WO2002034885A1

WO2002034885A1 - Produit contenant de la sericine, procedes de production et d'utilisation correspondants

Info

Publication number: WO2002034885A1
Application number: PCT/JP2001/002250
Authority: WO
Inventors: Kozo Tsubouchi; Hiromi Yamada; Yoko Takasu
Original assignee: National Institute Of Agrobiological Sciences
Priority date: 2000-10-24
Filing date: 2001-03-22
Publication date: 2002-05-02
Also published as: EP1335018A1; US6815427B2; JP2002128691A; US20030087433A1; CN1406276A; KR20020079761A

Description

明細書

セリシン含有素材、その製造方法およびその使用方法技術分野

本発明は、家蚕セリシンを含有してなる細胞育成促進剤に関し、詳しくは医療用材料、細胞培養床素材および化粧用素材に関する。

また、本発明は、家蚕が吐糸する繊維（繭糸等）から細胞生育機能を有するセリシンを取得する方法に関する。背景技術

家蚕が吐糸する繊維、つまり繭糸等は、フイブ口インとセリシンの 2種のタンパクから構成されており、セリシンはフイブ口インをコ一ティングした状態で存在している。

繭は乾繭、煮繭、繰糸等の工程を経た後、精練（脱セリシン）され、精練された絹糸（フイブ口イン繊維）は絹織物として利用されてきた。

また、絹糸は天然繊維の中で唯一の長繊維であり、結晶性に優れ、強度が高く、古来より衣料のほかに手術糸としても利用されてきた。

近年絹タンパクは、その固有の機能に着目して様々な用途に利用することが盛んになつている。

絹夕ンパクを用いた新素材開発はフィブロインが先行したが、近年はフイブロインの成果に基づいて、もう一方の絹タンパクであるセリシンについても研究開発の対象になってきている。

例えば、セリシン加水分解物を基体表面に被覆して成る化粧用粉体（特開平 1 0 — 2 2 6 6 2 6号公報）、フイブロイン分散液及び /又はセリシン水溶液を含浸させたセルロース繊維を含んでなる化粧料（特開平 1 1 一 1 5 2 2 0 6号公報）、セリシン加水分解物を有効成分とする皮膚炎症防止剤（特開平 1 0 — 2 4 5 3 4 5号公報 ) 、セリシン加水分解物を有効成分とするコラーゲン産生促進剤および老化防止用皮膚外用剤（特開平 1 0 — 2 2 6 6 5 3号公報）、セリシン加水分解物と酵母分解物を含有する皮膚外用剤（特開平 1 1 一 1 9 3 2 1 0号公報）、家蚕の絹タンパク（フイブ口インおよび/またはセリシン）から作成されたフィルムからなる細胞培養床 (蓂浦ら「Attachment and growth of cultured fibroblast cells on Silk protein matrices , J. B i omed i cal Materials Res. , Vol. 29， 1215-1221 (1995)) 等が報告されている。

—方、繭糸等からセリシンを得る方法として、従来の精練廃液からセリシンを回収する方法では、平均分子量 5 0， 0 0 0以下の低分子量のものしか得られなかつた（特開平 1 — 1 6 8 9 0 6公報、特開平 4 — 2 0 2 4 3 5号公報等）。

つまり、繭糸中のセリシンは結晶化しているため、ほとんど水に溶けないが、アルカリ性の熱水中で分解することにより、除去されてきた。

最近になって、平均分子量 1 0 0， 0 0 0以上の高分子量のセリシンを効率よく取得できるようになり（特開平 1 1 一 9 2 5 6 4号公報、特開平 1 1 — 1 3 1 3 1 8号公報等）、また、分子量の低下を抑えるようにして繭糸等からセリシン等を溶出する方法も開発されてきている（特開平 1 1 — 2 2 8 8 3 7号公報、特開 2 0 0 0 — 3 8 5 1 4号公報等）。

家蚕のセリシンは、古くから分子量数万から数十万のタンパクの混合物であると言われてきたが、巨大であるために会合ゃ不溶化が起き易く、取り扱いが困難であった。

そのため、未分解状態での分画 · 精製がどのようなタンパク成分から構成されているかについては未解決のままであった。

さらに、生理活性などの機能が示唆されている従来の報告でも、ほとんどは抽出段階で低分子化したものであつた。

我々は最近、未分解セリシンを抽出と分画に成功したことから、分画して得られたこれらの成分の利用研究が課題となっていた。本発明は、未分解セリシンを構成する成分の生理活性機能を解明し、その機能成分を利用した新しい医療用材料、化粧素材等を提供することを目的とする。発明の開示

(課題を解決するための手段）

上記課題を解決するために、本発明者らは、先ず、未分解セリシンを構成するセリシンの分子量と生理活性との関連について追跡したところ、未分解セリシンを構成する成分の中で特定の分子量を有するセリシンが、極めて高い細胞生育促進作用を有するという知見を得た。

本発明は、上記知見に基づいてなされたものであり、以下の各構成力、らなる。

すなわち、本発明は、（ 1 ) 、が吐糸する繊維（繭糸等）から溶出して得られる、ドデシル硫酸ナトリウム一ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ S D S — P A G E ) による分子量が約 4 0 0， 0 0 0 のセリシンを主体とする細胞生育促進剤に存する。

そして、（ 2 ) 、家蚕が吐糸する繊維（繭糸等）中のセリシンを、尿素水溶液で溶解せしめた後、ドデシル硫酸ナトリウム一ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ S D S— P A G E ) による分子量が約 4 0 0 , 0 0 0 のセリシンを分離回収する方法に存する。

そしてまた、（ 3 ) 、 4 M以上の尿素水溶液で溶解せしめることを請求項 2記載の分離回収する方法に存する。

そしてまた、（ 4 ) 、家蚕が吐糸する繊維（繭糸等）を、中性塩水溶液で溶解せしめて得られる、ドデシル硫酸ナトリゥムーポリァクリルアミドゲル電気泳動（ S D S— P A G E ) による分子量が約 4 0 0 , 0 0 0のセリシン、および絹フイブロインを含有する細胞生育促進剤に存する。

そしてまた、（ 5 ) 、粉末状またはフィルム状の形態を有する細胞生育促進剤に存する。

そしてまた、（ 6 ) 、家蚕が吐糸する繊維（繭糸等）を温和な条件で精練し、低分子量のセリシンを除去することにより得られる、フイブロイン繊維表面が実質的にドデシル硫酸ナトリウム一ポリアクリルァミドゲル電気泳動（ S D S— P A G E ) による分子量が約 4 0 0 , 0 0 0 のセリシン成分により被覆された状態の繊維状素材からなる細胞生育促進剤に存する。

そしてまた、（ 7 ) 、家蚕が吐糸する繊維（繭糸等）を温和な条件で精練し、低分子量のセリシンを除去することからなる、フイブ口ィン繊維表面が実質的にドデシル硫酸ナトリウム一ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ S D S— P A G E ) による分子量が約 4 0 0 ， 0 0 0 のセリシンにより被覆された状態の繊維状素材の製造方法に存する。

そしてまた、（ 8 ) 、できる限り中性に近い温和な p h領域で煮沸精鍊を行うこと繊維状素材の製造方法に存する。

そしてまた、（ 9 ) 、蚕体内の中部糸腺および前部糸腺の液状絹を水中に浸漬して得られる、実質的にドデシル硫酸ナトリウム一ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ S D S— P A G E) による分子量が約 4 0 0， 0 0 0のセリシンを主体とする細胞生育促進剤に存する。

そしてまた、（ 1 0 ) 、上記に記載の細胞生育促進剤を、皮膚ケァ素材としての化粧素材、医療用材料としての創傷被覆用素材，血管内皮形成，臓器形成素材、およびバイオ材料としての細胞培養床素材に使用する方法存する。

(発明の実施の形態）

( 1 ) 未分解のセリシンを構成する各種セリシンの分離と同定

( a ) 未分解セリシンの取得

繭糸等から未分解のセリシンを取り出すための手段として、従来の酸、アルカリ水溶液や酵素処理による溶出方法を用いたのでは、 . 加水分解により分子量が低下するために、これらの溶出方法は採用することができない。

そこで、繭糸等をチオシアン酸リチウム等の中性塩水溶液にフィプロインともども溶解し、フイブ口インとセリシンからなる絹タンパク溶液を作成する。

この中性塩水溶液による溶解方法によれば、加水分解による分子量低下を抑制してほぼ未分解のセリシンを含有する絹タンパク溶液を得ることができる。この未分解のセリシンを含有する絹タンパク溶液を、ドデシル硫酸ナトリウム—ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ S D S— P A G E) による分子量測定およびセリシンの分別に供する。

(以下、ドデシル硫酸ナトリウム一ポリアクリルアミドゲル電気泳動は、 S D S— P A G Eと省略する。）上記中性塩水溶液による溶解方法において使用する中性塩としては、チォシアン酸リチウム、臭化リチウム、塩化カルシウム、硝酸カルシウム等が挙げられるが、特にチォシアン酸リチウム、臭化リチウムが好ましい。

繭糸等は、中性塩の濃厚水溶液中に投入され、溶解される。

溶解においては、絹タンパクの分子量低下をできる限り抑制するために、温和な条件を選定する。

中性塩は、 5 0 %飽和以上の濃度で使用され、加熱温度は室温〜 8 0 °Cの範囲にする。

8 0 °Cを超えると絹タンパクの分子量低下が起こるので、溶解時間や中性塩の種類との兼ね合いもあるが、できるだけ低温であることが好ましい。

溶解時間は 1〜 2 0分の範囲で、中性塩の種類、温度等の条件を考慮し、完全に溶解し、かつ分子量低下が起こらないよう決定する o

絹タンパクを溶解した中性塩溶液は、透析に付して純粋な絹タンパク水溶液とする。

( b ) 電気泳動法による分子量測定

絹タンパクは、電気泳動法によって、 2成分のフイブ口イン ( H および L ) および 4成分のセリシン（ a、 b、 c、および d ) に分離される。

すなわち、繭糸等を上記中性塩水溶液に溶解し、 5 M ( 5 m 0 1 / 1 ) 尿素液で置換したものを、還元剤、例えば 2 —メルカプトェタノ一ル（M E ) で処理し、分子間架橋結合（ S S結合）を切断する。

これを S D S— P A G Eに供して繭糸の構成タンパク各成分の分子量を測定する。

電気泳動法による測定の結果、繭層セリシンの約 4 5 %を分子量約 4 0 0， 0 0 0 のセリシン a力く、約 3 4 %を約 2 5 0， 0 0 0 のセリシン d力く、約 1 5 . 5 %を約 2 0 0， 0 0 0 のセリシン b力く、約 5 . 3 %を約 3 5 , 0 0 0 セリシン cがそれぞれ占めることを突きとめた。

( ) セリシン a成分からなる素材の作成；

繭糸等を尿素水溶液中、大気圧下で加熱してセリシン a成分を溶出一 9 る。

尿素水溶液の濃度は 4 M以上、好ましくは 7 M〜飽和で 7 0〜 1 0 0 °Cに 3〜 3 0分間好ましくは 5〜 3 0分間保ち、セリシンを抽出する。

尿素水溶液の濃度は低いほど尿素量が少ないため、ロストが少なくてよい。

しかし、尿素濃度が低いと特にセリシン aの溶解が低下し抽出量が少なくなるため、抽出を早く回収量を多くするには 4 M以上の尿素濃度にする方がよい。

加熱温度が低いと抽出されにくく、高いとセリシンが分解し分子量が下がる。

抽出時間が短いと抽出されにくく、長いとセリシンが分解しやすい。

また、尿素水溶液に 1 %以上の還元剤（M E等）を加えることで、セリシンの回収率は向上する。

以上のようにして得たセリシン溶解液に、容量にして 3〜 5倍量の有機溶媒（メタノール、エタノール、アセトン等）を加え、未分解セリシンの沈澱を得る。これを 1 %以上の還元剤（M E等）を含むチォシアン酸リチウム等の中性塩水溶液に溶解した後、ェタノール等の有機溶媒を順次加えて沈澱させ、 S D S — P A G Eで確認しつつ各種セリシンの分画を行う。

沈澱物の溶解 · 沈澱の操作を繰り返すことにより、セリシン a含有率が 9 0 %以上の絹タンパクを得る。

あるいは、繭糸等をチオシアン酸リチウム等の中性塩水溶液に溶解して得たフィブロインを含む絹タンパク溶液を還元剤（例えば M E等）で処理し、次いでエタノール等の有機溶媒による沈澱および ME含有チォシアン酸リチウム水溶液による溶解を繰り返して絹タンパク成分の分別を行うことにより、セリシン a含有率が 9 0 %以上の絹タンパクを得る。

溶解と沈澱を繰り返し行って精製されたセリシン aを、チオシァン酸リチウム等の中性塩水溶液に溶解し、透析等で脱塩する。

精製 ·脱塩されたセリシン a水溶液を噴霧乾燥して粉末状素材を得る。

また、精製 · 脱塩されたセリシン a水溶液を平板上で乾燥してフイルム状素材を得る。

このフィルム状素材を粉碎して粉末状素材としてもよい。

以上のようにして得られたセリシン a成分からなる粉末状またはフィルム状素材は、バイオ用として細胞培養床素材等に、医療用として創傷被覆材、血管内皮形成材（人工血管）、臓器形成材医療素材等に、また、皮膚ケア用として化粧素材等に、一部あるいは全部として利用できる。

平均粒子径が 1 〜 1 , 0 0 0 〃 m、好ましくは 1 〜 1 0 0 〃であれば、粉末は皮膚等の動きに柔軟に対応でき、創傷被覆剤としても利用できる。

( 3 ) セリシン a とフィブロインからなる素材の作成；

セリシン aを含有する素材を、特にフィルム状素材として使用する場合には、セリシン a成分のみからなる素材自体の強度が十分でないために、そのまま創傷被覆材ゃ人工血管等の医療素材等に用いるのは必ずしも望ましくない。

そこで、繭糸を構成するもう一方のタンパク成分であり、生体適合性がよく、強度の優れた絹糸の構成成分であるフイブロインをセリシン a と組み合わせて用いることにより、創傷被覆材ゃ人工血管等の医療素材等により適した素材を得ることができる。

セリシン a とフイブ口インを組み合わせて用いる態様としては、絹糸をリチウム塩等の中性塩の水溶液で溶解したフイブロイン水溶液と、セリシン aからなる水溶液とを混合して得られるセリシン a —フイブロイン混合水溶液を用いることができる。

中性塩水溶液としてはチオシアン酸リチウムの 5 M以上の水溶液、好ましくは 9 M程度の飽和水溶液が効果的である。

原料タンパクに対し溶媒量が多いほど溶解しやすいが、精製 · 脱塩等は非効率的になる。

したがって、原料タンパクに対し溶媒量を極力少なくした方が、絹タンパクを効率的に回収できる。

このようなことから原料に対する中性塩水溶液の容量は原料重に対し 7倍以上、好ましくは 9 〜 5 0倍がよい。

溶液の脱塩は水に対する透析により行う。

透析は、透析外液が A g N 0 ₃ 添加により沈澱を生じなくなるまで行う。

これによつて、セリシン a _フィブロイン混合水溶液を得る。得られた混合水溶液を平板上で乾燥させてフイルム状の素材とする。

フィルムを作る場合は、透析をできるだけすみやかに行うことが好ましく、具体的には 3 日以内、好ましくは 2 日以内である。

透析に長い日数をかけると、絹タンパクがゲル化し、塊状となるため、フィルム化が困難になる。

絹タンパク水溶液を平板上、特にァクリル等のブラスチック板上に流し、結晶化度が 1 0 %未満となるように、すみやかに乾燥してフィルム化する。

たとえば、 6 0 % R H (相対湿度）以下の室内で、送風しながら乾燥するのが好ましい。

結晶化度 1 0 %以上のフィルムは吸水性が低いため、創傷部に被覆した時、創傷部の滲出液を充分に吸収できず、柔軟になれないため、むしろ創部を傷つけてしまう。

そのため、創傷被覆材には適さない。

粉末状の素材は、脱塩したセリシン a — フイブロイン混合水溶液を噴霧乾燥させるか、または、混合水溶液を凍結乾燥させるか、もしくはアルコール等により沈澱させ、乾燥後粉砕して得.られる。また、フィルム状の素材を粉砕することによつて得ることもできる。

粉末の形状はフィルムと異なるため、粉末の結晶化度は 0 〜 1 0 0 %の範囲で創傷被覆材として利用できる。

( 4 ) セリシン a成分がフイブロイン繊維表面に被覆された繊維状素材；

繭糸等の原料を精練する際に、水に溶解しやすいセリシン d と b は最初の段階で除かれ、セリシンの 4 0 %程度が除かれた段階では、繭糸の表面はほとんどセリシン aから構成されているから、この段階で精練を終了して得られる生糸を原料とすることが好ましい。

繭糸等の原料を煮沸精練する際は、精練液の P Hが中性から離れるほどセリシンは取得しやすいが、この場合、分解して分子量が低下するので、未分解のセリシンを取得するためには、できる限り中性に近い温和な p H領域で精練を行うことが好ましい。

水で精練する場合には、セリシン aを含む原料を水中に浸漬して行う。

この場合、水温は高い方が効率的で、大気圧下で水を沸騰させることは効果的である。

分子量の低下を防ぐため、煮沸時間は数時間以内、好ましくは 1 時間以内がよい。

セッゲンを用いて精練する場合には、たとえば濃度 0 . 3 %のマルセルセッケンなど、水溶液の p Hが 1 0以下となるようなセッケンを用いて 1 時間以内、好ましくは 3 0分以内の煮沸とする。

セリシン a とフイブ口インからなる素材は、セリシン a含有率が 5 %以上、好ましくは 2 0 %以上であることが好ましい。

繭糸等の原料を上記の方法により精練して、水に溶解しやすいセリシン d， b等を除去し、繭糸の表面がセリシン aのみで覆われた状態の繊維状素材を、そのままで、或いは織布、不織布等に加工し、手術用の糸、創傷被覆材ゃ人工血管等の医療用素材および化粧用素材として用いることができる。

または、表面を主にセリシン aで覆われた繊維状素材を上記（ 1 ) ( a ) と同様の方法により溶解、脱塩し、絹タンパク水溶液を得る。

これを平板上で乾燥してフィルム状素材を得る。あるいは噴霧乾燥して粉末状素材を得る。

また、フィルム状素材を粉碎して粉末状素材としてもよい。

以上のようにして得られたセリシン aからなる粉末状またはフィルム状素材は、創鍔被覆材、人工血管等の医療素材として、また、皮膚ケア用の化粧素材等の一部あるいは全部として利用できる。平均粒子径が 1 〜 1， 0 0 0 m . 好ましくは 1 〜 1 0 0 〃 mであれば、粉末は皮膚等の動きに柔軟に対応でき、創傷被覆剤としても利用できる。

本発明でセリシン a ( a力く 9 0 %以上）およびセリシン aを含有する素材を取得する'ための原料と'しての繭糸等とは、家蚕の吐糸した繭糸セリシンを含有する物質とする。

繭糸セリシンを含有する物質としては家蚕の繭層、繭糸、生糸、絹織編物等の未精練物、またそれらの不完全精練物およびセリシンを含有する繊維、粉末、フィルム等があり、これらの中でセリシン aが含有されている物すベてを原料として利用できる。

また、フィブロインを含まずセリシンのみを吐糸するセリシン蚕の繭も原料にすることができる。

( 5 ) 蚕体内の中部糸腺および前部糸腺液状絹からのセリシン aおよびセリシン aを含有する素材；

吐糸直前の家蚕の絹糸腺を取り出し、水中で絹糸腺を裂いて内容物である液状絹と絹糸腺細胞とを分ける。

' 絹糸腺は前部、中部、後部に分けらる。

前部、中部絹糸腺の液状絹は直径数 mmの液状フイブロインの周りを液状セリシン力く 0 . l m m〜 0 . 5 m mの厚さで覆っている。液状フイブ口イン、液状セリシンともに水に溶解するので、前部、中部絹糸腺の液状絹を水中に浸漬しておけば、セリシンとフイブ口ィンの混合水溶液が得られる。

セリシンの方が速く溶解する為、 1 0〜 3 0分間の浸漬ではセリシンを多く含む水溶液が得られるが、浸漬時間が長くなるとフィブ口ィンの割合が多くなる。

この水溶液にスプレードライの方法を用いれば、粉末が得られる o

また、凍結乾燥、あるいはアルコール等で沈澱した後に乾燥粉砕すると、粉末が得られる。

また、平板上で乾燥すれば、フィルムが得られ、このフィルムを粉砕すれば粉末が得られる。

(効果）

本発明の、家蚕が吐糸する繊維（繭糸等）から溶出して得られる

、 S D S — P A G Eによる分子量が約 4 0 0， 0 0 0 のセリシンを主体とする細胞生育促進剤（物質）は、繭糸等からほぼ未分解で溶出され取得されたものであり、繭糸等を構成するセリシンが有する細胞生育促進作用の実質的な有効成分である。

また、 S D S — P A G Eによる分子量が約 4 0 0， 0 0 0のセリシンを主体とする細胞生育促進剤（物質）は液状絹から得ることも i_d 。

この細胞生育促進剤（物質）は、細胞の生育促進作用を有することから、医療用として創傷被覆材，血管内皮形成材，臓器形成素材に，バイオ用として細胞培養床素材に、また皮膚ケア用として化粧用素材に、使用されると極めて有用である。図面の簡単な説明

第 1 図は、繭糸タンパクの電気泳動像である。第 2図は、各沈澱物の電気泳動像である。

第 3図は、分画、精製したセリシンの主要 3成分（ s— d， s— a , s _ b) の電気泳動像である。

第 4図は、繭層タンパクの電気泳動像である。

第 5図は、抽出セリシンの電気泳動像である。発明を実施するための最良の形態

以下、本発明の細胞生育促進剤の上記用途に対する有用性を示すために、それに関する実験（実施例）を行ったので述べることにする。

もっとも、本発明はこれら実施例に限定されることはない。

実施例 1

〔セリシン aの分画、精製〕

光、熱、水等の処理を行っていない吐糸後 1 ヶ月以内の家蚕繭を原料とし、繭層を約 7 0 % (重量 L i S CN ( p H 7 ) 水溶液に溶解し、濃度約 5 %の絹タンパク溶液を得た。

この絹タンパク溶液の溶媒を 5 M尿素水溶液に置換したサンプル (N) と、それに 1 %の 2—メルカプトエタノール（ME) を添加し、 S S結合を切断したサンプル（R) の S D S— P AG E ( 2 - 1 5 %グラジヱントゲル）を図 1 に示す。

図 1 は、繭糸タンパクの電気泳動像である。

2—メルカプトエタノールで還元してある繭糸タンパク（R) と還元していない繭糸タンパク（N) とする。

セリシン（ s ) 、フイブ口イン（ f ) 、マ一力一（M) とする。繭糸タンパクはフイブ口インとセリシンから成り、 S S結合を切断することで、フイブ口インは、 2成分〔H (フイブ口イン H鎖、及びフイブ口イン L鎖）〕に、セリシンは主に 4成分（ a， b， c および d ) に分かれ、これらを絹タンパ ⁽'クの主成分とみなすことができる。

絹タンパクの各成分は図 1 の Rの電気泳動像の染色濃度から見積

¾つた o

その結果を表 1 に示す。

表 1 セリシン各成分の割合

セリシンでは a と d成分が特に多く、 a， b， dの 3成分で、セリシンの約 9 5 %を占めるので、これら 3成分をセリシンの主要成分とした。

次に、前述の 5 %絹タンパク溶液を MEで還元したもの 1 0 m 1 にエチルアルコール 8 2 m 1 を 1 1 回に分けて、順次加えた。

1 回ごとに生成した沈澱物を遠心分離して回収した。

各沈澱物の電気泳動像を図 2 に示す。

図 2 は、繭糸タンパク溶解液にエタノ一ル添加による 1 1分画物の電気泳動像である。

図 2 において、セリシン dは第 1， 2沈澱物に、セリシン a は第 2〜 5沈澱物に、セリシン bは第 2〜 6沈澱物に、 'セリシン c は第 1 0〜 1 1沈澱物に存在していることが分かる。

そこで、セリシンの主要 3成分をできるだけ高純度で得るため、第 1， 3， 4， 5の各沈澱物を別々に 1 %の MEを含む 7 0 %チオシアン酸リチウム水溶液（ P H 7 ) に再度溶解し、溶解液にエタノールを順次加え再沈澱させた。

得られた沈澱物の内でセリシン d， a , bの S D S— P A G Eを図 3 に示す。図 3 は、分画、精製したセリシンの主要 3成分（ s 一 d， s - a , s — b ) の電気泳動像である。

セリシン d， aおよび bの純度は高くなり、 bが少し含まれていると思われるセリシン aにおいても電気泳動像から見積もつて純度は 9 0 %以上であった。

実施例 2

〔セリシン 3成分の細胞生育促進作用〕

セリシン 3成分について、正常なヒト皮膚由来の線維芽細胞を用いて、細胞生育促進作用の有無を調べた。

線維芽細胞は動物個体内のほとんどすべての組織中に分散して存在し、組織に外傷が加えられたり、臓器の実質細胞が失われた場合、線維芽細胞が分裂増殖して欠落した部分を修復する特徴を有する o

分画精製されたセリシン 3成分は 7 0 %チオシアン酸リチウム水溶液に溶解し、これを水で透析した。

透析はチォシアン酸イオンの濃度が 0. 0 1 M以下になるまで行い、これをポリスチレンの細胞培養容器（ 3 5 mm ø ) の底にコ一卜した。

コートは 2 5 マイクログラム/ c m ² の割合で行った。

コートされた容器は生理食塩水で洗浄後、 7 0 %エタノールで滅菌して、細胞培養容器とした。

正常ヒト皮膚由来の線維芽細胞は細胞培養液 1 m 1 に 2 0 ， 0 0 0個を懸濁させ、 2 m 1 を細胞培養容器に接種した。

5 日間培養後の細胞数をアラマ一ブルー色素法で測定した。

結果を表 2 に示す。

表 2ではセリシン aが線維芽細胞の成育を促進していることが分力、る。

セリシン d とセリシン b には細胞生育促進作用は認められない。表 2 セシリン成分の正常ヒト皮膚由来の繊維芽細胞生育促進性

実施例 3

〔セリシン aを含有する素材の細胞生育促進作用〕

家蚕の繭層を 8 M尿素中で、 8 0 °Cに 1 0分間保ちセリシンを抽 gj した 0

このセリシンの抽出液にアルコールを加え、セリシンを沈澱させ

/ o

この沈澱物は図 1 のセリシン d ， a , b , c力、ら成っている。このセリシン沈澱物を飽和チオシアン酸リチウム水溶液に溶解し、脱塩後細胞培養容器の底にコートし、ヒト正常皮膚細胞由来の線維芽細胞の生育促進作用を検討した。

この間の工程は実施例 2 と同じ方法である。

セリシンの各成分を含有する培養床で培養したヒト正常皮膚由来の線維芽細胞生育促進作用については、結果を表 3 に示す。

表 3 のように細胞生育促進作用を持つセリシン aを含有していれば、その素材は細胞生育促進作用を有する。

表 3 の試料はセリシンの各成分（セリシン d， a , bおよび c ) を含有しているが、セリシン aを含有していれば、それ以外のものはフイブ口インの成分であってもよい。

また、セリシン a以外のものは分解していてもよい。

セリシン aの確認は図 1 のように S D S— P A G Eのバンドの有無で行う。

表 3 セリシンの各成分（s- d、 s- a、 s- b、 s- c ) を含有する培養床で培養したヒト正常皮膚由来の線維芽細胞生育促進作用

実験区生育（％) 対照（ポリスチレン） 1 0 0土 8 . 3

セリシン各成分を含有する沈澱物 1 7 2 ± 1 3 . 6 実施例 4

〔絹糸にセリシン aを含有する素材の製造〕

繭糸はフィブロイン繊維の表面をセリシンが覆った状態となっている。

繭糸からセリシン dを除けば、セリシンの約 7 0 %はセリシン a となる。

そこで、家蚕の繭層を繭層重の 1 0 0倍量の水に浸漬し、煮沸し o

煮沸時間を 5 1 0 1 5 2 0 3 0 6 0分をとした時の繭層タンパクの電気泳動像を図 4 に示す。

2 0分と 3 0分後にはセリシン a とセリシン cのみフイブ口イン繊維の表面に残っているが、 1 5分後ではセリシン b も若干残っている。

一方、セリシン aは繭糸表面から離れ難いが、 6 0分後には非常に少なくなつている。

また、家蚕の繭層を繭層重の 1 0 0倍量の水に浸漬し、これに 0 . 2 gのマルセルセッケンを加え煮沸した。

煮沸時間を 5 1 0 1 5 2 0 3 0 6 0分として繭層を処 Sし、処理時間と繭糸表面のセリシン成分を電気泳動で調べた。

その結果、原料の繭層にはセリシンの各成分が見られるが、 20分と 30分後にはセリシン a とセリシン cのみフイブ口イン繊維の表面に残つていた。

6 0分後ではセリシン aは非常に少なくなっている。

したがって、繭層を水またはセッゲン水中で 1 0 6 0分程度、好ましくは 1 5 4 0分程度煮沸すれば、フイブロイン繊維表面のほとんどがセリシン a とすることができる。実施例 5

〔セリシンの分解〕

家蚕の繭層を 8 0 °Cの 8 M尿素中に 5分浸漬してセリシンを抽出した。

このセリシン抽出液を 1 0 0 °Cで 5 , 1 0， 1 5 , 2 0， 3 0，

6 0分の各時間処理した。

処理後の繭糸の電気泳動像を図 5 に示す。 '

セリシン a成分は dや b成分より分解速度が速い。

処理時間が 2 0分間ではセリシン a成分は明確に確認できるが、

3 0分の処理では非常に少なくなり、 4 5分の処理ではほとんど確認できない。

図 5 は、抽出セリシンの電気泳動像、家蚕の繭層を 8 0 °Cの 8 M 尿素中に 5分間浸漬してセリシンを抽出し、このセリシン抽出液を 1 0 0 °Cで 5， 1 0， 1 5， 2 0， 3 0， 6 0分の各時間処理した実施例 6

〔動物実験〕

この実施例は、ヘアレス犬〔日本農産工業（株）〕を用いて創傷被覆材としての効果をより詳しく調べたものである。

使用した創傷被覆材として、まず前記実施例 1 で得たセリシン a 成分 9 0 %以上の沈殿物（ a ) 、および前記実施例 3で得たセリシン各成分を含有する沈殿物（ S ) を使用した。

これらの沈澱物は、よく水洗後に凍結乾燥して、粉砕した。

粉末の平均粒子径は 1 0〜 2 0 2 mである。

また、前記実施例 4 において、家蚕繭層を水中で 15分煮沸して得たセリシン a成分含有絹糸（F a ) についても、動物実験に用いたこの場合は水洗後、繊維長を 0 . 5 m m程度以下にに裁断した。そしてまた、液状絹からセリシン含有フィルム（L— S ) を次のように作った。

家蚕（日 1 3 7 X支 1 3 7号）が吐糸直前となったとき、蚕体をアルコールで消毒し、その絹糸腺を摘出し、水で水洗後に、中部糸腺中区の液状絹を取り出し、水中に浸漬した。

' 浸漬 2 0分以内の浸漬液をブラスチック扳上で室温で送風しながら乾燥し、厚さ 3 0 mのフィルムを作った。

このフィルムのセリシン含有率は約 7 0 %で、水溶性を示す。以上の他に、比較のため、厚さ 4 0 m〃で、セリシンが 1 · 7 % 、フイブ口インが 9 8 . 3 %の水溶性を示すフィルム（ A— 1 ) を創傷被覆材としてへアレス犬で試験した。

このフィルム（ A— 1 ) は、本発明者が発明した特許第 2 9 9 0 2 3 9号における、実施例 3 の表 4 に示す A— 1 のフィルムと同様のフィルム作成工程を経て造られたフィルムである。

また、絹糸を 1 2 0 °Cの炭酸ソ一ダ水溶液に 2時間浸漬し、水洗乾燥後、粉碎して得たフイブロイン粉末（F— 1 . 8 ) 〔平均粒子径 1 . 8 m で水に水溶性を示す〕についても創傷被覆材としてへアレス犬で試験した。

このフイブ口イン粉末は、本発明者が発明した特願平 1 1 — 2 5 9 1 4 9号における実施例 3 の表 4 に示す（ 3 ) のフイブ口イン粉末と同様の条件で造られたフイブ口イン粉末である。

なお、創傷被覆材を使わない場合を対照区とした。

まず、ヘアレス犬の背部皮膚に約 1 c m ² の大きさに表皮を含め真皮まで剝離し、この創傷部をヒビデン消毒薬で消毒後、動物用抗生物質ベンジルぺニシリンプロカイン〔明治製菓（株）〕を滴下し、各創傷被覆材で被覆した。

さらに、吸収ノ、 °ッド付ポリウレタンフィルム O p S i t e 〔スミスアンドネフユ一（株）〕で覆った。

さらに、創傷被覆材の脱落を防ぐためにィヌ用ジャッケットを装

¾し 7こ。試験開始後 1週目および 2適目に、試験部位の観察記録を行った o

その結果を表 4 に示す。

ここで、「炎症部の滲出液の程度」は、一一（無し）が治癒の度合いがよいことを示し、また「表皮の再生状態」は + + + (非常にある）が治癒度の高いことを示すものである。

いづれの創傷被覆材も対照区より創傷の治癒を促進し、治癒効果があった。セリシン a成分または a成分を含有する創傷被覆材（ a 、 s、 F a ) は比較として使ったアモルファスフイブ口インフィルム（セリシン 1 . 7 %含有） A— 1 と同等かそれ以上の治癒効果がめった 0

被覆材 S と A— 1 の治癒効果は、表 4で示すようにほとんどは同じであるが、 S と A— 1 を比較すれば Sの方が A— 1 より治癒効果

(ίよのつた o 表 4

へアレス犬の創傷部に対する被覆材の治瘛観察

一：無し、一：ほとんど無し、 +：少しある、 ++：ある、 +++：非常にある

産業上の利用可能性

本発明により製造されたこの細胞生育促進剤は、細胞の生育促進作用を有することから、その細胞生育促進剤を期待できる種々の分野、例えば、医療用として創傷被覆材，血管内皮形成材，臓器形成素材に，バイオ用として細胞培養床素材に、また皮膚ケア用として化粧用素材に、広く使用可能である。

Claims

請求の範囲

1 . 家蚕が吐糸する繊維（繭糸等）から溶出して得られる、ドデシル硫酸ナトリウム—ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ S D S - P A G E ) による分子量が約 4 0 0， 0 0 0 のセリシンを主体とする細胞生育促進剤。

2. 家蚕が吐糸する繊維（繭糸等）中のセリシンを、尿素水溶液で溶解せしめた後、ドデシル硫酸ナトリウム—ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ S D S — P A G E ) による分子量が約 4 0 0， 0 0 0 のセリシンを分離回収する方法。

3. 4 M以上の尿素水溶液で溶解せしめることを請求項 2記載の分離回収する方法。

4. 家蚕が吐糸する繊維（繭糸等）を、中性塩水溶液で溶解せしめて得られる、ドデシル硫酸ナトリウム一ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ S D S— P A G E) による分子量が約 4 0 0， 0 0 0 のセリシン、および絹フイブロインを含有する細胞生育促進剤。

5. 粉末状またはフィルム状の形態を有する請求項 1， 4記載の細胞生育促進剤。

6 . 家蚕が吐糸する繊維（繭糸等）を温和な条件で精練し、低分子量のセリシンを除去することにより得られる、フイブロイン繊維表面が実質的にドデシル硫酸ナトリウム一ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ S D S — P A G E) による分子量が約 4 0 0， 0 0 0 のセリシン成分により被覆された状態の繊維状素材からなる細胞生育促進剤。

7. 家蚕が吐糸する繊維（繭糸等）を温和な条件で精練し、低分子量のセリシン成分を除去することからなる、フイブロイン繊維表面が実質的にドデシル硫酸ナトリウム一ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ S D S — P A G E ) による分子量が約 4 0 0 , 0 0 0 のセリシンにより被覆された状態の繊維状素材の製造方法。

8. できる限り中性に近い温和な p h領域で煮沸精鍊を行うこ- とを特徴とする請求項 6記載の繊維状素材の製造方法。

9. 蚕体内の中部糸腺および前部糸腺の液状絹を水中に浸漬して得られる、実質的にドデシル硫酸ナトリウム—ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ S D S— P A G E) による分子量が約 4 0 0， 0 0 0 のセリシンを主体とする細胞生育促進剤。

1 0 . 請求項 1， 4， 5 , 6，又は 9 に記載の細胞生育促進剤を、皮膚ケア素材としての化粧素材、医療用材料としての創傷被覆用素材，血管内皮形成，臓器形成素材およびバイオ材料としての細胞培養床素材に使用する方法。