WO2001057204A1 - Vecteur d'enveloppe virale pour transfert de gene - Google Patents

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Definitions

  • the present invention relates to safe and highly efficient vectors for gene transfer in vitro and in vivo.
  • the present invention relates to a gene transfer vector prepared using a virus, an inactivated virus, particularly an inactivated HVJ (Sendai virus).
  • the gene transfer vectors herein can also be used for gene therapy and high-throughput screening.
  • viral and non-viral (synthetic) methods for gene transfer have been developed for gene therapy (Mulligan, Science, 260, 926-932 (1993) and Ledley). Human Gene Therapy, Vol. 6, 1129-: I 144 (1995)).
  • viral methods are more effective than non-viral methods for delivering genes to cells.
  • virus vectors can pose safety issues due to the co-introduction of essential genetic elements from the parent virus, leaky expression of viral genes, immunogenicity, and altered host genomic structure.
  • non-viral vectors are less cytotoxic and less immunogenic.
  • most non-viral methods are less efficient than some viral vectors, especially for gene transfer in vivo.
  • both viral and non-viral vectors have advantages with limitations. Therefore, by developing an in vivo gene transfer vector with high efficiency and low toxicity, the limitations of one type of vector-one system can be compensated by introducing the advantages of another type of system. Should.
  • HV J has high immunogenicity, especially when NP protein is produced in large quantities. It is known to induce TL (Colle, GA et al., J. Immunolog 158, 4301-4309 (1997)). There is also concern that host protein synthesis may be inhibited.
  • particles produced by the method of purifying the fusion protein by centrifugation or column operation and reconstituting the fusion protein into lipid membranes can be used to reconstitute other proteins possessed by the virus (mainly M proteins).
  • the loss of results in a decrease in fusion activity because the ratio of F1 to HN protein required for fusion activity is not maintained as in the wild-type virus.
  • the direction of insertion of the fusion protein into the lipid membrane upon reconstitution may not always be the same as that of the wild-type virus, and there is a possibility that unknown antigen presentation may be performed.
  • HVJ-ribosomes in which genes and proteins are encapsulated in a liposome and then fused with inactivated HVJ, are used to produce fused particles.
  • Non-invasive gene transfer has become possible, and this method has been used frequently at the level of animal experiments worldwide (Dz au, VJ et al., Proc. Natl. Accad. Sci. USA, 93, 11421-11425 (1996) and Canada, Y. et al., Molecular Medicine Today, 5, 298-303 (1999)).
  • an object of the present invention is to overcome the drawbacks of the conventional reconstituted HVJ vector method or HVJ-liposome method, and to provide a safe, highly efficient and simple virus-based method for a wide range of cultured cells and biological tissues. To develop a gene transfer vector. Disclosure of the invention
  • a safe and highly efficient gene transfer vector using an inactivated virus is provided.
  • Inactivated viruses in which the viral genome is inactivated, are safe and have low cytotoxicity and antigenicity due to no replication of viral proteins.
  • a virus envelope vector which is a gene transfer vector using an inactivated virus, a safe, highly efficient and simple gene transfer vector for cultured cells and biological tissues can be prepared.
  • a virus envelope vector capable of introducing a gene into a wide range of tissues in a living body.
  • the virus used is HVJ.
  • the tissues to which genes are introduced in vivo by the virus envelope vector of the present invention include liver, skeletal muscle, uterus, brain, eyes, carotid artery, skin, blood vessels, lungs, heart, kidney, spleen, cancer tissues, Examples include, but are not limited to, nerve, B lymphocyte, and respiratory tissues.
  • a method for simply introducing a gene into a floating cell As a preferable method for introducing a gene into a floating cell using the virus envelope vector of the present invention, a step of mixing the floating cell and the virus envelope vector in the presence of protamine sulfate, and a step of applying a centrifugal force to the mixed solution And a gene introduction method.
  • high-efficiency and rapid gene transfer into cultured cells and living tissues can be achieved by using the gene transfer vector of the present invention to encapsulate a large amount of genes in a short time.
  • a high-throughput, high-throughput genome analysis system of the genome using the gene transfer vector of the present invention becomes possible.
  • the transfection vector can be stored for long periods (at least 2-3 months) while frozen at —20 ”C. In another aspect of the invention, it is preferably at least 70%, more preferably at least 80%, even more preferably at least 90% at the inlet.
  • the present invention provides a gene transfer vector having a gene transfer activity to 95% or more of cells, and more preferably, a virus which is a gene transfer vector two months after preparation of an inactivated virus.
  • Input base Kuta one is provided.
  • a gene transfer vector having gene transfer activity for cells in a tissue is provided.
  • a gene transfer vector comprising an inactivated virus envelope.
  • the virus used for preparing the gene transfer vector may be a wild-type virus or a recombinant virus.
  • the viruses used are retroviridae, togaviridae, coronaviridae, flaviviridae, paramyxoviridae, orthomyxoviridae, bunyaviridae, rhabdoviridae, boxwirt. It is a virus belonging to the family selected from the group consisting of the family Rusaceae, the family Herpesviridae, the family Paculiriridae, and the family Hepadnaviridae. In a specific aspect of the present invention, the virus used is HVJ.
  • a gene transfer vector for transferring a gene into a tissue in an animal body.
  • the step of inactivating the virus is not always necessary. Therefore, in one aspect of the present invention, without performing the step of inactivating the virus,
  • the gene transfer vector can be prepared by a method including the following.
  • a method includes:
  • a method for preparing an inactivated virus envelope vector for gene transfer comprising:
  • the surfactant used is selected from the group consisting of octyl glucoside, Triton-X100, CHAPS and NP-40.
  • a method for preparing an inactivated virus envelope vector further comprising a step of adding prominin sulfate to a foreign gene before mixing with an inactivated virus envelope.
  • a method for introducing a gene into an isolated animal tissue comprising:
  • a method includes:
  • a method for introducing a foreign gene into floating cells comprising the steps of:
  • composition for gene therapy comprising the gene transfer vector of the present invention.
  • Fig. 1 shows the results of freezing and thawing the HVJ envelope vector at various times, transfection into cultured cells, and measuring the expression level of the foreign gene (luciferase gene) (luciferase activity). is there.
  • FIG. 2 shows the HVJ envelope vector used for the preparation of cultured cells.
  • FIG. 5 shows the results of measuring luciferase activity when transfected into cultured cells with the same number of viruses.
  • FIG. 3 shows the results of measuring the luciferase activity when the amount of the foreign gene (luciferase expression vector) of the HVJ envelope vector was varied.
  • FIG. 4 shows the results of measuring the luciferase activity when the type of the buffer for preparing the HVJ envelope vector was changed.
  • FIG. 5 shows the results of comparison between the conventional gene transfer using the vector-inactivated HVJ-ribosome and the method of the present invention.
  • FIG. 6 is a diagram showing an outline of a method for preparing an inactivated HVJ envelope vector using a surfactant.
  • FIG. 7 is a diagram showing an SDS-PAGE pattern of protein contained in the HVJ envelope vector prepared using a surfactant.
  • FIG. 8 is an electron micrograph using the negative staining method of the HVJ envelope vector.
  • Untreated HVJ (2) DNA-free octyldarcoside-treated HVJ; (3) Octyldarcoside-treated HVJ containing DNA.
  • 9A to 9C show the concentration of each octyldarcoside shown in the drawing, each treatment time of HVJ with octylglucoside, with or without sonication (sonic), and with each vector volume used.
  • 5 is a graph showing the gene transfer efficiency in Example 1 in terms of luciferase activity.
  • FIGS. 1OA and 10B are graphs showing the concentration of each prominin sulfate (PS) and the gene transfer efficiency at each transfection time shown in the drawing, as luciferase activity.
  • FIGS. 11A and 11B are graphs showing the amount of each DNA (the amount used in the experiment) shown in the drawing and the gene transfer efficiency at each storage temperature by luciferase activity.
  • Figure 12 shows the HVJ envelope using the HVJ of each HAU titer shown in the drawing.
  • 5 is a graph showing the gene transfer efficiency in the case where a vector was prepared and gene transfer was carried out, in terms of luciferase activity.
  • FIG. 13A is a graph showing the gene transfer efficiency at each of the UV irradiation doses shown in the drawing, as luciferase activity.
  • FIG. 13B is a graph showing the gene transfer efficiency at each 0-propiolactone (BPL) concentration shown in the figure, as a luciferase activity.
  • FIG. 14 is a graph showing the gene transfer efficiency for human tongue squamous cell carcinoma (SAS) at each of the concentrations of glutamine sulfate and the incubation time of each transfusion shown in the figure, as luciferase activity.
  • SAS human tongue squamous cell carcinoma
  • FIG. 15 is a graph showing the gene transfer efficiency of human aortic endothelial cells (HAECs) at each of the concentrations of glutamine sulfate and the incubation time of each transfection as indicated by the luciferase activity.
  • HAECs human aortic endothelial cells
  • FIG. 16A shows the gene transfer efficiency to mouse liver using the HVJ envelope vector and HVJ-AVE (Artificia 1 Viral Envelop) liposome of the present invention in terms of luciferase activity. It is a graph.
  • FIG. 16B is a graph showing the efficiency of gene transfer to mouse uterus using the HVJ envelope vector and HVJ-AVE (Artificial Viral Envelop) liposome of the present invention, in terms of luciferase activity.
  • FIG. 16C shows the results of LacZ staining of uterine tissues after transfection of mouse uterus with the pEB-CMV-LacZ gene using the HVJ envelope vector of the present invention. LacZ staining detected expression of the LacZ gene mainly in the glandular epithelium of the endometrium.
  • Fig. 16D shows that HV J envelope vector containing 10,000 1; £ 0 ??-1 was administered to SD rats (male, body weight 300-400) via the cisterna magna and the arteriole. The result. Three to four days after the administration, the mice were sacrificed, and live sections were prepared and observed under a fluorescence microscope. 1Administration via cistern
  • FIG. 16E is a diagram showing the results of pCMV-NK4, a vector expressing a mutant HGF that inhibits HGF function, suppressed angiogenesis induced by VEGF in a dose-dependent manner.
  • FIG. 16F shows the results of gene transfer performed by injecting the HVJ envelope vector into the trachea.
  • FIGS. 17A and 17B show the results of observing the fluorescence of the cells with a fluorescence microscope on the day after the introduction of the oligonucleotide into the cells.
  • the oligonucleotide introduction efficiency was about 10% after 10 minutes of incubation (Fig. 17B).
  • the oligonucleotide was introduced into 80% or more of the cells after 60 minutes of incubation (Fig. 17A).
  • FIG. 18 shows the results of a transfection experiment performed on human leukemia cell lines CCRF-CEM, NALM-6, and K-562. These cell lines have very low transfection efficiency using HVJ-liposome or existing liposome reagents (Gibc 8 to 106 (1: 1: 11, Lipofect amine, etc.)) (especially CCR). F_CEM, NALM-6).
  • FIG. 19 shows the results of gene transfer into cancer tissue. Gene expression was observed in the tumor mass, which is a cancer tissue, and high gene transfer activity was obtained especially when prosamine sulphate was 500 sm1. When protamine sulfate was used at a lower concentration, gene expression could not be detected.
  • FIG. 20 shows the results of gene transfer into cells using the herpesvirus envelope vector. Although the total luciferase activity was low, it was judged that the vector with the highest transduction efficiency could be produced by treatment with Triton-XI00 for 5 minutes. In addition, the preparation method that did not use promin sulphate had a higher introduction efficiency. No cytotoxicity was observed in any of the samples by morphological observation.
  • Figure 21 shows the results of transfection of cells into cells using the Herpesvirus envelope vector after storage at -80.
  • BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION “gene transfer” refers to a natural, synthetic or recombinant desired gene or gene in a target cell, in vivo or in vitro. Introducing a fragment so that the introduced gene maintains its function.
  • the gene or gene fragment introduced in the present invention includes a DNA having a specific sequence, a RNA or a nucleic acid which is a synthetic analog thereof. Also, as used herein, gene transfer, transfection, and transfect are used interchangeably.
  • virus transfer vector refers to a vector in which a foreign gene is encapsulated in a virus envelope.
  • the virus used for preparing the gene transfer vector may be a wild-type virus or a recombinant virus.
  • the viruses used are retroviridae, togaviridae, coronaviridae, flaviviridae, paramyxoviridae, orthomyxoviridae, bunyaviridae, rhabdoviridae, box virus.
  • the virus used is HVJ.
  • gene transfer activity refers to the activity of “gene transfer” by a vector, and refers to the function of the transferred gene (eg, in the case of an expression vector, the expression and And / or the activity of the protein).
  • inactivated refers to a virus that has inactivated the genome. This inactivated virus is replication defective. Preferably, this inactivation is achieved by UV treatment or treatment with an alkylating agent.
  • the exogenous gene refers to a nucleic acid sequence contained in a transfection vector of non-viral origin.
  • the exogenous gene is a regulatory sequence (eg, promoter, enhancer, terminator necessary for transcription) necessary for expression of the gene introduced by the gene transfer vector. Operably linked to the A and poly A addition signals, as well as the ribosome binding site, initiation codon, and stop codon required for translation.
  • the foreign gene does not contain regulatory sequences for expression of the foreign gene.
  • the foreign gene is an oligonucleotide or a decoy nucleic acid.
  • the foreign gene contained in the gene transfer vector is typically a nucleic acid molecule of DNA or RNA, but the nucleic acid molecule to be introduced may include a nucleic acid analog molecule.
  • the molecular species contained in the gene transfer vector may be a single genetic molecular species or a plurality of different genetic molecular species.
  • a “gene library” is a nucleic acid library that contains nucleic acid sequences that are isolated from nature or synthetic. Sources of nucleic acid sequences isolated from nature include, but are not limited to, genomic and cDNA sequences from eukaryotic cells, prokaryotic cells, or viruses. A library obtained by adding an arbitrary sequence (eg, signal, tag, etc.) to a sequence isolated from nature is also included in the gene library of the present invention. In one embodiment, the gene library comprises sequences, such as promoters, that effect transcription and Z or translation of the nucleic acid sequences contained therein.
  • HVJ HVJ
  • Sendai virus Sendai virus
  • HAU refers to the activity of a virus capable of aggregating 0.5% of chicken erythrocytes, and 1 HAU corresponds to approximately 24 million viral particles (Okada, Y. et al., Bik en Journal, 4, 209-213, 1961).
  • nucleic acid constructs can be administered either locally or systemically using the gene transfer vectors of the present invention.
  • nucleic acid constructs include the coding sequence of a protein
  • expression of the protein may be induced by the use of an endogenous mammalian promoter or a heterologous promoter. Expression of the coding sequence can be constitutive or regulated.
  • administering may be performed using PBS (phosphate buffered saline) or saline.
  • PBS phosphate buffered saline
  • saline phosphate buffered saline
  • the gene transfer vector is generally used in a pharmaceutically acceptable carrier (ie, used in a unit dose injectable form (solution, suspension or emulsion) of the gene transfer vector).
  • a pharmaceutically acceptable carrier ie, used in a unit dose injectable form (solution, suspension or emulsion) of the gene transfer vector.
  • the formulation is preferably free of oxidizing agents and other compounds known to be harmful to gene transfer vectors.
  • the carrier may optionally contain minor amounts of additives such as substances that enhance isotonicity and chemical stability. Such substances are non-toxic to the recipient at the dosages and concentrations employed and buffers such as phosphoric acid, citrate, succinic acid, acetic acid, and other organic acids or salts thereof.
  • Antioxidants such as ascorbic acid; low molecular weight (less than about 10 residues) polypeptides (eg, polyarginine or tripeptide); proteins (eg, serum albumin, gelatin, or immunoglobulin); Anionic acids (eg, glycine, glutamic acid, aspartic acid, or arginine); monosaccharides, disaccharides and other carbohydrates (including cellulose or derivatives thereof, glucose, mannose, or dextrin) Chelating agents (eg, ED TA); sugar alcohols (Eg, mannitol or sorbitol); a counter ion (eg, sodium); and a Z or non-ionic surfactant (eg, polysorbate, poloxamer), or PEG.
  • polypeptides eg, polyarginine or tripeptide
  • proteins eg, serum albumin, gelatin, or immunoglobulin
  • Anionic acids eg, glycine, glutamic acid, aspartic acid
  • compositions containing the gene transfer vector can be stored as an aqueous solution, typically in unit or multi-dose containers, for example, sealed ampules or vials.
  • the invention also relates to one or more containers filled with one or more components of the pharmaceutical composition of the invention.
  • a pharmaceutical pack or kit comprising: Further, the polypeptides of the present invention can be used with other therapeutic compounds.
  • compositions containing the gene transfer vectors of the invention include, in a manner consistent with good medical practice, the individual patient's clinical condition (eg, the condition to be prevented or treated), the gene transfer vector.
  • the composition is formulated and administered taking into account the site of delivery of the composition, target tissue, method of administration, dosing regimen, and other factors known to those of skill in the art.
  • the “effective amount” or appropriate dosage of the transgenic vectors herein is determined by such considerations.
  • a gene vector corresponding to 20-20,000 HAU, preferably 60-6,000 HAU, more preferably 200-2,000 HAU per mouse is administered.
  • the amount of exogenous gene contained in the administered gene vector is
  • a gene vector corresponding to 400400,000 HAU, preferably 1,200 to 120,000 HAU, more preferably 4,000 to 40,000 HAU is administered.
  • the amount of the foreign gene contained in the gene vector to be administered is 2 to 2, OO Og, preferably 6 to 600 g, more preferably 20 to 200 g, per subject.
  • TE 500 Z1 750 g of luciferase expression vector PcOriPLuc (Saeki and Kaneda et al., Human Gene Therapy, 11, 471-479 (2000)) and various concentrations of HVJ virus was mixed.
  • the HVJ virus concentration was adjusted to 10, 25, 50, 100 HAU / jLt1.
  • This solution was divided into 12 portions, each of which was stored at 4 on dry ice, frozen, and then thawed up to 30 times.
  • the solution that has been frozen and thawed a predetermined number of times is added to the medium of BHK-21 cells (24 ⁇ eldish, 4 ⁇ 10 4 cell dishes, 0.5 ml DMEM, 10% FCS), and 5% CO 2 is added at 37.
  • the cells were washed with PBS, and 0.5 ml of a fresh culture solution was added thereto, followed by culturing for 24 hours.
  • luciferase activity was measured using Promega Ga Luciferase Assay System and Lumat LB 9501 Luminophotometer. The measurement was performed three times for each solution, and the average value was determined.
  • the results are as shown in FIG. Luciferase activity increased as the number of freeze-thaw cycles of the recombinant HVJ virus increased, and luciferase expression was observed 10 times or more in 20 freeze-thaw cycles compared to 3 freeze-thaw cycles. From these results, it was confirmed that, under the conditions used in this example, the number of freeze-thaw cycles of the recombinant HVJ virus is preferably 5 or more, and more preferably about 15 to 20 times.
  • the gene transfer efficiency into cells was examined under the same conditions for the number of viruses added to the host cells.
  • the results are as shown in FIG. In FIG. 2, for example, when the X-axis is 500 HAU, the addition amount of the solution with the virus concentration of 1 OHAU / 1 is 501, and the solution of 10 OHAU / 1 is 51.
  • the solution with a virus concentration of 100 HAUZ1 reduced the gene expression efficiency by about 50% as compared with a solution with a concentration of 10 to 50 HAU // 1. From these results, it was confirmed that the recombinant virus concentration was preferably in the range of 10 to 50 HAUZ1 under the conditions of this example.
  • the recombinant HVJ virus was thawed 29 times and then thawed 30 times, stored in the frozen state for 1 week, thawed and added to the cells.
  • the recombinant HVJ virus stored frozen for one week also showed the same level of luciferase gene expression as that of the virus that had been continuously frozen and thawed 30 times.
  • Example 3 Measurement of Gene Transfer Efficiency Using Luciferase Expression Vector
  • the HVJ envelope vector was prepared by changing the amount of the luciferase expression vector, and the gene transfer efficiency into host cells was examined.
  • the HV J virus load was 50 HAU / TE.
  • the amount of luciferase expression vector pc ⁇ ri PLuc is 0.05, 0.1, 0.25, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 3.0 per TE of 11 , 5.5. After performing freeze-thawing 20 times with the final solution amount being 1001, luciferase activity was measured in the same manner as in Example 1.
  • the amount of the HVJ virus was 50 HAU per 1 ml of the buffer, and the amount of the luciferase expression vector pcOriPLuc was 15 fig / n1.
  • Buffers are TE, PBS, BSS (137 mM NaCl, 5.4 mM KC1, 1 OmM Tris-HC1, pH 7.5), and these buffers have final concentrations of 0 mM, 20 mM, ° 40 mM, 6 OmM.
  • the sucrose was used. After performing freeze-thawing 20 times with the final solution amount being 100, luciferase activity was measured in the same manner as in Example 1.
  • HV J-ribosomes which are conventional gene transfer vectors (AVE type, which has the highest gene transfer efficiency (Saeki, Y., et al., Human Gene Therapy, 8, 2133-2141 ( 1 997)) and the method of the present invention were compared.
  • HVJ—ribosome or HVJ virus was 50 HAU per TE11, and the amount of luciferase expression vector pcOri? 1! (: Was 1.5 g1.
  • the number of freeze-thaw cycles was 2 or 15.
  • the other conditions were the same as in Example 1 except that the host cells were human embryonic kidney cell line HEK293.
  • FITC fluorescein isothiocyanate fluorescently labeled synthetic oligonucleotide Nucleotide (20 bp) was mixed with inactivated HVJ virus at a concentration of 1 mg Zml, and the solution was freeze-thawed 20 times and then reacted with BHK-21 cells for 20 minutes. Observation of the fluorescence signal 17 hours later revealed that about 100% of the cells had accumulated fluorescence in the nucleus. From these results, it was confirmed that the method of the present invention is also effective for introducing synthetic nucleic acids into cells.
  • the mixed solution of the GFP (green fluorescent protein) gene and the inactivated HVJ virus was freeze-thawed 20 times, and then 2 ng — 51 was injected into the rat cerebrum. As a result, a fluorescent signal was observed at the injection site.
  • the HV J envelope vector containing the GFP gene was frozen and stored for 3 months, and then injected into the rat cerebrum. A fluorescent signal due to the expression of the GFP gene was also observed at the injection site.
  • the method of the present invention can reliably introduce a gene into a living body. It was also confirmed that the HVJ envelope vector could be stored frozen.
  • FIG. 6 shows an outline of a method for preparing an inactivated HVJ envelope vector using a surfactant.
  • HVJ can be generally used when propagated by inoculation of a seed virus into fertilized eggs of chickens.However, a system for persistent infection of the virus into cultured cells such as monkeys and humans, and cultured tissues (using a hydrolase such as trypsin, etc.) (Added to the culture medium), and those obtained by infecting cultured cells with the cloned virus genome and causing persistent infection to grow.
  • HVJ was propagated as follows.
  • HV J seed virus is propagated using SPF (Specificpathog enfree) fertilized eggs, separated and dispensed.
  • SPF Specificpathog enfree
  • the purified HV J (Z species) is dispensed into a cell storage tube, and 10% DMSO is added to the liquid.
  • 10% DMSO is added to the liquid.
  • the inoculated eggs were then soaked at 4 overnight. The next day, the air chamber part of the egg was broken with tweezers, a 10m1 syringe with an 18 gauge needle was placed in the chorioallantoic membrane, the chorioallantoic fluid was aspirated, collected in a sterile bottle, and stored in step 4. .
  • HVJ can be purified by a purification method by centrifugation, a purification method by a column, or other purification methods known in the art.
  • the proliferated virus solution was collected and the tissue debris in the culture solution and chorioallantoic fluid was removed by low-speed centrifugation. Centrifuge the supernatant at high speed (27, 500 Xg, 30 minutes) Purification was performed by ultracentrifugation (62, 800 Xg, 90 minutes) using a sucrose density gradient (30 to 60% wZv). Care should be taken to keep the virus as gentle as possible during purification and store at 4 ° C.
  • HVJ was purified by the following method.
  • HVJ-containing chorioallantoic humor Approximately 100 ml of HVJ-containing chorioallantoic humor (collect the hen egg-containing chorioallantoic humor and store at 4) into two 50-ml centrifuge tubes using a wide-mouth Komagome pipette (Saeki, Y , And Kaneda, Y: Protein modified lipo s omes (HVJ—li po s omes) forthedeli ve ryof ge nes, oli gonuc leotides and protein s.
  • the eggs were centrifuged at 4 for 10 minutes at 4 minutes (brake off) to remove the egg tissue.
  • the supernatant was dispensed into four 35-ml centrifuge tubes (for high-speed centrifugation), and centrifuged at 27,000 g for 30 minutes at Angle Low, with the accelerator and brake on. Except for the supernatant, BSS (1 OmM Tris _HC 1 (pH 7.5), 137 mM NaCl, 5.4 mM KC 1; autoclaved and stored at 4) (preserved in PBS instead of BSS) can be used for precipitation. Approximately 5 ml per tube was added, and the tube was left still at 4 * C.
  • the precipitate was loosened by gentle pipetting using a wide-mouth Komagome pipette, collected in a single tube, and centrifuged at 27,000 g for 30 minutes in the same angled mouth. The supernatant was removed, and about 10 ml of BSS was added to the precipitate. Gently pipette with a wide-mouthed Komagome pipe to loosen the precipitate, centrifuge at 3000 rpm for 10 minutes at 4 with a low-speed centrifuge at 4 (brake off), and remove the remaining tissue fragments. Virus aggregation I looked into the lump. Put the supernatant in a new sterile tube and store at 4 ° C as purified virus.
  • HAU hemagglutination activity
  • purification of HVJ using a sucrose density gradient can be performed if necessary.
  • the virus suspension is placed in a centrifuge tube overlaid with a 60% or 30% sucrose solution (autoclave sterilization), and subjected to density gradient centrifugation at 62,800 ⁇ g for 120 minutes. After centrifugation, collect the band found on the 60% sucrose solution layer.
  • the collected virus suspension is dialyzed overnight against 4 "using BSS or PBS as an external solution to remove sucrose. If not used immediately, add glycerol (autoclave sterilization) to the virus suspension.
  • Add 5M EDTA solution autoclave sterilized
  • 5M EDTA solution autoclave sterilized
  • 10 mM DMSO can be used instead of glycerol and 0.5 M EDTA solution).
  • purification of HVJ by a column is also applicable to the present invention.
  • purification was performed using ultrafiltration with a filter with a molecular weight cutoff of 50,000 (approximately 10-fold) and elution by ion exchange chromatography (0.3M to 1M NaCl).
  • HVJ was purified by a column using the following method.
  • the HVJ fraction was concentrated by tangential flow ultrafiltration using 500 KMWCO (A / G Techno 1 ogy).
  • the solution 921 containing 200 to 800 g of foreign DNA was added to the stored HVJ, and the suspension was well suspended by pipetting. This solution is -20 and can be stored for at least 3 months. When prominin sulfate was added to the DNA before mixing with HVJ, the expression efficiency was more than doubled.
  • Tr it on— X 100 t-octylphenoxypolyethoxyethanol
  • CHAPS [(3-colamidopropyl) —dimethylammonio] —1-propanesulfonic acid
  • Detergents such as NP-40 (noelphenoxypolyethoxyethanol) may also be used.
  • Preferred final concentrations of Tr it on—X100, NP-40, and CHAPS are 0.24 to 0.80%, 0.04 to 0.12%, and 1.2 to 2.0%, respectively. is there.
  • X5 Laem1i sample buffer was added to 5, 10, and 20 / X1 of the three samples, and 10% SDS-polyacrylamide gel electrophoresis was performed. After electrophoresis, the cells were stained with Coomassie Blue, destained, and then pasted on cellophane paper and dried.
  • the sample that had been electrophoresed and stained was incorporated into LAS2000 (FujiFi 1 m, Tokyo) (FIG. 7), and the concentration of the protein band corresponding to F1, HN was measured. For one sample, three different amounts were run, the F 1ZHN density was calculated, and the average and standard deviation were calculated for each sample.
  • Example 10 Encapsulation and encapsulation rate of DNA in HVJ envelope vector
  • Example 10 Electron microscope image of HVJ envelope vector (DNA encapsulation, unencapsulation)
  • PSFV-LacZ 130 ig (14.5 kb) was enclosed in 10,000 HAU HVJ (UV inactivated) to prepare an HVJ envelope vector.
  • the encapsulated HVJ envelope vector was suspended in PBS 3001 and stored at-20 "C. After 10 days, the suspension of 1H1 was placed on a dallid, and electron microscopy was performed using a negative staining method. As a control, HV Jenvelope Vector without DNA was used.
  • the HVJ envelope vector had the same outer shape as that of the previously observed HVJ virus itself. Compared to those without DNA, those using DNA showed structures with a higher electron density in the HVJ envelope vector. On the other hand, the unencapsulated one had high internal permeability, and it was presumed that the virus genome was destroyed or lost.
  • HVJ envelope vector As described above, pc luci (7.4 kb) 157 / ig was encapsulated in 6,70 OHAU HVJ (UV inactivated) to prepare an HVJ envelope vector.
  • the HVJ envelope vector was suspended in 300 1 BSS, treated with 15 units of micrococcal nuclease, 2 mM of CaCl 2, 20 g of RNaseA and 20 gZm of 20 for 30 minutes, and dialyzed against 1 liter of PBS (4 And o-parnite). The plate was treated with 1% SDS at 37 ° C for 1 minute. Treat with 500 tl of phenol, 500 1-cloth form-isoamyl alcohol, then add ethanol Knol precipitated. Suspend in 100 1 BSS and use spectrophotometer at 260 nm, 28
  • the efficiency of DNA incorporation of 10,000 HAU into HVJ is estimated to be about 6-7% when octyl darcoside is used, but it may vary slightly depending on the amount of DNA used.
  • Triton_X100, NP-40 the efficiency is further improved, and it is estimated to be about 10 to 40%.
  • a 1,000 HAU portion was placed in an Eppendorf tube (301), and prosulfinamine (lmgZml) 51 was added. Change the medium of BHK-21 cells (200,000 cells per well, spread over 6 wells the day before) and add 0.5 ml of medium (10% FCS-DMEM) per well did.
  • Each Ueru, said vector and (1, equivalent 000HAU) a mixture of sulfuric acid pro evening Min addition, shook Plate back and forth and left and right mixed well vectors and cells, 37 "C, 5% C 0 2 It was left in the incubator for 10 minutes.
  • Luciferase gene with CMV promoter The cells were lysed with 0.5 ml of Lysis Buffer (Prome ga), and the activity of the cells in a 20/1 solution was measured using a Luciferasease kit (Prome ga). In the case of green fluorescent protein (pCMV-GFPE; Promega), the cells were directly observed with a fluorescence microscope, and 5 to 8 visual fields were observed at a magnification of 400 to calculate the ratio of cells that emit fluorescence.
  • pCMV-GFPE green fluorescent protein
  • the cultured cells used were BHK-21 cells.
  • Inactivated HV J was processed by OG when creating the HV J envelope vector: 1 min, 5 min, 10 min;
  • Sonication was performed (sonic) or not.
  • volume of vector used for transfection 10-100 l.
  • the HVJ envelope vector was stored at 20 ⁇ € or -80 for 5 days.
  • HVJ envelope vectors using HVJ with a titer of 5,000, 10,000, 20,000 HAU, and use an amount corresponding to 250, 500, 1,000, 2,000 HAU of each. And transfected into BHK-21 cells.
  • Example 12 Gene Transfer of HVJ Envelope Vector into Various Cells
  • SAS human squamous cell carcinoma of the tongue
  • HAEC human aortic endothelial cells
  • the HVJ envelope vector was prepared by leaving 0.8% octylglucoside and 200 ig pcLuci for 1 minute on ice and suspending in 300/1 PBS. 1 10 volume of the prepared suspension (equivalent to 1,000 HAU) 30 1 is diluted with 70 1 of PBS (total volume 100 1), and is diluted into one mouse (C 57 B LZ6) liver leaf (1 obe) Injected.
  • HV J-AVE (Artificial Viral Envelop) liposome was vortexed / extrusioned using 200 g pc Lu ci, followed by sucrose gradient centrifugation (62,000 g for 90 min). ). The preparation was then pelleted by centrifugation (27,000 g, 30 minutes) and suspended in 5001 PBS. 100 / x1 of this sample was injected into one of the lobes (1 ob) of the liver of a mouse (C57BLZ6).
  • the HVJ envelope vector of the present invention exhibited a remarkably high gene transfer efficiency, which was about twice that of the conventional HVJ-AVE ribosome.
  • HVJ envelope vector-1 was prepared in the same manner as 13.1. The 50 1 and 100 1 samples were diluted with PBS to 500 1 and injected into a mouse Fallopian tube and the cervix was ligated for 10 minutes. Twenty-four hours later, mouse uteri were isolated, and leaf and uterine luciferase activities were assayed using a Luciferase Assay System from Promega. The results are shown in FIG. 16B. Although the HVJ envelope vector of the present invention enabled gene transfer into mouse uterus, the method using HVJ-AVE ribosome did not find detectable gene transfer into uterine tissue. Was. An HVJ envelope vector containing pcLuci was prepared as in 13.1.
  • an HVJ envelope vector containing pEB-CMV-LacZ (13 kb) was prepared using 200 ⁇ g of plasmid.
  • the HVJ envelope vector containing each of these vectors was injected into the uterus as described above.
  • the results are shown in FIG. 16C. LacZ staining detected expression of the LacZ gene mainly in the glandular epithelium of the endometrium.
  • One vector (1Z10 of the preparation, equivalent to 1,000 HAU) was injected into an SD rat (Sprague-Dawley rat) by carotid artery injection or intracavitary injection from the cisterna magna.
  • rats were sacrificed, brain sections were prepared without fixation, and fluorescence was observed under a fluorescence microscope.
  • NK4c DNA 1.4
  • HGF hepatocyte growth factor
  • HVJ envelope vector was prepared in the same manner as in the preparation of the HVJ envelope vector containing pc Luci described above, except that 0 OHAU inactivated HVJ was used.
  • pCMV—NK4 is a vector that expresses a variant HGF that inhibits HGF function.
  • One hundred fifty-one vectors (preparation 1Z6) were injected into porcine corneal tissue that had been treated with a pellet of recombinant VEGF to induce neovascularization. Seven days after the treatment, the egrets were sacrificed and neovascularization in the eyes was observed. The results are shown in FIG. 16E.
  • HV J envelope vector containing ison, WI HV J envelope vector containing ison, WI
  • 50 1 vector (1/6 of the preparation) were injected into the trachea of rats.
  • rats were sacrificed, tissues were fixed with 1% dataraldehyde, and expression of LacZ in arteries was visualized using Xga1.
  • FIG. 16F Lac Z staining was observed in bronchial epithelium.
  • Gene expression was also observed in bronchial epithelium when HVJ envelope vector was introduced from the pulmonary artery (data not shown).
  • Example 14 Function of virus envelope vector as drug delivery system (DDS)
  • the gene transfer vector of the present invention is also useful as a drug delivery system for oligonucleotide or decoy nucleic acid therapy.
  • virus envelope vector of the present invention fluorescently labeled oligonucleotides were introduced into cells.
  • oligonucleotide introduction efficiency was about 10% at 10 minutes as shown in Fig. 17B, but it was 60 minutes as shown in Fig. 17A. In 80% or more of the cells, the oligonucleotide was introduced.
  • the decoy nucleic acid was introduced into cells using the virus envelope vector of the present invention.
  • Double-stranded nucleic acid having the DNA binding sequence of Stat 6 (5 '— GATCAAGACC TTTTCCCAAGAATCTAT-3' and 3'-CATGTTCTGG AAAAGGGTTCTTAGATA-5 ' ) 250 / g / 300 i 1 BS S mixed with precipitation of inactivated) at 30, 000 HAU of HV J (UV 99 mJ Z cm 2, Tr ito nX- 100 ( final concentration 0.24%) was added, treated on ice for 1 minute, added with 1 ml of BSS, and centrifuged (15,000 rpm, 15 minutes, 4). The precipitate was stored at ⁇ 20 ° C. by adding 300 1 of PBS. When this HVJ envelope vector was used for subcutaneous injection in mice, it suppressed IgE-induced allergy and delayed skin reactions.
  • HVJ human leukemia cell-like CCRF-CEM, NALM-6, and K-562.
  • p CMV-Luciferase 200 ig (92jul) was mixed with 10,000 H AU inactivated HVJ (ultraviolet 99 mJ / cm 2 ) precipitate and TritonX-100 (0.24%, final concentration) The mixture was treated on ice for 1 minute, added with 1 ml of BSS, and centrifuged (15,000 rpm, 15 minutes, 4). 300 t1 of PBS was added to the precipitate to prepare an HVJ envelope vector.
  • Vector 60 1 (equivalent to 2,000 HAU), promin sulphate, and 4 million suspension cells were mixed in a 1.5 ml eppendorf tube, and 10,000 to 15,000 rpm, Centrifugation was performed at 20 minutes for 10 minutes. Thereafter, a culture solution was added to the precipitate, transferred to a culture dish, and one day later, the luciferase activity of the cells was measured.
  • the cell line used was HV J-ribosome or an existing ribosome reagent (Gibe
  • the preferred conditions for gene transfer were to add prominin sulfate 600-1 and OOO zgZml, and to centrifuge at 10, OOO or 15,000 rpm for 10 minutes at 20. . No significant cytotoxicity due to the HVJ envelope vector was observed. Also, both centrifugation and the addition of promin sulfate were necessary for gene transfer.
  • pCMV-Luc iferase 354 ig (92 1) 34, 000 mixed with precipitation of HA U inactivated HVJ (UV 99 mJ Zcm 2), T rit onX- 100 (0. 24%, final concentration) After addition, the mixture was treated on ice for 1 minute, lm1 BSS was added, and the mixture was centrifuged (10,000 to 15,000 rDm, 10 minutes, 20 ° C). Add 300 1 of PBS to the precipitate and store at -20. One day later, mix with 500 g / m1 or 1000 gZm1 Was injected into a tumor mass (diameter 7-8 mm) of mouse melanoma B16-F1, and luciferase activity was measured one day later. As shown in FIG. 19, gene expression was observed in the tumor mass. The preferred concentration of prominamine sulfate was 500 g / ml. However, gene expression could not be detected at lower concentrations of prominamine sulfate.
  • Herpes simplex virus type 1 (HSV-1) (10 1Q plaque forming unit Zml) was provided by Prof. Yamanishi, Department of Bacteriology, graduate School of Medicine, Osaka University. The inactivation conditions of this virus were examined by virus plaque formation in cultured monkey cells (Vero cells). ) 3 The inactivation of propiolactone (BPL) 0. 05% virus using, frequency of occurrence of plaque at Ve r 0 cells, 9. 1 X 1 0- 4 (flops la one click ZVe ro Cells). On the other hand, inactivation of viruses by ultraviolet light 200 and 400 Miriju Le ZCM 2 irradiation, respectively 4. 3 X 10- 4, 2. was 2 X 10_ 6 (plaque ZVe ro cells).
  • the herpes virus envelope vector treated with Triton-X100 for 5 minutes was stored at -80 for 2 days, thawed, added to BHK-21 cells again, and the transduction efficiency was measured. This time, 60 minutes after the introduction, 10% FCS-DME 2.5 ml 1 well was added, and the cells were cultured overnight to measure the activity. The effects of serum and the amount of vector were examined.
  • the herpes simplex virus envelope vector is a neurotrophic vector.
  • the enveloper vector of the invar virus can be applied as a B lymphocyte-directed vector, and the influenza envelope vector can be applied as a respiratory-directed vector.
  • a new gene transfer method that is easy to operate and has excellent gene transfer efficiency is provided. This will enable rapid screening of gene libraries. Also provided is a kit for high-throughput screening, comprising the viral envelope vector of the present invention.
  • the virus envelope vector provided by the present application can be stored for a long period of time and can be cryopreserved for a long period of time. Introduction becomes possible.
  • the gene transfer vector of the present invention enables more efficient gene transfer than a vector prepared based on the conventional HVJ, and has a wider range of gene transduction in living tissue than the conventional method. Introduction is possible.

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Description

明 細 書
遺伝子導入のためのウィルスエンベロープベクタ— 技術分野
本発明は、 インビトロおよび生体内での遺伝子導入のための安全かつ高効率の ベクタ一に関する。 特に、 本発明は、 ウィルス、 不活性化ウィルス、 特に不活性 化 HVJ (センダイウィルス） を用いて調製する遺伝子導入ベクターに関する。 また、 本明細書の遺伝子導入べクタ一は、 遺伝子治療および高スループットスク リーニングにも使用され得る。 背景技術
遺伝子治療のために、 遺伝子導入のための多くのウィルスおよび非ウィルス (合成） 法が開発されている （Mu l l i gan、 Sc i enc e、 260、 9 26〜 932 (1993) および L ed l ey、 Human Gene The r apy, 第 6巻、 1129〜： I 144 (1995) ) 。 一般に、 細胞への遺伝 子送達のために、 ウィルス法は、 非ウィルス法より効果的である。 しかし、 ウイ ルスベクターは、 親ウィルスからの必須遺伝子要素の同時導入、 ウィルス遺伝子 のリーキーな発現、 免疫原性、 および宿主ゲノム構造の改変のため安全性での問 題を生じ得る。 一般に、 非ウィルスベクターは、 細胞傷害性および免疫原性がよ り少ない。 しかし、 大部分の非ウィルス法は、 ウィルスベクターのいくつかに比 ベ、 特に生体内への遺伝子導入効率はより悪い。
従って、 ウィルスおよび非ウィルスベクターの両方は、 制限とともに長所を持 つている。 それ故、 高効率および低毒性を持つ生体内への遺伝子導入ベクターを 開発することで、 1つのタイプのベクタ一システムの制限を、 別のタイプのシス テムの有利な点を導入することにより補償すべきである。
一方、 HV Jは免疫原性が高く、 特に NPタンパク質が大量に産生されると C TLを誘導することが知られている （Co l e、 G. A. ら、 J. I mmu n o l o gy 158、 4301〜 4309 (1997) ) 。 また宿主のタンパク質 合成が阻害される懸念もある。
HV Jについて、 ウィルス融合タンパク質を遠心やカラム操作で融合タンパク 質を精製して脂質膜に再構成する方法で作成された粒子は、 再構成させることに よってウィルスの持つ他のタンパク質 （主として Mタンパク質） が失われること により、 融合活性に必要な F 1と HNタンパク質の比率が野生型のウィルスと同 様には保たれないために、 融合活性が低くなるという欠点もある。 また再構成し たときに融合夕ンパク質が脂質膜に挿入される方向性が野生型ウィルスと同様で あるとは限らないために未知の抗原提示がなされる可能性もある。
また、 新たな分子を加えて再構成する方法も報告されているが （Uc h i d a， T. ら、 J. Ce l l . B i o l . 80、 10〜20、 1979) 、 この方法で は完成粒子の膜組成は本来のウィルス粒子とは大きく異なるために本来のウィル ス機能が喪失される危険性は大きい。
従来の HV J—リボソームに代表されるように遺伝子やタンパク質をリポソ一 ムに封入し、 これと不活性化 HV Jを融合して作成される融合粒子を用いる方法 は、 培養細胞や生体組織への非侵襲の遺伝子導入を可能とし、 世界的にもこの手 法が動物実験レベルでは頻用されるようになった （Dz a u， V. J. ら、 P r o c . Na t l . Ac ad. S c i . USA, 93、 1 1421〜 1 1425 ( 1996) および Ka n ed a, Y. ら、 Mo l e c u l a r Me d i c i n e Tod ay、 5、 298〜 303 (1999) ) 。 しかしウィルスとリポ ソームという 2つの異なるべシクルを準備する必要があり手法が複雑であること、 リボソームと融合することによってウィルス粒子より平均直径が 1. 3倍大きく なった粒子は融合活性がウィルスの 10 %以下に落ちてしまうことなどの欠点も 合わせ持つことがわかった。
さらに、 従来の HV Jに基づくベクターでは、 遺伝子導入が不可能な組織や極 めて効率の低い組織も存在した。 このことは、 従来法に基づく遺伝子治療の対象 となる組織を限定し得ることを示す。
ヒト遺伝子治療のために、 安全、 高効率かつ簡便に調製でき、 かつ広範囲の生 体内組織に対して遺伝子導入が可能なウィルスベクタ一の開発が望まれている。 従って、 本発明の目的は、 従来の再構成 HV Jベクタ一法または HV J—リポ ソ一ム法の欠点を克服し、 広範囲の培養細胞や生体組織に対する、 安全、 高効率 かつ簡便なウィルスベースの遺伝子導入べクタ一を開発することにある。 発明の開示
本発明の 1つの局面において、 不活性化ウィルスを使用する安全かつ高効率な 遺伝子導入ベクターが提供される。 ウィルスのゲノムが不活性化されている不活 性化ウィルスでは、 ウィルスタンパク質の複製がないため安全で細胞毒性 ·抗原 性も低い。 不活性化ウィルスを用いる遺伝子導入ベクターであるウィルスェンべ ロープベクター中に遺伝子を封入することにより、 培養細胞や生体組織に対する、 安全、 高効率かつ簡便な遺伝子導入ベクターが調製される。
本発明のさらなる局面において、 広範囲の生体内組織に遺伝子導入が可能であ るウィルスエンベロープベクターが提供される。 1つの実施態様において、 使用 されるウィルスは、 HV Jである。 本発明のウィルスエンベロープベクターによ つて生体内で遺伝子導入される組織としては、 肝臓、 骨格筋、 子宮、 脳、 眼部、 頸動脈、 皮膚、 血管、 肺、 心臓、 腎臓、 脾臓、 癌組織、 神経、 Bリンパ球、 およ び呼吸器官の組織が挙げられるが、 これらに限定されない。
本発明の別の局面において、 浮遊細胞に簡便に遺伝子導入する方法が提供され る。 本発明のウィルスエンベロープベクターを使用する、 好ましい浮遊細胞への 遺伝子導入方法としては、 浮遊細胞とウィルスエンベロープベクタ一とを硫酸プ ロタミン存在下で混合する工程、 およびその混合液に遠心力を加える工程を包含 する、 遺伝子導入方法が挙げられる。 本発明の 1つの局面において、 本発明の遺伝子導入ベクターを用いて、 大量の 遺伝子を短時間で封入することによる、 高効率で迅速な培養細胞及び生体組織へ の遺伝子導入が可能となる。 従って、 本発明のさらなる局面において、 本発明の 遺伝子導入ベクターを用いるゲノムの高スループッ卜の大量迅速解析システムが 可能となる。
本発明の特定の局面において、 遺伝子導入べクタ一は、 — 2 0 "Cで凍結した状 態で長期間 （少なくとも 2〜3ヶ月以上） の保存が可能である。 そしてこの遺伝 子導入ベクターは、 例えば凍結状態で密封し、 貯蔵し、 輸送することができる。 本発明の別の局面において、 インビト口において好ましくは 7 0 %以上、 より 好ましくは 8 0 %以上、 さらにより好ましくは 9 0 %以上、 最も好ましくは 9 5 %以上の細胞に遺伝子導入活性を有する遺伝子導入べクタ一が提供される。 本発明のある局面において、 不活性化ウィルスの調製の 2ヶ月後に遺伝子導入 ベクターであるウィルスエンベロープベクターを形成した場合に、 6 0 %以上、 好ましくは 7 0 %以上、 より好ましくは 8 0 %以上、 最も好ましくは 9 0 %以上 の遺伝子導入活性を保持する遺伝子導入べクタ一が提供される。
本発明の別の局面において、 生体内での局所投与において好ましくは 3 0 %以 上、 より好ましくは 4 0 %以上、 さらにより好ましくは 5 0 %以上、 最も好まし くは 6 0 %以上の組織中の細胞に対して遺伝子導入活性を有する遺伝子導入べク ターが提供される。
本発明の局面において、 不活性化ウィルスエンベロープを含む遺伝子導入べク ターが提供される。
本発明の 1つの局面において、 遺伝子導入ベクターの調製のために使用される ウィルスは、 野生型ウィルスであっても、 組換え型ウィルスであってもよい。 本発明のさらなる局面において、 使用されるウィルスは、 レトロウイルス科、 トガウィルス科、 コロナウィルス科、 フラビウィルス科、 パラミクソウィルス科、 オルトミクソウィルス科、 ブニヤウィルス科、 ラブドウィルス科、 ボックスウイ ルス科、 ヘルぺスウィルス科、 パキュロウィルス科、 およびへパドナウィルス科 からなる群から選択される科に属するウィルスである。 また、 本発明の特定の局 面において、 使用されるウィルスは、 HVJである。 また、 本発明のさらなる局 面において、 Ha s an, M. K. ら （J ou r n a l o f Ge ne r a l V i r o l ogy, 78、 2813〜 2820 (1997) ) または Yo n e mi t s u, Y. ら （Na t u r e B i o t e c hno l ogy 18、 97 0〜973 (2000) ) に記載される組換え型センダイウィルスを用いて、 遺 伝子導入ベクターが調製される。
本発明の別の局面において、 動物生体内の組織に遺伝子導入するための遺伝子 導入ベクターが提供される。
本発明の遺伝子導入ベクターを調製する方法において、 ウィルスを不活性化す る工程は必ずしも必要ではない。 従って、 本発明の 1つの局面において、 ウィル スを不活性化する工程を行わずに、
1) ウィルスを外来遺伝子と混合する工程、 および
2) この混合液を凍結融解するか、 もしくはこの混合液を、 さらに界面活性剤と 混合する工程、
を包含する方法によつて遺伝子導入べクタ一を作成し得る。
本発明の別の局面において、 遺伝子導;^のための不活性化ウィルスェンベロー プベクタ一の調製方法であって、 以下；
ウイルスを不活性化する工程、
不活性化ウィルスを外来遺伝子と混合する工程、 および
混合液を凍結融解する工程、
を包含する、 方法が提供される。
本発明のさらなる局面において、 遺伝子導入のための不活性化ウィルスェンべ ロープベクターの調製方法であって、 以下；
ウィルスを不活性化する工程、 および 不活性化ウィルスを界面活性剤の存在下で外来遺伝子と混合する工程、 を包含する、 方法が提供される。
本発明のさらなる局面において、 使用される界面活性剤は、 ォクチルグルコシ ド、 T r i t o n— X 1 0 0、 C HA P Sおよび N P— 4 0からなる群から選択 される。
本発明の特定の局面において、 不活性化ウィルスエンベロープとの混合前に、 硫酸プロ夕ミンを外来遺伝子に添加する工程をさらに包含する、 不活性化ウィル スエンベロープベクターの調製方法が提供される。
本発明のさらなる局面において、 単離された動物組織に遺伝子を導入する方法 であって、 以下；
所望の遺伝子を含有する遺伝子導入ベクターを調製する工程、
遺伝子導入ベクターによって、 該動物組織に遺伝子を導入する工程、
を包含する、 方法が提供される。
本発明の別の局面において、 浮遊細胞に外来遺伝子を導入する方法が提供され、 この方法は、 以下：
浮遊細胞と遺伝子導入べクターとを、 硫酸プロタミン存在下で混合する工程、 混合液を遠心する工程
を包含する。
本発明のさらに別の局面において、 本発明の遺伝子導入ベクターを含有する、 遺伝子治療のための薬学的組成物が提供される。 図面の簡単な説明
図 1は、 HV Jエンベロープベクタ一を様々な回数で凍結融解し、 培養細胞に トランスフエクシヨンして外来遺伝子 (ルシフェラ一ゼ遺伝子） の発現 （ルシフ エラ一ゼ活性） の程度を測定した結果である。
図 2は、 培養細胞に添加する HV Jエンベロープベクターの調製に使用したゥ ィルス数を同一として培養細胞にトランスフエクシヨンした場合のルシフェラ一 ゼ活性を測定した結果である。
図 3は、 HV Jエンベロープベクターの外来遺伝子 （ルシフェラーゼ発現べク 夕一） の量を様々に変えた場合のルシフェラ一ゼ活性を測定した結果である。 図 4は、 HV Jエンベロープベクタ一調製のための緩衝液の種類を変えた場合 のルシフェラーゼ活性を測定した結果である。
図 5は、 従来の遺伝子導入べクタ一不活性化 HV J—リボソームを用いた遺伝 子導入と、 この発明の方法とを比較した結果である。
図 6は、 界面活性剤を用いる不活性化 HV Jエンベロープベクターの調製方法 の概略を示す図である。
図 7は、 界面活性剤を用いて調製した HV Jエンベロープベクター中に含まれ る夕ンパク質の、 S D S— P A G Eパターンを示す図である。
図 8は、 HV Jエンベロープベクターの陰性染色法を用いた電子顕微鏡写真で ある。 （1) 未処理の HVJ ； (2) DNAを含まないォクチルダルコシド処理 した HVJ ； (3) ォクチルダルコシド処理した、 DNAを含有する HVJ。
図 9A〜Cは、 図面に示した各ォクチルダルコシド濃度、 ォクチルグルコシド による HV Jの各処理時間、 超音波処理有り （s on i c) または超音波処理な し、 および各使用したベクター容量における遺伝子導入効率を、 ルシフェラーゼ 活性で示したグラフである。
図 1 OAおよび 10Bは、 図面に示した各硫酸プロ夕ミン （PS) の濃度およ び各トランスフエクト時間における遺伝子導入効率を、 ルシフェラーゼ活性で示 したグラフである。
図 1 1Aおよび 1 1 Bは、 図面に示した各 DN A量 （実験に使用した量） 、 お よび各保存温度における遺伝子導入効率を、 ルシフェラーゼ活性で示したグラフ である。
図 12は、 図面に示した各 HAUの力価の HV Jを用いて HV Jエンベロープ ベクターを調製し、 遺伝子導入を行った場合の遺伝子導入効率を、 ルシフェラ一 ゼ活性で示したグラフである。
図 13Aは、 図面に示した各 UV照射量における遺伝子導入効率を、 ルシフエ ラーゼ活性で示したグラフである。
図 13Bは、 図面に示した各 0—プロピオラクトン （BPL) 濃度における遺 伝子導入効率を、 ルシフェラ一ゼ活性で示したグラフである。
図 14は、 ヒト舌部の扁平上皮癌 (SAS) に対する、 図面に示した各硫酸プ 口タミン濃度および各トランスフエクシヨンのインキュベーション時間における 遺伝子導入効率を、 ルシフェラーゼ活性で示したグラフである。
図 15は、 ヒト大動脈内皮細胞 （HAEC) に対する、 図面に示した各硫酸プ 口タミン濃度および各トランスフエクシヨンのインキュベーション時間における 遺伝子導入効率を、 ルシフエラ一ゼ活性で示したグラフである。
図 16 Aは、 マウス肝臓に対する、 本発明の HV Jエンベロープベクターおよ び HV J— AVE (A r t i f i c i a 1 V i r a l Enve l op) リポ ソ一ムを用いた遺伝子導入効率を、 ルシフェラーゼ活性で示したグラフである。 図 16Bは、 マウス子宮に対する、 本発明の HV Jエンベロープベクターおよ び HV J— AVE (Ar t i f i c i a l V i r a l Enve l op) リポ ゾームを用いた遺伝子導入効率を、 ルシフェラーゼ活性で示したグラフである。 図 16Cは、 マウス子宮に対する、 本発明の HV Jエンベロープベクタ一を用 いた pEB— CMV— L a c Zの遺伝子導入後に、 子宮組織の L a c Z染色を行 つた結果である。 La c Z染色によって、 主に子宮内膜の腺上皮での L a c Z遺 伝子の発現が検出された。
図 16Dは、 SDラット （雄性、 体重300〜400 ） に対して、 10, 0 001 1；の £0??— 1を含む HV Jエンベロープベクタ一を、 大槽経由、 類動脈経由で投与した結果である。 投与後 3〜4日目に屠殺し、 生切片を作製し、 蛍光顕微鏡下で観察した。 ①大槽経由での投与
脳の表面への、 遺伝子導入が確認された。 一方、 脳深部への遺伝子導入は、 確 認されなかった。 脈絡叢への遺伝子導入も確認されなかった。
②、 ③頸動脈経由での投与
投与を行った左側において、 有意に高い発現が確認された。 脳表面部分のみで はなく、 基底核部にも、 発現が確認された。 また、 対脳の脳表にも、 確認された。 対脳の脳表での発現は、 側副流 （c o 1 a t e r a 1 f 1 ow) によって、 対 側に流れたものと考えられた。
図 16Eは、 HGF機能を阻害する変異型 HGFを発現するベクターである p CMV— NK4が、 容量依存的に VEGFによって誘導された血管新生を抑制し た結果を示す図である。
図 16Fは、 HV Jエンベロープベクタ一を気管に注入して行った遺伝子導入 の結果を示す図である。
図 17 Aおよび 17 Bは、 細胞へのオリゴヌクレオチド導入の翌日に、 蛍光顕 微鏡で細胞の蛍光を観察した結果を示す。 10分間のインキュベーションでは 1 0%程度のオリゴヌクレオチド導入効率であった （図 17B) 。 一方、 60分間 のインキュベーションでは 80%以上の細胞にオリゴヌクレオチドが導入されて いた （図 17 A) 。
図 18は、 ヒト白血病細胞株である CCRF— CEM、 NALM— 6、 K— 5 62を対象として導入実験を行った結果である。 これら細胞株は、 HVJ—リポ ソームや既存のリポソ一ム試薬 （G i b c 8 しの 1 0 6 (： 1: 11、 L i p 0 f e c t am i n eなど） では導入効率が極めて低い細胞株 （特に CCR F_CEM、 NALM- 6) である。
硫酸プロ夕ミン 600〜： L 000 g/m 1を添加し、 遠心は 10000 r p mまたは 15000 r pmで、 10分間、 20 °Cでの遠心をする条件において、 高いルシフェラーゼ活性が得られた。 有意な細胞毒性は認められなかった。 また、 遠心と硫酸プロ夕ミンはどちらも導入に必要であった。
図 1 9は、 癌組織への遺伝子導入の結果を示す。 癌組織である腫瘍塊における 遺伝子発現がみられ、 特に、 硫酸プロ夕ミン 5 0 0 s m 1の時に高い遺伝子 導入活性が得られた。 これより低い濃度の硫酸プロタミンを用いた場合、 遺伝子 発現を検出できなかった。
図 2 0は、 ヘルぺスウィルスエンベロープベクターを用いる細胞への遺伝子導 入の結果を示す。 総ルシフェラーゼ活性は低いが、 T r i t o n— X I 0 0での 5分間の処理によって、 最も導入効率の高いベクターが作製できたと判断された。 また硫酸プロ夕ミンを用いない調製方法が、 導入効率が高かった。 各サンプルと も形態学的な観察によって細胞毒性は認められなかった。
図 2 1は、 — 8 0 での保存後のへルぺスウィルスエンベロープベクターを用 いる細胞への遣伝子導入の結果を示す。 血清 1 0 %を加えた培地を用いた場合、 無血清培地よりも導入効率が高く、 ベクター溶液 2 0 0 // 1 (推定量： 2 . 8 X 1 0 7ウィルス粒子 Zゥエル） が 1 0 0 1溶液 （推定量： 1 . 4 X 1 0 7ウイ ルス粒子 Zゥエル） より活性が高かった。 発明を実施するための最良の形態 本明細書で使用される場合、 「遺伝子導入」 とは、 生体内またはインビトロに おいて、 標的細胞内に、 天然、 合成または組換えの所望の遺伝子または遺伝子断 片を、 導入された遺伝子がその機能を維持するように、 導入することをいう。 本 発明において導入される遺伝子または遺伝子断片は、 特定の配列を有する D NA、 R NAまたはこれらの合成アナログである核酸を包含する。 また、 本明細書にお いて使用される場合、 遺伝子導入、 トランスフエクシヨン、 およびトランスフエ クトは、 互換可能に使用される。
本明細書で使用される場合、 「遺伝子導入ベクター」 、 「遺伝子ベクター」 ま たは 「ウィルスエンベロープベクター」 とは、 ウィルスエンベロープ中に外来遺 伝子を封入したベクターをいう。 遺伝子導入ベクターの調製のために使用される ウィルスとしては、 野生型ウィルスであっても、 組換え型ウィルスであってもよ い。
本発明の 1つの局面において、 使用されるウィルスは、 レトロウイルス科、 ト ガウィルス科、 コロナウィルス科、 フラビウィルス科、 パラミクソウィルス科、 オルトミクソウィルス科、 ブニヤウィルス科、 ラブドウィルス科、 ボックスウイ ルス科、 ヘルぺスウィルス科、 パキュロウィルス科、 およびへパドナウィルス科 からなる群から選択される科に属するウィルスである。 また、 本発明の特定の局 面において、 使用されるウィルスは、 H V Jである。
本明細書で使用される場合、 「遺伝子導入活性」 とは、 ベクターによる 「遺伝 子導入」 の活性をいい、 導入された遺伝子の機能 （例えば、 発現ベクターの場合、 コードされるタンパク質の発現および/またはそのタンパク質の活性など） を指 標として検出され得る。
本明細書で使用される場合、 「不活性化」 とは、 ゲノムを不活性化したウィル スをいう。 この不活性化ウィルスは、 複製欠損である。 好ましくは、 この不活性 化は、 U V処理またはアルキル化剤による処理によって、 なされる。
本明細書で使用される場合、 「外来遺伝子」 とは、 遺伝子導入べクタ一内に含 まれる、 ウィルス以外の起源の核酸配列をいう。 本発明の 1つの局面において、 この外来遺伝子は、 遺伝子導入べクタ一によって導入された遺伝子が発現するた めに適切な調節配列 （例えば、 転写に必要なプロモー夕一、 ェンハンサー、 ター ミネ一夕一、 およびポリ A付加シグナル、 ならびに翻訳に必要なリボゾーム結合 部位、 開始コドン、 終止コドンなど） と作動可能に連結される。 本発明の別の局 面において、 外来遺伝子は、 この外来遺伝子の発現のための調節配列を含まない。 本発明のさらなる局面において、 外来遺伝子は、 オリゴヌクレオチドまたはデコ ィ核酸である。 遺伝子導入ベクター内に含まれる外来遺伝子は、 代表的には DNAまたは RN Aの核酸分子であるが、 導入される核酸分子は、 核酸アナログ分子を含んでもよ い。 遺伝子導入ベクター内に含まれる分子種は、 単一の遺伝子分子種であっても、 複数の異なる遺伝子分子種であってもよい。
本明細書で使用される場合、 「遺伝子ライブラリー」 とは、 天然より単離され た核酸配列または合成の核酸配列を含む、 核酸ライブラリーである。 天然より単 離された核酸配列の供給源としては、 真核生物細胞、 原核生物細胞、 またはウイ ルス由来の、 ゲノム配列、 cDNA配列が挙げられるが、 これらに限定されない。 天然より単離された配列に、 任意の配列 （例えば、 シグナル、 タグなど） を付加 したライブラリ一もまた、 本発明の遺伝子ライブラリ一に含まれる。 1つの実施 態様において、 遺伝子ライブラリ一は、 その中に含まれる核酸配列の、 転写およ び Zまたは翻訳をもたらすプロモー夕一などの配列を含む。
本明細書において、 「HVJ」 および 「センダイウィルス」 は、 互換可能に用 いられ得る。
本明細書において、 「HAU」 とは、 ニヮトリ赤血球 0. 5%を凝集可能なゥ ィルスの活性をいい、 1 HAUは、 ほぼ 2400万ウィルス粒子に相当する (Ok a d a, Y. ら、 B i k en J ou r n a l 4、 209〜213、 1 961) 。
(遺伝子治療）
治療的な核酸構築物は、 本発明の遺伝子導入ベクターを用いて局所的にまたは 全身的にのいずれかで投与され得る。 そのような核酸構築物がタンパク質のコー ド配列を包含する場合、 そのタンパク質の発現は、 内因性の哺乳類のプロモー夕 一または異種のプロモーターの使用により誘導され得る。 コード配列の発現は、 構成的であり得るか、 または調節され得る。
本発明の遺伝子導入ベクターを遺伝子治療のための組成物として使用する場合、 本発明のベクタ一の投与は、 PBS (リン酸緩衝化生理食塩水） または生理食塩 水などに懸濁したベクタ一懸濁液の局所 （例えば、 癌組織内、 肝臓内、 筋肉内お よび脳内など） への直接注入か、 または血管内 （例えば、 動脈内、 静脈内および 門脈内） への投与によりなされる。
1つの実施態様において、 遺伝子導入ベクターは、 一般には、 この遺伝子導入 ベクターを単位用量注入可能な形態 （溶液、 懸濁液または乳濁液） で、 薬学的に 受容可能なキャリア （すなわち、 使用された投薬量および濃度においてレシピエ ントに対して非毒性であり、 そして処方物の他の成分と適合性であるもの） とを 混合することによって処方され得る。 例えば、 処方物は、 好ましくは、 酸化剤お よび遺伝子導入べクタ一にとつて有害であることが公知である他の化合物を含ま ない。
キャリアは、 等張性および化学的安定性を増強する物質のような微量の添加物 を適宜含む。 このような物質は、 使用された投薬量および濃度においてレシピエ ントに対して非毒性であり、 そしてリン酸、 クェン酸、 コハク酸、 酢酸、 および 他の有機酸またはそれらの塩のような緩衝剤；ァスコルビン酸のような抗酸化 剤；低分子量 （約 1 0残基未満の） ポリペプチド （例えば、 ポリアルギニンまた はトリペプチド） ；タンパク質 （例えば、 血清アルブミン、 ゼラチン、 またはィ ムノグロブリン） ；親水性ポリマ一 （例えば、 ポリビニルピロリドン） ；ァミノ 酸 （例えば、 グリシン、 グルタミン酸、 ァスパラギン酸、 またはアルギニン） ； 単糖、 二糖および他の炭水化物 （セルロースまたはその誘導体、 グルコース、 マ ンノース、 またはデキストリンを含む） ；キレート剤 （例えば、 E D TA) ；糖 アルコール （例えば、 マンニトールまたはソルビトール） ；対イオン （例えば、 ナトリウム） ；および Zまたは非イオン性界面活性剤 (例えば、 ポリソルベート、 ポロキサマー） 、 または P E Gを含み得る。
遺伝子導入ベクターを含む薬学的組成物は、 代表的には、 単位または多用量容 器、 例えば、 密封アンプルまたはバイアルにおいて、 水溶液として貯蔵され得る。 本発明はまた、 本発明の薬学的組成物の 1以上の成分を満たした 1以上の容器 を含む薬学的パックまたはキットを提供する。 さらに、 本発明のポリペプチドは、 他の治療化合物とともに使用され得る。
本発明の遺伝子導入ベクターを含む薬学的組成物は医療実施基準 （good me d i c a l p r a c t i c e) に一致した様式で、 個々の患者の臨床状態 (例えば、 予防または処置されるべき状態） 、 遺伝子導入ベクターを含む組成物 の送達部位、 標的組織、 投与方法、 投与計画および当業者に公知の他の因子を考 慮しつつ処方され、 そして投与される。 従って、 本明細書の遺伝子導入べクタ一 の 「有効量」 または適切な投与量は、 このような考慮事項によって決定される。 例えば、 マウスに本発明の遺伝子ベクターを投与する場合、 マウス一匹あたり、 20-20, 000HAU相当の、 好ましくは 60〜6, 000HAU相当の、 より好ましくは 200〜2, 000HAU相当の遺伝子べクタ一が投与される。 投与される遺伝子べクタ一中に含有される外来遺伝子の量は、 マウス一匹あたり、
0. 1~100 g、 好ましくは 0. 3〜30 g、 より好ましくは 1〜： I 0 gである。
また、 ヒトに本発明の遺伝子ベクターを投与する場合、 被験体あたり、 400
〜400, 000HAU相当の、 好ましくは 1, 200〜120, 000HAU 相当の、 より好ましくは 4, 000~40， 000HAU相当の遺伝子ベクター が投与される。 投与される遺伝子べクタ一中に含有される外来遺伝子の量は、 被 験体あたり、 2〜2， O O O g、 好ましくは 6〜600 g、 より好ましくは 20~200 gである。
以下の実施例は、 例示であって、 本発明を限定しないことが意図される。 実施例
1. 凍結融解を使用する遺伝子導入べクタ一の調製およびその使用
(実施例 1 ：凍結融解による HV Jエンベロープベクターの調製）
外来遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を用い、 組換え HV Jウィルスを様々 な回数で凍結融解した後、 培養細胞に遺伝子導入した。
TE 500 Z 1に、 750 gのルシフェラーゼ発現ベクター P c O r i P L u c (S a e k iおよび K a n e d aら、 Human Ge n e T h e r a p y、 1 1、 471〜479 (2000) ) と様々な濃度の HV Jウィルスを混合 した。 HV Jウィルス濃度は、 10、 25、 50、 100 H AU/jLt 1に調製し た。 この溶液を 12分割し、 それぞれをドライアイスによって 4でに保存して凍 結させた後、 融解することを最大 30回まで繰り返した。 所定回数の凍結融解を 終えた溶液を、 BHK— 21細胞 （24ゥエルディッシュ、 4X 104細胞 デ イツシュ、 0. 5ml DMEM, 10%FCS) の培地に添加し、 37で、 5%C02にて 20分間反応後、 PBSにより洗浄し、 新たに培養液を 0. 5m 1加えて 24時間培養した。
培地を除去し、 l XCe l l Cu l t u r e Ly s i s Re agen t (P r ome g a社） 500 1を細胞上に加えて細胞を溶解した後、 マイクロ チューブに移して遠心し、 得られた上清 20 1から、 P r ome g a Lu c i f e r a s e As s ay Sy s t emと Luma t L B 9501 L u m i n o p h o t ome t e rを用いてルシフェラ一ゼ活性を測定した。 測定は 各溶液について 3回行い、 平均値を求めた。
結果は図 1に示したとおりである。 組換え HV Jウィルスの凍結融解の回数が 増加するに従ってルシフェラーゼ活性が上昇し、 3回の凍結融解に比べ 20回の 凍結融解では 10倍以上のルシフェラ一ゼ発現が観察された。 この結果から、 こ の実施例に用いた条件では、 組換え HV Jウィルスの凍結融解の回数は好ましく は 5回以上、 さらに好ましくは 15〜 20回程度であることが確認された。
(実施例 2 ：凍結融解により調製された HV Jエンベロープベクターの遺伝子 導入効率）
実施例 1と同様の組換え HV Jウィルスを 30回凍結融解した後、 宿主細胞に 添加するウィルス数を同一条件として、 細胞への遺伝子導入効率を調べた。 結果は図 2に示したとおりである。 この図 2において、 例えば X軸が 500 H AUの場合では、 ウィルス濃度 1 OHAU/ 1の溶液の添加量は 50 1であ り、 10 OHAU/ 1の溶液は 5 1となる。 この図 2に示したとおり、 ウイ ルス濃度が 100 HAUZ 1の溶液は 10〜 50 HAU// 1濃度の場合に比 較して遺伝子発現の効率が約 50%低下した。 この結果から、 この実施例の条件 では、 組換えウィルス濃度は 1 0〜50 HAUZ 1の範囲とすることが好まし いことが確認された。
また、 組換え HV Jウィルスを 29回凍結融解した後、 30回目の凍結を行い、 その凍結状態で 1週間保存した後、 融解して細胞に添加した。 その結果、 この 1 週間冷凍保存した組換え HV Jウィルスも、 30回の凍結融解を連続で行ったゥ ィルスと同程度のルシフェラーゼ遺伝子発現を示した。
(実施例 3 ：ルシフェラ一ゼ発現ベクターを用いる遺伝子導入効率の測定） ルシフェラーゼ発現べクタ一の量を様々に変えて HV Jエンベロープベクター を調製し、 宿主細胞への遺伝子導入効率を調べた。
HV Jウィルス量は 1 1 TE当たり 50HAUとした。 ルシフェラ一ゼ発 現ベクター pc〇r i PLucの量は、 1 1の TE当たり 0. 05、 0. 1、 0. 25、 0. 5、 1. 0、 1. 5、 2. 0、 3. 0、 5. 5 とした。 最終 溶液量を 100 1として 20回の凍結融解を行った後、 実施例 1と同一の方法 によりルシフエラーゼ活性を測定した。
結果は図 3に示したとおりである。 外来遺伝子である発現ベクター p cOr i
PLu c (約 9. 5 kb) の添加量が 1. 5 gまでは量依存的に発現量が増加 し、 これ以降は発現量にはほとんど変化はなかった。 以上の結果から、 この実施 例で用いた条件では、 1. 1以上の外来遺伝子 DNAを遺伝子導入に 用いることが好ましいことが確認された。
(実施例 4 ：遺伝子導入効率に対する緩衝液の種類の影響）
HV Jエンベロープベクター調製に用いる緩衝液の種類を変えて、 宿主細胞へ の遺伝子導入効率を調べた。
HV Jウィルス量は緩衝液 1 ί 1当たり 50HAU、 ルシフェラーゼ発現べク ター p cOr i PLu c量は 1 5 fig/ n 1とした。 緩衝液は TE、 PBS, B S S (137mM NaC l、 5. 4mM KC 1、 1 OmM Tr i s— HC 1、 pH7. 5) 、 並びにこれらの緩衝液に最終濃度 0mM、 20mM、 °40m M、 6 OmMのショ糖を添加したものを使用した。 最終溶液量を 1 0 O 1とし て 20回の凍結融解を行った後、 実施例 1と同一の方法によりルシフェラーゼ活 性を測定した。
結果は図 4に示したとおりであり、 この実施例で用いた条件では、 組換え HV Jウィルスの調製のための緩衝液としては TE単独が好ましいことが確認された。
(実施例 5 ： AVE (Ar t i f i c i a l V i r a l Env e l o p) 型のベクタ一と本願発明の HV Jエンベロープベクターとの比較）
従来の遺伝子導入べクタ一である不活性化 HV J—リボソーム （最も遺伝子導 入効率の優れた AVE型 （S a e k i , Y. ら、 Huma n Ge n e Th e r a py、 8、 2133〜 2 141 (1 997) ) を用いた遺伝子導入と、 この 発明の方法とを比較した。
HV J—リボソームまたは HV Jウィルス量は TE 1 1当たり 50HAU、 ルシフェラ一ゼ発現べクタ一 p cOr i ? 1!(：の量は1. 5 g 1とした。 また、 組換え HV Jウィルスの凍結融解の回数は 2回または 1 5回とした。 その 他の条件は、 宿主細胞をヒト胎児腎細胞株 HE K 293とした以外は実施例 1と 同様とした。
結果は図 5に示したとおりである。 H V Jエンベロープベクターの凍結融解を 1 5回繰り返すこの発明の方法は、 遺伝子導入効率において HV J—リボソーム を用いた従来方法よりはるかに優れていることが確認された。
(実施例 6 ：合成オリゴヌクレオチドの導入効率）
F I TC (イソチォシアン酸フルォレツセイン） で蛍光標識した合成オリゴヌ クレオチド （2 0 b p ) を l m g Zm lの濃度で不活性化 H V Jウィルスと混合 し、 この溶液を 2 0回凍結融解した後、 B HK— 2 1細胞と 2 0分間反応させた。 1 7時間後に蛍光シグナルを観察した結果、 ほぼ 1 0 0 %の細胞の核内に蛍光の 集積が認められた。 この結果から、 この発明の方法は、 合成核酸の細胞内導入に も有効であることが確認された。
(実施例 7 ： G F P遺伝子の導入効率）
G F P (グリーン蛍光タンパク質） 遺伝子と不活性化 HV Jウィルスの混合溶 液を 2 0回凍結融解した後、 2 n g _ 5 1をラット大脳に注入した。 その結果、 注入部位に蛍光シグナルが観察された。 また、 G F P遺伝子による HV Jェンべ ロープベクターを凍結して 3ヶ月保存した後、 ラット大脳に注入したが、 同じく 注入部位に G F P遺伝子発現による蛍光シグナルが観察された。
以上の結果から、 この発明の方法は、 生体内においても確実に遺伝子導入が可 能であることが確認された。 また、 HV Jエンベロープベクターの凍結保存が可 能であることも確認された。
2 . 界面活性剤を使用する遺伝子導入べクタ一の調製およびその使用
(実施例 8 ：界面活性剤を用いる不活性化 H V Jエンベロープベクターの調 製）
界面活性剤を用いる不活性化 HV Jエンベロープベクタ一の調製方法の概略を 図 6に示す。
( 1 ： HV Jの増殖）
HV Jは鶏の受精卵への種ウィルスの接種により増殖されたものが一般に使用 され得るが、 サル、 ヒトなどの培養細胞、 培養組織へのウィルスの持続感染系 (トリプシンなどの加水分解酵素を培養液中に添加） を利用して増殖させたもの、 クローニングされたウィルスゲノムを培養細胞に感染させ持続感染をおこさせて 増殖させたもの、 全てが利用可能である。 本実施例において、 HV Jの増殖を以下のようにおこなった。
HV Jの種ウィルスを、 SPF (Sp e c i f i c p a t hog e n f r e e) の受精卵を使って増殖させ分離 ·精製した HV J (Z種） を細胞保存用チ ユーブに分注し、 10% DMSOを加えて液体窒素中に保存し、 調製した。 受精直後のニヮトリ卵を入荷し、 インキュベーター （SHOWA— FURAN
K I P— 03型；約 300鶏卵収容） にいれ、 36. 5で， 湿度 40%以上の 条件で 10 ~ 14日飼育した。 暗室中で、 検卵器 （電球の光が口径約 1. 5 cm の窓を通して出るようになっているもの） を用いて、 胚の生存及び気室と漿尿膜 を確認し、 漿尿膜の約 5mm上方に鉛筆でウィルス注入箇所の記しをつけた （太 い血管を除いた場所を選定する） 。 ポリペプトン溶液 （1%ポリペプトン、 0.
2% NaC lを混合し、 1M NaOHでpH7. 2に調整してオートクレー ブ滅菌し、 4で保存したもの） で種ウィルス （液体窒素からとりだしたもの） を 500倍に希釈し、 4 においた。 卵をイソジン及びアルコールで消毒し、 ウイ ルス注入箇所に千枚通しで小孔をあけ、 希釈した種ウィルス 0. 1mlを 26ゲ 一ジの針付き lmlシリンジを用いて、 漿尿腔内に入るように注入した。 溶かし たパラフィン （融点 50〜52°C) をパスツールピペットを用いて孔の上に置き これをふさいだ。 卵をインキュベーターにいれ、 36. 5 、 湿度 40%以上の 条件で 3日飼育した。 次に、 接種卵を一晩 4でにおいた。 翌日、 卵の気室部分を ピンセットで割り、 18ゲージの針を付けた 10m 1シリンジを漿尿膜の中にい れて、 漿尿液を吸引し、 滅菌ボトルに集め、 4でに保存した。
(2 ： HV Jの精製）
HVJは、 遠心分離による精製方法、 カラムによる精製方法、 または当該分野 において公知のその他の精製方法によって、 精製され得る。
(2. 1 ：遠心分離による精製方法）
手短には、 増殖させたウィルス液を回収し低速遠心で培養液や漿尿液中の組 織'細胞片を除去した。 その上清を高速遠心 （27, 500 Xg, 30分間） と ショ糖密度勾配 （30〜60%wZv) を利用した超遠心 （62, 800 Xg, 90分間） により精製した。 精製の間にウィルスをできるだけ穏和に扱い、 4°C で保存することに注意すべきである。
本実施例において、 具体的には、 以下の方法によって HV Jを精製した。
HVJ含有漿尿液 （HV J含有のニヮトリ卵の漿尿液を集め 4でにて保存） の 約 100mlを広口の駒込ピぺッ卜で 50m 1の遠心チューブ 2本に入れ （S a e k i , Y. ， および K a n e d a, Y : P r o t e i n mod i f i e d l i po s ome s (HVJ— l i po s ome s) f o r t h e d e l i ve r y o f ge ne s, o l i gonuc l e o t i d e s and p r o t e i n s. Ce l l B i o 1 o g y ; A l abo r a t o r y h and book (第 2版） J. E. Ce l i s編 （Ac ad emi c P r e s s I nc. , S anD i e go) 第 4卷、 127〜： L 35, 1998を参照の こと） 、 低速遠心機で 3000 r pm, 10分、 4でで遠心し （ブレーキはォ フ） 、 卵の組織片を除去した。
遠心後、 上清を 35ml遠心チューブ 4本 （高速遠心用） に分注し、 アングル ロー夕一で 27, 000 g, 30分遠心した （アクセル、 ブレーキはオン） 。 上 清を除き、 沈殿に BS S (1 OmM T r i s _HC 1 (pH7. 5) 、 137 mM NaC l、 5. 4mM KC 1 ；オートクレーブし、 4で保存） （BSS のかわりに PBSでも可能） をチューブ当たり約 5m 1加え、 そのまま 4*Cで一 晚静置した。 広口の駒込ピペットでゆるやかにピペッティングして沈殿をほぐし 1本のチューブに集め、 同様にアングル口一ターで 27， 000 g、 30分遠心 した。 上清をのぞき沈殿に BSS約 10mlを加え、 周様に 4 でー晚静置した。 広口の駒込ピぺットでゆるやかにピペッティングして沈殿をほぐし、 低速遠心機 で 3000 r pm, 10分、 4でで遠心し （ブレーキはオフ） 、 除ききれなかつ た組織片ゃウィルスの凝集塊をのぞいた。 上清を新しい滅菌済みチューブに入れ 精製ウィルスとして 4 °Cで保存する。 このウィルス液 0. 1mlに BSSを 0. 9m 1加え、 分光光度計で 540 n mの吸収を測定し、 ウィルス力価を赤血球凝集活性 （HAU) に換算した。 54 0 nmの吸収値 1がほぼ 15, 000 H AUに相当した。 H AUは融合活性とほ ぼ比例すると考えられる。 また実際にニヮトリ赤血球液 （0. 5%) を用いて、 赤血球凝集活性を測定してもよい （動物細胞利用実用化マニュアル、 REAL I ZE INC. (内田、 大石、 古沢編集） P 259〜268、 1984を参照の こと） 。
さらにショ糖密度勾配を用いた HV Jの精製も必要に応じて行い得る。 具体的 には、 ウィルス懸濁液を 60%、 30%のショ糖溶液 （ォ一トクレーブ滅菌） を 重層した遠心チューブにのせ、 62, 800Xgで 120分間密度勾配遠心を行 う。 遠心後、 60%ショ糖溶液層上にみられるパンドを回収する。 回収したウイ ルス懸濁液を B S Sもしくは PBSを外液として 4 " で透析を一晩行い、 ショ糖 を除去する。 すぐに使用しない場合は、 ウィルス懸濁液にグリセロール （オート クレープ滅菌） と 0. 5M EDTA液 （オートクレープ滅菌） をそれぞれ最終 濃度が 10%と 2〜1 OmMになるように加えて一 80でで穏やかに凍結し、 最 終的に液体窒素中で保存する （凍結保存はグリセロールと 0. 5M EDTA液 の代わりに 10mM DMSOでも可能） 。
(2. 2：カラムおよび限外濾過による精製方法）
遠心分離による精製方法に代えて、 カラムによる HV Jの精製も本発明に適用 可能である。
手短には、 分子量カットオフが 50， 000のフィルターによる限外濾過によ る濃縮 （約 10倍） とイオン交換クロマトグラフィー （0. 3M〜1M NaC 1) による溶出を用いて精製した。
具体的には、 本実施例において、 以下の方法を使用して、 HV Jをカラムによ つて精製した。
漿尿液を採集した後、 80 Π！〜 10 mのメンブランフィルターにてろ過し た。 0. 006〜0. 008 % BPL (最終濃度） を漿尿液に加え （4° (：、 1 時間） 、 HVJを不活性化した。 漿尿液を 37で、 2時間インキュベートするこ とによって、 B PLを不活性化した。
500 KMWCO (A/G Te c hno l ogy, Ne e dh am、 Ma s s a c hu s e t t s) を用いたタンジェンシャルフロー限外ろ過法により約 1 0倍濃縮した。 緩衝液として、 50 mM NaC l、 ImM MgC l 2、 2 % マンニトール、 20mM T r i s ( H 7. 5) を用いた。 HAUアツセィ により、 ほぼ 100 %の HVJ回収率であり優れた結果がえられた。
QS e pha r o s eFF (アマシャムフアルマシアバイオテク KK、 To k yo) によるカラムクロマトグラフィー法 （緩衝液： 2 OmM Tr i sHC l (pH7. 5) 、 0. 2〜1M NaC 1) で HVJを精製した。 40〜50% の回収率であり、 純度は 99%以上であった。
500KMWCO (A/G Te c hno 1 ogy) を用いたタンジェンシャ ルフロー限外ろ過法により HV Jの画分を濃縮した。
(3 ： HV Jの不活性化）
HV Jの不活性化が必要な場合、 以下に記載するように、 紫外線照射またはァ ルキル化剤処理により行った。
(3. 1 :紫外線照射法）
HV J懸濁液 lmlを 30mm径のシャーレにとり、 99または 198ミリジ ユール cm2を照射した。 ガンマ一線照射も利用可能である （5〜20ダレ ィ） が完全な不活性化がおこらない。
(3. 2 ：アルキル化剤による処理）
使用直前に、 1 OmM KH2PO中に 0. 01 % )3—プロピオラクトンの 調製をした。 作業中は低温下に保ち素早く作業を行った。
精製直後の HV Jの懸濁液に最終 0. 01 %になるように 0—プロピオラクト ンを添加し、 氷上で 60分間でインキュベートした。 その後 2時間、 37ででィ ンキュペートした。 エツペンドルフチューブにチューブあたり 10, 000HA U分ずつ分注し、 15， 000 r pm, 15分遠心し、 沈殿を— 20でで保存す る。 上記の不活性化法によらず、 沈殿を— 20 で保存せず、 そのまま界面活性 剤処理により DN Aを取り込ませ、 ベクターを作成することも可能である。
(4 ： HV Jエンベロープベクターの作成）
保存してあった HV Jに外来 DNA 200〜800 gを含む溶液 92 1を 加えてピペッティングでよく懸濁した。 この溶液は、 —20でで、 少なくとも、 3ヶ月保存可能である。 HV Jとの混合前に DNAに硫酸プロ夕ミンを添加する と、 発現効率が 2倍以上増強した。
この混合液を氷上に 1分間置き、 ォクチルダルコシド （10%) を 8 1加え て 15秒氷上でチューブを振盪し、 45秒氷上に静置した。 界面活性剤での処理 時間は、 1〜5分間が好ましい。 ォクチルダルコシド以外に、 Tr i t on— X 100 (t—ォクチルフエノキシポリエトキシエタノール） 、 CHAPS (3— [ (3—コラミドプロピル） —ジメチルアンモニォ] — 1—プロパンスルホン 酸） 、 NP— 40 (ノエルフエノキシポリエトキシエタノール） などの界面活性 剤も使用し得る。 Tr i t on— X100、 NP— 40および CHAP Sの好ま しい最終濃度は、 それぞれ、 0. 24〜0. 80%、 0. 04〜0. 12%およ び 1. 2〜2. 0%である。
冷 BSSを lml添加し、 すぐに 15, 000 r pmで 15分遠心した。 生じ た沈殿に PBSまたは生理食塩水などを 300 1加えて、 ボルテックス、 ピぺ ッティングで懸濁した。 懸濁液は直接遺伝子導入に使用することも、 _20でで 保存後に遺伝子導入に使用することも可能である。 この H V Jエンベロープべク 夕一は、 少なくとも 2ヶ月間の保存後、 同程度の遺伝子導入効率を維持した。
(実施例 9 ： HV Jエンベロープベクターにおける F 1と HNタンパク質の比 率）
(1 ：サンプルの調製） ( i) 精製 HVJ 1 0, 000HAU相当を 1 5， 000 r pm, 1 5分間遠 心し、 沈殿を 30 0 il lの PB Sに懸濁し一 20でに保存した。
精製11 】 10, 000HAU相当を紫外線照射 （1 98ミリジュー ル Zcm2) 後、 1 5, O O O r pm, 1 5分間遠心し、 沈殿を 300 /z 1の P BSに懸濁し— 20でで保存した。
( i i i ) 精製 HV J 10, 000 HAU相当を紫外線照射 （ 198ミリジュ ール Zcm2) 後、 1 5， O O O r m, 1 5分間遠心し、 沈殿に p c L u c i DNA200 / g (溶液 92 l) を加えて、 ピぺッテングで懸濁した。 氷上に 置き、 ォクチルダルコシド （10%) を 8 l加えて、 1 5秒間、 手でチューブ を振盪し、 45秒間氷上静置し、 冷 BS Sを lml加えて、 すぐに 15, 000 r pm, 1 5分間遠心後、 300 1の P B Sに懸濁し一 20でで保存した。
(2 ：タンパク質電気泳動）
3種類のサンプルの 5、 10、 20 /X 1に X 5の L a em 1 iサンプル緩衝液 を加え 10% SDS—ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。 泳動終了後、 クマシ一ブルーで染色し、 脱染色後、 セロファン紙に張り付けて乾燥させた。
(3 ：タンパク質同定）
電気泳動し、 染色したサンプルを LAS 2000 (Fu j i F i 1 m、 T o kyo) に取り込ませ （図 7) 、 F 1, HN相当のタンパク質バンドの濃度を測 定した。 1種類のサンプルにっき、 3つの異なる量を泳動し、 各々の F 1ZHN 密度を算出し、 サンプル毎に平均と標準偏差を求めた。
(4 ：結果）
(i) 、 （i i) 、 ( i i i) のサンプルで F 1 ZHNは、 ほぼ 1. 7で一致 した。 F l 5 1 kD、 HN 68 k D aの分子量を考慮すれば、 モル比は約 2. 3となる。 F 1、 HNを用いた再構成リボソームでの融合の最適値が、 F 1ZH Nが約 2で与えられるという報告 （Ex p. C e 1 1 Re s. 142、 95〜 1 0 1、 1 985) とも矛盾しない。 他の研究者から報告のある再構成型ではこ の比が野生型ウィルスのものと異なる （J. V i r o l . 67、 3312〜 33 18、 1993) 。 その他のタンパク質組成も HV Jと HV Jエンベロープべク ターではほぼ同じであった。
(実施例 10 ： HV Jエンベロープベクタ一への DNAの封入及び封入率） (1 ： HV Jエンベロープベクター （DNA封入、 未封入） の電子顕微鏡像） 前述のようにして P SFV-L a c Z (14. 5 k b) 130 igを 10, 0 00HAUの HVJ (紫外線不活性化） に封入し HV Jエンベロープベクターを 作成した。
封入後の HV Jエンベロープベクターを 300 1の PBSに懸濁し— 20 "C で保存した。 10日後、 1 H 1の懸濁液をダリッド上にのせ、 陰性染色法にて電 子顕微鏡を用いて観察した。 コントロールとして DNA未封入の HV Jェンベロ ープベクタ一を用いた。
(結果）
結果を、 図 8に示す。 HV Jエンベロープベクターは、 かって観察された HV Jウィルスそのものとほぼ外郭は同型のものが多かった。 DNA未封入のものに 比較し、 DNAを用いたものは HV Jエンベロープベクター内に電子密度の濃い 構造物を認めた。 一方、 未封入のものは内部の透過性は高く、 ウィルスゲノムが 破壊されたか、 喪失されたと推定された。
(2 ： HV Jエンベロープベクターへの DNA封入率）
前述のようにして p c Lu c i (7. 4k b) 157/igを 6, 70 OHAU の HVJ (紫外線不活性化） に封入して、 HV Jエンベロープベクターを作成し た。 HV Jエンベロープベクターを、 300 1の B S Sに懸濁し、 ミクロコッ カルヌクレア一ゼ 15単位、 CaC l 2 2mM、 RNa s eA 20 gZm し 20で、 30分間処理し、 PBS 1リットルに対して透析した （4で、 ォ —パーナイト） 。 1 %SDS、 37°Cで、 1分間処理した。 500 t lのフエノ —ル、 500 1クロ口ホルム—イソアミルアルコールで処理し、 その後、 エタ ノール沈殿した。 100 1の BS Sに懸濁し、 分光光度計で 260 nm, 28
0 nmを測定した。
(結果）
回収率が 85. 7%であったので、 換算すると、 HV Jエンベロープベクター 中への DNAの取り込み効率は、 3. 8%であった。 10， 0001^ 11の1"[¥ Jに、 279 gの P c L u c iを取り込ませた場合の取り込み効率は、 7. 2 %であった。
以上より 10， 000HAUの HV Jへの DNA取り込み効率は、 ォクチルダ ルコシドを用いた場合約 6〜 7 %であろうと推定されるが、 用いる DNA量によ つて多少変化する可能性がある。 また硫酸プロ夕ミンを DNA、 HVJェンベロ ープベクターと共存させると導入効率が上昇することがわかっているが、 これは HV Jエンベロープベクターへの DNA封入効率が上昇したためではないかと考 えられる。 Tr i t on_X100， N P— 40ではさらに効率が上がり 10〜 40%程度と推定される。
(実施例 11 ： HV Jエンベロープベクターによる細胞内への遺伝子導入）
( 1 ：遺伝子導入方法）
1， 000HAU分をエツペンドルフチューブにとり （30 1) 、 硫酸プロ 夕ミン （lmgZml) 5 1を加えた。 BHK— 21細胞 （前日に、 ゥエルあ たり 200, 000個で、 6つのゥエルにまいたもの） の培地を交換し、 1ゥェ ルあたり 0. 5mlの培地 （10%FCS— DMEM) を添加した。 各ゥエルに、 上記のベクター （1, 000HAU相当） と硫酸プロ夕ミンの混合液を加え、 プ レートを前後左右にふってベクターと細胞を良く混ぜ合わせ、 37"Cで、 5%C 02インキュベータ一中に 10分間放置した。
培地交換し、 37"Cで、 5 %C02インキュベータ一中でオーバーナイト （1 6 h r〜24h r) 放置し、 遺伝子発現を調べた。 ルシフェラ一ゼ （p c Lu c
1 ； CMVプロモータ一を有するルシフェラ一ゼ遺伝子） の場合は、 Ce l l Ly s i s Bu f f e r (P r ome g a) 0. 5mlで細胞を溶解し、 その 20 / 1溶液中の活性をルシフェラ一ゼアツセィキット （P r ome g a) を用 いて測定した。 グリーン蛍光タンパク質 （pCMV— GFPE； P r ome g a) の場合は、 そのまま蛍光顕微鏡で観察し、 400倍率で 5〜8視野を観察し、 蛍光を発する細胞の割合を算出した。
(2 ：培養細胞における導入効率に与える条件の検討）
培養細胞は BHK— 21細胞を用いた。
(2. 1 ： HV Jエンベロープベクター作成におけるォクチルグルコシド （O G) 濃度の検討）
(1) の遺伝子導入方法に、 以下の変更を加えて、 HV Jエンベロープベクタ
—による遺伝子導入に対する、 各濃度 （HV Jエンベロープベクタ一の作成時に 用いた〇Gの最終濃度） のォクチルダルコシド （OG) の影響を調べた：
(A) ォクチルダルコシド濃度： 1、 2, 3% ;
H V Jエンベロープベクター作成時に、 不活性化 HV Jを OGによって処 理した時間： 1分間、 5分間、 10分間；
超音波処理を行ったか （s o n i c) 、 または行わなかった。
(B) ォクチルダルコシド濃度： 0. 125- 1. 25% ;
トランスフエクションに用いたベクターの容量： 10 し 100 x l。
(C) ォクチルダルコシド： 0. 55〜0. 8% ;
トランスフエクシヨンの時間： 30分間、 オーバーナイト （OZN) 。 結果を図 9に示す。
(2. 2 ：細胞への遺伝子導入条件、 硫酸プロタミン （PS) の濃度 ·処理時 間）
(1) の遺伝子導入方法に、 以下の変更を加えて、 HV Jエンベロープベクタ 一による遺伝子導入に対する、 硫酸プロ夕ミンの影響を調べた：
(A) 硫酸プロ夕ミン： 0〜： L 00 gZm 1培地； トランスフエクシヨンの時間： 20、 40、 60分間。
(B) 硫酸プロ夕ミン： 0〜40 gZml培地；
トランスフエクシヨンの時間： 5、 10、 20分間。
結果を図 10に示す。
(2. 3 ： HV Jエンベロープベクタ一に封入する DNA濃度の遺伝子発現量 に対する効果）
(1) の遺伝子導入方法に、 以下の変更を加えて、 HV Jエンベロープベクタ 一による遺伝子発現量に対する、 実験に使用した DN A量の影響を調べた：
(A) DNA量： 20〜200 i g ；
HV Jエンベロープベクターを一 20<€またはー80でで 5日間保存した。
(B) DNA量： 180~360 g/HV J 10， 000HAU。
結果を図 1 1に示す。
(2. 4 ：遺伝子導入に用いる HV J力価の、 遺伝子発現量に対する影響） (1) の遺伝子導入方法に、 以下の変更を加えて、 HV Jエンベロープベクタ 一による遺伝子発現量に対する、 遺伝子導入に用いる HV J力価の影響を調べ た：
5, 000、 10, 000、 20， 000HAUの力価の HV Jを用いて HV Jエンベロープベクターを調製し、 その各々の、 250、 500、 1, 000、 2, 000HAUに相当する量を用いて、 BHK— 21細胞にトランスフエクシ ヨンした。
結果を図 12に示す。
(2. 5 ： HV Jエンベロープベクタ一遺伝子導入効率に対する、 HVJ不活 性化条件の影響）
(1) の遺伝子導入方法に、 以下の変更を加えて、 BHK— 21細胞中でのル シフェラーゼ遺伝子発現に対する、 HV Jの不活性化方法 （UVまたは /3—プロ ピオラクトン） の効果を調べた。 (A) UV不活性化のための照射量： 0〜231ミリジュール Zcm2。
(B) HV J処理に用いた 3—プロピオラクトン （BPL) 濃度： 0~0. 02 5 %。
結果を図 13に示す。
(実施例 12 ： HV Jエンベロープベクターの各種細胞への遺伝子導入） ヒト舌部の扁平上皮癌 (SAS) へ、 実施例 1 1に記載の方法により遺伝子導 入を行った。 結果を図 14に示す。 遺伝子導入の際の、 硫酸プロ夕ミン濃度およ びトランスフエクシヨン時のインキュベーション時間を、 図 14に記載のように 変化させ、 遺伝子導入の効率を、 ルシフェラ一ゼ遺伝子の発現によって測定した。 トランスフエクシヨンを行った条件の範囲内では、 200 gZm 1の硫酸プロ 夕ミンを使用し、 60分間のトランスフエクシヨン処理をした場合に遺伝子導入 効率が最大であつたが、 硫酸プロ夕ミン濃度をさらに増加させれば、 遺伝子導入 効率のさらなる増加が予測される。
ヒト大動脈内皮細胞 （HAEC) へ、 実施例 1 1に記載の方法により遺伝子導 入を行った。 結果を図 15に示す。 遺伝子導入の際の、 硫酸プロ夕ミン濃度およ びトランスフエクシヨン時のインキュベーション時間を、 図 15に記載のように 変化させ、 遺伝子導入の効率を、 ルシフェラーゼ遺伝子の発現によって測定した。 トランスフエクションを行った条件の範囲内では、 100 g/m 1の硫酸プロ 夕ミンを使用し、 60分間のトランスフエクシヨン処理をした場合に遺伝子導入 効率が最大であつたが、 硫酸プロ夕ミン濃度をさらに増加させれば、 遺伝子導入 効率のさらなる増加が予測される。
(実施例 13 ： HV Jエンベロープベクターの各種生体組織内への遺伝子導 入）
本実施例では、 実施例 1 1に記載の HV Jエンベロープベクターを用いる、 種々の生体内組織への遺伝子導入を例示する。
(13. 1 ：マウス肝臓） HV Jエンベロープベクターを、 0. 8 %のォクチルグルコシドおよび 200 igの p cLuc iを氷上に 1分間放置し、 そして 300 / 1の PB Sに懸濁す ることによって調製した。 調製懸濁液の 1 10量 （1, 000HAUに相当） 30 1を、 70 1の PBSで希釈し （全量 100 1 ) 、 マウス （C 57 B LZ6) 肝臓の葉 （1 obe) の 1つに注入した。
HV J -AVE (Ar t i f i c i a l V i r a l Enve l op) リポ ソームを、 200 gの p c Lu c iを用いて、 ボルテックス 排出 （V o r t e x i n g/e x t r u s i o n) 、 その後のスクロース勾配遠心分離 （62, 000 g、 90分間） によって調製した。 次に、 この調製物を、 遠心分離 （27, 000 g、 30分間） によってぺッレトとし、 そして 500 1の PBS中に懸 濁した。 このサンプルの 100/x 1をマウス （C57BLZ6) 肝臓の葉 （1 o b e) の 1つに注入した。
24時間後、 注入された肝臓葉を単離して、 その葉のルシフェラ一ゼ活性を P r ome g a社の L u c i f e r a s e As s ay Sy s t emを用いてァ ッセィした。 結果を図 16Aに示す。 この結果から、 明らかなように、 本発明の HV Jエンベロープベクタ一は、 従来の HV J— AVEリボソームと比べて約 2 倍の顕著に高い遺伝子導入効率を示した。
(13. 2 ：マウス子宮）
13. 1と同様に HV Jエンベロープベクタ一を調製した。 50 1と 100 1のサンプルを、 PBSで希釈して 500 1とし、 マウスのファロ一ピウス 管に注入し、 子宮頸を 10分間結絷した。 24時間後、 マウス子宮を単離して、 葉および子宮のルシフェラーゼ活性を、 P r ome g a社の Lu c i f e r a s e As s ay S y s t e mを用いてアツセィした。 結果を図 16 Bに示す。 本発明の HV Jエンベロープベクターによって、 マウス子宮への遺伝子導入が可 能であつたが、 HV J— AVEリボソームを用いた方法では、 検出可能な程度の 子宮組織への遺伝子導入が見出されなかった。 p c Lu c iを含有する HV Jエンベロープベクタ一を 13. 1と同様に調製 した。 LacZ発現のために、 pEB— CMV— LacZ ( 13 k b) を含有す る HV Jエンベロープベクタ一を、 200 μ gのプラスミドを使用して調製した。 これら各べクタ一を含有する HV Jエンベロープベクターを上記のように子宮に 注入した。 結果を、 図 16 Cに示す。 LacZ染色によって、 主に子宮内膜の腺 上皮での L a c Z遺伝子の発現が検出された。
(13. 3：ラッ卜脳）
上記に記載の p c Lu c iを含有する HV Jエンベロープベクタ一を調製した のと同様の方法によって、 pEGFP— 1 (クラゲのグリーン蛍光タンパク質遺 伝子 （約 0. 7kb) を、 サイトメガロウィルスプロモーターを有する発現べク ターに組み込んだベクター； C 1 o n t e c h社、 Pa l o Al t o, CAよ り入手可能） を含有する HV Jエンベロープベクターを調製した。 30 1のべ クタ一 （調製物の 1Z10であり、 1, 000HAUに相当） を SDラット （S p r ague— Dawl eyラッ卜） に、 頸動脈注入、 または大槽より應空内注 入した。 遺伝子導入の 3〜4日後、 ラットを屠殺し、 脳切片を固定化することな く調製し、 そして蛍光顕微鏡下で蛍光を観察した。 図 16Dに示される結果のよ うに、 類動脈注入及び大槽より髄腔内注入のいずれの場合も、 脳内におけるダリ —ン蛍光タンパク質 （GFP) の発現が認められた。 これに対して、 HVJ—A VEリボソームを用いて、 同様の遺伝子導入をラット頸動脈より行った場合、 脳 内での GFP発現は、 認められなかった。
(13. 4：ゥサギ眼）
p CDNA3 (I n V i t r o g e n社、 S a nD i e g o, CA) の H i nd I I I/Xba I部位にヒ,ト HGF (肝細胞増殖因子） 遺伝子の変異体であ る NK4 c DNA (1. 4 k b) をクロ一ニングして構築された p CM V— N K4を、 大阪大学医学系研究科の中村敏ー教授らより分与していただいた。
40 または 800 gいずれかの pCMV— ΝΚ4を用いて、 10, 0 0 OHAUの不活性化 HV Jを用いた以外は、 上記に記載の p c Luc iを含有 する HV Jエンベロープベクターを調製したのと同様の方法によって、 HV Jェ ンべロープベクターを調製した。 pCMV— NK4は、 HGF機能を阻害する変 異型 HGFを発現するべクタ一である。 50 1のべクタ一 （調製物の 1Z6) を、 新血管形成を誘導するために組換え VEGFのペレットで処理した、 ゥサギ の角膜組織中に注入した。 処置の 7日後、 ゥサギを、 屠殺し、 目の中の新血管形 成を観察した。 結果を図 16Eに示す。 pCMV— NK4が容量依存的に VEG Fによって誘導された血管新生を抑制した。
(13. 5 ：ラット肺動脈）
上記に記載の p c Luc iを含有する HV Jエンベロープベクターを調製した のと同様の方法によって、 SV40プロモーターの制御下の L a c Z遺伝子を有 する pSV— La c Z (P r ome g a社、 Mad i s on、 WI) を含有する HV Jエンベロープベクターを調製した。 50 1のベクター.（調製物の 1 / 6) をラットの気管に注入した。 遺伝子導入の 3日後、 ラットを屠殺し、 組織を 1 %のダルタルアルデヒドを用いて固定化し、 動脈中の L a c Zの発現を、 X— ga 1を用いて可視化した。 結果を図 16Fに示す。 気管支上皮に Lac Z染色 を認めた。 また、 肺動脈から HV Jエンベロープベクタ一を導入したときも気管 支上皮に遺伝子発現を認めた （データを示さず） 。
(実施例 14 ：ウィルスエンベロープベクターのドラッグデリバリーシステム (DDS) としての機能）
本発明の遺伝子導入ベクターは、 オリゴヌクレオチドまたはデコイ核酸治療の ためのドラッグデリバリ一システムとしても有用である。
(14. 1 ：蛍光オリゴヌクレオチドの導入）
本発明のウィルスエンベロープベクターを使用して、 細胞への蛍光標識オリゴ ヌクレオチドの導入を行った。
F I TCで 5， をラベルした 20マーのオリゴヌクレオチド （5' -CCTT gAAGGGATTTCCCTCC - 3 ' ) 194 g/92 1 BSSを 1 0, 000HAUの HVJ (紫外線 1 98ミリジュール Z cm2で不活性化） の 沈殿と混合し、 Tr i t o nX— 100 (0. 24%、 最終濃度） を添加し、 氷 上で 1分間処理し、 1m lの BSSを加えて、 遠心 （1 5, 000 r pm、 1 5 分、 4で） した。 沈殿に 100 1の PBSを加えて、 一 20で保存した。 1ケ 月後、 融解し、 1 O 1分を の硫酸プロ夕ミンと混合し、 500万個の B HK— 21細胞 （0. 5ml倍地中） とインキュベート （1 0分、 60分） した。 導入翌日に蛍光顕微鏡で細胞の蛍光を観察したところ、 図 17 Bに示すように、 1 0分では 10%程度のオリゴヌクレオチド導入効率であつたが、 図 1 7Aに示 すように、 60分では 80%以上の細胞にオリゴヌクレオチドが導入されていた。
(14. 2 ： S t a t 6デコイ核酸による接触性皮膚炎の治療）
本発明のウィルスエンベロープベクターを使用して、 細胞へのデコイ核酸の導 入を行った。
S t a t 6の DN A結合配列をもつ二重鎖核酸 （5' — GATCAAGACC TTTTCCCAAGAATCTAT- 3' および 3' -CATGTTCTGG AAAAGGGTTCTTAGATA - 5 ' 、 (Wang, LHら、 ： B l o o d 95、 1249〜1257、 2000) ) 250 / g/300 i 1 BS Sを 30， 000 HAUの HV J (紫外線 99ミリジュール Z c m2で不活性 化） の沈殿と混合し、 Tr i t o nX- 100 (最終濃度 0. 24%) を添加 し、 氷上で 1分間処理し、 1 m 1の BS Sを加えて、 遠心 （1 5, 000 r pm、 1 5分間、 4で） した。 沈殿に 300 1の PBSを加えて— 20°C保存した。 この HV Jエンベロープベクタ一を、 マウスの皮下注入に用いたところ、 I gE 誘発のアレルギーと遅延型皮膚反応を抑制した。
(実施例 15 ：浮遊系細胞への遺伝子導入）
ヒト白血病細胞様である CCRF— CEM、 NALM— 6、 K— 562を対象 として遺伝子導入実験を行った。 p CMV-Lu c i f e r a s e 200 ig (92ju l) を 10, 000H AUの不活性化 HVJ (紫外線 99ミリジュール/ cm2) の沈殿と混合し、 T r i t onX— 100 (0. 24%、 最終濃度） を加え、 氷上で 1分間処理し、 lmlの BSSを加えて、 遠心 （15， 000 r pm、 15分、 4 ） した。 沈 殿に 300 t 1の PBSを加えて HV Jエンベロープベクターを調製した。 べク ター 60 1 (2, 000HAU相当） 、 硫酸プロ夕ミン、 および 400万個の 浮遊系細胞を、 1. 5mlのエツペンドルフチューブ中で混合し、 10, 000 〜15, 000 r pm、 10分、 20 の遠心を行った。 その後、 沈殿に培養液 を加え、 培養皿に移し、 1日後に細胞のルシフェラーゼ活性を測定した。
使用した細胞株は、 HV J—リボソームや既存のリボソーム試薬 （G i be
BRLの L i po f e c t i n、 L i p o f e c t ami neなど） を用いた場 合には導入効率が極めて低い細胞株 （特に CCRF— CEM、 NALM-6) で あるが、 図 18に示すように、 これら細胞株に対する高効率の遺伝子導入が観察 された。
好ましい遺伝子導入の条件は、 硫酸プロ夕ミン 600〜1， O O O zgZml を添加し、 遠心は 10， O O O r pmまたは 15, 000 r pmで、 10分間、 20ででの遠心をする条件であった。 HV Jエンベロープベクタ一による有意な 細胞毒性は認められなかった。 また、 遠心と硫酸プロ夕ミンの添加の両方が、 遺 伝子導入に必要であった。
(実施例 16 ：癌組織への遺伝子導入）
pCMV-Luc i f e r a s e 354 ig ( 92 1 ) を 34, 000 HA Uの不活性化 HVJ (紫外線 99ミリジュール Zcm2) の沈殿と混合し、 T r i t onX— 100 (0. 24%、 最終濃度） を添加して、 氷上で 1分間処理し、 lm 1の BS Sを加えて、 遠心 （10, 000〜 15， 000 r Dm, 10分間、 20°C) した。 沈殿に 300 1の PBSを加えて、 — 20 で保存した。 1日 後、 硫酸プロ夕ミン 500 a g/m 1、 または 1000 gZm 1と混合し、 そ の 100 1をマウスメラノーマ B 16— F 1の腫瘍塊 （径 7〜8mm) に注入 し、 1日後にルシフェラーゼ活性を測定した。 図 19に示すように、 腫瘍塊での 遺伝子発現がみられた。 好ましい硫酸プロ夕ミン濃度は、 500 g/m 1であ つた。 しかし、 これより低い硫酸プロ夕ミン濃度では、 遺伝子発現を検出できな かった。
(実施例 17 ：ヘルぺスウィルスエンベロープベクターの調製）
(17. 1 ：不活性化ウィルスの調製）
1型単純疱疹ウィルス （HSV— 1) (101Qプラーク形成単位 Zml) を 大阪大学医学系研究科細菌学講座の山西教授より供与された。 このウィルスの不 活性化条件を培養サル細胞 （Ve r o細胞） におけるウィルスのプラーク形成に より検討した。 ）3—プロピオラクトン （BPL) 0. 05%を用いたウィルスの 不活性化では、 Ve r 0細胞でのプラークの出現頻度が、 9. 1 X 1 0—4 (プ ラ一ク ZVe r o細胞） であった。 一方、 紫外線 200および 400ミリジュー ル Zcm2照射でのウィルスの不活性化は、 それぞれ 4. 3 X 10—4、 2. 2 X 10_6 (プラーク ZVe r o細胞） であった。
(17. 2 ：不活性化ウィルスを用いる遺伝子導入）
100 1の HSV— 1 (109粒子） を 620 1の PBSで希釈後、 紫外 線 400ミリジュール Zcm2照射 ύ その 10 %量 （72 1) と DNA (ρ CMV-Lu c i f e r a s e 8. 83 gZ 1 ) と混合し、 氷上で 3 % T r i t o n_X 100を 8 1加え （最終濃度、 0. 24%) 、 その 1、 2、 3、 4、 5、 6分後に lmlの PBSを添加して希釈した。 各サンプルの 100 1をそのまま BHK— 21細胞 （6ゥエルプレート中） に導入した。 細胞は 1 0%のゥシ胎児血清 （FCS) 含有ダルベッコ最少必須培地 （DME) 0. 5m 1 ウエルで培養した。 また、 別の実験において、 各サンプルの 100/ 1を硫 酸プロ夕ミン 5 t gと混合後、 BHK— 21に導入した。 37 、 5 % COz のインキュベータ一中で 60分問放置後、 培養液を 10%?じ3—01^[£と交換 した。 22時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。 図 20に示すように、 本発 明の方法を用いて調製されたへルぺスウィルスエンベロープベクターによる高効 率の遺伝子導入が確認された。 各サンプルとも形態学的な観察による細胞毒性は 認められなかった。
次に、 T r i t o n— X 100で 5分間処理したヘルぺスウィルスェンベロー プベクターを— 80でで 2日間保存後、 解凍し、 再度 BHK— 21細胞に添加し て導入効率を測定した。 今回は導入 60分後に 10%FCS—DME 2. 5m 1ノウエルを加えて一晩培養して活性を測定した。 血清の影響、 ベクタ一量につ いて検討した。
図 21に示すように、 一 80でで 2日間保存後であっても、 なお高効率の遺伝 子導入が確認された。 血清 10%を加えた培地を用いたものが、 無血清培地より も導入効率が高く、 ベクター溶液 200 t 1 (推定量： 2. 8X 107ウィルス 粒子 ウエル） が 100 1溶液 （推定量： 1. 4X 107ウィルス粒子 Zゥェ ル） より遺伝子導入活性が高かった。
(17. 3 ：不活性化ウィルスを用いる遺伝子導入）
上記の開示より、 この界面活性剤を用いてエンベロープベクターを作成する技 術は HVJのみでなく、 広く脂質膜を有するエンベロープウィルスに適用可能で あることが当業者に明らかである。 従って、 当業者が本発明の開示に従って、 他 のエンベロープウィルスを用いて、 容易に遺伝子導入のためのエンベロープべク ターを調製し得ることが明らかである。 従って、 レトロウイルス科、 トガウィル ス科、 コロナウィルス科、 フラビウィルス科、 パラミクソウィルス科、 オルトミ クソウィルス科、 ブニヤウィルス科、 ラブドウィルス科、 ボックスウィルス科、 ヘルぺスウィルス科、 バキュロウィルス科、 へパドナウィルス科などのウィルス のエンベロープベクタ一が作成可能である。 これによりウィルスの有する組織指 向性を利用した特定の臓器への標的導入が実現可能と考えられる。 たとえば単純 疱疹ウィルスのエンベロープベクタ一は神経指向性のベクターとして、 ェプス夕 ィンーバーウィルスのエンベロープベクターは Bリンパ球指向性のベクターとし て、 インフルエンザのエンベロープベクタ一は呼吸器指向性ベクターとして応用 し得る。
上記から、 本発明の特定の実施態様が例示の目的について本明細書に記載され るが、 種々の改変が、 本発明の意図および範囲から逸脱せずに行われ得ることは、 明らかである。 具体的には、 本明細書の実施例は、 不活性化 H V Jを用いた遺伝 子導入べクタ一について記載されてきたが、 同様の調製方法を用いて、 H V J以 外のウィルスを不活性化して本発明の遺伝子導入ベクターを調製すること、 およ び不活性化工程を行わずに本発明の遺伝子導入ベクターを調製することは、 本明 細書の開示から当業者に明らかである。 したがって、 本発明は、 添付の請求の範 囲以外によっては限定されない。 産業上の利用可能性
操作が簡便で、 しかも遺伝子導入効率の優れた新しい遺伝子導入方法が提供さ れる。 これにより、 遺伝子ライブラリ一の迅速なスクリーニングが可能になると 考えられる。 本発明のウィルスエンベロープベクターを含む、 高スループットス クリーニングのためのキットもまた提供される。 また、 本出願によって提供され るウィルスエンベロープベクターは長期間の凍結保存が可能であり、 要事調製の 必要がないため、 作業工程が大幅に簡略化できるとともに、 導入ベクターの大量 調製による均質な遺伝子導入が可能となる。 さらに、 本発明の遺伝子導入べクタ —は、 従来の H V Jを基に調製されたべクタ一よりも、 高効率の遺伝子導入を可 能にし、 かつ従来の方法よりもより広範囲の生体内組織に対する遺伝子導入を可 能とする。
本発明の遺伝子導入ベクターを含む、 医薬品投与のためのドラッグデリバリ一 システム、 薬物のスクリーニング系、 および遺伝子治療用ベクターも提供される。

Claims

請求の範囲
1. ウィルスエンベロープを含む、 遺伝子導入ベクター。
2. 前記ウィルスが、 野生型ウィルスまたは組換え型ウィルス由来である、 請 求項 1に記載の遺伝子導入ベクター。
3. 前記ウィルスが、 レトロウイルス科、 トガウィルス科、 コロナウィルス科、 フラビウィルス科、 パラミクソウィルス科、 オルトミクソウィルス科、 ブニヤゥ ィルス科、 ラブドウィルス科、 ボックスウィルス科、 ヘルぺスウィルス科、 バキ ュロウィルス科、 およびへパドナウィルス科からなる群から選択される科に属す るウィルス由来である、 請求項 1または 2に記載の遺伝子導入べクタ一。
4. 前記ウィルスが HV Jである、 請求項 3に記載の遺伝子導入ベクター。
5. 請求項 1〜4のいずれか 1項に記載のベクタ一であって、 ；
該ウィルスを外来遺伝子と混合する工程、 および
該混合液を 2回以上凍結融解する工程、
を包含する方法によって調製される、 遺伝子導入ベクター。
6. 請求項 1〜4のいずれか 1項に記載のベクターであって、 該ウィルスを界 面活性剤の存在下で外来遺伝子と混合する工程を包含する方法によって調製され る、 遺伝子導入べクタ一。
7. 前記方法が、 ウィルスを不活性化する工程をさらに包含する、 請求項 5ま たは 6に記載の遺伝子導入ベクター。
8. 前記界面活性剤が、 ォクチルダルコシド、 Tr i t on— X100、 CH
APSおよび NP— 40からなる群から選択される、 請求項 7に記載の遺伝子導 入ベクター。
9. 前記界面活性剤が、 ォクチルダルコシドである、 請求項 8に記載の遺伝子 導人べクタ一。
10. 硫酸プロ夕ミンを前記外来遺伝子に添加する工程をさらに包含する、 請 求項 1〜 9のいずれか 1項に記載の遺伝子導入べクタ一。
1 1. 動物生体内の組織に遺伝子導入するための、 請求項 1〜 10のいずれか 1項に記載の遺伝子導入べクタ一。
12. 前記組織が、 肝臓、 骨格筋、 子宮、 脳、 眼部、 類動脈、 皮膚、 血管、 肺、 心臓、 腎臓、 脾臓、 癌組織、 神経、 Bリンパ球、 および呼吸器官の組織からなる 群から選択される、 請求項 11に記載の遺伝子導入ベクター。
13. 遺伝子治療のための、 請求項 1〜12に記載の遺伝子導入ベクターを含 有する薬学的組成物。
14. 請求項 1〜12に記載の遺伝子導入べクタ一を含有する、 遺伝子ライブ ラリーのスクリーニングのためのキッ卜。
1 5. 遺伝子導入のためのウィルスエンベロープを含む遺伝子導入ベクターの 調製方法であって、 以下；
該ウィルスを外来遺伝子と混合する工程、 および
該混合液を 2回以上凍結融解する工程、
を包含する、 方法。
16. 遺伝子導入のためのウィルスエンベロープを含む遺伝子導入ベクターの 調製方法であって、 該ウィルスを界面活性剤の存在下で外来遺伝子と混合するェ 程、 を包含する、 方法。
17. ウィルスを不活性化する工程をさらに包含する、 請求項 15または 16 に記載の方法。
18. 単離された動物組織に遺伝子を導入する方法であって、 以下；
所望の外来遺伝子を含有する請求項 1〜 12のいずれか 1項に記載の遺伝子導 入べクタ一を調製する工程、
該遺伝子導入ベクターによって、 該単離された動物組織に遺伝子を導入するェ 程、
を包含する、 方法。
19. 浮遊細胞に外来遺伝子を導入する方法であって、 以下： 該浮遊細胞と請求項 1〜1 2のいずれか 1項に記載の遺伝子導入ベクターとを， 硫酸プロ夕ミン存在下で混合する工程、
該混合液を遠心する工程
を包含する、 方法。
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Cited By (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002000264A1 (fr) * 2000-06-27 2002-01-03 Dnavec Research Inc. Vecteur de virus pour transfert de gene dans des cellules renales
WO2003029475A1 (en) * 2001-09-28 2003-04-10 Dnavec Research Inc. MAMMALIAN CELL-INFECTING VIRUS VECTOR ENCODING EPITOPE-BOUND β2m AND UTILIZATION THEREOF
WO2004031380A1 (ja) * 2002-10-01 2004-04-15 Dnavec Research Inc. TAP活性の阻害により MHC class I による外来エピトープの提示を増強する方法
WO2004035779A1 (ja) * 2002-08-27 2004-04-29 Anges Mg, Inc. ウイルスエンベロープを用いた生体分子の導入方法ならびにそのための組成物およびシステム
WO2004039406A1 (ja) * 2002-11-01 2004-05-13 Genomidea Inc. 化学療法剤を封入した医薬製剤
WO2004046353A1 (ja) * 2002-11-21 2004-06-03 Genomidea Inc. 所望の機能的性質を有する核酸の単離方法およびそのためのキット
JPWO2003103721A1 (ja) * 2002-06-06 2005-10-06 アンジェスＭｇ株式会社 脳血管障害遺伝子治療剤
WO2005120579A1 (ja) * 2004-06-14 2005-12-22 Ishihara Sangyo Kaisha, Ltd. 膜融合活性のある不活性化ウイルスエンベロープの凍結乾燥組成物
WO2010032764A1 (ja) 2008-09-16 2010-03-25 ジェノミディア株式会社 前立腺癌の治療・予防剤
US8067388B2 (en) 2002-02-01 2011-11-29 Anges Mg, Inc. Decoy-containing pharmaceutical compositions and method of using the same
WO2018084185A1 (ja) 2016-11-01 2018-05-11 国立大学法人大阪大学 Ｈｖｊ－ｅおよび免疫チェックポイントタンパク質の阻害物質を含む抗がん剤
WO2018105630A1 (ja) 2016-12-06 2018-06-14 国立大学法人大阪大学 新規プリオノイド病用治療薬
WO2022059703A1 (ja) 2020-09-16 2022-03-24 国立大学法人大阪大学 がん治療用医薬、免疫賦活剤および抗がん物質のスクリーニング方法

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU769385C (en) * 2000-02-02 2004-07-29 Genomldea Inc. Virus envelope vector for gene transfer
US9012417B2 (en) * 2001-02-20 2015-04-21 Anges Mg, Inc. Topical administration of NF-kappaB decoy to treat atopic dermatitis
WO2003014338A1 (fr) * 2001-08-02 2003-02-20 Anges Mg, Inc. Procede de production d'enveloppes virales inactivees
JP2004289816A (ja) * 2003-03-06 2004-10-14 Matsushita Electric Ind Co Ltd 遠隔制御装置、遠隔制御方法および被遠隔制御装置
US7871765B2 (en) 2004-03-31 2011-01-18 Genomidea Inc. Composition having antitumor effect
RU2408387C2 (ru) 2004-04-27 2011-01-10 Веллстат Байолоджикс Корпорейшн Лечение злокачественного новообразования с применением вирусов и камптотецинов
JP5190958B2 (ja) * 2005-07-14 2013-04-24 ウェルスタット バイオロジクス コーポレイション ウイルス、フルオロピリミジンおよびカンプトテシンを使用した癌の処置
WO2007089780A2 (en) * 2006-01-30 2007-08-09 Licentia, Ltd. Bmx/etk tyrosine kinase gene therapy materials and methods
US20090053790A1 (en) 2006-01-31 2009-02-26 Ishihara Sangyo Kaisha, Ltd. Polypeptide Having Affinity for Envelope Virus Constituent and Use Thereof in Transferring Substance Into Cell
JP2008308440A (ja) * 2007-06-14 2008-12-25 Genomidea Inc 癌治療用薬剤送達ビヒクルおよびその製造方法ならびにそれを用いた製剤
EP2351574B1 (en) 2008-10-10 2016-08-24 Kringle Pharma, Inc. Promoter for regeneration of tendon-bone junction tissue or ligament-bone junction tissue
WO2011046983A2 (en) 2009-10-12 2011-04-21 Smith Holdings, Llc Methods and compositions for modulating gene expression using oligonucleotide based drugs administered in vivo or in vitro
JP4653242B1 (ja) 2010-02-12 2011-03-16 ナノキャリア株式会社 粒子状医薬組成物
CA2797059A1 (en) * 2010-05-03 2011-11-10 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Novel method
CN103941924B (zh) * 2014-04-25 2016-09-14 锐达互动科技股份有限公司 一种实现红外光编解码的互动投影方法
CN109963506B (zh) * 2016-11-22 2024-05-07 西达-赛奈医疗中心 一种新型的转染和药物递送装置

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995016784A1 (fr) * 1993-12-13 1995-06-22 Transgene S.A. Vecteurs exprimant un interferon humain pour le traitement du sida
JPH09234069A (ja) * 1996-03-01 1997-09-09 Deinabetsuku Kenkyusho:Kk 遺伝子導入用組成物及び該組成物を用いた遺伝子導入方法

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2961658D1 (en) * 1978-05-17 1982-02-18 Thomae Gmbh Dr K Process for preparing human interferon
CA1282721C (en) * 1984-06-04 1991-04-09 Bernard Roizman Herpes simplex virus as a vector
ATE132034T1 (de) 1990-10-19 1996-01-15 Univ Florida Künstliche virushüllen
US5879685A (en) * 1991-05-08 1999-03-09 Schweiz, Serum- & Impfinstitut Bern Immunostimulating and immunopotentiating reconstituted influenza virosomes and vaccines containing them
US6268213B1 (en) * 1992-06-03 2001-07-31 Richard Jude Samulski Adeno-associated virus vector and cis-acting regulatory and promoter elements capable of expressing at least one gene and method of using same for gene therapy
US5244635A (en) * 1992-06-19 1993-09-14 Cirrus Diagnostics, Inc. Centrifuge vessel with coaxial waste chamber having cap to prevent waste fluid transfer from the chamber into the vessel
WO1995002698A1 (en) * 1993-07-12 1995-01-26 Life Technologies, Inc. Composition and methods for transfecting eukaryotic cells
US5843459A (en) * 1996-01-19 1998-12-01 Human Gene Therapy Research Institute Differential inactivation of nucleic acids by chemical modification
US6451592B1 (en) * 1996-04-05 2002-09-17 Chiron Corporation Recombinant alphavirus-based vectors with reduced inhibition of cellular macromolecular synthesis
US5683866A (en) * 1996-05-09 1997-11-04 Sarkar; Debi P. Process for producing a targeted gene
US6183752B1 (en) * 1997-02-05 2001-02-06 Pasteur Merieux Serums Et Vaccins Restenosis/atherosclerosis diagnosis, prophylaxis and therapy
US6051428A (en) * 1997-03-21 2000-04-18 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Rapid production of autologous tumor vaccines
US5849561A (en) * 1997-05-22 1998-12-15 Cornell Research Foundation, Inc. Method for the production of non-group C adenoviral vectors
US6472375B1 (en) * 1998-04-16 2002-10-29 John Wayne Cancer Institute DNA vaccine and methods for its use
US6432925B1 (en) * 1998-04-16 2002-08-13 John Wayne Cancer Institute RNA cancer vaccine and methods for its use
EP1137771A2 (en) * 1998-11-10 2001-10-04 The Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for preventing cardiac hypertrophy and heart failure by inhibition of mef2 transcription factor
AU769385C (en) * 2000-02-02 2004-07-29 Genomldea Inc. Virus envelope vector for gene transfer
US6509162B1 (en) * 2000-02-29 2003-01-21 Yale University Methods for selectively modulating survivin apoptosis pathways

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995016784A1 (fr) * 1993-12-13 1995-06-22 Transgene S.A. Vecteurs exprimant un interferon humain pour le traitement du sida
JPH09234069A (ja) * 1996-03-01 1997-09-09 Deinabetsuku Kenkyusho:Kk 遺伝子導入用組成物及び該組成物を用いた遺伝子導入方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KANEDA Y.: "Fusigenic sendai-virus liposomes:a novel hybrid type liposome for gene therapy", BIOGENIC AMINES, vol. 14, no. 5, 1998, pages 553 - 572, XP002942037 *
KOMAL RAMANI ET AL.: "Novel gene delivery to liver cells using engineered virosomes", FEBS LETTERS, vol. 404, 1997, pages 164 - 168, XP002942035 *
KOMAL RAMANI ET AL.: "Site-specific gene delivery in vivo through engineered sendai viral envelopes", PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 95, 1998, pages 11886 - 11890, XP002942034 *
SAKAI Y. ET AL.: "Accommodation of foreign genes into the sendai virus genome: sizes of inserted genes and viral replication", FEBS LETTERS, vol. 456, 1999, pages 221 - 226, XP002942036 *
See also references of EP1170363A4 *

Cited By (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002000264A1 (fr) * 2000-06-27 2002-01-03 Dnavec Research Inc. Vecteur de virus pour transfert de gene dans des cellules renales
WO2003029475A1 (en) * 2001-09-28 2003-04-10 Dnavec Research Inc. MAMMALIAN CELL-INFECTING VIRUS VECTOR ENCODING EPITOPE-BOUND β2m AND UTILIZATION THEREOF
US8067388B2 (en) 2002-02-01 2011-11-29 Anges Mg, Inc. Decoy-containing pharmaceutical compositions and method of using the same
JPWO2003103721A1 (ja) * 2002-06-06 2005-10-06 アンジェスＭｇ株式会社 脳血管障害遺伝子治療剤
JPWO2004035779A1 (ja) * 2002-08-27 2006-02-16 アンジェスＭｇ株式会社 ウイルスエンベロープを用いた生体分子の導入方法ならびにそのための組成物およびシステム
WO2004035779A1 (ja) * 2002-08-27 2004-04-29 Anges Mg, Inc. ウイルスエンベロープを用いた生体分子の導入方法ならびにそのための組成物およびシステム
US7504098B2 (en) 2002-08-27 2009-03-17 Anges Mg, Inc. Method for introducing a biological molecule using a viral envelope and heparin and system therefore
WO2004031380A1 (ja) * 2002-10-01 2004-04-15 Dnavec Research Inc. TAP活性の阻害により MHC class I による外来エピトープの提示を増強する方法
WO2004039406A1 (ja) * 2002-11-01 2004-05-13 Genomidea Inc. 化学療法剤を封入した医薬製剤
US7427395B2 (en) 2002-11-01 2008-09-23 Genomidea Inc. Chemotherapeutic agent-incorporated pharmaceutical preparation
WO2004046353A1 (ja) * 2002-11-21 2004-06-03 Genomidea Inc. 所望の機能的性質を有する核酸の単離方法およびそのためのキット
WO2005120579A1 (ja) * 2004-06-14 2005-12-22 Ishihara Sangyo Kaisha, Ltd. 膜融合活性のある不活性化ウイルスエンベロープの凍結乾燥組成物
US8043610B2 (en) 2004-06-14 2011-10-25 Ishihara Sangyo Kaisha, Ltd. Freeze-dried composition of inactivated virus envelope with membrane fusion activity
WO2010032764A1 (ja) 2008-09-16 2010-03-25 ジェノミディア株式会社 前立腺癌の治療・予防剤
WO2018084185A1 (ja) 2016-11-01 2018-05-11 国立大学法人大阪大学 Ｈｖｊ－ｅおよび免疫チェックポイントタンパク質の阻害物質を含む抗がん剤
US11166995B2 (en) 2016-11-01 2021-11-09 Osaka University Anticancer agent comprising HVJ-E and immune checkpoint protein inhibitor
WO2018105630A1 (ja) 2016-12-06 2018-06-14 国立大学法人大阪大学 新規プリオノイド病用治療薬
KR20190082842A (ko) 2016-12-06 2019-07-10 고꾸리쯔 다이가꾸 호우징 오사까 다이가꾸 신규 프리오노이드병용 치료약
WO2022059703A1 (ja) 2020-09-16 2022-03-24 国立大学法人大阪大学 がん治療用医薬、免疫賦活剤および抗がん物質のスクリーニング方法

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CN1365388A (zh) 2002-08-21
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US20040219674A1 (en) 2004-11-04
CA2369491C (en) 2008-09-02
US20030013195A1 (en) 2003-01-16
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DE60131498D1 (de) 2008-01-03

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