WO2001068881A2 - Dna-sequenz und verfahren zur invivo-markierung und analyse von dna/chromatin in zellen - Google Patents

Dna-sequenz und verfahren zur invivo-markierung und analyse von dna/chromatin in zellen Download PDF

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Waldemar Waldeck
Gabriele MÜLLER
Angel Alonso
Jörg LANGWOSKI
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Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts
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    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Definitions

  • the present invention relates to a method for in vivo labeling of DNA / chromatin structures in a cell, which is characterized in that a DNA sequence, preferably inserted into an expression vector, is expressed in the cell, which comprises a histone protein and a fusion protein encoding fluorescent protein.
  • the present invention also relates to a method for analyzing the DNA structure, chromatin structure, core structure, cell structure or cell dynamics, apoptosis, etc., which is based on this in vivo marking.
  • the fusion protein is also linked to a "His tag", which allows simple isolation of histone proteins from cells. These histone proteins can then be used as "purified" histones.
  • the invention further relates to a DNA sequence encoding a fusion protein comprising a histone protein and a fluorescent protein.
  • DNA / chromatin structure or DNA / chromatin dynamics in cell nuclei is essential.
  • counter-staining of DNA / chromatin in the cell nucleus has been carried out for certain applications. This also allows the location of certain proteins, metabolites or other substances to be determined.
  • the in vivo labeling of DNA / chromatin also allows, for example, the investigation of (a) structure / functional relationships in the cell nucleus under the influence of chemical substances or physical influences (e.g.
  • the main disadvantages of the studies which have been carried out to date by observing the DNA / chromatin structure include, for example, the findings that (a) these cannot generally be carried out in vivo, with respect to mitosis so far only observations on metaphase chromosomes being possible (b) the fixation of the cells leads to strong structural changes and the generation of a number of artifacts, (c) the time required (e.g. compared to a morphological assessment in vivo under the microscope) is significantly longer, (d) the examinations without cell consumption do not occur the same cells can be continued and (e) this is associated with high costs since, for example, additional substances (or kits) and possibly also more cells are required.
  • the present invention is therefore based on the technical problem, these disadvantages of those used in the prior art
  • a method ie to provide a method for labeling (and observing) or documenting the DNA / chromatin structure and / or DNA / chromatin dynamics, which allows in vivo analyzes of the problems listed above, does not lead to the generation of artifacts, and the investigations are continued Allowed without cell consumption on the same cells and ultimately leads to cost and time savings.
  • the above problem can be solved by labeling the histone proteins of chromatin with a fluorescent protein.
  • the cells are transfected with a DNA sequence which encodes a fusion protein (histone XFP) comprising a histone protein and fluorescent protein, which is expressed in the cell.
  • histone XFP a fusion protein
  • the fusion protein is transported into the cell nucleus and incorporated into the nucleosome like a natural histone (without a label) due to the fact that histones have a nuclear localization signal.
  • the chromatin (and therefore the DNA) is thus fluorescence-labeled via the histone protein.
  • this method is also suitable for controlling gene transfer and gene therapy experiments.
  • the method is also suitable for controlling genome transfer and cell fusion experiments, one cell line / cell (the donor / donor cell line / cell) expressing the histone fusion protein and another cell line / cell (the acceptor / recipient cell line / cell) does not ,
  • the previously separated genomes can be distinguished by the histone fusion protein label. This applies to every cell cycle phase and in particular to mitosis, or genome transfer and cell fusion during mitosis.
  • the method according to the invention is also useful for labeling, isolating and purifying certain histones, which can be achieved, for example, by further coupling a "His tag" to the fusion protein.
  • Histones have been labeled by non-specific labeling with fluorescent dyes, for example using a dye Succinimidyl ester, which is bound non-specifically by all sterically accessible lysines via transesterification and the formation of an acid amide bond to the NH side group.
  • the method according to the invention achieves the following: (a) The labeling of the histones is specific, (b) the labeling per histone molecule is carried out with exactly one dye molecule (at a defined position), which allows precise concentration control / quantification, (c) the isolation of the histones is essential more specifically and easily possible, ie in one step and thus much more gently, and (d) the histone-XFP fusion proteins can be used immediately after isolation and do not have to be labeled with great effort. This results in significant time and cost savings.
  • one embodiment of the present invention relates to a method for in vivo labeling of DNA / chromatin structures in a cell, which is characterized in that a DNA sequence is expressed in the desired cell which comprises a fusion protein comprising a histone protein and a fluorescent protein coded.
  • the DNA sequence is preferably inserted on an expression vector, the expression vector preferably being a plasmid, cosmid, virus, bacteriophage or another expression vector customary in genetic engineering.
  • expression vectors can have further functional units which bring about a stabilization of the expression vector in the host organism.
  • the histone can be one or more histone proteins. These and the DNA sequences coding for them are known to the person skilled in the art.
  • the terms "histone”, “histone protein” and used in the present invention "Fluorescent protein” also include proteins that differ from the natural or original proteins by deletion (s), insertion (s), exchange (s) of amino acids and / or other modifications known in the art or a fragment of the include original protein, the protein so modified still essentially has the biological properties of the histone (protein) s or fluorescent protein and is biologically active in mammals. This also includes allele variants. Methods for generating the above changes in the amino acid sequence are known to the person skilled in the art and are described in standard works in molecular biology, for example in Sa brook et al. , supra. The person skilled in the art is also able to determine whether such a modified protein still has the original biological properties.
  • the DNA sequence encoding the histone protein can be linked directly to the DNA sequence encoding the fluorescent protein or a suitable DNA spacer can be inserted between the two DNA sequences, which is also preferred according to the invention is because with it steric interactions and other interactions, such as additional charges can be avoided.
  • the spacer preferably has a length of 5-20 base pairs, very preferably 7-15 base pairs. For example, when using mH2Al .2, a spacer of 14 base pairs has proven itself, while for all other histone proteins shorter spacers, e.g. 7 bp, are more preferred.
  • the selection of the bases of the spacer is not subject to any restrictions and can be chosen by the person skilled in the art.
  • the "multiple cloning site" can act as a spacer between the two coding sequences for histone and fluorescent protein.
  • the histone protein can be located within the fusion protein before or after the fluorescent protein.
  • the fluorescent protein represents the C-terminal portion of the fusion protein.
  • the DNA sequence encoding the fusion protein can also be inserted into an expression vector.
  • the present invention also includes expression vectors containing this DNA sequence, the DNA sequence being functionally linked to a promoter which allows expression in prokaryotic or eukaryotic cells, preferably eukaryotic cells.
  • the term "vector” refers to a plasmid (pUCl ⁇ , pBR322, pBlueScript etc.), a virus or another suitable vehicle.
  • vectors typically contain an origin of replication and specific genes which allow the phenotypic selection of a transformed host cell.
  • the regulatory elements (promoters) for expression in prokaryotes for example E.
  • coli include the lac, trp promoter or T7 promoter, and for expression in eukaryotes the AOXl or GAL1 promoter in yeast and the CMV- , SV40, RVS-40 promoter, CMV or SV40 enhancers, sensitive or inducible promoters, tet-on, tet-off for expression in mammalian cells.
  • the natural promoters that control the histones are also suitable. This has the advantage that the HX-XFPs are then regulated in exactly the same way as the natural histones.
  • the natural promoters are mostly bidirectional and for the start of the transcription it must be flanked by two genes. If there is only one gene, the transcription can practically not take place.
  • telomeres can be constitutive or during a certain stage, for example with regard to cell differentiation, development of a disease stage, etc.
  • suitable promoters are the metallothionein I and the polyhedrin promoter.
  • Suitable expression vectors for E. coli include, for example, pGEMEX, pUC derivatives, pGEX-2T, pET3b, pPro TetE, pPro Lar .A and pQE-8.
  • Vectors suitable for expression in yeast include pYlOO and Ycpadl, pMSXND, pKCR, pEFBOS, cDM8, pef, pQBI and pCEV4 for expression in mammalian cells.
  • the time required for expression of the DNA sequence encoding the fusion protein for sufficient in vivo labeling depends on various factors, for example the transfection efficiency, the fluorescent protein used, the vector, the promoter strength etc. and can be easily determined by the person skilled in the art.
  • the transfection efficiency with the constructs according to the invention and commercially available transfection reagents is over 85%. A transient transfection brings satisfactory results after 4 hours and gives very good results after 6-8 hours, the transfection becomes stable after 3-4 days. Individual levels of transfection are cloned into monocultures after 4 weeks. Even freezing and thawing the cells does not result in switching off, no reduction in the expression of the constructs or even loss of the constructs.
  • the DNA sequences according to the invention can also be linked to a DNA sequence coding for a further protein or peptide.
  • this further DNA sequence is a DNA sequence encoding a “His tag”.
  • DNA sequences encoding “His tags” are known to the person skilled in the art and are available, for example, from Clontech, Heidelberg, and these can be linked according to standard techniques with the DNA sequences encoding the fusion protein.
  • the "His tag” is preferably located at the C-terminus of the fusion protein.
  • XFP fluorescent protein and stands for BFP (Blue Fluorescent Protein; Heim et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91: 12501-12504), CFP (Cyan Fluorescent Protein; Heim et al. , 1994, Proc. Natl. Acad. Sci.
  • GFP Green Fluorescent Protein
  • SWISSPROT GFP AEQVI: P42212
  • YFP Yellow Fluorescent Protein
  • SWISSPROT LUXY VIBFI: P21578
  • RFP Red Fluorescent Protein
  • Any histone protein which has a nuclear localization signal and can be inserted into the chromate scaffold is suitable for the construction of the DNA sequence according to the invention and for the method according to the invention.
  • the histone protein preferably comes from mammals, in particular humans.
  • those of the groups Hl, H2A, mH2A, H2B, H3 and H4 are suitable, with Hl .0, H2A.1, mH2Al .2, H2Ba, H3.1 and H4a being particularly preferred: Hl .0 (EMBL database M87841 ), H2A.1 (Genbank X83549), mH2Al .2 (Genbank AF041483), H2Ba (EMBL X 57127), H3.1 (EMBL X57128) and H4a (EMBL X600481).
  • mH2A it should be noted that this occurs preferentially in the inactive X chromosome.
  • Macro H2As are a way of labeling
  • the in vivo marking method according to the invention is suitable for a series of tests.
  • the present invention also relates to a method for analyzing the DNA structure, chromatin structure, core structure, cell structure and / or cell dynamics, which is characterized in that following the labeling method described above, the marked cells of an analysis of the spatial distribution of the
  • FRET Fluorescence energy resonance transfer
  • FCS Fluorescence Correlation Spectroscopy
  • XFPs serve not only as a basis for determining the in vivo structure, but also as a calibration standard for other staining methods, especially pathological sections.
  • the method according to the invention is not only suitable, for example, for microscopic images of the structure, that is to say the density distribution of DNA / chromatin in the cell nucleus during the Gl phase or mitosis (cell division), but also, inter alia, particularly for analyzing apoptosis (see also Example 5), especially with regard to the different stages of apoptosis, which are based on changes in the DNA / chromatin structure, eg regression of tumors, breakdown of tissue in the organism, etc.
  • the course of apoptosis over time can be observed directly in vivo at the microscope.
  • the method according to the invention is suitable because of its simple feasibility, especially for mass screening of apoptosis-inducing chemical or physical processes.
  • Chemical processes are understood to mean, for example, the action of sodium butyrate, deoxyglucose or cytostatics. Physical processes are, for example, the effect of radiation, pressure or temperature.
  • FACS analyzes for the determination of apoptosis have hitherto been based on the measurement of the DNA / chromatin density distribution in the cell nucleus or the cell, DNA / chromatin being stained with fluorescent dyes, but for many fluorescent dyes the cells have to be fixed prior to their application. As already mentioned above, this fixation leads to the generation of artifacts.
  • the absorption of fluorescent dyes in vivo often results in toxic and / or structure-changing effects. These effects can often not be distinguished from the apoptosis to be examined.
  • the studies of apoptosis used so far are only of limited significance.
  • the cells are no longer fixed and stained with fluorescent dyes, so that the FACS analyzes can be carried out directly and on the living cell and the formation of artifacts can also be practically ruled out.
  • a simplification and qualitative improvement of the analysis of apoptosis by the method according to the invention also results in the detection of histone release.
  • Previous apoptosis ELISA tests have been based on the detection and quantification of the release of hues due to the breakdown of chro atin during apoptosis.
  • the cell nuclei are isolated and disrupted by lysis.
  • the lysate is placed on a special carrier material on which there are antibodies directed against free histones. After a washing step, the free histone-antibody complexes are stained and detected in a multi-stage process. This detection also amplifies low histone-antibody complex concentrations.
  • the method according to the invention is a quantitative detection in that released fusion protein-antibody complexes are detected and quantified directly (depending on the antibody carrier), for example using the Elispot TM antibody screening method (Zeiss, Jena). FCS is particularly suitable for the detection of low concentrations of these complexes.
  • a color reaction to detect the antibody complexes, as in the conventional ELISA, can be omitted, since the histones in the fusion proteins according to the invention already have a fluorescent label in the form of the fluorescent protein.
  • the present invention also relates to a method for isolating histone proteins, which is characterized in that the histone proteins are isolated following the in vivo labeling method described above.
  • the histone proteins are purified by means of the "His-Tag” attached to the fusion protein via affinity chromatography (columns available e.g. from Clontech, Heidelberg).
  • Histone proteins purified in this way have the advantage that they can be used as labeled histones as isolates. This also avoids the cultivability of cells / tissues.
  • the present invention also relates to the above-described DNA sequences or expression vectors coding for the histone-XFP fusion protein and to cells containing these DNA sequences or expression vectors.
  • These cells include bacteria (for example the E. coli strains HB101, DH1, xl776, JM101, JM109, BL21 and SG13009), yeast, preferably S. cerevisiae, insect cells, preferably sf9 cells, and animal cells, preferably mammalian cells.
  • Preferred mammalian cells are CHO, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293 and WI38 cells. Methods for transforming these host cells, for phenotypically selecting transformants and for expressing the DNA sequences according to the invention are known in the art.
  • histones can be specifically labeled with the present invention, which was not the case previously.
  • the inventors have also established a non-human mammal that expresses a histone fusion protein of the invention.
  • non-human mammal includes any mammal. Examples of such mammals are mouse, rat, rabbit, horse, cattle, sheep, goat, monkey, pig, dog and cat, with mouse being preferred ("histone mouse”).
  • Another object of the present invention are cells obtained from the above non-human mammal. These cells can be in any form, e.g. in a primary or long-term culture.
  • a non-human mammal according to the invention can be provided by conventional methods.
  • a method is favorable which comprises the following steps:
  • step (c) inserting the DNA fragment from step (a) into the embryonic stem cells from step (b),
  • step (d) culturing the cells of step (c),
  • step (e) selection of the cultured cells from step (d) for the presence of the fusion protein, which is reflected in the fluorescent properties of the cells
  • step (f) Generating chimeric non-human mammals from the cells of step (e) by injecting these cells into mammalian blastocysts (preferably mouse blastocysts), transferring the blastocysts into pseudo-pregnant female mammals (preferably mouse) and analyzing the progeny obtained ,
  • mammalian blastocysts preferably mouse blastocysts
  • pseudo-pregnant female mammals preferably mouse
  • the DNA sequence according to the invention which is preferably present in an expression vector, is introduced, for example, by means of microinjection or the shotgun method.
  • embryonic stem cells refers to any embryonic stem cells from a non-human mammal.
  • the embryonic stem cells are preferably from the mouse, in particular the cells E14 / 1 or 129 / SV.
  • tissues / cells which are difficult or impossible to cultivate in a cell culture and which express a histone fusion protein.
  • These tissues have the advantage that they originate natively from an organism and thus reflect the complex interrelationships, ie also clinical pictures in the organism. Structures, relationships and clinical pictures can then be examined.
  • the animals take no discernible damage through the expression of a fluorescent protein.
  • the Expression of green fluorescent protein in a living organism has been described, for example, by Okabe et al. , FEBS Lett. 1997, 407 (3), pp. 313-319 examined and found that all tissues (except erythrocytes and hair) of the transgenic organism glow green in the excitation light, but the animals had no other abnormalities.
  • Figure 1 Schematic map of pSV-HIII-H complicat-XFP
  • H x generally refers to one in the
  • XFP fluorescent protein, e.g. ECFP (Enhanced Cyan Fluorescent
  • EYFP Enhanced Yellow Fluorescent Protein
  • FIG. 2 Schematic map of pSV-HIII-H-XFP-His.
  • the designation H x generally refers to a histone gene specified in Tables 1 and 2;
  • XFP fluorescent protein, e.g. ECFP or EYFP.
  • Figure 3 Microscopic images of histone XFP proteins expressed in HeLa cells
  • FIG. 4 Microscopic images of the sodium butyrate-induced apoptosis of St. O-YFP and H2A-YFP expressing
  • the recordings were described as in Example 5 carried out.
  • the images were taken 36 (or 12) hours after induction of apoptosis.
  • the histone sequences are cloned into the MCS 2nd part.
  • Fig. 6 plasmid map of pH2B.x-NP-X / H2A.x-XFP
  • NP-I and NP-II are the two natural variants of the bidirectional promoter region of H2B-H2A.
  • H2A.X. and H2B.X stand for the different histone subclasses. The same applies to H3 and H4.
  • Fig. 7 Overview graphic of an experiment using fractal analysis to determine the core morphology.
  • the fractal analysis of two confocal sections is shown, with which the so-called box analysis is carried out as a function of different intensity threshold values for different living Cos-7 cells with H10-GFP , The fractal dimension is determined from this.
  • the fractal dimension plotted as a function of the intensity threshold is different for both cuts.
  • Example 1 Construction of the starting vectors for the insertion of the histone genes
  • the plasmids pSV-HIII-CFP and pSV-HIII-YFP-His were prepared. Both plasmids are based on the plasmid pECFP-1 (Clontech, Heidelberg) which has no promoter. To use this vector in eukaryotic cells, the SV40 promoter / enhancer region (1118 base pairs in the range from position 5171 to 1046) was therefore inserted into the HindIII site of the multiple cloning site (MCS) of the plasmid pECFP-1. This regulatory Hindlllc region (SV 40 cut with Hindlll results in 6 fragments, which are labeled with their size) was inserted in the reverse orientation, since this results in a higher expression efficiency.
  • MCS multiple cloning site
  • the plasmid pSV-HIII-YFP was obtained from pSV-HIII-CFP by replacing the CFP gene with the YFP gene from plasmid pEYFP-NUC (Clontech).
  • the MCS agel site and the BsrGI site located 6 base pairs in front of the XFP stop codon were used for this exchange.
  • the genes for CFP and YFP do not differ in these areas, so the exchange did not lead to base pair changes.
  • Those in Example 2 below The histone genes described were inserted into the plasmids pSV-HIII-CFP and pSV-HIII-YFP thus obtained.
  • Example 2 Obtaining histone genes via PCR with simultaneous generation of those suitable for ligation
  • the histone genes were cloned into the MCS between the regulatory Hindlllc region and the start codon of the XFP gene.
  • the histone genes were determined by means of the polymerase chain reaction (PCR) from plasmids containing the histone genes H1.0, H2A1 or H2Ba, Caski genomic DNA (H3.1, H4a) or the cDNA clone mH2A1.2 (IMAGp998A141538, IMAGE Consortium) a plify.
  • the PCR was carried out in a reaction volume of 100 ⁇ l in small siliconized 600 ⁇ l Eppendorf reaction tubes made of polypropylene (Biozym Diognostk GmbH, Oldendorf).
  • the reaction mixture was overlaid with 40 ⁇ l "Chill-out 14TM Liquid Wax" (MJ Research, Inc., Biozym, Oldendorf). Initially, the PCR cycles were heated to 96 ° C for 3 minutes, followed by 30 cycles (for plasmid DNA) or 33 cycles (for genomic DNA) (30 seconds denaturation at 96 ° C, 30 seconds primer attachment at 50 ° C, 30 seconds primer extension at 72 ° C and at the end 10 minutes primer extension at 72 ° C). The PCR was first tested in two reaction vessels and then carried out on a larger scale (up to 10-fold).
  • Enzymes, salts, remaining primers and dNTPs were purified from the PCR products using the QIAquick TM -PCR cleaning kit (Qiagen, Hilden). The PCR products were analyzed on small 8% polyacrylamide gels (6 cm gel, TBE buffer) 90 minutes at 90 V using Lambda HindIII fragments and a 100 bp ladder (Gen Sura) as a length marker after the test reaction (before and after cleaning).
  • the restriction enzymes for the restriction of the PCR products for insertion into the plasmids pSV-HIII-H x -XFP and pSV-HIII-H x - XFP-His are listed in Tables I and II.
  • a maximum of 10 ⁇ g of the PCR product or 20 ⁇ g of the recipient plasmid were used for cleavage with the restriction enzymes.
  • 10 to 20 units (1 or 2 ⁇ l) of restriction enzyme and 3 ⁇ l of 10X restriction buffer (10X buffer B or H from Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany) were used in a 30 ⁇ l reaction volume and it was incubated overnight.
  • Double cleavages were carried out to cleave EcoRI / BamHI and EcoRI / Sall sites.
  • the split PCR products were either directly cleaned with the QIAquick TM -PCR cleaning kit (Qiagen) or cut out of a 1% agarose gel (20 cm gel, TAE buffer, 150 V, 4 ° C) and then with the QIAquick TM - Gel extraction kit (Qiagen) or the Ultrafree TM DNA gel extraction kit (Millipore, Molsheim, France). For further purification, ethanol precipitation and a subsequent washing step with 70% ethanol were carried out.
  • Table 2 Plasmids constructed and investigated in vivo
  • All plasmids carry genes for kanamycin and neomycin resistance for use as a "shuttle" vector and selection in prokaryotes and eukaryotes. All plasmids were transformed into competent cells (Epicurian Coli TM XLIO-Gold Ultra Competent, from Clontech, Heidelberg).
  • the His-Tag sequence was made synthetically. It contains a BsrGI and Notl site for insertion after the XFP gene (C-terminal) directly before the stop codon.
  • the sequence of the sense strand is GAG CTG TAC AAG AAG GAT CAT CTC ATC CAC AAT GTC CAC AAA GAG GAG CAC GCT CAT GCC CAC AAC AAG TAA AGC GGC CGC GAC T, the sequence of the antisense strand A GTC GCG GCC GCT TTA CTT GTT GTG GGC ATG AGC GTG CTC CTC TTT GTG GAC ATT GTG GAT GAG ATG ATC CTT CTT GTA CAG CTC.
  • the two strands were combined to form the double strand by mixing equimolar amounts of the two single strands and incubation elevated temperature (2 minutes 90 ° C, 10 minutes 65 ° C, 10 minutes 37 ° C, overnight at room temperature).
  • the product was purified as described above for the PCR products and then cloned into the corresponding plasmid, the plasmid pSV-HIII-XFP-His being obtained (see FIG. 2).
  • the recipient plasmid (see Table 2; maximum 3 ⁇ g) was mixed with the PCR products (maximum 300 ng).
  • 1 U T4 DNA ligase (1 U / ul, Boehringer Mannheim) and 3 ul 10X T4 ligase buffer (Boehringer Mannheim) were used in a reaction volume of 30 ul. The reaction was carried out at 4 ° C overnight.
  • To transform "Epicurian Coli TM XL10-Gold Ultra Competent Cells" (from Clontech, Heidelberg), aliquot of the bacterial stock suspension frozen at -80 ° thawed on ice for 10 minutes.
  • the cells were then cooled on ice for 2 minutes, then 450 ⁇ l SOC medium (20 g / 1 bactotrypton, 5 g / 1 yeast extract, 0.5 g / 1 NaCl, 10 mM MgCl 2 , 10 mM MgSO 4 , 2, 5 mM KC1, 20 mM glucose, pH 7.5, sterile filtered) was added and the bacteria were incubated at 37 ° C. for 60 minutes, with careful mixing every 10 minutes. Finally, the bacteria were plated on agar plates under kanamycin selection (30 ⁇ g / ml).
  • Plasmid DNA was extracted from the bacteria using the "Nucleo Bond Plasmid" kit (Stratagene). Successful ligation was tested by restricting 300 ng vector DNA using the same restriction enzymes to cut out the inserts. The vector was cut analyzed for the correct insertion of the histone genes in a 1% agarose gel.
  • DNA positive clones were then sequenced for the inserted histone gene with the "reverse" primer EGFP Nl (5'-CGT CGC CGT CCA GCT CGA CCA G-3 ') (from Clontech, Heidelberg). This primer lies within the XFP gene so that the purity of the histone insertion can be determined. Larger amounts were then prepared from correct clones.
  • EGFP Nl 5'-CGT CGC CGT CCA GCT CGA CCA G-3 '
  • Example 5 Transfection of the constructs in HeLa cells and production of microscopic images of the HeLa cells
  • the transfection mixture was discarded and 10 ml of RPMI 1640 medium with 10% FCS was added. At least 60% of the HeLa cells showed positive transfection after 24 hours.
  • cells in the presence of G418 500 ul / ml were what after two weeks of obtaining more than 85% positive HeLa cells ⁇ led.
  • the cells were trypsinized, diluted and placed in "Linbro" plates (Nunc, Naperville, IL, USA). Positive clones were removed and grown up. This resulted in 99% positive HeLa cells with the same fluorescence.
  • the HeLa cells were typically trypsinized twice a week with no apparent effect on the expression or fluorescence of the fusion protein.
  • the cells were trypsinized and sown and cultivated in 8 chamber cells from Nunc (Naperville, IL, USA).
  • the recordings were taken with a "Zeiss 410" confocal laser scanning microscope (CLSM, Zeiss, Jena) with the following parameters: Image dimensions: 512 x 512 pixels; Pinhole: 17; Zoom: 6.0; Average determination: averaging 16 times over one image plane; Laser excitation wavelength: 488 nm; La s er - In t ens it 410 ⁇ 10; Contrast: 45001100, pixel dimension (side): 79 nm.
  • the images were filtered with a 3 * 3 median filter (see FIG. 3).
  • Apoptosis was induced in HeLa cells transformed with the constructs expressing St. O-YFP and H2A-YFP described in the examples and tables above and treated as in Example 4 using 6 mM sodium butyrate according to standard procedures.
  • the apoptosis images were taken with a "Zeiss 410" confocal laser scanning microscope (CLSM, Zeiss, Jena) with the following parameters: Image dimensions: 512 x 512 pixels; Pinhole: 17; Zoom: 6.0; Average determination: averaging 32 times over one image plane; Laser excitation wavelength: 488 nm; Laser intensity 450110; Contrast: 4500110, pixel dimension (side): 66.1 nm.
  • the images were filtered using a 3 * 3 median filter (see FIG. 4).

Abstract

Beschrieben wird ein Verfahren zur in vivo-Markierung von DNA/Chromatin-Strukturen in einer Zelle, das dadurch gekennezeichnet ist, dass in der Zelle eine DNA-Sequenz, vorzugsweise in eine Expressionsvektor inseriert, exprimiert wird, die ein ein Histonprotein und ein fluoreszentes Protein umfassendes Fusionsprotein codiert. Beschrieben wird ferner ein Verfahren zur Analyse der DNA-Struktur, Chromatin-Struktur, Kernstruktur, Zellstruktur oder Zelldynamik, Apoptose etc., das auf dieser in vivo-Markierung basiert. In einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens ist das Fusionsprotein noch mit einem 'His-Tag' verknüpft, was die einfache Isolierung von Histonproteinen erlaubt.

Description

DNA-Sequenz und Verfahren zur in vivo-Markierung und Analyse von DNA/Chromatin in Zellen
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur in vivo- Markierung von DNA/Chromatin-Strukturen in einer Zelle, das dadurch gekennzeichnet ist, daß in der Zelle eine DNA-Sequenz, vorzugsweise in einen Expressionsvektor inseriert, exprimiert wird, die ein ein Histonprotein und ein fluoreszentes Protein umfassendes Fusionsprotein codiert. Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Analyse der DNA-Struktur, Chromatin-Struktur, Kernstruktur, Zellstruktur oder Zelldynamik, Apoptose etc., das auf dieser in vivo- Markierung basiert. In einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist das Fusionsprotein noch mit einem "His-Tag" verknüpft, was die einfache Isolierung von Histonproteinen aus Zellen erlaubt. Diese Histonproteine können dann als "gereinigte" Histone verwendet werden. Die Erfindung betrifft weiter eine DNA-Sequenz, die ein Histonprotein und ein fluoreszentes Protein umfassendes Fusionsprotein codiert.
Für bestimmte Fragestellungen, z.B. die Beurteilung des Zustands von Geweben und Zellen, ist die Markierung und Beobachtung bzw. Dokumentation der DNA/Chromatin-Struktur bzw. DNA/Chromatin-Dynamik in Zellkernen unerläßlich. So wurden bisher für bestimmte Anwendungen beispielsweise Gegenfärbungen von DNA/Chromatin im Zellkernen vorgenommen. Dies erlaubt auch die Bestimmung der Lokalisation bestimmter Proteine, Metabolite oder anderer Substanzen. Die in vivo-Markierung von DNA/Chromatin erlaubt darüber hinaus auch noch beispielsweise die Untersuchung von (a) Struktur/FunktionsbeZiehungen im Zellkern unter Einwirkung chemischer Substanzen oder physikalischer Einflüsse (z.B. Strahlung oder Hitze), (b) Struktur / Funkt ionsbez iehungen im Zellkern zwischen verschiedenen Zellzyklusphasen oder verschiedenen Zellarten, (c) Struktur/Funktionsbeziehungen im Zellkern bei der Differenzierung von Zellen, (d) Mitose, (e) Apoptose und (f) Nekrose . Bisher wurden für diese Untersuchungen meistens die Zellen fixiert und im Anschluß daran wurde die DNA markiert bzw. über Fluores zenz -in si tu-Hybridisierung (FISH) nachgewiesen. Zu den bisher angewandten Verfahren zählt auch die Markierung der DNA über die Mikroinj ektion von Bromdesoxyuridin, wobei keine native Aufnahme über die Zellmembran erfolgt und ein Nachteil dieses Verfahrens auch die kurze Halbwertszei von Bromdesoxyuridin ist. Untersuchungen der Mitose waren bisher nur mit aufwendigen Mikroskopie- und B i 1 dver arbe i tungs ver f ahr en für Metaphasenchromosomen möglich und durchführbar (keine Kondensation und Dekondensation von Chromosomen) . Studien der Apoptose und von Nekrose basierten bisher hauptsächlich auf "DNA-Laddering" von Zellkernlysaten, der Anfärbung von fixierten Zellen mit DNA-interkalierenden Farbstoffen, in vitro-Assays mit terminaler Transferase ( "Tunneling" ) , ELISA (Test hinsichtlich der Freisetzung von Histonen) und "Flow Associated Cell Sorting" (FACS) von fixierten Zellen. Zu den Hauptnachteilen der bisher üblichen Untersuchungen, die durch Beobachtung der DNA/Chromatin-Struktur durchgeführt wurden, zählen z.B. die Befunde, daß (a) diese in der Regel nicht in vivo durchgeführt werden können, wobei hinsichtlich der Mitose bisher nur Beobachtungen an Metaphasechromosomen möglich sind, (b) die Fixierung der Zellen zu starken Strukturänderungen und der Erzeugung einer Reihe von Artefakten führt, (c) der Zeitaufwand (z.B. gegenüber einer morphologischen Begutachtung in vivo am Mikroskop) wesentlicher größer ist, (d) die Untersuchungen ohne Zellverbauch nicht an denselben Zellen fortgesetzt werden können und (e) damit hohe Kosten verbunden sind, da z.B. zusätzliche Substanzen (oder Kits) und gegebenenfalls auch mehr Zellen benötigt werden.
Somit liegt der vorliegenden Erfindung das technische Problem zugrunde, diese Nachteile der im Stand der Technik angewandten Verfahren zu überkommen, d.h. ein Verfahren zur Markierung (und Beobachtung) bzw. Dokumentation der DNA/ChromatinStruktur und/oder DNA/Chromatindynamik bereitzustellen, das in vivo-Analysen der vorstehend aufgeführten Probleme erlaubt, nicht zur Erzeugung von Artefakten führt, die Fortsetzung der Untersuchungen ohne Zellverbrauch an denselben Zellen erlaubt und schließlich zu Kosten- und Zeitersparnis führt.
Die Lösung dieses technischen Problems erfolgt durch die Bereitstellung der in den Patentansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen.
Es wurde überraschenderweise gefunden, daß das vorstehende Problem dadurch gelöst werden kann, daß die Histonproteine des Chromatins mit einem fluoreszenten Protein markiert werden. Dazu werden die Zellen mit einer DNA-Sequenz transfiziert, das ein ein Histonprotein und fluoreszentes Protein umfassendes Fusionsprotein (Histon-XFP) codiert, das in der Zelle exprimiert wird. Nach Transfektion der Zellen mit dieser DNA- Sequenz und dessen Expression wird das Fusionsprotein aufgrund der Tatsache, daß Histone ein Kern-Lokalisationssignal besitzen, wie ein natürliches Histon (ohne Markierung) in den Zellkern transportiert und in das Nukleosom eingebaut. Somit ist das Chromatin (und damit die DNA) über das Histonprotein fluoreszenzmarkiert . Bei der Verwendung von CFP zur Markierung lassen sich mindestens drei weitere spektrale Markierungen (zwei z.B. mit YFP und RFP ebenfalls in vivo exprimiert) zusätzlich durchführen. Die wesentlichen Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens sind darin zu sehen, daß es zum ersten Mal in vivo-Analysen hinsichtlich der vorstehend diskutierten Probleme ermöglicht und es erlaubt, Beobachtungen zur Mitose nicht nur an Metaphase-Chromosomen durchzuführen. Desweiteren kommt es nicht zur Bildung von Artefakten, was z.B. bei der Fixierung von Zellen leicht möglich ist. Durch die Möglichkeit der einfachen morphologischen Begutachtung am Mikroskop (Echtzeit-Analyse) kommt es zum Wegfall aufwendiger Präparationsverfahren, die Untersuchungen können ohne Zellverbrauch an denselben Zellen durchgeführt werden und schließlich kommt es auch zu einer beträchtlichen Kostenersparnis, da keine weiteren Substanzen oder Kits und auch weniger Zellen benötigt werden. Schließlich eignet sich dieses Verfahren auch zur Kontrolle von Gentransfer und Gentherapie-Experimenten. Das Verfahren eignet sich weiterhin zur Kontrolle von Genomtransfer und Zeilverschmelzungsexperimenten, wobei die eine Zellinie/Zelle (die Donor/Geber- Zellinie/Zelle) das Histonfusionsprotein exprimiert und eine andere Zellinie/Zelle (die Akzeptor/Empfänger-Zellinie/Zelle) dies nicht tut. Für einen begrenzten Zeitraum nach dem Genomtransfer oder der Zellverschmelzung lassen sich die vorher getrennten Genome durch die Histonfusionsprotein- Markierung unterscheiden. Dies gilt für jede Zellzyklusphase und insbesondere für die Mitose, oder den Genomtransfer und die Zellverschmelzung während der Mitose.
Darüber hinaus ist das erfindungsgemäße Verfahren auch zur Markierung, Isolierung und Aufreinigung bestimmter Histone von Nutzen, was z.B. durch das weitere Ankoppeln eines "His-Tag" an das Fusionsprotein erreicht werden kann. Bisher wurden dazu, z.B. zur Beantwortung von Fragen hinsichtlich der Genregulation bzw. der Transkription, des Transports und des Metabolismus von Histonen und für auf FRET, FCS, CLSM und FACS basierenden Analysen, Histone durch unspezifische Markierung mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert, z.B. über einen Farbstoff-Succinimidylester, der über eine Umesterung und der Ausbildung einer Säureamidbindung kovalent an die NH- Seitengruppe von allen sterisch zugänglichen Lysinen unspezifisch gebunden wird. Eine spezifische Isolierung von Histonen war dabei nur mit hohem experimentellem Aufwand möglich, z.B. über Saccharose-Ultragradientenzentrifugation. Die dabei außerdem auftretenden Nachteile waren (a) die unspezifische Markierung der Histone und die unspezifische Zahl der Farbstoffmoleküle bei der Markierung, (b) eine durch die unspezifisch markierten Moleküle fehlende Möglichkeit der genauen Konzentrationskontrolle der Histone und (c) die Notwendigkeit der Markierung der Histone in einem zweiten Schritt nach deren Isolierung. Im Gegensatz dazu wird mit dem erfindungsgemäßen Verfahren folgendes erreicht: (a) Die Markierung der Histone ist spezifisch, (b) die Markierung pro Histonmolekül erfolgt mit genau einem Farbstoffmolekül (an definierter Position) , was eine genaue Konzentrationskontrolle/Quantifizierung erlaubt, (c) die Isolierung der Histone ist wesentlich spezifischer und einfacher möglich, d.h. in einem Schritt und somit wesentlich schonender, und (d) die Histon-XFP-Fusionsproteine können nach der Isolierung sofort verwendet werden und müssen nicht aufwendig markiert werden. Somit ergeben sich deutliche Zeit- und Kostenersparnisse .
Somit betrifft eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur in vivo-Markierung von DNA/ChromatinStrukturen in einer Zelle, das dadurch gekennzeichnet ist, daß in der gewünschten Zelle eine DNA-Sequenz exprimiert wird, die ein ein Histonprotein und ein f luoreszentes Protein umfassendes Fusionsprotein codiert.
Verfahren zur Konstruktion der zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens benötigten, das Fusionsprotein codierenden DNA-Sequenz sind dem Fachmann bekannt und beispielsweise auch in gängigen Standardwerken beschrieben (siehe z.B. Sambrook et al . , 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Aufl. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) . Die DNA-Sequenz liegt vorzugsweise auf einem Expressionsvektor inseriert vor, wobei es sich bei dem Expressionsvektor vorzugsweise um ein Plasmid, Cosmid, Virus, Bakteriophagen oder einen anderen in der Gentechnik üblichen Expressionsvektor handelt. Diese Expressionsvektoren können weitere Funktionseinheiten besitzen, die eine Stabilisierung des Expressionsvektors im Wirtsorganismus bewirken.
Bei dem Histon kann es sich um eines oder mehrere Histonproteine handeln. Diese und die diese codierenden DNA- Sequenzen sind dem Fachmann bekannt. Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Begriffe "Histon", "Histonprotein" und "fluoreszentes Protein" umfassen auch Proteine, die sich gegenüber den natürlichen bzw. ursprünglichen Proteinen durch Deletion (en) , Insertion(en) , Austausch(e) von Aminosäuren und/oder andere im Stand der Technik bekannte Modifikationen unterscheiden bzw. ein Fragment des ursprünglichen Proteins umfassen, wobei das so veränderte Protein noch im wesentlichen die biologischen Eigenschaften des Histon (protein) s bzw. fluoreszenten Proteins aufweist und in Säugern biologisch aktiv ist. Dazu zählen auch Allelvarianten. Verfahren zur Erzeugung der vorstehenden Änderungen in der Aminosäuresequenz sind dem Fachmann bekannt und in Standardwerken der Molekularbiologie beschrieben, beispielsweise in Sa brook et al . , supra. Der Fachmann ist auch in der Lage, zu bestimmen, ob ein so verändertes Protein noch über die ursprünglichen biologischen Eigenschaften verfügt.
Bei der Konstruktion der das Fusionsprotein codierenden DNA- Sequenz kann die das Histonprotein codierende DNA-Sequenz direkt mit der das fluoreszente Protein codierenden DNA- Sequenz verknüpft werden oder es kann zwischen beide DNA- Sequenzen ein geeigneter DNA-Spacer inseriert werden, was erfindungsgemäß auch bevorzugt ist, da damit sterische Wechselwirkungen und andere Wechselwirkungen, wie z.B. zusätzliche Ladungen, vermieden werden. Bevorzugt hat der Spacer eine Länge von 5-20 Basenpaaren, ganz bevorzugt 7-15 Basenpaare. So hat sich bei Verwendung von mH2Al .2 ein Spacer von 14 Basenpaaren bewährt, während für alle anderen Histonproteine kürzere Spacer, mit z.B. 7 Bp, bevorzugter sind. Die Auswahl der Basen des Spacers unterliegen keiner Beschränkung und können vom Fachmann beliebig ausgewählt werden. Bei der Klonierung in einen Vektor kann beispielsweise die "multiple cloning site" als Spacer zwischen den beiden kodierenden Sequenzen für Histon- und fluoreszentes Protein fungieren.
Das Histonprotein kann innerhalb des Fusionsproteins vor oder nach dem fluoreszenten Protein lokalisiert sein. In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens stellt das fluoreszente Protein den C-terminalen Anteil des Fusionsproteins dar.
Die das Fusionsprotein codierende DNA-Sequenz kann auch in einen Expressionsvektor inseriert werden. Somit umfaßt die vorliegende Erfindung auch diese DNA-Sequenz enthaltende Expressionsvektoren, wobei die DNA-Sequenz mit einem Promotor funktionell verknüpft ist, der die Expression in prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen, vorzugsweise eukaryotischen Zellen, erlaubt. Die Bezeichnung "Vektor" bezieht sich auf ein Plasmid (pUClδ, pBR322, pBlueScript etc.), auf ein Virus oder ein anderes geeignetes Vehikel. Solche Vektoren enthalten neben dem Promotor typischerweise einen Replikationsursprung und spezifische Gene, die die phänotypische Selektion einer transformierten Wirtszelle erlauben. Zu den regulatorischen Elementen (Promotoren) für die Expression in Prokaryonten, beispielsweise E.coli, zählen der lac- , trp-Promotor oder T7-Promotor, und für die Expression in Eukaryoten der AOXl- oder GAL1-Promotor in Hefe und der CMV-, SV40-, RVS-40-Promotor, CMV- oder SV40-Enhancer, sensitive bzw. induzierbare Promotoren, Tet-on, Tet-off für die Expression in Säugerzellen. In Frage kommen auch die natürlichen Promotoren, die die Histone steuern. Dies hat den Vorteil, daß die HX-XFPs dann genau so reguliert werden wie die natürlichen Histone. Die natürlichen Promotoren sind zumeist bidirektional und für den Start der Transkription muß dieser dann von zwei Genen flankiert werden. Ist nur ein Gen vorhanden, kann die Transkription praktisch nicht stattfinden. Allerdings kann man damit Zellzyklusanalysen durchführen, sowohl anhand der Struktur als auch anhand der Fluoreszenzintensität im FACS, was wesentlich genauer als bisher ist. In dieser Hinsicht wird auf die Plasmidkarte von Fig. 6 verwiesen. Die Expression kann entweder konstitutiv oder während eines bestimmten Stadiums z.B. hinsichtlich der Zelldifferenzierung, Entwicklung eines Krankheitsstadiums etc. erfolgen. Weitere Beispiele für geeignete Promotoren sind der Metallothionein I- und der Polyhedrin-Promotor. Zu geeigneten Expressionsvektoren für E.coli zählen beispielsweise pGEMEX, pUC-Derivate, pGEX-2T, pET3b, pPro TetE, pPro Lar .A und pQE-8. Zu den für die Expression in Hefe geeigneten Vektoren zählen pYlOO und Ycpadl , für die Expression in Säugerzellen pMSXND, pKCR, pEFBOS, cDM8, pef, pQBI und pCEV4. Der für eine ausreichende in vivo-Markierung benötigte Zeitraum der Expression der das Fusionsprotein codierenden DNA-Sequenz hängt von verschiedenen Faktoren ab, z.B. der Transfektionseffizienz , dem verwendeten fluoreszenten Protein, dem Vektor, der Promotorstärke etc. ab und kann vom Fachmann leicht bestimmt werden. Die Transsfektionseffizienz mit den er f indungs gemäßen Konstrukten und handelsüblichen Transfektionsreagenzien liegt über 85%. Eine transiente Transfektion bringt befriedigende Ergebnisse nach 4 Stunden und ergibt nach 6-8 Stunden schon sehr gute Ergebnisse, stabil wird die Transfektion nach 3-4 Tagen. Die Klonierung einzelnder Transfektionsgrade zu Monokulturen erfolgt nach 4 Wochen. Auch ein Einfrieren und Wiederauftauen der Zellen bringt kein Abschalten, keine Verringerung der Expression der Konstrukte oder gar einen Verlust der Konstrukte.
Allgemeine, auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren können zur Konstruktion von Expressionsvektoren, welche die das Fusionsprotein codierende DNA-Sequenz und geeignete Kontrollsequenzen enthalten, verwendet werden. Zu diesen Verfahren zählen beispielsweise in vitro- Rekombinationstechniken, synthetische Verfahren, sowie in vivo-Rekombinationsverfahren, wie sie beispielsweise in Sambrook et al . , supra, beschrieben sind. Dem Fachmann sind Verfahren und Bedingungen bekannt um Wirtszellen zu transformieren bzw. zu transfizieren, Transformanten zu selektieren und diese weiterzukultivieren.
Die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen können auch mit einer für ein weiteres Protein bzw. Peptid codierenden DNA-Sequenz verknüpft werden. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist diese weitere DNA-Sequenz eine ein "His-Tag" codierende DNA-Sequenz. "His-Tags" codierende DNA-Sequenzen sind dem Fachmann bekannt und sind z.B. bei der Fa. Clontech, Heidelberg erhältlich und diese können entsprechend Standardtechniken mit der das Fusionsprotein codierenden DNA-Sequenzen verknüpft werden. Vorzugsweise liegt der "His-Tag" am C-Terminus des Fusionsproteins .
Der Fachmann kennt auch geeignete fluoreszente Proteine XFP und die diese codierenden DNA-Sequenzen. Die Abkürzung "XFP" bedeutet fluoreszentes Protein und steht für BFP (Blue Fluorescent Protein; Heim et al . , 1994, Proc . Natl . Acad. Sei. USA 91: 12501-12504), CFP (Cyan Fluorescent Protein; Heim et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91: 12501-12504), GFP (Green Fluorescent Protein; SWISSPROT : GFP AEQVI : P42212 ) , YFP (Yellow Fluorescent Protein; SWISSPROT : LUXY VIBFI : P21578 ) oder RFP (Red Fluorescent Protein; Matz, M.V. et al . , Nature Biotechnol., 17(10), S. 969-973, 1999).
Jedes Histonprotein, das über ein Kern-Lokalisationssignal verfügt und in das Chromatingerüst inseriert werden kann, eignet sich für die Konstruktion der erfindungsgemäßen DNA- Sequenz und für das erfindungsgemäße Verfahren. Bevorzugt stammt das Histonprotein aus Säugetieren, insbesondere Mensch. Geeignet sind beispielsweise solche der Gruppen Hl, H2A, mH2A, H2B, H3 und H4 , wobei Hl .0 , H2A.1, mH2Al .2 , H2Ba, H3.1 und H4a besonders bevorzugt sind: Hl .0 (EMBL-Datenbank M87841) , H2A.1 (Genbank X83549), mH2Al .2 (Genbank AF041483), H2Ba (EMBL X 57127), H3.1 (EMBL X57128) und H4a (EMBL X600481). Bezüglich mH2A ist anzumerken, daß dieses bevorzugt im inaktiven X- Chromosom vorkommt. Makro H2As stellen somit eine Möglichkeit dar, ein einzelnes Chromosom zu markieren.
Wie bereits vorstehend erwähnt eignet sich das erfindungsgemäße in vivo-Markierungsverfahren zu einer Reihe von Untersuchungen. Somit betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Analyse der DNA-Struktur, Chromatinstruktur , Kernstruktur, Zellstruktur und/oder Zelldynamik, das dadurch gekennzeichnet ist, daß im Anschluß an das vorstehend beschriebene Markierungsverfahren die markierten Zellen einer Analyse der räumlichen Verteilung der
Fluoreszenz unterzogen werden. Dies erlaubt dann z.B.
Rückschlüsse auf die Chromatinverteilung im Zellkern, aus der ein entsprechend gebildeter Fachmann (Pathologe) auf
Krankheitszustände schließen kann. Geeignete Analyseverfahren sind dem Fachmann bekannt, wobei als Analyseverfahren ein
" Fluores zenz-Energie-Resonanz -Trans f er " (FRET), eine
"Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (FCS) , eine "Konfokale
Laser Scanning Mikroskopie" (CLSM) , Epifluoreszenz-Mikroskopie oder eine "Flow Associated Cell Sorting" -Analyse (FACS) bevorzugt sind. Desweiteren kann eine Strukturbestimmung mittels fraktaler Analyse stattfinden. Mit der fraktalen
Analyse können verschiedene Zustände des Chromatins unterschieden und quantifiziert werden. Dies kann als
Grundlage für ein Diagnoseverfahren gesehen werden. Die HX-
XFPs dienen dabei nicht nur als Grundlage für die Bestimmung der in-vivo Struktur, sondern damit auch als Eichstandard für andere Färbemethoden, insbesondere pathologische Schnitte. Die
Unterscheidung und Quantifizierung der Chromatinstruktur mittels fraktaler Analyse in Zusammenhang mit einem Tier ist dabei besondere Bedeutung beizumessen, da man aus einem Tier entsprechende Gewebe entnehmen kann. Zellkulturen dagegen leiden meist an dem Nachteil, daß sie wegen ihrer unendlichen
Teilungseigenschaften gegenüber dem natürlichen Zustand verändert sind. In diesem Zusammenhang wird auf Fig. 7 verwiesen.
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich nicht nur z.B. für mikroskopische Aufnahmen der Struktur, also der Dichteverteilung von DNA/Chromatin im Zellkern während der Gl- Phase oder Mitose (Zellteilung), sondern unter anderem auch besonders zur Analyse der Apoptose (siehe dazu Beispiel 5), vor allem auch hinsichtlich der unterschiedlichen Apoptosestadien, die auf Veränderungen in der DNA/Chromatin- Struktur basieren, z.B. Rückbildung von Tumoren, Abbau von Gewebe im Organismus, etc. Dabei kann der zeitliche Verlauf der Apoptose direkt in vivo am Mikroskop beobachtet werden. Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich dabei aufgrund seiner einfachen Durchführbarkeit auch besonders für das Massenscreening von Apoptose-induzierenden chemischen oder physikalischen Vorgängen. Unter chemischen Vorgängen ist beispielsweise das Einwirken von Natriumbutyrat , Deoxyglucose oder von Zytostatika zu verstehen. Unter physikalischen Vorgängen ist beispielsweise die Einwirkung von Strahlung, Druck oder Temperatur zu verstehen. Hier ist auch eine Vereinfachung des Apoptose-Nachweises aufgrund der Möglichkeit der Anwendung von FACS-Analysen möglich. FACS-Analysen zur Bestimmung der Apoptose beruhten bisher auf der Messung der DNA/Chromatin-Dichteverteilung im Zellkern bzw. der Zelle, wobei DNA/Chromatin mit Fluoreszenzfarbstoffen angefärbt wurde, allerdings müssen für viele Fluoreszenzfarbstoffe vor deren Applikation die Zellen fixiert werden. Wie vorstehend bereits erwähnt führt diese Fixierung zur Erzeugung von Artefakten. Andererseits resultiert die Aufnahme von Fluoreszenzfarbstoffen in vivo häufig zu toxischen und/oder strukturverändernden Effekten. Diese Effekte lassen sich oft nicht von der zu untersuchenden Apoptose unterscheiden. Somit sind die bisher angewandten Untersuchungen der Apoptose nur von eingeschränkter Aussagekraft. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren entfällt nun die Fixierung der Zellen und die Anfärbung mit Fluoreszenzfarbstoffen, so daß die FACS-Analysen direkt und an der lebenden Zelle durchgeführt werden können und auch die Entstehung von Artefakten praktisch ausgeschlossen werden kann.
Eine Vereinfachung und qualitative Verbesserung der Analyse der Apoptose durch das erfindungsgemäße Verfahren ergibt sich auch bei einem Nachweis der Histonfreisetzung. Bisherige Apoptose-ELISA-Tests beruhen auf dem Nachweis und der Quantifizierung der Hi s tonfrei set zung infolge des Chro atinabbaus während der Apoptose. Hierzu werden die Zellkerne isoliert und durch Lyse aufgeschlossen. Das Lysat wird auf ein spezielles Trägermaterial gegeben, auf dem sich gegen freie Histone gerichtete Antikörper befinden. Nach einem Waschschritt werden die freien Histon-Antikörper-Komplexe in einem mehrstufigen Verfahren angefärbt und nachgewiesen. Dieser Nachweis amplifiziert auch geringe Histon-Antikörper- Komplex-Konzentrationen. Diese aufwendigen Präparationsschritte und der mehrstufige Nachweis (und die damit verbundenen Möglichkeiten der Entstehung von Artefakten) entfallen bei dem erfindungsgemäßen Verfahren. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren handelt es sich um einen quantitativen Nachweis, indem freigesetzte Fusionsprotein - Antikörper-Komplexe direkt (je nach Antikörperträger) nachgewiesen und quantifiziert werden, z.B. mittels des Antikörper-Screeningverfahrens Elispot™ (Zeiss, Jena). Für den Nachweis von geringen Konzentrationen dieser Komplexe eignet sich besonders FCS. Eine Farbreaktion zum Nachweis der Antikörperkomplexe wie beim konventionellen ELISA kann entfallen, da die Histone in den erf indungsgemäeßn Fusionsproteinen bereits eine fluoreszente Markierung in Form des fluoreszenten Proteins tragen. Man könnte vereinfacht von einem "Ein-Schritt-ELISA" sprechen, der den konventionellen ELISA ersetzt.
Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Isolierung von Histonproteinen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß im Anschluß an das vorstehend beschriebene in vivo-Markierungsverfahren die Histonproteine isoliert werden. Dabei werden die Histon-Proteine mittels des an das Fusionsprotein angeknüpften "His-Tags" über Affinitätschromatographie (Säulen z.B. von Fa. Clontech, Heidelberg erhältlich) gereinigt. Derart gereinigte Histon- Proteine haben den Vorteil, daß man sie als markierte Histone als Isolat einsetzen kann. Damit läßt sich auch die Kultivierbarkeit von Zellen/Geweben umgehen.
Die vorliegende Erfindung betrifft schließlich auch die vorstehend beschriebenen, das Histon-XFP-Fusionsprotein codierenden DNA-Sequenzen bzw. Expressionsvektoren und diese DNA-Sequenzen oder Expressionsvektoren enthaltende Zellen. Zu diesen Zellen zählen Bakterien (beispielsweise die E.coli- Stämme HB101, DH1, xl776, JM101, JM109, BL21 und SG13009), Hefe, vorzugsweise S. cerevisiae, Insektenzellen, vorzugsweise sf9-Zellen, und Tierzellen, vorzugsweise Säugerzellen. Bevorzugte Säugerzellen sind CHO- , VERO- , BHK- , HeLa-, COS-, MDCK, 293- und WI38-Zellen. Verfahren zur Transformation dieser Wirtszellen, zur phänotypischen Selektion von Transformanten und zur Expression der erfindungsgemäßen DNA- Sequenzen sind auf dem Fachgebiet bekannt.
Wichtig zu erwähnen ist, daß mit der vorliegenden Erfindung Histone spezifisch markiert werden können, was vorher nicht der Fall war.
Von den Erfindern wurde auch ein nicht-menschliches Säugetier etabliert, das ein erfindungsgemäßes Histon-Fusionsprotein exprimiert .
Der Ausdruck "nicht-menschliches Säugetier" umfaßt jegliches Säugetier. Beispiele solcher Säugetiere sind Maus, Ratte, Kaninchen, Pferd, Rind, Schaf, Ziege, Affe, Schwein, Hund und Katze, wobei Maus bevorzugt ist ( "Histon-Maus" ) .
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Zellen, die aus dem vorstehenden nicht-menschlichen Säugetier erhalten werden. Diese Zellen können in jeglicher Form vorliegen, z.B. in einer Primär- oder Langzeit-Kultur.
Ein erfindungsgemäßes nicht-menschliches Säugetier kann durch übliche Verfahren bereitgestellt werden. Günstig ist ein Verfahren, das folgende Schritte umfaßt:
(a) Herstellung eines DNA-Fragments, insbesondere eines Vektors, das (der) ein Histonprotein und ein fluoreszentes Protein umfassendes Fusionsprotein codiert;
(b) Präparation embryonaler Stammzellen aus einem nichtmenschlichen Säuger (bevorzugt Maus) ;
(c) Einbringen des DNA-Fragments von Schritt (a) in die embryonalen Stammzellen von Schritt (b) ,
(d) Kultivieren der Zellen von Schritt (c),
(e) Selektion der kultivierten Zellen von Schritt (d) auf das Vorhandensein des Fusionsproteins , was sich sich an den fluoreszenten Eigenschaften der Zellen äußert,
(f) Erzeugen chimerer nicht-menschlicher Säuger aus den Zellen von Schritt (e) durch Injektion dieser Zellen in Säuger-Blastocysten (bevorzugt Maus-Blastocysten) , Übertragen der Blastocysten in pseudo-schwangere weibliche Säuger (bevorzugt Maus) und Analyse der erhaltenen Nachkommen .
Das Einbringen der erfindungsgemäßen DNA-Sequenz, die bevorzugt in einem Expressionsvektor vorliegt, erfolgt beispielsweise mittels Mikroinjektion oder der Shotgun- Methode .
Der Ausdruck "embryonale Stammzellen" betrifft jegliche embryonalen Stammzellen eines nicht-menschlichen Säugetiers. Vorzugsweise sind die embryonalen Stammzellen von der Maus, insbesondere die Zellen E14/1 oder 129/SV.
Desweiteren kennt der Fachmann Bedingungen und Materialien, um die Schritte (a)-(f) durchzuführen.
Mit der "Histon-Maus " (gilt analog natürlich auch für andere Säugetiere) ist die Gewinnung von Geweben/Zellen, die nicht oder nur schlecht in einer Zellkultur zu kultivieren sind, und die ein Histonfusionsprotein exprimieren, möglich. Diese Gewebe besitzen den Vorteil, daß sie nativ aus einem Organismus stammen und somit die komplexen Zusammenhänge, d.h. auch Krankheitsbilder im Organismus widerspiegeln. Somit können dann Strukturen, Beziehungen und Krankheitsbilder untersucht werden. Die Tiere nehmen durch die Expression eine fluoreszierenden Proteins keinen erkennbaren Schaden. Die Expression von Green Fluorescent Protein in einem lebenden Organismus wurde beispielsweise von Okabe et al . , FEBS Lett. 1997, 407(3), S. 313-319 untersucht und festgestellt, daß alle Gewebe (außer Erythrozyten und Haare) des transgenen Organismus im Anregungslicht grün leuchten, aber die Tiere ansonsten keine Anomalien aufwiesen.
Beschreibung der Figuren:
Figur 1: Schematische Karte von pSV-HIII-H„-XFP
Die Bezeichnung Hx bezieht sich allgemein auf ein in den
Tabellen 1 und 2 näher bezeichnetes Histongen; XFP: fluoreszentes Protein, z.B. ECFP (Enhanced Cyan Fluorescent
Protein) oder EYFP (Enhanced Yellow Fluorescent Protein)
Figur 2: Schematische Karte von pSV-HIII-H-XFP-His Die Bezeichnung Hx bezieht sich allgemein auf ein in den Tabellen 1 und 2 näher bezeichnetes Histongen; XFP: fluoreszentes Protein, z.B. ECFP oder EYFP.
Figur 3 : Mikroskopische Aufnahmen von in HeLa-Zellen exprimierten Histon-XFP-Proteinen
Die Aufnahmen wurden wie in Beispiel 4 beschrieben durchgeführt .
(A) Nucleus einer Hl.O-YFP exprimierenden HeLa-Zelle
(B) Nucleus einer Hl.O-YFP exprimierenden HeLa-Zelle
(C) Zwei apoptotische, vorher Hl.O-YFP exprimierende Zellen
(D) Zwei Nuclei von H2A-YFP exprimierenden HeLa-Zellen
(E) Nucleus einer H2A-YFP exprimierenden HeLa-Zelle
(F) Mitose von HeLa-Zellen: a) Metaphase (Ansicht der Plattenseite) , b) Anaphase, c) Späte Anaphase oder frühe Telophase
Figur 4 : Mikroskopische Aufnahmen der Natriumbutyrat- induzierten Apoptose von Hl.O-YFP und H2A-YFP exprimierenden
HeLa-Zellen
Die Aufnahmen wurden wie in Beispiel 5 beschrieben durchgeführt. Die Aufnahmen wurden 36 (bzw. 12) Stunden nach Induktion der Apoptose hergestellt.
(A) Hl.O-YFP; Kontrollnucleus ohne Natriumbutyrat-Behandlung
(B) H2A-YFP; Kontrollnucleus ohne Natriumbutyrat-Behandlung
(C) Hl.O-YFP; Nucleus mit apoptotischem Strukturverlust, fast homogener Nucleus (Im Vergleich zu (A) die gleiche Laser- Intensität und gleicher Kontrast; Laser-Intensität: 420, Kontrast: 2752)
(D) H2A-YFP; Nucleus mit apoptotischem Strukturverlust, fast homogener Nucleus (Im Vergleich zu (B) die gleiche Laser- Intensität und gleicher Kontrast; Laser-Intensität: 424, Kontrast: 4490)
(E) Hl.O-YFP; apoptotischer Halbmond und beginnende Agglomeration des Chromatins (Zoom: 8; Pixelabmessungen
(seitlich) : 49, 6 nm)
(F) H2A-YFP; apoptotischer Halbmond vor der wirklichen Agglomeration des Chromatins (Zoom: 8; Pixelabmessungen
(seitlich) : 49,6 nm)
(G) Hl.O-YFP; apoptotische Kondensation des Zellnucleus (Zoom: 8; Pixelabmessungen (seitlich): 49,6 nm)
(H) H2A-YFP; apoptotische Kondensation des Zellnucleus (Zoom: 8; Pixelabmessungen (seitlich): 49,6 nm)
(I) Hl.O-YFP; Endstadium der apoptotischen Kondensation des Zellnucleus vor Zellfragmentierung
(J) Hl.O-YFP; apoptotische Zellfragmentierung (Zoom: 8; Pixelabmesssungen (seitlich): 49,6 nm)
(K) H2A-YFP; apoptotische Zellfragmentierung
(L) Hl.O-YFP; Übersicht der Apoptose, die den apoptotischen Strukturverlust und apoptotische Halbmonde zeigt (Zoom: 2,5 Pixelabmessungen (seitlich): 150 nm; Laser-Intensität: 475; Kontrast: 0)
Fig. 5: Sequenzen von pSV-HIII-CFP sowie der Histone Hl .0 ,
H2A.1, H2B.a, H3.1 , H4. a und mH2Al .2
Die Histonsequenzen werden dabei in die MCS 2. Teil kloniert.
Fig. 6: Plasmidkarte von pH2B.x-NP-X/H2A.x-XFP
NP-I und NP-II sind die zwei natürlichen Varianten der bidirektionalen Promoterregion von H2B-H2A. H2A.X. und H2B.X stehen für die verschiedenen Histonsubklassen. Entsprechendes gilt für H3 und H4.
Fig. 7: Übersichtsgrafik über ein Experiment unter Anwendung fraktaler Analyse zur Bestimmung der Kernmorphologie Es wird die fraktale Analyse von zwei konfokalen Schnitten gezeigt, womit die sogenannte Box-Analyse in Abhängigkeit verschiedener Intensitätsschwellenwerte für verschieden lebende Cos-7 Zellen mit H10-GFP durchgeführt wird. Hieraus wird die fraktale Dimension bestimmt. Die fraktale Dimension aufgetragen als Funktion des Intensitätsschwellenwertes ist für beide Schnitte unterschiedlich.
Die nachstehenden Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiel 1: Konstruktion der Ausgangsvektoren für die Insertion der Histongene
Es wurden die Plasmide pSV-HIII-CFP und pSV-HIII-YFP-His hergestellt. Beide Plasmide basieren auf dem keinen Promotor aufweisenden Plasmid pECFP-1 (Clontech, Heidelberg) . Zur Verwendung dieses Vektors in eukaryotischen Zellen wurde daher die SV40-Promotor/Enhancer-Region (1118 Basenpaare des Bereichs von Position 5171 bis 1046) in die Hindlll-Stelle der Mehrfachclonierungsstelle (MCS) des Plasmids pECFP-1 inseriert. Dieser regulatorische Hindlllc-Bereich (SV 40 mit Hindlll geschnitten ergibt 6 Fragmente, die der Größe nach mit Buchstaben gekennzeichnet werden) wurde in umgekehrter Orientierung inseriert, da dadurch eine höhere Expressionseffizienz erreicht wird. Dies führte zum Erhalt des Plasmids pSV-HIII-CFP (s. Fig. 5). Das Plasmid pSV-HIII-YFP wurde von pSV-HIII-CFP durch Austausch des CFP-Gens gegen das YFP-Gen von Plasmid pEYFP-NUC (Clontech) erhalten. Für diesen Austausch wurden die Agel-Stelle der MCS und die 6 Basenpaare vor dem XFP-Stopcodon liegende BsrGI-Stelle verwendet. Die Gene für CFP und YFP unterscheiden sich in diesen Bereichen nicht, somit führte der Austausch nicht zu Basenpaaränderungen. Die in dem nachstehenden Beispiel 2 beschriebenen Histongene wurden in die so erhaltenen Plasmide pSV-HIII-CFP und pSV-HIII-YFP inseriert.
Beispiel 2 : Gewinnung von Histongenen über PCR mit gleichzeitiger Erzeugen von für die Ligation geeigneten
Termini
Die Histongene wurden in die MCS zwischen den regulatorischen Hindlllc-Bereich und das Startcodon des XFP-Gens cloniert. Die Histongene wurden mittels der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) von die Histongene H1.0, H2A1 bzw. H2Ba enthaltenden Plasmiden, Caski genomischer DNA (H3.1, H4a) oder dem cDNA- Klon mH2A1.2 ( IMAGp998A141538 , I.M.A.G.E. Consortium) a plifizier . Die PCR wurde in einem Reaktionsvolumen von 100 μl in kleinen silikonisierten 600 μl-Eppendorf - Reaktionsgefäßen aus Polypropylen (Biozym Diognostk GmbH, Oldendorf ) . Für die Reaktion wurden 10 μl GenAmp™ 10X PCR- Puffer II (Hoffmann-La Röche, Basel), 2 μl eines dNTP-Gemischs (Konzentration jeweils 25 mM; Peqlab Biotech GmbH, Erlangen) , 8 μl MgCl2-Lösung (25 mM; Perkin Eimer) und 2 Einheiten DNA Polymerase AmpliTaq™ (2 E/μl; Perkin Eimer) verwendet. Als PCR-Matrize wurden 4 ng Plasmid-DNA oder 1 μg genomische DNA (maximal 3 μl ) verwendet. Jeweils 0,3 μg "Forwärts"- bzw. "Rückwärts"-Primer (siehe Tabelle I) wurden verwendet (maximal 3 μl ) . Zur Vermeidung von Verdunstung während der PCR-Zyklen wurde das Reaktionsgemisch mit 40 μl "Chill-out 14TM Liquid Wax" (MJ Research, Inc., Fa. Biozym, Oldendorf) überschichtet. Für die PCR-Zyklen wurde einleitend zuerst 3 Minuten auf 96°C erhitzt, danach folgten 30 Zyklen (für Plasmid-DNA) oder 33 Zyklen (für genomische DNA) (30 Sekunden Denaturierung bei 96°C, 30 Sekunden Primer-Anlagerung bei 50°C, 30 Sekunden Primer-Verlängerung bei 72°C und am Ende 10 Minuten Primer- Verlängerung bei 72°C) . Die PCR wurde zuerst in zwei Reaktionsgefäßen getestet und danach in größerem Maßstab (bis zu lOfach) durchgeführt. Die PCR-Produkte wurden von Enzymen, Salzen, verbliebenen Primern und dNTPs mit dem QIAquick™-PCR- Reinigungskit (Qiagen, Hilden) gereinigt. Die Analyse der PCR- Produkte erfolgte auf kleinen 8% Polyacrylamidgelen (6 cm Gel, TBE-Puffer) 90 Minuten bei 90 V unter Verwendung von Lambda- Hindlll-Fragmenten und einer lOObp-Leiter (Gen Sura) als Längenmarker nach der Testreaktion (vor und nach der Reinigung) .
Tabelle I: Für die Vektorkonstruktion verwendete Primer
Histon Pnmerrich- Restrik- Sequenz der Sequenz im Primerlange tung tions- Restrik- Histongen [bp] stelle tionsstelle H1.0 V Sall CAGTCGACG ATGACCGA- 27
GAATTCCA- CG R BamHI TGGATCCCG CTTCTTCT- 27
TGCCGGCC- CT H2A.1 V EcoRI CGAATTCTG ATGTCGGG- 27
ACGCGGCA- AG R BamHI TGGATCCCG TTTGCCTT- 27
TGGCCTTG- TG mH2Al.2 V EcoRI CTTCGAAT- ATGTCGAG- 30
TCTG CCGCGGTG- GG R Sall TACCGTCG- GTTGGCGT- 30
ACTG CCAGCTTG- GC "Vorwärts"- - - GGAAGCCA- 21
Sequenz- TCATCACA- ierung CCACC
"Rückwärts" - - CCAGCTAC- 21
Sequenz- TTCCAAGG- ierung GCCCG
H2Ba V EcoRI CTTCGAAT- ATGCCTGA- 27
TCTG ACCAGCT R BamHI CGGTGGAT- CTTGGAGC- 32
CCCG TTGTATAC- TTGG H3.1 V EcoRI CTTCGAAT- ATGGCTCG- 36 TCTG TACGAAGC-
AAACAGCT
R BamHI CGGTGGAT- TGCCCTTT- 33
CCCG CCCCACGG- ATGCG H4a V EcoRI CTTCGAAT- ATGTCTGG- 33
TCTG ACGTGGTA- AGGGC R BamHI CGGTGGAT- ACCGCCAA- 32
CCCG AGCCATAA- AGGG (V= "Vorwärts "-Primer, R= "Rückwärts "-Primer; die Sequenzen sind in 5 ' -3 ' -Richtung angegeben, die Sequenz beispielsweise des "Vorwärts "-Primers für mH 2 A 1.2 lautet somit 5 ' - CTTCGAATTCTGATGTCGAGCCGCGGTGGG-3 ' . )
Die Restriktionsenzyme für die Restriktion der PCR-Produkte zur Insertion in die Plasmide pSV-HIII-Hx-XFP und pSV-HIII-Hx- XFP-His (siehe Figur 1) sind in den Tabellen I und II aufgelistet. Zur Spaltung mit den Restriktionsenzymen wurden maximal 10 μg des PCR-Produkts bzw. 20 μg des Empfängerplasmids verwendet. 10 bis 20 Einheiten (1 oder 2 μl) Restriktionsenzym und 3 μl lOX-Restriktionspuffer (10X Puffer B oder H von Boehringer Mannheim, Mannheim, Deutschland) wurden in einem 30 μl-Reaktionsvolumen verwendet und es wurde über Nacht inkubiert. Zur Spaltung von EcoRI/BamHI- und EcoRI/Sall-Stellen wurden Doppelspaltungen durchgeführt. Die gespaltenen PCR-Produkte wurden entweder direkt mit dem QIAquick™-PCR-Reinigungskit (Qiagen) gereinigt oder aus einem 1% Agarosegel (20 cm Gel, TAE-Puffer, 150 V, 4°C) ausgeschnitten und danach mit dem QIAquick™-Gelextraktionskit (Qiagen) oder dem Ultrafree™-DNA-Gelextraktionskit (Millipore, Molsheim, Frankreich) extrahiert. Zur weiteren Reinigung wurden eine Ethanolpräzipitation und ein anschließender Waschschritt mit 70% Ethanol durchgeführt. Tabelle 2: Konstruierte und in vivo untersuchte Plasmide
Tabelle: bp = Basenpaare, kbp = Kilobasenpaare, AA=Zahl der Aminosäuren,
-für BFP, CFP, GFP, YFP :
Figure imgf000022_0001
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Alle Plasmide tragen Gene für Kanamycin- und Neomycin- Resistenz zur Verwendung als "Shuttle"-Vektor und Selektion in Prokaryoten und Eukaryoten. Alle Plasmide wurden in kompetente Zellen (Epicurian Coli™ XLIO-Gold Ultra Competent, Fa. Clontech, Heidelberg) transformiert.
Beispiel 3 : Insertion einer His-Tag-Sequenz
Die His-Tag-Sequenz wurde synthetisch hergestellt. Sie enthält eine BsrGI- und Notl-Stelle zur Insertion nach dem XFP-Gen (C- terminal) direkt vor dem Stopcodon. Die Sequenz des Sense- Strangs ist GAG CTG TAC AAG AAG GAT CAT CTC ATC CAC AAT GTC CAC AAA GAG GAG CAC GCT CAT GCC CAC AAC AAG TAA AGC GGC CGC GAC T, die Sequenz des Antisense-Strangs A GTC GCG GCC GCT TTA CTT GTT GTG GGC ATG AGC GTG CTC CTC TTT GTG GAC ATT GTG GAT GAG ATG ATC CTT CTT GTA CAG CTC. Die Zusammenlagerung der beiden Stränge zum Doppelstrang erfolgte durch Vermischen äquimolarer Mengen der beiden Einzelstränge und Inkubation bei erhöhter Temperatur (2 Minuten 90°C, 10 Minuten 65°C, 10 Minuten 37°C, über Nacht bei Raumtemperatur) . Das Produkt wurde wie vorstehend für die PCR-Produkte beschrieben gereinigt und danach in das entsprechende Plasmid Kloniert, wobei das Plasmid pSV-HIII-XFP-His erhalten wurde (siehe Figur 2) .
Beispiel 4 : Ligation und Transformation in Bakterien
Das Empfängerplasmid (siehe Tabelle 2; maximal 3 μg) wurde mit den PCR-Produkten (maximal 300 ng) vermischt. 1 E T4 DNA- Ligase (1 E/μl, Boehringer Mannheim) und 3 μl 10X T4 Ligase- Puffer (Boehringer Mannheim) wurden in einem Reaktionsvolumen von 30 μl verwendet. Die Reaktion wurde über Nacht bei 4°C durchgeführt. Zur Transformation von "Epicurian Coli™ XL10- Gold Ultra Competent Cells" (Fa. Clontech, Heidelberg) Aliquot der bei -80° eingefrorenen Bakterien-Stocksuspension auf Eis 10 Minuten aufgetaut. Dann wurden 1,7 μl ß-Mercaptoethanol zugegeben und das Ganze wurde unter vorsichtigem Vermischen (alle 2 Minuten) 10 Minuten auf Eis gehalten. Schließlich wurden 10 μl Ligationsgemisch (maximal 1 μg) und 10 μl B- Medium zugegeben. Nach 30minütiger Inkubation wurde für 42 Sekunden eine Hitzebehandlung bei 42°C durchgeführt. Danach wurden die Zellen auf Eis 2 Minuten abgekühlt, dann 450 μl SOC-Medium (20 g/1 Bactotrypton, 5 g/1 Hefeextrakt, 0,5 g/1 NaCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgS04, 2 , 5 mM KC1, 20 mM Glucose, ph- Wert 7,5, sterilfiltriert) zugegeben und die Bakterien wurden 60 Minuten bei 37°C inkubiert, wobei alle 10 Minuten vorsichtig vermischt wurde. Schließlich wurden die Bakterien auf Agarplatten unter Kanamycinselektion (30 μg/ml) ausplattiert. Erscheinende Klone wurden nach 24 Stunden Inkubation abgenommen, in 20 ml B-Medium mit 30 μg/ml Kanamycin überführt und bei 37°C über Nacht auf einem Schüttler inkubiert. Plasmid-DNA wurde aus den Bakterien mit dem "Nucleo Bond Plasmid"-Kit (Stratagene) extrahiert. Die erfolgreiche Ligation wurde durch Restriktion von 300 ng Vektor-DNA unter Verwendung der gleichen Restriktionsenzyme zum Herausschneiden der Insertionen getestet. Der geschnittene Vektor wurde hinsichtlich der korrekten Insertion der Histongene in einem 1% Agarose-Gel analysiert. DNA positiver Klone wurde dann bezüglich des inserierten Histongens mit dem "Rückwärts"- Primer EGFP Nl (5'-CGT CGC CGT CCA GCT CGA CCA G-3 ' ) (Fa. Clontech, Heidelberg) sequenziert. Dieser Primer liegt innerhalb des XFP-Gens, so daß die Reinheit der Histon- Insertion bestimmt werden kann. Von korrekten Klonen wurden dann größere Mengen präpariert.
Beispiel 5: Transfektion der Konstrukte in HeLa-Zellen und Herstellung mikroskopischer Aufnahmen der HeLa-Zellen
0,9 ml RPMI 1640 Medium (Gibco BRL, Freiburg) und etwa 4μg pSV-HIII-Hx bzw. pSV-HIII-Hx-His wurden vermischt und mit einem Millex-GV4-22μm-Filter (Millipore, Molsheim, Frankreich) sterilfiltriert . Zur gleichen Zeit wurden 0,9 ml RPMI 1640 Medium mit 10 μl Lipofectamin ( "Transfection Reagent Kit", Gibco BRL) vermischt. Beide Gemische wurden ebenfalls miteinander vermischt, 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und 5mal vorsichtig vermischt. In der Zwischenzeit wurden kleine Zellkulturflaschen mit etwa 106 HeLa-Zellen zweimal mit RPMI 1640 Medium gewaschen und das Transfektionsgemisch wurde zugegeben. Nach 6 Stunden Inkubation wurde das Transfektionsgemisch verworfen und es wurden 10 ml RPMI 1640 Medium mit 10% FCS zugegeben. Mindestens 60% der HeLa-Zellen zeigten nach 24 Stunden eine positive Transfektion. Zur Erzielung einer stabilen Transfektion wurden die Zellen in Gegenwart von G418 (500 μl/ml) selektiert, was nach zwei Wochen zum Erhalt von mehr als 85% positiven HeLa-Zellen ■ führte. Zum Erhalt einer homogeneren Zellpopulation hinsichtlich der XFP-Fluoreszenz wurden die Zellen trypsiniert, verdünnt und in "Linbro"- Platten gegeben (Fa. Nunc , Naperville, IL, USA) . Positive Klone wurden abgenommen und weitergezüchtet. Dies ergab 99% positive HeLa-Zellen mit gleicher Fluoreszenz. Die HeLa-Zellen wurden üblicherweise zweimal pro Woche trypsiniert, wobei sich offensichtlich keine Auswirkung auf die Expression oder Fluoreszenz des Fusionsproteins zeigte. Zur Herstellung mikroskopischer Aufnahmen von Einzelzellen zur Bestimmung der Dichteverteilung von DNA/Chromatin während der Gl- und G2- Phase wurden die Zellen trypsiniert und in 8 Kammerzellen der Fa. Nunc (Naperville, IL, USA) ausgesät und kultiviert. Die Aufnahmen wurden mit einem "Zeiss 410" confokalen Laserscanning-Mikroskpop (CLSM, Zeiss, Jena) mit folgenden Parametern aufgenommen: Bildabmessungen: 512 x 512 Pixel; Lochblende: 17; Zoom: 6,0; Durchschnittsermittlung : Mittelung 16 mal über eine Bildebene; Laser-Anregungswellenlänge: 488 nm; La s er - In t ens i t ä t 410±10; Kontrast: 45001100, Pixeldimension (seitlich) : 79 nm. Die Aufnahmen wurden mit einem 3*3 Median-Filter gefiltert (siehe Figur 3).
Beispiel 6: Untersuchung von Apoptose mittels der Hiεton-XFP-
Fusionsproteine
In HeLa-Zellen, die mit den in den vorstehenden Beispielen und Tabellen beschriebenen, Hl.O-YFP und H2A-YFP exprimierenden Konstrukten transformiert worden und wie in Beispiel 4 behandelt worden waren wurden mittels 6 mM Natriumbutyrat gemäß Standardverfahren Apoptose induziert. Die Apoptose- Aufnahmen wurden mit einem "Zeiss 410" confokalen Laserscanning-Mikroskpop (CLSM, Zeiss, Jena) mit folgenden Parametern aufgenommen: Bildabmessungen: 512 x 512 Pixel; Lochblende: 17; Zoom: 6,0; Durchschnittsermittlung: Mittelung 32 mal über eine Bildebene; Laser-Anregunsgwellenlänge : 488 nm; Laser-Intensität 450110; Kontrast: 4500110, Pixeldimension (seitlich): 66,1 nm. Die Aufnahmen wurden mit einem 3*3 Median-Filter gefiltert (siehe Figur 4) .

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur in vivo-Markierung von DNA/Chromatin- Strukturen in einer Zelle, dadurch gekennzeichnet, daß in der Zelle eine DNA-Sequenz exprimiert wird, die ein ein Histonprotein und ein fluoreszentes Protein umfassendes Fusionsprotein codiert.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das fluoreszente Protein den C-terminalen Anteil des Fusionsproteins darstellt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Sequenz in einen Expressionsvektor inseriert und mit einem Promotor funktioneil verknüpft ist.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Promotor ein SV40-Promotor ist.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Fusionsprotein außerdem ein His-Tag enthält .
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das fluoreszente Protein BFP, CFP, GFP, RFP oder YFP ist.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Histonprotein aus einem Säugetier stammt .
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Histonprotein aus Mensch stammt.
9. Verfahren nach einem der Amsprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Histonprotein aus den Gruppen Hl, H2A, mH2A, H2B, H3 oder H4 ausgewählt ist.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Histonprotein H1.0, H2A.1, mH2A1.2, H2Ba, H3.1, Makro H2A oder H4a ist.
11. Verfahren zur Analyse der DNA-Struktur, Chromatin- Struktur, Nucleus-Struktur, Zellstruktur und/oder Zelldynamik, dadurch gekennzeichent, daß im Anschluß an das in einem der Ansprüche 1 bis 10 beschriebene Verfahren die Zellen einer Analyse der räumlichen Verteilung der Fluoreszenz unterzogen werden.
12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei die Analyse ein "Fluorescence Resonance Energy Transfer" (FRET), eine "Fluorescence Correlation Spectroscopy" (FCS) , eine "Confocal Laser Scanning Microscopy" (CLSM) , Epifloureszenz-Mikroskopie, fraktale Analyse oder eine "Flow Associated Cell Sorting" (FACS) ist.
13. Verfahren nach Anspruch 11 oder 12 zum Nachweis von Apoptose oder Lokalisierung von Genomschädigungen.
14. Verfahren zur Isolierung von Histonproteinen, dadurch gekennzeichnet, daß im Anschluß an das in einem der Ansprüche 5 bis 10 beschriebene Verfahren die Histonproteine über Affinitätschromatographie isoliert werden.
15. DNA-Sequenz, die ein Histonprotein und ein fluoreszentes Protein umfassendes Fusionsprotein codiert.
16. DNA-Sequenz nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß das fluoreszente Protein den C-terminalen Anteil des Fusionsproteins darstellt.
17. DNA-Sequenz nach Anspruch 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Sequenz in einen Expressionsvektor inseriert und mit einem Promotor funktioneil verknüpft ist.
18. DNA-Verfahren nach Anspruch 17, wobei der Promotor ein SV40-Promotor oder natürlicher Promotor ist.
19. DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 15-18, dadurch gekennzeichnet, daß das Fusionsprotein außerdem ein His-Tag enthält .
20. DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 15-19, dadurch gekennzeichnet, daß das fluoreszente Protein BFP, CFP, GFP, RFP oder YFP ist.
21. DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 15-20, dadurch gekennzeichnet, daß das Histonprotein aus einem Säugetier stammt .
22. DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 15 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß das Histonprotein aus Mensch stammt.
23. DNA-Sequenz nach einem der Amsprüche 15 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß das Histonprotein aus den Gruppen Hl, H2A, mH2A, H3 oder H4 ausgewählt ist.
24. DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 15 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß das Histonprotein Hl .0 , H2A.1, mH2Al .2 , H2Ba, H3.1, Makro H2A oder H4a ist.
25. Zelle, die die DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 15-24 enthält .
26. Zelle nach Anspruch 25, die eine Säugerzelle ist.
27. Zelle nach Anspruch 26, die eine HeLa-Zelle ist.
28. Nicht-menschliches Säugetier, das ein Fusionsprotein umfassend ein Histonprotein und ein fluoreszentes Protein exprimiert .
29. Kit zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1-14 umfassend eine DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 15-24 und/oder eine Zelle nach Anspruch 24 oder 25 sowie übliche Puffer, Reagenzien und/oder oder Behälter.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2850979A1 (fr) * 2003-02-12 2004-08-13 Centre Nat Rech Scient Nouvelle lignee cellulaire, son procede de preparation et son utilisation, notamment pour suivre l'evolution de la texture de la chromatine

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101490647B1 (ko) * 2002-08-16 2015-02-06 안티캔서, 인코포레이티드 세포성 응답의 실시간 측정
US20070148693A1 (en) * 2003-03-20 2007-06-28 Sabanci Universitesi Circular recombinant plasmid dna constructs and their protein products, methods of preparation and immobilisation of proteins on support

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU761272B2 (en) * 1998-01-12 2003-05-29 Newbiotics, Inc. Compositions and methods for treating cells having double minute DNA

Non-Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHA H J ET AL: "Purification of human interleukin-2 fusion protein produced in insect larvae is facilitated by fusion with green fluorescent protein and metal affinity ligand" BIOTECHNOLOGY PROGRESS, Bd. 15, Nr. 2, 19. M{rz 1999 (1999-03-19), Seiten 283-286, XP002121721 ISSN: 8756-7938 *
CLARKSON MICHAEL ET AL: "A His2AvDGFP fusion gene complements a lethal His2AvD mutant allele and provides an in vivo marker for Drosophila chromosome behavior." DNA AND CELL BIOLOGY, Bd. 18, Nr. 6, Juni 1999 (1999-06), Seiten 457-462, XP002176077 ISSN: 1044-5498 *
DAY RN. ET AL.: "Visualizing protein-protein interactions in the nucleus of the living cell." MOL ENDOCRINOL 1999 APR;13(4):517-26., XP002176079 *
GUNJAN AKASH ET AL: "Effects of H1 histone variant overexpression on chromatin structure." JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY., Bd. 274, Nr. 53, 31. Dezember 1999 (1999-12-31), Seiten 37950-37956, XP002176078 ISSN: 0021-9258 *
KANDA TERU ET AL: "Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells." CURRENT BIOLOGY, Bd. 8, Nr. 7, 26. M{rz 1998 (1998-03-26), Seiten 377-385, XP002176075 ISSN: 0960-9822 *
LEVER MELODY ET AL: "Dynamics in chromatin organization and histone H1-GFP association." MOLECULAR BIOLOGY OF THE CELL, Bd. 10, Nr. SUPPL., November 1999 (1999-11), Seite 280a XP001016032 ISSN: 1059-1524 & 39th Annual Meeting of the American Society for Cell Biology;Washington, D.C., USA; December 11-15, 1999 *
MISTELI TOM ET AL: "Dynamic binding of histone H1 to chromatin in living cells." NATURE (LONDON), Bd. 408, Nr. 6814, 14. Dezember 2000 (2000-12-14), Seiten 877-881, XP002176080 ISSN: 0028-0836 *
NISWENDER KD. ET AL.: "Quantitative imaging of green fluorescent protein in cultured cells: comparison of microscopic techniques, use in fusion proteins and detection limits." J MICROSC 1995 NOV;180 ( PT 2):109-16., XP001016222 *
OKABE MASARU ET AL: "'Green mice' as a source of ubiquitous green cells." FEBS LETTERS, Bd. 407, Nr. 3, 1997, Seiten 313-319, XP002176076 ISSN: 0014-5793 in der Anmeldung erw{hnt *
SADONI NICOLAS ET AL: "Large-scale chromatin fibers of living cells display a discontinuous functional organization." CHROMOSOMA (BERLIN), Bd. 110, Nr. 1, 23. Februar 2001 (2001-02-23), Seiten 39-51, XP001016154 ISSN: 0009-5915 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2850979A1 (fr) * 2003-02-12 2004-08-13 Centre Nat Rech Scient Nouvelle lignee cellulaire, son procede de preparation et son utilisation, notamment pour suivre l'evolution de la texture de la chromatine
WO2004074466A1 (fr) * 2003-02-12 2004-09-02 Centre National De La Recherche Scientifique Nouvelle lignee cellulaire, son procede de preparation et son utilisation, notamment pour suivre l'evolution de la texture de la chromatine

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Publication number Publication date
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