FR2850979A1 - Nouvelle lignee cellulaire, son procede de preparation et son utilisation, notamment pour suivre l'evolution de la texture de la chromatine - Google Patents

Nouvelle lignee cellulaire, son procede de preparation et son utilisation, notamment pour suivre l'evolution de la texture de la chromatine Download PDF

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Abstract

L'invention concerne des cellules de lignée cellulaire stable, notamment monoclonale, possédant au moins un chromosome X inactif, exprimant une protéine de fusion comprenant une protéine associé à l'hétérochromatine, notamment un variant d'histone, et une protéine fluorescente. L'invention concerne également un procédé de préparation de ladite lignée cellulaire stable et l'utilisation desdites cellules de lignée cellulaire stable pour cribler des agents susceptibles de modifier la texture de la chromatine et notamment l'état d'inactivation du chromosome X inactif.

Description

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NOUVELLE LIGNEE CELLULAIRE, SON PROCEDE DE PREPARATION ET SON UTILISATION, NOTAMMENT POUR SUIVRE L'EVOLUTION DE LA TEXTURE DE LA CHROMATINE
La présente invention a pour objet une nouvelle lignée cellulaire, son procédé de préparation et son utilisation, notamment pour suivre l'évolution de la texture de la chromatine.
La chromatine interphasique, constituée de l'association d'ADN génomique et de protéines, peut prendre une forme condensée, inactive sur le plan transcriptionnelle, l'hétérochromatine. Cette forme condensée résulte de la compaction de l'ADN réalisée par certaines protéines, dont notamment les histones, telles que les histones du nucléosome H2A, H2B, H3, H4 ou encore Hl.
Un cas particulier de formation hétérochromatique est le chromosome X inactif, ou Xi.
En effet, dans les cellules de mammifères femelles un des deux chromosomes X est quasi complètement transcriptionellement inactif, ce qui permet de compenser le doublement du nombre de copies de gènes liés au chromosome X par rapport aux cellules mâles. Durant l'interphase ce chromosome Xi est visible en microscopie sous la forme d'un élément nucléaire condensé, le corpuscule de Barr, et présente les mêmes caractéristiques que l'hétérochromatine constitutive, à savoir : une hyperméthylation des îlots CpG, une hypoacétylation des histones de c#ur H3 et H4 et une réplication tardive en phase S. Le chromosome X inactif exprime de plus un ARN qui lui est particulier l'ARN Xist (Brown et al., 1992)
La modification de la texture de la chromatine, c'est-à-dire du niveau de condensation de la chromatine, est responsable et/ou indicative, de changements importants dans le niveau d'expression des gènes, en particulier au niveau transcriptionnel. En effet, comme l'ont montré les expériences classiques réalisées sur les chromosomes polyténiques de larves de diptères, la condensation d'une région auparavant décondensée correspond à un arrêt de la transcription des gènes situés dans cette région. A contrario, la décondensation d'une région auparavant condensée correspond à une dérépression de la transcription des gènes de cette région.
Il a été montré que certaines protéines étaient plus particulièrement associées aux régions hétérochromatiques et notamment au chromosome Xi. La protéine macroH2A (Pehrson et Fried, 1992) en est un exemple particulier. Cette protéine constituée de 372 acides aminés a une taille environ 3 fois supérieure à celle d'une histone classique ; un tiers de la
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protéine, situé du côté N-terminal, présente 64% de similarité de séquence avec l'histone H2A, le reste de la protéine ne présente pas d'homologies particulières. Il a été mis en évidence que cette protéine, et notamment le sous-type macroH2Al, se concentrait de manière préférentielle dans le chromosome X inactif (Costanzi et Pehrson, 1998). Toutefois, d'autres éléments hétérochromatiques du noyau semblent également contenir cette protéine (Perche et al., 2000), mais de manière moins concentrée.
Différents modèles cellulaires permettant de visualiser le chromosome Xi, ainsi que d'autres éléments hétérochromatiques, à l'aide d'une protéine de fusion contenant la protéine macroH2A et une protéine marqueur ont été réalisés. Dans un des cas, le modèle utilise des cellules de lignée cellulaire HEK-293 (ATCC CRL-1573, Graham et al., 1977) transformées par une construction codant pour une protéine de fusion macroH2Al-Myc (Chadwick et al., 2002) ; les cellules sont fixées à l'aide de formaldéhyde et visualisées en immunofluorescence. La lignée cellulaire utilisée (HEK-293), est une lignée de cellules primaires de rein embryonnaire humain immortalisées par transformation avec un adénovirus de type 5, cette lignée contient plusieurs chromosomes X inactifs. Dans un autre cas, le modèle cellulaire empirique est constitué de cellules de cultures primaires de fibroblastes humains femelles (Perche et al., 2000), ayant par conséquent un potentiel de multiplication limité. Ces cellules sont transformées par une construction exprimant une protéine de fusion GFP-macroH2A. La GFP est une protéine émettant une fluorescence de couleur verte, bien connue de l'homme de l'art (Chalfie et al., 1994, brevet US n 5 491 084).
A ce jour, il n'est pas fait mention dans la littérature d'une lignée cellulaire stable permettant l'étude de la dynamique de la chromatine.
Un des aspects de l'invention est de fournir une nouvelle lignée cellulaire stable permettant notamment de suivre l'évolution de la texture de la chromatine.
Un des aspects avantageux de l'invention est de fournir une nouvelle lignée cellulaire permettant de suivre l'évolution de l'état d'inactivation du chromosome Xi, l'un des autres aspects de l'invention est de fournir une nouvelle lignée cellulaire stable permettant d'observer l'évolution de la texture de la chromatine dans un environnement cellulaire standard.
L'un des autres aspects de l'invention est de fournir une nouvelle lignée cellulaire permettant de tester les effets de certains agents sur la texture de la chromatine, notamment de l'hétérochromatine, et notamment sur l'état d'inactivation du chromosome Xi.
La présente invention concerne des cellules de lignée cellulaire stable, possédant au moins un chromosome X inactif, exprimant une protéine de fusion comprenant :
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- une protéine associée à l'hétérochromatine et - une protéine fluorescente.
On désigne par chromosome X inactif un chromosome X exprimant l'ARN Xist (Brown et al., 1992)
On désigne par protéine de fusion une protéine formée de l' association covalente, par le biais d'une liaison peptidique, d'au moins deux peptides, polypeptides et/ou protéines.
On désigne par lignée cellulaire stable une lignée cellulaire dont la séquence nucléotidique codant pour la protéine de fusion est intégrée dans un chromosome. Avantageusement la stabilité de la lignée cellulaire peut être vérifiée à tout moment par la résistance de ladite lignée cellulaire à un agent de sélection provoquant la mort cellulaire, tel qu'un antibiotique.
On désigne par agent de sélection un composé provoquant la mort des cellules n'exprimant pas la séquence nucléotidique codant pour la protéine de fusion, ladite séquence nucléotidique codant également pour un gène de résistance audit composé.
On désigne par protéine fluorescente une protéine émettant un rayonnement lumineux, désigné également par fluorescence, en réponse à une excitation lumineuse.
On désigne par protéine associée à l'hétérochromatine une protéine constitutive de l'hétérochromatine et notamment une protéine impliquée dans la compaction de l'ADN et pouvant participer à l'inhibition de la transcription de l'ADN.
Selon un mode de réalisation avantageux, la lignée cellulaire est monoclonale, les cellules de ladite lignée cellulaire ayant une viabilité supérieure à environ 5 jours, notamment environ 1 mois et de préférence environ 1 an.
On désigne par monoclonale une lignée cellulaire issue de la division d'une seule cellule.
La viabilité est définie comme la capacité des cellules de la lignée cellulaire à se multiplier.
L'intérêt de disposer d'une lignée cellulaire monoclonale selon l'invention est de créer un environnement cellulaire standard. On désigne par environnement cellulaire standard un ensemble de cellules dont les caractéristiques génétiques sont substantiellement identiques.
Selon un autre mode de réalisation avantageux, dans les cellules de l'invention la protéine associée à l'hétérochromatine est un variant d'histone.
On désigne par variant d'histone une isoforme non-allélique d'une histone naturelle ou majoritaire, telle que H2A, H2B, H3, H4 ou Hl, et qui diffère de ladite histone naturelle ou majoritaire par mutation, délétion ou insertion d'au moins un acide aminé.
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Les variants d'histone sont constitutifs de la chromatine, ces protéines peuvent être de plus constitutives de l'hétérochromatine et peuvent avoir une fonction de répression de la transcription.
L'invention concerne notamment des cellules pour lesquelles la protéine associée à l'hétérochromatine est associée au chromosome X inactif.
L'association de la protéine associée à l'hétérochromatine au chromosome X inactif peut être vérifiée par la localisation du marquage de ladite protéine associée à l'hétérochromatine, par exemple à l'aide d'un anticorps spécifique, sur un même élément nucléaire que le marquage de l'ARN Xist, par exemple par hybridation in situ fluorescente (FISH).
Un des intérêts d'utiliser le chromosome X inactif est que celui-ci est essentiellement hétérochromatique. Le chromosome X inactif est la région hétérochromatique la plus aisément identifiable dans les cellules de mammifères.
Selon un autre mode de réalisation, les cellules de l'invention sont susceptibles d'être observées vivantes en microscopie à fluorescence, la longueur d'onde d'excitation étant d'environ 380 nm à environ 600 nm.
Les processus métaboliques des cellules de l'invention sont actifs durant l'observation desdites cellules, notamment les processus de modification de la texture de la chromatine.
On désigne par microscopie à fluorescence un procédé d'observation utilisant un microscope comprenant une source lumineuse permettant d'exciter des molécules fluorescentes et un récepteur sensible à la fluorescence émise par lesdites molécules.
On désigne par texture de la chromatine la distribution dans le noyau cellulaire, ou la topologie, d'une intensité correspondant à un marquage de la chromatine et traduisant en particulier le niveau de condensation de la chromatine. Cette notion est notamment définie par Colomb et al. (1991) et utilisée par Mongelard et al. (1999).
La mesure de la texture de la chromatine ou du niveau de condensation de la chromatine ou de l'état d'inactivation d'un chromosome est notamment réalisée par imagerie de fluorescence en mesurant les variations topologiques d'un marquage fluorescent de la chromatine, notamment au travers de l'intensité lumineuse émise en microscopie à fluorescence.
L'invention concerne en particulier des cellules, dans lesquelles le rapport entre la concentration molaire de la protéine de fusion exprimée et la concentration molaire de la protéine associée à l'hétérochromatine naturellement exprimée par lesdites cellules est inférieur à environ 3, notamment compris d'environ 0,1 à environ 2 et notamment inférieur à environ 1.
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On désigne par protéine associée à l'hétérochromatine naturellement exprimée la protéine correspondant à la protéine associée à l'hétérochromatine comprise dans la protéine de fusion et dont le gène est présent dans lesdites cellules avant la transformation par une construction d'ADN codant pour la protéine de fusion ci-dessus.
On peut mesurer le rapport ci-dessus par un transfert de Western à l'aide d'anticorps dirigés contre la protéine associée à l'hétérochromatine.
L'intérêt de la valeur du rapport ci-dessus est qu'il permet de maintenir le niveau d'expression total de la protéine associée à l'hétérochromatine à un niveau proche de l'état naturel, le rapport ci-dessus permet notamment de maintenir la viabilité de la cellule. Si ce rapport est supérieur à environ 3 la viabilité des cellules ci-dessus est significativement plus faible que celle des cellules correspondantes n'exprimant la protéine de fusion.
Selon un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, les cellules dérivent d'une lignée cellulaire choisie parmi HEK-293 et hTERT-RPEl.
Les cellules dérivent d'une lignée cellulaire signifie que les cellules sont des cellules de lignées cellulaires transfectées par un transgène codant pour une protéine de fusion telle que définie ci dessus.
La lignée cellulaire HEK-293 est décrite par Graham et al., 1977. La lignée cellulaire hTERT-RPEl est décrite par Bodnar et al., 1998.
La lignée cellulaire HEK-293 est une lignée femelle comportant au moins deux chromosomes X inactifs. De plus, les cellules HEK-293 sont adhérentes en culture cellulaire, ce qui facilite leur observation en microscopie. Par ailleurs, ces cellules expriment un récepteur de surface pour la vitronectine, composé de la sous-unité béta-1 de l'intégrine et de la sous unité alpha-v du récepteur à la vitronectine. Ce récepteur constitue une cible pour la recherche de molécules synthétiques ou naturelles impliquées dans les cancers et l'ostéoporose (Henry et al., 2002).
Selon un mode de réalisation avantageux, dans les cellules de l'invention la protéine associée à l'hétérochromatine est une histone modifiée, notamment un variant d'histone, choisie parmi une protéine de la famille macroH2A, notamment macroH2Al.l ou macroH2A1.2.
Les caractéristiques de macroH2A sont décrites dans Pehrson et Fried, 1992. macroH2Al.l et macroH2A1.2 sont deux isoformes de macroH2Al (Pehrson et Fried, 1992) codées par un même gène et issues de l'épissage alternatif d'un même ARN pré-messager.
La protéine macroH2A est plus concentrée dans le chromosome X inactif que dans les autres chromosomes, notamment le chromosome X actif (Costanzi et Pehrson, 1998). La
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protéine macroH2A est exprimée dans essentiellement toutes les cellules de l'organisme, chez les mammifères et également chez les oiseaux. Cette protéine permet un marquage essentiellement total du chromosome X inactif.
L'invention concerne notamment des cellules, dans lesquelles la protéine fluorescente est choisie dans une liste comprenant YFP, GFP, CFP, BFP, DsRed et HcRed.
On désigne par GFP une protéine émettant une fluorescence de couleur verte (de longueur d'onde approximative 507 nm) correspondant à la protéine émettant une fluorescence de couleur verte de Aequorea victoria (Chalfie et al., 1994, brevet US n 5 491 084) ou de Renilla reniformis (demande de brevet US n 2002/0064842) ou étant dérivée par mutation, insertion et/ou délétion de ces protéines.
On désigne par YFP (Ormö et al., 1996), CFP (Heim et al., 1996) et BFP (Heim et al., 1996) des protéines émettant respectivement une fluorescence de couleur jaune (de longueur d'onde approximative 527 nm), cyan (de longueur d'onde approximative 475 nm) et bleue (de longueur d'onde approximative 440 nm) et dérivées par mutation, insertion et/ou délétion de GFP.
On désigne par DsRed une protéine émettant une fluorescence de couleur rouge (de longueur d'onde approximative 580 nm) correspondant à la protéine émettant une couleur rouge de Discosoma sp. (Matz et al., 1999) ou étant dérivée de celle-ci par mutation, insertion et/ou délétion.
On désigne par HcRed une protéine émettant une fluorescence de couleur rouge (de longueur d'onde approximative 588 ou 618 nm) correspondant à la protéine émettant une couleur rouge de Heteractis crispa (Gurskaya et al., 2001) ou étant dérivée de celle-ci par mutation, insertion et/ou délétion.
Selon un mode de réalisation préféré, la protéine fluorescente, notamment GFP, est codée par un gène humanisé.
On désigne par gène humanisé un gène dont au moins un des codons a été remplacé par un codon synonyme, dont la fréquence d'utilisation par l'appareil traductionnel humain est plus élevée que celle du codon remplacé.
Ces protéines sont utilisables en microscopie à fluorescence. Elles permettent notamment de réaliser des expériences de FRAP (retour de fluorescence après photo-blanchiment), de FRET (transfert d'énergie de fluorescence par résonnance) ou de co-localisation (localisation de molécules en même temps au sein d'une même cellule).
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Selon un autre mode de réalisation, les cellules dérivent de cellules de la lignée HEK-293 dans lesquelles la protéine associée à l'hétérochromatine est macroH2A1.2 et la protéine fluorescente est YFP.
Avantageusement, l'extrémité N-terminale de la protéine macroH2A est liée à l'extrémité C-terminale de la protéine YFP.
Avantageusement, la protéine YFP est de type EYFP.
Avantageusement, la protéine YFP peut être utilisée pour des expériences de transfert d'énergie par résonance de fluorescence (FRET).
Selon un autre mode de réalisation, l'invention a pour objet une protéine comprenant la protéine de fusion (SEQ ID NO : 2) constituée par macroH2Al.2 et la protéine YFP.
L'invention a également pour objet la séquence nucléotidique (SEQ ID NO : 1) codant pour la protéine de fusion ci-dessus.
L'invention concerne également un procédé de préparation de cellules de lignée cellulaire stable, possédant au moins un chromosome X inactif, exprimant une protéine de fusion comprenant : - une protéine associée à l'hétérochromatine, notamment une histone modifiée, notamment une protéine associée au chromosome X inactif, et - une protéine fluorescente, comprenant : - une étape de sélection parmi des cellules de lignée cellulaire transformées par une séquence nucléotidique codant pour ladite protéine de fusion, notamment par culture desdites cellules transformées en présence d'un agent de sélection afin d'éliminer les cellules non-transformées et les cellules transformées ayant intégré ladite séquence nucléotidique de manière transitoire, pour obtenir des cellules de lignée cellulaire stable.
On désigne par transitoire une séquence nucléotidique ne s'étant pas intégrée dans un chromosome de la cellule transformée.
L'agent de sélection est par exemple un antibiotique, tel que la généticine (G418), la puromycine, la basticidine S, la phléomycine ou l'hygromycine B.
L'invention concerne plus particulièrement un procédé de préparation de cellules de lignée cellulaire monoclonale stable, possédant au moins un chromosome X inactif, exprimant une protéine de fusion comprenant : - une protéine associée à l'hétérochromatine, notamment une histone modifiée, notamment une protéine associée au chromosome X inactif, et
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- une protéine fluorescente, lesdites cellules ayant une viabilité supérieure à environ 5 jours, notamment environ 1 mois et de préférence environ 1 an, comprenant : - une étape de sélection par cytométrie de flux parmi les cellules de lignée cellulaire stable obtenues par la mise en oeuvre du procédé ci-dessus pour obtenir des cellules de lignée cellulaire stable monoclonale ayant une viabilité supérieure à environ 5 jours, notamment environ 1 mois et de préférence environ 1 an.
Avantageusement les cellules émettant une fluorescence détectée à l'aide d'un filtre LP (passe haut) 530 nm sont sélectionnées par cytométrie de flux avec une excitation lumineuse à 488 nm de sorte que les cellules retenues présentent une intensité de fluorescence significativement différente du bruit de fond.
L'invention concerne plus particulièrement un procédé de préparation de cellules de lignée cellulaire stable monoclonale dérivées de la lignée cellulaire HEK-293, exprimant une protéine de fusion comprenant le facteur macroH2Al .2 et la protéine fluorescente YFP.
L'invention concerne notamment des cellules telles qu'obtenues par la mise en #uvre du procédé ci-dessus.
L'invention concerne également un procédé de préparation de cellules de lignée cellulaire définies ci-dessus, comprenant : - une étape de sélection parmi des cellules de lignée cellulaire transformées par une séquence nucléotidique codant pour ladite protéine de fusion, notamment par culture desdites cellules transformées en présence d'un agent de sélection afin d'éliminer les cellules non transformées et les cellules transformées ayant intégré ladite séquence nucléotidique de manière transitoire et la récupération de cellules de lignée cellulaire stable et éventuellement, - une étape de sélection par cytométrie de flux parmi les susdites cellules de lignée cellulaire stable pour obtenir des cellules de lignée cellulaire stable monoclonale ayant une viabilité supérieure à environ 5 jours, notamment environ 1 mois et de préférence environ 1 an.
L'invention a également pour objet l'utilisation des cellules de lignée cellulaire ci-dessus, pour suivre l'évolution de la texture de la chromatine présente dans lesdites cellules et notamment l'état d'inactivation d'au moins un chromosome X inactif présent dans lesdites cellules.
On désigne par état d'inactivation du chromosome X inactif le niveau de condensation de la chromatine constitutive du chromosome X inactif.
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L'état d'inactivation du chromosome X inactif ou le niveau de condensation de la chromatine constitutive du chromosome X inactif est notamment mesurable par imagerie de fluorescence, en mesurant les variations topologiques d'un marquage fluorescent de la chromatine, notamment au travers de l'intensité lumineuse émise en microscopie de fluorescence.
L'invention à également pour objet l'utilisation des cellules de lignée cellulaire ci-dessus, pour suivre l'évolution de la texture de l'hétérochromatine présente dans lesdites cellules.
L'évolution de la texture de la chromatine, notamment de l'hétérochromatine, est notamment suivie à l'aide d'une protéine de fusion comprenant une protéine associée à l'hétérochromatine et une protéine fluorescente. La protéine de fusion est un marqueur fluorescent de l'hétérochromatine. Lorsque l'hétérochromatine se décondense (en chromatine), l'intensité lumineuse du marquage dû à ladite protéine de fusion diminue.
Lorsque la chromatine se condense (en hétérochromatine), le marquage lumineux dû à ladite protéine de fusion apparaît et/ou l'intensité lumineuse du marquage augmente.
L'invention concerne également un procédé de suivi de l'évolution de la texture de la chromatine et notamment de l'état d'inactivation du chromosome X inactif comprenant l'observation en microscopie à fluorescence de la texture de la chromatine et notamment de l'état d'inactivation d'au moins un chromosome X inactif des cellules ci-dessus.
L'invention a également pour objet l'utilisation des cellules de lignées cellulaires cidessus pour cribler des agents susceptibles de modifier la texture de la chromatine et notamment l'état d'inactivation du chromosome X inactif, tels que des parasites cellulaires ou des virus, des radiations ou des rayonnements, des molécules organiques ou inorganiques, synthétiques ou naturelles, et notamment des composés xénobiotiques, des molécules d'intérêt pharmaceutique, des drogues, des médicaments, des métaux, deshormones, des extraits cellulaires.
On désigne par xénobiotique une substance étrangère à un organisme donné et possédant des propriétés toxiques vis-à-vis de cet organisme.
L'invention concerne également un procédé de criblage d'agents à tester, tels que des parasites cellulaires ou des virus, des radiations ou des rayonnements, des molécules organiques ou inorganiques, synthétiques ou naturelles, et notamment des composés xénobiotiques, des molécules pharmaceutiques, des drogues, des médicaments, des métaux, des hormones, des extraits cellulaires susceptibles de modifier la texture de la chromatine et notamment l'état d'inactivation du chromosome X inactif, comprenant,
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- l'observation en microscopie à fluorescence de la texture de la chromatine et notamment de l'état d'inactivation d'au moins un chromosome X inactif de cellules ci- dessus, - l'ajout d'un agent à tester aux cellules observées, - le suivi en microscopie à fluorescence de l'évolution de la texture de la chromatine et notamment de l'état de condensation d'au moins un chromosome X inactif des cellules auxquelles un agent à tester a été ajouté, pour évaluer l' effet dudit agent à tester sur la texture de la chromatine et notamment sur l'état d'inactivation du chromosome X inactif.
Les cellules de la lignée cellulaire de l'invention expriment une protéine associée aux régions hétérochromatiques, notamment au chromosome X inactif, couplée à un marqueur fluorescent permettant ainsi d'observer l'évolution de la texture de la chromatine et notamment l'évolution de l'état d'inactivation du chromosome X inactif, en réponse à certains agents induisant une condensation ou une décondensation de la chromatine.
La lignée cellulaire de l'invention est stable, ce qui permet d'observer l'évolution de la texture de la chromatine dans un environnement cellulaire standard, limitant ainsi la variabilité expérimentale liée aux cellules utilisées, notamment dans le cadre de l'évaluation des effets de modification de la texture chromatinienne induits par certains agents.
Avantageusement, la lignée cellulaire de l'invention permet de tester les effets de certains agents, notamment dans le cadre de criblages à haut débit, tels que des parasites cellulaires ou des virus, des radiations ou des rayonnements, des molécules organiques ou inorganiques, synthétiques ou naturelles, et notamment des composés xénobiotiques, des molécules pharmaceutiques, des drogues, des médicaments, des métaux, des hormones, des extraits cellulaires, sur la texture de la chromatine, et notamment sur l' état d'inactivation du chromosome X inactif. La modification de la texture de la chromatine, et notamment de l'état d'inactivation du chromosome X inactif due aux effets de ces composés peut en effet altérer de manière importante le profil d'expression génique d'une cellule, conduisant à des dérèglements pathologiques pouvant aboutir à des développements de type cancéreux par exemple.
Figure 1A et Figure 1B
Les Figures 1A et 1B représentent le profil de fluorescence obtenu en trieur de cellules (FACS), de cellules HEK-293 transfectées par pEYFP-Cl-macroH2A stables. L'axe des abscisses, gradué selon une échelle logarithmique, correspond à l'intensité de fluorescence
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mesurée. L'axe des ordonnées correspond au pourcentage de cellules ayant une valeur de fluorescence donnée.
Dans la Figure 1A, trois pics de fluorescence, notés 1, 2 et 3 sont visibles. Le pic 1 correspond à des cellules non fluorescentes, le pic 2 à des cellules faiblement ou moyennement fluorescentes (54% du total des cellules triées), le pic 3 à des cellules fortement fluorescentes (3% du total des cellules triées).
Dans la Figure 1 B, les cellules triées sont issues du pic 2 obtenu lors du premier passage en trieur de cellules (correspondant à la Figure 1A). Le pic marqué d'une flèche représente les cellules émettant une fluorescence faible ou moyenne, ces cellules représentent 71% du total des cellules triées.
Figure 2
La figure 2 représente une photographie d'un transfert de Western réalisé à partir d'extraits protéiques de cellules de trois lignées HEK-293 transfectées par pEYFP-ClmacroH2A stables monoclonales différentes et de cellules d'une lignée HEK-293 témoin. La piste A correspond à la lignée témoin, les pistes B, C et D correspondent chacune à une lignée HEK-293 transfectée par pEYFP-Cl-macroH2A stable monoclonale différente. Sur la partie gauche du transfert, les limites de migration correspondant à des protéines de poids moléculaires 85 kDa et 39 kDa sont repérées par des flèches. Sur la partie droite du transfert les bandes correspondant à la protéine YFP-macroH2A et à la protéine macroH2A endogène sont repérées par des flèches. Les protéines sont repérées à l'aide d'un anticorps polyclonal de lapin anti-macroH2Al.2.
Figure 3 La figure 3 représente une photographie obtenue en microscopie confocale de cellules HEK- 293 transfectées par pEYFP-Cl-macroH2A stables monoconales. Quatre cellules nommées A, B, C et D sont visibles sur ce plan. Deux chromosomes X inactifs marqués par la protéine YFP-macroH2A sont visibles dans la cellule C sous la forme de deux taches claires situées de part et d'autre de la cellule.
Figure 4 La figure 4 représente la séquence nucléotidique du gène de la protéine de fusion YFPmacroH2A (en majuscule) superposée à la séquence peptidique correspondante de la protéine YFP-macroH2A en code à trois lettres des acides aminés.
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Exemple 1 Construction du plasmide peYFP-Cl-macroH2A
La séquence d'ADN correspondant à macroH2Al.2 a été amplifiée par PCR à partir d'une banque d'ADNc de muscle squelettique humain f#tal (Marathon-Ready PCR cDNA, Clontech, USA). Deux PCR ont été réalisées à partir des couples d'amorces oligonucléotidiques suivants : Macro 1.2-5' (SEQ ID NO : 3) : 5' ctgacccttattcacagtgaaatcagtaatttag 3' Macro l.X-3' (SEQ ID NO : 4) : 5' gttggcgtccagcttggccatttcctgcacatag 3' Macro l.X-5' (SEQ ID NO : 5) : 5' ccatgtcgagccgcggtgggaagaagaagtcc 3' Macro 1.2-3' (SEQ ID NO : 6) : 5' gtgtttcctaggtcatctttagggtcaatg 3'
Les deux produits obtenus ont alors servi de matrice dans une troisième PCR en présence des oligonucléotides Macrol.2-5' et Macrol.2-3' pour former un fragment d'ADN contenant l'intégralité de la séquence codante de macroH2A1.2 et aux extrémité duquel se trouvent les sites de restriction BglII en 5' et EcoRI en 3'. Le fragment PCR obtenu a été digéré par ces enzymes et inséré dans les sites de restrictions correspondants du plasmide pEYFP-Cl (Clontech, USA) en aval de la phase ouverte de lecture codant YFP, pour former la phase de lecture ouverte (SEQ ID NO : 1) (Figure 4) codant pour la protéine de fusion YFP-macroH2A (SEQ ID NO : 2) (Figure 4). Le plasmide ainsi obtenu a été nommé pEYFPCl-macroH2A, ce plasmide porte en outre le gène Kanr conférant la résistance à la généticine (G418).
Transfection des cellules HEK-293 par le plasmide pEYFP-Cl-macroH2A
Des cellules de la lignée HEK-293 (ATCC CRL-1573) ont été transfectées par le plasmide pEYFP-C 1-macroH2A.
Les cellules HEK-293 sont entretenues en boites de culture de diamètre 100 mm (Falcon) notamment dans du milieu de culture DMEM 10% SVF contenant 500 ml de milieu DULBECCO'MEM avec glutamax, sans pyruvate de sodium (DMEM, GIBCO), 50 ml de sérum de veau f#tal (SVF) décomplémenté et 2,75 ml de gentamycine 10 mg/ml. Le milieu de culture des cellules est renouvelé tous les 3 jours : les cellules sont détachées à l'aide d'une solution de trypsine (trypsine 1 %, gentamycine 8 g/ml) et reprises dans du tampon DMEM
10% SVF pour un volume final de 10 ml. Un volume de 1,5 ml de cette suspension est alors transféré dans une nouvelle boite contenant 8,5 ml de milieu DMEM 10% SVF.
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Un jour avant la transfection 2,5 ml de cellules HEK-293 en culture sont prélevés et mélangés à 12,5 ml de milieu DMEM 10% SVF, 5 ml de cette suspension sont alors répartis dans les alvéoles de diamètre 35 mm de boites en polystyrène à 6 alvéoles (Costar).
La transfection est réalisée sur les alvéoles présentant 70% de confluence, comme estimé au microscope. Après lavage avec 1 ml de milieu OPTIMEM sans sérum (GIBCO), 900 l de ce même milieu sont déposés dans les alvéoles sélectionnées. On ajoute alors 100 l d'un mélange, pré-incubé 20 minutes, contenant 50 l de milieu EXGEN et 50 l de la solution de plasmide pEYFP-Cl-macroH2A à 0,02 g/ l. Le milieu EXGEN contient 4 l d'agent transfectant EXGEN 500 (EUROMEDEX) et de l'eau en quantité suffisante pour 50 l. Les plaques sont alors placées en étuve CO2 (5%) à 37 C. 6 heures plus tard, 4 ml de milieu DMEM 20% SVF sont ajoutés puis les plaques sont incubées pendant 48 heures dans les mêmes conditions.
L'obtention de cellules transfectées est vérifiée par observation de la fluorescence émise par les cellules présentes dans les alvéoles à l'aide d'un microscope AXIOVERT 135 TV, filtre YFP (longueur d'onde d'excitation 488 nm, fluorescence émise observée au-delà de 525 nm).
Obtention de lignées stables HEK-293 transfectées par le plasmide pEYFP-Cl-macroH2A
Les cellules transfectées sont détachées de leur support par trypsinolye et reprises dans un volume de 1,25 ml de milieu DMEM 10% SVF par alvéole. Un volume de 312 l est alors prélevé et dilué dans 60 ml de milieu de sélection DMEM 10% SVF + G418 contenant 1 mg/ml de G418 (ou généticine, GIBCO). Cette suspension est alors répartie dans 5 boites de polystyrène de diamètre 100 mm. Les boites sont incubées 3 jours dans les conditions précédemment citées sans changer le milieu, puis le milieu de sélection est renouvelé par moitié tous les 2 jours pendant 10 jours.
Lorsque les tapis cellulaires arrivent à environ 80% de confluence, les cellules d'une boite sont décollées par trypsinolyse et reprises dans 1,25 ml de milieu DMEM 10% SVF. Un volume de 312 l est à nouveau prélevé et dilué dans 60 ml du milieu de sélection DMEM
10% SVF + G418. Cette suspension est répartie comme précédemment dans 5 boites de polystyrène de diamètre 100 mm et une incubation similaire à celle décrite ci-dessus est réalisée.
A l'issu de cette étape, les lignées cellulaires obtenues sont considérées stables. La pression de sélection à laquelle les cellules ont été soumises durant 26 jours ayant permis de
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sélectionner les cellules pour lesquelles le transgène est présent et intégré dans un chromosome.
Sélection d'une lignée stable monoclonale
Le tapis cellulaire d'une des boites de culture précédentes est décollé par trypsinolyse et les cellules obtenues sont reprises dans 1 ml de milieu DMEM + G418 (sans sérum). Cette suspension est alors passée dans un trieur de cellules (FACS) de type Coulter Elie EPICS. Les cellules sont excitées par un laser argon de longueur d'onde 488 nm et l'émission de fluorescence est observée au-delà de 525 nm grâce à un filtre YFP. Lors d'un premier passage des cellules, trois pics de fluorescence, correspondant aux cellules n'émettant pas de fluorescence, émettant une fluorescence faible à moyenne ou émettant une fluorescence forte sont observables (Figure 1A). Un deuxième passage a permis de récupérer individuellement des cellules issues du pic de florescence faible à moyenne et du pic de fluorescence forte en plaques de 96 puits contenant 100 III de milieu de sélection sans sérum. Le profil de fluorescence des cellules récupérées dans le pic de fluorescence faible à moyenne est représenté dans la Figure 1B. 5 plaques ont été utilisées pour le pic de fluorescence faible à moyenne et 1 plaque pour le pic de fluorescence forte. 100 III de milieu DMEM 20% SVF + G418 sont alors ajoutés et il est vérifié 12 à 24h plus tard que chaque puits ne contient qu'une seule cellule.
Les plaques sont ensuite incubées 1 semaine dans une étuve CO2 (5%) sans renouveler le milieu. Le milieu est alors remplacé par 100 fil de milieu DMEM 10% SVF + G418 qui est renouvelé par 50 III tous les 3 jours durant 10 jours.
Suite à cette incubation les puits sont observés directement à l'aide d'un microscope AXIOVERT 135 TV, filtre YFP et les puits présentant un tapis cellulaire dont la fluorescence est homogène sont sélectionnés. Ces puits présentent une population cellulaire monoclonale (i.e. issue d'une même cellule). Les cellules des puits correspondants sont alors détachées par trypsinolyse et reprises dans 2 ml de milieu DMEM 10% SVF +G418.18 clones issus du pic de fluorescence faible à moyenne et 11clones issus du pic de fluorescence forte ont ainsi été sélectionnés. La suspension obtenue pour chaque population clonale sélectionnée est répartie dans 2 plaques de 24 puits (NUNUCLEON) dont l'une contient des lamelles de verre traitées avec du collagène de type I (EUROMEDEX) à 30 ug/ml. Lorsque les cultures cellulaires sur lamelles de verre sont à 70% de confluence, celles-ci sont rincées par du PBS (tampon phosphate salin) et fixées par du PFA 3% (paraformaldéhyde 3% en PBS). Les lamelles sont alors observées à l'aide d'un microscope inversé ZEISS AXIOVERT 100M, objectif x63,
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filtre YFP pour valider la présence d'une fluorescence homogène, de cellules à différents stade de divisions cellulaires et de corpuscule nucléaires fluorescents. Les cellules des plaques correspondant aux plaques avec lamelles de verre pour lesquelles ces observations se sont avérées positives ont été détachées par trypsinolyse et mises en culture en boite de 100 mm avec le milieu de sélection DMEM 10% SVF + G418 0,3 mg/ml. Le clone définitif a été choisi après plusieurs phases successives d'observation en boites BIOPTECH à l'aide d'un microscope inversé ZEISS AXIOVERT 100M, objectif x63, filtre YFP, pour vérifier la persistance des caractéristiques de fluorescence homogène, de cellules à différents stade de divisions cellulaires et de corpuscule nucléaires fluorescents.
Cette étape de sélection permet d'obtenir une lignée cellulaire stable, monoclonale, viable à long terme, la viabilité en culture des cellules sélectionnée est en effet supérieure à 1 an, et ayant des caractéristiques de fluorescence bien définies.
Exemple 2 Expression de la protéine de fusion YFP-macroH2A
L'expression de la protéine de fusion YFP-macroH2A par les cellules HEK-293 transfectées par le plasmide pEYFP-Cl-macroH2A stables monoclonales a été mesurée par transfert de Western et comparée à l'expression de la protéine macroH2A1.2 endogène pour trois lignées HEK-293 transfectées par le plasmide pEYFP-Cl-macroH2A stables monoclonales différentes (Figure 2).
Les cellules des différentes lignées cellulaires ont été cultivées dans les conditions décrites ci-dessus puis centrifugées. Les culots cellulaires obtenus ont été ensuite repris dans une solution d'urée 9M et soumis à une sonication. Quatre échantillons de 10 g d'extraits protéiques ainsi obtenus ont alors été déposés respectivement sur quatre pistes d'un gel SDS/PAGE 8%. Après migration électrophorétique et transfert des protéines sur membrane selon des techniques bien connues de l'homme de l'art, la membrane de transfert a été incubée en présence d'un anticorps polyclonal de lapin dirigé contre la protéine macroH2A1.2. La révélation du marquage a été réalisée à l'aide d'un anticorps anti-lapin couplé à la peroxydase (Promega Biotech Corporation).
Les résultats présentés dans la Figure 2 indiquent que pour chacune des lignées testée la quantité de protéine de fusion YFP-macroH2A exprimée est inférieure à la quantité de protéine endogène macroH2Al .2 exprimée.
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Exemple 3 Observation en microscopie à fluorescence des domaines nucléaires marqués par YFPmacroH2A
Trois modes d'observation en microscopie à fluorescence ont été utilisés :
Microscopie à fluorescence conventionnelle
Les cellules sont fixées par du paraformaldéhyde 3% en PBS et observées avec un microscope droit équipé d'une lampe au mercure 50 Watt et d'un jeu de filtres XF1068, XF2030 et XF3074 (Omega Optical, USA). Les images sont acquises par une caméra CCD.
Microscopie inversée à fluorescence sur cellules vivantes
Les cellules à observer sont cultivées et observées dans des boites de culture à fond en verre de 17 mm, comme décrit dans l'exemple 1. Lors de l'observation le milieu de culture L15 (GIBCO) supplémenté par 10% de SVF est utilisé afin de compenser l'absence d'enrichissement en C02. Les cellules sont maintenues à température contrôlée constante ou variable (entre 32 C et 40 C) selon les expériences. Le microscope inversé est équipé du jeu de filtres XF1068, XF2030 et XF3074 (Omega Optical, USA). Les cellules sont observées vivantes durant plusieurs heures à raison d'une acquisition d'image toute les 3 à 60 minutes au moyen d'une caméra CCD pilotée par le logiciel Metamorph (Universal Imaging, USA).
Microscopie confocale sur cellules vivantes
Les cellules à observer sont placées dans des boites de culture à fond en verre de 17 mm en milieu L15 (GIBCO) supplémenté par 10% de SVF. Les boites de culture sont disposées sur la platine du microscope confocal dans un incubateur, à température contrôlée.
Les fluorophores sont excités par un laser Argon (Lasos, USA) à 515 nm (<5 mW) et analysées par l'intermédiaire d'un système multi-PMT confocal équipé d'un dispositif de séparation spectral de la lumière (SP2, Leica, Meinnheim, Allemagne). Le chromosome X inactif est alors visible sous la forme d'une zone lumineuse bien définie (Figure 3).
Exemple 4 Observation de l'évolution de la texture de la chromatine en réponse à l'ajout d'agents à tester aux cellules de lignée stable monoclonale HEK-293 transfectée par le plasmide pEYFP-ClmacroH2A
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Les cellules obtenues suite à la mise en #uvre de l'exemple 1 sont placées dans des boites de culture à fond en verre de 17 mm en milieu L15 (GIBCO) supplémenté par 10% de SVF. Les boites de culture utilisées sont pourvues d'un dispositif de perfusion permettant l'introduction contrôlée des agents à tester dans le milieu de culture. Les boites sont placées sur la platine d'un microscope inversé équipé d'une enceinte permettant la régulation des conditions de culture des cellules. Le microscope utilisé est également pourvu d'une caméra CCD (circuit à transfert de charge). L'ensemble du dispositif est piloté par le logiciel Metamorph (Universal, Imaging, USA) qui contrôle le microscope et la platine motorisée, enregistre et contrôle les conditions de culture et gère l'acquisition des images au cours de l'expérience.
Dans un premier temps, différents champs d'observations des cellules, comprenant notamment un chromosome X inactif, sont définis par l'opérateur, il est également possible de choisir différents grossissements, ces paramètres sont alors enregistrés par le logiciel de pilotage. Suite au paramétrage, le procédé d'observation se divise en trois étapes, normalisation, acquisition et analyse. Ce procédé peut être réalisé de manière semi-manuelle ou automatique : - l'étape de normalisation consiste à fixer l'état de référence avant la mise en contact des cellules avec le ou les agent (s) sur une durée fixée par l'opérateur ou par le logiciel de contrôle, - les cellules sont alors mises en présence de l'agent à tester grâce au dispositif d'injection ou par vaporisation. Une suite d'acquisition d'images est lancée pour une durée prédéfinie ou dépendante des modifications de texture au cours du temps, - l'analyse de la texture est réalisée en temps réel,,au cours de l'expérience, ou a posteriori.
Les algorithmes d'analyse de texture utilisés sont notamment décrits par Colomb et al.
(1991), Pappas (1992), Einstein et al. (2002) et Albregsten et al. (1994). Les résultats obtenus permettent d'évaluer l'influence du ou des agent (s) tester sur la texture de la chromatine et notamment sur l'état d'inactivation du chromosome X inactif. Ce procédé peut également être utilisé dans le cadre d'un criblage à haut débit.
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Claims (21)

  1. REVENDICATIONS 1. Cellules de lignée cellulaire stable, possédant au moins un chromosome X inactif, exprimant une protéine de fusion comprenant : - une protéine associé à l'hétérochromatine et - une protéine fluorescente.
  2. 2. Cellules de lignée cellulaire selon la revendication 1, pour lesquelles ladite lignée cellulaire est monoclonale, lesdites cellules ayant une viabilité supérieure à environ 5 jours, notamment environ 1 mois et de préférence environ 1 an.
  3. 3. Cellules selon la revendication 1 ou 2, dans lesquelles la protéine associée à l'hétérochromatine est un variant d'histone.
  4. 4. Cellules selon l'une des revendications 1 à 3, pour lesquelles la protéine associée à l'hétérochromatine est associée au chromosome X inactif.
  5. 5. Cellules selon l'une des revendications 1 à 4, susceptibles d'être observées vivantes en microscopie à fluorescence, la longueur d'onde d'excitation étant d'environ 380 nm à environ 600 nm.
  6. 6. Cellules selon l'une des revendications 1 à 5, dans lesquelles le rapport entre la concentration molaire de la protéine de fusion exprimée et la concentration molaire de la protéine associée à l'hétérochromatine naturellement exprimée par lesdites cellules est inférieur à environ 3, notamment compris d'environ 0,1à environ 2 et notamment inférieur à environ 1.
  7. 7. Cellules selon l'une des revendications 1 à 6, dérivant d'une lignée cellulaire choisie parmi HEK-293 et hTERT-RPEl.
  8. 8. Cellules selon l'une des revendications 1 à 7, dans lesquelles la protéine associée à l'hétérochromatine est une histone modifiée, notamment un variant d'histone, choisie parmi une protéine de la famille macroH2A, notamment macroH2Al.l ou macroH2A1.2.
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  9. 9. Cellules selon l'une des revendications 1 à 8, dans lesquelles la protéine fluorescente est choisie dans une liste comprenant YFP, GFP, CFP, BFP, DsRed et HcRed.
  10. 10. Cellules selon l'une des revendications 1 à 9, dérivant de cellules de la lignée HEK-
    293 et dans lesquelles la protéine associée à l'hétérochromatine est macroH2A1.2 et la protéine fluorescente est YFP.
  11. 11. Protéine comprenant la protéine de fusion (SEQ ID NO : 2) constituée par macroH2Al .2 et la protéine YFP.
  12. 12. Séquence nucléotidique (SEQ ID NO : 1) codant pour une protéine selon la revendication 11.
  13. 13. Procédé de préparation de cellules de lignée cellulaire stable, possédant au moins un chromosome X inactif, exprimant une protéine de fusion comprenant : - une protéine associée à l'hétérochromatine, notamment une histone modifiée, notamment une protéine associée au chromosome X inactif, et - une protéine fluorescente, comprenant : - une étape de sélection parmi des cellules de lignée cellulaire transformées par une séquence nucléotidique codant pour ladite protéine de fusion, notamment par culture desdites cellules transformées en présence d'un agent de sélection afin d'éliminer les cellules non-transformées et les cellules transformées ayant intégré ladite séquence nucléotidique de manière transitoire, pour obtenir des cellules de lignée cellulaire stable.
  14. 14. Procédé de préparation de cellules de lignée cellulaire monoclonale stable, possédant au moins un chromosome X inactif, exprimant une protéine de fusion comprenant : - une protéine associée à l'hétérochromatine, notamment une histone modifiée, notamment une protéine associée au chromosome X inactif, et - une protéine fluorescente, lesdites cellules ayant une viabilité supérieure à environ 5 jours, notamment environ 1 mois et de préférence environ 1 an, comprenant :
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    - une étape de sélection par cytométrie de flux parmi les cellules de lignée cellulaire stable obtenues par la mise en oeuvre du procédé selon la revendication 13, pour obtenir des cellules de lignée cellulaire stable monoclonale ayant une viabilité supérieure à environ 5 jours, notamment environ 1 mois et de préférence environ 1 an.
  15. 15. Procédé de préparation selon la revendication 14, de cellules de lignée cellulaire stable monoclonale dérivées de la lignée cellulaire HEK-293, exprimant une protéine de fusion comprenant le facteur macroH2A1.2 et la protéine fluorescente YFP.
  16. 16. Cellules telles qu'obtenues par la mise en #uvre du procédé selon l'une des revendications 13 à 15.
  17. 17. Procédé de préparation de cellules de lignée cellulaire selon l'une des revendications 1 à 10, comprenant : - une étape de sélection parmi des cellules de lignée cellulaire transformées par une séquence nucléotidique codant pour ladite protéine de fusion, notamment par culture desdites cellules transformées en présence d'un agent de sélection afin d'éliminer les cellules non transformées et les cellules transformées ayant intégré ladite séquence nucléotidique de manière transitoire et la récupération de cellules de lignée cellulaire stable et éventuellement, - une étape de sélection par cytométrie de flux parmi les susdites cellules de lignée cellulaire stable, pour obtenir des cellules de lignée cellulaire stable monoclonale ayant une viabilité supérieure à environ 5 jours, notamment environ 1 mois et de préférence environ 1 an.
  18. 18. Utilisation des cellules de lignée cellulaire selon l'une des revendications 1 à 10 et 16, pour suivre l'évolution de la texture de la chromatine présente dans lesdites cellules et notamment l'état d'inactivation d'au moins un chromosome X inactif présent dans lesdites cellules.
  19. 19. Procédé de suivi de l'évolution de la texture de la chromatine et notamment de l'état d'inactivation du chromosome X inactif comprenant l'observation en microscopie à fluorescence de la texture de la chromatine et notamment de l'état de condensation
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    10 et 16.
    d'au moins un chromosome X inactif des cellules selon l'une des revendications 1 à
  20. 20. Utilisation des cellules de lignées cellulaires selon l'une des revendications 1 à 10 et
    16 pour cribler des agents susceptibles de modifier la texture de la chromatine et notamment l'état d'inactivation du chromosome X inactif, tels que des parasites cellulaires ou des virus, des radiations ou des rayonnements, des molécules organiques ou inorganiques, synthétiques ou naturelles, et notamment des composés xénobiotiques, des molécules pharmaceutiques, des drogues, des médicaments, des métaux, des hormones, des extraits cellulaires.
  21. 21. Procédé de criblage d'agents à tester, tels que des parasites cellulaires ou des virus, des radiations ou des rayonnements, des molécules organiques ou inorganiques, synthétiques ou naturelles, et notamment des composés xénobiotiques, des molécules pharmaceutiques, des drogues, des médicaments, des métaux, des hormones, des extraits cellulaires, susceptibles de modifier la texture de la chromatine et notamment l'état d'inactivation du chromosome X inactif, comprenant, - l'observation en microscopie à fluorescence de la texture de la chromatine et notamment de l'état d'inactivation d'au moins un chromosome X inactif de cellules selon l'une des revendications 1 à 10 et 16, - l' aj out d'un agent à tester aux cellules observées, - le suivi en microscopie à fluorescence de l' évolution de la texture de la chromatine et notamment de l'état de condensation d'au moins un chromosome X inactif des cellules auxquelles un agent à tester a été ajouté, pour évaluer l'effet dudit agent à tester sur la texture de la chromatine et notamment sur l'état d'inactivation du chromosome X inactif.
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WO2001068881A2 (fr) * 2000-03-17 2001-09-20 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts Sequence d'adn et procede pour le marquage in vivo et l'analyse d'adn/chromatine dans des cellules

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