WO2003061687A1 - High-concentration preparation of soluble thrombomodulin - Google Patents

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Definitions

  • the present invention relates to a method for suppressing foaming in preparing a solution containing a high concentration of soluble tombo modulin by dissolving a lyophilized formulation containing soluble tombo modulin, and the stability of soluble tombo modulin in the freeze-dried preparation. And lyophilized soluble tombo modulin containing them; »agents and kit preparations thereof.
  • Thrombomodulin has been discovered as a substance that specifically binds to thrombin and has the effect of significantly promoting the activation of protein C by thrombin.
  • Protein C is a vitamin K-dependent protein that plays an important role in the blood coagulation / fibrinolysis system, and is activated by the action of thrombin to become activated protein c. This activated protein C inactivates the active coagulation factors V and VIII in the living body and is involved in the production of plasminogen activator, which has a thrombolytic effect. [Koji Suzuki, History of Medicine, Vol. 125, pp. 901 (1983)].
  • thrompomodulin is useful as an anticoagulant or thrombolytic agent by promoting the activation of protein C by thrombin.
  • Conventional applications of thrombomodulin include, for example, acute coronary syndrome (ACS), thrombosis, peripheral vascular obstruction, obstructive atherosclerosis, vasculitis, functional disorders secondary to heart surgery, and organ transplantation.
  • DIC intravascular coagulation
  • angina transient ischemic attack
  • preeclampsia diabetes
  • liver Liver veno-occlusive disease VOD
  • hepatic vein after fulminant hepatitis and bone marrow transplantation It is expected to be used in the treatment and prevention of diseases such as obstruction, deep venous thrombosis (DVT), sepsis and adult respiratory distress syndrome (ARDS).
  • diseases such as obstruction, deep venous thrombosis (DVT), sepsis and adult respiratory distress syndrome (ARDS).
  • DVT deep venous thrombosis
  • ARDS adult respiratory distress syndrome
  • thrombomodulin has been used in vascular endothelial cells of various animal species including humans. It was discovered and acquired as a glycoprotein expressed on the vesicle, and was subsequently successfully clawed. That is, the gene for the human thrombomodulin precursor including the signal peptide was cloned from the human lung cDNA library using a genetic engineering technique, and the entire gene sequence of thrombomodulin was analyzed, and the signal peptide of 18 amino acid residues was analyzed. The amino acid sequence of 575 residues including the amino acid sequence has been clarified (JP-A-64-6219).
  • the mature topompomodulin from which the signal peptide has been cleaved has an N-terminal region (1-226) from the N-terminal side of the mature peptide, a region having six EGF-like structures (227-462), O-glycosylation region (463-498), transmembrane region (499-521), and cytoplasmic region (522-557), which are the same as full-length thrombomodulin It is known that the portion having activity is mainly composed of the fourth, fifth and sixth EGF-like structures from the N-terminal side among the regions having six EGF-like structures (M. Zushi et al., J. Biol. Chem., 246, 10351-10353 (1989)].
  • soluble thrombomodulin prepared so as not to contain a transmembrane region can dissolve neatly in the absence of a surfactant, for example, a ⁇ -terminal region and a region having six EGF-like structures.
  • Soluble thrombomodulin consisting of only three regions of the type I glycosylation region (namely, consisting of the amino acid sequence at positions 19 to 516 of SEQ ID NO: 1). It has been confirmed that tombo modulin has the activity of natural tombomodulin (JP-A-64-6219).
  • soluble thrombomodulin examples include JP-A-2-255699, JP-A-3-133380, JP-A-3-259908, JP-A-4-210700, JP-A-5-213998, and W092. / 00325, W092 / 03149, W093 / 15755, etc., and soluble thrompomodulin.
  • soluble thrombomodulin derived from human urine as a natural type JP-A-3-86900, JP-A-3-218399
  • a lyophilized preparation is used to supply soluble thrombomodulin in a wide and stable manner as a pharmaceutical composition.
  • a lyophilized formulation is redissolved in water for injection or the like to form a high-concentration soluble thrombomodulin solution, countless microscopic bubbles are generated in the solution, and the bubbles are hard to disappear, and in some cases, cloudy ⁇ Is the first thing confirmed by the present inventors.
  • the inner wall of the container for dissolving the lyophilized formulation containing soluble tombo modulin is coated with silicone, or the pressure in the container for dissolving the lyophilized formulation containing soluble thrompomodulin is reduced. Therefore, it was confirmed that the generation of bubbles was suppressed, and the present invention was completed.
  • the present effort is to dissolve a lyophilized preparation containing soluble thrombomodulin containing soluble thrombomodulin as an active ingredient and prepare a high-concentration solution of soluble thrombomodulin at a concentration of 10 mg / mL or more
  • a At least one selected from the group consisting of nonionic surfactants, benzyl alcohol and chlorobutanol
  • B that the inner wall of the container for dissolving the lyophilized product containing soluble tonbo modulin is coated with silicone, or
  • C lyophilization containing the soluble tonbo modulin.
  • the present invention provides a solution containing a soluble thrombomodulin containing soluble thrombomodulin as an active ingredient, and dissolving a lyophilized preparation containing the same. It is used for the preparation and contains at least one compound selected from the group consisting of a nonionic surfactant, benzyl alcohol and chlorobutanol as an active ingredient. It is a foam inhibitor.
  • the present invention relates to a lyophilized preparation containing soluble tonpomodulin which contains soluble tonpomodulin as an active ingredient, or a kit preparation in which the lyophilized preparation containing soluble tonpompomodulin is combined with an aqueous solution for dissolution thereof.
  • the lyophilized preparation containing soluble thrompomodulin is for preparing a high-concentration solution of soluble thrompomodulin having a concentration of 10 mg / mL or more, and (a) the lyophilized preparation containing soluble thrompomodulin is used.
  • At least one compound selected from the group consisting of a nonionic surfactant, benzyl alcohol and chlorobutanol is present, and Z or the freeze-dried preparation containing the soluble thrombomodulin.
  • the present inventors studied the problems of the conventional techniques when preparing a high-concentration soluble thrombomodulin preparation. That is, in the preparation of high-concentration soluble topopomodulin that can be widely applied to various diseases to be treated and various administration methods, For example, it is difficult to administer a certain amount or more of a solution intramuscularly or subcutaneously so that it can be used for an intramuscular or subcutaneous administration method. Furthermore, the present inventors have conducted a close examination and found that pain is strong and unfavorable even if the osmotic pressure of the administration solution is too low or too high.
  • a specific composition disclosed in Japanese Patent Application Laid-Open No. 6-321805 is a high-concentration soluble tonpomodulin containing 10 mg or more of soluble tonpomodulin, and is a subcutaneous or intramuscular preparation.
  • a specific composition disclosed in Japanese Patent Application Laid-Open No. 6-321805 is a high-concentration soluble tonpomodulin containing 10 mg or more of soluble tonpomodulin, and is a subcutaneous or intramuscular preparation.
  • the present invention relates to the use of a soluble tongue mbomodulin in a freeze-dried preparation containing a soluble tongue mombomodulin containing an active ingredient
  • a stabilization method comprising: (1) glutamic acid or a salt thereof, and mannitol; (2) glutamic acid or a salt thereof, and lysine or a salt thereof; (3) glutamic acid or a salt thereof; And (4) a combination of aspartic acid or a salt thereof and mannitol, and (4) a lyophilized preparation containing the soluble tobacco Can be dissolved in 0.1 mL to 2 mL of the aqueous solution for dissolution to prepare a solution containing 10 mg / mL or more of high-concentration soluble thrompomodulin, and the osmotic pressure ratio at the time of dissolution is 0.5 to 2.
  • a method for stabilizing soluble tombo modulin in a freeze-dried preparation containing soluble tombo modulin characterized by being 0. BEST MODE
  • the present invention is a foam control method or a foam control agent described below. That is, the present invention provides a method for dissolving a soluble thrombomodulin-containing freeze-dried preparation containing soluble thrombomodulin as an active ingredient to prepare a solution containing 10 mg / mL or more of a high-concentration soluble tombo modulin.
  • any of the above (a), (b) and (c) is preferable, but (a) is preferable, and (a) (c), (a) and (b) are also preferred. (B) and (c) are also preferred, and (a), (b) and (c) are particularly preferred examples.
  • the present invention provides a method for dissolving the lyophilized preparation containing soluble thrompomodulin to prepare a high-concentration solution containing 10 mg / mL or more of soluble tonpomodulin.
  • the present invention relates to a method for suppressing foaming of a solution containing a high concentration of soluble topomodulin, which comprises causing at least one compound selected from the group consisting of a zwitterionic surfactant, benzyl alcohol and chlorobutanol.
  • At least one compound selected from the group consisting of a nonionic surfactant, benzyl alcohol and chlorobutanol is present in the lyophilized preparation containing soluble topompomodulin, Alternatively, at least one compound selected from the group consisting of a nonionic surfactant, benzyl alcohol, and chlorobutanol is contained in an aqueous solution for dissolving the lyophilized preparation containing soluble tombo modulin.
  • Soluble topomodulin in the present invention may be any substance that binds to thrombin, has an action of promoting the activation of protein C by thrombin, and can be easily dissolved even in the absence of a surfactant.
  • soluble thrombomodulin generally has an effect of prolonging the coagulation time by thrombin and an effect of suppressing platelet aggregation by Z or thrombin.
  • Preferred examples of the solubility of soluble tobonummodulin include water, for example, distilled water for injection (in the absence of a surfactant such as Triton X-100 @ polidocanol, usually near neutrality).
  • 1 mg / mL or more, or 10 mg / mL or more preferably 15 mg / mL or more, or 17 mg / mL or more, more preferably 20 mg / mL or more, 25 mg / mL or more.
  • mL or more, or 30 mg / mL or more particularly preferably 60 mg / mL or more, and in some cases, 80 mg / mL or more, or 100 mg / mL or more.
  • the action of thrombin to promote the activation of protein C is, for example, as follows.
  • the amount of activity for promoting protein C activation and the presence or absence of the activity can be easily confirmed by test methods clearly described in various publicly known documents such as Japanese Unexamined Patent Publication No. 64-6219.
  • the effect of prolonging the coagulation time by thrombin and the effect of inhibiting platelet aggregation by Z or thrombin can be easily confirmed.
  • Preferred examples of the soluble thrombomodulin include human-derived peptides derived from human urine and the like, and mutations or derivatives of human-derived genes and DNAs.
  • the amino acid sequence of -132 is included in the peptide.
  • the amino acid sequence of 19-132 of SEQ ID NO: 3 may be naturally or artificially mutated as long as it has an action of promoting the activation of protein C by thrombin.
  • One or more amino acid sequences of 19 to 132, that is, one or more amino acids, and more preferably several amino acid sequences may be substituted, deleted or added.
  • a peptide consisting of the amino acid sequence of 19-132 of SEQ ID NO: 7 in the Sequence Listing that is, a peptide consisting of a sequence in which Val at position 125 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 is replaced with Ala, or a peptide comprising these Peptides can also be used in the present invention.
  • the allowed degree of mutation is not particularly limited as long as it has activity, but, for example, as an amino acid sequence, 50% or more, preferably 70% or more, particularly preferably 80% or more, more preferably 90% or more or 95% Above, and 98% or more homology is exemplified. As will be described later, these mutations can be easily obtained by using ordinary genetic engineering techniques.
  • Examples of soluble 1 "live thrombomodulin that can be used in the present invention include, for example, a trait prepared by transfecting a DNA encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 into a host cell with a vector.
  • Preferred examples of the peptide obtained from the transformed cell include a peptide consisting of the amino acid sequence at positions 19 to 516 in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
  • the amino acid sequence of 19-516 of SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing may be naturally or artificially mutated as long as it has the effect of promoting the activation of protein C by tobacco.
  • the acid may be substituted, deleted or added.
  • a peptide consisting of the amino acid sequence of 19-516 of SEQ ID NO: 5 in the Sequence Listing that is, a sequence in which Val at position 473 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is replaced with Ala
  • a signal portion as it is, a peptide consisting of each of the amino acid sequences at positions 17 to 516 of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 5, or a mixture thereof is produced. Any of these may be used.
  • these peptides have extremely high solubility, and have sufficient solubility as described above.
  • peptides consisting of the respective amino acid sequences at positions 19-516 or 17-516 of SEQ ID NO: 1 are particularly preferred.
  • Soluble thrombomodulin is a peptide encoded by DNA capable of hybridizing under stringent conditions to the complementary DNA having a nucleotide sequence of 55-396 of SEQ ID NO: 4 or 8; and thrombin protein C It is also preferable that the compound has an action of promoting the activity of the compound and can be dissolved in the absence of a surfactant.
  • Stringent conditions are conditions under which complementary DNA can specifically hybridize to the target DNA.For example, the complementary DNA is hybridized with DNA, thighs, or synthetic DNA, and then non-specifically. This refers to the conditions under which the hybridized complementary DNA other than DNA is washed away. For example, the determination may be made with reference to Sambrook et al.
  • these peptides need only have the above-mentioned amino acid sequence, and may or may not have a sugar chain, and this point is not particularly limited.
  • the type of sugar chain, the addition position and the degree of addition are different depending on the type of host cell used, and any of them can be used.
  • the signal sequence is obtained by genetic manipulation.
  • the signal sequence that can be used for expression includes 1-18 of SEQ ID NO: 1 in the above Sequence Listing. Base sequence consisting of amino acid sequence Sequence, other known signal sequences, for example, human tissue plasminogen activator
  • the DNA sequence encoding soluble topo-tompomodulin is preferably incorporated into a vector, particularly preferably an expression vector that can be expressed in animal cells.
  • An expression vector is a DNA molecule consisting of a promoter sequence, a sequence for providing a ribosome binding site to mRNA, a DNA sequence encoding a protein to be expressed, a splicing signal, a transcription termination terminator sequence, a replication origin sequence, and the like.
  • preferred animal cell expression vectors include pSV2_X reported by RC Mulligan et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78. 2072 (1981)] and PM Howley et al. [Method in Emzymology, 101, 387, Academic Press (1983)] reported pBP69 T (69-6).
  • Host cells that can be used for producing these peptides include Chinese hamster ovary (CH0) cells, COS-1 cells, COS-7 cells, VER0 (ATCC CCL-81) cells, BHK cells, and dog kidney. Derived MDCK cells, hamster AV-12-664 cells and the like, and human-derived cells include HeLa cells, WI38 cells, and human 293 cells. For CHO cells, DHFR-CH0 cells are more preferable.
  • microorganisms such as Escherichia coli are often used in the process of gene manipulation and peptide production, and it is preferable to use a host-vector system suitable for each of them. You can choose.
  • the gene for soluble tombo modulin used for genetic recombination technology has been cloned, and the gene for soluble tombo modulin has been disclosed, and examples of production using the recombinant technology have been disclosed. Purification methods are also known (JP-A-64-6219, JP-A-2-255699, JP-A-5-213998, JP-A-5-310787, JP-A-7-155176, J. Biol. Chem., 264: 10351-10353 (1989)].
  • the soluble thrompomodulin of the present invention can be produced by using the method described in the above report or by following the method described therein.
  • An Escherichia coli K-12 strain DH5 ATCC Deposit No. 67283 containing the plasmid pSV2TMJ2 containing DNA encoding oral npomodulin is disclosed.
  • a strain Escherichia coli DH5 / pSV2TM J2
  • FERMBP-5570 obtained by re-depositing this strain with Life Science Laboratories (now the Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology) can be used.
  • the soluble topomodulin of the present invention can be prepared by a known gene manipulation technique.
  • the soluble topopomodulin used in the present invention may be prepared by a conventionally known method or a method similar thereto.
  • the method of Yamamoto et al. Japanese Patent Application Laid-Open No. 64-6219], or 213998 can be referred to. That is, a soluble thrombomodulin gene derived from human can be converted into a DNA encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 by genetic engineering techniques, for example, and further modified as necessary. As this modification, site-specific mutation is performed according to the method described in Method in Enzymology, 100: 468 (1983), Academic Press. For example, the base T at position 1418 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing can be converted into base C using synthetic DNA for mutation.
  • the DNA thus prepared was incorporated into, for example, Chinese hamster ovary (CH0) cells to obtain transformed cells, which were appropriately selected, and purified from a culture obtained by culturing the cells by a known method. Soluble thrombomodulin can be produced. As described above, it is preferable that DNA encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 be transfected into the host cell.
  • the method for producing soluble thrombomodulin used in the present invention is not limited to the above method. For example, it can be extracted and purified from urine, blood, other body fluids, etc. Can be extracted and purified from a tissue producing the same or a tissue culture solution thereof, or if necessary, further digested with a protease.
  • the method for isolating and purifying soluble tombo modulin from the culture supernatant or culture obtained as described above should be carried out according to a known method [Takeshi Horio-edited, Basic Experimental Method for Proteins and Enzymes].
  • the opposite of soluble thrombomodulin It is also preferable to use ion exchange chromatography or adsorption chromatography using an interaction between a chromatographic carrier on which a functional group having a charge is immobilized and soluble tombomodulin.
  • a preferable example is affinity chromatography utilizing specific affinity for soluble tombo modulin.
  • the adsorbent include an example in which a thrombin which is a ligand for soluble tonbomodulin and an antibody to soluble tonpomodulin are used.
  • a thrombin which is a ligand for soluble tonbomodulin and an antibody to soluble tonpomodulin
  • antibodies soluble thrombomodulin antibodies recognizing appropriate properties or appropriate epitopes can be used.
  • Japanese Patent Publication No. 5-42920 Japanese Patent Application Laid-Open No. 64-45398
  • Examples described in Japanese Unexamined Patent Publication No. Hei 6-205692 are cited.
  • gel filtration chromatography and ultrafiltration utilizing the molecular weight size of soluble topompomodulin can be mentioned.
  • hydrophobic chromatography utilizing a hydrophobic bond between a chromatographic carrier having a hydrophobic group immobilized thereon and a hydrophobic site of soluble thrombomodulin. It is also possible to use hydroxyapatite as a carrier as the adsorption chromatography, for example, the example described in JP-A-9-110900. These methods can be appropriately combined.
  • the degree of purification can be selected according to the purpose of use.For example, the results of electrophoresis, preferably SDS-PAGE, are obtained as a single band, or gel-based HPLC or reverse-phase HPLC of isolated purified products. It is desirable to purify until a single peak results.
  • the band be substantially only soluble toxin thrombomodulin, and it is not required to form a single band.
  • a specific example of the purification method of the present invention is a method of purifying using soluble tombomodulin activity as an index.
  • Purification method for concentrating the fractions and subjecting them to gel filtration to obtain a soluble tobacco active fraction as a pure product [Gomi K. et al., Blood, 75: 1396-1399 (1990)].
  • the soluble tombo modulin activity used as an indicator includes, for example, the activity of promoting protein C activation by tombo.
  • Other preferred purification methods are as follows.
  • a particularly preferred example is a method using Q-Sepharose Fast Flow equilibrated with a 0.02 M Tris-HCl buffer ( ⁇ 7.4) containing 0.18 M NaCl. After washing as appropriate, for example, elution is carried out with a 0.02 M tris-chloride buffer containing 0.3 M NaCl (PH 7.4), whereby a soluble topo-nbomodulin as a crude product can be obtained.
  • a substance having a specific affinity for soluble tombomodulin can be immobilized on a resin, and affinity chromatography can be performed.
  • Preferred examples include the example of a DIP-thrombin-agarose column and the example of an anti-soluble tombomodulin monoclonal antibody column.
  • the DIP-thrombin-agarose column is pre-equilibrated with, for example, 20 mM Tris-HCl buffer (PH7.4) containing 100 mM NaCl and 0.5 mM calcium chloride, and the crude product is charged.
  • a soluble topo-nbomodulin as a purified product. It can.
  • elution with 20 mM Tris-chloride buffer (PH7.4) containing 1.0 M NaCl and 0.5 mM calcium chloride may be performed to obtain a soluble topo-nbomodulin as a purified product. it can.
  • the anti-soluble topo-modomodulin monoclonal antibody column the anti-soluble topo-modo-modulin monoclonal antibody was dissolved in Sepharose 4FF (Pharmacia) previously activated with CNBr.
  • the obtained purified product is adjusted to pH 3.5, and then a cation exchanger, preferably a strong cation, which is equilibrated with a 100 mM daricin hydrochloride buffer containing 0.3 M NaCl (PH3.5).
  • a cation exchanger preferably a strong cation, which is equilibrated with a 100 mM daricin hydrochloride buffer containing 0.3 M NaCl (PH3.5).
  • SP-Sepharose FF Pulicin hydrochloride buffer containing 0.3 M NaCl
  • the non-adsorbed fraction obtained by purification is obtained.
  • the obtained fraction is neutralized with a suitable buffer and can be obtained as a highly purified product. These are preferably concentrated by ultrafiltration.
  • buffer exchange by gel filtration.
  • 20 mM phosphate buffer (pH 7.3) containing 50 mM NaCl developed and confirmed thrombin-promoting activity of protein C.
  • the active fraction was collected and buffer exchanged.
  • Purified products can be obtained.
  • the high-purity purified product thus obtained is preferably filtered using a suitable virus removal membrane, for example, Blanova 15N (Asahi Kasei Corporation) to enhance safety, and then subjected to ultrafiltration for the purpose. Can be concentrated. Finally, filtration through a sterile filtration membrane is preferred.
  • the soluble freeze-dried tombomodulin-containing lyophilized preparation is dissolved in an aqueous solution for dissolution to suppress bubbles generated in the solution when obtaining a solution containing a high concentration of soluble tombo modulin.
  • the foaming suppression method of the present invention substantially completely prevents the generation of air bubbles. It is understood that the foaming suppression effect is obtained when the degree of foaming is improved when foaming is suppressed.
  • freeze-dried #M agent as a measuring material (for example, a 3 mL vial (18 X 33 O, bore size 9.1 ⁇ , manufactured by Namikos), rubber stopper (V5-F8, manufactured by Daikyo Seie))
  • a syringe for injection (1 mL for tuberculin, a syringe needle: 26G 0.45 X 13 mm, manufactured by Terumo) that sucks 1 mL of an aqueous solution for dissolution (for example, injection water from the Japanese Pharmacopoeia, manufactured by Otsuka Pharmaceutical Factory)
  • the time from injection of the aqueous solution for dissolution to measurement of the transmittance should be constant.
  • the freeze-dried lysate is aspirated from the vial and the transmittance is measured.
  • a preferred example is that the time until this is performed is about 15 seconds.
  • the degree of suppression of foaming it is usually preferable that no bubbles are generated so as to appear cloudy when visually observed, and it is more preferable that no bubbles can be visually observed.
  • the transmittance of the solution is preferably 95% or more, more preferably 97% or more, particularly preferably 98% or more, and most preferably 99% or more.
  • the upper limit of the soluble tompomodulin concentration is not particularly limited as long as it is not more than the soluble concentration. However, for example, it is usually 100 mg / mL or less, or 80 mg / mL or less, preferably 60 mg / mL or less, or 50 mg / mL or less, more preferably 40 mg / mL or less, and particularly preferably. Is 30 mg / mL or less.
  • the lower limit of the soluble thrombomodulin concentration is preferably 10 mg / mL or more, or 13 mg / mL or more, more preferably 15 mg / mL or more, or 16 mg / mL or more. 17 mg / mL or more is more preferable, and 20 mg / mL or more is particularly preferable. In addition, 25 mg / mL or more is preferable, and about 30 mg / mL or more is particularly preferable.
  • the concentration is preferably a concentration at which the problem of foaming occurs.
  • foam-suppressing additive The nonionic surfactants listed as the foam-suppressing additive of the present invention (hereinafter, also referred to as foam-suppressing additive) must be usable as pharmaceutical additives. Is preferred, but is not particularly limited.
  • foam-suppressing additive When the nonionic surfactant of the present invention is classified by structure, for example, polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester, polyoxyethylene-polyoxypropylene copolymer, polyoxyethylene alkyl ether, polyoxyethylene fatty acid ester, polyoxyethylene Ethylene hard Castor oil and the like are mentioned as preferred types.
  • polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters examples include monolaurate (Polysorbate 20), monopalmitate (Polysorbate 40), monostearate (Polysorbate 60), tristearate, isostearate, monooleate (Polysorbate 80), and triolate. Examples thereof include Polysorbate 20, Polysorbate 40, Polysorbate 60, and Polysorbate 80, with Polysorbate 80 being particularly preferred.
  • the degree of polymerization of propylene oxide and ethylene oxide is not particularly limited and is not particularly limited. However, preferably, Poloxamer 124, Poloxamer 188, Poloxamer 237, and Poloxamer 338 are used. And poloxamer 407, and particularly preferably, poloxamer 188 and polyoxyethylene (160) polyoxypropylene (30) glycol.
  • polyoxyethylene alkyl ether examples include higher alcohols such as lauryl alcohol, myristyl alcohol, cetyl alcohol, and stearyl alcohol.
  • the degree of polymerization of ethylene oxide is arbitrary, but lauroma crogonore (polyoxyethylene lauryl) can be used. Ether), and those having an addition mole number of ethylene oxide of 9, 21 or 25 are more preferable.
  • polyoxyethylene fatty acid ester examples include, for example, monolaurate, dilaurate, monostearate, distearate, monoolate, and diolate.
  • Polyoxyethylene monostearate is preferable, and depending on the number of moles of oxidized ethylene, Polyoxyl 12 stearate, Polyoxyl 20 stearate, Polyoxyl 40 stearate s Polyoxyl 50 stearate% Polyoxyl 100 force s more preferable, stearate, particularly preferably les is Polyoxyl 40 stearate,.
  • Polyoxyethylene hydrogenated castor oil includes polyoxyl 20 hydrogenated castor oil, Polyoxyl 30 hydrogenated castor oil, Polyoxyl 40 hydrogenated castor oil, and Polyoxyl 50 hydrogenated castor oil (polyoxyethylene hydrogenated castor oil) depending on the number of moles of ethylene oxide added.
  • Polyoxyl 60 hydrogenated castor oil (Ru More if the expression following HC0- 60. is also called polyoxyethylene hydrogenated castor oil 60) is particularly preferred.
  • these nonionic surfactants When these nonionic surfactants are used, they can be used alone or as a mixture of two or more thereof, and can also be used as a mixture with benzyl alcohol / chlorobutanol.
  • the amount of the foam-suppressing additive to be added to the soluble lyophilized preparation of the present invention or to the aqueous solution for dissolving the lyophilized preparation containing the soluble topo-hombomodulin is to suppress foaming.
  • the amount is not particularly limited as long as it is an amount that can be obtained, but it may be appropriately determined according to the concentration of the soluble tonbomodulin and the content of other additives.
  • the inner wall of the container when dissolving the freeze-dried product is coated with silicone, or (c) the pressure in the container when dissolving the freeze-dried product containing soluble tombo modulin is reduced.
  • the above-described method for measuring the degree of generation of bubbles may be 95% or less.
  • Preferred Rukoto to determine the pre-measured and added amount of addition amount is shown a transmittance.
  • the nonionic surfactant is added in an amount of 10 mg / raL by dissolving a lyophilized preparation containing soluble thrompomodulin containing soluble topo-nbomodulin as an active ingredient.
  • the lower limit of the amount of the nonionic surfactant present in the solution is, for example, preferably 0.001 mg or more, more preferably 0. 005 mg or more, more preferably 0.01 mg or more, and in some cases, 0.05 mg or more, or 0.1 mg or more, or even 0.5 mg or more.
  • the upper limit of the nonionic surfactant is usually 10 mg or less, preferably 5 mg or less, more preferably 1 mg or less, and in some cases, 0.5 mg or less.
  • the lower limit of the amount of nonionic surfactant present in this solution is, for example, 0.003 mg or more.
  • An example is mg or more.
  • the upper limit of the nonionic surfactant is, for example, usually 30 mg or less, preferably 15 mg or less, more preferably 3 mg or less, and in some cases, 1.5 mg or less.
  • the amount of addition for example, 10 mg / mL and 30 mg / mL.
  • the amount of the nonionic surfactant present in the solution containing a high concentration of soluble tonbo-modomodulin in mL it is also possible to obtain the ratio by calculating the equivalence based on the concentration of the soluble tonbo-modomodulin. preferable.
  • the method of measuring the transmittance at a wavelength of 650 nm should be determined by, for example, examining the amount of additive that gives a transmittance of 95% or more. Can be. Usually, it will be simple to make the total amount of the plurality of ionic surfactants the addition amount exemplified above, and it is also preferable to add the ionic surfactant to a slightly higher concentration.
  • the foam-suppressing additive benzyl is added.
  • the addition amount of alcohol, chlorobutanol, or a mixture of both substances is not particularly limited as long as foaming can be suppressed, but an appropriate amount depends on the content of soluble tonbomodulin and other additives. Can be added. When using benzyl alcohol or chlorobutanol to exert the foam suppressing effect, it is preferable to add these compounds to the aqueous solution for dissolution.
  • the method of examining the amount of these additives is preferably, for example, a method of measuring the transmittance of the above-mentioned wavelength 650 dish and examining the amount of the additive that shows a transmittance of 95% or more.
  • a specific example for example, when the soluble thrombomodulin-containing lyophilized preparation is dissolved to prepare a high-concentration solution of 10 mg / mL soluble toombombomodulin, the benzyl present in the solution is prepared.
  • the lower limit of the addition amount when alcohol, chlorobutanol, or both substances are mixed is, for example, preferably 0.01 mg or more, more preferably 0.05 mg or more, still more preferably 0.1 mg or more, and in some cases.
  • Examples include 0.5 mg or more, or 1 mg or more, and even 5 mg or more.
  • the upper limit is, for example, usually 100 mg or less, preferably Is 50 mg or less, more preferably 10 mg or less, and in some cases, 5 mg or less.
  • the lower limit of the amount of benzyl alcohol, chlorobutanol, or a mixture of both substances present in this solution should be Is preferably, for example, 0.03 mg or more, more preferably 0.15 mg or more, even more preferably 0.3 mg or more, and sometimes 1.5 mg or more, or 3 mg or more, or even more.
  • An example is 15 mg or more.
  • the upper limit is usually 300 mg or less, preferably 150 mg or less, more preferably 30 mg or less, and in some cases, 15 mg or less.
  • a solution containing a high concentration of soluble tropomodulin other than the above for example, benzyl alcohol, chlorobutanol, etc., which are present in a solution containing 10 mg / mL or 30 mg / mL of a high concentration of soluble topopomodulin, are used.
  • the aqueous solution for dissolution in the present invention is not particularly limited, but includes, for example, distilled water (or water for injection), physiological saline, glucose injection, xylitol injection, and the like, and distilled water is a preferable example. Further, it is preferable that at least one compound selected from the group consisting of a nonionic surfactant, benzyl alcohol, and chlorobutanol is present in the aqueous solution for dissolution.
  • the aqueous solution for dissolution may be distilled water, physiological A saline solution or a glucose injection solution can be used, and it may further contain at least one compound selected from the group consisting of nonionic surfactants, benzyl alcohol and chlorobutanol.
  • the freeze-dried preparation contains a nonionic surfactant instead of benzyl alcohol and chlorobutanol.
  • the aqueous solution for dissolution is selected from the group consisting of a nonionic surfactant, benzyl alcohol and chlorobutanol.
  • a foam-suppressing action can be exhibited, which is also preferable.
  • the foam suppressing additive is added to the aqueous solution for dissolution, the amount of the foam suppressing additive is not particularly limited as long as the foam suppressing effect is exhibited effectively.
  • the amount exemplified above is preferable as the addition amount of the solution containing a high concentration of oral mombomodulin with respect to the concentration of soluble tongu modulin.
  • the amount of the nonionic surfactant added to the aqueous solution for dissolution is not particularly limited as long as the foaming suppressing effect is exhibited effectively, and may be appropriately determined by measuring as described above. It is good, but for simplicity, the amount of nonionic surfactant, benzyl alcohol, or octabutanol in the aqueous solution for dissolution, which is a guideline under conditions such as the concentration of soluble soluble topopomodulin, is shown below. Is exemplified. That is, for nonionic surfactants, the upper limit of the amount to be added is, for example, usually 100 mg or less, or 50 mg or less, preferably 30 mg or less, or 10 mg or less per 1 mL of distilled water.
  • the lower limit is, for example, 0.001 mg or more, preferably 0.01 mg or more, more preferably 0.03 mg or more, particularly preferably 0.05 mg or more, or 0.1 mg or more.
  • the upper limit of the amount of benzyl alcohol added to 1 mL of distilled water is usually 50 mg or less, or 40 mg or less, preferably 30 mg or less, more preferably 20 mg or less, or 10 mg or less. mg or less.
  • the lower limit is, for example, 0.1 mg or more, or 1 mg or more, preferably 4 mg or more, or 5 mg or more, more preferably 7 mg or more, and particularly preferably 10 mg or more.
  • the upper limit of the amount of butanol added is, for example, generally 20 mg or less, or 15 mg or less, preferably 10 mg or less, or 8 mg or less, more preferably, as the upper limit of the amount added to 1 mL of distilled water. Is 7 mg or less, or 5 mg or less.
  • the lower limit is usually 0.1 mg or more, or 1 mg or more, preferably 2 mg or more, more preferably 3 mg or more, and particularly preferably 5 mg or more.
  • the volume of the aqueous solution for dissolution is not particularly limited from a small amount to a large amount, but when subcutaneous injection or intramuscular injection is considered, it is usually 0.1 mL or more, preferably 0.3 mL or more, and more preferably 0.3 mL or more.
  • An example is 5 mL or more.
  • the upper limit of the volume is usually 10 mL or less, preferably 5 mL or less, more preferably 3 mL or less, particularly preferably 2 mL or less, or 1.5 mL or less.
  • its capacity is Usually, from about 0.5 mL to about 1 mL is particularly preferred.
  • the osmotic pressure ratio is preferably such that pain is not felt when the preparation is administered, but is usually preferably 0.5 or more, more preferably 0.8 or more.
  • the upper limit is preferably 2.0 or less, more preferably 1.5 or less, and particularly preferably 1.2 or less.
  • a soluble thrompomodulin-containing lyophilized preparation or a kit preparation thereof may be prepared by adding the above-mentioned soluble topombomodulin and other foam-suppressing additives to another Is not particularly limited as long as it does not hinder foaming, and includes, for example, arginine and other amino acids or salts thereof, saccharides such as mannitol and trehalose, and urea. And other commonly used additives can be added.
  • a freeze-dried preparation containing only soluble tombo modulin or a freeze-dried preparation comprising soluble tombo modulin and an antifoaming additive may be used without containing these compositions.
  • the freeze-dried formulation containing pomodulin is also optimally stable and optimal.
  • the composition of arginine, trenodulose or urea is also a preferred example.
  • the soluble thrombomodulin-containing lyophilized preparation contains (1) glutamic acid or a salt thereof and mannitol, and (2) glutamic acid or a salt thereof and lysine or a salt thereof. Or (3) glutamic acid or a salt thereof and aspartic acid or two of its salt, or (4) aspartic acid or its salt and mannitol of two. And at least one compound selected from the group consisting of nonionic surfactants, benzyl alcohol and chlorobutanol in the freeze-dried preparation containing soluble tombo modulin.
  • the osmotic pressure ratio at the time of dissolution is preferably 0.5 to 2.0.
  • the present invention provides the freeze-dried preparation containing soluble thrombomodulin, wherein the freeze-dried preparation containing (1) urea or (2) urea and an amino acid is further contained in the freeze-dried preparation containing soluble thrombomodulin.
  • At least one compound selected from the group consisting of a nonionic surfactant, benzyl alcohol, and chlorobutanol is present and / or to dissolve the lyophilized preparation containing the soluble tolombombomodulin;
  • High concentration of soluble tonbomodulin characterized in that at least one compound selected from the group consisting of nonionic surfactants, benzyl alcohol, and chlorobutanol is present in the aqueous solution for dissolution of This is a method for suppressing foaming of a solution.
  • freeze-dried preparation containing soluble thrombomodulin can be dissolved in 0.1 mL to 2 mL of an aqueous solution for dissolution, and a high-concentration solution containing 10 mg / mL or more of soluble tobacco tombomodulin can be prepared.
  • the osmotic pressure ratio is between 0.5 and 2.0.
  • the present invention provides the lyophilized preparation containing soluble thrombomodulin, wherein the lyophilized preparation contains arginine, glutamic acid, proline, serine, glycine, histidine, asparagine, lysine, phenylalanine and valine, and salts thereof, trehalose, lactose, and sucrose.
  • the lyophilized preparation contains arginine, glutamic acid, proline, serine, glycine, histidine, asparagine, lysine, phenylalanine and valine, and salts thereof, trehalose, lactose, and sucrose.
  • Nonionic surfactants benzyl alcohol, and chlorobutanol are added to the aqueous solution for dissolving the lyophilized preparation containing at least one selected compound and the soluble tropomodulin containing the at least one compound.
  • the high-concentration soluble thrombomodulin-containing solution containing the foam-suppressing additive is expected not only to suppress foaming during dissolution but also to have an effect of defoaming on shaking. It is preferable to include benzyl alcohol chlorobutanol.
  • the inner wall of the container used for dissolving the lyophilized preparation containing soluble tombo modulin is coated with silicone.
  • the container for dissolving the lyophilized preparation containing soluble tombomodulin according to the present invention is not particularly limited as long as it is a material and shape suitable for aseptically filling and usable as a container for pharmaceuticals.
  • the container is preferably a container suitable for enclosing the freeze-dried preparation containing thrombomodulin. Usually, it is preferable to use the container enclosing the freeze-dried preparation containing soluble thrompomodulin as it is when dissolving it.
  • Examples of the material of the container for dissolving the freeze-dried preparation containing soluble tombo modulin in the present invention include glass or polypropylene, polyethylene, cyclic polyolefin, copolymer of cyclic polyolefin and ⁇ -olefin, polyethylene terephthalate, polystyrene, ABS resin. , Polyester, polyvinyl chloride, nylon, polytetrafluoroethylene, polymethylpentene, hexafluoride resin, plastics such as polymethyl methacrylate, polycarbonate, stainless steel, gold, aluminum, aluminum alloy, titanium alloy Metal, ceramics, a composite material such as a carbon composite material, and quartz, but are not limited thereto.
  • alkali-treated glass For the glass, it is preferable to use alkali-treated glass.
  • the dealkalization treatment is performed, for example, by contacting the glass with an aqueous solution of ammonium sulfate and heating it to a high temperature, or by washing the glass surface or by contacting the glass surface with a water-soluble sulfur oxide such as sulfurous acid gas at a high temperature. It can be carried out by a method in which the sulfur component is converted into fine sulfate crystals and then washed.
  • the plastics polypropylene, cyclic polyolefin, and a copolymer of cyclic polyolefin and OL resin are preferable. Further cyclic polyolefin Is particularly preferred.
  • the inner wall of the container for dissolving the lyophilized preparation containing soluble tombomodulin according to the present invention may be, for example, a container that can be contacted with the lysate in the container when the container is stoppered (in the case of an ampoule or the like, sealed). Refers to the part.
  • the coating with silicone applied to the inner wall of the container for dissolving the lyophilized preparation containing soluble topompomodulin can be used.
  • the silicone include silicone oils such as dimethylpolysiloxane and methylhydrogenpolysiloxane, and methyl varnish silicone and methylphenyl varnish silicone.
  • the method of coating the silicone is a usual method, for example, a treatment of dipping the entire container in a silicone solution, a treatment of spraying the silicone solution on the inner wall of the container, or a method of injecting the silicone solution into the container and applying the silicone solution to the inner wall. It can be obtained by evaporating the solvent after treatment such as discharging excess silicone solution after contact.
  • the solvent for the silicone solution examples include carbon tetrachloride and trichloroethylene. From the viewpoint of the safety of the solvent, it is also preferable to use an aqueous emulsion prepared by oxidizing silicone.
  • the glass is preferably heated at a high temperature of 100 to 800 ° C, more preferably at a high temperature of 250 to 350 ° C. It is desirable that the temperature is such that the resin does not soften. Also, it is usually considered convenient to express the amount of silicone by the concentration of the silicone solution to be adhered. For example, concentration l w / v ° /.
  • the amount of silicone coating on the inner wall of the container is the lower limit.
  • the above is preferable, more preferably 0.05 w / v% or more, further preferably 0.1 w / v% or more, in some cases 0.5 or more, or 1 w / v% or more, and further 2 w / v% or more.
  • V / The above is a preferred example.
  • the upper limit is usually 10 w / v% or less, preferably 7 w / v% or less, and more preferably 5 w / v%. /. Below, in some cases 2 w / v ° /. The following are mentioned.
  • the pressure in the container when the soluble thrombomodulin-containing lyophilized preparation is dissolved is in a reduced pressure state. That is, in the foaming suppressing method of the present invention, it is preferable that the pressure in the container when dissolving the freeze-dried preparation containing soluble thrompomodulin is reduced. Normally, it is understood that the pressure in the container is lower than the atmospheric pressure (760 mmHg), and any method may be used to create a reduced pressure state, for example, when dissolving the lyophilized preparation. After injecting the aqueous solution for dissolution with a syringe, the gas in the container is sucked with the syringe to reduce the pressure from atmospheric pressure.
  • the gas in the container is suctioned in advance with an empty syringe or a syringe connected to a vacuum pump before the dissolving step.
  • the depressurized state of the pressure in the container when dissolving the lyophilized formulation containing soluble tombo modulin is, for example, a state in which the pressure is reduced by 200 mmHg from the atmospheric pressure (760 thigh Hg) may be referred to as a decompression degree of -200 mmHg. . If the pressure is reduced in advance to achieve the set decompression during dissolution, confirm the change in the volume of the added aqueous solution for dissolution, determine the initial decompression, and determine the initial decompression before dissolution. It is preferable to reduce the pressure to a reduced pressure. The initial degree of pressure reduction may be determined by the method described in the examples or other appropriate methods.
  • the preferable pressure in the container for suppressing foaming slightly varies depending on the volume, type, and amount of the aqueous solution for dissolution.
  • the pressure is preferably reduced so as to show a transmittance of 95% or more, and there is no particular limitation.
  • freeze-drying containing soluble thrombomodulin in a 3 mL vial »When dissolving the agent with 1 mL of an aqueous solution for dissolution, the lower limit of the pressure in the container is preferably -50 mmHg or more, and -100 nraiHg or more.
  • the upper limit is usually -600 mmHg or less, preferably -500 mmHg or less, more preferably -400 mmHg or less, and in some cases -300 mmHg or less.
  • the present invention provides a soluble agent having the above-mentioned foaming inhibitory effect, and Z or a stabilizing effect described later. It is intended to provide a freeze-dried preparation containing tombo modulin, and a kit preparation in which the freeze-dried preparation and its dissolving water are combined intensely.
  • the present invention relates to a lyophilized preparation containing soluble tombo modulin containing soluble tombo modulin as an active ingredient, or a kit preparation in which the lyophilized preparation containing the soluble tombo modulin is combined with an aqueous solution for dissolution thereof.
  • the lyophilized preparation containing soluble topomodulin is for preparing a solution containing 10 mg / mL or more of high concentration of soluble tropomodulin
  • the dry preparation contains at least one compound selected from the group consisting of a nonionic surfactant, benzyl alcohol and chlorobutanol, and / or a freeze-dried preparation containing the soluble tombo modulin.
  • Non-ionic surfactant benzyl alcohol, chlorobutano (B) that the inner wall of the container used for dissolving the lyophilized preparation containing soluble tobonum modulin is coated with silicone, or c) the pressure in the container at the time of dissolving the lyophilized preparation containing soluble tombo modulin is in a reduced pressure state; Or a kit preparation thereof.
  • the present invention relates to a freeze-dried preparation containing soluble tombo modulin containing soluble thrombomodulin as an active ingredient, or a combination of the freeze-dried preparation containing soluble tombo modulin and an aqueous solution for dissolving the same.
  • a kit preparation wherein the lyophilized preparation containing soluble thrombomodulin is used to prepare a high-concentration solution containing 10 mg / mL or more of soluble thrombomodulin, wherein the lyophilized preparation containing soluble thrombomodulin is used.
  • glutamic acid or a salt thereof and mannitol include glutamic acid or a salt thereof and mannitol; (2) glutamic acid or a salt thereof and lysine or a salt thereof; (3) glutamic acid or a salt thereof and Aspara And (4) aspartic acid or a salt thereof, and / or mannitol, and a freeze-drying method containing the soluble topoamphomodulin.
  • aqueous solution for dissolution can be dissolved in 0.1 niL to 2 niL aqueous solution for dissolution, and a solution containing 10 mg / mL or more of high-concentration soluble toombombomodulin can be adjusted, and the osmotic pressure ratio at the time of dissolution is 0.5. From 2.0 to 2.0.
  • the present invention also relates to a lyophilized preparation containing soluble tombomodulin having soluble tonpomodulin as an active ingredient, or a kit preparation comprising a combination of the lyophilized preparation containing soluble tombomodulin and an aqueous solution for dissolution thereof.
  • the lyophilized preparation containing soluble toombombomodulin is for preparing a solution containing 10 mg / mL or more of high-concentration soluble toombotombomodulin, and the lyophilized preparation containing soluble thrombomodulin contains (1) ) Including two types of glutamic acid or its salt and mannitol; (2) Including two types of glutamic acid or its salt and lysine or its salt; (3) Glutamic acid or its salt, and aspartic acid or its salt Or (4) Aspartic acid or its salt, and mannitol Lyophilized containing 0.1 to 2 raL of the aqueous solution for dissolution, and containing 10 mg / mL or more of soluble tobacco.
  • a solution containing a high concentration of oral npomodulin can be prepared, the osmotic pressure ratio at the time of dissolution is 0.5 to 2.0, and the non-ionic surfactant, benzyl alcohol, A lyophilized preparation containing soluble tobonum modulin, characterized in that at least one compound selected from the group consisting of chlorobutanol is present.
  • (b), or (, as described above, is preferably a combination thereof.
  • the present invention relates to a lyophilized preparation containing soluble tonpomodulin containing soluble tonpomodulin as an active ingredient, or What is claimed is: 1.
  • a kit preparation comprising a combination of the above-mentioned lyophilized preparation containing soluble topompomodulin and an aqueous solution for dissolving the same, wherein the lyophilized preparation containing soluble topompomodulin contains a high concentration of soluble topombomodulin of 10 mg / mL or more.
  • the soluble topoprotein is prepared.
  • Modulin-containing freeze-dried preparations include (1) glutamic acid or a salt thereof, and mannitol; (2) glutamic acid or a salt thereof, and lysine or a salt thereof; (3) glutamic acid or a salt thereof And (4) aspartic acid or a salt thereof, and mannitol, and (2) the soluble thrombomodulin.
  • the lyophilized preparation can be dissolved in 0.1 to 2 mL of dissolution aqueous solution to prepare a high-concentration solution of soluble thrombomodulin of 10 mg / mL or more, and the osmotic pressure ratio during dissolution is 0.5 to 2
  • the aqueous solution for dissolving the freeze-dried preparation containing the soluble thrombomodulin contains a nonionic surfactant, benzyl alcohol ⁇ .
  • the present invention relates to a lyophilized preparation containing soluble tombo modulin which contains soluble tombo modulin as an active ingredient, or a kit preparation comprising a combination of the lyophilized preparation containing the soluble tombo modulin and an aqueous solution for dissolving the same.
  • the lyophilized preparation containing soluble thrombomodulin is for preparing a solution containing a high concentration of soluble thrombomodulin of 10 mg / raL or more, and the lyophilized preparation containing soluble thrombomodulin comprises: (1) glutamic acid (2) glutamic acid or a salt thereof, and lysine or a salt thereof; (3) glutamic acid or a salt thereof, and aspartic acid or a salt thereof.
  • the agent can be dissolved in 0.1 mL to 2 mL of an aqueous solution for dissolution, and the soluble tron is more than 10 mg / mL.
  • a solution containing a high concentration of pomodulin can be prepared, the osmotic pressure ratio at the time of dissolution is 0.5 to 2.0, and the lyophilized preparation containing soluble tombo modulin contains a nonionic surfactant, benzyl At least one compound selected from the group consisting of alcohol and chlorobutanol is present, and furthermore, non-aqueous
  • (b) or (C), or a combination thereof is preferable as described above.
  • the properties and concentrations of soluble tombo modulin contains a nonionic surfactant, benzyl At least one compound selected from the group consisting of alcohol and chlorobutanol is present, and furthermore, non-aqueous
  • V is the same as the foaming suppression method described above.
  • the present invention relates to a method for stabilizing soluble tombo modulin in a lyophilized preparation containing soluble tombo modulin which contains soluble tombo modulin as an active ingredient, comprising the steps of (1) glutamic acid or a salt thereof, and mannitol.
  • a high-concentration solution of soluble tobombomodulin at a concentration of at least 10 mg / mL, preferably at least 15 or 17 mg / mL, can be prepared.
  • a stabilization method of soluble preparative port Nbomojurin in the soluble preparative port Nbomojurin containing freeze-dried preparation characterized by osmotic pressure ratio when it is 2.0 from 0.5.
  • the present invention relates to a lyophilized preparation containing a high concentration of soluble tonpomodulin that contains soluble tonpomodulin as an active ingredient at a concentration of 10 mg / mL or more, preferably 15 or 17 mg / mL or more. Or a salt thereof, and mannitol, and the preparation can be dissolved in 0.1 mL to 2 mL of an aqueous solution for dissolution.
  • the present invention provides a freeze-dried preparation containing a high concentration of soluble tombo modulin containing at least 10 mg / mL, preferably at least 15 or 17 mg / mL of soluble tombo modulin as an active ingredient, comprising glutamic acid or a salt thereof. And lysine or a salt thereof, and the preparation can be dissolved in 0.1 to 2 mL of an aqueous solution for dissolution, and the osmotic pressure ratio at the time of dissolution is 0.5 to 2. It is a lyophilized preparation containing a high concentration of soluble tonbomodulin at a concentration of 0.
  • the present invention is a lyophilized preparation containing a high concentration of soluble tonpomodulin which contains soluble tonpomodulin as an active ingredient at 10 mg / mL or more, preferably 15 or 17 mg / mL or more, and comprises glutamic acid or a salt thereof. And aspartic acid or a salt thereof, and the preparation is soluble in 0.1 to 2 mL of an aqueous solution for dissolution, and has an osmotic pressure ratio of 0.5 to 2. 0, which is a freeze-dried; M agent containing a high concentration of soluble tombo modulin.
  • the present invention also provides a lyophilized preparation containing a high concentration of soluble topompomodulin containing 10 mg / mL or more, preferably 15 or 17 mg / mL or more of soluble topombomodulin as an active ingredient, comprising aspartic acid or a salt thereof.
  • a lyophilized preparation containing a high concentration of soluble topompomodulin containing 10 mg / mL or more, preferably 15 or 17 mg / mL or more of soluble topombomodulin as an active ingredient, comprising aspartic acid or a salt thereof.
  • mannitol and that the preparation can be dissolved in 0.1 mL to 2 mL of an aqueous solution for dissolution, and that the osmotic pressure ratio at the time of dissolution is 0.5 to 2.0. It is a lyophilized preparation containing a high concentration of soluble tombomodulin.
  • the properties and structure of the above-mentioned soluble tonpomodulin can be cited, and the same applies to the concentration of a solution containing a high concentration of soluble tonpomodulin or an aqueous solution for dissolution.
  • the solution volume of the high-concentration soluble tombo modulin-containing solution of the present invention is from 0.1 raL to 2 mL, and the osmotic pressure ratio of the solution is from 0.5 to 2.0.
  • the osmotic pressure ratio is preferably such that pain is not felt at the time of administration of the preparation, but is generally preferably 0.5 or more, more preferably 0.8 or more.
  • the upper limit is preferably 2.0 or less, more preferably 1.5 or less, and particularly preferably 1.2 or less.
  • the osmotic pressure ratio of the present invention is determined by the ratio of the sample solution to the osmolality given by the physiological saline solution.
  • the ratio is defined as the smol concentration (14th revision of the Japanese Pharmacopoeia, osmotic pressure measurement method), and the osmol concentration of the physiological saline solution (0.900 g / 100 mL) is constant (286 m0sm).
  • the glutamic acid of the present invention may be either the D-form or L-form which is an optically active form, or the racemic form which is a mixture thereof, but is preferably the L-form.
  • the salt of glutamic acid is preferably a water-soluble salt, and for example, an acid addition salt thereof is a preferred example.
  • an acid addition salt the acid that can be added is usually hydrochloric acid, sulfuric acid, nitric acid, acetic acid, phosphoric acid, oxalic acid, citric acid, tartaric acid, etc., and is preferably hydrochloric acid, acetic acid, or phosphoric acid.
  • hydrochloric acid is used.
  • an ammonium salt is mentioned as a preferred example.
  • a salt with an alkali metal or an alkaline earth metal is also a preferred example.
  • the alkali metal include sodium, potassium, lithium and the like, preferably sodium and potassium, and more preferably sodium.
  • a salt with an alkaline earth metal is also a preferred example.
  • the alkaline earth metal include magnesium, calcium, beryllium and the like, preferably magnesium and calcium, and more preferably calcium.
  • These glutamic acids and salts thereof can be used as appropriate hydrates in addition to anhydrides. Specifically, sodium glutamate monohydrate is a preferred example. When considering the amount of glutamic acid and its salts to be added, unless otherwise specified, it is expressed as the converted value of free glutamic acid.
  • Mannitol may be in any of the D-form or L-form, or a mixture thereof, but D-mannitol is a preferred example.
  • Trehalose may be either the D-form or the L-form, or a mixture thereof.
  • an appropriate hydrate can be used.
  • D-trehalose dihydrate is a preferred example.
  • Lysine also referred to as lysine
  • the lysine salt is preferably a water-soluble salt, for example, a preferred example thereof is an acid addition salt
  • an acid addition salt hydrochloric acid, sulfuric acid, nitric acid, acetic acid is usually used as an acid to be added.
  • Phosphoric acid, oxalic acid, citric acid, tartaric acid, etc. preferably hydrochloric acid, acetic acid, phosphoric acid, and more preferably hydrochloric acid.
  • Other suitable hydrates can be used, specifically, lysine hydrate is a preferable example.
  • lysine taminate anhydride ⁇ lysine tamate dihydrate it is also preferable to collectively use, for example, lysine taminate anhydride ⁇ lysine tamate dihydrate. No. When considering the amount of this lysine taminate dihydrate, it is expressed as a converted value for lysine and glutamic acid separately.
  • Aspartic acid may be either the D-form or L-form which is an optically active form, or the racemic form which is a mixture thereof, but is preferably the L-form.
  • the salt of aspartic acid is preferably a water-soluble salt.
  • a salt with an alkaline metal or an alkaline earth metal is also a preferred example.
  • the alkali metal include sodium, potassium, lithium and the like, preferably sodium and potassium, and more preferably sodium.
  • a salt with an alkaline earth metal is also a preferred example.
  • the alkaline earth metal include magnesium, calcium, beryllium and the like, preferably magnesium and calcium, and more preferably calcium.
  • any of these aspartic acid and its salts can be used as appropriate hydrates in addition to anhydrides. Specifically, sodium aspartate monohydrate is a preferred example.
  • the value is expressed as the converted value of the free form of aspartic acid.
  • proline, serine, glycine, histidine, asparagine, and fenilalanine valine of the present invention any of the optically active D-form or L-form or a racemic mixture thereof is used. The body may be wrong!
  • the salt is preferably a water-soluble salt, and for example, a salt with an alkali metal or an alkaline earth metal is also a preferred example.
  • these amino acids and salts thereof not only anhydrides but also appropriate hydrates can be used.
  • arginine is preferably arginine hydrochloride.
  • the ratio of the amounts of the above-mentioned Stabilizing additives to be added to the preparation of the present invention is preferably 50:50 to each other, and 60:40 to 40:60 is also a preferable example. And 80:20 to 20:80.
  • the addition amount of each can be appropriately selected.
  • the lower limit of the addition amount per 1 mg of soluble thrombomodulin is usually 0.0001 mmol or more, preferably 0.0003 mmol or more, more preferably 0.0007 mmol. As described above, particularly preferably, 0.001 mmol or more is exemplified.
  • the upper limit of the amount added per 1 mg of soluble tobombomodulin is usually 1 mmol or less, preferably 0.7 ramol or less, more preferably 0.3 mmol or less, and particularly preferably 0.1 ramol or less. Is exemplified.
  • the above-mentioned addition amount is not particularly limited as long as it shows the stabilizing effect of the present invention and the addition amount can be adjusted so that the osmotic pressure ratio is in the range of 0.5 to 2.0. In the case of an additive that dissociates (dissociates) when dissolved in water as described above, the osmotic pressure ratio increases.
  • the amount of addition should be appropriately adjusted to the required osmotic pressure ratio by increasing or decreasing the amount of addition described in the above example. Is preferred.
  • pharmaceuticals may be used as other components. Isotonic agents, buffering agents, thickeners, preservatives, preservatives, soothing agents, pH regulators, and the like, which are acceptable as additives, may be added as appropriate.
  • surfactants include polyoxyethylene hydrogenated castor oil 60, Tylene-hardened castor oil 50, polysorbate 80, polysorbate 20, polyoxyethylene (160) polyoxypropylene (30) glycol, and the like.
  • an appropriate method can be adopted.
  • an appropriate amount of the soluble tombo modulin and the above-mentioned additive or a solution thereof are mixed simultaneously or sequentially. It can be prepared by preparing a mixed solution of all the compositions and freeze-drying by a known method.
  • the method for adding the above-mentioned foam suppressing additive, the Z or stabilizing additive, and the additives of other components may be a method of directly adding to a solution containing a high-concentration soluble soluble tombomodulin, or a method of previously suppressing foaming.
  • Examples include a method in which an additive, a stabilizing additive, and additives of other components are dissolved in water, water for injection, or an appropriate buffer, and then added to a solution containing a high concentration of soluble thrompomodulin.
  • the timing of addition may be any time, but preferably during the purification process or the concentration process of the soluble tombomodulin, more preferably during the formulation process.
  • the pH of the solution containing a high concentration of soluble thrombomodulin during the formulation step is particularly preferably around neutral.
  • the lower limit of the pH is usually pH 4 or higher, preferably pH 5 or higher, more preferably pH 6 or higher, and particularly preferably pH 6.5 or higher.
  • pH 11 or less is illustrated as the upper limit of the pH, preferably P H 10 or less, more preferably pH 9 hereinafter, and still more preferably pH 8 or less, particularly preferably exemplified pH 7. 5 below.
  • the pH adjuster include hydrochloric acid, acetic acid, citric acid, phosphoric acid, sodium dihydrogen phosphate, sodium hydrogen phosphate, sodium hydroxide, and sodium hydroxide, and preferably hydrochloric acid, hydroxy acid, and the like. And sodium.
  • the timing of the adjustment is not particularly limited, but is preferably immediately before the aseptic filtration step.
  • a purification step or a concentration step of a soluble thrombomodulin may be used.
  • the adjustment method is not particularly limited, but the pH of the sampled solution is measured with a pH measuring device. For example, if the pH is low, the pH may be adjusted by dropping an aqueous sodium hydroxide solution.
  • a solution containing the soluble thrombomodulin obtained by force and the foaming inhibitor, stabilizing additive, or other additives to be added as necessary is filled in a container, and sealed as it is to obtain a formulation.
  • freeze-drying is more preferable.
  • the freeze-drying method is not particularly limited, and can be freeze-dried by a usual method.
  • foam-suppressing additive when the above-mentioned foam-suppressing additive is present in the freeze-dried preparation containing soluble tombomodulin by a freeze-drying method, a nonionic surfactant is preferred as the foam-suppressing additive. ,.
  • a particularly preferable example of the amount of the solution to be filled in the container and freeze-dried is 0.5 to 1.0 mL. That is, the lower limit is preferably 0.1 mL or more, more preferably 0.3 mL or more, and particularly preferably 0.5 mL or more.
  • the upper limit of the amount of the solution is typically 10 mL or less, preferably 5 mL or less, more preferably 2 mL or less, and particularly preferably 1 mL or less.
  • the high-concentration soluble tonpomodulin concentration-containing preparation of the present invention usually contains 5 nig or more, preferably 10 mg or more, and more preferably 15 mg or more, per soluble preparation of the soluble tonpomodulin. Furthermore, 17 mg or more is preferable, 20 mg or more, or 25 mg or more is more preferable, and particularly preferable is 30 mg or more.
  • the container is as described above, but is not particularly limited as long as it can be used as a container for pharmaceuticals and is suitable for aseptic filling, and the shape is not particularly limited.
  • glass vials (and stoppers), glass Examples include syringes made of rubber (and rubber caps and stoppers), ampoules made of glass, etc.
  • Other plastic containers can also be used.
  • a kit preparation in which an aqueous solution for dissolution is combined with or attached to a freeze-dried preparation is preferable. The freeze-dried preparation and the aqueous solution for dissolution are filled in separate containers, for example, freeze-dried.
  • a preferred example is a kit preparation comprising a combination of a glass-made vial in which the preparation is aseptically filled and a prefilled syringe in which an aqueous solution for dissolution is aseptically filled.
  • a glass or plastic double chamber or dual chamber two-chamber syringe one syringe has two chambers, for example, A dried solution and an aqueous solution for dissolution are enclosed in the other chamber.
  • two chambers are separated during production or distribution, and a type in which two chambers are combined and used to dissolve one body during use is also preferable.
  • the high-concentrated soluble topopomodulin-containing preparation of the present invention can be stored as a preparation at the time of distribution or until use, for several months to several years.
  • the administration method can be a generally used administration method, that is, a parenteral administration method, for example, intravenous administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, etc., and particularly, intramuscular administration, subcutaneous administration. Is most preferably used.
  • a lyophilized preparation it can be dissolved in water, for example, distilled water (or water for injection), and administered to patients at the time of use.
  • about 0.1 mL to 2 mL, preferably about 0.3 mL to 1.5 mL, particularly preferably about 0.5 mL to about 1 mL is exemplified.
  • the dose of the high-concentration soluble topopomodulin-containing preparation of the present invention varies depending on the patient's age, body weight, degree of disease, administration route and the like, but generally, the amount of soluble thrombomodulin is 0.001 to 5 per body weight. mg / kg, preferably 0.02 to 2 mg / kg, more preferably 0.05 to 1 mg / kg, particularly preferably 0.1 to 0.5 mg / kg, and 1 Administer once a day or several times as needed.
  • the administration interval may be daily, but preferably once every 2 to 14 days, more preferably once every 3 to 10 days, even more preferably once every 4 to 7 days. is there.
  • intramuscular administration and subcutaneous administration are preferable since the blood concentration is maintained for a long period of time and the administration interval can be lengthened.
  • the present invention also relates to a method for stabilizing soluble tombo modulin in a lyophilized preparation containing soluble tombo modulin containing soluble thrombomodulin as an active ingredient, comprising: (1) urea, or (2) urea and an amino acid.
  • the lyophilized preparation containing soluble thrombomodulin can be dissolved in 0.1 mL to 2 mL of a dissolution water solution, and a solution containing 10 mg / mL or more, preferably 20 mg / mL or more, containing a high concentration of soluble thrombomodulin, is dissolved.
  • a soluble lyophilized formulation containing tombomodulin characterized by having an osmotic pressure ratio of 0.5 to 2.0 upon dissolution. It is a method of stabilizing sex tobombomodulin and is the most suitable formulation.
  • the soluble tombo modulin of the present invention is the same as described above, and its content in the preparation is the same as described above.
  • the content is exemplified, and more preferably, the content is 20 mg / mL or more, 25 mg / mL or more, or 30 mg / mL or more.
  • the urea may be an acid addition salt, for example, urea phosphate, urea nitrate, etc., preferably urea.
  • an acid addition salt for example, urea phosphate, urea nitrate, etc., preferably urea.
  • Preferred amino acids that can be combined with urea include glutamic acid or a salt thereof, and aspartic acid or a salt thereof. Detailed examples of these amino acids and salts thereof are as described above.
  • the ratio, amount and osmotic pressure ratio of the additives are the same as described above. Basically, the above disclosure can be referred to for the production method, administration method, dose and the like. In addition, as described above, these compositions can also be used as a high-concentration soluble soluble tombomodulin-containing preparation or a kit preparation thereof in the foam control method.
  • L-sodium glutamate monohydrate (special grade, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), D (-)-mannitol (special grade, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), L-lysine hydrochloride (special grade, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • L-lysine-L-glutamate dihydrate (Ajinomoto Co., Ltd.), sodium L-asparaginate monohydrate (special grade, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), urea (Kosaka Pharmaceutical Co., Ltd.), L-arginine hydrochloride (special grade, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), sucrose (special grade, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), D-trehalose dihydrate (special grade, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), Polysorbate 80 ( Nikko Chemicals Co., Ltd.), Polysorbate 20 W
  • the soluble thrombomodulin used in the examples was produced according to the method of Yamamoto et al. (The method described in Example 10 of JP-A-64-6219), and further obtained by concentration by ultrafiltration. That is, DNA encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 can be used.
  • a peptide having at least -132 amino acids (hereinafter sometimes abbreviated as TME456H) was obtained.
  • the above-described site-specific mutation was performed using a DNA fragment containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 and the synthetic DNA for mutation having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 9, and DNA encoding the amino acid sequence (specifically, consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6 in the Sequence Listing) was obtained.
  • This DNA sequence was transfected into CH0 cells, and the active fraction was purified from the culture of the transformed cells by the above-mentioned or a conventional purification method using a 20 mM phosphate buffer (pH 7.3) containing 50 mM NaCl. High-purity Acquired the product.
  • ultrafiltration was performed to reduce the soluble thrombomodulin concentration.
  • a peptide having at least 60-mg / mL of the amino acid sequence 19-516 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 (hereinafter abbreviated as TMD123HM) was obtained.
  • TMD123HM the amino acid sequence 19-516 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5
  • DNA fragment containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 and the synthetic DNA for mutation having the base sequence shown in SEQ ID NO: 9 was performed, and DNA encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 (specifically, consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 8 in the Sequence Listing) was obtained.
  • TME456HM a peptide having at least amino acids 19 to 132 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 (hereinafter, abbreviated as TME456HM) was obtained by the method described above. I got it.
  • Rubber Co., Ltd. (manufactured by Daikyo Seie Co., Ltd.) Perform the freeze-drying process under the following conditions in the following order: half stoppering ⁇ freeze-drying ⁇ nitrogen filling ⁇ rubber stopper stoppering ⁇ cap wrapping.
  • a high-concentrated preparation of soluble tongue-bombomodulin containing 30 mg of sodium L-glutamate monohydrate 0.055 mmol, D (-)-mannitol 0.05% was obtained (Example 1-1-1). .
  • Example 1-1-2 Example 1-1-3, Example 1-1-4
  • TMD123HM (Example 1-1-2), TME456H (Example 1-1-3), and TME456HM (Example 1) were used in place of TMD123H in Example 1-1-1 by changing the type of soluble tonpomodulin.
  • Example 1-1-4 a preparation containing a high concentration of soluble tonbu mombomodulin was obtained according to each of the above methods.
  • Example 1 In the same manner as in Example 11-11, high-concentration soluble topopomodulin-containing preparations described in Table 1 were obtained (as described above, Examples 3-1 and 1-3-2, respectively).
  • Example 1- In the same manner as in Example 11-11, high-concentration soluble topopomodulin-containing preparations described in Table 1 were obtained (as described above, Examples 3-1 and 1-3-2, respectively).
  • Example 11-11 high-concentration soluble tombo modulin-containing preparations shown in Table 1 were obtained (similar to the above, Example 1-4-1 and Example 1-4-2, Example 1-
  • Example 1-5-4 was prepared).
  • Example 1 In the same manner as in Example 1-1, high-concentration soluble topopomodulin-containing preparations shown in Table 1 were obtained (similar to Example 1-6-1 and Example 1-6-2, respectively).
  • Example 1- In the same manner as in Example 1-1, high-concentration soluble topopomodulin-containing preparations shown in Table 1 were obtained (similar to Example 1-6-1 and Example 1-6-2, respectively).
  • Example 1-6-4 was prepared).
  • Example 11-11 high-concentration soluble tombombomodulin-containing preparations shown in Table 1 were obtained (similar to the above, Example 1-7-1, Example 1-7-2, Example 1-
  • Example 1-7-4 was prepared).
  • Example 1 In the same manner as in Example 11-11, a high-concentration soluble tombombomodulin-containing preparation shown in Table 1 was obtained (as described above, Example 1-8-1 and Example 1-8-2, respectively).
  • Example 1-8-1 and Example 1-8-2 Example 1-8-2, respectively.
  • Example 11-11 In the same manner as in Example 11-11, a high-concentration soluble toombombomodulin-containing preparation shown in Table 1 was obtained (similar to the above, Example 1-9-1, Example 1-9-2, Example 1-
  • Example 1-9-4 was prepared).
  • Example 1-10-1 a high-concentration soluble topopomodulin-containing preparation shown in Table 1 was obtained (as described above, Example 1-10-1, Example 1-10-2, Example 1-10-2, respectively).
  • Example 1-10-3 and Example 1-10-4 were prepared).
  • Example 1-1 high-concentrated soluble topompomodulin-containing preparations shown in Table 1 were obtained (similar to the above, Example 1-11-1, Example 1-11-2, Example 1-11-3 and Example 11-4 were prepared).
  • Example 11-11 high-concentration soluble tombo modulin-containing preparations shown in Table 1 were obtained (as described above, Examples 1-12-1 and 1-12-2, respectively).
  • Example 1-12-3 and Example 1-12-4 were prepared).
  • Example 1-13-1, Example 1-13-2, Example 1-13-3 and Example 1-13-4 were prepared.
  • Example 1-14-3 and Example 1-14-4 were prepared).
  • Example 1-15-1 high-concentration soluble tombombomodulin-containing preparations shown in Table 1 were obtained (as described above, Example 1-15-1, Example 1-15-2, Example 1-15-2, respectively).
  • Example 1-15-3 and Example 1-15-4 were prepared).
  • Example 11-11 In the same manner as in Example 11-11, the high-concentration soluble topopomodulin-containing preparations shown in Table 1 were obtained (similar to the above, Example 1-16-1, Example 1-16-2, Example 1-16-3 and Example 1-16-4 were prepared).
  • Example 11 Example 1 Instead of dispensing the sample solution into sterile Pierbin in the preparation of the sample solution in 1-11, 1 mL was dispensed into one chamber of a two-chamber syringe (manufactured by Arte). These were subjected to a freeze-drying process (the freeze-drying conditions were the same as in Example 11-11) in the order of middle stopper half stopper ⁇ freeze-drying-nitrogen filling ⁇ middle stopper stopper. Next, 0.75 mL of water was aseptically filled into the other room, sealed with a rubber stopper, and a plunger rod was attached to obtain a kit preparation of a high-concentration soluble tropompomodulin kit. Example 1-17-1, Example 1-17-2, Example 1-17-3, and Example 1-17-4 were prepared, respectively).
  • Example 1 In the preparation of the sample solution in Example 13, 1 mL was dispensed into one chamber of a two-chamber syringe (manufactured by Arte) in place of the sterile vial. These were subjected to the freeze-drying step (half-stoppering of the middle stopper ⁇ freeze-drying ⁇ filling with nitrogen ⁇ stoppering of the middle stopper) in this order (the freeze-drying conditions were the same as in Example 1-1). Next, 0.75 mL of water for injection was aseptically filled in the other chamber, sealed with a rubber stopper, and then a plunger was attached to obtain a kit preparation of a high-concentration soluble tonbomodulin-containing preparation (see above). Similarly to Example 1-1-18-1, Example 1-1 ⁇ -2, Example 1-18-3 and Example 1-18-4, respectively.
  • Example 1-19-1, Example 1-19-2, Example 1-19-3, and Example 1-19-4 were prepared respectively).
  • Example 11 The same method as in Example 1 was repeated except that 0.333 mL of the sample solution that had been sterile-filtered was dispensed into sterile Pierbin, thereby obtaining a high-concentration soluble topo-npomodulin-containing preparation shown in Table 1 (see above). Similarly, Example 1-20-1, Example 1-20-2, Example 1-20-3, and Example 1-20-4 were prepared, respectively.
  • Example 12 The same method as in Example 1 was repeated except that 0.5 mL of the sterile-filtered sample solution was dispensed into sterile Pierbin to obtain the high-concentration soluble topo-npomodulin-containing preparations shown in Table 1 (same as described above).
  • Example 1-21-1, Example 1-21-2, Example 1-21-3, Example 1-21-4 was prepared).
  • Example 1-22-1, Example 1-22-2, Example 1-22-3, and Example 1-22-4 were prepared, respectively.
  • Example 1-23-1, Example 1-23-2, Example 1-23-3, and Example 1-23-4 were prepared, respectively.
  • Example 13 Except for dispensing 0.333 mL of the sample solution aseptically filtered in aseptic vials in 1-3, the products containing high concentration of soluble tongue nombomodulin listed in Table 1 were obtained in the same manner (see above). Similarly, Example 1-24-1, Example 1-24-2, Example 1-24-3, and Example 1-24-4 were prepared, respectively.
  • Example 11-11 In the same manner as in Example 11-11, a high-concentration soluble tombo modulin-containing preparation shown in Table 1 was obtained (as described above, Examples 1-25-1 and 1-25-2, respectively). Example 1-25-3 and Example 1-25-4 were prepared).
  • Example 1-1 high-concentration soluble tombo modulin-containing preparations shown in Table 1 were obtained (as described above, Example 1-26-1, Example 1-26-2, Example 1-26-3 and Example 1-26-4 were prepared).
  • Example 11-11 high-concentration soluble tombombomodulin-containing preparations shown in Table 1 were obtained (as described above, Examples 1-27-1 and 1-27-2, respectively).
  • Example 1-27-3 and Example 1-27-4 were prepared).
  • Example 11 In the same manner as in Example 1-1, high-concentrated soluble topompomodulin-containing preparations shown in Table 1 were obtained (as described above, Examples 1-28-1 and 1-28-2, respectively). Example 1-28-3 and Example 1-28-4 were prepared). .
  • Example 1-1 a soluble high-concentration preparation of '14 tongue mouthbomodulin shown in Table 1 was obtained (similar to Example 1-29-1 and Example 1-29, respectively, as described above). -2, Example 1-29-3 and Example 1-29-4 were prepared).
  • Example 11-11 high-concentration soluble topopomodulin-containing preparations shown in Table 1 were obtained (as described above, Examples 1-30-1 and 1-30-2, respectively).
  • Example 1-30-3 and Example 1-30-4 were prepared).
  • Example 1-31-1, Example 1-31-2, Example 1-31-3, and Example 1-31-4 were prepared, respectively.
  • Example 1-32-1 Example 1-32-2, Example 1-32-3, and Example 1-32-4 were prepared, respectively.
  • Example 1-33-1, Example 1-33-2, Example 1-33-3, and Example 1-33-4 were prepared, respectively.
  • Examples 1-34-1, Example 1-34-2, Examples 1-34-3, and Examples 1-34-4 were prepared as described above).
  • Example 1-35-1, Example 1-35-2, Example 1-35-3, and Example 1-35-4 were prepared respectively).
  • Example 1-36-1, Example 1-36-2, Example 1-36-3, and Example 1-36-4 were prepared, respectively.
  • the freeze-drying process was performed under the following conditions in the order of rubber stopper half-stopper ⁇ freeze-drying ⁇ nitrogen filling ⁇ rubber stopper stopper ⁇ cap-sealing, to obtain a high-concentration soluble tombomodulin-containing preparation (Example 1- 37-1).
  • TMD123HM (Examples 1-37-2), TME456H (Examples 1-37-3), and TME456HM (Examples) were used in place of TMD123H obtained in Reference Example 1 by changing the type of soluble thrombomodulin. According to 1-37-4), a high-concentration soluble soluble tombo modulin-containing preparation was obtained according to the above method.
  • Example 1-37 In the same manner as in Example 1-37 except that sodium L-aspartate monohydrate was weighed instead of sodium L-glutamate monohydrate, a preparation containing a high concentration of soluble thrombomodulin was obtained (Example According to 1-37-1, 1-37-2, 1-37-3, and 1-37-4, the type of soluble thrombomodulin was changed, and Examples 1-38-1 and 1-38-2, respectively. Examples 1-38-3 and 1-38-4 were prepared).
  • Example 1-40 Except for using the additive solution of Example 1-1 as described above, a high-concentration soluble thrombomodulin-containing preparation was obtained in the same manner (Examples 1-39-1 and 1-39, respectively, as described above). -2, Examples 1-39-3 and Examples 1-39-4 were prepared). Example 1-40
  • Example 1-40-1 was prepared in the same manner as described above.
  • Example 1-4 1 A preparation containing a high concentration of soluble thrombomodulin was obtained in the same manner as described above except that the additive solution in Example 1-1 was used (Example 1-40-1 was prepared in the same manner as described above).
  • Example 1-4 1 A preparation containing a high concentration of soluble thrombomodulin was obtained in the same manner as described above except that the additive solution in Example 1-1 was used (Example 1-40-1 was prepared in the same manner as described above).
  • Example 1-4 1 A preparation containing a high concentration of soluble thrombomodulin was obtained in the same manner as described above except that the additive solution in Example 1-1 was used (Example 1-40-1 was prepared in the same manner as described above).
  • Example 1-4 1 A preparation containing a high concentration of soluble thrombomodulin was obtained in the same manner as described above except that the additive solution in Example 1-1 was used (Example 1-40-1 was prepared in the same manner as described above).
  • Example 1 A preparation containing a high concentration of soluble thrombomodulin was obtained in the same manner except that the additive solution of Example 1-1 was used as described above (Example 1 was prepared in the same manner as described above).
  • Example 1-4 2 A preparation containing a high concentration of soluble thrombomodulin was obtained in the same manner except that the additive solution of Example 1-1 was used as described above (Example 1 was prepared in the same manner as described above).
  • Example 1-4 2 A preparation containing a high concentration of soluble thrombomodulin was obtained in the same manner except that the additive solution of Example 1-1 was used as described above (Example 1 was prepared in the same manner as described above).
  • Example 1-4 2 A preparation containing a high concentration of soluble thrombomodulin was obtained in the same manner except that the additive solution of Example 1-1 was used as described above (Example 1 was prepared in the same manner as described above).
  • Example 1-4 2 A preparation containing a high concentration of soluble thrombomodulin was obtained in the same manner except that
  • Example 1-42-1 was prepared as described above).
  • Example 1-43-1 was prepared as described above).
  • Example 1-13 The soluble thrombomodulin-containing lyophilized preparation obtained in Example 1-13 was combined with an ampoule obtained by aseptically filling 1 mL of a solution containing 5 mg of chlorobutanol in 1 mL of water for dissolution water intense night. Contains soluble tobombomodulin A kit preparation of the freeze-dried preparation was obtained. (Examples 1-44-1 were prepared).
  • Example 1-1 Aseptically filled 1 mL of the soluble lyophilized topompomodulin-containing lyophilized preparation obtained in Example 1-1 and a solution containing 0.1 mg of Polysorbate 80 in 1 mL of water for injection as an aqueous solution for dissolution.
  • a kit preparation of a freeze-dried preparation containing soluble topompomodulin in combination with an ampoule was obtained.
  • Example 1-1 The soluble thrombomodulin-containing lyophilized preparation obtained in Example 1-1 was combined with an ampoule aseptically filled with 1 mL of a solution containing 10 mg of benzyl alcohol in 1 mL of water for injection as an aqueous solution for dissolution. A kit preparation of a freeze-dried preparation containing soluble tombo modulin was obtained. (Examples 1-46-1 were prepared as described above).
  • a kit preparation of a lyophilized preparation containing soluble tombo modulin in combination with an ampoule filled aseptically with mL was obtained.
  • a kit preparation of a lyophilized preparation containing soluble tombo modulin combined with an ampoule filled aseptically with 1 mL was obtained.
  • Example 50-1 was prepared as described above.
  • Example 51-1 was prepared as described above.
  • Example 1-52-1 was prepared as described above.
  • a kit preparation of a lyophilized preparation containing soluble tonpomodulin was obtained by combining an ampoule filled aseptically with mL.
  • Example 1-53-1 was prepared as described above.
  • Example 1-1 In the preparation of the additive solution of Example 1-1, the composition shown in Table 1 was obtained in the same manner except that 1.25 mmol of the additive shown in Table 1 was weighed.
  • a composition shown in Table 1 was obtained in the same manner as in Example 1-1, except that 1.25 mmol of the additive shown in Table 1 was weighed.
  • compositions shown in Table 1 were obtained in the same manner except that 2.5 mmol of the additives shown in Table 1 were used in preparing the additive solution of Example 1-1.
  • compositions shown in Table 1 were obtained in the same manner except that 2.5 mmol of the additives shown in Table 1 were weighed in the preparation of the additive solution of Example 1-1.
  • Example 1-1 In the preparation of the additive solution of Example 1-1, the composition shown in Table 1 was obtained in the same manner except that 3.75 mmol of the additive shown in Table 1 was weighed.
  • Comparative Example 11 In the preparation of the additive solution of Example 1-1, the composition shown in Table 1 was obtained in the same manner except that 3.75 mmol of the additive shown in Table 1 was weighed.
  • a composition shown in Table 1 was obtained in the same manner as in Example 1-1, except that 1.25 mmol of the additive shown in Table 1 was weighed.
  • Example 11 The composition shown in Table 1 was obtained in the same manner as in Example 11 except that 2.5 mmol of the additive shown in Table 1 was weighed.
  • Example 1-1 In the preparation of the additive solution of Example 1-1, the composition shown in Table 1 was obtained in the same manner except that 3.75 mmol of the additive shown in Table 1 was weighed.
  • Example 1-1-1 The high-concentration soluble thrombomodulin-containing preparation obtained in Example 1-1-1 was dissolved again by adding 0.75 mL of water for injection to obtain a composition for administration.
  • Example 1-1-2 The soluble thrompomodulin high-concentration preparation obtained in Example 1-1-2 was added with 0.75 mL of water for injection to accelerate the re-melting angle, thereby obtaining a fibrous composition for administration.
  • Example 1-1-3 The high-concentration soluble thrombomodulin-containing preparation obtained in Example 1-1-3 was re-dissolved by adding 0.75 mL of water for injection to obtain a composition for administration.
  • the high-concentration soluble tropomodulin-containing preparation obtained in Example 1-1-4 was re-dissolved by adding 0.75 mL of water for injection to obtain a composition for administration.
  • Example 1-2-1 The high-concentration soluble thrombomodulin-containing preparation obtained in Example 1-2-1 was re-dissolved by adding 1.0 mL of water for injection to obtain a composition for administration.
  • Example 6 The preparation containing high concentration of soluble thrombomodulin obtained in Example 1-1-1 was redissolved by adding 1.5 mL of water for injection to obtain a composition for administration.
  • Administration Example 7 The preparation containing high concentration of soluble thrombomodulin obtained in Example 1-1-1 was redissolved by adding 1.5 mL of water for injection to obtain a composition for administration.
  • Administration Example 7
  • Example 1-1-1 The high-concentration soluble thrombomodulin-containing preparation obtained in Example 1-1-1 was re-dissolved by adding 0.5 mL of water for injection to obtain a composition for administration.
  • Physiological saline was used as the composition for administration.
  • Comparative Example 1-1 The composition obtained in Comparative Example 1-1 was re-dissolved by adding 1.0 mL of water for injection to obtain a composition for administration.
  • composition obtained in Comparative Example 1-2 was re-dissolved by adding 2.0 mL of water for injection to obtain a composition for administration.
  • composition obtained in Comparative Examples 1-3 was re-dissolved by adding 1.0 mL of water for injection to obtain a composition for administration.
  • the osmolality was determined according to the osmotic pressure measurement method of the 14th revision of the Japanese Pharmacopoeia. That is, using an osmotic pressure measuring device (V0GEL: 0M802-D), calibrate the device in advance by a two-point calibration method according to the following method, confirm the suitability of the device, and then determine the osmolality of the sample solution. It was measured.
  • V0GEL 0M802-D
  • the 300m0sm standard solution (manufactured by V0GEL) was repeatedly measured 6 times, and it was confirmed that the relative standard deviation of the 6 runs was within 2% and the measured value was 291 to 309m0sm.
  • Each administration solution was collected in a dedicated sample cup (V0GEL) and measured.
  • the administration solutions obtained in Comparative Administration Examples 2, 3, and 4 were diluted 10, 10, and 3 times with water for injection (manufactured by Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.), and the same measurement was performed on this solution. The concentration was increased 10, 10, and 3 times. Table 2 shows the results.
  • each of the administration solutions of administration examples 1 to 7 caused pain in mice.
  • the pain time was very short, almost the same as that of the physiological saline in Comparative Administration Example 1, and the degree of pain was not large. It was confirmed that the administration solutions of Comparative Administration Examples 2 to 4 had a long pain time and therefore had a large degree of pain, which was not preferable.
  • the osmotic pressure ratio of Experimental Example 2 was examined, as shown in Table 2, the composition having a short pain time had an osmotic pressure ratio of around 1, and the composition having a remarkably long pain time had a high or low osmotic pressure ratio. Met.
  • the high-concentration soluble tombomodulin-containing preparation obtained in the example and the composition obtained in the comparative example were stored in a thermostat at 60 ° C, and the preparation was redissolved in the second week and administered.
  • the aggregate formation rate (%) of the drug was measured.
  • the aggregate formation rate of soluble topomodulin was measured by HPLC analytical gel filtration.
  • the mobile phase used was a 50 ol / L phosphate buffer pH 7.3 containing 0.1 mmol / L sodium sulfate
  • the column was TSK-gel 3000SWXL (Tosoichi Co., Ltd.)
  • the column temperature was constant at around 25 ° C.
  • the flow rate was adjusted so that the retention time of soluble thrombomodulin was 9 minutes.
  • the sample solution was prepared by diluting the mobile phase of 50 ramol / L phosphate buffer containing 0.1 mmol / L sodium sulfate so that the soluble tombomodulin content was 1 mg / mL. .
  • TMD123H high-concentration soluble tropomodulin
  • kit preparation obtained in Examples 1-39-1 to 1-53-1 prepare a high-concentration soluble topopomodulin solution containing high concentration of soluble topompomodulin.
  • the osmotic pressure ratio and the aggregate formation rate were determined in the same manner as in Example 3, and the results are shown in Table 4.
  • kits preparation of a high-concentration-containing preparation in which the soluble topompomodulin obtained in Examples 1-42-1 to 1-53-1 is TMD123H was dissolved using a disposable syringe (1 mL, manufactured by Terumo Corporation). 1 mL of the aqueous solution for aspiration was aspirated, injected into Pierbin, and redissolved to obtain a solution containing a high concentration of soluble tobonumbomodulin. .
  • the soluble thrombomodulin obtained in Examples 1-39-2 to 1-39-4 also penetrated a high-concentration soluble topopomodulin-containing preparation or kit preparation containing TTMD123HM or TME456H or TME456HM in the same manner as in Table 4.
  • the pressure ratio was almost 1, and the result of further suppressing the formation rate of aggregates was obtained.
  • the examples of the present invention have a low rate of formation of aggregates and have less pain when dissolved for administration, and can be used for administration methods such as intramuscular administration and subcutaneous administration. . '' Table 4 Osmotic pressure ratio Aggregate formation rate (%)
  • Example 1-41-1 1.0.0.48
  • Example 1-42-1 1.0.4.44
  • Example 1-53-1 1.10.35
  • Polysorbate 80 (5 mg) was weighed and placed in a 20-mL volumetric flask (50 times the amount added in the column of composition in Table 5), and water for ait was added to dissolve to 20 mL. Sample solution preparation
  • Rubber stopper (V5-F8, manufactured by Daikyo Seie) Semi-stopper ⁇ Freeze-dry ⁇ Nitrogen filling ⁇ Rubber stopper stopper ⁇ Cap wrapper Perform the freeze-drying process under the following conditions in one container. Soluble tongue comb containing 30 mg of soluble tonbomodulin and Polysorbate 80 (0.1 mg) A preparation containing a high concentration of modulin was obtained (Example 2-1-1).
  • Example 2-1-2 An empty vial bottle was previously stoppered with a rubber stopper with -100 g Hg, and the cap was wrapped. 1 mL of ⁇
  • Example 2-1-2, Example 2-1-3, Example 2-1-4 An empty vial bottle was previously stoppered with a rubber stopper with -100 g Hg, and the cap was wrapped. 1 mL of ⁇
  • Example 2-1-2, Example 2-1-3, Example 2-1-4 An empty vial bottle was previously stoppered with a rubber stopper with -100 g Hg, and the cap was wrapped. 1 mL of ⁇
  • TMD123HM (Example 2-1-2), TME456H (Example 2-1-3), and TME456HM (Example Using Example 2-1-4)
  • a high-concentration soluble tombo modulin-containing preparation was obtained in accordance with the above-mentioned methods.
  • Example 2-3 In the same manner as in Example 2-1, a high-concentration soluble topopomodulin-containing preparation described in the column of composition in Table 5 was obtained (according to Example 2-1-1, Example 2-2- 1 was prepared).
  • Example 2-3 In the same manner as in Example 2-1, a high-concentration soluble topopomodulin-containing preparation described in the column of composition in Table 5 was obtained (according to Example 2-1-1, Example 2-2- 1 was prepared).
  • Example 2-3 Example 2-3
  • Example 2-3-1 was prepared in the same manner as described above.
  • Example 2-4-1 was prepared in the same manner as described above).
  • Example 2-5-1 was prepared in the same manner as described above.
  • Example 2-6
  • Example 2-6-1 was prepared in the same manner as described above).
  • Example 2-7-1 was prepared in the same manner as described above).
  • Example 2-8-1 was prepared in the same manner as described above).
  • Example 2-9-1 was prepared in the same manner as described above).
  • Example 2-10-1 was prepared in the same manner as described above).
  • Example 2-1 In the same manner as in Example 2-1, a high-concentration soluble topopomodulin-containing preparation described in the column of composition in Table 5 was obtained (in the same manner as described above, Example 2-1 to 1 was prepared).
  • Example 2-1- 1 was prepared in the same manner as described above).
  • Example 2-13-1 was prepared in the same manner as described above).
  • Example 2-14-1 was prepared in the same manner as described above).
  • Example 2-15-1 was prepared as described above.
  • Example 2-16-1 was prepared in the same manner as described above).
  • Example 2-17-1 was prepared in the same manner as described above).
  • Example 2-1 In the same manner as in Example 2-1, a high-concentration soluble toombombomodulin-containing preparation described in the column of composition in Table 5 was obtained (prepared in the same manner as described above and Example 2-18-1). .
  • Example 2-19-1 was prepared in the same manner as described above).
  • Example 2-20-1 was prepared in the same manner as described above).
  • Example 2-12-1 was prepared in the same manner as described above).
  • Example 2-22-1 was prepared in the same manner as described above).
  • Example 2-23-1 was prepared as described above).
  • Example 2-24-1 was prepared in the same manner as described above).
  • Example 2-18 In the same manner as in Example 2-18, except that the silicone-coated vial (3 mL, 18 X 33 mm, bore size 9.1 A preparation containing a high concentration of oral npomodulin was obtained (Example 2-25-1 was prepared in the same manner as described above).
  • Example 2-26-1 was prepared in the same manner as described above).
  • Example 2-27-1 was prepared in the same manner as described above. Further, the pressure reduction degree was reduced to the initial pressure reduction degree by the following method so that the pressure reduction degree at the time of re-dissolving the preparation was -200 mmHg.
  • Example 2-28-1 was prepared in the same manner as described above).
  • the initial decompression degree was adjusted so that the decompression degree upon re-dissolution was -200 mmHg.
  • Example 2-29-1 was prepared in the same manner as described above). Also, as in Examples 2-27, the initial pressure reduction was adjusted so that the pressure reduction when re-dissolving the formulation was -200 mmHg.
  • Example 2-15 In the same manner as in Example 2-15, except that the vial was changed to a 2.0 w / v% silicone-coated vial (3 mL, 18 x 33 thighs, inner diameter 9. lnm, manufactured by Namikos), A formulation containing a high concentration of soluble thorombomodulin described in the column of composition was obtained (Example 2-30-1 was prepared in the same manner as described above). In addition, as in Examples 2-27, the initial pressure reduction was adjusted so that the pressure reduction when re-dissolving the preparation was -200 mmHg.
  • a freeze-dried preparation containing soluble tongue mbomodulin described in the composition column of Table 5 obtained in the same manner as in Example 2-14 except that Polysorbate 80 was not added at the time of excipient addition, and 3 ⁇ 4lt water as an aqueous solution for dissolution.
  • a kit of soluble thrombomodulin-containing lyophilized product was obtained in combination with an ampoule in which 1 mL of 10 mL of benzyl alcohol was aseptically filled with 1 mL of benzyl alcohol aseptically.
  • Example 2-31-1 was prepared).
  • a lyophilized preparation containing soluble topompomodulin described in the composition column of Table 5 obtained in the same manner as in Example 2-14 except that Polysorbate 80 was not added to the additive solution, and water for injection as an aqueous solution for dissolution.
  • a kit preparation of a lyophilized preparation containing soluble tombo modulin was obtained by combining an ampoule in which 1 mL of a solution containing 5 mg of benzyl alcohol in 1 mL was aseptically filled (as described above. Example 2-32-1 was prepared).
  • Example 2-33-1 was prepared in the same manner as described above).
  • a lyophilized preparation containing soluble topompomodulin described in the composition column of Table 5 obtained in the same manner as in Example 2-14 except that Polysorbate 80 was not added to the additive solution, and water for injection as an aqueous solution for dissolution.
  • a lyophilized kit containing soluble topopomodulin was obtained by combining an ampoule prepared by aseptically filling 1 mL of a solution containing 2.5 mg of chlorobutanol in the same manner as described above. 2-34-1).
  • Example 2- 35-1) a kit preparation containing a high concentration of soluble thrombomodulin (TMD123H) (Example 2- 35-1) was obtained.
  • Comparative Example 2-1 1.67 mL of TMD123H (concentration of soluble thrombomodulin: 60 mg / mL) obtained in Reference Example 1 was reduced to 10 times the amount shown in the column of addition amount in Table 5 as soluble tobonumbomodulin. was added to a 15 mL assist tube, and water for injection was added to make 10 mL, followed by mixing and stirring.
  • This sample solution was sterilized by filtration using a 25 mL disposable syringe (manufactured by Terumo Corporation) with a filter having a pore size of 0.22 ⁇ ( ⁇ -GV, manufactured by Millipore). 1 mL each was dispensed into a volume of 3 mL, 18X33 mm, bore size 9.1 mm, manufactured by Namikos).
  • TMD123HM (Comparative Example 2-3-2), TME456H (Comparative Example 2-3-3), and TME456HM were used instead of TMD123H of Comparative Example 2-3-1 by changing the type of soluble topompomodulin.
  • This sample solution was sterilized by filtration using a 25 mL disposable syringe (manufactured by Terumo Corporation) with a filter having a pore size of 0.22 ⁇ ( ⁇ -GV, manufactured by Millipore), and sterile vials without silicone coating were treated. (3 mL, 18 x 33 corrupt, caliber 9.1 Awake, manufactured by Namikos) was dispensed in 1 mL portions.
  • Rubber stopper half stopper (V5-F8, manufactured by Daikyo Seie) ⁇ Freeze-drying ⁇ Nitrogen filling ⁇ Rubber stopper stopper ⁇ Cap winding
  • the freeze-drying process is performed under the conditions described in Example 2-1. ! The composition described in the composition column of Table 5 was obtained. Comparative Example 2-5
  • the substance was redissolved in 1 mL of the aqueous solution for dissolution described in the column of aqueous solution for dissolution in Table 5, and the foaming suppression effect at that time was determined by the turbidity measurement described below in terms of transmittance, and the typical results are shown in Table 5. Indicated.
  • a syringe for injection (1 mL for tuberculin, needle: 26G 0.45 x 13 mm, manufactured by Terumo) that aspirated 1 mL of the aqueous solution for dissolution was pierced into the center of the rubber stopper of the freeze-dried preparation to be measured.
  • An aqueous solution for dissolution is injected into the center of the lyophilized product at a rate of mL / sec. Leave the syringe for injection still. 30 seconds after the end of the injection, turn the vial upside down, and aspirate approximately 0.8 mL of the high-concentration soluble tombomodulin-rich solution using a syringe.
  • the sucked solution is gently poured into a quartz cell (black cell, light path length: 10 mm, light path width: 2 souls, manufactured by GE Science) through the cell wall.
  • a quartz cell black cell, light path length: 10 mm, light path width: 2 souls, manufactured by GE Science
  • UV-2500PC ultraviolet-visible spectrophotometer
  • the time from when the freeze-dried lysate is aspirated from the vial to when the transmittance is measured is 15 seconds. Unless otherwise specified, transmittance is expressed as the average of three measurements. Table 5
  • Example 2-35-1 push the plunger rod to the half-stopper position (constant speed of about 0.1 mL / sec), and press the plunger rod for one chamber containing the lyophilized product. 30 seconds after injection of water for injection into the cell, push the plunger rod further, gently pour the solution containing high-concentrated soluble tombomodulin into the quartz cell through the cell wall, and calculate the transmittance according to the method described above. However, as in Table 5, it showed high transmittance.
  • a formulation containing a nonionic surfactant, benzyl alcohol, and chlorobutanol as a foam suppressing additive in a solution containing a high concentration of soluble tombomodulin suppressed foaming The inner wall of the container for dissolving the lyophilized preparation containing soluble thrompomodulin may be coated with silicone, or the pressure in the container for dissolving the lyophilized preparation containing soluble tombomodulin may be in a reduced pressure state. It was confirmed that the generation of bubbles was suppressed.
  • a kit preparation was prepared by combining the lyophilized preparation containing soluble thrombomodulin (TMD123H) obtained in Examples 1-1-1 to 1-38-1 shown in Table 1 with the aqueous solution for dissolution shown in Table 6.
  • TMD123H soluble thrombomodulin
  • Table 6 Dissolution water ⁇ Dissolution solution 1 Orchid water 1 mL
  • Poloxamer 188 0.lmg Dissolution 5 3 ⁇ 4lt water l mL
  • foaming which arises in the solution containing a high concentration of soluble topomodulin can be suppressed, and it is clinically useful.

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Description

可溶性ト口ンボモジュリン高濃度含有製剤
技術分野
本発明は、 可溶性ト口ンボモジュリン含有凍結乾燥製剤を溶解して可溶性ト口 ンボモジュリン高濃度含有溶液を調製するに際しての起泡抑制方法、 および該凍 結乾燥製剤中の可溶性ト口ンボモジュリンの安定ィヒ方法、 およびそれらに適した 可溶性ト口ンボモジュリン含有凍結乾; »剤とそのキット製剤に関する。 背景技術
トロンポモジュリンは、 トロンビンと特異的に結合し、 トロンビンによるプロ ティン Cの活性化を著しく促進する作用を有する物質として発見された。 プロテ イン Cは、 血液凝固線溶系において重要な役割を演じているビタミン K依存性の 蛋白質であり、 トロンビンの作用により活性化され、 活性型プロテイン cとなる。 この活性型プロテイン Cは、 生体内で血液凝固系因子の活性型第 V因子、 および 活性型第 VIII 因子を失活させ、 また血栓溶解作用を有するプラスミノーゲンァ クチベータ一の産生に関与していることが知られている' [鈴木宏治、 医学のあゆ み、 第 125卷、 901頁（1983年) ]。
したがって、 トロンポモジュリンは、 このトロンビンによるプロテイン Cの活 性化を促進して抗血液凝固剤又は血栓溶解剤として有用であるとされている。 ま た、 従来トロンポモジュリンの用途としては、 例えば、 急性冠動脈症候群 (ACS)、 血栓症、 末梢血管閉塞症、 閉塞性動脈硬化症、 血管炎、 心臓手術に続発する機能 性障害、 臓器移植の合併症、 血管内血液凝固症候群 (DIC)、 狭心症、 一過性脳虚 血発作、 妊娠中毒症、 糖尿病、 肝 VOD (Liver veno- occlusive disease；劇症肝 炎や骨髄移植後の肝静脈閉塞症）、 深部静脈血栓症（DVT ； Deep venous thrombosis)等や、 さらには敗血症や成人呼吸窮迫症候群 （ARDS) の疾患の治療 および予防に用いられることが期待されている。
従来、 トロンボモジュリンは、 ヒトをはじめとする種々の動物種の血管内皮細 胞上に発現している糖蛋白質として発見取得され、 その後、 クローユングに成功 した。 即ち、 遺伝子工学的手法を用いてヒト肺 cDNA ライブラリーからシグナル ぺプチドを含むヒトトロンボモジュリン前駆体の遺伝子をクローニングし、 そし てトロンボモジュリンの全遺伝子配列を解析し、 18アミノ酸残基のシグナルぺプ チドを含む 575残基のァミノ酸配列が明らかにされている （特開昭 64 - 6219号公 報)。 シグナルぺプチドが切断されたマチュアなト口ンポモジュリンは、 そのマ チユアなぺプチドの N末端側より N末端領域（1-226番目）、 6つの EGF様構造を もつ領域 (227- 462番目）、 O型糖鎖付加領域 (463-498番目）、 膜貫通領域 (499- 521番目）、 そして細胞質内領域 (522- 557番目） の 5つの領域から構成されてお り、 そして全長のトロンボモジュリンと同じ活性を有する部分としては、 6つの EGF様構造を持つ領域のうち、 主には N末端側から 4, 5, 6番目の EGF様構造か らなる部分であることが知られている [M. Zushi ら、 J. Biol. Chem. , 246, 10351—10353 (1989) ]。
少なくとも、 膜貫通領域を含有しないように調製された可溶性トロンボモジュ リンにおいては、 界面活性剤の非存在下でもきれいに溶解することができ、 例え ば、 Ν末端領域と 6つの EGF様構造をもつ領域と Ο型糖鎖付加領域の 3つの領域 のみからなる （即ち、 配列番号 1の 19〜516位のアミノ酸配列からなる） 可溶性 トロンボモジュリンは、 組換え技術の応用により取得できること、 そしてその組 換え体可溶性ト口ンボモジュリンは、 天然のト口ンボモジュリンの活性を有して いることが確認されている （特開昭 64 - 6219号公報)。 他に可溶性トロンポモジ ュリンの例として、 特開平 2- 255699号公報、 特開平 3- 133380号公報、 特開平 3 - 259084号公報、 特開平 4-210700号公報、 特開平 5-213998号公報、 W092/00325 号公報、 W092/03149号公報、 W093/15755号公報等に記載の可溶性トロンポモジ ュリンが挙げられる。 あるいは天然型としてヒト尿由来の可溶性トロンボモジュ リン （特開平 3-86900号公報、 特開平 3-218399号公報） 等も例示される。
因みに、 遺伝子においては、 自然の変異または取得時の変異により、 多くのケ ースで認められる通り、 ヒトにおいても多形性の変異が見つけられており、 上述 の 575残基のァミノ酸配列からなるヒトトロンボモジュリン前駆体の第 473位の アミノ酸において Valであるものと、 Alaであるものが現在確認されている。 こ のアミノ酸をコードする塩基配列においては、 第 1418位において、 それぞれ T と Cとの変異に相当する [Wenら、 Biochemistry, 26, 4350-4357 (1987) ]0 しかし、 活性および物性においては、 全く相違なく、 両者は実質的に同一と判断できる。 発明の開示
これらの可溶性ト口ンポモジュリンを医薬組成物として使用する際には、 各種 の治療対象疾患や各種の投与方法が知られている。 これらの全ての治療対象疾患 や投与方法に適合する製剤の開発が待たれていた。
本発明者らは、 上記課題を解決するために、 先ず可溶性トロンボモジュリン高 濃度製剤の必要性を感じ、 これを作成することとした。 可溶性トロンボモジユリ ンを医薬組成物として広く安定的に供給するに際しては凍結乾燥製剤とすること が知られている。 凍結乾燥製剤を注射用水などで再溶解し、 高濃度の可溶性トロ ンボモジュリン溶液を作成するに際して、 該溶液中に無数の微小な気泡が発生し、 且つ気泡の消えが悪く、 場合によっては白濁の^を呈することが、 本件発明者 らにより始めて確認されたものである。 勿論、 医療現場で使用する場合、 気泡を 含有したまま投与することは到底できず、 気泡が消えて澄明となるまで放置する 時間を無用に取らせ、 製剤として品質上問題となる。 このような従来全く予想さ れていなかつた問題点を見出し、 その解決策を求めて本件発明者らが鋭意検討し たところ、 可溶性ト口ンボモジュリン高濃度含有溶液に起泡抑制添加剤として、 非イオン性界面活性剤、 ベンジルアルコール、 クロロブタノールを含有した製剤 は、 気泡の発生を抑制することを確認し、 本件発明を完成するに至った。 また、 該可溶性ト口ンボモジュリン含有凍結乾燥製剤を溶解する際の容器の内壁がシリ コーンでコーティングされていること、 または該可溶性トロンポモジュリン含有 凍結乾燥製剤を溶解する際の容器内圧力が減圧状態であることも気泡の発生を抑 制することを確認し、 本件発明を完成するに至った。
すなわち、 本努明は、 有効成分として可溶性トロンボモジュリンを含有する可 溶性ト口ンボモジュリン含有凍結乾燥製剤を溶解して、 10 mg/mL以上の可溶性ト 口ンボモジュリン高濃度含有溶液を調製するに際し、 （a)非ィオン性界面活性剤、 ベンジルアルコール、 クロロブタノールからなる群より選ばれる少なくとも一種 の化合物を存在せしめること、 （b)該可溶性ト口ンボモジュリン含有凍結乾燥製 剤を溶解する際の容器の内壁がシリコーンでコーティングされていること、 また は (C)該可溶性ト口ンボモジュリン含有凍結乾燥製剤を溶解する際の容器内圧力 が減圧状態であること、 の少なくともレ、ずれかを特徴とする可溶性ト口ンボモジ ュリン高濃度含有溶液の起泡抑制方法である。
また、 本発明は、 有効成分として可溶性トロンボモジュリンを含有する可溶性 ト口ンボモジュリン含有凍結乾燥製剤を溶解して、 10 mg/mL以上、 好ましくは 20 mg/mL以上の可溶性ト口ンボモジュリン高濃度含有溶液を調製するに際して用 いられるものであって、 非イオン性界面活性剤、 ベンジルアルコール、 クロロブ タノールからなる群より選ばれる少なくとも一種の化合物を有効成分とする可溶 性ト口ンボモジュリン高濃度含有激夜の起泡抑制剤である。
さらにまた、 本発明は、 有効成分として可溶性ト口ンボモジュリンを含有する 可溶性ト口ンボモジュリン含有凍結乾燥製剤、 または該可溶性ト口ンポモジュリ ン含有凍結乾燥製剤とその溶解用水溶液とを組み合わせしめたキット製剤であつ て、 該可溶性ト口ンボモジュリン含有凍結乾燥製剤が 10 mg/mL以上の可溶性ト ロンポモジュリン高濃度含有溶液を調製されるためのものであって、 且つ (a)該 可溶性トロンポモジュリン含有凍結乾燥製剤中に、 非イオン性界面活性剤、 ベン ジルアルコール、 クロロブタノールからなる群より選ばれる少なくとも一種のィ匕 合物が存在せしめられているカゝ、 および Zまたは該可溶性トロンボモジュリン含 有凍結乾燥製剤の溶解用水溶液中に、 非イオン性界面活性剤、 ベンジルアルコー ル、 クロ口ブタノールからなる群より選ばれる少なくとも一種のィ匕合物が存在せ しめられていること、 （b)該可溶性ト口ンボモジュリン含有凍結乾燥製剤を溶解 する際の容器の内壁がシリコーンでコーティングされていること、 または (c)該 可溶性ト口ンボモジュリン含有凍結乾燥製剤を溶解する際の容器内圧力が減圧状 態であること、 の少なくともいずれかを特徴とする可溶性トロンポモジュリン含 有凍結乾燥製剤、 またはそのキット製剤である。
また、 本発明者らは、 可溶性トロンボモジュリン高濃度製剤を作成するに際し、 - 従来の技術の問題点を検討した。 すなわち、 各種の治療対象疾患や各種の投与方 法に広く適用可能な可溶性ト口ンポモジュリンの高濃度製剤の調製においては、 例えば特に筋肉内投与や皮下投与の投与方法に採用できるためには、 筋肉内や皮 下に対して一定量以上の溶液量を投与することは困難である点が挙げられる。 し かも、 本発明者らが子細に検討したところ、 該投与溶液の浸透圧が低すぎても高 過ぎても疼痛が強く現れ好ましくないことが 、された。
一方、 ト口ンポモジュリンの凍結乾燥の過程で、 可溶性ト口ンポモジュリン含 有溶液を凍結乾燥すると、 変性または会合等によって高分子化した多量体が生成 することが明らかとなっている。 従来、 可溶性トロンボモジュリンの変性を防止 する方法として、 ァミノ酸またはその塩類および糖類よりなる群から選ばれた一 種または二種以上を添加することが知られている （特開平 6 - 321805号公報)。 し かしながら、 同公報が具体的に開示する添加物やその添加暈による組成物は、 疼 痛等の点において必ずしも好ましくないことが、 本発明者らにより確認された。 すなわち、 特開平 6-321805 号公報の開示する具体的な組成物 （例えば実施例 20) は、 可溶性ト口ンボモジュリンを 10 mg以上含有する可溶性ト口ンポモジュ リン高濃度含有製剤とし、 皮下や筋肉内投与を念頭において 0. 1 mLから 2 mLの 溶解用水溶液に溶解した場合、 本発明者らの実験によれば疼痛を示すことが確認 された。
また、 可溶性トロンボモジュリンに、 マルトース、 ラタトース、 蔗糖、 アルギ ニンを添加することも知られているが（W095/16460号公報）、 この W095/16460号 公報中では、 マンニトールの添加は可溶性ト口ンポモジュリンの変性を防止する ことはできないと記載されているため、 当業者には必ずしも好ましレヽ添加物とも 考えられていない状況であつたが、 本件発明者らが鋭意検討したところ、 例えば W095/16460号公報中好ましくないと言われているマンニトールであっても、 マン 二トールにグルタミン酸またはその塩を共存させると、 マンニトールを単独で添 加するのに比べて、 極めて高い安定性が達成されという顕著な相乗効果が認めら れ、 浸透圧比を適当に調整できる濃度においても好ましい安定性が達成されると いう事実を確認し、 併せて、 皮下や筋肉内投与をした場合でも疼痛が生じがたい 製剤となることを ¾^して、 以下の本件発明を完成するに至った。
すなわち、 本発明は、 有効成分として可溶性ト口ンボモジュリンを含有する可 溶性ト口ンボモジュリン含有凍結乾燥製剤における可溶性ト口ンボモジュリンの 安定化方法であって、 （1) グルタミン酸またはその塩、 およびマンニトールの 2 種を含む、 （2) グルタミン酸またはその塩、 およびリシンまたはその塩の 2種を 含む、 （3) グルタミン酸またはその塩、 およびァスパラギン酸またはその塩の 2 種を含む、 または (4) ァスパラギン酸またはその塩、 およびマンニトールの 2種 を含む、 のいずれかの組み合わせを含有せしめ、 且つ該可溶性ト口ンボモジュリ ン含有凍結乾燥製剤が、 0. 1 mL から 2 mL の溶解用水溶液に溶解し得て、 10 mg/mL以上の可溶性トロンポモジュリン高濃度含有溶液を調製でき、 その溶解時 の浸透圧比が 0. 5から 2. 0であることを特徴とする可溶性ト口ンボモジュリン含 有凍結乾燥製剤における可溶性ト口ンボモジュリンの安定ィヒ方法である。 発明を実施するための最良の形態
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明は、 下記に示される起泡抑制方法、 または起泡抑制剤である。 すなわ ち、 本発明は、 有効成分として可溶性トロンボモジュリンを含有する可溶性トロ ンボモジュリン含有凍結乾燥製剤を溶解して、 10 mg/mL以上の可溶性ト口ンボモ ジュリン高濃度含有溶液を調製するに際し、 （a)非イオン性界面活性剤、 ベンジ ルアルコール、 クロロブタノールからなる群より選ばれる少なくとも一種の化合 物を存在せしめること、 （b)該可溶性トロンボモジュリン含有凍結乾燥製剤を溶 解する際の容器の内壁がシリコーンでコーティングされていること、 または（c) 該可溶性ト口ンボモジュリン含有凍結乾燥製剤を溶解する際の容器内圧力が減圧 状態であること、 の少なくともいずれかを特徴とする可溶性ト口ンボモジュリン 高濃度含有溶液の起泡抑制方法である。
該可溶性ト口ンボモジュリン高濃度含有溶液の起泡抑制手段としては、 上記の (a)、 (b)、 （c)のいずれかが好ましいが、 好ましくは (a)であり、 さらに (a)且つ (c)や、 （a)且つ (b)も好ましい。 また (b)且つ (c)も好ましく、 （a)且つ (b)且つ (c) が特に好ましい例として挙げられる。
以下先ず、 上記の (a)について説明する。
具体的に本発明は、 該可溶性トロンポモジュリン含有凍結乾燥製剤を溶解して、 10 mg/mL以上の可溶性ト口ンボモジュリン高濃度含有溶液を調製するに際し、 非 ィォン性界面活性剤、 ベンジルアルコール、 クロロブタノールからなる群より選 ばれる少なくとも一種の化合物を存在せしめることを特徴とする可溶性ト口ンポ モジュリン高濃度含有溶液の起泡抑制方法である。
また、 さらに具体的には、 該可溶性ト口ンポモジュリン含有凍結乾燥製剤中に、 非イオン性界面活性剤、 ベンジルアルコール、 クロロブタノールからなる群より 選ばれる少なくとも一種の化合物が存在せしめられていること、 または、 該可溶 性ト口ンボモジュリン含有凍結乾燥製剤を溶解するための溶解用水溶液中に、 非 ィオン性界面活性剤、 ベンジルアルコール、 クロロブタノールからなる群より選 ばれる少なくとも一種のィ匕合物が存在せしめられていること、 のいずれかを特徴 とする可溶性ト口ンボモジュリン高濃度含有溶液の起泡抑制方法である。
本発明で可溶性ト口ンポモジュリンとしては、 トロンビンに結合し、 トロンビ ンによるプロティン Cの活性ィ匕を促進する作用を有し、 界面活性剤の非存在下で も容易に溶解し得る物質であれば、 特に限定されない。 また可溶性トロンボモジ ュリンには、 その他に、 トロンビンによる凝固時間を延長する作用、 および Zま たはトロンビンによる血小板凝集を抑制する作用が通常認められると、 当業者は 理解する。 可溶性ト口ンボモジュリンの溶解性の好ましい例示としては、 水、 例 えば注射用蒸留水に対して （トリ トン X- 100ゃポリドカノール等の界面活性剤の 非存在下、 通常は中性付近にて）、 1 mg/mL以上、 または 10 mg/mL以上が挙げら れ、 好ましくは 15 mg/mL以上、 または 17 mg/mL以上が挙げられ、 さらに好まし くは 20 mg/mL以上、 25 mg/mL以上、 または 30 mg/mL以上が例示され、 特に好ま しくは 60 mg/mL以上が挙げられ、 場合によっては、 80 mg/mL以上、 または 100 mg/mL以上がそれぞれ挙げられる。 可溶性ト口ンボモジュリンが溶解し得た力否 かを判断するに当たっては、 溶角早した後に、 例えば白色光源の直下、 約 1000ル タスの明るさの位置で、 肉眼で観察した場合に、 澄明であって、 明らかに認めら れるような程度の不溶性物質を含まないことが端的な指標となるものと理解され る。 また、 濾過して残渣の有無を確認することもできる。 この溶解についての判 断は、 後述する起泡抑制添加剤や安定化添加剤やその他の添加剤等を含めて溶解 する？ m方法としても利用できる。
また、 トロンビンによるプロテイン Cの活性ィ匕を促進する作用は、 例えば、 特 開昭 64 - 6219号公報を初めとする各種の公知文献に明確に記載された試験方法に よりプロティン Cの活性化を促進する作用の活性量やその有無を容易に確認でき るものである。 また、 トロンビンによる凝固時間を延長する作用、 および Zまた はトロンビンによる血小板凝集を抑制する作用についても同様に容易に確認でき る。 可溶性トロンボモジュリンとしては、 ヒト尿等を原料とするヒト由来のぺプ チドゃ、 ヒト由来の遺伝子や DNA等からの変異、 または誘導体が好ましい例とし て挙げられ、 例えば、 配列表配列番号 3の 19 - 132 のアミノ酸配列を該ペプチド 中に包含していることが好ましく、 この場合に、 勿論、 前述の通り、 可溶性トロ ンボモジュリンであるとの性質が必要となる。 この配列表配列番号 3の 19 - 132 のアミノ酸配列は、 トロンビンによるプロテイン Cの活性ィ匕を促進する作用等を 有する限り自然または人工的に変異していてもよく、 すなわち配列表配列番号 3 の 19-132 のアミノ酸配列の 1つ以上、 すなわち 1つまたは複数のアミノ酸、 さ らに好ましくは数個のアミノ酸配列が置換、 欠失、 付加していても良い。 例えば 配列表配列番号 7の 19-132 のアミノ酸配列、 すなわち配列表配列番号 3のアミ ノ酸配列中の 125位の Valが Alaに置換された配列からなるぺプチド、 またはそ れらを包含するペプチドも本発明に用いることができる。 許容される変異の程度 は、 活性を有する限り特に限定されないが、 例えばアミノ酸配列として、 50%以 上、 好ましくは 70%以上、 特に好ましくは 80%以上、 さらに好ましくは 90%以 上または 95%以上、 さらには 98%以上の相同性が例示される。 後述の通り、 こ れらの変異にっレヽては通常の遺伝子操作技術を用レヽれば容易に取得可能である。 また、 本発明に用いることのできる可溶 1"生トロンボモジュリンとしては、 例え ば、 配列表配列番号 1のァミノ酸配列をコードする DNAをベクターにより宿主細 胞にトランスフエタトして調製された形質転換細胞より取得されるべプチドが挙 げられる。 この形質転換細胞により取得されるペプチドとしては、 配列表配列番 号 1の 19-516位のアミノ酸配列からなるペプチドが好ましい例として挙げられ る。 また上述の通り、 この配列表配列番号 1の 19-516のァミノ酸配列は、 ト口 ンビンによるプロテイン Cの活性ィ匕を促進する作用を有する限り自然または人工 的に変異していてもよく、 すなわち配列表配列番号 1の 19-516 のァミノ酸配列 の 1つ以上、 すなわち 1つまたは複数のアミノ酸、 さらに好ましくは数個のアミ ノ酸が置換、 欠失、 付加していても良い。 例えば配列表配列番号 5の 19-516 の アミノ酸配列、 すなわち配列表配列番号 1のアミノ酸配列中の 473位の Val が Ala に置換された配列からなるぺプチドも本発明に用いることができる。 その他 に宿主細胞によっては、 シグナル部分がそのままのものや、 前記配列表配列番号 1、 又は配列番号 5の 17-516位のアミノ酸配列のそれぞれからなるペプチド、 またはそれらの混合物等が産生され、 それらのいずれであってもよい。 勿論これ らのぺプチドは極めて溶解性が高く、 前述の溶解性を十分に有するものである。 本発明において、 上記の配列表配列番号 1の 19- 516位、 又は 17- 516位のそれぞ れのァミノ酸配列からなるぺプチドは特に好ましレ、。
また、 可溶性トロンボモジュリンが、 配列表配列番号 4または 8の 55-396 の 塩基配列の相捕 DNAに対してストリンジェントな条件下にてハイブリダィズでき る DNAによりコードされるペプチドであり、 トロンビンのプロテイン Cの活性ィ匕 を促進する作用を有し、 且つ界面活性剤の非存在下で溶解し得ることのできるこ とも好ましレ、。 ストリンジェントな条件とは、 相補 DNAが目的の DNAと特異的に ハイブリダィズできる条件であって、 例えば、 相補 DNAに DNA、 腿、 合成 DNAを 用いてハイプリダイズさせ、 その後、 非特異的に目的の DNA以外にハイプリダイ ズした相補 DNA を洗い流す条件を言う。 例えば、 Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning,第 2版、 Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) を参考にして決定すればよい。 例えば、 42°Cで、 6 X SSC、 5 X Denhardt s reagent 0. 5% SDS、 100 g/mL denatured, fragmented salmon sperm DNA, 50%ホルムアミ ド中ハイブリダィズせしめ、 68°Cで、 0. 1 X SSC、 0. 5%SDSにて洗浄してもハイブリダイズするものが挙げられる。
さらに、 これらのペプチドは、 前記のアミノ酸配列を有すればよいのであって、 糖鎖が付いていても、 又付いていなくともよく、 この点は特に限定されるもので はない。 また遺伝子操作においては、 使用する宿主細胞の種類により、 糖鎖の種 類や、 付加位置や付加の程度は相違するものであり、 いずれも用いることができ る。 後述の通り、 遺伝子操作により取得することに特定されるものではないが、 遺伝子操作により取得する場合には、 発現に際して用いることができるシグナル 配列としては、 上述の配列表配列番号 1の 1-18 のァミノ酸配列からなる塩基配 列、 その他公知のシグナル配列、 例えば、 ヒト組織プラスミノーゲン活性ィヒ因子
(tPA)のシグナル配列を利用することができる （国際公開 88/9811 号公報参照の こと）。
可溶性ト口ンポモジュリンをコードする DNA配列を宿主細胞へ導入する場合に は、 好ましくは可溶性ト口ンボモジュリンをコ一ドする DNA配列を、 ベクター、 特に好ましくは、 動物細胞において発現可能な発現ベクターに組み込んで導入す る方法が挙げられる。 発現ベクターとは、 プロモーター配列、 mRNAにリボソーム 結合部位を付与する配列、 発現したい蛋白をコードする DNA配列、 スプライシン グシグナル、 転写終結のターミネータ一配列、 複製起源配列などで構成される DNA分子であり、 好ましい動物細胞発現ベクターの例としては、 R. C. Mulligan ら [Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 78. 2072 (1981) ]が報告している pSV2_Xや、 P. M. Howleyら [Method in Emzymology, 101, 387, Academic Press (1983) ]が報 告している pBP69 T (69 - 6)などが挙げられる。
これらのぺプチドを製造するに際して用いることのできる宿主細胞としては、 チャイニーズハムスター卵巣（CH0)細胞、 COS- 1 細胞、 COS- 7細胞、 VER0(ATCC CCL- 81)細胞、 BHK細胞、 ィヌ腎由来 MDCK細胞、 ハムスター AV- 12- 664細胞等が、 またヒ ト由来細胞として HeLa細胞、 WI38細胞、 ヒ ト 293細胞等が挙げられる。 CH0細胞にぉレ、ては、 DHFR-CH0細胞がさらに好ましレ、。
また、 遺伝子操作の過程やペプチドの製造過程において、 大腸菌等の微生物も 多く使われ、 それぞれに適した宿主一ベクター系を使用することが好ましく、 上 述の宿主細胞においても、 適宜のベクター系を選択することができる。 遺伝子組 換え技術に用いる可溶性ト口ンボモジュリンの遺伝子は、 クローニングされてお り、 そして可溶性ト口ンボモジュリンの遺伝子 ,袓換え技術を用いた製造例が開示 されており、 さらにはその精製品を得るための精製方法も知られている [特開昭 64-6219号公報、 特開平 2-255699号公報、 特開平 5-213998号公報、 特開平 5 - 310787 号公報、 特開平 7-155176 号公報、 J. Biol. Chem. , 264： 10351- 10353 (1989) ]。 したがって本発明の可溶性トロンポモジュリンは、 上記の報告に 記載されている方法を用いることにより、 あるいはそれらに記載の方法に準じる ことにより製造することができる。 例えば特開昭 64 - 6219号公報では、 全長のト 口ンポモジュリンをコードする DNA を含むプラスミ ド pSV2TMJ2 を含む、 Escherichia coli K - 12 strain DH5 (ATCC寄託番号 67283号）が開示されている。 また、 この菌株を生命研 （現独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託 センター） に再寄託した菌株 (Escherichia coli DH5/pSV2TM J2) (FERMBP-5570) を用いることもできる。 この全長のトロンポモジュリンをコードする DNAを原料 として、 公知の遺伝子操作技術によって、 本発明の可溶性ト口ンポモジュリンを 調製することができる。
本発明に用いられる可溶性ト口ンポモジュリンは、 従来公知の方法またはそれ に準じて調製すればよいが、 例えば、 前記山本らの方法 [特開昭 64-6219号公 報]、 または特開平 5 - 213998号公報を参考にすることができる。 すなわちヒト由 来の可溶性トロンボモジュリン遺伝子を遺伝子操作技術により、 例えば、 配列表 配列番号 1のアミノ酸配列をコードする DNA となし、 さらに必要に応じた改変を 行うことも可能である。 この改変としては、 メソッド イン ェンザィモロジ一 [Method in Enzymology, 100： 468 (1983 年）， アカデミックプレス（Academic Press) ]に記載の方法に従って、 部位特異的変異を行う。 例えば、 配列表配列番 号 2の第 1418位の塩基 Tは、 変異用合成 DNAを用いて塩基 Cに変換した DNAと なすことができる。
このようにして調製した DNA を、 例えばチャイニーズハムスター卵巣 (CH0)細 胞に組み込んで、 形質転換細胞とし、 適宜選択し、 この細胞を培養して得た培養 液から、 公知の方法により精製された可溶性トロンボモジュリンが製造できる。 前述の通り配列表配列番号 1のァミノ酸配列をコ一ドする DNAを前記宿主細胞に トランスフエクトすることが好ましレ、。 本発明に用いられる可溶性トロンポモジ ュリンの生産方法は、 上記の方法に限定されるものではなく、 例えば、 尿や血液、 その他体液等から抽出精製することでも可能であるし、 また可溶性ト口ンポモジ ュリンを生産する組織またはこれら組織培養液等から抽出精製することも、 また 必要によりさらに蛋白分解酵素により切断処理することも可能である。
次いで上記により取得された培養上清、 または培養物からの可溶性ト口ンボモ ジュリンの単離精製方法は、 公知の手法 [堀尾武ー編集、 蛋白質 ·酵素の基礎実 験法] に準じて行なうことができる。 例えば、 可溶性トロンボモジュリンと逆の 電荷を持つ官能基を固定化したクロマトグラフィ一担体と、 可溶性ト口ンボモジ ュリンの間の相互作用を利用したィオン交換ク口マトグラフィ一や吸着ク口マト ダラフィ一の使用も好ましい。 また、 可溶性ト口ンボモジュリンとの特異的親和 性を利用したァフィ二ティークロマトグラフィーも好ましい例として挙げられる。 吸着体の好ましい例として、 可溶性ト口ンボモジュリンのリガンドであるトロン ビンや可溶性ト口ンポモジュリンの抗体を利用する例が挙げられる。 これらの抗 体としては、 適宜の性質、 或いは適宜のェピトープを認識する可溶性トロンポモ ジュリンの抗体を利用することができ、 例えば、 特公平 5- 42920号公報、 特開昭 64-45398号公報、 特開平 6-205692号公報などに記載された例が挙げられる。 ま た、 可溶性ト口ンポモジュリンの分子量サイズを利用した、 ゲル濾過クロマトグ ラフィ一や限外濾過が挙げられる。 そしてまた、 疎水性基を固定化したクロマト グラフィ一担体と、 可溶性トロンボモジュリンのもつ疎水性部位との間の疎水結 合を利用した疎水性クロマトグラフィーが挙げられる。 また、 吸着クロマトダラ フィ一としてハイドロキシァパタイトを担体として用いることも可能であり、 例 えば、 特開平 9 - 110900号公報に記載した例が挙げられる。 これらの手法は適宜 組み合わせることができる。 精製の程度は、 使用目的等により選択できるが、 例 えば電気泳動、 好ましくは SDS - PAGEの結果が単一バンドとして得られるか、 も しくは単離精製品のゲル據過 HPLCまたは逆相 HPLCの結果が単一のピークになる まで純粋化することが望ましい。
もちろん、 複数種の可溶性トロンボモジュリンを用いる場合には、 実質的に可 溶性ト口ンボモジュリンのみのバンドになることが好ましいのであり、 単一のパ ンドになることを求めるものではない。
本発明における精製法を具体的に例示すれば、 可溶性ト口ンボモジュリン活性 を指標に精製する法が挙げられ、 例えばイオン交換カラムの Q-セファロース Fast Flowで培養上清または培養物を粗精製し可溶性ト口ンポモジュリン活性を 有する画分を回収し、 ついでァフィ二ティーカラムの DIP-トロンビン-ァガロー ス（diisopropylphosphorylthrombin agarose)力ラムで主精製し可溶性ト口ンボ モジュリン活性が強い画分を回収し、 回収画分を濃縮し、 ゲルろ過にかけ可溶性 ト口ンボモジュリン活性画分を純品として取得する精製方法 [Gomi K.ら、 Blood、 75: 1396 - 1399 (1990) ]が挙げられる。 指標とする可溶性ト口ンボモジュリン活性 としては、 例えばト口ンビンによるプロティン C活性化の促進活性が挙げられる。 その他に、 好ましい精製法を例示すると以下の通りである。
可溶性ト口ンポモジュリンと良好な吸着条件を有する適当なイオン交換樹脂を 選定し、 イオン交換クロマト精製を行なう。 特に好ましい例としては、 0. 18 M NaClを含む 0. 02 M トリス塩酸緩衝液 (ρΗ7· 4)で平衡化した Q-セファロース Fast Flowを用いる方法である。 適宜洗浄後、 例えば 0. 3M NaCl含む 0. 02 M トリス塩 酸緩衝液 (PH7. 4)で溶出し粗精製品の可溶性ト口ンボモジュリンを得ることがで きる。
次に、 例えば可溶性ト口ンボモジュリンと特異的親和性を持つ物質を樹脂に固 定化しァフィ二ティークロマト精製を行なうことができる。 好ましい例として DIP -トロンビン-ァガロースカラムの例と、 抗可溶性ト口ンボモジュリンモノク 口ーナル抗体力ラムの例が挙げられる。 DIP-トロンビン-ァガロースカラムは、 予め、 例えば、 100 mM NaClおよび 0. 5 mM塩化カルシウムを含む 20 mMトリス塩 酸緩衝液 (PH7. 4)で平衡ィ匕せしめ、 上記の粗精製品をチャージして、 適宜の洗浄 を行い、 例えば、 1. 0 M NaCl及び 0. 5 mM塩化カルシウムを含む 20 mM トリス塩 酸緩衝液 (PH7. 4)で溶出し精製品の可溶性ト口ンボモジュリンを取得することが できる。 また抗可溶性ト口ンボモジュリンモノクローナル抗体カラムにおいては、 予め CNBrにより活性ィ匕したセファロース 4FF (フアルマシア社） に、 抗可溶性ト 口ンポモジュリンモノクローナル抗体を溶解した 0. 5 M NaCl含有 0. 1 M NaHC03 緩衝液 (ρΗ8· 3)に接触させ、 セファロース 4FF に抗可溶性ト口ンポモジュリンモ ノクローナル抗体をカツプリングさせた樹脂を充填したカラムを、 予め例えば 0. 3 M NaCl含む 20 mM リン酸塩緩衝液 (pH7. 3)で平衡ィ匕し、 適宜の洗浄の後、 例 えば、 0. 3 M NaCl含む 100 mMグリシン塩酸緩衝液 (pH3. 0)にて溶出せしめる方法 が例示される。 溶出液は適当な緩衝液で中和し、 精製品として取得することもで きる。
次に得られた精製品を pH3. 5に調整した後に、 0. 3 M NaClを含む 100 mMダリ シン塩酸緩衝液 (PH3. 5)で平衡ィ匕した陽イオン交換体、 好ましくは強陽イオン交 換体である SP -セファロース FF (フアルマシア社） にチャージし、 同緩衝液で洗 浄'して得られた非吸着画分を得る。 得られた画分は適当な緩衝液で中和し、 高純 度精製品として取得することができる。 これらは、 限外濾過により濃縮すること が好ましい。
さらに、 ゲル濾過による緩衝液交換を行なうことも好ましレ、。 例えば、 50 IDM NaClを含む 20 mMリン酸塩緩衝液 (pH7. 3)で平衡化せしめた Sephacryl S- 300力 ラムもしくは S - 200カラムに、 限外濾過により濃縮した高純度精製品をチャージ し、 50 mM NaCl を含む 20 mM リン酸塩緩衝液 (pH7. 3)で展開分画し、 トロンビン によるプロテイン Cの活性ィ匕の促進活性の確認を行ない活性画分を回収し緩衝液 交換した高純度精製品を取得することができる。 このようにして得られた高純度 精製品は安全性を高めるために適当なウィルス除去膜、 例えばブラノバ 1 5 N (旭化成株式会社） を用いてろ過することが好ましく、 その後限外濾過により目 的の濃度まで濃縮することができる。 最後に無菌濾過膜により濾過することが好 ましい。
本発明の起泡抑制としては、 可溶性ト口ンボモジュリン含有凍結乾燥製剤を溶 解用水溶液で溶解して、 可溶性ト口ンボモジュリン高濃度含有溶液を得る際に、 溶液中に発生する気泡を抑制することと通常理解される。 本発明の起泡抑制方法 により、 気泡の発生がほぼ完全に防止されることが、 勿論最も好ましいことでは あるが、 起泡抑制のための方策を行わなかった場合に比較して、 本発明の起泡抑 制を行った場合に、 起泡の程度が改善されている場合には、 起泡抑制効果がある と理解される。
起泡抑制の程度を知る方法としては、 目視で濁り度合いを観察する方法がある 力 例えば、 以下の方法により、 気泡の発生程度を濁度として波長 650 nmの透 過率を測定することにより調べることができる。 例えば、 測^料となる凍結乾 火 #M剤 （例えば 3 mLバイアル瓶（18 X 33 應、 口内径 9. 1 脑、 ナミコス製)、 ゴム 栓 (V5- F8、 大協精ェ製)） のゴム栓中央に、 溶解用水溶液 （例えば日本薬局方注 射用水、 大塚製薬工場製） 1 mL を吸引した注射用シリンジ （ッベルクリン用 1 mL、 注射針: 26G 0. 45 X 13 脑、 テルモ製） を刺し、 0. 1 mL/秒の速度で溶解用水 溶液を凍結乾燥物中央に注入する。 注射用シリンジを刺したまま静置して溶解さ せる。 注入終了の 30秒後にバイアル瓶を逆さまにしてシリンジで凍乾物溶解液 を約 0. 8 mL 吸引する。 この吸引した溶解液を石英セル （ブラックセル、 光路 長： 10 mm、 光路幅： 2 mm、 ジーエルサイエンス製） にセル壁を伝わらせて静かに 注ぐ。 素早く紫外可視分光光度計 （UV- 2500PC、 島津製作所製） を用いて、 650 ranの透過率 （事前に溶解用水溶液のみで 650 nmにおける透過率 100%を調整して おく） を測定すればよレヽ。 測定の正確性を期すためには、 溶解用水溶液を注入し てから透過率を測定するまでの時間を一定とすべきであり、 例えば凍乾物溶解液 をバイアル瓶から吸引して透過率を測定するまでの時間は 15秒程度とすること が好ましい例として挙げられる。 起泡抑制の程度としては、 目視で観察した場合、 白濁して見えるほど気泡が発生していないことが通例好ましく、 目視では気泡が 確認できないことがさらに好ましい。 さらに上記の »を用いて濁度を測定する 方法の場合、 溶液の透過率が 95%以上が好ましく、 97%以上がさらに好ましく、 特 に好ましくは 98%以上、 最も好ましくは 99%以上が挙げられる。
本発明の可溶性ト口ンポモジュリン含有凍結乾燥製剤を溶解して得られる可溶 性ト口ンボモジュリン高濃度含有溶液において、 可溶性ト口ンボモジュリン濃度 の上限としては、 溶解し得る濃度以下であれば特に制限は無いが、 例えば、 通常 100 mg/mL以下、 または 80 mg/mL以下であり、 好ましくは 60 mg/mL以下、 又は 50 mg/mL以下、 さらに好ましくは 40 mg/mL以下が挙げられ、 特に好ましくは 30 mg/mL以下が挙げられる。 可溶性トロンボモジュリン濃度の下限としては 10 mg/mL以上、 又は 13 mg/mL以上が好ましく、 15 mg/mL以上、 又は 16 mg/mL以上 がさらに好ましい。 17 mg/mL以上がさらに好ましく、 20 mg/mL以上が特に好ま しい。 また 25 mg/mL以上も好ましく、 特に約 30 mg/mL, またはそれ以上が好ま しい例として挙げられる。 なお、 起泡抑制の効果を求める場合には、 起泡の問題 が生ずる濃度であることが好ましい。
本発明の起泡を抑制する添加剤 （以下、 起泡抑制添加剤と言うことがある） と して挙げた非イオン性界面活性剤は、 医薬品の添加剤として利用可能なものであ ることが好ましいが、 特に限定されるものではない。 本発明の非イオン性界面活 性剤を構造から分類すると例えば、 ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステ ル、 ポリオキシエチレン一ポリオキシプロピレン共重合体、 ポリオキシエチレン アルキルエーテル、 ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、 ポリオキシエチレン硬 化ヒマシ油などが好ましい種類として挙げられる。
ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルとしては、 例えばモノラウレー ト （Polysorbate 20)、 モノパルミテート （Polysorbate 40)、 モノステアレート (Polysorbate 60)、 トリステアレート、 イソステアレート、 モノォレート (Polysorbate 80)、 トリオレートなどが例示されるが、 好ましくは Polysorbate 20、 Polysorbate 40、 Polysorbate 60、 Polysorbate 80などであり、 特に好まし くは Polysorbate 80が挙げられる。
また、 ポリオキシエチレン一ポリオキシプロピレン共重合体としては、 プロピ レンォキサイドとエチレンォキサイドの重合度はそれぞれ任意であって特に制限 は無いが、 好ましくは Poloxamer 124、 Poloxamer 188、 Poloxamer 237、 Poloxamer 338、 Poloxamer 407などが例示され、 特に好ましくは Poloxamer 188、 ポリオキシエチレン （160) ポリオキシプロピレン （30) グリコールが挙げられ る。
また、 ポリオキシエチレンアルキルエーテルとしては、 例えば高級アルコール 部がラウリルアルコール、 ミリスチルアルコール、 セチルアルコール、 ステアリ ルアルコールなどが挙げられ、 酸化エチレンの重合度は任意であるが、 ラウロマ クロゴーノレ （ポリオキシエチレンラウリルエーテル） が好ましく、 酸化エチレン の付加モル数が 9、 2 1、 2 5のものなどがさらに好ましレ、。
また、 ポリオキシエチレン脂肪酸エステルとしては、 例えばモノラウレート、 ジラウレート、 モノステアレート、 ジステアレート、 モノォレート、 ジォレート などが例示されるが、 ポリオキシエチレンモノステアレートが好ましく、 酸化工 チレンの付加モル数により Polyoxyl 12 stearate、 Polyoxyl 20 stearate、 Polyoxyl 40 stearates Polyoxyl 50 stearate % Polyoxyl 100 stearate など力 s さらに好ましく、 Polyoxyl 40 stearateが特に好ましレ、。
また、 ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油としては、 酸化エチレンの付加モル数 によ り Polyoxyl 20 hydrogenated castor oil、 Polyoxyl 30 hydrogenated castor oil 、 Polyoxyl 40 hydrogenated castor oil 、 Polyoxyl 50 hydrogenated castor oil (ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油 60 と記載すること もめる)、 Polyoxyl '60 hydrogenated castor oil、 Polyoxyl 80 hydrogenated castor oil、 Polyoxyl 100 hydrogenated castor oil、 など力 s好ましく、 Polyoxyl 60 hydrogenated castor oil (以下 HC0- 60 という表現をする場合もあ る。 ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油 60 と言う事もある）が特に好ましい。 これ らの非ィォン性界面活性剤を用いる場合は、 1種類あるいは 2種類以上を混合し て用いることができるし、 さらにべンジルアルコールゃクロロブタノールと混合 して用いることもできる。
本発明の可溶性ト口ンポモジュリン含有凍結乾燥製剤中、 または該可溶性ト口 ンボモジュリン含有凍結乾燥製剤を溶解するための溶解用水溶液中に添加される 起泡抑制添加剤の添加量は、 起泡を抑制できる量であれば特に制限されるもので はないが、 可溶性ト口ンボモジュリンの濃度や、 その他の添加剤の含有量により 適宜判断すればよく、 さらに、 後述する（b)該可溶性ト口ンボモジュリン含有凍 結乾燥製剤を溶解する際の容器の内壁がシリコーンでコーティングされているこ と、 または (c)該可溶性ト口ンボモジュリン含有凍結乾燥製剤を溶解する際の容 器内圧力が減圧状態であること、 等の処置の有無によっても変ィ匕し得るので、 例 えば、 上記の気泡の発生程度を波長 650 nmの透過率を測定する方法において、 例えば 95%以上の透過率を示すようになる添加量を予め測定して添加量を決定す ることが好ましい。 一例としては、 起泡抑制添加剤の内、 非イオン性界面活性剤 の添加量は、 有効成分として可溶性ト口ンボモジュリンを含有する可溶性トロン ポモジュリン含有凍結乾燥製剤を溶解して、 10 mg/raLの可溶性ト口ンボモジュリ ン高濃度含有溶液を調製するに際しでは、 この溶液中に存在する非ィオン性界面 活性剤の添加量の下限としては、 例えば 0. 001 mg以上が好ましく、 より好まし くは 0. 005 mg以上、 さらに好ましくは 0. 01 mg以上、 場合によっては 0. 05 mg 以上、 または 0. 1 mg以上、 さらには 0. 5 mg以上である例が挙げられる。 非ィォ ン性界面活性剤の上限としては通常 10 mg以下であり、 好ましくは 5 mg以下、 さらに好ましくは 1 mg以下、 場合によっては 0. 5 mg以下が挙げられる。 また、 . 30 mg/mLの可溶性ト口ンポモジュリン高濃度含有溶液を調製するに際しては、 こ の溶液中に存在する非イオン性界面活性剤の添加量の下限としては、 例えば 0. 003 mg以上が好ましく、 より好ましくは 0. 015 mg以上、 さらに好ましくは 0. 03 mg以上、 場合によっては 0. 15 mg以上、 または 0. 3 mg以上、 さらには 1. 5 mg以上である例が挙げられる。 非イオン性界面活性剤の上限としては、 例えば通 常 30 mg以下であり、 好ましくは 15 mg以下、 さらに好ましくは 3 mg以下、 場 合によっては 1. 5 mg以下が挙げられる。 さらに、 17， 20, 25 mg/mL等やそれら 以外の可溶性ト口ンボモジュリン高濃度含有溶液を調製するに際しては、 実際に 添加量を測定することが好ましいが、 例えば 10 mg/mLと 30 mg/mLの可溶性ト口 ンボモジュリン高濃度含有溶液中に存在する非イオン性界面活性剤の上記の添加 量の例示を参考に、 可溶性ト口ンボモジュリンの濃度に基づいて等比等の計算に て求めることも好ましい。
また、 複数の非イオン性界面活性剤を添加する場合にも、 波長 650 nmの透過 率を測定する方法において、 95%以上の透過率を示すような添加量を調べる等の 方法により決定することができる。 通常は、 複数の イオン性界面活性剤の合計 量が、 上記に例示された添加量とすることが簡便であろうし、 若干濃い目に添加 することも好ましい。
本発明の可溶性ト口ンボモジュリン含有凍結乾燥製剤中、 または該可溶 '性ト口 ンポモジュリン含有凍結乾燥製剤を溶解するための溶解用水溶液中に添カ卩される 起泡抑制添加剤の内、 ベンジルアルコール、 クロロブタノール、 または両物質を 混合した時の添加量は、 起泡を抑制できる量であれば特に制限されるものではな いが、 可溶性ト口ンボモジュリンおよびその他の添加剤の含有量により適量添加 することができる。 なお、 ベンジルアルコール、 クロロブタノールを使用して起 泡抑制効果を発揮せしめるに際しては、 溶解用水溶液中に、 これらの化合物を添 加することが好ましい。 これらの添加量を検討する方法は、 上述した通り、 例え ば、 上記の波長 650皿の透過率を測定し、 95%以上の透過率を示すような添加量 を調べる方法が好ましレ、。 具体的な一例としては、 例えば、 該可溶性トロンボモ ジュリン含有凍結乾燥製剤を溶解して、 10 mg/mLの可溶性ト口ンボモジュリン高 濃度含有溶液を調製するに際しては、 この溶液中に存在するべンジルアルコール、 クロロブタノール、 または両物質を混合した時の添加量の下限としては、 例えば 0. 01 mg以上が好ましく、 より好ましくは 0. 05 mg以上、 さらに好ましくは 0. 1 mg以上、 場合によっては 0. 5 mg以上、 または 1 mg以上、 さらには 5 mg以上で ある例が挙げられる。 上限としては、 例えば通常 100 mg以下であり、 好ましく は 50 mg以下、 さらに好ましくは 10 mg以下、 場合によっては 5 mg以下が挙げ られる。 また、 30 mg/raLの可溶性ト口ンボモジュリン高濃度含有溶液を調製する に際しては、 この溶液中に存在するべンジルアルコール、 クロロブタノール、 ま たは両物質を混合した時の添加量の下限としては、 例えば 0. 03 mg以上が好まし く、 より好ましくは 0. 15 mg以上、 さらに好ましくは 0. 3 mg以上、 場合によつ ては 1. 5 mg以上、 または 3 mg以上、 さらには 15 mg以上である例が挙げられる。 上限としては、 通常 300 mg以下であり、 好ましくは 150 mg以下、 さらに好まし くは 30 mg以下、 場合によっては 15 mg以下が挙げられる。 さらに、 上記以外の 可溶性トロンポモジュリン高濃度含有溶液を調製するに際しては、 例えば 10 mg/mLや 30 mg/mLの可溶性ト口ンポモジュリン高濃度含有溶液中に存在するベン ジルアルコール、 クロロブタノール等の上記の添加量の例示を参考に可溶性ト口 ンボモジュリンの濃度に基づいて等比で計算にて求めることも好ましい例として 挙げられる。
本発明における溶解用水溶液としては、 特に限定されないが、 例えば蒸留水 (または注射用水）、 生理食塩液、 ブドウ糖注射液、 キシリトール注射液などが 挙げられ、 蒸留水が好ましい例として挙げられる。 さらに、 該溶解用水溶液中に、 非ィオン性界面活性剤、 ベンジルアルコール、 クロロブタノールからなる群より 選ばれる少なくとも一種の化合物が存在せしめることも好ましい。 上記の凍結乾 燥製剤中に非ィオン性界面活性剤、 ベンジルアルコール、 クロロブタノールから なる群より選ばれる少なくとも一種のィ匕合物を含む場合には、 溶解用水溶液とし ては、 蒸留水、 生理食塩液、 またはブドウ糖注射液などを使用することが出来、 またさらに非ィオン性界面活性剤、 ベンジルアルコール、 クロロブタノールから なる群より選ばれる少なくとも一種の化合物を含んでいてもよレ、。 通常、 上記凍 結乾燥製剤中には、 ベンジルアルコール、 クロロブタノールではなく、 非イオン 性界面活性剤が含有されることが凍結乾燥製剤においては好ましい。 上記凍結乾 剤中に非ィオン性界面活性剤、 ベンジルアルコール、 クロロブタノ一ルを含 まない場合は、 溶解用水溶液には、 非イオン性界面活性剤、 ベンジルアルコール、 クロロブタノールからなる群より選ばれる少なくとも一種の化合物を含ませるこ とにより、 起泡抑制作用を発揮させることが出来、 その場合も好ましい。 なお、 溶解用水溶液中に起泡抑制添加剤を添加する場合の起泡抑制添加剤の添加量は、 起泡抑制効果が有効に発揮するのであれば特に制限されるものではないが、 可溶 性ト口ンボモジュリン高濃度含有溶液の可溶性ト口ンボモジュリン濃度に対する 添加量として上記に例示した量が好ましい。
溶解用水溶液に非ィオン性界面活性剤を添加する際の添加量は、 起泡抑制効果 が有効に発揮するのであれば特に制限されるものではなく、 前述の通り測定する ことにより適宜決定すればよいが、 簡便のために、 通常の可溶性ト口ンポモジュ リン濃度等の条件において目安となる溶解用水溶液中の非ィオン性界面活性剤、 ベンジルアルコール、 またはク口ロブタノールの添加量を提示すると以下が例示 される。 すなわち、 非イオン性界面活性剤においては、 通常添加量の上限として は、 例えば蒸留水 1 mLに対して、 通常 100 mg以下、 または 50 mg以下、 好まし くは 30 mg以下、 又は 10 mg以下、 特に好ましくは 1 mg以下が挙げられる。 下 限としては 0. 001 mg以上、 好ましくは 0. 01 mg以上、 さらに好ましくは 0. 03 mg 以上、 特に好ましくは 0. 05 mg以上、 または 0. 1 mg以上が例示される。 ベンジ ルアルコールの添加量は、 例えば蒸留水 1 mL に対しての添加量の上限としては、 通常、 50 mg以下、 又は 40 mg以下、 好ましくは 30 mg以下、 さらに好ましくは 20 mg以下、 又は 10 mg以下が挙げられる。 下限としては 0. 1 mg以上、 又は 1 mg以上、 好ましくは 4 mg以上、 又は 5 mg以上、 さらに好ましくは 7 mg以上、 特に好ましくは 10 mg以上が例示される。 また、 クロ口ブタノールの添加量は、 例えば蒸留水 1 mL に対しての添加量の上限としては、 通常、 20 mg以下、 又は 15 mg以下、 好ましくは 10 mg以下、 又は 8 mg以下、 さらに好ましくは 7 mg以 下、 又は 5 mg以下が挙げられる。 下限としては通常、 0. 1 mg以上、 又は 1 mg以 上、 好ましくは 2 mg以上、 さらに好ましくは 3 mg以上、 特に好ましくは 5 mg 以上が例示される。
また、 溶解用水溶液の容量は、 少量から大量まで特に限定されないが、 皮下 注射や筋肉内注射を考慮したときには、 通常、 0. 1 mL以上、 好ましくは 0. 3 mL 以上、 さらに好ましくは 0. 5 mL以上が例示される。 また、 その容量の上限とし ては、 通常 10 mL以下、 好ましくは 5 mL以下、 さらに好ましくは 3 mL以下、 特 に好ましくは 2 mL以下、 または 1. 5 mL以下が例示される。 さらに、 その容量は、 通常は、 約 0. 5 mLから約 1 mLであることが特に好ましい。
浸透圧比としては、 製剤の投与時に疼痛を感じないことが望ましいが、 通例 0. 5以上が好ましく、 さらに好ましくは 0. 8以上が挙げられる。 上限としては、 2. 0以下が好ましく、 さらに好ましくは 1. 5以下、 特に好ましくは 1. 2以下が挙 げられる。
本発明の起泡抑制方法、 およびその効果を達成するためには、 可溶性トロンポ モジュリン含有凍結乾燥製剤、 またはそのキット製剤において、 前述した可溶性 ト口ンボモジュリンと起泡抑制添加剤の他の糸且成は、 起泡抑制に特別に障害とな らない限り、 特に限定されず、 例えば、 アルギニンを初めとする 種のアミノ酸 またはその塩や、 マンニトール、 トレハロース等の糖類、 さらには尿素が添加さ れていてもよく、 その他の通常用いられる添加物を添加することができる。 また さらに、 それらの組成物を含有させず、 可溶性ト口ンボモジュリンのみの凍結乾 燥製剤、 または可溶性ト口ンボモジュリンと起泡抑制添加剤とからなる凍結乾燥 製剤であってもよレ、。 し力 し、 後述の（1) グノレタミン酸またはその塩、 およぴマ ンニトールの 2種を含む、 （2) グルタミン酸またはその塩、 およびリシンまたは その塩の 2種を含む、 （3) グルタミン酸またはその塩、 およびァスパラギン酸ま たはその塩の 2種を含む、 または (4) ァスパラギン酸またはその塩、 およびマン 二トールの 2種を含む、 のいずれかの組み合わせを含有せしめた可溶性ト口ンポ モジュリン含有凍結乾燥製剤は安定性も好ましく、 最適である。 その他に、 アル ギニン、 トレノヽロースまたは尿素の組成も好ましい例として挙げられる。
すなわち、 本発明は、 該可溶性トロンボモジュリン含有凍結乾燥製剤が、 （1) グルタミン酸またはその塩、 およびマンニトールの 2種を含む、 （2) グルタミン 酸またはその塩、 およびリシンまたはその塩の 2種を含む、 （3) グルタミン酸ま たはその塩、 およびァスパラギン酸またはその塩の 2種を含む、 または (4) ァス パラギン酸またはその塩、 およびマンニトールの 2種を含む、 のいずれかの組み 合わせを含有せしめられており、 さらに該可溶性ト口ンボモジュリン含有凍結乾 燥製剤中に、 非イオン性界面活性剤、 ベンジルアルコール、 クロロブタノールか らなる群より選ばれる少なくとも一種の化合物が存在せしめられている力、 およ び/または該可溶性ト口ンポモジュリン含有凍結乾燥製剤を溶解するための溶解 用水溶液中に、 非イオン性界面活性剤、 ベンジルアルコール、 クロロブタノール からなる群より選ばれる少なくとも一種の化合物が存在せしめられていることを 特徴とする可溶性ト口ンボモジュリン高濃度含有溶液の起泡抑制方法である。 な お、 該可溶性ト口ンボモジュリン含有凍結乾; »剤が、 0. 1 mLから 2 mLの溶解 用水溶液に溶解し得て、 10 mg/mL以上の可溶性ト口ンポモジュリン高濃度含有溶 液を調製でき、 その溶解時の浸透圧比が 0. 5から 2. 0であることが好ましレ、。 また本発明は、 該可溶性トロンポモジュリン含有凍結乾燥製剤が、 （1) 尿素、 または (2) 尿素およびアミノ酸、 のいずれかを含有せしめられており、 さらに該 可溶性トロンボモジュリン含有凍結乾燥製剤中に、 非イオン性界面活性剤、 ベン ジルアルコール、 クロロブタノールからなる群より選ばれる少なくとも一種のィ匕 合物が存在せしめられているか、 および/または該可溶性ト口ンボモジュリン含 有凍結乾燥製剤を溶解するための溶解用水溶液中に、 非イオン性界面活性剤、 ベ ンジルアルコール、 クロロブタノールからなる群より選ばれる少なくとも一種の 化合物が存在せしめられていることを特徴とする可溶性ト口ンボモジュリン高濃 度含有溶液の起泡抑制方法である。 なお、 該可溶性トロンボモジュリン含有凍結 乾燥製剤が、 0. 1 mLから 2 mLの溶解用水溶液に溶解し得て、 10 mg/mL以上の可 溶性ト口ンボモジュリン高濃度含有溶液を調製でき、 その溶解時の浸透圧比が 0. 5から 2. 0であることが好ましレ、。
さらに本発明は、 該可溶性トロンボモジュリン含有凍結乾燥製剤が、 アルギニ ン、 グルタミン酸、 プロリン、 セリン、 グリシン、 ヒスチジン、 ァスパラギン、 リジン、 フエ二ルァラニンおょぴバリン、 およびそれらの塩、 トレハロース、 ラ クトース、 スクロ ^"スからなる群より選ばれた一種または二種を含有せしめられ ており、 さらに該可溶性トロンポモジュリン含有凍結乾燥製剤中に、 非イオン性 界面活性剤、 ベンジルアルコール、 クロロブタノールからなる群より選ばれる少 なくとも一種の化合物が存在せしめられているカヽ および Zまたは該可溶性トロ ンポモジュリン含有凍結乾燥製剤を溶解するための溶解用水溶液中に、 非イオン 性界面活性剤、 ベンジルアルコール、 クロロブタノールからなる群より選ばれる 少なくとも一種の化合物が存在せしめられていることを特徴とする可溶性トロン ボモジュリン高濃度含有溶液の起泡抑制方法である。 なお、 本発明においては、 起泡抑制添加剤が含有された可溶性トロンボモジュ リン高濃度含有溶液は、 溶解時の起泡抑制だけでなく、 振とうに対する消泡の効 果も期待され、 特にべンジルアルコールゃクロロブタノールを含有せしめること が好ましい。
次いで、 （b)該可溶性ト口ンボモジュリン含有凍結乾燥製剤を溶解する際の容 器の内壁がシリコーンでコーティングされていること、 について説明する。
すなわち、 本発明の起泡抑制方法においては、 該可溶性ト口ンボモジュリン含 有凍結乾燥製剤を溶解する際の容器の内壁がシリコーンでコーティングされてい ることが好ましい。
本発明における該可溶性ト口ンボモジュリン含有凍結乾燥製剤を溶解する際の 容器としては、 医薬品の容器として使用可能なもので無菌充填することに適した 材料、 形状であれば特に限定されないが、 該可溶性トロンボモジュリン含有凍結 乾燥製剤を封入するのに適した容器であることが好ましく、 通常は、 該可溶性ト ロンポモジュリン含有凍結乾燥製剤を封入した容器を、 溶解する際にもそのまま 使用することが好ましい。 本発明における該可溶性ト口ンボモジュリン含有凍結 乾燥製剤を溶解する際の容器の材質としては、 例えばガラス又はポリプロピレン、 ポリエチレン、 環状ポリオレフイン、 環状ポリオレフインと α ォレフィンの共 重合体、 ポリエチレンテレフタレート、 ポリスチレン、 A B S樹脂、 ポリエステ ル、 ポリ塩化ビュル、 ナイロン、 ポリテトラフルォロエチレン、 ポリメチルペン テン、 6フッ化樹脂、 ポリメチルメタアタリレート、 ポリカーボネイトなどのプ ラスチック類、 ステンレススチール、 金、 アルミニウム、 アルミニウム合金、 チ タニゥムなどの金属類、 セラミック類、 炭素複合材料などの複合素材、 石英など の中から選択することができるが、 これらに限定されない。 ガラスは脱アルカリ 処理ガラスを用いることも好ましレ、。 脱アルカリ処理は、 例えば、 ガラスに硫酸 アンモニゥム水溶液を接触させて、 高 熱せしめ、 洗浄する方法、 あるいはガ ラス表面に高温状態で亜硫酸ガスなどの水溶性硫黄酸化物と接触させて、 表面の アル力リ成分を微細な硫酸塩結晶とし、 その後洗浄する方法により行うことがで きる。 プラスチック類の中ではポリプロピレン、 環状ポリオレフイン、 環状ポリ 才レフィンと OL ォレフインとの共重合体が好ましい。 さらに環状ポリオレフィ ンが特に好ましい。
本発明における該可溶性ト口ンボモジュリン含有凍結乾燥製剤を溶解する際の 容器の内壁としては、 容器を栓 （アンプル等の場合は熔閉） した時に、 容器の中 で溶解液が接触可能な容器の部分を指す。
本発明における該可溶性ト口ンポモジュリン含有凍結乾燥製剤を溶解する際の 容器の内壁に施されるシリコーンでのコーティングとしては、 通常の方法、 通常 の材料が使用可能である。 シリコーンとしては、 例えば、 ジメチルポリシロキサ ン、 メチルハイドロジェンポリシロキサンなどのシリコーンオイル、 およぴメチ ルワニスシリコーン、 メチルフエニルワニスシリコーンなどが挙げられる。 また 本発明においてシリコーンをコーティングする方法としては、 通常の方法、 例え ばシリコーン溶液に容器全体を浸漬する処理、 またはシリコーン溶液を容器内壁 にスプレーする処理、 またはシリコーン溶液を容器に注入して内壁に接触させた 後に余分のシリコーン溶液を排出する処理などの処理後に、 溶媒を蒸発させるこ とにより得ることができる。 シリコーン溶液の溶媒としては、 四塩化炭素や、 ト リクロルエチレンなどが挙げられる力 溶剤の安全性からはシリコーンを乳ィ匕さ せた水系エマルジョンを用いることも好ましい。 水系エマルジョンの溶媒除去の 場合は、 ガラスにおいては 100〜800 °Cの高温で加熱することが好ましく、 250〜 350 °Cの高温で加熱することがより好ましレ、。 樹脂などにおいては軟化しない程 度の温度が望ましい。 また、 シリコーンの量は、 通常、 付着させるシリコーン溶 液の濃度によっても表わすことが簡便と考えられる。 例えば、 濃度 l w/v°/。のシリ コーン溶液を容器に付着させて溶媒を除去する場合に、 「1 w/v%のシリコーンコ 一ティング」 として表示することとした場合には、 容器内壁へのシリコーンコー ティング量は、 下限としては、 例えば 0. 01 w/ /。以上が好ましく、 より好ましく は 0. 05 w/v%以上、 さらに好ましくは 0. 1 w/v%以上、 場合によっては 0. 5 樣 上、 または 1 w/v%以上、 さらには 2 w/V/。以上が好ましい例として挙げられる。 上限としては、 通常 10 w/v%以下であり、 好ましくは 7 w/v%以下、 さらに好まし くは 5 w/v。/。以下、 場合によっては 2 w/v°/。以下が挙げられる。
または以下に、 （c)該可溶性トロンボモジュリン含有凍結乾燥製剤を溶解する 際の容器内圧力が減圧状態であること、 について説明する。 すなわち、 本発明の起泡抑制方法においては、 該可溶性トロンポモジュリン含 有凍結乾燥製剤を溶解する際の容器内圧力が減圧状態であることが好ましい。 通 常、 容器内の圧力が大気圧 (760 mmHg)より低いことと理解され、 減圧状態を作る 方法としては、 どのような手段であってもよいが、 例えば該凍結乾燥製剤を溶解 する際に溶解用水溶液をシリンジで注入した後に、 そのシリンジで容器内の気体 を吸引して大気圧より減圧状態にする方法が挙げられる。 また、 溶解用水溶液を シリンジで注入した後に、 真空ポンプ等の減圧装置を接続した注射針で容器内の 気体を吸引する方法も挙げられる。 また、 溶解用水溶液をシリンジで注入する前 に容器内を減圧しておくことも好ましく、 凍結乾燥の製剤化工程において、 減圧 状態のままに栓をすることも検討しえることとなるが、 例えば、 空のシリンジや 真空ポンプを接続した注射針で容器内の気体を溶解工程以前に予め吸引すること も好ましい例として挙げられる。 該可溶性ト口ンボモジュリン含有凍結乾燥製剤 を溶解する際の容器内圧力の減圧状態は、 例えば大気圧 （760 腿 Hg) より 200 mmHg減圧された状態を - 200 mmHgの減圧度と表記することがある。 設定された溶 解時の減圧度を達成するために、 あらかじめ減圧しておく場合に、 添加される溶 解用水溶液等の容量の変化を確認して、 初期減圧度を決め、 溶解以前に初期減圧 度まで減圧しておくことが好ましい。 初期減圧度は、 実施例に記載された方法や、 その他の適宜の方法により決めればよレ、。
該可溶性ト口ンボモジュリン含有凍結乾燥製剤を溶解する際に、 起泡抑制する 好ましい容器内圧力は、 容器の容量、 形式や溶解用水溶液の量によって若干異な るため、 上記の気泡の発生程度を濁度として波長 650 nmの透過率を測定する方 法において、 95%以上の透過率を示すような減圧状態とすることが好ましく、 特 に限定されるものではない。 例えば、 3 mLバイアル瓶中の可溶性トロンボモジュ リン含有凍結乾; »剤を 1 mL の溶解用水溶液で溶解する際は、 容器内圧力の下 限としては- 50 mmHg以上が好ましく、 -100 nraiHg以上がさらに好ましく、 場合に よっては - 200 mmHg以上、 または - 300 mmHg以上である例が挙げられる。 上限と しては通常 - 600 mmHg以下が例示され、 好ましくは - 500 mmHg以下、 さらに好ま しくは - 400 mmHg以下、 場合によっては - 300 mmHg以下が挙げられる。 さらに本 発明は、 前述の起泡抑制効果、 および Zまたは後述の安定化効果を有する可溶性 ト口ンボモジュリン含有凍結乾燥製剤、 さらには、 凍結乾燥製剤とその溶解用水 激夜とが組み合わされたキット製剤を提供するものである。
すなわち本発明は、 有効成分として可溶性ト口ンボモジュリンを含有する可溶 性ト口ンボモジュリン含有凍結乾燥製剤、 または該可溶性ト口ンボモジュリン含 有凍結乾燥製剤とその溶解用水溶液とを組み合わせしめたキット製剤であって、 該可溶性ト口ンポモジュリン含有凍結乾燥製剤が 10 mg/mL以上の可溶性トロン ポモジュリン高濃度含有溶液を調製されるためのものであって、 且つ (a)該可溶 性ト口ンボモジュリン含有凍結乾燥製剤中に、 非イオン性界面活性剤、 ベンジル アルコール、 クロロブタノールからなる群より選ばれる少なくとも一種の化合物 が存在せしめられているカゝ、 および/または該可溶性ト口ンボモジュリン含有凍 結乾燥製剤の溶解用水溶液中に、 非イオン性界面活性剤、 ベンジルアルコール、 クロロブタノールからなる群より選ばれる少なくとも一種の化合物が存在せしめ られていること、 （b)該可溶性ト口ンボモジュリン含有凍結乾燥製剤を溶解する 際の容器の内壁がシリコーンでコーティングされていること、 または (c)該可溶 性ト口ンボモジュリン含有凍結乾燥製剤を溶解する際の容器内圧力が減圧状態で あること、 の少なくともレ、ずれかを特徴とする可溶性ト口ンボモジユリン含有凍 結乾;^剤、 またはそのキット製剤である。
本発明の可溶性ト口ンボモジュリン含有凍結乾燥製剤、 またはそのキット製剤 としては、 上記の（a)、 （b)、 （c)のいずれかが好ましいが、 好ましくは (a)であり、 さらに (a)且つ (c)や、 （a)且つ (b)も好ましい。 また (b)且つ (c)も好ましく、 （a) 且つ (b)且つ (c)が特に好ましレ、例として挙げられることは前記と同様である。 さらに具体的には、 本発明は、 有効成分として可溶性トロンボモジユリンを含 有する可溶性ト口ンボモジュリン含有凍結乾燥製剤、 または該可溶性ト口ンボモ ジュリン含有凍結乾燥製剤とその溶解用水溶液とを組み合わせしめたキット製剤 であって、 該可溶性トロンポモジュリン含有凍結乾燥製剤が 10 mg/mL以上の可 溶性トロンポモジュリン高濃度含有溶液を調製されるためのものであって、 該可 溶性トロンボモジュリン含有凍結乾燥製剤は、 （1) グルタミン酸またはその塩、 およびマンニトールの 2種を含む、 （2) グルタミン酸またはその塩、 およびリシ ンまたはその塩の 2種を含む、 （3) グルタミン酸またはその塩、 およびァスパラ ギン酸またはその塩の 2種を含む、 または (4) ァスパラギン酸またはその塩、 お ょぴマンニトールの 2種を含む、 のいずれかの組み合わせを含有せしめ、 且つ該 可溶性ト口ンポモジュリン含有凍結乾 «剤が、 0. 1 niLから 2 niLの溶解用水溶 液に溶解し得て、 10 mg/mL以上の可溶性ト口ンボモジュリン高濃度含有溶液を調 整でき、 その溶解時の浸透圧比が 0. 5から 2. 0であることを特徴とする可溶性ト 口ンポモジユリン含有凍結乾燥製剤である。
また本発明は、 有効成分として可溶性ト口ンポモジュリンを贪有する可溶性ト 口ンボモジュリン含有凍結乾燥製剤、 または該可溶性ト口ンボモジュリン含有凍 結乾燥製剤とその溶解用水溶液とを組み合わせしめたキット製剤であって、 該可 溶性ト口ンボモジュリン含有凍結乾燥製剤が 10 mg/mL以上の可溶性ト口ンボモ ジュリン高濃度含有溶液を調製されるためのものであって、 該可溶性トロンボモ ジュリン含有凍結乾燥製剤は、 （1) グルタミン酸またはその塩、 およびマンニト ールの 2種を含む、 （2) グルタミン酸またはその塩、 およびリシンまたはその塩 の 2種を含む、 （3) グルタミン酸またはその塩、 およぴァスパラギン酸またはそ の塩の 2種を含む、 または (4) ァスパラギン酸またはその塩、 およびマンニトー ルの 2種を含む、 のいずれかの組み合わせを含有せしめ、 且つ該可溶性ト口ンボ モジュリン含有凍結乾; ¾ 剤が、 0. 1 mLから 2 raLの溶解用水溶液に溶解し得て、 10 mg/mL以上の可溶性ト口ンポモジュリン高濃度含有溶液を調製でき、 その溶解 時の浸透圧比が 0. 5から 2. 0であり、 且つ該可溶性ト口ンボモジュリン含有凍結 乾燥製剤中に、 非イオン性界面活性剤、 ベンジルアルコール、 クロロブタノール 力 らなる群より選ばれる少なくとも一種の化合物が存在せしめられていることを 特徴とする可溶性ト口ンボモジュリン含有凍結乾燥製剤である。 この場合に、 (b)、 または ( 、 それらの組み合わせであることが好ましいことは前述の通りで さらに本発明は、 有効成分として可溶性ト口ンポモジュリンを含有する可溶性 ト口ンボモジュリン含有凍結乾燥製剤、 または該可溶性ト口ンポモジュリン含有 凍結乾燥製剤とその溶解用水溶液とを組み合わせしめたキット製剤であって、 該 可溶性ト口ンポモジュリン含有凍結乾燥製剤が 10 mg/mL以上の可溶性ト口ンボ モジュリン高濃度含有溶液を調製されるためのものであって、 該可溶性ト口ンポ モジュリン含有凍結乾燥製剤は、 （1) グルタミン酸またはその塩、 およびマンニ トールの 2種を含む、 （2) グルタミン酸またはその塩、 およびリシンまたはその 塩の 2種を含む、 （3) グルタミン酸またはその塩、 およぴァスパラギン酸または その塩の 2種を含む、 または (4) ァスパラギン酸またはその塩、 およびマンニト ールの 2種を含む、 のいずれかの組み合わせを含有せしめ、 且つ該可溶性トロン ボモジュリン含有凍結乾燥製剤が、 0. 1 raLから 2 mLの溶解用水溶液に溶解し得 て、 10 mg/mL以上の可溶性トロンボモジュリン高濃度含有溶液を調製でき、 その 溶解時の浸透圧比が 0. 5から 2. 0であることを特徴とし、 さらに該可溶性トロン ボモジュリン含有凍結乾燥製剤の溶解用水溶液中に、 非イオン性界面活性剤、 ベ ンジルアルコ^ "ル、 クロロブタノールからなる群より選ばれる少なくとも一種の 化合物が存在せしめられていることを特徴とする可溶性ト口ンボモジュリン含有 凍結乾燥製剤のキット製剤である。 この場合に、 （b)、 または ( 、 それらの組み 合わせであることが好ましいことは前述の通りである。
またさらに本発明は、 有効成分として可溶性ト口ンボモジュリンを含有する可 溶性ト口ンボモジュリン含有凍結乾燥製剤、 または該可溶性ト口ンボモジュリン 含有凍結乾燥製剤とその溶解用水溶液とを組み合わせしめたキット製剤であって、 該可溶性ト口ンポモジュリン含有凍結乾燥製剤が 10 mg/raL 以上の可溶性トロン ボモジュリン高濃度含有溶液を調製されるためのものであって、 該可溶性トロン ボモジュリン含有凍結乾燥製剤は、 （1) グルタミン酸またはその塩、 およびマン 二トールの 2種を含む、 （2) グルタミン酸またはその塩、 およびリシンまたはそ の塩の 2種を含む、 （3) グルタミン酸またはその塩、 およぴァスパラギン酸また はその塩の 2種を含む、 または (4) ァスパラギン酸またはその塩、 およびマンニ トールの 2種を含む、 のいずれかの組み合わせを含有せしめ、 且つ該可溶性トロ ンポモジュリン含有凍結乾; ^剤が、 0. 1 mLから 2 mLの溶解用水溶液に溶解し 得て、 10 mg/mL以上の可溶性トロンポモジュリン高濃度含有溶液を調製でき、 そ の溶解時の浸透圧比が 0. 5から 2. 0であり、 且つ該可溶性ト口ンボモジュリン含 有凍結乾燥製剤中に、 非イオン性界面活性剤、 ベンジルアルコール、 クロロブタ ノールからなる群より選ばれる少なくとも一種の化合物が存在せしめられており、 さらに該可溶性ト口ンボモジュリン含有凍結乾燥製剤の溶解用水溶液中に、 非ィ オン性界面活性剤、 ベンジルアルコール、 クロロブタノールからなる群より選ば れる少なくとも一種の化合物が存在せしめられていることを特徴とする可溶性ト ロンボモジュリン含有凍結乾燥製剤のキット製剤である。 この場合に、 （b)、 ま たは (C)、 それらの組み合わせであることが好ましいことは前述の通りである。 この発明においても、 可溶性ト口ンポモジュリンに関する諸性質や濃度等につ
V、て前述の起泡抑制方法と同様である。
さらに本発明は、 有効成分として可溶性ト口ンボモジュリンを含有する可溶性 ト口ンボモジュリン含有凍結乾燥製剤における可溶性ト口ンボモジュリンの安定 化方法であって、 （1) グルタミン酸またはその塩、 およびマンニトールの 2種を 含む、 （2) グルタミン酸またはその塩、 およびリシンまたはその塩の 2種を含む、 (3) グルタミン酸またはその塩、 およびァスパラギン酸またはその塩の 2種を含 む、 または (4) ァスパラギン酸またはその塩、 およびマンニトールの 2種を含む、 のいずれかの組み合わせを含有せしめ、 且つ該可溶性ト口ンポモジュリン含有凍 結乾; »剤が、 0. 1 mLから 2 mLの溶解用水溶液に溶解し得て、 10 mg/mL以上、 好ましくは 15または 17 mg/mL以上の可溶性ト口ンボモジュリン高濃度含有溶液 を調製でき、 その溶解時の浸透圧比が 0. 5から 2. 0であることを特徴とする可溶 性ト口ンボモジュリン含有凍結乾燥製剤における可溶性ト口ンボモジュリンの安 定化方法である。
可溶性ト口ンボモジュリン高濃度含有凍結乾燥製剤における可溶性ト口ンボモ ジュリンの安定化効果を示す、 例えば、 （1) グルタミン酸またはその塩、 'および マンニトールの 2種を含む、 （2) グルタミン酸またはその塩、 およびリシンまた はその塩の 2種を含む、 （3) グルタミン酸またはその塩、 およぴァスパラギン酸 またはその塩の 2種を含む、 または (4) ァスパラギン酸またはその塩、 およぴマ ンニトールの 2種を含む、 等の添加剤を、 以下安定化添加剤と言うことがある。 本発明の安定ィ匕方法に適するより好ましい製剤としては以下が挙げられる。 す なわち、 本発明は、 有効成分として可溶性ト口ンボモジュリンを 10 mg/mL以上、 好ましくは 15または 17 mg/mL以上含有する可溶性ト口ンポモジュリン高濃度含 有凍結乾燥製剤であって、 ダルタミン酸またはその塩、 およびマンニト一ルを含 有せしめ、 且つ該製剤が、 0. 1 mLから 2 mLの溶解用水溶液に溶解し得るもので あって、 その溶解時の浸透圧比が 0. 5から 2. 0であることを特徴とする可溶性ト 口ンポモジュリン高濃度含有凍結乾燥製剤である。
また本発明は、 有効成分として可溶性ト口ンボモジュリンを 10 mg/mL以上、 好ましくは 15または 17 mg/mL以上含有する可溶性ト口ンボモジュリン高濃度含 有凍結乾燥製剤であって、 グルタミン酸またはその塩、 および、 リシンまたはそ の塩を含有せしめ、 且つ該製剤が、 0. 1 raLから 2 mLの溶解用水溶液に溶解し得 るものであって、 その溶解時の浸透圧比が 0· 5から 2. 0であることを特徴とする 可溶性ト口ンボモジュリン高濃度含有凍結乾燥製剤である。
また本発明は、 有効成分として可溶性ト口ンボモジュリンを 10 mg/mL以上、 好ましくは 15または 17 mg/mL以上含有する可溶性ト口ンポモジュリン高濃度含 有凍結乾燥製剤であって、 グルタミン酸またはその塩、 およびァスパラギン酸ま たはその塩を含有せしめ、 且つ該製剤が、 0. 1 から 2 mLの溶解用水溶液に溶 解し得るものであって、 その溶解時の浸透圧比が 0. 5から 2. 0であることを特徴 とする可溶性ト口ンボモジュリン高濃度含有凍結乾; M剤である。
また本発明は、 有効成分として可溶性ト口ンボモジュリンを 10 mg/mL以上、 好ましくは 15または 17 mg/mL以上含有する可溶性ト口ンポモジュリン高濃度含 有凍結乾燥製剤であって、 ァスパラギン酸またはその塩、 およびマンニトールを 含有せしめ、 且つ該製剤が、 0. 1 mLから 2 mLの溶解用水溶液に溶解し得るもの であって、 その溶解時の浸透圧比が 0. 5から 2. 0であることを特徴とする可溶性 ト口ンボモジュリン高濃度含有凍結乾燥製剤である。
安定化効果を達成するに際しても、 前述の可溶性ト口ンポモジュリンの性質、 構造等が引用でき、 また可溶性ト口ンボモジュリン高濃度含有溶液の濃度や溶解 用水溶液等にぉレ、ても同様である。
本発明の可溶性ト口ンボモジュリン高濃度含有溶液の液量は、 0. 1 raL から 2 mLであって、 その溶液の浸透圧比が 0. 5から 2. 0であることが好ましレ、。 浸透圧 比としては製剤の投与時に疼痛を感じないことが望ましいが、 通例 0. 5以上が好 ましく、 さらに好ましくは 0. 8以上が挙げられる。 上限としては、 2. 0以下が好 ましく、 さらに好ましくは 1. 5以下、 特に好ましくは 1. 2以下が挙げられる。 本発明の浸透圧比は、 生理食塩液の与えるォスモル濃度に対する試料溶液のォ スモル濃度の比と定義 （第 14改正日本薬局方、 浸透圧測定法） され、 生理食塩 液 (0. 900 g/100mL)のォスモル濃度は一定 (286m0sm) であることから、 次式で計 算することができる [浸透圧比 =試料溶液のォスモル濃度 (m0sm) /286 (m0sm) ]0 なお、 ォスモル濃度は、 第 14 改正日本薬局方の浸透圧測定法、 あるいは USP24<785>0SM0LARITY に記載の方法で求めることができ、 単位は mOsm (milliosmoles per丄 iter) "arfflレヽ Ι ττ:す 0
本発明のグルタミン酸は、 光学活性体である D体、 または L体のいずれか、 ま たはそれらの混合物であるラセミ体のいずれであつても良いが、 L体であること が好ましい。 グルタミン酸の塩としては、 水溶性の塩であることが好ましく、 例 えばその酸付加塩が好ましい例として挙げられる。 酸付加塩の場合、 付加しうる 酸として通常、 塩酸、 硫酸、 硝酸、 酢酸、 リン酸、 シユウ酸、 クェン酸、 酒石酸 などが例示されるが、 好ましくは塩酸、 酢酸、 リン酸であり、 さらに好ましくは 塩酸が挙げられる。 また、 他の塩としては、 アンモニゥム塩が好ましい例として 挙げられる。 また、 例えばアルカリ金属やアルカリ土類金属との塩も好ましい例 として挙げられる。 アルカリ金属としては、 例えばナトリウム、 カリウム、 リチ ゥムなどが挙げられ、 好ましくはナトリウム、 カリウムであり、 さらに好ましく はナトリウムが挙げられる。 また、 アルカリ土類金属との塩も好ましい例として 挙げられる。 アルカリ土類金属としては例えばマグネシウム、 カルシウム、 ベリ リウムなどが挙げられ、 好ましくはマグネシウム、 カルシウムであり、 さらに好 ましくはカルシウムである。 これらのグルタミン酸およびその塩は、 無水物の他、 適宜の水和物が利用できる。 具体的には、 グルタミン酸ナトリウム一水和物が好 ましい例として挙げられる。 なお、 これらのグルタミン酸おょぴその塩の添加量 を考慮する際には、 特別にことわりのない限り、 フリー体のグ タミン酸として の換算値として表示する。
また、 マンニトールは、 D体、 または L体のいずれ力、 またはそれらの混合物 のいずれであっても良いが、 D-マンニトールが好ましい例として挙げられる。 また、 トレハロースは、 D体、 または L体のいずれか、 またはそれらの混合物 のいずれであっても良い。 また、 無水物の他、 適宜の水和物が利用できる。 具体 的には、 D-トレハロース二水和物が好ましい例として挙げられる。 また、 リシン （リジンとも言う） は、 光学活性体である D体、 または L体のい ずれか、 またはそれらの混合物であるラセミ体のいずれであっても良いが、 "本 であることが好ましい。 リシンの塩としては、 水溶性の塩であることが好ましく、 例えばその酸付加塩が好ましい例として挙げられる。 酸付加塩の場合、 付加しう る酸として通常、 塩酸、 硫酸、 硝酸、 酢酸、 リン酸、 シユウ酸、 クェン酸、 酒石 酸などが例示されるが、 好ましくは塩酸、 酢酸、 リン酸であり、 さらに好ましく は塩酸が挙げられる。 これらのリシンおよびその塩は、 無水物の他、 適宜の水和 物が利用できる。 具体的には、 リシン水和物が好ましい例として挙げられる。 な お、 これらのリシンおよびその塩の添加量を考慮する際には、 特別にことわりの ない限り、 フリー体のリシンとしての換算値として表示する。
また、 グルタミン酸またはその塩、 および、 リシンまたはその塩の組み合わせ を実施する際においては、 一括して、 リシングルタミン酸塩無水物ゃリシングル タミン酸塩二水和物などを利用することも好ましい例として挙げられる。 このリ シングルタミン酸塩二水和物の量を考慮する際には、 リシンとグルタミン酸とに 分けての換算値として表示する。
また、 ァスパラギン酸は、 光学活性体である D体、 または L体のいずれか、 ま たはそれらの混合物であるラセミ体のいずれであつても良いが、 L体であること が好ましい。 ァスパラギン酸の塩としては、 水溶性の塩であることが好ましく、 例えばアル力リ金属やアル力リ土類金属との塩も好ましい例として挙げられる。 アルカリ金属としては、 例えばナトリウム、 カリウム、 リチウムなどが挙げられ、 好ましくはナトリウム、 カリウムであり、 さらに好ましくはナトリゥムが挙げら れる。 また、 アルカリ土類金属との塩も好ましい例として挙げられる。 アルカリ 土類金属としては例えばマグネシウム、 カルシウム、 ベリリウムなどが挙げられ、 好ましくはマグネシウム、 カルシウムであり、 さらに好ましくはカルシウムであ る。 これらのァスパラギン酸おょぴその塩は、 無水物の他、 適宜の水和物が利用 できる。 具体的には、 ァスパラギン酸ナトリゥム一水和物が好ましい例として挙 げられる。 なお、 これらのァスパラギン酸おょぴその塩の添加量を考慮する際に は、 特別にことわりのない限り、 フリー体のァスパラギン酸としての換算値とし て表示する。 また、 本発明のアルギニン、 プロリン、 セリン、 グリシン、 ヒスチジン、 ァス パラギン、 フエ二ルァラニンおょぴバリンにおいても、 光学活性体である D体、 または L体のいずれ力 またはそれらの混合物であるラセミ体の!/、ずれであつて も良い。 また、 塩としては、 水溶性の塩であることが好ましく、 例えばアルカリ 金属やアルカリ土類金属との塩も好ましい例として挙げられる。 これらのァミノ 酸およびその塩は、 無水物の他、 適宜の水和物が利用できる。 例えばこれらのァ ミノ酸のうち、 アルギニンについてはアルギニン塩酸塩が好ましい例として挙げ られる。 これらのアミノ酸およびその塩の添加量を考慮する際には、 特別にこと わりのない限り、 フリ一体のァミノ酸としての換算値として表示する。
さらに、 本発明の製剤中に添加される、 上述の安定ィ匕添加剤の添加量の比は、 互いに 50: 50が特に好ましい例であり、 また、 60:40〜40:60も好ましい例として 挙げられ、 さらにまた 80: 20〜20: 80 も例示される。 おのおのの添加量は、 適宜 選択できるが、 例えば、 可溶性トロンボモジュリン 1 mgあたりの添加量の下限 として、 通常 0. 0001 mmol以上が例示され、 好ましくは 0. 0003 mmol以上、 より 好ましくは 0. 0007 mmol以上、 特に好ましくは 0. 001 mmol以上が例示される。 また、 可溶性ト口ンボモジュリン 1 mg あたりの添加量の上限として、 通常 1 mmol以下が例示され、 好ましくは 0. 7 ramol以下、 より好ましくは 0. 3 mmol以下、 特に好ましくは 0. 1 ramol 以下が例示される。 上記の添加量としては、 本発明の 安定化効果を示し、 且つ浸透圧比が 0. 5から 2. 0の範囲に調整できる添加量であ れば特に限定されず、 例えば塩酸塩ゃナトリゥム塩のように水に溶解した時に電 離 （解離） する添加剤の場合は浸透圧比が高くなるので添加量を、 上述の例示さ れた添加量を適宜増減し、 求められる浸透圧比に適宜調整することが好ましい。 本発明で上記の起泡抑制添加剤、 および Zまたは安定化添加剤を含む可溶性ト ロンポモジュリン高濃度含有製剤においては、 上記起泡抑制添加剤や安定化添加 剤の他に、 その他の成分として医薬品の添加剤として許容できる、 等張化剤、 緩 衝化剤、 増粘剤、 保存剤、 防腐剤、 無痛化剤、 p H調整剤などを適宜添加しても 良い。 なお、 起泡抑制添加剤としてべンジルアルコールゃク口ロブタノ一ルを用 いる場合には、 無痛化剤としての作用も併せて示すことができるため、 好ましレ、。 界面活性剤としては、 例えばポリォキシエチレン硬化ヒマシ油 60、 ポリォキシェ チレン硬化ヒマシ油 50、 ポリソルベート 80、 ポリソルベート 20、 ポリオキシェ チレン（160)ポリォキシプロピレン (30)グリコールなどが挙げられる。
本発明の可溶性ト口ンボモジュリン高濃度含有製剤の製造に際しては、 適宜の 方法が採用できるが、 例えば、 適当量の可溶性ト口ンボモジュリンと上述の添加 物、 またはその溶液を、 同時または順次混合して全ての組成物の混合溶液を調製 し、 公知の方法により凍結乾燥することにより、 調製することが可能である。 例えば、 上記起泡抑制添加剤、 および Zまたは安定化添加剤や、 その他の成分 の添加剤の添加方法は、 直接可溶性ト口ンボモジュリン高濃度含有溶液に添加す る方法、 または、 あらかじめ起泡抑制添加剤、 安定化添加剤や、 その他の成分の 添加剤を、 水、 注射用水、 あるいは適当な緩衝液に溶解後、 可溶性トロンポモジ ュリン高濃度含有溶液に添加する方法などが挙げられる。 添加時期はいつでも良 いが、 好ましくは可溶性ト口ンボモジュリンの精製過程や濃縮過程、 さらに好ま しくは製剤化工程中が例示される。 また、 製剤化工程中で可溶性トロンボモジュ リン高濃度含有溶液の pHは、 特に好ましくは中性付近が例示される。 さらに、 その pHの下限としては、 通常 pH 4以上、 好ましくは pH 5以上、 より好ましく は pH 6以上、 特に好ましくは pH 6. 5以上が例示される。 また、 pHの上限として は通常 pH 11以下が例示され、 好ましくは PH 10以下、 より好ましくは pH 9以 下、 さらに好ましくは pH 8以下、 特に好ましくは pH 7. 5以下が例示される。 前 述の pHとなすためには、 必要により、 適宜の PH調整剤などを添加して調整すれ ば良い。 pH調整剤としては、 例えば塩酸、 酢酸、 クェン酸、 リン酸、 リン酸二水 素ナトリゥム、 リン酸水素ナトリゥム、 水酸化ナトリゥム、 水酸^^力リゥムなど が例示され、 好ましくは塩酸、 水酸ィ匕ナトリウムなどである。 調整時期は特に限 定されないが、 無菌ろ過工程の直前が好ましい。 また、 可溶性トロンボモジユリ ンの精製過程や濃縮過程でも良い。 調整方法は特に限定されないが、 サンプリン グした溶液の pHを pH測定装置で測り、 例えば pHが低ければ水酸ィ匕ナトリウム 水溶液を滴下して pHを調整すればょレ、。
上記のように製剤化工程で調製した可溶性ト口ンボモジュリンおよび必要によ り添加される起泡抑制添加剤、 および Zまたた安定化添加剤を含み、 さらに所望 により適宜のその他の添加剤を含有してなる溶液を、 例えば 0. のフィルタ 一を通して無菌ろ過することが好ましい。 力べして得られた可溶性トロンボモジ ュリンおよび必要により添加される起泡抑制添加剤、 安定化添加剤、 またはその 他の添加剤を含有してなる溶液を容器に充填し、 そのまま密封して製剤としても よいが、 凍結乾燥することがより好ましい。 凍結乾燥方法は特に制限はなく、 通 常の方法で凍結乾燥することができる。 また、 凍結乾燥の方法により、 該可溶性 ト口ンボモジュリン含有凍結乾燥製剤中に上記起泡抑制添加剤を存在せしめる場 合には、 起泡抑制添加剤としては非イオン性界面活性剤が好ましレ、。
容器に充填され、 凍結乾燥される溶液の量として、 特に好ましくは 0. 5 から 1. 0 mLが例示される。 すなわち、 その下限としては 0. 1 mL以上が好ましく、 よ り好ましくは 0. 3 mL以上、 特に好ましくは 0. 5 mL以上が例示される。 また、 溶 液の量の上限としては通常 10 mL以下が例示され、 好ましくは 5 mL以下、 より 好ましくは 2 mL以下、 特に好ましくは 1 mL以下が挙げられる。
本発明の可溶性ト口ンポモジュリン高濃度含有製剤は、 可溶性ト口ンボモジュ リンの量として、 製剤あたり、 5 nig以上含むことが通常であり、 10 mg以上含む ことが好ましく、 15 mg以上がさらに好ましい。 またさらに、 17 mg以上が好ま しく、 20 mg以上、 または 25 mg以上がさらに好ましく、 30 mg以上含むことも 特に好ましい例として挙げられる。
容器としては、 前述の通りであるが、 医薬品の容器として使用可能なもので無 菌充填することに適した材料、 形状であれば特に限定されず、 例えばガラス製バ ィアル （および栓）、 ガラス製シリンジ （さらにゴム製キャップおよびストッパ 一）、 ガラス製アンプルなどが挙げられ、 その他にプラスチック製容器を用いる こともできる。 本努明において、 ガラス製バイアルに封入せしめた凍結乾;^剤 として提供することが好ましい。 また、 例えば凍結乾燥製剤に、 溶解用水溶液が 組み合わされた、 又は添付されているキット製剤が好ましく、 凍結乾燥製剤や、 溶解用水溶液は、 それぞれ別の容器に充填されており、 例えば、 凍結乾燥製剤が 無菌充填されたガラス製パイアルと、 溶解用水溶液が無菌充填されたプレフィル ドシリンジの組み合わせからなるキット製剤が好ましい例として挙げられる。 ま た、 ガラス製またはプラスチック製のダブルチヤンパーあるいはデュアルチヤン バ一と言われる 2室式シリンジ （1本のシリンジに 2室があり、 例えば 1室に凍 結乾燥物を、 もう 1室に溶解用水溶液が封入されている） もキット製剤として好 ましい。 また、 2室式シリンジの別タイプとして、 製造や流通時は 2室が分離し ており、 使用時に 2室を組み合わせることにより 1体となし溶解するタイプも好 ましい。
本発明の可溶性ト口ンポモジュリン高濃度含有製剤は、 製剤として流通時また は使用までの間、 数ケ月〜数年間保存されることができる。 その投与方法として は、 一般的に使用されている投与方法、 すなわち非経口投与方法、 例えば静脈内 投与、 筋肉内投与、 皮下投与等によって投与することができるが、 特に筋肉内投 与、 皮下投与に用いることが最も好ましい。 凍結乾燥製剤とした場合は、 用時に、 水、 例えば蒸留水 （または、 注射用水） 等にて溶解して患者に投与することがで きるが、 前述の通りであって、 特に筋肉内投与、 皮下投与に用いる場合には、 0. 1 mLから 2 mL、 好ましくは 0. 3 mLから 1. 5 mL、 特に好ましくは 0. 5 mLから 1 mL程度が例示される。
本発明の可溶性ト口ンポモジュリン高濃度含有製剤の投与量は、 患者の年齢、 体重、 疾患の程度、 投与経路などによっても異なるが、 一般的に可溶性トロンボ モジュリンの量として体重あたり 0. 001から 5 mg/kgの範囲であり、 好ましくは 0. 02から 2 mg/kg、 さらに好ましくは 0. 05から 1 mg/kg, 特に好ましくは 0. 1か ら 0. 5 mg/kgが挙げられ、 1日あたり 1回または必要に応じて数回投与する。 投 与間隔は毎日でも良いが、 好ましくは 2日から 1 4日間に 1回、 さらに好ましく は 3日から 1 0日間に 1回、 さらに好ましくは 4日から 7 に 1回とすることも 可能である。 特に、 筋肉内投与、 皮下投与においては、 血中濃度が長期間維持さ れることより、 投与間隔を長くできるので、 好ましい。
また、 本発明は、 有効成分として可溶性トロンボモジュリンを含有する可溶性 ト口ンボモジュリン含有凍結乾燥製剤における可溶性ト口ンボモジュリンの安定 化方法であって、 （1) 尿素、 または (2) 尿素およびアミノ酸を含有せしめ、 且つ 該可溶性トロンボモジュリン含有凍結乾燥製剤が、 0. 1 mLから 2 mLの溶解用水 溶液に溶解し得て、 10 mg/mL以上、 好ましくは 20 mg/ml以上の可溶性トロンボ モジュリン高濃度含有溶液を調製でき、 その溶解時の浸透圧比が 0. 5から 2. 0で あることを特徴とする可溶性ト口ンボモジュリン含有凍結乾燥製剤における可溶 性ト口ンボモジュリンの安定化方法であり、 またそれに最適な製剤である。
本発明の可溶性ト口ンボモジュリンは前述と同様であり、 その製剤中での含有 量も前述と同様であり、 例えば、 通常は 10 mg/mL以上、 15 mg/mL以上、 または 17 mg/mL以上含有することが例示され、 20 mg/mL以上、 25 mg/mL以上、 または 30 mg/mL以上含有することがさらに好ましい例として挙げられる。
尿素は、 酸付加塩であってもよく、 例えば尿素リン酸塩、 尿素硝酸塩などが挙 げられるが、 好ましくは尿素である。 なお、 これらの尿素およびその酸付加塩の 添加量を考慮する際には、 特別にことわりのない限り、 フリー体の尿素としての 換算値として表示する。
尿素と組み合わすことのできるアミノ酸としては、 グルタミン酸またはその塩、 ァスパラギン酸またはその塩が好ましい例として例示される。 これらのアミノ酸 やその塩についての詳細な例示は前述の通りである。 添加物の比率、 添加量、 浸 透圧比は前述と同様である。 基本的に製造方法や投与方法、 用量等は前述の開示 が参考にできる。 なお前述のとおり、 これらの組成も、 起泡抑制方法における可 溶性ト口ンボモジュリン高濃度含有製剤、 又はそのキット製剤として利用するこ とができる。 実施例
以下、 参考例、 実施例、 比較例、 投与例おょぴ実験例により本発明を具体的に 説明するが、 本発明は何らこれらによって限定されるものではない。
以下の参考例、 実施例および比較例において、 有効成分である可溶性トロンポ モジュリンの他、 次のような製剤原料を用いた。
L-グルタミン酸ナトリウム一水和物 （特級、 和光純薬工業株式会社)、 D (- )-マ ンニトール （特級、 和光純薬工業株式会社)、 L-リシン塩酸塩 （特級、 和光純薬 工業株式会社)、 L-リシン- L-グルタミン酸塩二水和物 （味の素株式会社)、 L -ァ スパラギン酸ナトリウム一水和物 （特級、 和光純薬工業株式会社)、 尿素 （小堺 製薬株式会社)、 L-アルギニン塩酸塩 （特級、 和光純薬工業株式会社)、 スクロー ス （特級、 和光純薬工業株式会社)、 D-トレハロースニ水和物 （特級、 和光純薬 工業株式会社）、 Polysorbate 80 (日光ケミカルズ株式会社）、 Polysorbate 20 W
( 日 光ケ ミ カルズ株式会社） 、 Poloxamer 188 ( B A S F ) , Polyoxyethylene (25) lauryl ether (日光ケミカルズ株式会社）、 Polyoxyl 40 stearate (日光ケミカルズ株式会社）、 HCO-60 (Polyoxyl 60 hydrogenated castor oil； 日光ケミカルズ株式会社）、 ラウリル硫酸ナトリウム （一級、 和光 純薬工業株式会社）、 塩化ベンザルコニゥム （ICN Biochemicals In ）、 ベンジ ルアルコール （特級、 和光純薬工業株式会社)、 クロロブタノール （特級、 和光 純薬工業株式会社)、 塩化ナトリウム （特級、 和光純薬工業株式会社)、 リン酸
(特級、 和光純薬工業株式会社)、 水酸ィヒナトリウム （特級、 和光純薬工業株式 会社)、 注射用水 （大塚製薬株式会社)、 生理食塩液 （大塚製薬株式会社） 参考例 1
本実施例で用いる可溶性ト口ンボモジュリンの生産
実施例に用いる可溶性トロンボモジュリンは、 前記山本らの方法 （特開昭 64 - 6219号公報の実施例 10に記載の方法） に従い生産し、 さらに限外濾過により濃 縮を行って得た。 すなわち配列表配列番号 1のアミノ酸配列をコードする DNA
(具体的には、 配列表配列番号 2の塩基配列よりなる） を、 チャイニーズハムス ター卵巣 (CH0)細胞にトランスフエクシヨンして、 この形質転換細胞の培養液よ り上述あるいは定法の精製法にて、 50 mM NaCl を含む 20 πιΜ リン酸塩緩衝液 (ΡΗ7. 3)で活性画分を回収した高純度精製品を取得した。 さらに、 限外濾過を行 つて可溶性トロンボモジュリン濃度が 60 mg/mLである TMD123Hを取得した。 同 様に、 配列表配列番号 3のアミノ酸配列をコードする DNA (具体的には、 配列表 配列番号 4の塩基配列よりなる） を用いることにより、 配列表配列番号 3のアミ ノ酸配列の 19-132のアミノ酸を少なくとも有するぺプチド （以下、 TME456Hと略 することがある） を取得した。
また、 配列表配列番号 2の塩基配列を含む DNA断片および配列表配列番号 9に 示された塩基配列を有する変異用合成 DNAを用いて前述の部位特異的変異を行い、 配列表配列番号 5のアミノ酸配列をコードする DNA (具体的には、 配列表配列番 号 6の塩基配列よりなる） を取得した。 この DNA配列を CH0細胞にトランスフエ クションして、 この形質転換細胞の培養液より上述あるいは定法の精製法にて、 50 mM NaCl を含む 20 mM リン酸塩緩衝液 (pH7. 3)で活性画分を回収した高純度精 製品を取得した。 さらに、 限外濾過を行って可溶性トロンボモジュリン濃度が
60mg/mLである酉己列表配列番号 5のァミノ酸配列の 19 - 516のアミノ酸を少なくと も有するペプチド （以下、 TMD123HMと略すことがある） を取得した。 同様に、 配 列表配列番号 4の塩基配列を含む DNA断片おょぴ配列表配列番号 9に示された塩 基配列を有する変異用合成 DNAを用いて前述の部位特異的変異を行い、 配列表配 列番号 7のアミノ酸配列をコードする DNA (具体的には、 配列表配列番号 8の塩 基配列よりなる） を取得した。 この DNA配列を CH0細胞にトランスフエクシヨン し、 上述の方法にて配列表配列番号 7のァミノ酸配列の 19 - 132 のァミノ酸を少 なくとも有するペプチド （以下、 TME456HMと略すことがある） を取得した。
実施例 1一 1
添加剤溶液調製
20 mLのメスフラスコに、 L-グルタミン酸ナトリゥム一水和物 2. 5 mmolおよび D (-)-マンニトール 2. 5 mraol を量り入れ （表 1に記載している添加剤量のそれ ぞれ 50倍量にあたる）、 注射用水を加え溶解して 20 mLとした。
試料赚調製
上記添加剤溶液 4 mLを 15 mL のアシストチューブに入れ、 参考例 1で得られ た TMD123Hを 5 mL (可溶性ト口ンポモジュリンとして表 1記載の 10倍量にあたる 300 mg含有する）および注射用水を 1 mL加え、 混合攪拌した。 この試料溶液をデ イスポシリンジ 25 mL (テルモ製） を用い、 孔径： 0. 22 μ ηι(ΜΙΙ ΕΧ- GV、 ミリポア 製）のフィルターを付けてろ過滅菌し、 特別に限定しない限りシリコーンコーテ イング未処理の無菌バイアルビン （30 K 不二硝子製） に l mLずつ分注した。 凍結乾燥
ゴム拴 （大協精ェ製） 半打栓→凍結乾燥→窒素充填→ゴム栓打栓→キャップ卷 締めの順で以下の条件にて凍結乾燥工程を行い、 1容器中に可溶性ト口ンポモジ ュリン 30 mg、 L-グルタミン酸ナトリゥム一水和物 0. 05 mmol, D (-) -マンニト ール 0. 05 mmol を含む可溶性ト口ンボモジュリン高濃度含有製剤を得た （実施例 1-1-1)。
C凍結乾燥条件〕
予備冷却 (15 分かけて室温から 15°C)→ 本冷却 （2時間かけて 15°Cから - 45°C) → 保持 （2時間 - 45°C) → 真空開始 （18時間 - 45°C)→ 昇温 （20時 間かけて - 45°Cから 25°C) → 保持 （15 時間 25°C) → 昇温 （ 1時間かけて 25°Cから 45°C) → 保持 （5時間 45°C) → 室温 （2時間かけて 45°Cから 25°C) → 復圧窒素充填 (-100 mmHg まで窒素で復圧） → 打栓 → キャップ 卷締め
実施例 1— 1— 2、 実施例 1— 1— 3、 実施例 1— 1— 4
同様に、 可溶性ト口ンポモジュリンの種類を変えて実施例 1-1-1の TMD123Hの 代わりに TMD123HM (実施例 1-1-2)、 TME456H (実施例 1-1-3)、 および TME456HM (実施例 1-1-4)を用いて、 それぞれ上記の方法にしたがつて可溶性ト口ンボモジ ュリン高濃度含有製剤を得た。 表 1 実施例及び比較例 組成 1容器当りの添加量 実施例 1-1-1 TMD123H 30mg
L -グルタミン酸 Na—水和物 0. 05mmol D (—)一マンニトーノレ 0. Ooramol 実施例 1—1—2 TMD123HM . 30mg
L -グルタミン酸 Na—水和物 0. 05醒 ol D (―)—マンニトーノレ 0. 05画 0丄 実施例 H— 3 TME456H 30mg
L -グルタミン酸 Na—水和物 0. 05画。丄 D (―)—マンニトール 0. Ooramol 実施例ト H TME456HM 30mg
L -グルタミン酸 Na—水和物 0. 0o画。丄 D (-)-マンニトール 0. 05腿 ol 実施例 1-2-1 TMD123H 30mg
L -グルタミン酸 Na—水和物 0. 075励 1 D (-)—マンニトール 0. 075誦1 実施例ト 3- TMD123H 30mg
L -グルタミン酸 Na—水和物 0.025励 1 D( -：) -マンニトール 0. 025腸 1 実施例 1-4-1 TD123H 30mg
L -グルタミン酸 Na—水和物 0. 02画 ol D(- )-マンニト―ル 0. lOmmol 実施例 1-5-1 TMD123H 30mg
L-グルタミン酸 Na—水和物 0. 07mmol D(— )—マンニトール 0. 02讓 ol 実施例 1-6-1 TMD123H 30mg
L-グルタミン酸 Na—水和物 0. 03聽1 D (-) -マンニトール 0. 15mmol 実施例 1-7- TMD123H 30mg
L -グルタミン酸 Na—水和物 0. lOramo丄 D (-) -マンニトール 0. 03醒 ol 実施例 1-8-1 TMD123H csOmg
L -グルタミン酸 Na—水和物 0. Ooramo丄 L-リシン塩酸塩 0. 05画 ol 実施例ト 9- TMD123H 30mg
L-グルタミン酸 Na—水和物 0. 03醒 ol L -リシン塩酸塩 0.07mmol 実施例 1-10-1 TMD123H 30mg
(L -リシン- L-グルタミン酸塩二水和物）
リシン 0. lOmmol グルタミン酸 0. lOmmol 実施例 1-11-1 TMD123H 30mg
(L-リシン- L-グルタミン酸塩二水和物）
リシン 0. 15mmol グルタミン酸 0. 15腕 ol 実施例 1-12-1 TMD123H 30mg
L -グルタミン酸 Na—水和物 0.06mmol L-ァスパラギン酸 Na—水和物 0. 0り讓 o丄 実施例 1-13-1 TMD123H 30rag
L-ァスパラギン酸 Na—水和物 0. 0ΰ墮。丄 D (-) -マンニトーノレ 0. 05mmol 実施例 1-14-1 TMD123H 30mg
0.07腿 ol 実施例 1-15-1 TMD123H 30mg
0.0ΰ醒。丄
L-グルタミン酸 Na—水和物 0. 0ΰ匪 0丄 実施例 1—16-1 TMD123H 30mg
0. 05mmol
L-ァスパラギン酸 Na—水和物 0. Oommol 実施例ト 17- 1 TMD123H 30mg
L -グルタミン酸 Na—水和物 0. 05mmol D (-) -マンニトール 0. 05讓 ol 実施例ト 18 - 1 TMD123H 30mg
L-ァスパラギン酸 Na—水和物 0. 05画 ol D (-)—マンニトール 0.05mmo丄 実施例 1-19-1 TMD123H 15mg
L- グルタミン酸 Na—水和物 0. 025勤 1 D (―)—マンニトール 0. 025腿 ol 実施例 1-20-1 TMD123H 10mg
L -グルタミン酸 Na—水和物 0. 017漏 1 D (―)—マンニトール 0. 017腿 ol 実施例 1-2：1-1 TMD123H lomg
L -グルタミン酸 Na—水和物 0. 038腿 ol D (-)—マンニトール 0. 038醒 ol 実施例 1-22-1 TMD123H 10mg
L -グルタミン酸 Na—水和物 0. 025聽 1 D ("-)—マンニトー/レ 0. 025動 1 実施例 1-23-1 TMD123H 15mg
L -グルタミン酸 Na—水和物 0. 0125腕 ol D (-)一マンニトール 0. 0125議 1 実施例 1-24-1 TMD123H 10mg
L -グルタミン酸 Na—水和物 0. 0083塵 ol D (―)—マンニトール 0. 0083議 ol 実施例 1-25-1 TMD123H 30mg
L -ァスパラギン酸 Na—水和物 0. 075醒 1 D (―) -マンニトール 0. 075匪 ol 実施例 1-26-1 TMD123H 30mg
L-ァスパラギン酸 Na—水和物 0. 025腿 ol D(-)-マンニトール 0. 025腿 ol 実施例 1-27-1 T D123H 30mg
L-ァスパラギン酸 Na—水和物 0. 02醒 ol D (-) -マンニトール 0. lOmmol 実施例 1- 28-] TMD123H 30mg
L -ァスパラギン酸 Na—水和物 0. 07mmol D—)—マンニトール 0. 02讓 ol 実施例ト 29— 1 TMD123H 30mg
L-ァスパラギン酸 Na—水和物 0. 03mmol D (-)-マンニトール 0. lommo丄 実施例 1-30-1 TMD123H 30mg L-ァスパラギン酸 Na—水和物 0. lOmmol D( -;) -マンニトール 0. 03ramol 実施例 1-31-1 TMD123H 15mg
L -ァスパラギン酸 Na—水和物 0. 025mmol D (―) -マンニトール 0. 025mmol 実施例 1-32-] TMD123H 10mg
L -ァスパラギン酸 Na—水和物 0. 017藝1 D(-)-マンニトール 0. 017画 1 実施例 1-33-1 TMD123H 15mg
L -ァスパラギン酸 Na—水和物 0. 038醒 ol D (-)-マンニトール 0. 038画 1 実施例 1-34-1 TMD123H 10mg
L -ァスパラギン酸 Na—水和物 0. 025画 1 D (-) -マンニトール 0. 025mmol 実施例 1-35-1 TMD123H 15mg
L-ァスパラギン酸 Na—水和物 0.0125腿 ol D (-) -マンニトーノレ 0. 0125画 1 実施例 1-36-1 TMD123H 10mg
L-ァスパラギン酸 Na—水和物 0. 0083画 ol D (—)—マンニトーノレ 0. 0083腿 ol 実施例 1-37- 1 TMD123H 30mg
L-グルタミン酸 Na—水和物 0. Oommol D (一)—マンニト一ノレ 0. 05醒 ol 塩化ナトリウム 0. 05mmol リン酸 (水酸化ナトリウムにて PH7. 3に中和) 0. 02mmol 実施例 1-38-1 TMD123H 30mg
L -ァスパラギン酸 Na—水和物 0. 05賺 ol D (-) -マンニトール 0. 05醒 ol 塩化ナトリウム 0. 05腿 ol リン酸 (水酸化ナトリウムにて pH7. 3に中和) 0. 02讓 ol 実施例 1-39-1 TMD123H 30mg
L -ァスパラギン酸 Na—水和物 0. 05醒 ol D (-) -マンニトール 0. 05mmo丄 Po丄 vsorbate 80 0. lmg 実施例 1-40-1 TMD123H 30mg
L-グルタミン酸 Na—水和物 0. 05醒 ol D (-) -マンニトール 0. 05ramol Polysorbate 80 0. lmg 実施例 Hト 1 TMD123H 30mg
L-ァスパラギン酸 Na—水和物 0. 05mmol D (-) -マンニトール 0. 05腿。丄 Poloxamer 188 0. lmg 実施例 1-42-1 TMD123H 30mg
L -ァスパラギン酸 Na—水和物 0. 05mmol D (-）—マンニトール 0. 05mmol Polysorbate 80 (溶解用水溶液中添加） 0. lmg 実施例 H3- 1 TMD123H 30mg
L -ァスパラギン酸 Na—水和物 0. 05mmol D (-）-マンニトール 0. 05廳 ol
· ンジルアルコール (溶解用水溶液中添加） lOmg 実施例 1-44-1 TMD123H 30mg
L-ァスパラギン酸 Na—水和物 0. Oammol D (-) -マンニトール 0. 05ramol クロロブタノール （溶解用水溶液中添加） 5mg 実施例 1-45-1 TMD123H 30mg
L-グルタミン酸 Na—水和物 0. 05腿 ol D (―) -マンニトール 0. 05mmol
Polysorbate 80 (溶解用水溶液中添加） 0. lmg 実施例 1-46-1 TMD123H 30mg
L -グルタミン酸 Na—水和物 0. 05mmol D (—）一マンニトーノレ 0. 05mmol
：ンジルアルコール （溶解用水溶液中添加） lOmg 実施例 1-47-1 TMD123H 30mg
L-グルタミン酸 Na—水和物 0. Ooramol D (-） -マンニトール 0. ODmmo丄 クロロブタノール （溶解用水溶液中添加） 5mg 実施例 1-48-1 TMD123H 30mg
L -ァスパラギン酸 Na—水和物 0. 05匪 ol D (-) -マンニトール 0. 05匪 ol Polysorbate 80 0. 05mg
Polysorbate 80 (溶解用水溶液中添加） 0. 05mg 実施例 1-49-1 TMD123H 30mg
L-ァスパラギン酸 Na—水和物 0. 05醒 ol D (-) -マンニトール 0. 05醒 ol Polysorbate 80 0. 05mg
· ンジルアルコール （溶解用水溶液中添加） 5mg 実施例 1-50-1 T D123H 30mg
L -ァスパラギン酸 Na—水和物 0. 05醒 ol D (-) -マンニトール 0. 05ramol Polysorbate 80 0. 05mg クロロブタノール （溶解用水溶液中添加） 2. 5mg 実施例 1- 5ト 1 TMD123H 30mg
L-グルタミン酸 Na—水和物 0. 05mmol D (-) -マンニトール 0. 05画 ol Polvsorbate 80 0. 05mg Polysorbate 80 (溶解用水溶液中添加） 0. 05mg 実施例 1-52-1 TMD123H 30mg
L-グルタミン酸 Na—水和物 0. 05腿。丄 D (-) -マンニトール 0. 05讓 ol Polysorbate 80 0. 05rag
：ンジルアルコール （溶解用水溶液中添加） 5mg 実施例 1-53-1 TMD123H 30mg
L-グルタミン酸 Na—水和物 0. 05應。1 D (-) -マンニトール 0. 05讓 ol Polvsorbate 80 0. 05mg クロロブタノール （溶解用水溶液中添加） 2. 5rag 比較例 1-1 TMD123H 15mg
L-アルギニン一塩酸塩 0. /ommo丄 スクロース 0. 75腿 ol 比較例 1-2 TMD123H 10mg
L -アルギニン-塩酸塩 0. ΰ腿。丄 スクロース 0. り腿。丄 比較例 1-3 TMD123H 30mg 比較例 1-4 TMD123H 30mg
L-グルタミン酸 Na—水和物 0. 025匪 ol 比較例 1-5 TMD123H 30mg
D (―) -マンニトール 0. 025腿 ol 比較例 1-6 TMD123H 30mg
L-グルタミン酸 Na—水和物 0. ( mmo丄 比較例 1-7 TMD123H 30mg
D (-) - マンニトーノレ 0. 05腿 ol 比較例 1-8 TMD123H 30mg
L -グルタミン酸 Na—水和物 0. 075腿 ol 比較例 1-9 TMD123H 30mg
D (-) - マンニトール 0. 075励 1 比較例 1-10 TMD123H 30mg
L-ァスパラギン酸 Na一水和物 0. 025画 1 比較例 1-11 TMD123H 30mg
L-ァスパラギン酸 Na—水和物 0. 05腿 o丄 比較例 1-12 TMD123H 30mg
L-ァスパラギン酸 Na—水和物 0. 075腿 ol
実施例 1— 2
実施例 1一 1と同様の方法で、 表 1記載の可溶性ト口ンボモジュリン高濃度含 有製剤を得た （実施例 1-1-1、 1-1-2、 1-1-3、 1-1- に準じて、 可溶性トロンボ モジュリンの種類を変え、 それぞれ実施例 1-2-1、 実施例 1-2-2、 実施例 1-2-3、 実施例 1-2-4を調製した)。
実施例 1 - 3
実施例 1一 1と同様の方法で、 表 1.記載の可溶性ト口ンポモジュリン高濃度含 有製剤を得た （前述と同様に、 それぞれ実施例卜 3 - 1、 実施例 1-3-2、 実施例 1 -
3 - 3、 実施例 1—3—4を調製した)。
実施例 1—4
実施例 1一 1と同様の方法で、 表 1記載の可溶性ト口ンボモジュリン高濃度含 有製剤を得た （前述と同様に、 それぞれ実施例 1-4-1、 実施例 1 - 4 - 2、 実施例 1 -
4 - 3、 実施例 1 - 4- 4を調製した)。
実施例 1一 5 - 実施例.1一 1と同様の方法で、 表 1記載の可溶性ト口ンポモジュリン高濃度含 有製剤を得た （前述と同様に、 それぞれ実施例 1-5-1、 実施例 1-5-2、 実施例 1-
5- 3、 実施例 1-5-4を調製した)。
実施例 1 - 6
実施例 1— 1と同様の方法で、 表 1記載の可溶性ト口ンポモジュリン高濃度含 有製剤を得た （前述と同様に、 それぞれ実施例 1-6-1、 実施例 1-6-2, 実施例 1 -
6 - 3、 実施例 1-6-4を調製した)。
実施例 1—7
実施例 1一 1と同様の方法で、 表 1記載の可溶性ト口ンボモジュリン高濃度含 有製剤を得た （前述と同様に、 それぞれ実施例 1-7-1、 実施例 1-7-2, 実施例 1-
7- 3、 実施例 1-7-4を調製した)。
実施例 1—8
実施例 1一 1と同様の方法で、 表 1記載の可溶性ト口ンボモジュリン高濃度含 有製剤を得た （前述と同様に、 それぞれ実施例 1-8-1、 実施例 1-8-2、 実施例 1-
8 - 3、 実施例 1 - 8 - 4を調製した)。
実施例 1一 9
実施例 1一 1と同様の方法で、 表 1記載の可溶性ト口ンボモジュリン高濃度含 有製剤を得た （前述と同様に、 それぞれ実施例 1-9-1, 実施例 1-9-2, 実施例 1-
9 - 3、 実施例 1-9-4を調製した)。 実施例 l - i o
実施例 1一 1と同様の方法で、 表 1記載の可溶性ト口ンポモジュリン高濃度含 有製剤を得た （前述と同様に、 それぞれ実施例 1-10-1、 実施例 1-10-2、 実施例 1-10-3、 実施例 1-10-4を調製した)。
実施例 1一 1 1
実施例 1— 1と同様の方法で、 表 1記載の可溶性ト口ンポモジュリン高濃度含 有製剤を得た （前述と同様に、 それぞれ実施例 1-11-1、 実施例 1-11 - 2、 実施例 1-11-3、 実施例卜 11- 4を調製した)。
実施例 1—1 2
実施例 1一 1と同様の方法で、 表 1記載の可溶性ト口ンボモジュリン高濃度含 有製剤を得た （前述と同様に、 それぞれ実施例 1-12-1、 実施例 1-12-2、 実施例 1-12-3、 実施例 1-12-4を調製した)。
実施例 1—1 3
実施例 1一 1と同様の方法で、 表 1記載の可溶性ト口ンボモジュリン高濃度含 有製剤を得た （前述と同様に、 それぞれ実施例 1-13-1、 実施例 1-13-2、 実施例 1-13-3、 実施例 1—13-4を調製した)。
実施例 1 - 1 4
実施例 1一 1と同様の方法で、 表 1記載の可溶性ト口ンポモジュリン高濃度含 有製剤を得た （前述と同様に、 それぞれ実施例 1-14-1、 実施例 1-14-2、 実施例 1-14-3、 実施例 1-14-4を調製した)。
実施例 1 - 1 5
実施例 1— 1と同様の方法で、 表 1記載の可溶性ト口ンボモジュリン高濃度含 有製剤を得た （前述と同様に、 それぞれ実施例 1-15-1、 実施例 1-15-2、 実施例 1-15-3、 実施例 1-15-4を調製した)。
実施例 1 - 1 6
実施例 1一 1と同様の方法で、 表 1記載の可溶性ト口ンポモジュリン高濃度含 有製剤を得た （前述と同様に、 それぞれ実施例 1-16-1、 実施例 1-16-2、 実施例 1-16-3、 実施例 1 - 16- 4を調製した)。
実施例 1一 1 7 実施例 1一 1の試料溶液調製で試料溶液を無菌パイアルビンに分注する代わり に 2室式シリンジ （アルテ製） の 1室に 1 mLずつ分注した。 これらを、 ミドル 栓半打栓→凍結乾燥—窒素充填→ミドル栓打栓の順で凍結乾燥工程 （凍結乾燥条 件は実施例 1一 1と同様） を行った。 次にもう 1室側に、 用水 0. 75 mLを無菌 的に充填し、 ゴム栓で封印したのち、 プランジャーロッドを取りつけ可溶性トロ ンポモジュリン高濃度含有製剤のキット製剤を得た （前述と同様に、 それぞれ実 施例 1-17-1、 実施例 1-17-2、 実施例 1-17-3、 実施例 1-17- 4を調製した)。
実施例 1 - 1 8
実施例 1一 13 の試料溶液調製で無菌バイアルビンの代わりに 2室式シリンジ (アルテ製） の 1室に 1 mLずつ分注した。 これらを、 ミドル栓半打栓→凍結乾 燥→窒素充填→ミドル栓打栓の順で凍結乾燥工程 （凍結乾燥条件は実施例 1 - 1 と同様） を行った。 次にもう 1室側に注射用水 0. 75 mLを無菌的に充填し、 ゴム 栓で封印したのち、 プランジャー口ッドを取りつけ可溶性ト口ンボモジュリン高 濃度含有製剤のキット製剤を得た （前述と同様に、 それぞれ実施例 1-18- 1、 実施 例 1- 1δ - 2、 実施例 1-18-3、 実施例 1-18-4を調製した)。
実施例 1—1 9
実施例 1—1で無菌ろ過した試料溶液を無菌バイアルビンに 0. 5 mLずつ分注 した以外は同様の方法で、 表 1記載の可溶性ト口ンボモジュリン高濃度含有製剤 を得た （前述と同様に、 それぞれ実施例 1-19-1, 実施例 1-19-2、 実施例 1-19-3、 実施例 1 - 19- 4を調製した)。
実施例 1 - 2 0
実施例 1一 1で無菌ろ過した試料溶液を無菌パイアルビンに 0. 333 mLずつ分 注した以外は同様の方法で、 表 1記載の可溶性ト口ンポモジュリン高濃度含有製 剤を得た （前述と同様に、 それぞれ実施例 1-20-1、 実施例 1-20-2、 実施例 1 - 20 - 3、 実施例 1-20-4を調製した)。
実施例 1 - 2 1
実施例 1一 2で無菌ろ過した試料溶液を無菌パイアルビンに 0. 5 mLずつ分注 した以外は同様の方法で、 表 1記載の可溶性ト口ンポモジュリン高濃度含有製剤 を得た （前述と同様に、 それぞれ実施例 1-21-1、 実施例 1-21-2、 実施例 1-21-3, 実施例 1—21-4を調製した)。
実施例 1一 2 2
実施例 1—2で無菌ろ過した試料溶液を無菌バイアルビンに 0. 333 mLずつ分 注した以外は同様の方法で、 表 1記載の可溶性ト口ンボモジュリン高濃度含有製 剤を得た （前述と同様に、 それぞれ実施例 1-22- 1、 実施例 1-22-2、 実施例 1-22- 3、 実施例 1-22 - 4を調製した)。
実施例 1 - 2 3
実施例 1—3で無菌ろ過した試料溶液を無菌パイアルビンに 0. 5 mLずつ分注 した以外は同様の方法で、 表 1記載の可溶性ト口ンポモジュリン高濃度含有製剤 を得た （前述と同様に、 それぞれ実施例 1-23-1、 実施例 1-23-2、 実施例 1-23 - 3、 実施例 1-23-4を調製した)。
実施例 1 - 2 4
実施例 1一 3で無菌ろ過した試料溶液を無菌バイアルビンに 0. 333 mLずつ分 注した以外は同様の方法で、 表 1記載の可溶性ト口ンボモジュリン高濃度含有製 剤を得た （前述と同様に、 それぞれ実施例 1-24- 1、 実施例 1-24-2、 実施例 1-24- 3、 実施例 1-24—4を調製した)。
実施例 1一 2 5
実施例 1一 1と同様の方法で、 表 1記載の可溶性ト口ンボモジュリン高濃度含 有製剤を得た （前述と同様に、 それぞれ実施例 1-25-1、 実施例 1-25-2、 実施例 1-25-3、 実施例 1-25-4を調製した)。
実施例 1 - 2 6
実施例 1— 1と同様の方法で、 表 1記載の可溶性ト口ンボモジュリン高濃度含 有製剤を得た （前述と同様に、 それぞれ実施例 1-26-1、 実施例 1-26-2、 実施例 1-26-3、 実施例 1-26-4を調製した)。
実施例 1 - 2 7
実施例 1一 1と同様の方法で、 表 1記載の可溶性ト口ンボモジュリン高濃度含 有製剤を得た （前述と同様に、 それぞれ実施例 1-27-1、 実施例 1-27-2、 実施例 1-27-3、 実施例 1-27-4を調製した)。
実施例 1一 2 8 実施例 1— 1と同様の方法で、 表 1記載の可溶性ト口ンポモジュリン高濃度含 有製剤を得た （前述と同様に、 それぞれ実施例 1-28-1、 実施例 1-28-2、 実施例 1-28-3、 実施例 1-28-4を調製した)。 .
実施例 1一 2 9
実施例 1 _ 1と同様の方法で、 表 1記載の可溶 '14ト口ンボモジュリン高濃度含 有製剤を得た （前述と同様に、 それぞれ実施例 1-29-1、 実施例 1-29-2、 実施例 1-29-3、 実施例 1-29-4を調製した)。
実施例 1—3 0
実施例 1一 1と同様の方法で、 表 1記載の可溶性ト口ンポモジュリン高濃度含 有製剤を得た （前述と同様に、 それぞれ実施例 1-30-1、 実施例 1-30-2、 実施例 1-30-3、 実施例 1-30-4を調製した）。
実施例 1—3 1
実施例 1—13で無菌ろ過した試料溶液を無菌バイアルビンに 0. 5 raLずつ分注 した以外は同様の方法で、 表 1記載の可溶性ト口ンポモジュリン高濃度含有製剤 を得た （前述と同様に、 それぞれ実施例 1-31-1、 実施例 1-31 - 2、 実施例 1-31-3、 実施例 1-31-4を調製した)。
実施例 1 - 3 2
実施例 1 _13で無菌ろ過した試料溶液を無菌パイアルビンに 0. 333 mLずつ分 注した以外は同様の方法で、 表 1記載の可溶性ト口ンボモジュリン高濃度含有製 剤を得た （前述と同様に、 それぞれ実施例 1-32-1、 実施例 1-32-2、 実施例 1 - 32 - 3、 実施例 1-32-4を調製した)。
実施例 1—3 3
実施例 1—25で無菌ろ過した試料溶液を無菌バイアルビンに 0. 5 mLずつ分注 した以外は同様の方法で、 表 1記載の可溶性ト口ンボモジュリン高濃度含有製剤 を得た （前述と同様に、 それぞれ実施例 1-33-1、 実施例 1-33-2、 実施例 1-33-3, 実施例 1-33-4を調製した)。
実施例 1 - 3 4
実施例 1—25で無菌ろ過した試料溶液を無菌パイアルビンに 0. 333 mLずつ分 注した以外は同様の方法で、 表 1記載の可溶性ト口ンボモジュリン高濃度含有製 剤を得た （前述と同様に、 それぞれ実施例 1-34-1、 実施例 1-34-2、 実施例 1-34 - 3、 実施例 1-34-4を調製した)。
実施例 1 - 3 5
実施例 1—26で無菌ろ過した試料溶液を無菌バイアルビンに 0. 5 mLずつ分注 した以外は同様の方法で、 表 1記載の可溶性ト口ンボモジュリン高濃度含有製剤 を得た （前述と同様に、 それぞれ実施例 1-35-1、 実施例 1-35-2、 実施例 1-35 - 3、 実施例 1-35-4を調製した)。
実施例 1— 3 6
実施例 1—26で無菌ろ過した試料溶液を無菌パイアルビンに 0. 333 mLずつ分 注した以外は同様の方法で、 表 1記載の可溶性ト口ンポモジュリン高濃度含有製 剤を得た （前述と同様に、 それぞれ実施例 1-36-1、 実施例 1 - 36 - 2、 実施例 1-36 - 3、 実施例 1-36-4を調製した)。
実施例 1— 3 7
添加剤溶液調製
20 mLのメスフラスコに L -グルタミン酸ナトリゥム一水和物 2. 5 mmol および
D (-) -マンニトール 2. 5 mmol を量り入れ、 注射用水を加え溶解して 20 mL とし † 試料溶液調製
上記添加剤溶液 4 mLを 15 mL のアシストチューブに入れ、 参考例 1で得られ た TMD123Hを 5 mL (可溶性ト口ンボモジュリンとして 300 mg含有する） および 50 ΙΏΜ NaClを含む 20 mMリン酸塩緩衝液 (pH7. 3)を 1 mL加え、 混合攪拌した。 こ の試料溶液をデイスポシリンジ 25 mL (テルモ製） を用い、 孔径： 0. 22 μ ιη (MILLEX- GV、 ミリポア製） のフィルターを付けてろ過滅菌し、 無菌バイアルビ ン （3010、 不二硝子製） に 1 mLずつ分注した。 ゴム栓半打栓→凍結乾燥→窒素充填→ゴム栓打栓→キャップ卷締めの順で以下 の条件にて凍結乾燥工程を行い、 可溶性ト口ンボモジュリン高濃度含有製剤を得 た （実施例 1-37 - 1)。
〔50 mM NaClを含む 20 mMリン酸塩緩衝液 (pH7. 3)の調製方法〕 1000 mL ビーカーにリン酸を 2306 mg、 塩化ナトリゥムを 2937 mg量りいれる。 注射用水を 750 mL加え撹拌溶解する。 17%水酸化ナトリゥム溶液 (水酸ィ匕ナトリ ゥム 17. 71 gを注射用水で溶かし、 100 mLとした溶液）で ρΗ7· 3に調整し、 注射 用水を加え、 1000 mLとする。
〔凍結乾燥条件〕
予備冷却 (15分かけて室温から 15°C) → 本冷却 （2時間かけて 15°Cから - 45 °C) → 保持 （ 2時間 - 45°C) → 真空開始 （18 時間 -45°C) → 昇温 （20 時間かけて- 45°Cから 25°C)→ 保持 （15 時間 25°C)→ 昇温 （1時間かけて 25°Cから 45°C) → 保持 （5時間 45°C) → 室温 （2時間かけて 45°Cから 25°C) → 復圧窒素充填 （- 100 mmHgまで窒素で復圧） → 打栓 → キャップ 卷締め
同様に、 可溶性トロンボモジュリンの種類を変えて参考例 1で得られた TMD123Hの代わりに TMD123HM (実施例 1-37-2)、 TME456H (実施例 1-37-3)、 およ び TME456HM (実施例 1-37-4) を用いて、 それぞれ上記の方法にしたがって可溶 性ト口ンボモジュリン高濃度含有製剤を得た。
実施例 1 - 3 8
L -グルタミン酸ナトリゥム一水和物の代わりに、 L -ァスパラギン酸ナトリウム 一水和物を量り入れる以外は実施例 1-37 と同様の方法で、 可溶性トロンポモジ ユリン高濃度含有製剤を得た （実施例 1-37-1、 1-37-2、 1-37-3、 1-37-4 に準じ て、 可溶性トロンボモジュリンの種類を変え、 それぞれ実施例 1-38-1、 実施例 1-38-2、 実施例 1-38-3、 実施例 1-38- 4を調製した)。
実施例 1 - 3 9
添加剤溶液調製
20 mLのメスフラスコに L-ァスパラギン酸ナトリウム一水和物 2. 5 mmolおよ び D (―)—マンニ ト ル 2. 5 画 ol、 および Polysorbate 80 (5 mg) を量りいれ、 用水を加え溶解して 20 mLとした。
実施例 1-1の添加剤溶液を上記とする以外は同様の方法で、 可溶性トロンポモ ジュリン高濃度含有製剤を得た （前述と同様に、 それぞれ実施例 1-39-1、 実施例 1-39-2、 実施例 1-39-3、 実施例 1-39-4を調製した)。 実施例 1 - 4 0
添加剤溶液調製
20 mLのメスフラスコに L-グルタミン酸ナトリゥム一水和物 2. 5 mmolおよぴ D (-）-マンニトール 2. 5 腿 ol、 およぴ Polysorbate 80 (5 mg) を量りいれ、 注 射用水を加え溶解して 20 mLとした。
実施例 1-1の添加剤溶液を上記とする以外は同様の方法で、 可溶性トロンポモ ジュリン高濃度含有製剤を得た （前述と同様に、 実施例 1 - 40 - 1を調製した)。 実施例 1 - 4 1
添加剤溶液調製
20 mLのメスフラスコに L-ァスパラギン酸ナトリゥム一水和物 2. 5 mmolおよ ぴ D (-) -マンニトール 2. 5 mmol, および Poloxamer 188 (5 mg) を量りいれ、 注 射用水を加え溶解して 20 mLとした。
実施例 1-1の添加剤溶液を上記とする以外は同様の方法で、 可溶性トロンボモ ジュリン高濃度含有製剤を得た （前述と同様に、 実施例ト 4卜 1を調製した)。 実施例 1 - 4 2
実施例 1-13 で得られた可溶性ト口ンポモジュリン含有凍結乾燥製剤と、 溶解 用水溶液として ¾lt用水 1 raLに Polysorbate 80を 0. 1 mg含有する溶液を 1 mL 無菌的に充填してなるアンプルとを組み合わせた可溶性ト口ンボモジュリン含有 凍結乾燥製剤のキット製剤を得た。 （前述と同様に、 実施例 1-42-1 を調製した)。 実施例 1—4 3
実施例 1-13 で得られた可溶性トロンボモジュリン含有凍結乾燥製剤と、 溶解 用水溶液として、 用水 1 mLにべンジルアルコールを 10 mg含有する溶液を 1 mL無菌的に充填してなるアンプルとを組み合わせた可溶性ト口ンボモジュリン含 有凍結乾燥製剤のキット製剤を得た。 （前述と同様に、 実施例 1-43-1 を調製し た)。
実施例 1 - 4 4
実施例 1-13 で得られた可溶性トロンボモジュリン含有凍結乾燥製剤と、 溶解 用水激夜として、 用水 1 mLにクロロブタノールを 5 mg含有する溶液を 1 mL 無菌的に充填してなるアンプルとを組み合わせた可溶性ト口ンボモジュリン含有 凍結乾廳剤のキット製剤を得た。 （実施例 1-44-1を調製した)。
実施例 1—4 5
実施例 1-1で得られた可溶†生ト口ンポモジュリン含有凍結乾燥製剤と、 溶解用 水溶液として注射用水 1 mLに Polysorbate 80を 0. 1 mg含有する溶液を 1 mL無 菌的に充填してなるアンプルとを組み合わせた可溶性ト口ンポモジュリン含有凍 結乾燥製剤のキット製剤を得た。 （前述と同様に、 それぞれ実施例 1-45-1、 実施 例 1-45-2、 実施例 1-45-3、 実施例 1-45- 4を調製した)。
実施例 1一 4 6
実施例 1-1で得られた可溶性トロンボモジュリン含有凍結乾燥製剤と、 溶解用 水溶液として注射用水 1 mLにべンジルアルコールを 10 mg含有する溶液を 1 mL 無菌的に充填してなるアンプルとを組み合わせた可溶性ト口ンボモジュリン含有 凍結乾燥製剤のキット製剤を得た。 （前述と同様に、 実施例 1-46-1 を調製した)。 実施例 1—4 7
実施例ト 1で得られた可溶性ト口ンポモジュリン含有凍結乾燥製剤と、 溶解用 水溶液として注射用水 1 mLにク口ロブタノ一ノレを 5 mg含有する溶液を 1 mL無 菌的に充填してなるアンプルとを組み合わせた可溶性ト口ンポモジュリン含有凍 結乾 剤のキット製剤を得た。 （前述と同様に、 実施例 1 - 47 -を調製した)。
実施例 1 - 4 8
添加剤溶液調製
20 mLのメスフラスコに L-ァスパラギン酸ナトリゥム一水和物 2. 5 mmolおよ ぴ D (-) -マンニトール 2. 5 腿 ol、 およぴ Polysorbate 80 (2. 5 mg) を量りいれ、 注射用水を加え溶解して 20 mLとした。
実施例 1-1の添加剤溶液を上記とする以外は同様の方法で得た可溶性トロンボ モジュリン含有凍結乾燥製剤と、 溶解用水溶液として注射用水 1 mL に Polysorbate 80を 0. 05 mg含有する溶液を 1 mL無菌的に充填してなるアンプル とを糸且み合わせしめた可溶性ト口ンポモジュリン含有凍結乾燥製剤のキット製剤 を得た。 （前述と同様に、 実施例 1-48-1を調製した)。
実施例 1一 4 9
添加剤溶液調製 20 mLのメスフラスコに L-ァスパラギン酸ナトリウム一水和物 2. 5 mmolおよ ぴ D (-) -マンニトール 2. 5 讓 ol、 および Polysorbate 80 (2. 5 mg) を量りいれ、 ¾ 用水を加え溶解して 20 mLとした。
実施例 1-1の添加剤溶液を上記とする以外は同様の方法で得た可溶性トロンポ モジュリン含有凍結乾 剤と、 溶解用水溶液として注射用水 1 mL にべンジル アルコールを 5 mg含有する溶液を 1 mL無菌的に充填してなるアンプルとを組み 合わせしめた可溶性ト口ンボモジュリン含有凍結乾燥製剤のキット製剤を得た。
(前述と同様に、 実施例 1-49-1を調製した)。
実施例 1 - 5 0
添加剤溶液調製
20 mLのメスフラスコに L-ァスパラギン酸ナトリウム一水和物 2. 5 mmolおよ ぴ D (-）—マンニトール 2. 5 讓 ol、 および Polysorbate 80 (2. 5 mg) を量りいれ、 Sit用水を加え溶解して 20 mLとした。
実施例 1-1の添加剤溶液を上記とする以外は同様の方法で得た可溶性トロンポ モジュリン含有凍結乾燥製剤と、 溶解用水溶液として注射用水 1 mL にクロロブ タノールを 2. 5 mg含有する溶液を 1 mL無菌的に充填してなるアンプルとを組み 合わせしめた可溶性ト口ンボモジュリン含有凍結乾燥製剤のキット製剤を得た。
(前述と同様に、 実施例卜 50 - 1を調製した)。
実施例 1—5 1
添加剤溶液調製
20 mLのメスフラスコに L -グルタミン酸ナトリゥム一水和物 2. 5 mmolおよび D (-)—マンニトール 2. 5 醒 ol、 および Polysorbate 80 (2. 5 mg) を量りいれ、 注射用水を加え溶解して 20 mLとした。
実施例 1-1の添加剤激夜を上記とする以外は同様の方法で得た可溶性トロンポ モジュリン含有凍結乾燥製剤と、 溶解用水溶液として注射用水 1 mL に Polysorbate 80を 0. 05 mg含有する溶液を 1 mL無菌的に充填してなるアンプル とを組み合わせしめた可溶性ト口ンボモジュリン含有凍結乾燥製剤のキット製剤 を得た。 （前述と同様に、 実施例ト 51 - 1を調製した)。
実施例 1—5 2 添加剤溶液調製
20 mLのメスフラスコに L-グルタミン酸ナトリゥム一水和物 2. 5 mmolおよび D (-) -マンニトール 2. 5 醒 ol、 およぴ Polysorbate 80 (2. 5 mg) を量りいれ、 注射用水を加え溶解して 20 mLとした。
実施例 1-1の添加剤激夜を上記とする以外は同様の方法で得た可溶性トロンポ モジュリン含有凍結乾燥製剤と、 溶解用水溶液として注射用水 1 mLにべンジル アルコールを 5 mg含有する溶液を 1 mL無菌的に充填してなるアンプルとを組み 合わせしめた可溶性ト口ンポモジュリン含有凍結乾燥製剤のキット製剤を得た。
(前述と同様に、 実施例 1 - 52- 1を調製した)。
実施例 1一 5 3
添加剤溶液調製
20 mLのメスフラスコに L-グルタミン酸ナトリゥム一水和物 2. 5 mmolおよび D (-)—マンニトール 2. 5 mmol、 および Polysorbate 80 (2. 5 mg) を量りいれ、 注射用水を加え溶解して 20 mLとした。
実施例 1 - 1の添加剤溶液を上記とする以外は同様の方法で得た可溶性トロンポ モジュリン含有凍結乾燥製剤と、 溶解用水溶液として注射用水 1 にクロロブ タノールを 2. 5 mg含有する溶液を 1 mL無菌的に充填してなるアンプルとを組み 合わせしめた可溶性ト口ンポモジュリン含有凍結乾燥製剤のキット製剤を得た。
(前述と同様に、 実施例 1 -53- 1を調製した)。
比較例 1 - 1
20 mL のメスフラスコに L-アルギニン一塩酸塩 20 mmol およぴスクロース 20 mmolを量り入れ、 注射用水を加え溶解して 20 mLとした。 ここから 7. 5 mLを 15 mLのアシストチューブに入れ、 参考例 1で得られた TMD123Hを 2. 5 mL (可溶性ト ロンボモジュリンとして 150 mg含有する）加え、 混合攪拌した。 この試料溶液を ディスポシリンジ 25 mL (テルモ製） を用い、 孔径： 0. 22 ί ΐη(ΜΠ ΕΧ- GV、 ミリポ ァ製）のフィルターを付けてろ過滅菌し、 特別に限定しない限りシリコーンコー ティング未処理の無菌パイアルビン （3010、 不二硝子製） に 1 mLずつ分注した。 ゴム栓半打栓→凍結乾燥→窒素充填→ゴム栓打栓- '卷締めの順で実施 例 1一 1記載の条件にて凍結乾燥工程を行い、 1容器中に可溶性ト口ンポモジュ リン 15 mg、 L-アルギニン一塩酸塩 0. 75 腿。1、 スクロース 0. 75 腿 ol を含む組 成物を得た。
比較例 1一 2
20 raL のメスフラスコに L -ァノレギニン一塩酸塩 20 mmolぉょぴスクロース 20 醒 ol を量り入れ、 注射用水を加え溶解して 20 mL とした。 ここから 5 mL を 15 mLのアシストチューブに入れ、 参考例 1で得られた TMD123Hを 1. 67 raL (可溶性 ト口ンボモジュリンとして 100 mg含有する） および注射用水 3. 33 raL加え、 混 合攪拌した以外は比較例 1一 1と同様の方法で、 表 1記載の組成物を得た。
比較例 1—3
15 mLのアシストチューブに、 参考例 1で得られた TMD123Hを 5 mL (可溶性ト 口ンボモジュリンとして 300 mg含有する） および注射用水 5 mL加え、 混合攪拌 した以外は比較例 1—1と同様の方法で、 表 1記載の組成物を得た。
比較例 1 - 4
実施例 1—1の添加剤溶液調製で、 表 1記載の添加剤を 1. 25 mmol量り入れる 以外は同様の方法で、 表 1記載の組成物を得た。
比較例 1一 5
実施例 1 - 1の添加剤溶液調製で、 表 1記載の添加剤を 1. 25 mmol量り入れる 以外は同様の方法で、 表 1記載の組成物を得た。
比較例 1—6
実施例 1 - 1の添加剤溶液調製で、 表 1記載の添加剤を 2. 5 mmol量り入れる 以外は同様の方法で、 表 1記載の組成物を得た。
比較例 1一 7
実施例 1 - 1の添加剤溶液調製で、 表 1記載の添加剤を 2. 5 mmol 量り入れる 以外は同様の方法で、 表 1記載の組成物を得た。
比較例 1—8
実施例 1 - 1の添加剤溶液調製で、 表 1記載の添加剤を 3. 75 mmol量り入れる 以外は同様の方法で、 表 1記載の組成物を得た。
比較例 1一 9 実施例 1—1の添加剤溶液調製で、 表 1記載の添加剤を 3. 75 mmol量り入れる 以外は同様の方法で、 表 1記載の組成物を得た。
比較例 1—10
実施例 1 - 1の添加剤溶液調製で、 表 1記載の添加剤を 1. 25 mmol量り入れる 以外は同様の方法で、 表 1記載の組成物を得た。
比較例 1—11
実施例 1一 1の添加剤溶液調製で、 表 1記載の添加剤を 2. 5 mmol量り入れる 以外は同様の方法で、 表 1記載の組成物を得た。
比較例 1—12
実施例 1 - 1の添加剤溶液調製で、 表 1記載の添加剤を 3. 75 mmol量り入れる 以外は同様の方法で、 表 1記載の組成物を得た。
投与例 1
実施例 1-1-1 で得た可溶性トロンボモジュリン高濃度含有製剤を、 注射用水 0. 75 mLを加えて再溶解し、 投与用組成物を得た。
投与例 2
実施例 1-1-2 で得た可溶性トロンポモジュリン高濃度含有製剤を、 注射用水 0. 75 mLを加えて再溶角早し、 投与用糸且成物を得た。
投与例 3
実施例 1-1-3 で得た可溶性トロンボモジュリン高濃度含有製剤を、 注射用水 0. 75 mLを加えて再溶解し、 投与用組成物を得た。
投与例 4
実施例 1-1-4 で得た可溶性トロンポモジュリン高濃度含有製剤を、 注射用水 0. 75 mLを加えて再溶解し、 投与用組成物を得た。
投与例 5
実施例 1-2-1 で得た可溶性トロンボモジュリン高濃度含有製剤を、 注射用水 1. 0 mLを加えて再溶解し、 投与用組成物を得た。
投与例 6 ° 実施例 1-1-1 で得た可溶性トロンボモジュリン高濃度含有製剤を、 注射用水 1. 5 mLを加えて再溶解し、 投与用組成物を得た。 投与例 7
実施例 1-1-1 で得た可溶性トロンボモジュリン高濃度含有製剤を、 注射用水 0. 5 mLを加えて再溶解し、 投与用組成物を得た。
比較投与例 1
生理食塩液を投与用組成物とした。
比較投与例 2
塩ィ匕ナトリウム 9. 00 gを注射用水に溶解して 100 mLとし、 投与用組成物を得 た。
比較投与例 3
比較例 1 _ 1で得た組成物を、 注射用水 1. 0 mL を加えて再溶解し、 投与用組 成物を得た。
比較投与例 4
比較例 1 _ 2で得た組成物を、 注射用水 2. 0 mL を加えて再溶解し、 投与用組 成物を得た。
比較投与例 5
比較例 1—3で得た組成物を、 注射用水 1. 0 mL を加えて再溶解し、 投与用組 成物を得た。
実験例 1 表 2に示された投与例又は比較投与例の投与溶液の疼痛の程度を Quartaroli M らの方法 （J. Pharmacol. Exp. Ther. , 290 (1)： 158- 69, 1999)に準じて評価した。 CDマウス（25-30 g、 チヤ一ルスリパー） を一晚絶食させ 12群に分けた後、 透明 個別ケージに 15分入れて馴化させた。 各投与例おょぴ比較投与例の投与溶液を 左後肢に 20 z L皮下投与した。 投与後直ちに個別ケージに戻し、 5分間に左後肢 の持ち上げ時間および投与部位をなめる時間をトータルでカウントし疼痛の指標 とした。 実験は 1匹ずつ行い、 1群 n = 6匹で平均時間を求めた。 結果を表 2に 示す。
実験例 2
実験例 1で用いた各投与溶液の浸透圧比を求めた。 浸透圧比の求め方
浸透圧比は、 生理食塩液の与えるォスモル濃度に対する試料溶液のォスモル濃 度の比と定義 （第 14改正日本薬局方、 浸透圧測定法） され、 生理食塩液 (0. 900 g/100mL)のォスモル濃度は一定（286m0sm)であることから次式で計算した 〔浸透 圧比 =試料溶液のォスモル濃度 (mOsm) /286 (mOsm)〕。
なお、 ォスモル濃度は、 第 14改正日本薬局方の浸透圧測定法にしたがって求 めた。 すなわち、 浸透圧測定装置 (V0GELネ: 0M802- D)を用いて、 以下の方法に 従ってあらかじめ二点校正法により装置の校正を行い、 装置の適合性を確認した のちに試料溶液のォスモル濃度を測定した。
装置の校正法
注射用水 （大塚製薬製） でゼロ捕正を行い、 次に装置校正用ォスモル濃度標準 液 200m0smおよび 400m0smで装置の校正を行つた。
〔装置校正用ォスモル濃度標準液 200m0smの調製〕
塩化ナトリウム （和光純薬） を 600でで 50分間乾燥し、 デシケーター （シリカ ゲル） 中で放冷する。 この塩化ナトリゥム 0. 626 gを正確に量り、 ¾lt用水 100 gを力 Bえて溶カゝした。
〔装置用ォスモル濃度標準液 400m0smの調製〕
塩化ナトリウム （和光純薬） を 600°Cで 50分間乾燥し、 デシケーター （シリカ ゲル） 中で放冷する。 この塩化ナトリウム 1. 270 gを正確に量り、 ¾l†用水 100 gを加えて溶かした。
装置の適合性
300m0sm標準液 (V0GEL社製）を 6回繰り返し測定を行って、 6回の相対標準偏 差が 2 %以内であり、 測定値が 291〜309m0smであることを確認した。
試料溶液の測定
各投与溶液を専用サンプルカップ (V0GEL社製)に採取し測定を行った。 なお、 比較投与例 2, 3, 4 で得られた投与溶液は注射用水（大塚製薬製）でそれぞれ 10， 10， 3倍に希釈して、 この液につき同様な測定を行い、 得られたォスモル濃度 を 10, 10， 3倍した。 表 2にその結果を示した。
表 2から明らかなように、 投与例 1から 7の各投与溶液は、 マウスにおいて疼 痛時間は非常に短く、 比較投与例 1の生理食塩液とほぼ同等であり、 疼痛の程度 は大きいものではないことがわかった。 比較投与例 2から 4の投与溶液は、 疼痛 時間が長レ、ものであり、 従って疼痛の程度が大きく好ましくないことが確認され た。 実験例 2の浸透圧比を調べてみたところ表 2で示したとおり疼痛時間の短レヽ 組成物は浸透圧比が 1付近にあり、 顕著に疼痛時間が長い組成物は浸透圧比が高 いまたは低いものであった。
表 2から明らかなように、 実施例で得られた可溶性ト口ンボモジュリン高濃度 含有製剤を 0. 1 niLから 2 raLの溶解用水溶液に溶解したときの浸透圧比がほぼ 1 となり、 該製剤は例えば筋肉内投与や皮下投与方法の投与方法に採用できること が明確となった。 ' 表 2
Figure imgf000068_0001
実験例 3
以下に、 実施例で得られた可溶性ト口ンボモジュリン高濃度含有製剤および比 較例で得た組成物を 60°Cの恒温器に保存し、 2週間目に該製剤を再溶解し、 その 投与用薬剤の会合体生成率 (%)を測定した。 会合体生成率の測定法
可溶性ト口ンポモジュリンの会合体生成率を HPLC分析ゲルろ過法により測定 した。 つまり、 移動相は 0. 1 mmol/L硫酸ナト リゥムを含む 50 醒 ol/L リン酸塩 緩衝液 pH7. 3に調製したものを用い、 カラムは TSK- gel 3000SWXL (東ソ一株式会 社） を用い、 カラム温度は 25°C付近の一定温度で行った。 流量は、 可溶性トロン ボモジュリンの保持時間が 9分となるように調整した。 サンプル溶液は、 可溶性 ト口ンボモジュリンの含有量が 1 mg/mL となるように 0. 1 mmol/L硫酸ナトリウ ムを含む 50 ramol/L リン酸塩緩衝液の移動相を加えて希釈し調製した。 この液 0. 15 mLを注入した。 紫外可視吸光光度計 （測定波長： 280 ran)で可溶性ト口ンボ モジュリンのピーク面積 (A)および約 7から 8分に現れる会合体のピ一ク面積 (B) を求め、 100XB/(A+B)より会合体生成率 (%)を算出した。 表 3にその結果を示し た。
表 3から明らかなように、 添加剤を加えない場合 （比較例 1— 3 ) には会合体 の生成率は高く、 比較例 1— 4から 1—11のように単独で添加する場合に比べて、 実施例のように 2種の添加剤を組み合わせることにより、 極めて高い安定性が達 成されという顕著な相乗効果が認められた。 また、 実施例 1—19 から 1一 38 で 得られた可溶性ト口ンボモジュリン高濃度含有製剤、 および実施例 1一 1から 1 一 18で得られた TME456Hまたは TME456HMを含有する可溶性ト口ンボモジュリン 高濃度含有製剤についても表 3と同様に会合体の生成率を抑える結果が得られた。 従って、 本発明の実施例は会合体の生成率が低く、 力つ投与するために溶解し た場合に疼痛が少ないものであることが確認された。 表 3
会合体生成率 (%) 励口量 用いた可溶性トロンボ 添 Λ口剤
(mmo丄) モジュリンの種類
添 卩量 30 mg
TMD123H TMD123H
L -グルタミン酸 Na—水和物 0. 05
実施例 1-1 0. 32 0. 4
D (-) -マンニトール 0. 05
L-グルタミン酸 Na—水和物 0. 075
実施例 1-2 0. 34 0. 36
D (- ) -マンニトール 0. 075
Figure imgf000070_0001
実験例 4
実施例 1-39-1から 1-53-1 で得られた可溶性トロンポモジュリン （TMD123H) 高濃度含有製剤またはキット製剤につき、 可溶性ト口ンポモジュリン高濃度含有 溶液を調製し、 実験例 2又は実験例 3と同様の方法で浸透圧比および会合体生成 率を求め、 表 4にその結果を示した。
可溶性ト口ンボモジュリン高濃度含有溶液の調製法
実施例 1-39-1から 1-41-1で得られた可溶性ト口ンポモジュリンが TMD123Hで ある高濃度含有製剤について、 注射用水 1 mL を加えて再溶解し、 可溶性トロン ボモジュリン高濃度含有溶液を得た。 また、 実施例 1-42-1から 1-53-1で得られ た可溶性ト口ンポモジュリンが TMD123Hである高濃度含有製剤のキット製剤につ いて、 ディスポシリンジ 1 mL (テルモ製） を用いて溶解用水溶液 1 mLを吸引し、 パイアルビンに注入して再溶解し、 可溶性ト口ンボモジュリン高濃度含有溶液を 得た。 .
表 4の結果から明らかなように、 実施例で得られた可溶性ト口ンボモジュリン 高濃度含有溶液の浸透圧比がほぼ 1となり、 会合体の生成率を抑える結果が得ら れた。
また、 実施例 1-39 - 2 から 1-39-4 で得られた可溶性トロンボモジュリンが TTMD123HMまたは TME456Hまたは TME456HMを含有する可溶性ト口ンポモジュリン 高濃度含有製剤またはキット製剤についても、 表 4と同様に浸透圧比がほぼ 1と なり、 さらに会合体の生成率を抑える結果が得られた。
従って、 本発明の実施例は会合体の生成率が低く、 かつ投与するために溶解し た場合に疼痛が少なく、 例えば筋肉内投与や皮下投与方法の投与方法に採用でき ることが確認された。' 表 4 浸透圧比 会合体生成率 (%)
実施例 1-39-1 1. 0 0. 41
実施例 1-40-1 1. 0 0. 33
実施例 1-41-1 1. 0 0. 48 実施例 1-42-1 1. 0 0. 44
実施例ト 43 - 1 1. 2 0. 46
実施例 1-44-1 1. 2 0. 39
実施例 1-45-1 1. 0 0. 35
実施例 1-46-1 1. 2 0. 35
実施例 1-47-1 1. 2 0. 36
実施例 1-48-1 1. 0 0. 41
実施例 1-49-1 1. 1 0. 38
実施例 1-50-1 1. 1 0. 39
実施例 1-51-1 1. 0 0. 35
実施例 1-52-1 1. 1 0. 34
実施例 1-53-1 1. 1 0. 35 実施例 2 - 1 - 添加剤溶液調製 ,
20 mLのメスフラスコに、 Polysorbate 80 (5 mg) を量り入れ （表 5の組成の 欄に記載した添加量の 50倍量にあたる）、 ait用水を加え溶解して 20 mLとした。 試料溶液調製
上記添加剤溶液 4 mLを 15 mL のアシストチューブに入れ、 参考例 1で得られ た TMD123H (可溶性ト口ンボモジュリン濃度： 60 mg/mL) 5 mLを同アシストチュ ーブに入れ （可溶性ト口ンポモジュリンとして表 5の添加量の欄に記載の 10倍 量にあたる）、 さらに注射用水を加え合わせて 10 mL とし、 混合攪拌した。 この 試料溶液をディスポシリンジ 25 mL (テルモ製） を用い、 孔径： 0. 22μ ηι(ΜΙΙ ΕΧ - GV、 ミリポア製）のフィルターを付けてろ過滅菌し、 特別に限定しない限りシリ コーンコーティング未処理の無菌パイアルビン （容量 3 mL、 18 X 33 匪、 口内径 9. 1 腿、 ナミコス製） に 1 mLずつ分注した。
凍結乾燥工程
ゴム栓 （V5- F8、 大協精ェ製） 半打栓→凍結乾燥→窒素充填→ゴム栓打栓→キ ャップ卷締めの順で以下の条件にて凍結乾燥工程を行い、 1容器中に可溶性ト口 ンボモジュリン 30 mg、 および Polysorbate 80 (0. 1 mg) を含む可溶性ト口ンボ モジユリン高濃度含有製剤を得た （実施例 2-1-1)。
〔凍結乾燥条件〕
予備冷却 (15分かけて室温から 15°C)→ 本冷却 （2時間かけて 15°Cから - 45°C) → 保持 （2時間 - 45°C) → 真空開始 （18 時間 - 45°C) → 昇温 （20 時間かけて- 45°Cから 25°C) → 保持 (15時間 25°C) → 昇温 （1時間かけて 25°Cから 45°C) → 保持 （5時間 45°C) → 室温 （2時間かけて 45°Cから 25°C)→ 復圧窒素充填 （- 100 删¾まで窒素で復圧） → 打栓 → キャップ 卷締め
〔溶解時の減圧度の確認〕
あらかじめ、 空のバイアルビンを- 100 讓 Hg でゴム栓打栓、 キャップ卷締めを 行い、 このパイアルビンに ¾|†用水 1 mLを注入した後、 U 真空計 （U - 400、 岡野製作所製） で減圧度を確認したところほぼ大気圧となることを確認した。 実施例 2— 1— 2、 実施例 2— 1— 3、 実施例 2— 1—4
同様に、 可溶性ト口ンボモジュリンの種類を変えて実施例 2-1-1の TMD123Hの 代わりに TMD123HM (実施例 2-1-2)、 TME456H (実施例 2-1-3)、 および TME456HM (実施例 2-1-4) を用いて、 それぞれ上記の方法にしたがって可溶性ト口ンボモ ジュリン高濃度含有製剤を得た。
実施例 2 - 2
実施例 2— 1と同様の方法で、 表 5の組成の欄に記載の可溶性ト口ンポモジュ リン高濃度含有製剤を得た （実施例 2-1-1 に準じて、 実施例 2-2-1 を調製した)。 実施例 2— 3
実施例 2— 1と同様の方法で、 表 5の組成の欄に記載の可溶性ト口ンボモジュ リン高濃度含有製剤を得た （前述と同様に、 実施例 2 - 3-1を調製した)。
実施例 2—4
実施例 2— 1と同様の方法で、 表 5の組成の欄に記載の可溶性ト口ンポモジュ リン高濃度含有製剤を得た （前述と同様に、 実施例 2 - 4-1を調製した)。
実施例 2— 5
実施例 2— 1と同様の方法で、 表 5の組成の欄に記載の可溶性ト口ンボモジュ リン高濃度含有製剤を得た （前述と同様に、 実施例 2- 5-1を調製した)。 実施例 2 - 6
実施例 2— 1と同様の方法で、 表 5の組成の欄に記載の可溶性ト口ンボモジュ リン高濃度含有製剤を得た （前述と同様に、 実施例 2-6-1を調製した)。
実施例 2 - 7
実施例 2— 1と同様の方法で、 表 5の組成の欄に記載の可溶性ト口ンボモジュ リン高濃度含有製剤を得た （前述と同様に、 実施例 2 - 7-1を調製した)。
実施例 2— 8
実施例 2— 1と同様の方法で、 表 5の組成の欄に記載の可溶性ト口ンボモジュ リン高濃度含有製剤を得た （前述と同様に、 実施例 2-8-1を調製した)。
実施例 2 - 9
実施例 2— 1と同様の方法で、 表 5の組成の欄に記載の可溶性ト口ンボモジュ リン高濃度含有製剤を得た （前述と同様に、 実施例 2-9-1を調製した)。
実施例 2 - 1 0
実施例 2— 1と同様の方法で、 表 5の組成の欄に記載の可溶性ト口ンポモジュ リン高濃度含有製剤を得た （前述と同様に、 実施例 2 - 10-1を調製した)。
実施例 2 - 1 1
実施例 2— 1と同様の方法で、 表 5の組成の欄に記載の可溶性ト口ンポモジュ リン高濃度含有製剤を得た （前述と同様に、 実施例 2- 1ト1を調製した)。
実施例 2 - 1 2
実施例 2— 1と同様の方法で、 表 5の組成の欄に記載の可溶性ト口ンボモジュ リン高濃度含有製剤を得た （前述と同様に、 実施例 2-12- 1を調製した)。
実施例 2—1 3
実施例 2— 1と同様の方法で、 表 5の組成の欄に記載の可溶性ト口ンボモジュ リン高濃度含有製剤を得た （前述と同様に、 実施例 2-13- 1を調製した)。
実施例 2—1 4
実施例 2— 1と同様の方法で、 表 5の組成の欄に記載の可溶性ト口ンボモジュ リン高濃度含有製剤を得た （前述と同様に、 実施例 2-14- 1を調製した)。
実施例 2 - 1 5
実施例 2— 1と同様の方法で、 表 5の組成の欄に記載の可溶性ト口ンボモジュ リン高濃度含有製剤を得た （前述と同様に、 実施例 2 - 15- 1を調製した)。
実施例 2-16
実施例 2— 1と同様の方法で、 表 5の組成の欄に記載の可溶性ト口ンボモジュ リン高濃度含有製剤を得た （前述と同様に、 実施例 2-16- 1を調製した)。
実施例 2-17
実施例 2— 1と同様の方法で、 表 5の組成の欄に記載の可溶性ト口ンボモジュ リン高濃度含有製剤を得た （前述と同様に、 実施例 2 - 17 - 1を調製した)。
実施例 2-18
実施例 2— 1と同様の方法で、 表 5の組成の欄に記載の可溶性ト口ンボモジュ リン高濃度含有製剤を得た （前述と同樹こ、 実施例 2-18- 1を調製した)。
実施例 2-19
実施例 2— 1と同様の方法で、 表 5の組成の欄に記載の可溶性ト口ンポモジュ リン高濃度含有製剤を得た （前述と同様に、 実施例 2 - 19- 1を調製した)。
実施例 2-20
実施例 2— 1と同様の方法で、 表 5の組成の欄に記載の可溶性ト口ンボモジュ リン高濃度含有製剤を得た （前述と同様に、 実施例 2-20- 1を調製した)。
実施例 2-21
実施例 2— 1と同様の方法で、 表 5の組成の欄に記載の可溶性ト口ンボモジュ リン高濃度含有製剤を得た （前述と同様に、 実施例 2 - 21 - 1を調製した)。
実施例 2— 22
実施例 2 _ 1と同様の方法で、 表 5の組成の欄に記載の可溶性ト口ンボモジュ リン高濃度含有製剤を得た （前述と同様に、 実施例 2 - 22 - 1を調製した)。
実施例 2-23
バイアルビンを 0. lw/v。/。のシリコーンコーティングバイアルビン （3 mL、 18 X 33 mm、 口内径 9.1 mm、 ナミコス製） とする以外は実施例 2-18と同様の方法で、 表 5の組成の欄に記載の可溶性ト口ンボモジュリン高濃度含有製剤を得た （前述 と同様に、 実施例 2-23-1を調製した)。
実施例 2-24
パイアルビンを 0.5 w/V/。のシリコーンコーティングバイアルビン （3 mL、 18 X 33 mm、 口内径 9. 1 ram、 ナミコス製） とする以外は実施例 2- 18と同様の方法で、 表 5の組成の欄に記載の可溶性ト口ンボモジュリン高濃度含有製剤を得た （前述 と同様に、 実施例 2-24-1を調製した)。
実施例 2 - 2 5
バイアルビンを 1. 0 w/v。/。のシリコーンコーティングバイアルビン （3 mL、 18 X 33 mm, 口内径 9· 1 醒、 ナミコス製） とする以外は実施例 2-18と同様の方法で、 表 5の組成の欄に記載の可溶性ト口ンポモジュリン高濃度含有製剤を得た （前述 と同様に、 実施例 2-25-1を調製した)。
実施例 2— 2 6
パイアルビンを 2. 0 w/v%のシリコーンコーティングバイァ /レビン (3 mL、 18 X 33 mm、 口内径 9. 1 mm、 ナミコス製） とする以外は実施例 2- 18と同様の方法で、 表 5の組成の欄に記載の可溶性ト口ンポモジュリン高濃度含有製剤を得た （前述 と同様に、 実施例 2 - 26 - 1を調製した)。
実施例 2— 2 7
実施例 2- 18 と同様の方法で、 表 5の組成の欄に記載の可溶性トロンボモジュ リン高濃度含有製剤を得た （前述と同様に、 実施例 2 - 27-1を調製した)。 また、 下記の方法により、 該製剤を再溶解する際の減圧度が- 200 mmHg となるように減 圧度を初期減圧度まで減圧した。
真空ポンプ （LV- 140、 日東ェ器株式会社製） の吸引に際して、 U字型真空計 (U- 400、 岡野製作所製） にて減圧度を確認した。 あらかじめ、 空のバイアルビ ンにゴム栓とキャップをし、 ポンプに接続した注射針を刺し、 真空ポンプのスィ ツチを入れて容器内を減圧し （初期減圧度）、 注射用水 1 mLをバイアル内に注入 した直後の減圧度が- 200 mnflg となる初期減圧度を求めた。 各製剤を初期減圧度 になるまで減圧した。
実施例 2 - 2 8
バイアルビンを 2. 0 w/v%のシリコーンコーティングバイアルビン （3 mL、 18 X 33 mm, 口内径 9. 1 腿、 ナミコス製） とする以外は実施例 2 - 18と同様の方法で、 表 5の組成の欄に記載の可溶性ト口ンボモジュリン高濃度含有製剤を得た （前述 と同様に、 実施例 2-28-1 を調製した)。 また、 実施例 2-27 と同様に、 該製剤を 再溶解する際の減圧度が - 200 mmHgとなるように初期減圧度を調整した。
実施例 2— 2 9
バイアルビンを 2. 0 w/v%のシリコーンコーティングパイアルビン （3 mL、 18 X 33 画、 口内径 9. 1 腿、 ナミコス製） とする以外は実施例 2 - 11と同様の方法で、 表 5の組成の欄に記載の可溶性ト口ンボモジュリン高濃度含有製剤を得た （前述 と同様に、 実施例 2-29-1 を調製した)。 また、 実施例 2 - 27 と同様に、 該製剤を 再溶解する際の減圧度が -200 mmHgとなるように初期減圧度を調整した。
実施例 2 - 3 0
バイアルビンを 2. 0w/v%のシリコーンコーティングバイアルビン （3 mL、 18 X 33 腿、 口内径 9. lnm、 ナミコス製） とする以外は実施例 2- 15 と同様の方法で、 表 5の組成の欄に記載の可溶性ト口ンボモジュリン高濃度含有製剤を得た （前述 と同様に、 実施例 2 - 30-1 を調製した)。 また、 実施例 2 - 27 と同様に、 該製剤を 再溶解する際の減圧度が- 200 mmHgとなるように初期減圧度を調整した。
実施例 2— 3 1
実施例 2-14の、 添加剤激夜で Polysorbate 80を添加しない以外は同様の方法 で得た表 5の組成の欄に記載の可溶性ト口ンボモジュリン含有凍結乾燥製剤と、 溶解用水溶液として ¾lt用水 1 mLにべンジルアルコールを 10 mg含有する激夜 を 1 mL無菌的に充填してなるアンプルとを組み合わせしめた可溶性トロンボモ ジュリン含有凍結乾燥製剤のキット製剤を得た （前述と同様に、 実施例 2-31-1 を調製した)。
実施例 2 - 3 2
実施例 2-14の、 添加剤溶液で Polysorbate 80を添加しない以外は同様の方法 で得た表 5の組成の欄に記載の可溶性ト口ンポモジュリン含有凍結乾燥製剤と、 溶解用水溶液として注射用水 1 mLにべンジルアルコールを 5 mg含有する溶液を 1 mL無菌的に充填してなるアンプルとを組み合わせしめた可溶性ト口ンボモジュ リン含有凍結乾燥製剤のキット製剤を得た （前述と同様に、 実施例 2-32- 1 を調 製した)。
実施例 2— 3 3
実施例 2-14の、 添加剤溶液で Polysorbate 80を添加しない以外は同様の方法 で得た表 5の組成の欄に記載の可溶性ト口ンボモジュリン含有凍結乾; »剤と、 溶解用水溶液として ¾lt用水 1 mLにクロロブタノールを 5 mg含有する溶液を 1 mL無菌的に充填してなるァンプルとを組み合わせしめた可溶性ト口ンポモジュリ ン含有凍結乾燥製剤のキット製剤を得た （前述と同様に、 実施例 2-33-1 を調製 した)。
実施例 2— 3 4
実施例 2-14の、 添加剤溶液で Polysorbate 80を添加しない以外は同様の方法 で得た表 5の組成の欄に記載の可溶性ト口ンポモジュリン含有凍結乾燥製剤と、 溶解用水溶液として注射用水 1 にクロロブタノールを 2. 5 mg含有する溶液を 1 mL無菌的に充填してなるアンプルとを組み合わせしめた可溶性ト口ンポモジュ リン含有凍結乾燥製剤のキット製剤を得た （前述と同様に、 実施例 2-34-1 を調 製した)。
実施例 2 _ 3 5
実施例 2-1 の試料溶液調製で試料溶液を無菌パイアルビンに分注する代わりに 2室式シリンジ （アルテ製） の 1室に 1 mLずつ分注した。 これらを、 ミドル栓 半打栓—凍結乾燥→窒素充填→ミドル栓打栓の順で凍結乾燥工程 （凍結乾燥条件 は実施例 2— 1と同様） を行った。 次にもう 1室側に注射用水 1. 0 mL を無菌的 に充填し、 ゴム栓で封印したのち、 プランジャーロッドを取りつけ可溶性トロン ボモジュリン （TMD123H) 高濃度含有製剤のキット製剤 （実施例 2-35- 1) を得た。 比較例 2 - 1 参考例 1で得られた TMD123H (可溶性トロンボモジユリン濃度： 60 mg/mL) を 1. 67 mL (可溶性ト口ンボモジュリンとして表 5の添加量の欄に記載の 10倍量に あたる 100 mgを含有する） を 15 mL アシストチューブに入れ、 さらに注射用水 を加え合わせて 10 mLとし、 混合攪拌した。 この試料溶液をデイスポシリンジ 25 mL (テルモ製） を用い、 孔径： 0· 22 μ ιη(ΜΙΙ ΕΧ- GV、 ミリポア製）のフィルターを 付けてろ過滅菌し、 シリコーンコーティング未処理の無菌バイアルビン （容量 3 mL、 18X33 mm、 口内径 9. 1 mm、 ナミコス製） に 1 mLずつ分注した。
凍結乾燥工程 ゴム栓半打栓 （V5- F8、 大協精ェ製） →凍結乾燥→窒素充填→ゴム栓打栓→キ ャップ卷締めの順で実施例 2 - 1記載の条件にて凍結乾燥工程を行レ、、 表 5の組 成の欄に記載の組成物を得た。
比較例 2 - 2
比較例 2— 1と同様の方法で、 表 5の組成の欄に記載の組成物を得た。
比較例 2— 3
比較例 2— 1と同様の方法で、 表 5の組成の欄に記載の組成物を得た。 （比較 例 2 - 3-1)
同様に、 可溶性ト口ンポモジュリンの種類を変えて比較例 2-3-1の TMD123Hの 代わりに TMD123HM (比較例 2-3-2)、 TME456H (比較例 2-3-3)、 および TME456HM
(比較例 2-3-4) を用いて、 それぞれ上記の方法にしたがって組成物を得た。 比較例 2 - 4
添加剤溶液調製
20 mLのメスフラスコに、 L-グルタミン酸ナトリウム一水和物 500 mg、 D (-) - マンニトール 500 mgを量り入れ (表 5の組成の欄に記載した添加剤量のそれぞれ 50倍量にあたる）、 注射用水を加え溶解して 20 raLとした。 上記添加剤溶液 4 mLを 15 mL のアシストチューブに入れ、 参考例 1で得られ た TMD123H (可溶性ト口ンボモジュリン濃度： 60 mg/mL) を 5 mL (可溶性トロン ポモジュリンとして表 5の添加量の欄に記載の 10倍量にあたる 300 mgを含有す る） を同アシストチューブに入れ、 さらに注射用水を加え合わせて 10 mL とし、 混合攪拌した。 この試料溶液をディスポシリンジ 25 mL (テルモ製） を用い、 孔 径： 0. 22 μ ιη(ΜΙΐυΕΧ- GV、 ミリポア製）のフィルターを付けてろ過滅菌し、 シリコ ーンコーティング未処理の無菌バイアルビン （容量 3 mL、 18 X 33 墮、 口内径 9. 1 醒、 ナミコス製） に 1 mLずつ分注した。
凍結乾燥工程
ゴム栓半打栓 （V5- F8、 大協精ェ製） →凍結乾燥→窒素充填→ゴム栓打栓→キ ャップ卷締めの順で実施例 2 - 1記載の条件にて凍結乾燥工程を行！、、 表 5の組 成の欄に記載の組成物を得た。 比較例 2— 5
比較例 2— 4と同様の方法で、 表 5の組成の欄に記載の組成物を得た。
比較例 2— 6
比較例 2— 4と同様の方法で、 表 5の組成の欄に記載の組成物を得た。
実験例 4
表 5に示す実施例 2-1から実施例 2-34 で得られた可溶性ト口ンボモジュリン 含有凍結乾; ^剤またはキット製剤、 および比較例 2-1から比較例 2-6で得られ た組成物を表 5の溶解用水溶液の欄に記載した溶解用水溶液 1 mLで再溶解し、 その時の起泡抑制効果を下記の濁度測定により透過率で求め、 その代表的な結果 を表 5に示した。
濁度の測定方法
測定試料となる凍結乾燥製剤のゴム栓中央に、 溶解用水溶液 1 mL を吸引した 注射用シリンジ （ッベルクリン用 1 mL、 注射針: 26G 0. 45 X 13 mm、 テルモ製） を 刺し、 0. 1 mL/秒の速度で溶解用水溶液を凍結乾燥物中央に注入する。 注射用シ リンジを刺したまま静置する。 注入終了の 30秒後にバイアル瓶を逆さまにして シリンジで可溶性ト口ンボモジュリン高濃度含有溶液を約 0. 8 mL吸引する。 こ の吸引した溶解液を石英セル (ブラックセル、 光路長： 10 mm、 光路幅: 2 靈、 ジ 一エルサイエンス製） にセル壁を伝わらせて静かに注ぐ。 素早く紫外可視分光光 度計 （UV- 2500PC、 島津製作所製） を用いて、 650 nmの透過率 （事前に溶解用水 溶液のみで 650 nmにおける透過率 100%を調整しておく） を測定する。 凍乾物溶 解液をバイアル瓶から吸引して透過率を測定するまでの時間は 15秒間とする。 なお、 特別に記載しない限り、 透過率は 3回の測定値の平均として表される。 表 5
シリコー
実施例 溶解用
添ロ量 ンコーテ 減圧度 翻率 及ぴ 組成 氷赚
(rag) イング (*3) (%) 比較例 (*1) (*2)
実施例 T D123H 30
W 99. 5
2-1-1 Polysorbate 80 0. 1
実施例 T D123HM 30
W 99. 3 2-1-2 Polysorbate 80 0. 1 実施例 ΊΜΕ456Η 30
W ― ― 99.5
2-1-3 Polysorbate 80 0.1
実施例 TME456HM 30
W ― ― 99.4 2-1-4 Polysorbate 80 0.1
実施例 TMD123H 10
W ― ― 99.5 2-2-1 Polysorbate 80 0.01
実施例 TMD123H 15
W ― ― 99.4 2-3-1 Polysoroate 80 0.015
実施例 TMD123H 17
W ― ― 99.3 2-4-1 Polysorbate 80 0.017
実施例 TMD123H 20
W ― ― 99.4 2-5-1 Polysorbate 80 0.02
実施例 HD123H 25
W ― ― 99.3 2-6-1 Polysorbate 80 0.025
実施例 TMD123H 30
W ― ― 99.4 2-7-1 Polysorbate 80 0.03
実施例 T D123H 30
W ―
2-8-1 _ 99.5 Polysorbate 80 0.05
実施例 B1D123H 30
w 99.8 2-9-1 Polysorbate 80 0.2
実施例 TMD123H 30
W ― ― 100.0 2-10-1 Polysorbate 80 0.5
TMD123H , 30
実施例
L-アルギニン塩酸塩 10 W ― ― 99.2 2-11-1
Polysorbate 80 0.1
TMD123H 30
ま" iifii例
D-卜レハロース二水和物 10 W 98.8 2-12-1
Polysorbate 80 0.1
TMD123H 30
実施例 L-アルギニン塩酸塩 10
W 987 2-13-1 D-トレハロース二水和物 10
Polysorbate 80 0.1
TMD123H 30
実施例 L -グルタミン酸 Na—水和物 10
W 98.8 2-14-1 D -トレハロース二水和物 10
Polysoroate 80 0.1
漏 123H 30
実施例 L -グルタミン酸 Na—水和物 10
W 99.2 2-15-1 D(-)-マンニトール 10
Polysorbate 80 0.1
TMD123H 30
実施例 L -ァスパラギン酸 Na—水和物 10
W 99.3 2-16-1 D (-) -マンニトール 10
Polysorbate 80 0.1
TMD123H 30
L-グルタミン酸 10
実施例
D(- )-マンニトール 10 W 99.1 2-17-1
水酸化ナトリウム 2.8
Polysorbate 80 0.1 TMD123H 30
実施例 L -グルタミン酸 Na—水和物 10
W 97. 7
2-18-1 D (-) -マンニトール 10
Polysoroate 20 0. 1
TMD123H 30
実施例 L-ダルタミン酸 Na—水和物 10
W 98. 7 2-19-1 D (-) -マンニト一ル 10
Poloxamer 188 0. 1
TMD123H
30
L-グルタミン酸 Na—水和物
実施例 10
D (-) -マンニト一ル W 97. 2 2-20-1 10
Polyoxyethylene (2i>) lauryl
0. 1
ether
TMD123H 30
実施例 L-グルタミン酸 Na—水和物 10
W 98. 1 2-2ト 1 D (-) -マンニトール 10
Polyoxyl 40 stearate 0. 1
T D123H 30
実施例 L-グルタミン酸 Na—水和物 10
W 97. 8 2-22-1 D (-) -マンニトール 10
HC0-60 0. 1
TMD123H 30
実施例 L-グルタミン酸 Na—水和物 10
W 0. 1% 98. 0 2-23-1 D (-) -マンニト―ル 10
Polysorbate 20 0. 1
舊 123H 30
実施例 L-ダルタミン酸 Na一水和物 10
w 0. 5% 98. 3 2-24-1 D (-) -マンニトール 10
Polysoroate 20 0. 1
TMD123H 30
実施例 L -グルタミン酸 Na—水和物 10
W 1. 0% 98. 6 2-25-1 D (-) -マンニトール 10
Polysorbate 20 0. 1
TMD123H 30
実施例 L -グルタミン酸 Na—水和物 10
W 2. 0% 99. 1 2-26-1 D (-) -マンニトール 10
Polysorbate 20 0. 1
TMD123H 30
実施例 L-グルタミン酸 Na—水和物 10
W 2 2-27-1 D (-) -マンニトール 10 + 98.
Polysorbate 20 0. 1
TMD123H 30
実施例 L-クノレタミン酸 Na—水和物 10
W 2. 0% 99. 3 2-28-1 D (-) -マンニトール 10 +
Polysorbate 20 0. 1
TMD123H 30
実施例
L-アルギニン塩酸塩 10 W 2. 0%
2 1 + 99. 7 -29- Polysorbate 80 0. 1 TMD123H 30
実施例 L-グルタミン酸 Na— 7_k和物 10
W 2. 0%
2-30-1 D (-) -マンニトール 10 + 99. 5
Polysorbate 80 0. 1
TMD123H 30
実施例
L -グルタミン酸 Na—水和物 10 BelO ― 98. 2 2-31-1
D-卜レハロース二水和物 10
TMD123H 30
実施例
L-グルタミン酸 Na—水和物 10 Be05 一 ― 97. 9 2-32-1
D -トレハロースニ水和物 10
TMD123H 30
実施例
L-グルタミン酸 Na—水和物 10 Ch50 一 ― 98. 0 2-33-1
D-トレハロース二水和物 10
TMD123H 30
実施例
L -グルタミン酸 Na—水和物 10 Ch25 97. 7 2-34-1
D-トレハロ一スニ水和物 10
比較例
舊 123H 10· W : 90. 5 2-1
比較例
TMD123H 15 W 84. 9 2-2
比較例
TMD123H 30 W ― ― 79. 7 2-3-1
TMD123H 30
比較例
L-グルタミン酸 Na—水和物 10 W 62. 2 2-4
D(-)-マンニトール 10
TMD123H 30
比較例 L -グルタミン酸 Na—水和物 10
W 57. 7 2-5 D (-) -マンニトール 10
ラウリル硫酸ナトリウム 0. 1
TMD123H 30
比較例 L -グルタミン酸 Na—水和物 10
w 82. 7 2-6 D (-) -マンニトール 10
塩化ベンザルコニゥム 0. 1 表中の記号の説明
* 1 ：溶解用水溶液
W； ¾ 用蒸留水 ImL
BelO；注射用蒸留水 ImL + ンジルアルコール 10mg
Be05； ¾ϋ用蒸留水 ImL + ンジルァノレコール 5mg
Ch50； ¾|†用蒸留水 ImL + クロロブタノール 5mg
Ch25； ¾†用蒸留水 ImL + クロロブタノール 2. 5rag
* 2 ：シリコーンコーティング
―；未処理のパイアル
0. 1% 0. lw/v%のシリコーンコーティングバイァノレ
0. 5% 0. 5w/v のシリコーンコーティングバイアル
1. 0% 1. 0w/v°/。のシリコーンコーティングバイアル
2. 0% 2. 0w/v/。のシリコーンコーティングパイアル
氺 3 減圧度 一；溶解の際に実質的に減圧状態となっていない
+；溶解の際に- 200mmHgの減圧状態となっている 表 5の透過率（％)の欄に示した結果から、 可溶性トロンポモジュリンが 10 mg/raL以上の高濃度製剤において非イオン性界面活性剤を含有する場合には、 比 較例 2-3-1に示した非イオン性界面活性剤を含有しない場合及び陰イオン性界面 活性剤 （比較例 2-5) や陽イオン性界面活性剤 （比較例 2-6) を添加した場合と 比べて透過率が高く、 気泡の発生を抑制していることが ¾^された。
なお、 比較例 2-3-2 から比較例 2-3-4 における TMD123皿、 TME456H または TME456HMを含有する各凍結乾燥組成物の透過率は、 比較例 2 - 3 - 1と同程度であつ た。
また、 実施例 2-35-1 で得た 2室式シリンジキット製剤については、 プランジ ヤーロッドを半打栓位置まで押し込み （約 0. 1 mL/秒の一定速度）、 凍結乾燥物の ある 1室に注射用水を注入後から 3 0秒後に、 さらにプランジャーロッドを押し 込み、 可溶性ト口ンボモジュリン高濃度含有溶液を石英セルにセル壁を伝わらせ て静かに注ぎ、 前述の方法に従い透過率を求めたが、 表 5と同様に高い透過率を 示した。
以上より、 可溶性ト口ンボモジュリン高濃度含有溶液に起泡抑制添加剤として、 非イオン性界面活性剤、 ベンジルアルコール、 クロロブタノールを含有した製剤 が気泡の発生を抑制することを確認し、 また、 該可溶性トロンポモジュリン含有 凍結乾燥製剤を溶解する際の容器の内壁がシリコーンでコーティングされている こと、 または該可溶性ト口ンボモジュリン含有凍結乾燥製剤を溶解する際の容器 内圧力が減圧状態であることも気泡の発生を抑制することが確認された。
実験例 5
表 1に示す実施例 1-1-1から実施例 1-38-1 で得られた可溶性トロンボモジュ リン （TMD123H) 含有凍結乾燥製剤と、 表 6に示す溶解用水溶液と組み合わせた キット製剤を作り、 上記実験例 4と同様の方法で、 起泡抑制効果を確認したとこ ろ、 気泡の発生を抑制していることが確認された。 表 6 溶解用水赚 溶解液 1 蘭用水 1 mL
ベンジノレアノレコ一ノレ 10mg 溶解液 2 注射用水 1 mL
クロロブタノーノレ 5mg 溶解液 3 、歸用水 1 mL
Polvsorbate 80 0. lmg 溶解液 4 注射用水 1 mL
Poloxamer 188 0. lmg 溶解液 5 ¾lt用水 l mL
Polyoxy ethylene (25)丄 auryl ether 0. lmg
産業上の利用可能性
本発明によると、 高濃度の可溶性ト口ンポモジュリン含有溶液において生ずる 起泡を抑制することができ、 臨床上有用である。 また、 そのような起泡の発生を 抑制することのできる可溶性ト口ンボモジュリン高濃度含有製剤およぴキット製 剤を提供できる。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 有効成分として可溶性ト口ンポモジュリンを含有する可溶性ト口ンボモジ ュリン含有凍結乾燥製剤を溶解して、 10 mg/raL以上の可溶性ト口ンポモジュリン 高濃度含有溶液を調製するに際し、 （a)非イオン性界面活性剤、 ベンジルアルコ ール、 クロロブタノールからなる群より選ばれる少なくとも一種の化合物を存在 せしめること、 （b)該可溶性ト口ンボモジュリン含有凍結乾燥製剤を溶解する際 の容器の内壁がシリコーンでコーティングされていること、 または (c)該可溶性 ト口ンボモジュリン含有凍結乾燥製剤を溶解する際の容器内圧力が減圧状態であ ること、 の少なくともいずれかを特徴とする可溶性トロンポモジュリン高濃度含 有溶液の起泡抑制方法。 ,
2. 該可溶性ト口ンボモジュリン含有凍結乾燥製剤を溶解して、 10 mg/mL以上 の可溶性ト口ンポモジュリン高濃度含有溶液を調製するに際し、 非ィオン性界面 活性剤、 ベンジルアルコール、 クロロブタノールからなる群より選ばれる少なく とも一種の化合物を存在せしめることを特徴とする請求項 1に記載の可溶性ト口 ンボモジュリン高濃度含有溶液の起泡抑制方法。
3. 該可溶性ト口ンボモジュリン含有凍結乾燥製剤中に、 非ィオン性界面活性 剤、 ベンジルアルコール、 クロロブタノールからなる群より選ばれる少なくとも 一種の化合物が存在せしめられていることを特徴とする請求項 1または 2に記載 の可溶性ト口ンポモジュリン高濃度含有溶液の起泡抑制方法。
4. 該可溶性ト口ンボモジュリン含有凍結乾燥製剤を溶解するための溶解用水 激夜中に、 非イオン性界面活性剤、 ベンジルアルコール、 クロロブタノールから なる群より選ばれる少なくとも一種の化合物が存在せしめられていることを特徴 とする請求項 1—3のいずれかに記載の可溶性ト口ンボモジュリン高濃度含有溶 液の起泡抑制方法。
5 . 該可溶性ト口ンボモジュリン含有凍結乾燥製剤を溶解する際の容器の内壁 がシリコーンでコーティングされていることを特徴とする請求項 1—4のいずれ かに記載の可溶性ト口ンポモジュリン高濃度含有溶液の起泡抑制方法。
6 . 該可溶性ト口ンボモジュリン含有凍結乾燥製剤を溶解する際の容器内圧力 が減圧状態であることを特徴とする請求項 1—5のいずれかに記載の可溶性ト口 ンボモジュリン高濃度含有溶液の起泡抑制方法。
7. 該可溶性ト口ンポモジュリン高濃度含有溶液が、 17 mg/mL以上の可溶性ト 口ンボモジュリン濃度であることを特徴とする請求項 1 - 6のいずれかに記載の 可溶性ト口ンボモジュリン高濃度含有溶液の起泡抑制方法。
8 . 該可溶性ト口ンボモジュリン高濃度含有溶液が、 25 mg/mL以上の可溶性ト 口ンボモジュリン濃度であることを特徴とする請求項 1一 6のいずれかに記載の 可溶性ト口ンボモジュリン高濃度含有溶液の起泡抑制方法。
9 . 溶解して調製された可溶性ト口ンポモジュリン高濃度含有溶液の液量が、 0. 1 mLから 2 mLであり、 その溶解時の浸透圧比が 0. 5から 2· 0であることを特 徴とする請求項 1—8のいずれかに記載の可溶性ト口ンボモジュリン高濃度含有 溶液の起泡抑制方法。
1 0. 該可溶性ト口ンボモジュリン含有凍結乾燥製剤が、 （1) グルタミン酸ま たはその塩、 およびマンニトールの 2種を含む、 （2) グルタミン酸またはその塩、 およびリシンまたはその塩の 2種を含む、 （3) グルタミン酸またはその塩、 およ びァスパラギン酸またはその塩の 2種を含む、 または (4) ァスパラギン酸または その塩、 およびマンニトールの 2種を含む、 のいずれかの組み合わせを含有せし められており、 さらに該可溶性トロンボモジュリン含有凍結乾燥製剤中に、 非ィ オン性界面活性剤、 ベンジルアルコール、 クロロブタノールからなる群より選ば れる少なくとも一種の化合物が存在せしめられている力、 および Zまたは該可溶 性ト口ンボモジュリン含有凍結乾燥製剤を溶解するための溶解用水溶液中に、 非 イオン性界面活性剤、 ベンジルアルコール、 クロロブタノールからなる群より選 ばれる少なくとも一種の化合物が存在せしめられていることを特徴とする請求項 1 - 9のいずれかに記載の可溶性ト口ンボモジュリン高濃度含有溶液の起泡抑制 方法。
1 1 . 該可溶性トロンボモジュリン含有凍結乾燥製剤が、 （1) 尿素、 または (2) 尿素おょぴアミノ酸、 のいずれかを含有せしめられており、 さらに該可溶性 トロンボモジュリン含有凍結乾燥製剤中に、 非イオン性界面活性剤、 ベンジルァ ルコール、 クロロブタノールからなる群より選ばれる少なくとも一種の化合物が 存在せしめられて!/、るカ および/または該可溶性トロンポモジユリン含有凍結 乾燥製剤を溶解するための溶解用水溶液中に、 非イオン性界面活性剤、 ベンジル アルコール、 クロロブタノールからなる群より選ばれる少なくとも一種の化合物 が存在せしめられていることを特徴とする請求項 1 - 9のいずれかに記載の可溶 性ト口ンボモジュリン高濃度含有溶液の起泡抑制方法。
1 2 . 該可溶性トロンボモジュリン含有凍結乾燥製剤が、 アルギニン、 グルタ ミン酸、 プロリン、 セリン、 グリシン、 ヒスチジン、 ァスパラギン、 リジン、 フ ェニルァラニンおょぴパリン、 またはそれらの塩、 トレハロース、 ラタトース、 およびスクロースからなる群より選ばれた一種または二種を含有せしめられてお り、 さらに該可溶性ト口ンボモジュリン含有凍結乾;^ S剤中に、 非イオン性界面 活性剤、 ベンジルアルコール、 クロロブタノールからなる群より選ばれる少なく とも一種の化合物が存在せしめられているカゝ、 および/または該可溶性ト口ンボ モジュリン含有凍結乾；^剤を溶解するための溶解用水溶液中に、 非イオン性界 面活性剤、 ベンジルアルコール、 クロロブタノールからなる群より選ばれる少な くとも一種の化合物が存在せしめられていることを特徴とする請求項 1— 8のい ずれかに記載の可溶性ト口ンポモジュリン高濃度含有溶液の起泡抑制方法。
1 3 . 該非イオン性界面活性剤が、 ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エス テル、 ポリオキシエチレン一ポリオキシプロピレン共重合体、 ポリオキシェチレ ンアルキルエーテル、 ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、 ポリオキシエチレン 硬化ヒマシ油からなる群より選ばれるいずれ力 V少なくとも一種の化合物であるこ とを特徴とする請求項 1一 1 2のいずれかに記載の可溶性ト口ンボモジュリン高 濃度含有溶液の起泡抑制方法。
1 4 . 該非ィオン性界面活性剤の存在量が、 可溶性ト口ンボモジュリン 10 mg に対して 0. 01 mg以上であることを特徴とする請求項 1— 1 3のいずれかに記載 の可溶性ト口ンポモジュリン高濃度含有溶液の起泡抑制方法。
1 5 . 該可溶性ト口ンボモジュリンが、 水に 30 mg/mL以上の濃度として溶解 可能なぺプチドであることを特徴とする請求項 1一 1 4のいずれかに記載の可溶 性ト口ンボモジュリン高濃度含有溶液の起泡抑制方法。
1 6 . 該可溶' 14ト口ンボモジュリンが、 以下の配列の 1つを含有するぺプチド であり、 トロンビンのプロテイン Cの活性ィ匕を促進する作用を有し、 且つ界面活 性剤の非存在下で溶解し得るものであることを特徴とする請求項 1— 1 5のいず れかに記載の可溶性ト口ンポモジュリン高濃度含有溶液の起泡抑制方法。
i) 配列表配列番号 3の 19-132のァミノ酸配列。
ii) 配列表配列番号 7の 19一 132のァミノ酸配列。
iii) 上記 i)、 または ii)のアミノ酸配列に、 少なくとも 1つ以上のアミノ酸の 付加、 欠失、 または置換されたアミノ酸配列。
1 7 . 該可溶性ト口ンボモジュリンが、 配列表配列番号 4または 8の 55-396 の塩基配列の相補 DNAに対してストリンジェントな条件下にてハイプリダイズで きる DNAによりコードされ得るペプチドであり、 トロンビンのプロテイン Cの活 性化を促進する作用を有し、 且つ界面活性剤の非存在下で溶解し得ることのでき ることを特徴とする請求項 1— 1 5のいずれかに記載の可溶性ト口ンボモジュリ ン高濃度含有溶液の起泡抑制方法。
1 8 . 可溶性ト口ンボモジュリンが、 以下の配列の 1つを含有するぺプチドで あり、 トロンビンのプロテイン Cの活性化を促進する作用を有し、 且つ界面活性 剤の非存在下で溶解し得るものであることを特徴とする請求項 1— 1 5のいずれ 力に記載の可溶性ト口ンボモジュリン高濃度含有溶液の起泡抑制方法。
i) 配列表配列番号 1の 19- 516のァミノ酸配列。
1 i) 配列表配列番号 5の 19-516のァミノ酸配列。
iii) 上記 i；)、 または ii)のアミノ酸配列に、 少なくとも 1つ以上のアミノ酸の 付加、 欠失、'または置換されたアミノ酸配列。
1 9 . 有効成分として可溶性ト口ンボモジュリンを含有する可溶性ト口ンポモ ジュリン含有凍結乾燥製剤を溶解して、 20 mg/raL以上の可溶性ト口ンボモジュリ ン高濃度含有溶液を調製するに際して用いられるものであって、 非ィオン性界面 活性剤、 ベンジルアルコール、 クロロブタノールからなる群より選ばれる少なく とも一種の化合物を有効成分とする可溶性ト口ンボモジュリン高濃度含有溶液の 起泡抑制剤。
2 0 . 有効成分として可溶性ト口ンボモジュリンを含有する可溶性ト口ンボモ ジュリン含有凍結乾燥製剤、 または該可溶性ト口ンポモジュリン含有凍結乾燥製 剤とその溶解用水溶液とを組み合わせしめたキット製剤であって、 該可溶性トロ ンボモジュリン含有凍結乾燥製剤が 10 mg/mL以上の可溶性ト口ンポモジュリン 高濃度含有溶液を調製されるためのものであって、 且つ (a) 該可溶性トロンボモ ジュリン含有凍結乾燥製剤中に、 非イオン性界面活性剤、 ベンジルアルコール、 クロロブタノールからなる群より選ばれる少なくとも一種の化合物が存在せしめ られている力、 および/または該可溶性ト口ンボモジュリン含有凍結乾燥製剤の 溶解用水溶液中に、 非イオン性界面活性剤、 ベンジルアルコール、 クロロブタノ ールからなる群より選ばれる少なくとも一種の化合物が存在せしめられているこ と、 （b)該可溶性ト口ンポモジュリン含有凍結乾燥製剤を溶解する際の容器の内 壁がシリコーンでコーティングされていること、 または（c)該可溶性トロンポモ ジュリン含有凍結乾燥製剤を溶解する際の容器内圧力が減圧状態であること、 の 少なくともいずれかを特徴とする可溶性ト口ンポモジュリン含有凍結乾燥製剤、 またはそのキット製剤。
2 1 . 該可溶性ト口ンボモジュリン含有凍結乾燥製剤、 または該可溶性トロン ボモジュリン含有凍結乾燥製剤とその溶解用水溶液とを組み合わせしめたキット 製剤であって、 該可溶性トロンポモジュリン含有凍結乾燥製剤が 10 mg/mL以上 の可溶性ト口ンボモジュリン高濃度含有溶液を調製されるためのものであって、 且つ該可溶性ト口ンボモジュリン含有凍結乾燥製剤中に、 非イオン性界面活性剤、 ベンジルアルコール、 クロロブタノールからなる群より選ばれる少なくとも一種 の化合物が存在せしめられているか、 および Zまたは該可溶性ト口ンポモジュリ ン含有凍結乾燥製剤の溶解用水溶液中に、 非イオン性界面活性剤、 ベンジルアル コール、 クロロブタノールからなる群より選ばれる少なくとも一種の化合物が存 在せしめられていることを特徴とする請求項 2 0に記載の可溶性ト口ンボモジュ リン含有凍結乾,剤、 またはそのキット製剤。
2 2. 該可溶性ト口ンポモジュリン高濃度含有溶液が、 25 mg/mL以上の可溶性 トロンボモジュリン濃度であることを特徴とする請求項 2 0または 2 1に記載の 可溶性ト口ンボモジュリン含有凍結乾燥製剤、 またはそのキット製剤。
2 3 . 該可溶性ト口ンボモジュリン含有凍結乾燥製剤が、 （1) グルタミン酸ま たはその塩、 およびマンニトールの 2種を含む、 （2) グルタミン酸またはその塩、 およびリシンまたはその塩の 2種を含む、 （3) グルタミン酸またはその塩、 およ ぴァスパラギン酸またはその塩の 2種を含む、 または (4) ァスパラギン酸または その塩、 およびマンニトールの 2種を含む、 のいずれかの組み合わせを含有せし め、 且つ該可溶性ト口ンポモジュリン含有凍結乾 S剤が、 0. 1 mLから 2 raLの 溶解用水溶液に溶解し得て、 10 mg/mL以上の可溶性ト口ンボモジュリン高濃度含 有溶液を調製でき、 その溶解時の浸透圧比が 0. 5から 2· 0であることを特徴とす る請求項 2 0— 2 2のいずれかに記載の可溶性ト口ンポモジュリン含有凍結乾燥
2 4 . 該可溶性トロンボモジュリン含有凍結乾燥製剤が、 （1) グルタミン酸ま たはその塩、 およびマンニトールの 2種を含む、 （2) グルタミン酸またはその塩、 およびリシンまたはその塩の 2種を含む、 （3) グルタミン酸またはその塩、 およ びァスパラギン酸またはその塩の 2種を含む、 または (4) ァスパラギン酸または その塩、 およびマンニトールの 2種を含む、 のいずれかの組み合わせを含有せし め、 且つ該可溶性トロンボモジュリン含有凍結乾燥製剤が、 0. 1 mLから 2 mLの 溶解用水溶液に溶解し得て、 10 mg/mL以上の可溶性ト口ンボモジュリン高濃度含 有溶液を調製でき、 その溶解時の浸透圧比が 0. 5から 2. 0であり、 且つ該可溶性 トロンボモジュリン含有凍結乾燥製剤中に、 非イオン性界面活性剤、 ベンジルァ ルコール、 クロロブタノールからなる群より選ばれる少なくとも一種の化合物が 存在せしめられていることを特徴とする請求項 2 0— 2 2のいずれかに記載の可 溶性ト口ンボモジュリン含有凍結乾燥製剤。
2 5. 該可溶性ト口ンポモジュリン含有凍結乾燥製剤が、 （1) グルタミン酸ま たはその塩、 およびマンニトールの 2種を含む、 （2) グルタミン酸またはその塩、 およびリシンまたはその塩の 2種を含む、 （3) グルタミン酸またはその塩、 およ ぴァスパラギン酸またはその塩の 2種を含む、 または (4) ァスパラギン酸または その塩、 およびマンニトールの 2種を含む、 のいずれかの組み合わせを含有せし め、 且つ該可溶性トロンボモジュリン含有凍結乾；^剤が、 0. 1 raLから 2 mLの 溶解用水溶液に溶解し得て、 10 mg/mL以上の可溶性ト口ンボモジュリン高濃度含 有溶液を調製でき、 その溶解時の浸透圧比が 0. 5から 2. 0であることを特徴とし、 さらに (a)該可溶性ト口ンポモジュリン含有凍結乾燥製剤の溶解用水溶液中に、 非イオン性界面活性剤、 ベンジルアルコール、 クロロブタノールからなる群より 選ばれる少なくとも一種の化合物が存在せしめられていること、 （b)該可溶性ト ロンポモジュリン含有凍結乾燥製剤を溶解する際の容器の内壁がシリコーンでコ 一ティングされていること、 または (c)該可溶性ト口ンポモジュリン含有凍結乾 燥製剤を溶解する際の容器内圧力が減圧状態であること、 の少なくともいずれか を特徴とする請求項 2 0— 2 2のいずれかに記載の可溶性ト口ンボモジュリン含 有凍結乾燥製剤のキット製剤。
2 6 . 該可溶性トロンポモジュリン含有凍結乾燥製剤が、 （1) グルタミン酸ま たはその塩、 およびマンニトールの 2種を含む、 （2) グルタミン酸またはその塩、 およびリシンまたはその塩の 2種を含む、 （3) グルタミン酸またはその塩、 およ ぴァスパラギン酸またはその塩の 2種を含む、 または (4) ァスパラギン酸または その塩、 およびマンニトールの 2種を含む、 のいずれかの組み合わせを含有せし め、 且つ該可溶性ト口ンボモジュリン含有凍結乾燥製剤が、 0. 1 mLから 2 mLの 溶解用水溶液に溶解し得て、 10 mg/mL以上の可溶性ト口ンポモジュリン高濃度含 有溶液を調製でき、 その溶解時の浸透圧比が 0. 5から 2. 0であり、 且つ (a)該可 溶性ト口ンポモジュリン含有凍結乾燥製剤中に、 '非イオン性界面活性剤、 ベンジ ルアルコール、 クロロプタノールからなる群より選ばれる少なくとも一種の化合 物が存在せしめられており、 さらに該可溶性ト口ンボモジュリン含有凍結乾燥製 剤の溶解用水溶液中に、 非イオン性界面活性剤、 ベンジルアルコール、 クロロブ タノールからなる群より選ばれる少なくとも一種の化合物が存在せしめられてい ること、 （b)該可溶性ト口ンボモジュリン含有凍結乾燥製剤を溶解する際の容器 の内壁がシリコーンでコーティングされていること、 または（c)該可溶性トロン ポモジュリン含有凍結乾燥製剤を溶解する際の容器内圧力が減圧状態であること、 の少なくともいずれかを特徴とする請求項 2 0 - 2 2のいずれかに記載の可溶性 ト口ンポモジュリン含有凍結乾燥製剤のキット製剤。
2 7 . 該可溶性ト口ンボモジュリン含有凍結乾燥製剤の溶解用水溶液が、 0. 1 mLから 2 mLであり、 その溶解時の浸透圧比が 0. 5から 2. 0であることを特徴と する請求項 2 0— 2 2、 2 5または 2 6のいずれかに記載の可溶性ト口ンボモジ ュリン含有凍結乾燥製剤のキット製剤。
2 8 . 該可溶性ト口ンボモジュリン含有凍結乾燥製剤、 またはそのキット製剤 力 皮下または筋肉内注射用の製剤であることを特徴とする請求項 2 0— 2 7の いずれかに記載の可溶性ト口ンボモジュリン含有凍結乾燥製剤、 またはそのキッ 卜製剤 c
2 9 . 非イオン性界面活性剤が、 ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステ ル、 ポリオキシエチレン一ポリオキシプロピレン共重合体、 ポリオキシエチレン アルキルエーテル、 ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、 ポリオキシエチレン硬 化ヒマシ油からなる群より選ばれるいずれか少なくとも一種の化合物であること を特徴とする請求項 2 0、 2 1、 または 2 4— 2 6のいずれかに記載の可溶性ト ロンボモジュリン含有凍結乾燥製剤、 またはそのキット製剤。
3 0 . 該非ィオン性界面活性剤の存在量が、 可溶性ト口ンボモジュリン 10 mg に対して 0. 01 mg以上であることを特徴とする請求項 2 0、 2 1、 2 4— 2 6、 または 2 9のいずれかに記載の可溶性ト口ンポモジュリン含有凍結乾燥製剤、 ま たはそのキット製剤。
3 1 . 該可溶性ト口ンボモジュリンが、 水に 30 mg/mL以上の濃度として溶解 可能なぺプチドであることを特徴とする請求項 2 0 - 3 0のいずれかに記載の可 溶性ト口ンポモジュリン含有凍結乾燥製剤、 またはそのキット製剤。
3 2. 該可溶性ト口ンボモジュリンが、 以下の配列の 1つを含有するぺプチド であり、 トロンビンのプロテイン Cの活性化を促進する作用を有し、 且つ界面活 性剤の非存在下で溶解し得るものであることを特徴とする請求項 2 0 - 3 1のい ずれかに記載の可溶性ト口ンポモジュリン含有凍結乾燥製剤、 またはそのキット 製剤。
i) 配列表配列番号 3の 19-132のァミノ酸配列。
i i) 配列表配列番号 7の 19-132のァミノ酸配列。
iii) 上記 i)、 または ii) のアミノ酸配列に、 少なくとも 1つ以上のアミノ酸 の付加、 欠失、 または置換されたアミノ酸配列。
3 3 . 該可溶性ト口ンボモジュリンが、 配列表配列番号 4または 8の 55-396 の塩基配列の相補 DNAに対してストリンジェントな条件下にてハイブリダイズで きる DNAによりコードされ得るペプチドであり、 トロンビンのプロテイン Cの活 •性化を促進する作用を有し、 且つ界面活性剤の非存在下で溶解し得ることのでき ることを特徴とする請求項 2 0 - 3 1のいずれかに記載の可溶性ト口ンボモジュ リン含有凍結乾 剤、 またはそのキット製剤。
3 4. 可溶性ト口ンボモジュリンが、 以下の配列の 1つを含有するぺプチドで あり、 トロンビンのプロテイン Cの活性化を促進する作用を有し、 且つ界面活性 剤の非存在下で溶解し得るものであることを特徴とする請求項 2 0 - 3 1のいず れかに記載の可溶性ト口ンポモジュリン含有凍結乾燥製剤、 またはそのキット製 剤。
i) 配列表配列番号 1の 19—516のァミノ酸配列。
i i) 配列表配列番号 5の 19一 516のァミノ酸配列。
iii) 上記 i)、 または ii) のアミノ酸配列に、 少なくとも 1つ以上のアミノ酸 の付加、 欠失、 または置換されたアミノ酸配列。
3 5 . 有効成分として可溶性ト口ンボモジュリンを含有する可溶性ト口ンボモ ジュリン含有凍結乾燥製剤における可溶性ト口ンボモジュリンの安定化方法であ つて、 （1) グルタミン酸またはその塩、 およびマンニトールの 2種を含む、 （2) グルタミン酸またはその塩、 およびリシンまたはその塩の 2種を含む、 （3) ダル タミン酸またはその塩、 およびァスパラギン酸またはその塩の 2種を含む、 また は (4) ァスパラギン酸またはその塩、 およびマンニトールの 2種を含む、 のいず れかの組み合わせを含有せしめ、 且つ該可溶性ト口ンポモジュリン含有凍結乾燥 製剤が、 0. 1 mLから 2 mLの溶解用水溶液に溶解し得て、 10 mg/mL以上の可溶性 ト口ンボモジュリン高濃度含有溶液を調製でき、 その溶解時の浸透圧比が 0. 5か ら 2. 0であることを特徴とする可溶性ト口ンボモジュリン含有凍結乾燥製剤にお ける可溶性ト口ンボモジュリンの安定化方法。
3 6 . 該可溶性トロンボモジュリン含有凍結乾燥製剤中に、 さらに非イオン性 界面活性剤を存在せしめることを特徴とする請求項 3 5に記載の可溶性ト口ンボ モジユリンの安定化方法。
3 7 . 非ィオン性界面活性剤が、 ポリォキシェチレンソルビタン脂肪酸エステ ル、 ポリオキシエチレン一ポリオキシプロピレン共重合体、 ポリオキシエチレン アルキルエーテル、 ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、 ポリオキシエチレン硬 化ヒマシ油からなる群より選ばれるレ、ずれか少なくとも一種の化合物であること を特徴とする請求項 3 6に記載の可溶性ト口ンポモジュリンの安定化方法。
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