WO2003016914A1

WO2003016914A1 - Kit de diagnostic simultane d'une pluralite de maladies infectieuses et technique de preparation de celui-ci

Info

Publication number: WO2003016914A1
Application number: PCT/CN2001/001519
Authority: WO
Inventors: Gengxi Hu
Original assignee: Shanghai Health Digit Limited
Priority date: 2001-08-17
Filing date: 2001-10-30
Publication date: 2003-02-27
Also published as: EP1327885B1; CN1405564A; DE60109311T2; DE60109311D1; EP1327885A1; US20030165970A1; CN1164949C; EP1327885A4; CA2422942A1; JP3853317B2; JP2004538489A

Description

N01/01519 用于同时检测多种传染性疾病的试剂盒及其制备方法技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于同时检测多种传染性疾病的试剂盒及其制备方法。背景技术

乙型肝炎、丙型肝炎、梅毒和艾滋病是四种常见的传染性疾病。据 2000年卫生部的统计年报资料显示，此四种疾病的发病数约占传染病总发病数的 27.57%，给社会和人民生活帝来了极大的危害。

乙型肝炎是可能由药物、毒素和病毒等引起的炎症。在我国，约占人口总数 10¾-15%的人群为乙型肝炎病毒（HBV) 的感染者。 HBV可通过输血、血浆、血制品或使用被病毒污染的注射器针头、针灸用针、采血用具和血液透析等发生感染。其中通过输血这一途径感染因其发病率高，发病时间短，受累人群广而受到了极大的关注。

丙型肝炎的传染源主要为急性临床型病人和无症状的亚临床病人，慢性病人和病毒携带者。一般病人发病前 12天，其血液即有感染性，并可帝毒 12年以上。丙型肝炎的传染主要通过输血而引起，在大多数发达国家，丙型肝炎是输血后感染的肝炎中最常见的一种类型，国外 30-90%输血后感染的肝炎为丙型肝炎，我国输血后感染的肝炎中丙型肝炎占 1/3。

梅毒病人是梅毒螺旋体唯一的传染源。性接触传染占 95%。输血时如供血者为梅毒患者可传染于受血者。献血者如患梅毒并处于梅毒螺旋体血症阶段，可以传播梅毒。梅毒螺旋体在体外生活能力低， °C时生存 48- 72小时， 40 °C无传染力， 100 °C立即死亡，近年来我国性病增加，因此对预防输血传播梅毒应给予高度重视。

HIV 病毒是艾滋病的病原体，一般感染源以血液、精液、阴遒分泌物、母乳等为主。如果被输入带 HIV的血液，感染 HIV的可能性估计超过 90 % (相反，一次性交的风险为百分之几到小于 1 % ) , 一次输血带入 HIV病毒量是非常大的，通过这种方式感染后，很快就会发展为 AIDS , 平均时间是 3 - 5年（儿童约为 2年）。

可见，对血液和血液制品进行包括 HIV，梅毒， HBV， HCV在内的所有能通过血液传播的病毒的严格检查是非常必要的。我国卫生部早在一九九八年发布的《献血者健康检查标准》就规定了 9项必检项目，其中包括乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg) 、丙型肝炎病毒抗体（HCV 抗体）、艾滋病病毒抗体（HIV 抗体）和梅毒抗体。目前，对于梅毒的检测，一般采用 RPR法（快速血浆反应素试验）或 TRUST法（梅毒血清学试验），而对于 HIV、 HBV、 HCV的检测，一般采用 ELISA方法 (酶联免疫吸附分析），该方法一次检測需血清 400 /^ 1，耗时 1一 2 小时。由于目前对于献血者所献血液没有一种快速、彻底、覆盖多种疾病的检验方法，导致很多人在接受输血时感染肝炎、艾滋病和梅毒等传染病，严重地影响了受血者的身心健康和社会的安定。

胶体金免疫渗滤方法是从酶联免疫结合方法（ELISA)的基础上发展起来的，最初应用的结合物是酶标记的，称为酶免疫渗滤试验。 90 年代初发展了以胶体金为标记物的渗滤试验又称为金免疫渗滤试验 ( IGFA)。

胶体金免疫渗滤方法的原理是以硝酸纤維素膜为载体，利用微孔滤膜的可滤过性和毛细管作用，使抗原与抗体的反应、洗涤在一个特殊的渗滤装置上，以液体渗滤过膜的方式迅速完成。

由于此方法简单、快速、除商品试剂外不需任何仅器设备，几分钟即可用肉眼观察结果。目前已在临床检測中取得了广泛的应用。胶体金免疫渗滤方法可应用于免疫学检测的几乎所有方面，但主要用于检测正常体液中不存在的抗原性物质（例如诊断传染病中的抗原或抗体），以及正常含量极低而特殊情况下异常升高的物质（如 HCG、甲胎蛋白等）。近年来由于试剂原料的精选和制备技术的改进，应用范围更加广阔。但目前尚未有将胶体金免疫渗滤法用于多种传染性疾病相关抗原、抗体的同时检测。发明的公开

本发明所要解决的技术问题是利用胶体金免疫渗滤原理同时对多种传染性疾病进行检测，提供一种反应灵敏、准确，迅速的多用途检测试剂盒。

本发明公开的用于同时检测多种传染性疾病的试剂盒由免疫渗滤金标法联检反应装置、緩沖液、胶体金椋记物混合液組成；

其中所述的免疫渗滤金标法联检反应装置中的硝酸纤維素膜上，相距一定距离点制有 HBsAg单抗（鼠抗人）、 HCV抗原、梅毒抗原、 HIV抗原四种蛋白和质控物羊抗鼠 IgG抗体，抗原的点样量为 0.3 - 3 μ ΐ ;

其中所述的胶体金标记物混合液是四种胶体金标记物的混合溶液，包括 HBsAg单抗（鼠抗人）、 HCV抗原、梅毒抗原和 HIV抗原的胶体金标记物； HBsAg 的单抗（鼠抗人）被胶体金标记的蛋白浓度为 20-50 μ g/ml , HCV抗原被月¾体金标 ^己的蛋白浓度为 90—120 g/ml , 梅毒抗原被胶体金标记的蛋白浓度为 90- 120 g/ml， HIV抗原被胶体金栎记的蛋白浓度为 80- 120 g/ml，它们依次按体积比为 1 : 1 : 1 .2-2.5 : 1 .2-2.5的比例相混合；胶体金颗粒大小为 0— 30nm ;

其中所述的緩.沖液为含有 0.03- 0.05%Tween 20的 PH7.2— 8.8的 PBS (由磷酸二氢钾或磷酸二氢钠和磷酸氢二钠配制而成的緩沖液）緩沖液 °

本发明所述的梅毒抗原可以为单一的梅毒抗原，也可以是多种梅毒抗原的混合物； HIV抗原可以是 HIV- 1 ( 1型艾滋病病毒）抗原、HIV-2 ( 2型艾滋病病毒）抗原或 HIV-1抗原和 HIV- 2抗原的混合物。本发明所要解决的另一技术问题是提供上述检测试剂盒的制备方法。

本发明公开的用于同时检测多种传染性疾病的试剂盒的制备方法包括下列步骤：

一、制备免疫滤金柘法联检反应装置

1. 膜上加样物的制备

将 HBsAg单抗（鼠抗人）置于 0.02M， pH8.0的 PBS 中， 4°C透析过夜。透析后的鼠抗人 HBsAg 单抗用 0.02Μ， ρΗδ.Ο 的 PBS 稀释至 0.2-2. Omg/ml, 4°C保存备用。

将 HCV抗原置于 0.02M, pH8.0的 FBS 中， 4°C透析过夜。透析后的 HCV抗原用 0.02M， pH8.0的 PBS稀释至 0.2-2. Omg/ml， 4 °C保存备用。

将梅毒抗原置于 0.02M， pH8.0的 PBS 中， 4°C透析过夜。透析后的梅毒抗原用 0.02M, pH8.0的 PBS稀释至 0.2-2. Omg/ml, 4°C保存备用。

将 HIV抗原置于 0.02M， pH8.0的 PBS 中， 4°C透析过夜。透析后的 HIV抗原用 0.02M， pH8.0的 PBS稀释至 0.2-2. Omg/ml， 4°C保存备用。

将羊抗鼠 IgG抗体置于 0.02M, pH8.0的 PBS 中， 4°C透析过夜。透析后的羊抗鼠 IgG抗体用 0.02M，pH8.0的 PBS稀释至 0.2-2. Omg/ml， 4°C保存备用。 -

2. 在膜上加样

分别吸取上述 HBsAg单抗（鼠抗人）、 HCV抗原、梅毒抗原、 HIV抗原，仔细地点于硝酸纤維素膜的特定位点上，点样体积为 0.3-3^ 1/ 点。

另吸取羊抗鼠 IgG抗体，于同一硝酸纤維素膜上远离上述各点样位置的地方作一标记，此标记可为一点、一条线或其他符号。 3. 膜的后处理

将上述硝酸纤維膜（NC) ，· 置 37°C烘箱内 30 分钟。取出后室温放置 20分钟以上。然后将其浸没于 37°C的封闭液中 20分钟。取出后，在室温下置于洗涤液中振荡洗涤 5 - 10分钟。更换洗涤液，重复上述振荡洗涤过程。取出后，室温下晾干。 4°C干燥环境中保存备用。

其中所述的封闭液为含有 0.01-0.03%Tween20的 0.05M pH7.2-8.0 的 PBS緩沖液；其中所述的洗涤液为含有 0.03- 0.05%Tween20的 0.01M pH7.2-8.0的 PBS緩沖液。

4. 装置的装配，

取两层吸水滤纸垫于上述硝酸纤維素膜下方，再将滤纸与膜一齐装入并固定于塑料反应装置盒中。

二、制备胶体金标记物混合液

1. 制备胶体金颗粒

取 0.01%的氯金酸水溶液，加热煮沸，快速加入 1%枸橼酸三钠溶液，继续煮沸 5分钟，使得胶体金的大小为 20-30nm。

2. 制备胶体金标记物

2.1. HBsAg单抗（鼠抗人）的胶体金标记物的制备

取颗粒大小为 20- 30nm 的胶体金溶液，在磁力搅拌下緩慢加入 HBsAg 单抗（鼠抗人），使其最终浓度为 20- 50 u g/ml。室温下搅拌 30分钟。加入 10%BSA溶液使其终浓度为 0.2-1.0%，室温下搅拌 5分钟。加入 10% PEG20000 溶液使其终浓度为 0.1-0.5%，室温下搅拌 5 分钟。 12000-15000r/min 离心 60分钟，仔细吸取上清，弃去。沉淀溶于保存液中，用 0.45 μ η!滤膜过滤，置 4°C保存备用。

2.2. HCV抗原的胶体金标记物的制备

取颗粒大小为 20 - 30nm的胶体金溶液，在磁力搅拌下緩慢加入 HCV 抗原 ,使其终浓度为 90-120 μ g/ml。室温下搅拌 30分钟。加入 10%BSA 溶液使终浓度为 0.2-1.0%, 室温下搅拌 5 分钟。加入 10% PEG20000 溶液使终浓度为 0.1-0.5%，室温下搅拌 5分钟。 12000—15000r/min离心 60 分钟，仔细吸取上清，弃去。沉淀溶于保存液中，用 0.45 m 滤膜过滤，置 4°C保存备用。

2.3. 梅毒抗原的胶体金椋记物的制备

取颗粒大小为 20- 30nm的胶体金溶液，在磁力搅拌下緩慢加入梅毒抗原使抗原终浓度为 90-120 g/ml。室温下搅拌 30 分钟。加入 10%BSA 溶液使终浓度为 0.2-1.0%，室温下搅拌 5 分钟。加入 10% PEG20000 溶液使终浓度为 0.1- - 0.5¾，室温下搅拌 5 分钟。 12000-15000r/min 离心 60分钟，仔细吸取上清，弃去。沉淀溶于保存液中，用 0.45 um滤膜过滤，置 4°C保存备用。

当胶体金标记液中的梅毒抗原指多个梅毒抗原的混合物时各个梅毒抗原的胶体金标记物要分别制备，混合，保存备用。

2.4 HIV抗原的胶体金标记物的制备

取 20-30nm颗粒的胶体金溶液，在磁力搅拌下緩慢加入 HIV抗原使抗体终浓度为 80-120 μ g/ml。室温下搅拌 30分钟。加入 10%BSA溶液使终浓度为 0.2-1.0%，室温下搅拌 5分钟。加入 10% PEG20000溶液使终浓度为 0.1- -0.5%，室温下搅拌 5分钟。 12000- 15000r/min 离心 60 分钟，仔细吸取上清，弃去。沉淀溶于保存液中，用 0.45 滤膜过滤，置 4°C保存备用。

当胶体金标记液中的 HIV抗原指多个 HIV抗原的混合物时，各个 HIV抗原的胶体金标记物要分别制备，混合，保存备用。

3. 制备胶体金标记物混合液

将分别配制的胶体金标记物按体积比为 HBsAg的单抗（鼠抗人）月交体金标记液： HCV 抗原胶体金标己液：梅毒抗原胶体金标液： HIV 抗原胶体金标记液 = 1 : 1： 1.2-2.5： 1.2-2.5的比例混合完全。

三、緩沖液的制备在 pH7.2-8.8 的 PBS 中加入 Tween20 , 使 Tween20 的浓度为 0.03-0.05%。

本发明所要解决的再一技术问题是公开上述检测试剂盒在同时检测乙型肝炎、丙型肝炎、梅毒、艾滋病传染性疾病中的应用。

本发明所述试剂盒的检测方法如下：

1 - 取出免疫渗滤金椋法联检反应裝置，水平置于桌面；

2 . 在免疫渗滤金标法联检反应装置孔内加入两滴緩沖液，湿润表面；

3 . 加入待測血清 50ul，等其渗滤入膜内；

4 - 加入三滴緩沖液，待其渗入后加入两滴胶体金标记液；

5 - 力 P入三滴緩沖液；

6 . 1分钟后观察相应位置有无红色斑点，有则认为该位置对应的疾病病毒在体内呈阳性，没有则认为该位置对应的疾病病毒在体内呈阴性。

若待测血清中有 HBsAg、 HCV抗体、梅毒抗体、 HI V抗体中的一种或数种，当硝酸纤維素膜与血清接触时，膜上的抗原（或抗体）会与血清中的对应抗体（或抗原）发生反应，然后再与相应的胶体金标记物进行反应，从而显色。所以，从显色的情况可以判断出待测病人感染了何种病毒。由于羊抗鼠 IgG抗体不会与人血清内的抗体发生反应，而在胶体金标记液中含有的 HBsAg单抗（鼠抗人）可与羊抗鼠 IgG抗体发生反应，对应于羊抗鼠 IgG抗体的位置就会显色，被肉眼识別出；当试剂盒由于某組分的质量问题无法进行检测实验时，膜上对应于羊抗鼠 IgG抗体的位置就不会显色，所以，通过羊抗鼠 IgG抗体可对试剂盒进行质量控制。

本发明的检测试剂盒利用了胶体金免疫渗滤的原理，使多种传染性疾病的相关抗原、抗体在同一渗滤装置（硝酸纤維素膜）上进行反应、洗涤，通过肉眼观察各斑点的显色情况，对多种传染性疾病进行检测。

本发明试剂盒与传统的金标试剂盒、 RPR试剂盒、 TRUST试剂盒相比，其优点在于：

( 1 ) 检测多疾病

在同一装置内同时进行四种传染性疾病的检测。

(2) 同时检测多个抗原和抗体

在同一装置内既可以检测多个抗体，也可以同时检測多个抗原，实现了多种蛋白检测条件的一体化。

本发明试剂盒与 ELISA试剂盒相比，其优点在于：

( 1 ) 检测多疾病

在同一装置内可进行四种传染性疾病的检测。

(2) 同时检测多个抗原和抗体

在同一装置内既可以检测多个抗体，也可以同时检測多个抗原，实现了多种蛋白检測条件的一体化。

( 3) 反应时间短

整个实验可在 3 - 5分钟内完成，适合大规模的快速血检。该试剂盒只有 2步检测步骤，即加样、反应，均通过渗滤完成，检测全过程仅需数分钟，但敏感度却与需 1-2小时完成的 ELISA实验相仿。

(4) 采血量小

需要的血清量仅 50ul，只采集指血、耳血即可。而 ELISA法测一个指标就需要 1 OOul血清，则测试四项指标需要 400ul左右的血清。所以本试剂盒对于儿童、新生儿的使用十分方便，而 ELISA方法取样只能采静脉，对新生儿十分痛苦。

( 5) 检测结果不受仅器的影响；不受反应环境的影响。

( 6) 加入胶体金标记物即可显色，操作步驟简单，而且试剂可在室温长期保存。

本发明试剂盒利用胶体金免疫渗滤方法的原理，在同一载体上实现对多种抗原和抗体的同时检测，操作简便、迅速、准确，可适用于各种血样的多病种检測，特别适用于大规模血液检查，也为传染性疾病的检测提供了新思路。附图的简要说明

图 1是硝酸纤維素膜上点样示意图；

其中 1、 2、 3、 4分别表示点样位置。 " C " 的两点之间为羊抗鼠

IgG抗体点样位置。

图 2是 1号血清检測显示示意图，检测结果均为阴性；

图 3是 2号血清检测显示示意图，检测结果乙型肝炎病毒表面抗原为阳性；

图 4是 3号血清检测显示示意图，检测结果梅毒抗体，艾滋病 HIV - 1&2抗体为阳性；

图 5是 4号血清检測显示示意图，检測结果梅毒抗体，艾滋病 HIV - 1&2抗体，丙型肝炎病毒抗体为阳性； '

图 2 - 5中 C一 C代表羊抗鼠 IgG抗体的横线为阳性。具体实施方式

一、试剂盒选用抗体及材料

在实施本发明的优选方法中， HBsAg单抗（鼠抗人） Sl、 HBsAg单抗（鼠抗人） S2由倍尔乐生物科技有限公司提供； HCV抗原、 TP47梅毒抗原、TP15梅毒抗原、ΤΡ47/ΤΡ15梅毒混合抗原、HIV- 1抗原、 HIV - 2 抗原、 HIV- 1/2 混合抗原由美国 BioDesign公司提供；硝酸纤维素膜由 S&S公司提供；被测血清由上海市疾病控制中心提供。

二、免疫渗滤金标法联检反应装置的制备方法如下：

( 1 ) 将 HBsAg单抗（鼠抗人） S2置于 0 .02M, _PH8 .0的 PBS 中， 4 °C透析过夜。透析后的鼠抗人 HBsAg单抗 S2用 0 . 02M, ρΗδ . Ο的 PBS 稀释至 0.5m_g/ml， 4°C保存备用。

(2) 将 HCV抗原置于 0.02M, pH8.0的 FBS中， 4°C透析过夜。透析后的 HCV抗原用 0.02M, pH8.0的 FBS稀释至 0.4mg/ml， 4°C保存备用。 '

(3) 将 TF47/TP15梅毒混合抗原置于 0.02M, pH8.0的 PBS中， 4 °C透析过夜。透析后的 TP47/TP15 混合抗原用 0.02M, _PH8.0 的 PBS 稀释至 0.5mg/ml， 4°C保存备用。

(4) 将 HIV- 1/2混合抗原置于 0.02M, ρΗδ.Ο的 FBS中， 4°C透析过夜。透析后的 HIV- 1/2 混合抗原用 0.02M, ρΗδ.Ο 的 PBS 稀释至 0.6mg/ml， 4°C保存备用。

(5)羊抗鼠 IgG抗体置于 0.02M, pH8.0的 PBS中， 4°C透析过夜。透析后的 HIV-1/2混合抗原用 0.02M, pH8.0的 PBS稀释至 0.⁶mg/ml， 4°C保存备用。

(6) 如附图 1所示，在硝酸纤維素膜上的 1、 2、 3、 4位置处，分别用微量加样器点上四种蛋白： TF47/TF1⁵梅毒混合抗原、 HIV- 1/2 混合抗原、 HBsAg 单抗（鼠抗人） S2、 HCV 抗原，每点的点样体积为 1.0 1; 在硝酸纤維素膜上标有 "C" 的两点之间，用 0.2mm绘图笔吸取羊抗鼠 IgG抗体画一横线。

(7) 将此硝酸纤維素膜置于 37°C烘箱内 30分钟，取出后室温放置 25分钟。然后将其浸没于 37°C的封闭液中 20分钟。取出后，在室温下置于洗涤液中振荡洗涤 5分钟，重复洗涤数次。室温晾干。

(8) 取两层吸水滤纸垫于上述硝酸纤維素膜下方，再将滤纸与膜一齐装入并固定于塑料反应装置盒中。

三、緩冲液是由 pH为 7.8， 0.10M的 PBS和 0.30% Tween20等体积混合而成的溶液。

四、胶体金标记液由 HBsAg单抗（鼠抗人） S1的胶体金标记物、 HCV抗原的胶体金标记物、 TP47/TP15梅毒混合抗原的胶体金标记物、 HIV- 1/2 混合抗原的胶体金椋记物按照体积比为 1 ： 1 ： 1 .2-2.5 : 1 .2-2.5 的比例混合而成。各个胶体金标记物所用胶体金的颗粒大小均为 30nm。胶体金标记物的制备方法如下：

( 1 ) HBsAg单抗（鼠抗人） S1的胶体金标记物的制备

(2) 结合物的制备

取颗粒大小为 30nm的胶体金溶液，在磁力搅拌下緩慢加入 HBsAg 单抗'（鼠抗人） Sl，使其最终浓度为 20 g/ml。室溫下搅拌 ³0分钟。加入 10%BSA溶液使其终浓度为 0.6% , 室温下搅拌 5 分钟。加入 10% PEG20000 溶液使其终浓度为 0 .2%，室温下搅拌 5 分钟。 12000-15000r/min 离心 60分钟，仔细吸取上清，弃去。沉淀溶于保存液中，用 0 .45 rn滤膜过滤，置 4 °C保存备用。

(3) 胶体金 - HCV抗原的胶体金标记物的制备

取颗粒大小为 30nm的胶体金溶液，在磁力搅拌下緩慢加入 HCV抗原，使其终浓度为 90 μ g/ml。室温下搅拌 30分钟。加入 10%BSA溶液使终浓度为 0.6% , 室温下搅拌 5分钟。加入 10% PEG20000溶液使终浓度为 0.2%，室温下搅拌 5分钟。 12000-15000r/min 离心 60分钟' 仔细吸取上清，弃去。沉淀溶于保存液中，用 0.45 m滤膜过滤，置 4 °C保存备用。

(4) TP47/15梅毒混合抗原的胶体金标记物的制备

取颗粒大小为 30nm 的胶体金溶液，在磁力搅拌下緩慢加入 TP47 梅毒抗原使抗原终浓度为 90 ^ g/ml。室温下搅拌 30分钟。加入 10%BSA 溶液使终浓度为 0.6%，室温下搅拌 5分钟。加入 10% PEG20000溶液使终浓度为 0.2% , 室温下搅拌 5 分钟。 12000- 15000r/min 离心 60 分钟，仔细吸取上清，弃去。沉淀溶于保存液中，用 0.⁴5 πι滤膜过滤，置 4 °C保存备用。

TP15抗原的胶体金柘记物制备方法同 TP47。

将 ΤΡ47抗原和 TP15抗原的胶体金标记物等体积混合， 4°C保存备用。

( 5) HIV- 1/2抗原的胶体金标记物的制备

取 30nm颗粒的胶体金溶液，在磁力搅拌下緩慢加入 HIV- 1抗原使抗体终浓度为 100 μ g/ml。室温下搅拌 30分钟。加入 10%BSA溶液使终浓度为 0 .6%，室温下搅拌 5分钟。加入 10% PEG20000溶液使终浓度为 0.2% , 室温下搅拌 5分钟。 12000 - 15000r/min 离心 60分钟，仔细吸取上清，弃去。沉淀溶于保存液中，用 0.45 ιτι滤膜过滤，置 4 °C 保存备用。

HIV-2抗原的胶体金标记物制备方法同 HIV-1。

将 HIV- 1抗原和 HIV- 2抗原的胶体金标记物等体积混合， 4 °C保存备用。

当胶体金标记液中的 HIV抗原指多个 HIV抗原的混合物时，各个 HIV 抗原的胶体金标记物要分别制备，再按照一定倍数稀释、混合，保存备用。

用该试剂盒来测试不同的血清，医院提供的资料显示， 1 号血清的提供者未患上述四种传染性疾病中任一种； 2 号血清的提供者仅患有丙型肝炎； 3号血清的提供者患有艾滋病和梅毒； 4号血清的提供者患有乙型肝炎和梅毒。检测结果依次见附图 2、附图 3、附图 4、附图 5。

Claims

杈利要求

1、一种用于同时检測多种传染性疾病的试剂盒，该试剂盒由免疫渗滤金标法联检反应裝置、緩沖液和胶体金标记物混合液組成，其特征在于：

( 1 )其中所述的免疫渗滤金标法联检反应装置中的硝酸纤維素膜上 , 相距一定距离点制有 HBsAg单抗、 HCV抗原、梅毒抗原、 HIV抗原四种蛋白和质控物羊抗鼠 IgG抗体；

(2)其中所述的胶体金标记物混合液是四种胶体金标记物的混合溶液，包括 HBsAg单抗、 HCV抗原、梅毒抗原和 HIV抗原的胶体金柘记物。

2、一种如杈利要求 1所述的用于同时检测多种传染性疾病的试剂其特征在于其中所述的胶体金标记液中 HBsAg的单抗被胶体金标记的蛋白浓度为 20-50 ^ g/ml，HCV抗原被胶体金标记的蛋白浓度为 90-120 μ g/ml , 梅毒抗原被胶体金标记的蛋白浓度为 90- 120 g/ml， HIV抗原被月交体金标记的蛋白浓度为 80- 120；« g/ml ,它们依次按体积比为 1： 1： 1 .2-2 .5： 1 .2- 2.5的比例相混合；胶体金颗粒大小为 20—30nm。

3、一种如杈利要求 1或 2所述的用于同时检测多种传染性疾病的试剂盒，

其特征在于其中所述的梅毒抗原为单一的梅毒抗原或是多种梅毒抗原的混合物； HIV抗原是 HIV- 1抗原、 HIV-2抗原或 HIV-1抗原和 HIV-2 抗原的混合物。

4、一种如杈利要求 1所述的用于同时检测多种传染性疾病的试剂盒，

其特征在于其中所述的緩沖液为含有 0.03- 0.05%Tween 20的 PH7.2— 8 .8的 PBS緩沖液。 5、一种如杈利要求 1所述的用于同时检测多种传染性疾病的试剂盒的制备方法，

其特征在于试剂盒的制备方法包括下列步骤：

(一）免疫渗滤金标法联检反应装置的制备

( 1 ) 膜上加样物的制备

将 HBsAg单抗、HCV抗原、梅毒抗原、HIV抗原分别对 0.02M， pH8.0 的 PBS , 4°C透析过夜。透析后的各蛋白分别用 0.02M， pH8.0 的 FBS 稀释至 0.2-1 . Omg/ml；

( 2) 在膜上加样

分别吸取上述 HBsAg单抗、 HCV抗原、梅毒抗原、 HIV抗原，仔细地点于硝酸纤維素膜特定的位点上，每点 0.3-3 1；另吸取羊抗鼠 IgG 抗体，于同一硝酸纤維素膜上远离上述各点样位置的地方作一标记，此标记可为一点、一条线或其他符号；

( 3) 膜的后处理

将此硝酸纤維素膜置于 37 °C烘箱内 30分钟，取出后室温放置 20 分钟以上。然后将其浸没于 37 °C的封闭液中 20 分钟。取出后，在室温下置于洗涤液中振荡洗涤 5- 10分钟，重复洗涤数次。室温晾干；

(4) 反应装置的装配

取两层吸水滤纸垫于上述硝酸纤維素膜下方，再将滤纸与膜一齐装入并固定于塑料反应装置盒中；

(二）制备胶体金标记物混合液

( 1 ) 制备胶体金颗粒

取 0.01%的氯金酸水溶液，加热煮沸，快速加入 1%枸橼酸三钠溶液，继续煮沸 5分钟，使得胶体金的大小为 20- 30nm ;

( 2) 制备胶体金标记物

2 . 1 · HBsAg单抗的胶体金柘记物的制备

取颗粒大小为 20- 30nm 的胶体金溶液，在磁力搅拌下緩慢加入 HBsAg单抗，使其最终浓度为 20- 50 g/ml; 室温下搅拌 30分钟；加入 10%BSA溶液使其终浓度为 0.2-1.0%，室温下搅拌 5分钟；加入 10% PEG20000 溶液使其终浓度为 0.1-0.5%, 室温下搅拌 5 分钟； 12000-15000r/min 离心 60分钟，仔细吸取上清，弃去。沉淀溶于保存液中，用 0.45 ^um滤膜过滤，置 4°C保存备用；

2.2. HCV抗原的胶体金标记物的制备

取颗粒大小为 20 - 30nm的胶体金溶液，在磁力搅拌下緩慢加入 HCV 抗原，使其终浓度为 90-120 μ g/ml；室温下搅拌 30分钟，加入 10%BSA 溶液使终浓度为 0.2-1.0%, 室温下搅拌 5 分钟；加入 10% PEG20000 溶液使终浓度为 0.1-0.5%，室温下搅拌 5分钟； 12000- 15000r/min离心 60 分钟，仔细吸取上清，弃去；沉淀溶于保存液中，用 0.45 滤膜过滤，置 4°C保存备用；

2.3. 梅毒抗原的胶体金标记物的制备

取颗粒大小为 20-30nm的胶体金溶液，在磁力搅拌下緩慢加入梅毒抗原使抗原终浓度为 90-120 g/ml; 室温下搅拌 30 分钟；加入 10%BSA 溶液使终浓度为 0.2-1.0%，室温下搅拌 5 分钟；加入 10% PEG20000 溶液使终浓度为 0.1- -0.5%，室温下搅拌 5 分钟； 12000-15000r/min 离心 60分钟，仔细吸取上清，弃去；沉淀溶于保存液中，用 0.45 m滤膜过滤，置 4°C保存备用；

2.4 HIV抗原的胶体金标记物的制备

取 20- 30nm颗粒的胶体金溶液，在磁力搅拌下緩慢加入 HIV抗原使抗体终浓度为 80-120 μ g/ml；室温下搅拌 30分钟；加入 10%BSA溶液使终浓度为 0.2-1.0%, 室温下搅拌 5分钟；加入 10% PEG20000溶液使终浓度为 0.1-- 0.5%，室温下搅拌 5分钟； 12000- 15000r/min 离心 60 分钟，仔细吸取上清，弃去；沉淀溶于保存液中，用 0.⁴⁵^m 滤膜过滤，置 4°C保存备用；

(3) 制备胶体金标记液将分别配制的胶体金标记物按体积比为 HBsAg 的单抗胶体金标记液： HCV抗原胶体金标记液：梅毒抗原胶体金标液： HIV抗原肢体金标 i已液 = 1 : 1 : 1.2-2.

5: 1.2- 2.5的比例混合完全；

(三）緩沖液的制备

在 pH7.2-8.8 的 PBS 中加入 Tween20 , 使 Tween20 的浓度为 0.03-0.05%。

6、一种如杈利要求 1所述的用于同时检測多种传染性疾病的试剂盒在同时检测乙型肝炎、丙型肝炎、梅毒、艾滋病传染性疾病中的应用。