CN1406276A - 含有丝胶蛋白的材料,其生产和使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的是为了阐明组成未降解丝胶蛋白的成分的生理学活性功能，以提供利用这些功能性组分的新的医学材料、化妆材料等。从家蚕释放纤维(如茧丝等)中洗脱可得到的细胞生长促进剂，其中细胞生长促进剂包含用十二烷基磺酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS－PAGE)测定具有大约400,000分子量的丝胶蛋白作为主要成分。这个细胞生长促进剂(物质)极其有效，因为当它作为医疗材料(伤口敷料材料，血管内皮形成材料和器官形成材料)，生物工程材料(细胞培养床)，或化妆材料(皮肤护理产品)时，能促进细胞的生长。

Description

含有丝胶蛋白的材料，其生产和使用方法
                         技术领域
本发明涉及含有家蚕丝胶蛋白的细胞生长促进剂，具体涉及医学材料、细胞培养床材料和化妆材料。
此外，本发明方法涉及从家蚕释放的纤维，如茧丝或类似物中获得具有使细胞生长的功能的丝胶蛋白。
                         背景技术
家蚕释放的纤维，如茧丝或类似物，包括两种蛋白，丝心蛋白和丝胶蛋白。丝胶蛋白以包裹丝心蛋白而存在。
对茧实施处理，包括进行干燥、煮沸、卷丝等，然后脱胶(丝胶蛋白remouing)。脱胶的蚕丝(丝心蛋白纤维)用作丝织物。
进一步，丝纱(silk yarn)是天然纤维中唯一的长纤维且具有极好的结晶性和高强度。因此，自从古代开始，丝纱已经被用作手术线和衣物线。
近年来，丝蛋白固有的功能已经引起了很大的注意，结果，被积极用于各种应用。
在采用丝蛋白的新材料的发展中，丝心蛋白先于丝胶蛋白。然而，近年来，基于有关丝心蛋白的成就，另一种丝蛋白，丝胶蛋白也成为研究和发展的对象。
例如，报道了包含表面被丝胶蛋白水解产物覆盖的基质的化妆粉(JP-A-10-226626)，含有丝心蛋白分散体和/或丝胶蛋白水溶液浸渍的纤维素纤维的化妆品(JP-A-11-152206)，含有丝胶蛋白水解产物作为活性成分的皮肤刺激抑制剂(JP-A-10-245345)，用于预防衰老的胶原产生促进剂和皮肤外用制剂，都含有丝胶蛋白水解产物作为活性成分(JP-A-10-226653)，含有丝胶蛋白水解产物和酵母降解产物的皮肤外用制剂(JP-A-11-193210)和包含由家蚕丝蛋白(丝心蛋白和/或丝胶蛋白)制成的膜的细胞培养床(Minouara等，Attachment and growth of cultured fibroblast cells on silk protein matrices，J.Biomedical Materials Res.，29卷，1215-1221(1995))。
另一方面，当使用从脱胶废液中回收丝胶蛋白的常规方法作为从茧丝或类似物中获得丝胶蛋白的方法时，只能得到具有低分子量如平均分子量50,000或更低的产物(JP-A-1-168906，JP-A-4-202435等)。
简言之，由于丝胶蛋白在茧丝中是结晶化的，它很难溶于水。然而，通过在热碱水中降解，它已经被除去。
近来已经可高效获得具有高分子量如平均分子量100,000或更高的丝胶蛋白(JP-A-11-92564，JP-A-11-131318等)，而且已经开发了一种方法，从茧丝或类似物中洗脱(elute)丝胶蛋白和类似物，以控制分子量降低(JP-A-11-228837，JP-2000-38514等)。
长久以来认为家蚕中的丝胶蛋白是具有从几万到几十万分子量蛋白的混合物。因为它巨大，因此，容易形成聚集或变得不溶，这很难处理。
由于这个原因，未降解状态的级分和纯化物由什么类型的蛋白成分组成的问题仍未得到解决。
进一步，在多数提出例如生理学活性功能的常规报道中，在提取步骤中分子量发生降低。
既然我们近来已经在提取和分极分离未降解丝胶蛋白中取得成功，这些分级成分的应用研究已成为一个主要问题。
本发明的目的是检测组成未降解丝胶蛋白的成分的生理学活性，并提供利用这些功能性组分的新的医学材料、化妆材料和类似物。
                          发明详述
(解决问题的方法)
为了解决上面描述的问题，本发明首先研究了组成未降解丝胶蛋白的丝胶蛋白分子量和生理学活性之间的关系。结果，获得信息是组成未降解丝胶蛋白的成分中，具有特定分子量的丝胶蛋白具有极高的细胞生长促进作用。
本发明是基于上面的信息创造的且包括下列组成：
即，本发明提出(1)从释放纤维(茧丝或类似物)中洗脱可得到的细胞生长促进剂，其中细胞生长促进剂包含用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定的具有大约400,000分子量的丝胶蛋白作为主要成分。
本发明也提出(2)一种方法，包括将家蚕释放纤维(茧丝或类似物)中含有的丝胶蛋白溶解于尿素水溶液中，然后分离和回收用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定的具有大约400,000分子量的丝胶蛋白。
本发明还提出(3)根据权利要求2的分离和回收方法，其中丝胶蛋白溶于浓度为4M或更高的尿素水溶液中。
进一步，本发明也提出(4)将家蚕释放纤维(茧丝或类似物)溶解于中性盐的水溶液可得到的细胞生长促进剂，其中细胞生长促进剂包含用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定的具有大约400,000分子量的蚕丝丝心蛋白和丝胶蛋白。
进一步，本发明也提出(5)细胞生长促进剂，其中细胞生长促进剂是粉末或膜的形式。
进一步，本发明也提出(6)在温和条件下，将家蚕释放纤维(茧丝或类似物)进行脱胶，并除去低分子量的丝胶蛋白可得到的细胞生长促进剂，其中细胞生长促进剂包含纤维材料，其所处状态是丝心蛋白丝的表面被十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定的具有大约400,000分子量的丝胶蛋白成分包裹。
进一步，本发明也提出(7)一种生产纤维材料的方法，纤维材料所处状态是其丝心蛋白丝的表面被十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定的具有大约400,000分子量的丝胶蛋白成分包裹，该方法包括在温和条件下，将家蚕释放纤维(茧丝或类似物)进行脱胶，并除去低分子量的丝胶蛋白。
进一步，本发明也提出(8)一种生产纤维材料的方法，其中在尽可能接近中性的温和pH范围内煮沸精炼(scouring by boiling)。
进一步，本发明也提出(9)蚕体内中绢丝腺和前绢丝腺中(anterior silkgland)含有的液态丝浸渍可得到的细胞生长促进剂，其中细胞生长促进剂包含用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定的具有大约400,000分子量的丝胶蛋白作为实质性主要成分。
进一步，本发明也提出(10)一种方法，使用上述细胞生长促进剂作为皮肤护理材料用于化妆材料；作为医学材料用于伤口敷料材料，血管内皮形成材料和器官形成材料；和作为生物材料用于细胞培养床材料。
(发明的实施方式)
(1)组成未降解丝胶蛋白的各种类型丝胶蛋白的分离和鉴定
(a)未降解丝胶蛋白的获得
由于使用以酸性或碱性水溶液或酶处理作为分离茧丝或类似物中的丝胶蛋白的方法的常规洗脱方法，会导致由水解引起的分子量降低，因此不能采用这些洗脱方法。
因此，通过将茧丝或类似物与丝心蛋白一起溶于中性盐的水溶液如硫氰酸锂中，来制备包含丝心蛋白和丝胶蛋白的丝蛋白溶液。
通过这种使用中性盐的水溶液的溶解方法，由于水解引起的分子量降低得到抑制，能够得到含有近似未降解丝胶蛋白的丝蛋白溶液。接着用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)方法，对所得含有未降解丝胶蛋白的丝蛋白溶液进行分子量检测和丝胶蛋白的分离。
(十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳以下简称为SDS-PAGE。)
对于上面提及的使用中性盐的水溶液的溶解方法中使用的中性盐的水溶液，可提及硫氰酸锂，溴化锂，氯化钙，硝酸钙和类似物，而且尤其，优选硫氰酸锂和溴化锂。
将茧丝或类似物加入到浓缩的中性盐水溶液中并溶解。
在溶解过程中，选择尽可能多地抑制丝蛋白分子量降低的温和条件。
采用的中性盐的水溶液浓度为50％饱和度或更高。加热温度设置在从室温到80(℃)的范围内。
由于如果温度超过80(℃)，将会发生分子量降低，因此优选在考虑溶解时间和中性盐的水溶液类型的情况下，温度尽可能地低。
在考虑到如中性盐类型、温度等条件的情况下，溶解时间确定在从1至20分钟的范围内，以使茧丝能够完全溶解且没有发生分子量降低。
透析含有溶解的丝蛋白的中性盐的水溶液，以形成纯丝蛋白水溶液。
(b)电泳测定分子量
通过电泳将丝蛋白分离为两种成分的丝心蛋白(H和L)和四种成分的丝胶蛋白(a、b、c和d)。
茧丝或类似物溶于前述中性盐的水溶液中并用5M(5mol/l)尿素溶液替换而得到的溶液，用还原试剂，如2-巯基乙醇(ME)进行处理以打破交联键(蛋白的S-S键)。
对生成物进行SDS-PAGE测定组成茧丝的每个蛋白成分的分子量。
电泳测定显示丝胶蛋白a具有大约400,000的分子量，丝胶蛋白d具有大约250,000的分子量，丝胶蛋白b具有大约200,000的分子量和丝胶蛋白c具有大约35,000的分子量，分别占茧层丝胶蛋白的大约45％、大约34％、大约15.5％和大约5.3％。
(2)包含丝胶蛋白a成分的材料的制备：
在常压下，加热尿素水溶液中的茧丝或类似物而洗脱丝胶蛋白a成分。
尿素水溶液具有4M或更高的浓度，优选7M至饱和，并在70至100℃保存3至30分钟优选5至30分钟来提取丝胶蛋白。
尿素水溶液的浓度较低更好，因为尿素水溶液的浓度越低，尿素量越少且费用越低。
然而，如果尿素浓度低，尤其是，丝胶蛋白的溶解减少则提取的丝胶蛋白a的量降低。因此，为了达到快速提取和回收大量丝胶蛋白a，推荐设置尿素浓度为4M或更高。
如果加热温度低，很难提取丝胶蛋白，而高加热温度导致丝胶蛋白降解和分子量降低。
如果提取时间短，很难提取丝胶蛋白，而如果时间长，丝胶蛋白会降解。
向尿素水溶液中添加1％或更多还原试剂，如ME，能够提高丝胶蛋白的回收率。
向以上述方式得到的丝胶蛋白溶液中加入有机溶剂，如甲醇、乙醇和丙酮，以3至5倍的体积加入，因此获得未降解丝胶蛋白的沉淀物。
生成物溶于中性盐的水溶液中，如含1％或更高还原试剂如ME或类似物的硫氰酸锂，然后接连加入有机溶剂如乙醇，以形成沉淀，当用SDS-PAGE检测时，被分级分离为各种类型的丝胶蛋白。
通过重复进行包括沉淀物的溶解和沉淀的操作，获得丝胶蛋白a含量为90％或更高的丝蛋白。
可供选择地，丝胶蛋白a含量为90％或更高的丝蛋白的获得是通过用还原试剂(如ME或类似物)处理由茧丝或类似物溶于中性盐的水溶液如硫氰酸锂而得到的含有丝心蛋白的丝蛋白溶液，随后重复用有机溶剂如乙醇沉淀和用含ME的硫氰酸锂水溶液溶解，来分级丝蛋白成分。
将通过重复溶解和沉淀纯化的丝胶蛋白a溶于中性盐的水溶液如硫氰酸锂中，然后通过透析或类似方法除去盐分。
喷雾干燥纯化和除去盐分的丝胶蛋白a水溶液以产生粉状材料。
进一步，在平板上干燥纯化和除去盐分的丝胶蛋白a水溶液，产生膜样材料。
可以将膜样材料粉碎成粉状材料。
上面得到的粉状或膜样材料包含丝胶蛋白a成分，可以以其完整或一部分用作细胞培养床材料等的生物学应用，用作伤口敷料材料、血管内皮形成(人工血管)、形成器官的材料等的医学应用，和用作化妆材料的皮肤护理应用。
如果粉末具有平均1至1000μm的微粒直径，它能够跟随皮肤的移动或类似的灵活性，并且因此也能够用作伤口敷料材料。
(3)包含丝胶蛋白a和丝心蛋白的材料的制备
当含有丝胶蛋白a的材料具体以膜样材料应用时，最好不是必需使用仅由丝胶蛋白a成分制成的材料作为伤口敷料材料或医学材料，如人工血管可接受的材料，因为其强度不满意。
如果组成茧丝的另一种蛋白成分且由生物相容性好和强度好的丝纱组成的丝心蛋白与丝胶蛋白a组合使用，可获得更适合用于医学材料如伤口敷料材料和人工血管的材料。
在丝胶蛋白a和丝心蛋白联合使用的方案中，可使用包含丝胶蛋白a的水溶液和丝心蛋白水溶液混合得到的丝胶蛋白a-丝心蛋白混合水溶液，丝胶蛋白水溶液是由丝纱溶于中性盐的水溶液如锂盐中制备的。
对于中性盐的水溶液，5M和更高的硫氰酸锂水溶液，优选具有大约9M浓度的饱和水溶液是有效的。
溶剂相对于生丝材料的量越大，生丝材料越容易溶解，但纯化、去盐等的效率变得越低。
因此，如果溶剂相对于生丝材料的量降低得尽可能多，丝蛋白能高效回收。
由于这个原因，期望中性盐的水溶液相对于生丝材料的量至少7倍，优选是生丝材料的9至50倍。
用水进行透析去除溶液的盐分。
实施透析直到加入AgNO3，透析外液体不形成沉淀。
通过这种操作，得到了丝胶蛋白a-丝心蛋白混合水溶液。
得到的混合水溶液在平板上干燥形成膜样材料。
当形成膜时，最好尽可能迅速进行透析，特别是，在三天内，优选在两天内。
如果透析花费很多天，形成膜变得困难，因为丝蛋白形成凝胶并变成大块。
通过使丝蛋白水溶液在塑料特别是丙烯酸平板上流动使丝蛋白水溶液形成膜并迅速干燥，使结晶度小于10％。
例如，优选在传送空气时，在60％RH(相对湿度)或更低的RH室内进行干燥。
结晶度10％或更高的膜可吸水性低，并因此，当置于伤口上时，它不能充分吸收伤口的渗出液，且变得不能易曲。因此它可能破坏伤口。
由于这个原因，它不适于伤口敷料材料。
粉状材料可通过喷雾干燥预先脱盐的丝胶蛋白a-丝心蛋白混合水溶液，通过冷冻干燥混合水溶液，或通过用乙醇或类似物沉淀，干燥，然后粉碎而得到。
它也可通过粉碎膜样材料而获得。
由于粉末的形状与膜不同，当粉末的结晶度在0至100％范围内时，它可用作伤口敷料材料。
(4)包含表面被丝胶蛋白a成分包裹的丝心蛋白的纤维材料
当生丝材料如茧丝等脱胶时，在第一阶段除去易于溶解于水的丝胶蛋白d和b。在已经去除大约40％丝胶蛋白的阶段，茧丝表面几乎由丝胶蛋白a组成，因此，优选使用在此阶段完成脱胶的生丝。
当煮沸使生材料如茧丝等脱胶时，脱胶溶液的pH值离中性越远，越容易获得丝胶蛋白。然而，在这种情况下，由于发生降解和分子量降低，优选在尽可能接近中性的温和pH范围内进行脱胶。
当使用水进行脱胶时，将含有丝胶蛋白a的生材料浸于水中实施脱胶。
在这种情况下，水温越高，效率越高。在常压下煮沸水是有效的。
为了防止分子量降低，沸腾时间优选几个小时或更短，更优选一个小时或更短。
当使用肥皂进行脱胶时，使用pH显示10或更低的肥皂水溶液，如浓度0.3％的马赛皂，煮沸一个小时或更短，优选30分钟或更短。
在包含丝胶蛋白和丝心蛋白的材料中，优选丝胶蛋白a的含量是5％或更高，更优选20％或更高。
茧丝表面仅被丝胶蛋白a覆盖，且用上述方法使生丝材料如茧丝或类似物脱胶并除去丝胶蛋白d和b得到的易溶于水的纤维材料可以用作医学材料，如手术线、伤口敷料材料和人工血管，以及化妆材料而被接受或在被加工成纺织织物、非纺织织物或类似物被接受。
可供选择地，用上面(1)(a)中描述的类似方法，通过将表面主要被丝胶蛋白a覆盖的纤维材料溶解和去盐而得到丝蛋白水溶液。
在平板上干燥所得溶液，得到膜样材料。
可供选择地，通过喷雾干燥该溶液得到粉状材料。
进一步，膜样材料可以粉碎成粉状材料。
上面得到的包含丝胶蛋白a的粉状或膜样材料能以完整或部分形式用作医学材料，如伤口敷料材料和人工血管或用作化妆材料的皮肤护理应用。
如果粉末具有平均1至1000μm的微粒直径，优选1至100μm，它能够跟随皮肤的移动或类似的灵活性，并且因此也能够用作伤口敷料材料。
在本发明中，作为生丝材料用于获得丝胶蛋白a(纯度是90％或更高)和含有丝胶蛋白a材料的茧丝或类似物，定义为含有家蚕释放的茧丝丝胶蛋白的物质。
含有茧丝丝胶蛋白的物质包括未脱胶材料如家蚕的茧层、茧丝、生丝、纺织或编织丝织物、它们的未完全脱胶材料、和含丝胶蛋白的纤维、粉末和膜。在这些材料中，那些含有丝胶蛋白a的所有材料能被用作生丝材料。
进一步，仅释放丝胶蛋白不含丝心蛋白的“丝胶蛋白蚕”的茧也能被用作生丝材料。
(5)来自蚕体的中绢丝腺和前绢丝腺液态丝的丝胶蛋白a和含有丝胶蛋白a的材料；
就在释放丝之前，取出家蚕的绢丝腺并在水中撕破。其内容物，即，液态丝和绢丝腺细胞被分离。
绢丝腺被分为前部，中部和后部。
前绢丝腺和中绢丝腺中含有的液态丝中，直径几个毫米的液态丝心蛋白被覆盖着0.1mm至0.5mm厚的液态丝胶蛋白。
由于液态丝心蛋白和液态丝胶蛋白都可溶于水，含有丝胶蛋白和丝心蛋白的混合水溶液可通过浸渍前和中绢丝腺的液态丝而得到。
由于丝胶蛋白溶解较快，通过10至30分钟的浸渍能得到含有很多丝胶蛋白的水溶液。浸渍时间延长导致丝心蛋白比例增加。
如果将喷雾干燥方法应用于这种水溶液，可得到粉末。
可供选择地，也可通过冷冻干燥或用乙醇或类似物沉淀，随后干燥和粉碎而得到粉末。
如果在平板上干燥溶液，能够得到膜。粉碎膜可得到粉末。
(效果)
根据本发明的含有以家蚕释放的纤维(如茧丝或类似物)中洗脱得到的，用SDS-PAGE测定具有大约400,000分子量的丝胶蛋白作为主要成分的细胞生长促进试剂(物质)，是从保持几乎未降解的茧丝或类似物中洗脱得到的物质。细胞生长促进剂是组成茧丝或类似物的丝胶蛋白所具有的对细胞生长起促进作用的实质活性成分。
进一步，含有以SDS-PAGE测定具有大约400,000分子量的丝胶蛋白作为主要成分的细胞生长促进剂(物质)也可从液态丝中得到。
细胞生长促进剂(物质)具有促进细胞生长的作用，并因此，当用于伤口敷料材料、血管内皮形成材料和形成器官的材料的医学应用，用于细胞培养床材料的生物应用和化妆材料的皮肤护理应用时，极其有效。
                       附图说明
图1是茧丝蛋白的SDS-PAGE；
图2是沉淀物的SDS-PAGE；
图3是分级和纯化的丝胶蛋白的三个主要成分(s-d，s-a，s-b)的SDS-PAGE；
图4是茧层蛋白的SDS-PAGE；和
图5是提取的丝胶蛋白的SDS-PAGE。
                    发明的具体实施方式
为了表明本发明的细胞生长促进剂在上述应用中的实用性，实施了有关的实验(实施例)。这些实验将在下面描述。
本发明不限于这些实施例。
实施例1
[丝胶蛋白a的分级分离和纯化]
使用丝释放一个月内的家蚕茧作为生丝材料，不用光、热、水或类似进行处理，茧层溶于大约70％(重量％)LiSCN(pH7)水溶液，因此产生具有浓度大约5％的丝蛋白水溶液。
图1显示了用5M尿素水溶液替换上面的丝蛋白溶液得到样本(N)和向样本(N)中添加1％的2-巯基乙醇(ME)以打破SS键的样本(R)的SDS-PAGE(2-15％梯度胶)。
图1是茧丝蛋白的SDS-PAGE。
用2-巯基乙醇还原的茧丝蛋白用(R)符号表示，未被还原的茧丝蛋白用(N)符号表示。
丝胶蛋白、丝心蛋白和标准分别用(s)、(f)和(M)符号表示。
茧丝蛋白包括丝心蛋白和丝胶蛋白。SS将破坏后，丝心蛋白被分成两个成分[H(丝心蛋白H链和丝心蛋白L链)]，丝胶蛋白被分成四个成分(a，b，c和d)。可认为这些是丝蛋白的主要成分。
从图1中R的条带染色程度估计丝蛋白的每个成分。
结果在表1中显示。
表1
丝胶蛋白成分的比例
   成分    比例
   s-a    45.0
   s-d    34.2
   s-b    15.5
   其它    5.3
在丝胶蛋白中，成分a和d的含量特别高。由于三个成分a、b和d占大约95％，因此这三个成分定义为丝胶蛋白的主要成分。
随后，向10ml用ME还原的上述5％丝蛋白溶液中分11份接连加入82ml乙醇。
每次添加之后，离心分离形成的沉淀并回收。
每一沉淀的SDS-PAGE在图2中显示。
图2是乙醇加入丝蛋白溶液中得到的11个级分的SDS-PAGE。
在图2中，发现丝胶蛋白d出现在第一个和第二个沉淀中，丝胶蛋白a出现在第二至第五个沉淀中，丝胶蛋白b出现在第二至第六个沉淀中，和丝胶蛋白c出现在第十至第十一个沉淀中。为了获得尽可能高纯度的丝胶蛋白的三个主要成分，第一、第三、第四和第五个沉淀各自重新溶解于含1％ME的70％硫氰酸锂水溶液(pH7)中，并加入乙醇再次沉淀。
在得到的沉淀中，丝胶蛋白d、a和b的SDS-PAGE在图3中显示。图3是分级分离和纯化的丝胶蛋白的三个主要成分(s-d，s-a，s-b)的SDS-PAGE。
丝胶蛋白d、a和b的纯度变高，估计预期含有少量b的丝胶蛋白a经过SDS-PAGE后，具有90％或更高的纯度。
实施例2
[丝胶蛋白的三个成分的细胞生长促进作用]
对于丝胶蛋白的三个成分，使用来源于正常人皮肤的成纤维细胞检测细胞生长促进作用的存在。
成纤维细胞分散存在于动物体内几乎所有的组织中，它具有的特征是当组织受到创伤或器官的实质细胞(parenchymal cell)丧失时，通过细胞分裂来繁殖细胞修复丢失部分。
分级分离和纯化的丝胶蛋白的三个成分溶于70％硫氰酸锂水溶液中，生成物用水透析。
透析进行到硫氰酸离子的浓度变为0.01M或更低，聚苯乙烯的细胞培养容器(35mmφ)底部用生成溶液涂布。
涂布以25微克/cm2的比例进行。
用生理盐水溶液洗涤被涂布的容器，然后用70％乙醇消毒，用作细胞培养容器。
来源于正常人皮肤的数量为20,000个的成纤维细胞悬于1ml细胞培养液中，所得2ml液体接种于细胞培养容器中。
培养五天后，用Alamar Blue染料法测定细胞数量。
结果在表2中显示。表2显示了丝胶蛋白a能促进成纤维细胞的生长。观察到丝胶蛋白d和b不具有细胞生长促进作用。
表2
丝胶蛋白成分促进来源于正常人皮肤的成纤维细胞的生长的作用
    测试区     生长(％)
    对照(聚苯乙烯)s-as-ds-b     100±7.1305±10.295±16.5111±7.3
实施例3
[含丝胶蛋白a的材料的细胞生长促进作用]
家蚕的茧层在8M尿素中，80℃保存10分钟，从而提取。
向丝胶蛋白的提取物中加入乙醇，从而沉淀丝胶蛋白。
这种沉淀包含图1中所示的丝胶蛋白d、a、b和c。
这种丝胶蛋白沉淀溶于饱和的硫氰酸锂水溶液中，去盐后，加到细胞培养容器底部。调查促进来源于正常人皮肤的成纤维细胞的生长的作用。
调查步骤与实施例2中所做的相同。
有关含丝胶蛋白任何一种成分的培养床中培养的来源于正常人皮肤的成纤维细胞的促进生长作用，结果显示在表3中。
如表3所示，如果一种材料含有细胞生长促进活性的丝胶蛋白a，那么该材料具有细胞生长促进作用。
表3中的样本含有丝胶蛋白成分(丝胶蛋白d、a、b和c)。然而，如果含有丝胶蛋白a，其它丝胶蛋白也可以是丝心蛋白的成分。
进一步，除丝胶蛋白a之外的成分可以降解。
丝胶蛋白a的鉴定基于如图1所示的SDS-PAGE条带的出现。
表3
含丝胶蛋白成分(s-d、s-a、s-b和s-c)的培养床中培养的来源于正常人皮肤的成纤维细胞的促进生长作用
    测试区     生长(％)
    对照(聚苯乙烯)     100±8.3
    含有丝胶蛋白成分的沉淀     172±13.6
实施例4
[含有丝胶蛋白a丝纱的材料的制备]
茧丝处于丝心蛋白纤维表面被丝胶蛋白覆盖的状态。
如果从茧丝中去除丝胶蛋白d，大约70％的丝胶蛋白是丝胶蛋白a。
这里，将家蚕的茧层浸入重量是茧层重量100倍的水中并煮沸。
分别使煮沸时间为5、10、15、20、30和60分钟，得到的茧层蛋白的SDS-PAGE在图4中显示。
20分钟和30分钟后，只有丝胶蛋白a和丝胶蛋白c停留在丝心蛋白纤维的表面，但15分钟后，也保留着少量丝胶蛋白b。
另一方面，丝胶蛋白a难以脱离茧丝表面，但60分钟后，其量非常少。
进一步，将家蚕茧层浸入其量是茧层量100倍的水中，向其中加入0.2g马赛皂并煮沸。
煮沸时间为5、10、15、20、30和60分钟来处理茧层。电泳检测处理时间和茧丝表面的丝胶蛋白成分。
结果，在生丝材料的茧层中发现了丝胶蛋白的每种成分，但在20分钟和30分钟后，只有丝胶蛋白a和丝胶蛋白c停留在丝心蛋白纤维表面。
60分钟后，丝胶蛋白a的量非常少。
因此，如果茧层在水或肥皂水中煮沸大约10至60分钟，优选大约15至40分钟，存在于丝心蛋白纤维表面的几乎所有成分都是丝胶蛋白a。
实施例5
[丝胶蛋白的降解]
将家蚕茧层浸入8M尿素中5分钟，由此提取丝胶蛋白。
在100℃处理这种丝胶蛋白提取物5、10、15、20、30和60分钟。
图5显示了处理后茧丝的SDS-PAGE。
丝胶蛋白a成分降解比成分d和b快。
如果处理时间是20分钟，能清晰检测到丝胶蛋白a成分，但处理30分钟后，丝胶蛋白a成分的量已变得很少，处理45分钟后，几乎不能发现丝胶蛋白a成分。
图5显示了提取的丝胶蛋白的SDS-PAGE。家蚕的茧层浸入8M尿素中，在80℃下5分钟，由此提取丝胶蛋白。在100℃下处理这种丝胶蛋白提取物5、10、15、20、30和60分钟。
实施例6
[动物实验]
在这个实施例中，使用无毛狗(NOSAN Corp.)详细检测作为伤口敷料材料的效果。
使用上面实施例1中得到的含90％或更多丝胶蛋白a的沉淀(a)，和实施例3中得到的含丝胶蛋白每个成分的沉淀(S)用作伤口敷料材料。
用水充分洗涤这些沉淀，冷冻干燥并压成粉末。
粉末的平均微粒直径是10至20μm。
进一步，动物实验中也使用上面实施例4中家蚕茧层在水中煮沸15分钟得到的含有丝胶蛋白a成分的丝纱(Fa)。
在这个情况下，将丝纱切成长度大约0.5mm或更短的丝纱。
以下列方式从液态丝中制备含丝胶蛋白的膜(L-S)。
在家蚕(日本137×中国137)到达就要释放丝之前，用乙醇消毒蚕体。取出绢丝腺，用水洗涤。取出中绢丝腺的中间部分含有的液态丝，浸入水中。
在塑料板上室温下通风干燥浸渍20分钟内得到的浸渍液，以形成30μm厚的膜。
该膜含有大约70％的丝胶蛋白且显示出水溶性。
除上所述，为了对比，使用无毛狗检测包含1.7％丝胶蛋白和98.3％丝心蛋白且显示出水溶性的40μm厚的膜(A-1)作为伤口敷料材料。
膜(A-1)是通过类似于本发明人发明的日本专利No.2990239实施例3中表4所示的膜A-1使用的成膜步骤制备的。
进一步，也使用无毛狗检测丝纱浸入120℃的碳酸钠水溶液中2小时，用水洗涤，干燥然后压成粉末得到的丝心蛋白粉末(F-1.8)[平均颗粒直径1.8μm且显示出水溶性]作为伤口敷料材料。
这种丝心蛋白粉末是在与本发明人发明的日本专利申请No.Hei 11-259149的实施例3中表4所示的丝心蛋白粉末(3)相同的条件下制备的。
没有使用伤口敷料材料的例子用作对照区。
首先，去除无毛狗背部皮肤的表皮和真皮，每个大约1cm2大小，用消毒剂Hibitane消毒伤口，滴一滴MEIJI SEIKA KAISHA，LTD.生产的动物抗生素苄青霉素普鲁卡因，用伤口敷料材料覆盖伤口。
进一步，用Smith & Nephew生产的OpSite带吸收垫的聚氨酯膜覆盖伤口。
此外，为了防止伤口敷料材料掉下，给狗放置一个护套。
观察
在测试开始后一周和两周的日子，观察测试部位并记录。
结果在表4中显示。
在表4中，“炎症区的渗出量”项中出现的符号“--”(无)是指令人期望的治愈情况，而“表皮再生”项(明显)中出现的符号“+++”(极好)是指明显的治愈情况。
所有伤口敷料材料促进伤口治愈优于对照区且显示出治愈效果。含有a成分的丝胶蛋白a成分或伤口敷料材料(a、s、Fa)显示出等于或优于作为对照的无定形丝心蛋白膜(含1.7％丝胶蛋白)A-1所显示的治愈效果。
如表4所示，敷料材料S和A-1的治愈效果几乎相同，但，比较S和A-1，S比A-1的治愈效果好。
表4
有关无毛狗伤口的敷料材料治愈情况的观察。
    受伤后天数     组织情况                          伤口敷料材料
    7天     炎症区渗出量 a-- S- Fa-- L-S-- A-1- F-1.8+ 对照区++
    表皮再生 + + + + + - --
    14天     炎症区渗出量 -- -- -- -- -- - +
    表皮再生 +++ ++ ++ ++ ++ ++ +
--：无，-：罕见，+：一些，++：  中等，+++：明显
工业实用性
由于本发明产生的上述细胞生长促进剂具有促进细胞生长的作用，因此它能广泛用于期望细胞生长促进剂的各种领域，例如，用于伤口敷料材料、血管内皮形成材料和器官形成材料的医学用途，细胞培养基材料的生物学用途，或化妆材料的皮肤护理用途。

Claims (10)

1.通过洗脱家蚕释放的纤维(茧丝或类似物)可得到的细胞生长促进剂，其中该细胞生长促进剂包含分子量大约为400,000的丝胶蛋白作为主要成分，所述分子量用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定。
2.一种方法，包括将家蚕释放的纤维(茧丝或类似物)中包含的丝胶蛋白溶于尿素水溶液中，然后分离和回收具有分子量大约400,000的丝胶蛋白，所述分子量用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定。
3.权利要求2的分离和回收方法，其中将丝胶蛋白溶于4M或更高浓度的尿素水溶液中。
4.通过将家蚕释放的纤维(茧丝或类似物)溶于中性盐的水溶液可得到的细胞生长促进剂，其中该细胞生长促进剂含有蚕丝丝心蛋白和分子量大约400,000的丝胶蛋白，所述分子量用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电冰(SDS-PAGE)测定。
5.权利要求1或4的细胞生长促进剂，其中该细胞生长促进剂具有粉末或膜的形式。
6.通过在温和条件下，精炼家蚕释放的纤维(茧丝或类似物)，并除去低分子量的丝胶蛋白可得到的细胞生长促进剂，其中该细胞生长促进剂包含一种纤维材料，其所处状态是丝心蛋白丝的表面被大约400,000分子量的丝胶蛋白成分包裹，所述分子量用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定。
7.一种生产纤维材料的方法，该纤维材料所处状态是其丝心蛋白丝的表面被大约400,000分子量的丝胶蛋白成分包裹，所述分子量用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定，该方法包括在温和条件下，精炼家蚕释放的纤维(茧丝或类似物)，并除去低分子量的丝胶蛋白。
8.权利要求6的生产纤维材料的方法，其中通过煮沸进行的精炼是在尽可能接近中性的温和pH范围内进行。
9.通过浸渍蚕体内的中绢丝腺和前绢丝腺中含有的液态丝可得到的细胞生长促进剂，其中细胞生长促进剂包含大约400,000分子量的丝胶蛋白作为实质性主要成分，所述分子量用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定。
10.使用根据权利要求1、4、5、6或9的细胞生长促进剂作为皮肤护理材料用于化妆材料；作为医疗用材料用于伤口敷料材料、血管内皮形成材料和器官形成材料；和作为生物材料用于细胞培养床材料的方法。
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