로부터 단리된 간세포는 예를 들어 다음과 같은 표준 기술을 사용하여 캡슐화될 수 있다. 빈 및 간세포 마이크로비드(EMB 및 HMB)는 본질적으로 문헌[Dhawan et al. (2019) J Hepatol. 72(5):P877-884 and Jitraruch et al. (2014) PLOS One 9:10]에 기재된 바와 같이 생성된다. 간단히 말해서, 간세포 마이크로비드는 250 μm 노즐 및 멸균 임상 등급 시약이 있는 IE-50R 캡슐화기(Inotech Encapsulation AG, Dottikon, Switzerland)를 사용하여 생성된다. 저점도 및 고 굴루로네이트 함유 초순수 소듐 알지네이트(PRONOVA™ SLG20; NovaMatrix, Sandvika, 노르웨이)를 0.9% NaCl에 용해시켜 1.5% 알지네이트 용액(w/v)의 최종 농도를 제공하고, 2.5x106 세포/ml 알지네이트의 밀도로 세포와 혼합한다. 마이크로비드는 1.2% CaCl2 용액에서 10분 동안 가교되고 0.9% NaCl로 2회 세척하여 과량의 Ca2+ 이온을 제거한다. 마이크로비드의 평균 직경은 500 SD 100 μm이다.
간세포 조성물(알지네이트 HMB 포함)이 대상체에게 투여된다. 투여는 지속적인 심폐 모니터링 하에 집중 케어 유닛을 포함하여 복강내 주입을 통해 이루어질 수 있다. 주입 시 급성 간부전 관리의 일부로 대상체(성인 및 청소년)를 환기시킬 수 있다. 치료 전에 국제 표준화 비(INR)는 < 2 및 혈소판 > 50,000 / 마이크로리터로 수정된다. 16게이지 캐뉼러는 전복벽(anterior abdominal wall)을 통한 초음파 유도 하에 5 내지 20 ml/kg/간세포의 세션으로 배치된다(예를 들어, 세포 배지 중 알지네이트 HMB는 초음파 유도 하에 20 내지 45분에 걸쳐 주입됨). 용량은 알지네이트 ml당 대략 2500만 세포로 계산될 수 있다. 환자는 일반적으로 바이탈 사인, 복부 팽창, 장 폐색, 복부 출혈, 소변 배출 및/또는 아나필락시스 또는 감염 징후에 대해 모니터링된다.
이식된 간세포는 인간 대상체에서 생착 및 확장되어 증상의 중증도 및/또는 빈도의 감소, 증상 및/또는 근본 원인의 제거, 증상 및/또는 그 근본 원인의 발생 예방, 및/또는 질환으로 인한 손상의 개선 또는 교정에 의해 하나 이상의 간 질환을 치료한다.
본원에 언급된 모든 특허, 특허 공보 및 간행물은 모든 목적을 위해 그 전체가 인용되어 본원에 포함된다.
본 개시내용은 이해의 명료함을 위해 예시 및 실시예를 통해 일부 상세하게 제공되었지만, 본 개시내용의 정신 또는 범위를 벗어나지 않고 다양한 변경 및 수정이 실시될 수 있음이 당업자에게 명백할 것이다. 따라서, 전술한 설명 및 실시예는 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
실시형태
따라서, 본원에 기재된 본 주제의 실시형태는 단독으로 또는 하나 이상의 다른 양태 또는 실시형태와 조합으로 유익할 수 있다. 본 설명을 제한하지 않고, 연속적으로 번호가 매겨진 본 개시내용의 특정한 비제한적 실시형태가 아래에 제공된다. 본 개시내용을 읽을 때 당업자에게 명백한 바와 같이, 개별적으로 번호가 매겨진 각각의 실시형태가 사용될 수 있거나 개별적으로 번호가 매겨진 이전 또는 다음의 실시형태 중 임의의 것과 조합될 수 있다. 이는 이러한 모든 실시형태의 조합에 대한 지원을 제공하기 위한 것이며 아래에 명시적으로 제공된 실시형태의 조합에 제한되지 않는다.
1. 간세포 생성 방법으로서, 하기를 포함하는 방법:
동물의 간에서 간세포가 확장되도록 간세포를 생성하는 생체외 조작된 세포를 동물 생물반응기에 투여하는 것, 선택적으로, 확장된 간세포는 투여 후 8 내지 16주 이내에 동물의 총 간세포 집단의 적어도 70%를 구성함; 및
확장된 간세포를 동물로부터 단리하는 것.
2. 실시형태 1에 있어서, 생체외 조작이 간세포 생성 세포를 동물 생물반응기에서 간세포의 성장, 재생, 생존 및/또는 생착을 촉진하는 하나 이상의 제제와 배양하는 것을 포함하는, 방법.
3. 실시형태 2에 있어서, 적어도 하나 이상의 제제가 하나 이상의 항체, 하나 이상의 소분자, 및/또는 하나 이상의 핵산, 선택적으로 c-MET 및/또는 표피 성장 인자(EGFR) 항체를 포함하는, 방법.
4. 실시형태 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 확장된 간세포가 인간 간세포인, 방법.
5. 실시형태 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 동물 생물반응기가 유전적으로 변형된 동물을 포함하는, 방법.
6. 실시형태 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 동물 생물반응기가 FAH 결핍인, 방법.
7. 실시형태 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 동물 생물반응기가 마우스, 래트 또는 돼지를 포함하는, 방법.
8. 실시형태 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 생체외 조작된 간세포 생성 세포가 동물 생물반응기에 주입되는, 방법.
9. 실시형태 1 내지 8 중 어느 하나에 있어서, 생체외 조작된 간세포 생성 세포가 동물 생물반응기에 정맥내 주입되는, 방법.
10. 실시형태 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 생체외 조작된 간세포 생성 세포가 선택적으로 비장내 주사, 간문맥내 주사 또는 동물 생물반응기의 간으로의 직접 주사를 통해 동물 생물반응기의 기관에 투여되는, 방법.
11. 실시형태 1 내지 10 중 어느 하나에 있어서, 10% 초과의 간세포 재증식율이 동물 생물반응기에서 달성되는, 방법.
12. 실시형태 1 내지 11 중 어느 하나에 있어서, 40% 초과의 간세포 재증식율이 동물 생물반응기에서 달성되는, 방법.
13. 실시형태 1 내지 12 중 어느 하나에 있어서, 간세포 생성 세포가 상업적 공급원으로부터 수득되거나 살아있는 대상체 또는 사체, 또는 시험관내에서 사전 확장된 1차 인간 간세포로부터 단리된 다음 생체외 조작에 적용되는, 방법.
14. 실시형태 1 내지 13 중 어느 하나에 있어서, 생체외 조작이 간세포 생성 세포를 동물 생물반응기에 투여하기 전에 1분 내지 2일 동안 하나 이상의 제제와 배양하는 것을 포함하는, 방법.
15. 실시형태 1 내지 14 중 어느 하나에 있어서, 생체외 조작이 하나 이상의 제제와 배양된 간세포 생성 세포를 락킹하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
16. 실시형태 1 내지 15 중 어느 하나에 있어서, 생체외 조작된 간세포 생성 세포의 투여 전 및/또는 후 NTBC를 동물 생물반응기에 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
17. 실시형태 1 내지 16 중 어느 하나에 있어서, 생체외 조작된 간세포 생성 세포가 4 내지 16주, 선택적으로 6 내지 10주, 선택적으로 8주 미만 동안 동물 생물반응기에서 확장되는, 방법.
18. 실시형태 1 내지 17 중 어느 하나에 있어서, 확장된 간세포가 동물 생물반응기의 총 간세포 집단의 적어도 40%를 구성하는, 방법.
19. 실시형태 1 내지 18 중 어느 하나에 있어서, 확장된 간세포를 단리하고 단리된 확장된 간세포를 추가의 생체외 조작에 적용하는 것을 추가로 포함하고, 선택적으로 생체외 조작은 단리된 확장된 간세포를 간세포의 성장, 재생, 생존 및/또는 생착을 촉진하는 하나 이상의 제제와 배양하는 것을 포함하는, 방법.
20. 실시형태 1 내지 19 중 어느 하나의 방법에 의해 생성된 확장된 간세포의 집단.
21. 실시형태 20에 있어서, 간세포가 하나 이상의 제제와 배양되지 않은 간세포 생성 세포로부터 생성된 간세포보다 더 건강하고, 더 잘 생착되고/생착되거나 더 증식성인, 확장된 간세포의 집단.
22. 확장된 생체외 조작된 인간 간세포를 포함하는 동물 생물반응기 또는 이의 간으로서, 인간 간세포는 동물 생물반응기의 간세포 부피의 40% 초과 및/또는 동물 생물반응기의 간 간세포의 40% 초과를 구성하는, 동물 생물반응기 또는 이의 간.
23. 간 질환 또는 장애의 치료 및/또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 하나 이상의 간 질환 또는 장애를 치료 및/또는 예방하는 방법으로서, 실시형태 1 내지 실시형태 21 중 어느 하나의 방법에 의해 생성된 확장된 간세포 또는 실시형태 22의 동물 생물반응기로부터 단리된 인간 간세포를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
24. 실시형태 23에 있어서, 간 질환이 만성 간 질환 또는 급성 간 질환인, 방법.
25. 실시형태 23 또는 24에 있어서, 간 질환이 간경변; 급성-온-만성 간부전(ACLF); 약물 또는 중독 유발 간부전; 선천성 대사성 간 질환; 크리글러-나자르 증후군 유형 1; 가족성 고콜레스테롤혈증; 인자 VII 결핍증; 인자 VIII 결핍증(혈우병 A); 페닐케톤뇨증(PKU); 글리코겐 축적 질환 유형 I; 영아 레프섬병; 진행성 가족성 간내 담즙정체 유형 2; 유전성 티로신혈증 유형 1; 요소 사이클 결함; 급성 간부전; 급성 약물 유발 간부전; 바이러스 유발 급성 간부전; 특발성 급성 간부전; 버섯 중독 유발 급성 간부전; 수술 후 급성 간부전; 임신의 급성 지방간으로 인한 급성 간부전; 알코올성 간염, 간성 뇌병증, 간경변증을 포함하는 만성 간 질환; 및/또는 알콜 소비, 약물 섭취 및/또는 B형 간염 플레어 업 유발 급성-온-만성 간 질환인, 방법.
26. 실시형태 23 내지 25 중 어느 하나에 있어서, 간세포는 간문맥 주입, 제대 정맥 주입, 직접 비장 캡슐 주사, 비장 동맥 주입, 복강내 주사, 림프절 주사를 통해 투여되고, 선택적으로 간세포는 캡슐화된 간세포를 포함하는, 방법.
27. 실시형태 23 내지 26 중 어느 하나에 있어서, 대상체에서 간세포의 성장, 재생, 생존 및/또는 생착을 촉진하는 하나 이상의 제제를 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
28. 실시형태 27에 있어서, 하나 이상의 제제가 하나 이상의 항체, 하나 이상의 소분자, 및/또는 하나 이상의 핵산을 포함하는, 방법.
29. 실시형태 27 또는 28에 있어서, 하나 이상의 제제가 c-MET 항체를 포함하고, 선택적으로 c-MET 항체는 인간 특이적인, 방법.
30. 실시형태 27 내지 29 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 제제는 선택적으로 간세포와 함께 및/또는 간세포와 상이한 시간에 대상체에게 1회, 2회 또는 그 이상 투여되는, 방법.
31. 간세포 생성 세포(예를 들어, 인간 간세포) 및/또는 간세포의 성장, 재생, 생존 및/또는 생착을 촉진하는 하나 이상의 제제를 포함하고, 선택적으로 전술한 방법 중 임의의 방법을 수행하기 위한 지침을 포함하는 키트.
32. 간세포 생성 방법으로서, 하기를 포함하는 방법:
생체외에서 세포를 성장, 재생, 생존 및/또는 생착을 촉진하는 하나 이상의 제제와 접촉시켜 간세포 생성 세포를 조작하는 것;
생착에 적합한 조건 하에 생체외 조작된 세포를 생체내 생물반응기로 이식하는 것; 및
생착된 세포를 확장하고 간세포를 생성하기에 적합한 조건 하에 생체내 생물반응기를 유지하고, 선택적으로, 생체외 조작이 없는 상응하는 방법과 비교하여 생착 및/또는 재증식 효율을 적어도 10% 증가시키는 것.
33. 실시형태 32에 있어서, 조작이 간세포 생성 세포 및 하나 이상의 제제를 함유하는 용기를 진탕하는 것을 포함하고, 선택적으로 진탕은 락킹을 포함하는, 방법.
34. 실시형태 33에 있어서, 이식 전에, 생체외 조작된 세포로부터 하나 이상의 제제를 분리하는 것을 추가로 포함하는 방법.
35. 실시형태 34에 있어서, 분리가 하나 이상의 제제를 제거하고/제거하거나 생체외 조작된 세포를 단리하는 것을 포함하고, 선택적으로 분리는 원심분리 및/또는 흡인을 포함하는, 방법.
35. 실시형태 32 내지 35 중 어느 하나에 있어서, 확장된 간세포를 단리하는 것을 추가로 포함하는 방법.
36. 실시형태 32 내지 25 중 어느 하나에 있어서, 생성된 간세포가 인간 간세포이고, 선택적으로 간세포 생성 세포는 1차 인간 간세포를 포함하는, 방법.
37. 실시형태 32 내지 36 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 제제가 성장 인자 수용체에 특이적으로 결합하는 작용제를 포함하는, 방법.
38. 실시형태 37에 있어서, 작용제가 소분자 또는 항체를 포함하는, 방법.
39. 실시형태 37 또는 38에 있어서, 성장 인자 수용체가 c-MET 및/또는 EGFR인, 방법.
40. 실시형태 32 내지 39 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 제제가 c-MET 작용제 항체 및/또는 EGFR 작용제 항체를 포함하는, 방법.
41. 실시형태 32 내지 40 중 어느 하나에 있어서, 생착된 세포가 2 내지 16주의 기간 동안 확장되는, 방법.
42. 실시형태 32 내지 41 중 어느 하나에 있어서, 확장된 간세포가 생체내 생물반응기의 총 간세포 집단의 적어도 50%를 구성하는, 방법.
43. 실시형태 32 내지 42 중 어느 하나에 있어서, 생체내 생물반응기가 내인성 간 손상을 포함하고, 선택적으로 생체내 생물반응기가 내인성 간 손상을 포함하도록 유전적으로 변형되는, 방법.
44.실시형태 32 내지 43 중 어느 하나에 있어서, 생체내 생물반응기가 면역억제되고, 선택적으로 생체내 생물반응기는 면역억제되도록 유전적으로 변형되는, 방법.
45. 실시형태 32 내지 44 중 어느 하나에 있어서, 생체내 생물반응기가 FAH 결핍, IL-2Rγ 결핍, RAG1 결핍, RAG2 결핍, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 마우스, 래트 또는 돼지인, 방법.
46. 실시형태 45에 있어서, 생체내 생물반응기가 FAH, RAG1 및/또는 RAG2, 및 IL-2Rγ 결핍(FRG)을 포함하는 설치류 또는 돼지인, 방법.
47.실시형태 32 내지 46 중 어느 하나에 있어서, 생체외 조작된 간세포 생성 세포의 투여 전 및/또는 후 NTBC를 생물반응기에 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
48.실시형태 32 내지 47 중 어느 하나에 있어서, 생체외 조작된 간세포 생성 세포가 선택적으로 비장내 주사, 간문맥내 주사 또는 생체내 생물 반응기의 간으로의 직접 주사를 통해 생체내 생물반응기의 기관에 투여되는, 방법.
49.실시형태 32항 내지 48 중 어느 하나에 있어서, 간세포 생성 세포가 상업적 공급원으로부터 수득되거나 살아있는 대상체 또는 사체, 또는 시험관내에서 사전 확장된 1차 인간 간세포로부터 단리된 다음 생체외 조작에 적용되는, 방법.
50.실시형태 32 내지 49 중 어느 하나에 있어서, 생체외 조작이 간세포 생성 세포를 생체내 생물반응기에 투여하기 전에 1분 내지 2일 동안 하나 이상의 제제와 배양하는 것을 포함하는, 방법.
51. 간 질환에 대하여 대상체를 치료하는 방법으로서, 하기를 포함하는 방법:
간세포를 생성하는 생체외 조작된 세포를 생체내 생착 및 확장에 효과적인 양으로 대상체에게 투여하여 대상체에서 간 질환을 치료하는 것.
52. 실시형태 51에 있어서, 간세포 생성 세포를 성장, 재생, 생존 및/또는 생착을 촉진하는 하나 이상의 제제와 접촉시켜 생체외 조작된 세포를 생성하는 것을 추가로 포함하는 방법.
53. 실시형태 51 또는 52에 있어서, 대상체에 투여하기 전에 생체내 생물반응기에서 생체외 조작된 세포를 확장하는 것을 추가로 포함하는 방법.
54. 실시형태 51 내지 53 중 어느 하나에 있어서, 간 질환이 간경변; 급성-온-만성 간부전(ACLF); 약물 또는 중독 유발 간부전; 선천성 대사성 간 질환; 크리글러-나자르 증후군 유형 1; 가족성 고콜레스테롤혈증; 인자 VII 결핍증; 인자 VIII 결핍증(혈우병 A); 페닐케톤뇨증(PKU); 글리코겐 축적 질환 유형 I; 영아 레프섬병; 진행성 가족성 간내 담즙정체 유형 2; 유전성 티로신혈증 유형 1; 요소 사이클 결함; 급성 간부전; 급성 약물 유발 간부전; 바이러스 유발 급성 간부전; 특발성 급성 간부전; 버섯 중독 유발 급성 간부전; 수술 후 급성 간부전; 임신의 급성 지방간으로 인한 급성 간부전; 알코올성 간염, 간성 뇌병증, 간경변증을 포함하는 만성 간 질환; 및/또는 알콜 소비, 약물 섭취 및/또는 B형 간염 플레어 업 유발 급성-온-만성 간 질환인, 방법.
55. 실시형태 51 내지 54 중 어느 하나에 있어서, 간 질환이 유전성 장애인, 방법.
56. 실시형태 51 내지 55 중 어느 하나에 있어서, 간 질환이 간부전을 포함하는, 방법.
57. 실시형태 51 내지 56 중 어느 하나에 있어서, 간 질환이 간 관련 효소 결핍증을 포함하는, 방법.
58. 실시형태 51 내지 57 중 어느 하나에 있어서, 간 질환이 유전성 티로신혈증인, 방법.
59. 실시형태 51 내지 58 중 어느 하나에 있어서, 치료는 선택적으로 생체외 조작된 세포가 투여되지 않은 비교 대상체의 생존과 비교하여 대상체의 적어도 연장된 생존을 결과하는, 방법.
60. 간 질환의 치료를 위한, 선행하는 실시형태들 중 어느 하나의 방법 또는 시스템에 의해 생성된 세포의 용도.
61. 간 질환의 치료에서의 실시형태 20 또는 21에 따른 세포의 집단의 용도.
62. 실시형태 56 또는 57에 있어서, 간 질환이 간경변; 급성-온-만성 간부전(ACLF); 약물 또는 중독 유발 간부전; 선천성 대사성 간 질환; 크리글러-나자르 증후군 유형 1; 가족성 고콜레스테롤혈증; 인자 VII 결핍증; 인자 VIII 결핍증(혈우병 A); 페닐케톤뇨증(PKU); 글리코겐 축적 질환 유형 I; 영아 레프섬병; 진행성 가족성 간내 담즙정체 유형 2; 유전성 티로신혈증 유형 1; 요소 사이클 결함; 급성 간부전; 급성 약물 유발 간부전; 바이러스 유발 급성 간부전; 특발성 급성 간부전; 버섯 중독 유발 급성 간부전; 수술 후 급성 간부전; 임신의 급성 지방간으로 인한 급성 간부전; 알코올성 간염, 간성 뇌병증, 간경변증을 포함하는 만성 간 질환; 및/또는 알콜 소비, 약물 섭취 및/또는 B형 간염 플레어 업 유발 급성-온-만성 간 질환인, 용도.

Claims (63)

  1. 간세포(hepatocyte) 생성 방법으로서, 하기를 포함하는 방법:
    동물의 간에서 간세포가 확장되도록 간세포를 생성하는 생체외 조작된 세포를 동물 생물반응기에 투여하는 것, 선택적으로, 확장된 간세포는 투여 후 8 내지 16주 이내에 동물의 총 간세포 집단의 적어도 70%를 구성함; 및
    확장된 간세포를 동물로부터 단리하는 것.
  2. 제1항에 있어서, 생체외 조작이 간세포 생성 세포(hepatocyte-generating cell)를 동물 생물반응기에서 간세포의 성장, 재생, 생존 및/또는 생착을 촉진하는 하나 이상의 제제와 배양하는 것을 포함하는, 방법.
  3. 제2항에 있어서, 적어도 하나 이상의 제제가 하나 이상의 항체, 하나 이상의 소분자, 및/또는 하나 이상의 핵산, 선택적으로 간세포 성장 인자 수용체(c-MET) 및/또는 표피 성장 인자(EGFR) 항체를 포함하는, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 확장된 간세포가 인간 간세포인, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 동물 생물반응기가 유전적으로 변형된 동물을 포함하는, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 동물 생물반응기가 FAH 결핍인, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 동물 생물반응기가 마우스, 래트 또는 돼지를 포함하는, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 생체외 조작된 간세포 생성 세포가 동물 생물반응기에 주입되는, 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 생체외 조작된 간세포 생성 세포가 동물 생물반응기에 정맥내 주입되는, 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 생체외 조작된 간세포 생성 세포가 선택적으로 비장내 주사, 간문맥내 주사 또는 동물 생물반응기의 간으로의 직접 주사를 통해 동물 생물반응기의 기관에 투여되는, 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 10% 초과의 간세포 재증식율이 동물 생물반응기에서 달성되는, 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 40% 초과의 간세포 재증식율이 동물 생물반응기에서 달성되는, 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 간세포 생성 세포가 상업적 공급원으로부터 수득되거나 살아있는 대상체 또는 사체, 또는 시험관내에서 사전 확장된 1차 인간 간세포로부터 단리된 다음 생체외 조작에 적용되는, 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 생체외 조작이 간세포 생성 세포를 동물 생물반응기에 투여하기 전에 1분 내지 2일 동안 하나 이상의 제제와 배양하는 것을 포함하는, 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 생체외 조작이 하나 이상의 제제와 배양된 간세포 생성 세포를 락킹(rocking)하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 생체외 조작된 간세포 생성 세포의 투여 전 및/또는 후 NTBC를 동물 생물반응기에 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 생체외 조작된 간세포 생성 세포가 4 내지 16주, 선택적으로 6 내지 10주, 선택적으로 8주 미만 동안 동물 생물반응기에서 확장되는, 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 확장된 간세포가 동물 생물반응기의 총 간세포 집단의 적어도 40%를 구성하는, 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 확장된 간세포를 단리하고 단리된 확장된 간세포를 추가의 생체외 조작에 적용하는 것을 추가로 포함하고, 선택적으로 생체외 조작은 단리된 확장된 간세포를 간세포의 성장, 재생, 생존 및/또는 생착을 촉진하는 하나 이상의 제제와 배양하는 것을 포함하는, 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생성된 확장된 간세포의 집단.
  21. 제20항에 있어서, 간세포가 하나 이상의 제제와 배양되지 않은 간세포 생성 세포로부터 생성된 간세포보다 더 건강하고, 더 잘 생착되고/생착되거나 더 증식성인, 확장된 간세포의 집단.
  22. 확장된 생체외 조작된 인간 간세포를 포함하는 동물 생물반응기 또는 이의 간으로서, 인간 간세포는 동물 생물반응기의 간세포 부피의 40% 초과 및/또는 동물 생물반응기의 간 간세포의 40% 초과를 구성하는, 동물 생물반응기 또는 이의 간.
  23. 간 질환 또는 장애의 치료 및/또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 하나 이상의 간 질환 또는 장애를 치료 및/또는 예방하는 방법으로서, 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생성된 확장된 간세포 또는 제22항의 동물 생물반응기로부터 단리된 인간 간세포를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 간 질환이 만성 간 질환 또는 급성 간 질환인, 방법.
  25. 제23항 또는 제24항에 있어서, 간 질환이 간경변; 급성-온-만성 간부전(ACLF: acute-on-chronic liver failure); 약물 또는 중독 유발 간부전; 선천성 대사성 간 질환; 크리글러-나자르 증후군 유형 1; 가족성 고콜레스테롤혈증; 인자 VII 결핍증; 인자 VIII 결핍증(혈우병 A); 페닐케톤뇨증(PKU); 글리코겐 축적 질환 유형 I; 영아 레프섬병; 진행성 가족성 간내 담즙정체 유형 2; 유전성 티로신혈증 유형 1; 요소 사이클 결함; 급성 간부전; 급성 약물 유발 간부전; 바이러스 유발 급성 간부전; 특발성 급성 간부전; 버섯 중독 유발 급성 간부전; 수술 후 급성 간부전; 임신의 급성 지방간으로 인한 급성 간부전; 알코올성 간염, 간성 뇌병증, 간경변증을 포함하는 만성 간 질환; 및/또는 알콜 소비, 약물 섭취 및/또는 B형 간염 플레어 업(flare up) 유발 급성-온-만성 간 질환인, 방법.
  26. 제23항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 간세포는 간문맥 주입, 제대 정맥 주입, 직접 비장 캡슐 주사, 비장 동맥 주입, 복강내 주사, 림프절 주사를 통해 투여되고, 선택적으로 간세포는 캡슐화된 간세포를 포함하는, 방법.
  27. 제23항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에서 간세포의 성장, 재생, 생존 및/또는 생착을 촉진하는 하나 이상의 제제를 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  28. 제27항에 있어서, 하나 이상의 제제가 하나 이상의 항체, 하나 이상의 소분자, 및/또는 하나 이상의 핵산을 포함하는, 방법.
  29. 제27항 또는 제28항에 있어서, 하나 이상의 제제가 c-MET 항체를 포함하고, 선택적으로 c-MET 항체는 인간 특이적인, 방법.
  30. 제27항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 제제는 선택적으로 간세포와 함께 및/또는 간세포와 상이한 시간에 대상체에게 1회, 2회 또는 그 이상 투여되는, 방법.
  31. 간세포 생성 세포(예를 들어, 인간 간세포) 및/또는 간세포의 성장, 재생, 생존 및/또는 생착을 촉진하는 하나 이상의 제제를 포함하고, 선택적으로 전술한 방법 중 임의의 방법을 수행하기 위한 지침을 포함하는 키트.
  32. 간세포 생성 방법으로서, 하기를 포함하는 방법:
    생체외에서 세포를 성장, 재생, 생존 및/또는 생착을 촉진하는 하나 이상의 제제와 접촉시켜 간세포 생성 세포를 조작하는 것;
    생착에 적합한 조건 하에 생체외 조작된 세포를 생체내 생물반응기로 이식하는 것; 및
    생착된 세포를 확장하고 간세포를 생성하기에 적합한 조건 하에 생체내 생물반응기를 유지하고, 선택적으로, 생체외 조작이 없는 상응하는 방법과 비교하여 생착 및/또는 재증식 효율을 적어도 10% 증가시키는 것.
  33. 제32항에 있어서, 조작이 간세포 생성 세포 및 하나 이상의 제제를 함유하는 용기를 진탕(agitating)하는 것을 포함하고, 선택적으로 진탕은 락킹을 포함하는, 방법.
  34. 제33항에 있어서, 이식 전에, 생체외 조작된 세포로부터 하나 이상의 제제를 분리하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  35. 제34항에 있어서, 분리가 하나 이상의 제제를 제거하고/제거하거나 생체외 조작된 세포를 단리하는 것을 포함하고, 선택적으로 분리는 원심분리 및/또는 흡인을 포함하는, 방법.
  36. 제32항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 확장된 간세포를 단리하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  37. 제32항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 생성된 간세포가 인간 간세포이고, 선택적으로 간세포 생성 세포는 1차 인간 간세포를 포함하는, 방법.
  38. 제32항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 제제가 성장 인자 수용체에 특이적으로 결합하는 작용제를 포함하는, 방법.
  39. 제38항에 있어서, 작용제가 소분자 또는 항체를 포함하는, 방법.
  40. 제38항 또는 제39항에 있어서, 성장 인자 수용체가 c-MET 및/또는 EGFR인, 방법.
  41. 제32항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 제제가 c-MET 작용제 항체 및/또는 EGFR 작용제 항체를 포함하는, 방법.
  42. 제32항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 생착된 세포가 2 내지 16주의 기간 동안 확장되는, 방법.
  43. 제32항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 확장된 간세포가 생체내 생물반응기의 총 간세포 집단의 적어도 50%를 구성하는, 방법.
  44. 제32항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 생체내 생물반응기가 내인성 간 손상을 포함하고, 선택적으로 생체내 생물반응기가 내인성 간 손상을 포함하도록 유전적으로 변형되는, 방법.
  45. 제32항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 생체내 생물반응기가 면역억제되고, 선택적으로 생체내 생물반응기가 면역억제되도록 유전적으로 변형되는, 방법.
  46. 제32항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 생체내 생물반응기가 FAH 결핍, IL-2Rγ 결핍, RAG1 결핍, RAG2 결핍, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 마우스, 래트 또는 돼지인, 방법.
  47. 제46항에 있어서, 생체내 생물반응기가 FAH, RAG1 및/또는 RAG2, 및 IL-2Rγ 결핍(FRG)을 포함하는 설치류 또는 돼지인, 방법.
  48. 제32항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 생체외 조작된 간세포 생성 세포의 투여 전 및/또는 후 NTBC를 생물반응기에 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  49. 제32항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 생체외 조작된 간세포 생성 세포가 선택적으로 비장내 주사, 간문맥내 주사 또는 생체내 생물 반응기의 간으로의 직접 주사를 통해 생체내 생물반응기의 기관에 투여되는, 방법.
  50. 제32항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 간세포 생성 세포가 상업적 공급원으로부터 수득되거나 살아있는 대상체 또는 사체, 또는 시험관내에서 사전 확장된 1차 인간 간세포로부터 단리된 다음 생체외 조작에 적용되는, 방법.
  51. 제32항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 생체외 조작이 간세포 생성 세포를 생체내 생물반응기에 투여하기 전에 1분 내지 2일 동안 하나 이상의 제제와 배양하는 것을 포함하는, 방법.
  52. 간 질환에 대하여 대상체를 치료하는 방법으로서, 하기를 포함하는 방법:
    간세포를 생성하는 생체외 조작된 세포를 생체내 생착 및 확장에 효과적인 양으로 대상체에게 투여하여 대상체에서 간 질환을 치료하는 것.
  53. 제52항에 있어서, 간세포 생성 세포를 성장, 재생, 생존 및/또는 생착을 촉진하는 하나 이상의 제제와 접촉시켜 생체외 조작된 세포를 생성하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  54. 제52항 또는 제53항에 있어서, 대상체에 투여하기 전에 생체내 생물반응기에서 생체외 조작된 세포를 확장하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  55. 제52항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 간 질환이 간경변; 급성-온-만성 간부전(ACLF); 약물 또는 중독 유발 간부전; 선천성 대사성 간 질환; 크리글러-나자르 증후군 유형 1; 가족성 고콜레스테롤혈증; 인자 VII 결핍증; 인자 VIII 결핍증(혈우병 A); 페닐케톤뇨증(PKU); 글리코겐 축적 질환 유형 I; 영아 레프섬병; 진행성 가족성 간내 담즙정체 유형 2; 유전성 티로신혈증 유형 1; 요소 사이클 결함; 급성 간부전; 급성 약물 유발 간부전; 바이러스 유발 급성 간부전; 특발성 급성 간부전; 버섯 중독 유발 급성 간부전; 수술 후 급성 간부전; 임신의 급성 지방간으로 인한 급성 간부전; 알코올성 간염, 간성 뇌병증, 간경변증을 포함하는 만성 간 질환; 및/또는 알콜 소비, 약물 섭취 및/또는 B형 간염 플레어 업 유발 급성-온-만성 간 질환인, 방법.
  56. 제52항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 간 질환이 유전성 장애인, 방법.
  57. 제52항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 간 질환이 간부전을 포함하는, 방법.
  58. 제52항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 간 질환이 간 관련 효소 결핍증을 포함하는, 방법.
  59. 제52항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 간 질환이 유전성 티로신혈증인, 방법.
  60. 제52항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 치료는 선택적으로 생체외 조작된 세포가 투여되지 않은 비교 대상체의 생존과 비교하여 대상체의 적어도 연장된 생존을 결과하는, 방법.
  61. 간 질환의 치료를 위한, 선행하는 항들 중 어느 한 항의 방법 또는 시스템에 의해 생성된 세포의 용도.
  62. 간 질환의 치료에서의 제20항 또는 제21항에 따른 세포의 집단의 용도.
  63. 제57항 또는 제58항에 있어서, 간 질환이 간경변; 급성-온-만성 간부전(ACLF); 약물 또는 중독 유발 간부전; 선천성 대사성 간 질환; 크리글러-나자르 증후군 유형 1; 가족성 고콜레스테롤혈증; 인자 VII 결핍증; 인자 VIII 결핍증(혈우병 A); 페닐케톤뇨증(PKU); 글리코겐 축적 질환 유형 I; 영아 레프섬병; 진행성 가족성 간내 담즙정체 유형 2; 유전성 티로신혈증 유형 1; 요소 사이클 결함; 급성 간부전; 급성 약물 유발 간부전; 바이러스 유발 급성 간부전; 특발성 급성 간부전; 버섯 중독 유발 급성 간부전; 수술 후 급성 간부전; 임신의 급성 지방간으로 인한 급성 간부전; 알코올성 간염, 간성 뇌병증, 간경변증을 포함하는 만성 간 질환; 및/또는 알콜 소비, 약물 섭취 및/또는 B형 간염 플레어 업 유발 급성-온-만성 간 질환인, 용도.
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