DE60131498T2 - VIRUSHÜLLNVEKTOR FüR DIE GENÜBERTRAGUNG - Google Patents

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Description

  • Technisches Gebiet
  • Die vorliegende Erfindung betrifft einen sicheren und hocheffizienten Vektor für die In vitro- und In vivo-Genübertragung. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung einen Gentransfervektor, der hergestellt wird, indem man ein Virus oder ein inaktiviertes Virus verwendet, insbesondere inaktiviertes HVJ (Sendai-Virus). Darüber hinaus kann der Gentransfervektor, der in der vorliegenden Spezifikation beschrieben wird, auch für die Gentherapie und das Hochdurchsatz-Screening verwendet werden.
  • Technischer Hintergrund
  • Es ist eine Anzahl viraler und nicht-viraler (synthetischer) Verfahren für die Genübertragung entwickelt worden, die für die Gentherapie gedacht sind (Mulligan, Science, 260, 926 bis 932 (1993) und Ledley, Human Gene Therapy, Band 6, 1129 bis 1144 (1995)). Im allgemeinen sind virale Verfahren für die Genübertragung in Zellen effektiver als nicht-virale Verfahren. Jedoch kann ein viraler Vektor aufgrund der gleichzeitigen Einführung essentieller Genelemente des Elternvirus, einer durchlässigen Expression viraler Gene, Immunogenität und Modifikation der Wirtsgenomstruktur Sicherheitsbedenken verursachen. Im allgemeinen besitzt ein nicht-viraler Vektor weniger Zytotoxizität und weniger Immunogenität. Jedoch besitzt eine Mehrzahl nicht-viraler Verfahren eine geringere Effizienz der Genübertragung, insbesondere in vivo, als einige virale Vektoren.
  • Somit besitzen sowohl Virusvektoren als auch nicht-virale Vektoren sowohl Einschränkungen als auch Vorteile. Daher muss ein hocheffizienter und geringe Toxizität aufweisender Gentransfervektor für die In vivo-Verwendung entwickelt werden, um im Hinblick auf die Einschränkungen eines Typs von Vektorsystem zu kompensieren, und zwar mit den Vorteilen eines anderen Typs von System.
  • Auf der anderen Seite besitzt HVJ eine hohe Immunogenität und induziert bekanntermaßen CTL, insbesondere, wenn NP-Protein in einer großen Menge produziert wird (Cole, G. A. et al., J. Immunology 158, 4301 bis 4309 (1997)). Es wird außerdem befürchtet, dass die Proteinsynthese durch den Wirt inhibiert werden könnte.
  • HVJ besitzt außerdem das Problem, dass Partikel, die durch ein Verfahren erzeugt werden, bei dem ein Fusionsprotein gereinigt wird, indem man das Virus-Fusionsprotein der Zentrifugation oder Säulenmanipulation unterwirft, um auf einer Lipidmembran wiederhergestellt zu werden, die anderen Proteine des Virus (hauptsächlich M-Protein) aufgrund der Wiederherstellung verlieren könnten, sodass das Verhältnis zwischen F1, das für die Fusionsaktivität benötigt wird, und dem HN-Protein nicht auf dem gleichen Niveau wie bei dem Wildtypvirus aufrecht erhalten werden kann, was in einer niedrigeren Fusionsaktivität resultiert. Darüber hinaus, da die Orientierung, mit der das Fusionsprotein zum Zeitpunkt der Wiederherstellung in die Lipidmembran inseriert wird, nicht notwendigerweise die gleiche sein muss wie beim wildtypischen Virus, ist es möglich, dass einige unbekannte Antigene präsentiert werden können.
  • Es ist außerdem ein Verfahren beschrieben worden, bei dem die Wiederherstellung unter Zugabe neuer Moleküle durchgeführt wird (Uchida, T. et al., J. Cell Biol. 80, 10 bis 20, 1979). Jedoch besitzt dieses Verfahren ein hohes Risiko des Verlusts der ursprünglichen viralen Funktionen, da die Membranzusammensetzung der fertig gestellten Partikel von der eines nativen Viruspartikels wesentlich abweicht.
  • Verfahren, die das Einkapseln von Genen oder Proteinen in Liposomen und das Fusionieren dessen mit inaktiviertem HVJ beinhalten, um Fusionspartikel herzustellen, wie beim konventionellen HVJ-Liposom, haben eine nicht-invasive Genübertragung in kultivierte Zellen oder In vivo-Gewebe ermöglicht. Diese Technik befindet sich auf der Tierversuchsebene weltweit in häufiger Benutzung (Dzau, V. J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 11421 bis 11425 (1996) und Kaneda, Y. et al., Molecular Medicine Today, 5, 298 bis 303 (1999)). Es ist jedoch auch herausgefunden worden, dass diese Technik ihre Nachteile besitzt: beispielsweise kann die Prozedur kompliziert sein, da zwei verschiedene Vesikel, d. h. ein Virus und ein Liposom, hergestellt werden müssen; die Partikel, deren mittlerer Durchmesser aufgrund der Fusion mit dem Liposom auf das 1,3-fache des Durchmessers viraler Partikel angestiegen ist, besitzen eine Fusionsaktivität, die nur 10% oder weniger als diejenige des Virus beträgt.
  • Weiterhin ist es im Hinblick auf einige Gewebe so, dass Vektoren, die auf konventionellem HVJ basieren, nicht befähigt sein mögen, irgendeine Genübertragung zu erreichen, oder, falls überhaupt, mit einer extrem niedrigen Effizienz. Dies zeigt an, dass das Gewebe für die Gentherapie, die auf konventionellen Verfahren basiert, begrenzt sein kann.
  • Es gibt einen Bedarf für die Entwicklung viraler Vektoren für die humane Gentherapie, die sicher, hochgradig effizient und einfach hergestellt werden können, und die dennoch die Genübertragung auf ein breites Spektrum von In vivo-Geweben erlauben.
  • Daher besteht eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung darin, einen sicheren, hocheffizienten und einfachen Virus-basierten Gentransfervektor für ein breites Spektrum kultivierter Zellen oder von In vivo-Geweben zu entwickeln, der die Nachteile der konventionellen wiederhergestellten HVJ-Vektor- oder HVJ-Liposom-Verfahren überwinden kann.
  • Wir beschreiben einen sicheren und hocheffizienten Gentransfervektor, der ein inaktiviertes Virus verwendet. Ein inaktiviertes Virus, bei dem das Genom des Virus inaktiviert wurde, repliziert keine Virusproteine und ist daher sicher und von geringer Zytotoxizität und geringer Antigenität. Durch Einkapseln eines Gens in einen Virushüllvektor, der ein Gentransfervektor ist, der ein inaktiviertes Virus verwendet, kann ein sicherer, hocheffizienter und einfacher Gentransfervektor für kultivierte Zellen oder In vivo-Gewebe hergestellt werden.
  • Wir beschreiben weiterhin einen Virushüllvektor, der zur Genübertragung in ein breites Spektrum von In vivo-Geweben befähigt ist. Bei einer Ausführungsform ist das verwendete Virus HVJ. Beispiele für das Gewebe, auf das eine Genübertragung in vivo erreicht werden kann, indem man den Virushüllvektor gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet, beinhalten, ohne hierauf beschränkt zu sein: die Leber, Skelettmuskeln, den Uterus, das Gehirn, die Augen, die Halsschlagader (Arteria carotis), die Haut, die Blutgefäße, die Lunge, das Herz, die Nieren, die Milz, Krebsgewebe, Nerven, B-Lymphozyten, sowie Gewebe des Atmungstrakts.
  • Wir beschreiben ein Verfahren zur einfachen Verwirklichung der Genübertragung auf suspendierte Zellen. Beispiele bevorzugter Verfahren der Genübertragung auf suspendierte Zellen, die den Virushüllvektor gemäß der vorliegenden Erfindung verwenden, beinhalten ein Verfahren der Genübertragung, das die Schritte des Mischens suspendierter Zellen mit dem Virushüllvektor in Gegenwart von Protaminsulfat beinhaltet, wobei eine Zentrifugalkraft auf das Gemisch angewandt wird.
  • Es wird eine hocheffiziente und schnelle Genübertragung auf kultivierte Zellen und In vivo-Gewebe verwirklicht, indem man den Gentransfervektor gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet, um eine große Menge von Genen in einer kurzen Zeitspanne einzukapseln. Daher wird ein Hochdurchsatz zeigendes, schnelles Massenanalysesystem für das Genom, das den Gentransfervektor gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet, realisiert.
  • Der Gentransfervektor kann im gefrorenen Zustand bei –20°C für eine lange Zeitspanne gelagert werden (mindestens zwei bis drei Monate oder mehr). Dieser Gentransfervektor kann in einem gefrorenen Zustand, z. B. verschlossen, gelagert und transportiert werden.
  • Wir beschreiben einen Gentransfervektor, der in vitro eine Genübertragungsaktivität von bevorzugt 70% oder mehr Zellen, bevorzugter von 80% oder mehr Zellen, noch bevorzugter von 90% oder mehr Zellen, und, am bevorzugtesten, von 95% oder mehr Zellen besitzt.
  • Wir beschreiben weiterhin einen Gentransfervektor, der in dem Fall, dass ein Virus-Hüllvektor als ein Gentransfervektor innerhalb von zwei Monaten nach Herstellung eines inaktivierten Virus erzeugt wird, eine Genübertragungsaktivität von 60% oder mehr, bevorzugt von 70% oder mehr, bevorzugter von 80% oder mehr, am bevorzugtesten von 90% oder mehr, beibehält.
  • Wir beschreiben einen Gentransfervektor, der bei einer lokalen Verabreichung in vivo eine Genübertragungsaktivität von bevorzugt 30% oder mehr Zellen im Gewebe, bevorzugter von 40% oder mehr Zellen im Gewebe, noch bevorzugter von 50% oder mehr Zellen im Gewebe, und, am bevorzugtesten, von 60% oder mehr Zellen im Gewebe besitzt.
  • Bei einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung stellen wir einen Gentransfervektor bereit, der im wesentlichen aus einer Virushülle und einem exogenen Gen besteht, wobei der Vektor wie folgt hergestellt wird: eine Stufe des Inaktivierens eines Virus durch Inaktivieren des Genoms darin, sodass es hinsichtlich Replikation defizient ist, gefolgt von einer Stufe des Mischens eines exogenen Gens mit dem inaktivierten Virus und zwei- oder mehrmaligem Einfrieren und Auftauen des Gemischs, oder einer Stufe des Mischens eines exogenen Gens mit dem inaktivierten Virus in der Gegenwart eines Detergens, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Octylglucosid, Triton-X100, CHAPS und NP-40.
  • Das Virus kann ein wildtypisches Virus oder ein Virus des rekombinanten Typs sein.
  • Die Virushülle kann abgeleitet sein von einem Virus, das zu einer Familie gehört, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: Retroviridae, Togaviridae, Coronaviridae, Flaviviridae, Paramyxoviridae, Orthomyxoviridae, Bunyaviridae, Rhabdoviridae, Poxviridae, Herpesviridae, Baculoviridae und Hepadnaviridae. Bevorzugt ist das verwendete Virus HVJ. Der Gentransfervektor kann hergestellt werden unter Verwendung eines rekombinanten Sendai-Virus, das beschrieben ist in Hasan, M. K. et al. (Journal of General Virology, 78, 2813 bis 2820 (1997)) oder Yonemitsu, Y. et al. (Nature Biotechnology 18, 970 bis 973 (2000)).
  • Bevorzugt ist das Detergens Octylglucosid. Bevorzugt ist das Verhältnis von F1-Protein zu HN-Protein in der Virushülle das gleiche wie in dem Ausgangsvirus. Bevorzugt wird zu dem exogenen Gen vor dem Mischen Protaminsulfat hinzu gegeben.
  • Gemäß einem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Gentransfervektor gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung für das Einbringen eines Gens in Tiergewebe in vivo bereitgestellt.
  • Bevorzugt ist das Gewebe ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: Leber-, Skelettmuskel-, Uterus-, Gehirn-, Augen-, Halsschlagader-, Haut-, Blutgefäß-, Lungen-, Herz-, Nieren-, Milz-, Krebsgewebe, Nerven-, B-Lymphozyten- und Atemtraktgewebe.
  • Wir stellen gemäß einem dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung für die Gentherapie bereit, die einen Gentransfervektor gemäß dem ersten oder zweiten Aspekt der Erfindung umfasst.
  • Als ein vierter Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Kit zum Screenen einer Genbibliothek bereitgestellt, welches einen Gentransfervektor, wie dargestellt, umfasst.
  • Gemäß einem fünften Aspekt der vorliegenden Erfindung stellen wir ein Verfahren zur Herstellung eines Gentransfervektors bereit, welcher aus einer Virushülle und einem darin eingekapselten exogenen Gen besteht, wobei das Verfahren folgendes umfasst: eine Stufe des Inaktivierens eines Virus durch Inaktivieren des Genoms darin, so dass es hinsichtlich Replikation defizient ist, gefolgt von einer Stufe des Mischens eines exogenen Gens mit dem inaktivierten Virus und zwei- oder mehrmaligem Einfrieren und Auftauen des Gemischs.
  • In einem sechsten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Gentransfervektors bereit, welcher aus einer Virushülle und einem darin eingekapselten exogenen Gen besteht, wobei das Verfahren folgendes umfasst: eine Stufe des Inaktivierens eines Virus durch Inaktivieren des Genoms darin, so dass es hinsichtlich Replikation defizient ist, gefolgt von einer Stufe des Mischens eines exogenen Gens mit dem inaktivierten Virus in Gegenwart eines Detergens, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Octylglucosid, Triton X-100, CHAPS und NP-40.
  • In einem siebten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Einbringen eines Gens in ein isoliertes Tiergewebe bereit, wobei das Verfahren die Stufen umfasst, bei denen man einen Gentransfervektor, wie beschrieben, herstellt, welcher ein gewünschtes exogenes Gen enthält, und das Gen durch den Gentransfervektor in das isolierte Tiergewebe einbringt.
  • Gemäß einem achten Aspekt der vorliegenden Erfindung stellen wir ein Verfahren zum Einbringen eines exogenen Gens in eine suspendierte Zelle bereit, wobei das Verfahren die Stufen umfasst, bei denen man die suspendierte Zelle mit dem Gentransfervektor, wie beschrieben, in Gegenwart von Protaminsulfat mischt und das Gemisch zentrifugiert.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1 zeigt die Ergebnisse von Messungen des Expressionsniveaus (Luciferaseaktivität) eines exogenen Gens (Luciferasegen) nach unterschiedlich oft erfolgendem Einfrieren und Auftauen eines HVJ-Hüllvektors und Transfizieren von kultivierten Zellen.
  • 2 zeigt Ergebnisse der Messung der Luciferase-Aktivität in dem Fall, bei dem kultivierte Zellen transfiziert wurden, wobei sichergestellt wird, dass die gleiche Anzahl von Viren für die Herstellung eines HVJ-Hüllvektors zur Zugabe zu den kultivierten Zellen verwendet wurde.
  • 3 zeigt Ergebnisse der Luciferase-Aktivitätsmessung in dem Fall, bei dem verschiedene Mengen eines exogenen Gens (Luciferase-Expressionsvektor) bei dem HVJ-Hüllvektor verwendet wurden.
  • 4 zeigt Ergebnisse der Luciferase-Aktivitätsmessung in dem Fall, bei dem verschiedene Typen von Puffer für die Herstellung der HVJ-Hüllvektoren verwendet wurden.
  • 5 zeigt Ergebnisse eines Vergleichs zwischen der Genübertragung unter Verwendung eines konventionellen Gentransfer-Vektors, inaktiviertem HVJ-Liposom und dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung.
  • 6 zeigt schematisch ein Herstellungsverfahren für einen inaktivierten HVJ-Hüllvektor, bei dem ein Detergens verwendet wurde.
  • 7 ist ein Diagramm, das ein SDS-PAGE-Muster von Proteinen zeigt, die in einem HVJ-Hüllvektor enthalten sind, der unter Verwendung eines Detergens hergestellt wurde.
  • 8 ist eine elektronenmikroskopische Abbildung eines HVJ-Hüllvektors unter Verwendung von Negativfärbung, wobei folgendes gezeigt wird: (1) unbehandeltes HVJ; (2) HVJ, das keine DNA enthält und das einer Behandlung mit Octylglucosid unterzogen wurde; und (3) HVJ mit DNA, das einer Behandlung mit Octylglucosid unterzogen wurde.
  • Die 9A bis 9C sind Diagramme, die die Effizienz der Genübertragung darstellen, ausgedrückt in Begriffen der Luciferase-Aktivitätsniveaus, die gemessen wurden bei den entsprechenden Konzentrationen von Octylglucosid; den entsprechenden Behandlungszeiten von HVJ mit Octylglucosid, ob nun eine Ultraschallbehandlung durchgeführt wurde (Ultraschall) oder nicht, und den entsprechenden verwendeten Vektorvolumina, wie es in den Figuren angegeben ist.
  • Die 10A und 10B sind Diagramme, die die Effizienz der Genübertragung darstellen, ausgedrückt in Begriffen der Luciferase-Aktivitätsniveaus, die bei den entsprechenden Konzentrationen von Protaminsulfat (PS) und den entsprechenden Transfektionszeiten, wie in den Figuren gezeigt, gemessen wurden.
  • Die 11A und 11B sind Diagramme, die die Effizienz der Genübertragung darstellen, ausgedrückt in Begriffen der Luciferase-Aktivitätsniveaus, die bei den entsprechenden DNA-Mengen (in dem Versuch verwendete Mengen) und den entsprechenden Lagerungstemperaturen, wie in den Figuren gezeigt, gemessen wurden.
  • 12 ist ein Diagramm, das die Effizienz der Genübertragung darstellt, ausgedrückt in Begriffen der Luciferase-Aktivitätsniveaus, die aufgenommen wurden, wenn HVJ-Hüllvektoren durch Verwendung von HVJ mit verschiedenen HAU-Titern hergestellt und für den Gentransfer verwendet wurden, wie es in der Figur gezeigt ist.
  • 13A ist ein Diagramm, das die Effizienz der Genübertragung darstellt, ausgedrückt in Begriffen der Luciferase-Aktivitätsniveaus, aufgenommen bei den entsprechenden Mengen an UV-Bestrahlung, wie in der Figur gezeigt.
  • 13B ist ein Diagramm, das die Effizienz der Genübertragung darstellt, ausgedrückt in Begriffen der Luciferase-Aktivitätsniveaus, gemessen bei den entsprechenden β-Propiolacton(BPL)-Konzentrationen, wie in der Figur gezeigt.
  • 14 ist ein Diagramm, das die Effizienz der Genübertragung für Schuppenzellkarzinome (SAS) auf der menschlichen Zunge darstellt, ausgedrückt in Begriffen der Luciferase-Aktivitätsniveaus, gemessen bei der entsprechenden Konzentration an Protaminsulfat und den entsprechenden Transfektions-Inkubationszeiten, wie in der Figur gezeigt.
  • 15 ist ein Diagramm, das die Effizienz der Genübertragung für humane Aorten-Endothelzellen (HAEC) darstellt, ausgedrückt in Begriffen der Luciferase-Aktivitätsniveaus, gemessen bei der entsprechenden Konzentration an Protaminsulfat und den entsprechenden Transfektions-Inkubationszeiten, wie in der Figur gezeigt.
  • 16A ist ein Diagramm, das die Effizienz der Genübertragung für Mauslebern darstellt, ausgedrückt in Begriffen der Luciferase-Aktivitätsniveaus, gemessen unter Verwendung des HVJ-Hüllvektors gemäß der vorliegenden Erfindung oder HVJ-AVE(künstliches Virushüll)-Liposom.
  • 16B ist ein Diagramm, das die Effizienz der Genübertragung für Mausuteri darstellt, ausgedrückt in Begriffen der Luciferase-Aktivitätsniveaus, gemessen unter Verwendung des HVJ-Hüllvektors gemäß der vorliegenden Erfindung oder HVJ-AVE(künstliches Virushüll)-Liposom.
  • 16C zeigt Ergebnisse der LacZ-Färbung für Uterusgewebe, die nach dem Gentransfer von pEB-CMV-LacZ unter Verwendung des HVJ-Hüllvektors gemäß der vorliegenden Erfindung für Mausuteri durchgeführt wurde. Durch die LacZ-Färbung wurde die Expression des LacZ-Gens hauptsächlich im Drüsenepithel des Endometriums detektiert.
  • 16D zeigt Ergebnisse der Verabreichung von HVJ-Hüllvektoren, enthaltend pEGFP-1 von 10.000 HAU an SD-Ratten (männlich, Körpergewicht: 300 bis 400 g) über die Cisterna magna oder über die Halsschlagader. Drei bis vier Tage nach der Verabreichung wurden die Ratten getötet, und es wurden Lebendschnitte hergestellt, die der Beobachtung mittels Fluoreszenzmikroskopie unterzogen wurden.
  • (1) Verabreichung über die Cisterna magna:
  • Es wurde die Geneinführung in die Hirnoberfläche bestätigt. Auf der anderen Seite wurde keine Genübertragung in tiefe Bereiche des Gehirns bestätigt. Ebenso wurde keine Genübertragung in den Choroidalplexus bestätigt.
  • (2), (3) Verabreichung über die Halsschlagader
  • Es wurde eine signifikant hohe Expression an der linken Seite bestätigt, wo die Verabreichung durchgeführt wurde. Die Expression wurde nicht nur in den Teilen der Gehirnoberfläche bestätigt, sondern auch im Teilbereich der Basalganglien, und außerdem in der Hirnoberfläche des anderen Gehirns. Man nahm an, dass die Expression in der Hirnoberfläche des anderen Gehirns durch einen kollateralen Fluss zur anderen Seite bedingt war.
  • 16E zeigt die Ergebnisse der dosisabhängigen Suppression von VEGF-induzierter Angiogenese durch pCMV-NK4, das ein Vektor ist, welcher ein mutantes HGF exprimiert, das die HGF-Funktion inhibiert.
  • 16F zeigt Ergebnisse der Genübertragung, die durch Injizieren eines HVJ-Hüllvektors in die Luftröhre durchgeführt wurde.
  • Die 17A und 17B zeigen Ergebnisse der Zellfluoreszenz, die unter Fluoreszenzmikroskopie am nächsten Tag der Einführung von Oligonukleotiden in Zellen beobachtet wurden. Etwa 10% der Oligonukleotid-Einführungseffizienz wurden nach 10-minütiger Inkubation erhalten (17B), wogegen die Oligonukleotide in 80% oder mehr der Zellen nach 60-minütiger Inkubation eingeführt wurden (17A).
  • 18 zeigt Ergebnisse eines Einführungsexperiments an CCRF-CEM, NALM-6 und K-562, bei denen es sich um humane Leukämiezelllinien handelt.
  • Diese Zelllinien (insbesondere CCRF-CEM und NALM-6) würden eine sehr geringe Einführungseffizienz in den Fällen zeigen, bei denen HVJ-Liposom- oder bestehende Liposom-Reagenzien (Lipofectamin, Lipofectin und dergleichen von Gibco BRL) verwenden werden.
  • Eine hohe Luciferaseaktivität wurde unter den folgenden Bedingungen erhalten: Zugabe von 600 bis 1.000 μg/ml an Protaminsulfat und eine Zentrifugation bei 10.000 rpm oder 15.000 rpm für 10 Minuten bei 20°C. Es wurde keine signifikante, mit dem HVJ-Hüllvektor assoziierte Zytotoxizität beobachtet. Sowohl die Zentrifugation als auch die Zugabe von Protaminsulfat wurden für die Genübertragung benötigt.
  • 19 zeigt Ergebnisse der Genübertragung auf Krebsgewebe. Die Genexpression wurde in einer Tumormasse beobachtet, die Krebsgewebe darstellt. Insbesondere wurde eine hohe Gentransferaktivität bei 500 μg/ml an Protaminsulfat erhalten. Auf der anderen Seite war Genexpression bei niedrigeren Konzentrationen von Protaminsulfat nicht detektierbar.
  • 20 zeigt die Ergebnisse von Genübertragung auf Zellen unter Verwendung eines Herpesvirus-Hüllvektors. Obwohl die Gesamt-Luciferase-Aktivität gering war, wurde bestimmt, dass ein Vektor mit der höchsten Einführungseffizienz durch eine Behandlung mit Triton-X10 für 5 Minuten erhalten wurde. Ein Herstellungsverfahren, das kein Protaminsulfat verwandte, besaß eine hohe Einführungseffizienz. Bei einer morphologischen Betrachtung zeigte keine der Proben irgendwelche Zytotoxizität.
  • 21 zeigt Ergebnisse der Genübertragung auf Zellen mit einem Herpesvirus-Hüllvektor, der bei –80°C gelagert worden war. Bei dem Medium, zu dem 10% Serum hinzugegeben worden waren, wurde eine höhere Einführungseffizienz gezeigt als bei dem serumfreien Medium. Es wurde bei 200 μl der Vektorlösung (geschätzte Menge: 2,8 × 107 Viruspartikel/Well) eine höhere Gentransferaktivität gezeigt als bei 100 μl der Lösung (geschätzte Menge: 1,4 × 107 Viruspartikel/Well).
  • Definitionen:
  • Wie hier in der vorliegenden Beschreibung verwendet, bezieht sich „Gentransfer" (Genübertragung) auf die (in vivo oder in vitro stattfindende) Einführung eines gewünschten natürlichen, synthetischen oder rekombinanten Gens oder Genfragments in eine Zielzelle in einer solchen Weise, dass das eingeführte Gen seine Funktionen beibehält. Das einzuführende Gen oder Genfragment gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst DNA, RNA oder jede beliebige Nukleinsäure, die ein synthetisches Analogon hiervon ist, mit einer spezifischen Sequenz. Bei der vorliegenden Beschreibung werden die Begriffe „Genübertragung", „Transfektion" und „Transfizieren" in austauschbarer Weise verwendet.
  • Wie bei der vorliegenden Beschreibung verwendet, bezieht sich ein „Gentransfervektor", „Genvektor" oder „Virushüll-Vektor" auf einen Vektor, der durch Einkapseln eines exogenen Gens in eine Virushülle erhalten wird. Das für die Herstellung eines Gentransfervektors zu verwendende Virus kann ein wildtypisches Virus oder ein rekombinantes Virus sein.
  • Bei einigen Ausführungsformen ist das verwendete Virus ein Virus, das zu einer Familie gehört, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: Retroviridae, Togaviridae, Coronaviridae, Flaviviridae, Paramyxoviridae, Orthomyxoviridae, Bunyaviridae, Rhabdoviridae, Poxviridae, Herpesviridae, Baculoviridae und Hepadnaviridae. Bei einem besonderen Aspekt der vorliegenden Erfindung ist das verwendete Virus HVJ.
  • Wie bei der vorliegenden Beschreibung verwendet, bezieht sich „Gentransferaktivität" auf die „Gentransfer"-Aktivität eines Vektors; und sie kann detektiert werden, indem man die Funktion des eingeführten Gens (z. B. im Fall eines Expressionsvektors die Expression des codierten Proteins und/oder die Aktivität dieses Proteins etc.) als einen Anzeigewert nutzt.
  • Wie in der vorliegenden Beschreibung verwendet, wird „inaktiviert" verwendet, um sich auf ein Virus zu beziehen, dessen Genom inaktiviert wurde. Das inaktivierte Virus ist für die Replikation defizient. Bevorzugt wird die Inaktivierung durch eine UV-Behandlung oder durch eine Behandlung mit einem Alkylierungsmittel erreicht.
  • Wie in der vorliegenden Beschreibung verwendet, bezieht sich ein „exogenes Gen" auf jedwede Nukleinsäuresequenz, die in einem Gentransfervektor enthalten ist, wobei die Nukleinsäuresequenz nicht viralen Ursprung ist. Bei einem Aspekt der vorliegenden Erfindung ist das exogene Gen funktionsfähig mit einer geeigneten regulatorischen Sequenz verbunden, um es einem Gen, das über einen Gentransfervektor eingeführt wurde, zu erlauben, exprimiert zu werden (z. B. durch einen Promotor, einen Enhancer, einen Terminator und ein Poly-A-Anfügungssignal, das notwendig für die Transkription sein kann, ebenso wie eine Ribosomenbindestelle, ein Startcodon, ein Stopcodon, das notwendig für die Translation sein kann, und dergleichen). Das exogene Gen kann ein solches sein, das keinerlei regulatorische Sequenzen für die Expression dieses exogenen Gens beinhaltet. Das exogene Gen kann ein Oligonukleotid oder eine Köder-Nukleinsäure sein.
  • Ein exogenes Gen, das in einem Gentransfervektor enthalten sein soll, ist typischerweise ein DNA- oder RNA-Nukleinsäuremolekül, jedoch kann das einzuführende Nukleinsäuremolekül ein Nukleinsäure-analoges Molekül beinhalten. Die molekularen Spezies, die in dem Gentransfervektor enthalten sein sollen, können eine einzelne molekulare Genspezies oder eine Vielzahl verschiedener molekularer Genspezies sein.
  • Wie bei der vorliegenden Spezifikation verwendet, bezieht sich eine „Genbibliothek" auf eine Nukleinsäurebibliothek, die eine Nukleinsäuresequenz enthält, die aus der Natur isoliert wurde oder eine synthetische Nukleinsäuresequenz darstellt. Beispielhafte Quellen von aus der Natur isolierten Nukleinsäuresequenzen beinhalten eine genomische Sequenz oder eine cDNA-Sequenz, die aus eukaryotischen Zellen, prokaryotischen Zellen oder Viren stammt, darauf jedoch nicht beschränkt ist. Eine Bibliothek, die erhalten wird, indem man eine beliebige Sequenz (z. B. ein Signal oder Tag) an eine aus der Natur isolierte Sequenz anhängt, ist ebenfalls von der Genbibliothek gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst. Eine Genbibliothek kann Sequenzen, wie etwa Promotoren, beinhalten, um die Transkription und/oder Translation von darin enthaltenen Nukleinsäuresequenzen zu bewirken.
  • Bei der vorliegenden Spezifizierung werden „HVJ" und „Sendai-Virus" in austauschbarer Weise verwendet.
  • Bei der vorliegenden Erfindung bezieht sich „HAU" auf ein Niveau der viralen Aktivität, das 0,5% der Hühner-Erythrozyten agglutinieren kann. Ein HAU entspricht etwa 24.000.000 Viruspartikeln (Okada, Y. et al., Biken Journal 4, 209 bis 213, 1961).
  • Gentherapie:
  • Therapeutische Nukleinsäurekonstrukte können entweder lokal oder systemisch verabreicht werden, indem man den Gentransfervektor gemäß der vorliegenden Erfindung benutzt. In dem Fall, in dem ein solches Nukleinsäurekonstrukt eine codierende Sequenz für ein Protein enthält, kann die Expression des Proteins durch die Verwendung eines endogenen Säugerpromotors oder eines heterologen Promotors induziert werden. Die Expression der codierenden Sequenz kann konstitutiv oder reguliert sein.
  • In dem Fall, in dem der Gentransfervektor gemäß der vorliegenden Erfindung als eine Zusammensetzung für die Gentherapie verwendet wird, kann die Verabreichung des Vektors gemäß der vorliegenden Erfindung durch direkte Injektion einer Vektorsuspension, die in PBS (Phosphat-gepufferter Saline), Saline, etc. suspendiert ist, an lokale Stellen (z. B. in Krebsgewebe hinein, in die Leber, intramuskulär und intracerebral) oder durch intravaskuläre Verabreichung (z. B. intraarteriell, intravenös oder intraportal) erreicht werden.
  • Der Gentransfervektor kann allgemein formuliert werden, indem man den Gentransfervektor in einer injizierbaren Einheitsdosisform (Lösung, Suspension oder Emulsion) mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger (d. h. einem, der in den verwendeten Dosierungen und Konzentrationen für den Empfänger nicht-toxisch und mit den anderen Inhaltsstoffen der Formulierung kompatibel ist) mischt. Beispielsweise beinhaltet die Formulierung bevorzugt keine Oxidationsmittel und andere Verbindungen, von denen bekannt ist, dass sie für den Gentransfervektor schädlich sind.
  • Der Träger beinhaltet geeigneter Weise kleinere Mengen an Zusatzstoffen, wie etwa Substanzen, die die isotonischen Eigenschaften und die chemische Stabilität fördern. Solche Materialien sind für die Empfänger bei den verwendeten Dosierungen und Konzentrationen nicht toxisch und beinhalten Puffer, wie etwa Phosphat, Citrat, Succinat, Essigsäure und andere organische Säuren oder deren Salze; Antioxidantien, wie etwa Ascorbinsäure; Polypeptide mit niederem Molekulargewicht (weniger als etwa zehn Reste), z. B. Polyarginin oder Tripeptide; Proteine (wie etwa Serumalbumin, Gelatine oder Immunglobuline); hydrophile Polymere (wie etwa Polyvinylpyrrolidon); Aminosäuren (wie etwa Glycin, Glutaminsäure, Asparaginsäure oder Arginin; Monosaccharide, Disaccharide und andere Kohlenhydrate (einschließlich Cellulose oder deren Derivate, Glukose, Mannose oder Dextrine); Chelatbildner (wie etwa EDTA); Zuckeralkohole (wie etwa Mannitol oder Sorbitol); Gegenionen (wie etwa Natrium); und/oder nicht-ionische Detergentien (wie etwa Polysorbate oder Poloxamere) oder PEG.
  • Eine pharmazeutische Zusammensetzung, die einen Gentransfervektor enthält, kann typischerweise als eine wässrige Lösung in einem Einheits- oder Mehrfachdosis-Behälter, z. B. in einer verschlossenen Ampulle oder Phiole, gelagert werden.
  • Wir beschreiben außerdem eine pharmazeutische Packung oder ein Kit, die/das einen oder mehrere Behälter enthält, die mit einem oder mehreren Bestandteilen der pharmazeutischen Zusammensetzung gefüllt sind. Weiterhin kann das Polypeptid zusammen mit anderen therapeutischen Verbindungen verwendet werden.
  • Eine pharmazeutische Zusammensetzung, die den Gentransfervektor gemäß der vorliegenden Erfindung enthält, wird in einer Weise formuliert und dosiert werden, die mit guter medizinischer Praxis in Übereinstimmung steht und dabei den klinischen Zustand des einzelnen Patienten (z. B. einen Zustand, der zu verhindern oder zu behandeln ist), die Stelle der Auslieferung der Zusammensetzung, die den Gentransfervektor enthält, das Zielgewebe, das Verabreichungsverfahren, das Verabreichungsschema und andere, Fachleuten bekannte Faktoren berücksichtigt. Dem entsprechend wird eine „wirksame Menge" oder eine geeignete Dosierung des Gentransfervektors, der in der vorliegenden Anmeldung beschrieben ist, durch solche Überlegungen bestimmt.
  • Beispielsweise wird in dem Fall, in dem der Genvektor gemäß der vorliegenden Erfindung einer Maus verabreicht wird, das Äquivalent von 20 bis 20.000 HAU, bevorzugt von 60 bis 6.000 HAU, und bevorzugter von 200 bis 2.000 HAU an Genvektor pro Maus verabreicht. Die Menge an exogenem Gen, die in dem verabreichten Genvektor enthalten ist, beträgt 0,1 bis 100 μg, bevorzugt 0,3 bis 30 μg, und bevorzugter 1 bis 10 μg pro Maus.
  • In dem Fall, in dem der Genvektor gemäß der vorliegenden Erfindung einem Menschen verabreicht wird, wird das Äquivalent von 400 bis 400.000 HAU, bevorzugt von 1.200 bis 120.000 HAU, und bevorzugter von 4.000 bis 40.000 HAU an Genvektor pro Subjekt verabreicht. Die Menge an exogenem Gen, die in dem verabreichten Genvektor enthalten ist, beträgt 2 bis 2.000 μg, bevorzugt 6 bis 600 μg, und bevorzugter 20 bis 200 μg pro Subjekt.
  • Es ist beabsichtigt, dass die folgenden Beispiele veranschaulichend und nicht einschränkend für die vorliegende Erfindung sind.
  • Beispiele
  • 1. Gentransfervektor-Präparation, die Einfrieren und Auftauen verwendet, und deren Verwendung
  • Beispiel 1: Herstellung eines HVJ-Hüllvektors durch Einfrieren und Auftauen
  • Das Luciferasegen wurde als ein exogenes Gen verwendet. Nach mehrmaligem Einfrieren und Auftauen eines rekombinanten HVJ-Virus wurde das Gen in die kultivierten Zellen eingeführt.
  • Zu 500 μl an TE wurden 750 μg an Luciferase-Expressionsvektor pcOriPLuc (Saeki und Kaneda et al., Human Gene Therapy, 11, 471 bis 479 (2000)) und verschiedene Konzentrationen an HVJ-Virus gemischt. Die Konzentration an HVJ-Virus wurde auf 10, 25, 50 oder 100 HAU/μl eingestellt. Diese Lösung wurde auf 12 Aliquots aufgeteilt, von denen jedes bei 4°C gelagert, mit Trockeneis eingefroren und danach aufgetaut wurde; dies wurde bis zu 30-mal wiederholt. Eine Lösung, die eine vorab festgelegte Anzahl des Einfrierens und Auftauens durchlaufen hatte, wurde zu einem Medium für BHK-21-Zellen hinzugegeben (24 Well-Schale, 4 × 104 Zellen/Schale, 0,5 ml DMEM, 10% FCS). Nachdem man die Zellen für 20 Minuten bei 37°C mit 5% CO2 hat reagieren lassen, wurden die Zellen mit PBS gewaschen, und es wurden weitere 0,5 ml der Kulturlösung hinzugegeben und für 24 Stunden kultiviert.
  • Das Medium wurde entfernt. Nachdem 500 μl an 1 × Zellkultur-Lyse-Reagenz (Promega) zu den Zellen hinzugegeben worden waren, um die Zellen zu lysieren, wurde die Lösung in ein Mikroröhrchen eingebracht und zentrifugiert. Von 20 μl des resultierenden Überstands wurde die Luciferaseaktivität unter Verwendung des Promega Luciferase Assay Systems und des Lumat LB9501 Luminophotometers gemessen. Die Messungen wurden für jede Lösung dreimal vorgenommen, und es wurde ein Mittelwert bestimmt.
  • Die Ergebnisse sind in 1 dargestellt. Die Luciferaseaktivität nahm zu, wenn die Anzahl der Durchgänge des Einfrierens und Auftauens für das rekombinante HVJ-Virus zunahm. Bei 20-maligem Einfrieren und Auftauen wurde eine 10-fach oder noch stärker erhöhte Luciferase-Expression beobachtet, wenn man dies mit dem verglich, was bei dreimaligem Einfrieren und Auftauen beobachtet wurde. Anhand dieser Ergebnisse wurde bestätigt, dass unter den bei diesem Beispiel verwendeten Bedingungen die Anzahl der Durchgänge des Einfrierens und Auftauens für das rekombinante HVJ-Virus bevorzugt fünf oder mehr beträgt, und bevorzugter etwa 15 bis etwa 20.
  • Beispiel 2: Gentransfereffizienz von HVJ-Hüllvektor, der durch Einfrieren und Auftauen hergestellt wurde
  • Nach 30-maligem Einfrieren und Auftauen eines rekombinanten HVJ-Virus, das ähnlich zu dem in Beispiel 1 verwendeten ist, wurde die Effizienz der Genübertragung in Zellen untersucht, wobei sichergestellt wurde, dass die gleiche Anzahl an Viren zu der Wirtszelle hinzugegeben wurde.
  • Die Ergebnisse sind in 2 gezeigt. In 2, bei 500 HAU auf der X-Achse, wurde z. B. die Lösung mit einer Viruskonzentration von 10 HAU/μl in einer Menge von 50 μl zugegeben, gegenüber 5 μl für die Lösung mit 100 HAU/μl. Wie in 2 gezeigt, nahm die Genexpressionseffizienz der Lösung mit einer Viruskonzentration von 100 HAU/μl um etwa 50% ab, wenn man dies mit derjenigen verglich, die mit einer Konzentration von 10 bis 50 HAU/μl assoziiert war. Ausgehend von diesen Ergebnissen wurde bestätigt, dass unter den Bedingungen in diesem Beispiel die Konzentration an rekombinantem Virus bevorzugt im Bereich von 10 bis 50 HAU/μl liegt.
  • Darüber hinaus, nach 29-maligem Einfrieren und Auftauen eines rekombinanten HVJ-Virus, wurde das Einfrieren für ein 30. Mal durchgeführt, und die HVJ-Viruslösung wurde in diesem gefrorenen Zustand für eine Woche gelagert und danach aufgetaut, um zu den Zellen hinzugegeben werden zu können. Als Ergebnis zeigte das rekombinante HVJ-Virus, das für eine Woche in einem gefrorenen Zustand gelagert wurde, ebenfalls das gleiche Niveau der Luciferasegen-Expression wie bei dem Virus, das 30 aufeinanderfolgende Durchgänge des Einfrierens und Auftauens durchlaufen hatte.
  • Beispiel 3: Messung der Effizienz der Genübertragung unter Verwendung eines Luciferase-Expressionsvektors
  • Ein HVJ-Hüllvektor wurde durch die Verwendung verschiedener Mengen an Luciferase-Expressionsvektor hergestellt, und die Effizienz des Gentransfers in eine Wirtszelle wurde untersucht.
  • Die Menge an HVJ-Virus betrug 50 HAU pro μl TE. Die Menge des Luciferase-Expressionsvektors pcOriPLuc betrug 0,05; 0,1; 0,25; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 3,0 oder 5,5 μg pro μl TE. Es wurde 20-maliges Einfrieren und Auftauen durchgeführt, und das Endvolumen der Lösung wurde auf 100 μl eingestellt, danach wurde die Luciferase-Aktivität durch dasselbe Verfahren gemessen wie bei dem aus Beispiel 1.
  • Die Ergebnisse sind in 3 dargestellt. Die Expressionsmenge nahm in einer dosisabhängigen Weise zu, bis die zugegebene Menge des Expressionsvektors pcOriPLuc (etwa 9,5 kb groß) als einem exogenen Gen 1,5 μg erreichte; danach gab es kaum noch eine Veränderung bei der Expressionsmenge. Anhand der obigen Ergebnisse wurde bestätigt, dass es unter den bei diesem Beispiel verwendeten Bedingungen bevorzugt ist, 1,5 μg/μl oder mehr der DNA des exogenen Gens für den Gentransfer zu verwenden.
  • Beispiel 4: Wirkungen von Puffertypen auf die Effizienz der Genübertragung
  • Es wurde die Effizienz der Genübertragung in die Wirtszelle untersucht, wobei die Puffertypen, die für die Herstellung eines HVJ-Hüllvektors verwendet wurden, variiert wurden.
  • Die Menge an HVJ-Virus betrug 50 HAU pro μl Puffer, die Menge des Luciferase-Expressionsvektors pcOriPLuc betrug 15 μg/μl. Als Puffer wurden TE, PBS oder BSS (137 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 7,5) verwendet, oder diejenigen, die erhalten wurden, indem man Sucrose mit einer Endkonzentration von 0 mM, 20 mM, 40 mM oder 60 mM zu diesen Puffern zugibt. Es wurde 20-maliges Einfrieren und Auftauen durchgeführt, und das Endvolumen der Lösung wurde auf 100 μl eingestellt, wonach die Luciferase-Aktivität durch das gleiche Verfahren gemessen wurde wie bei Beispiel 1.
  • Die Ergebnisse sind in 4 dargestellt, und es wurde unter den bei diesem Beispiel verwendeten Bedingungen bestätigt, dass es bevorzugt ist, TE alleine als Puffer für die Herstellung eines rekombinantem HVJ-Virus zu verwenden.
  • Beispiel 5: Vergleich zwischen einem AVE (künstlicher Virushüll-)Typ-Vektor und dem HVJ-Hüllvektor gemäß der vorliegenden Erfindung
  • Es wurden ein Gentransfer, der inaktiviertes HVJ-Liposom (des AVE-Typs mit der besten Gentransfereffizienz (Saeki, Y. et al., Human Gene Therapy, 8, 2133 bis 2141 (1997)) verwendet und welches ein konventioneller Gentransfervektor ist, und das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung miteinander verglichen.
  • Die Menge an HVJ-Liposom oder HVJ-Virus betrug 50 HAU pro μl an TE, und die Menge des Luciferase-Expressionsvektors pcOriPLuc betrug 1,5 μg/μl. Die Anzahl der Durchgänge des Einfrierens und Auftauens für das rekombinante HVJ-Virus war zweimal oder 15-mal. Die anderen Bedingungen waren dieselben wie in Beispiel 1, mit dem Unterschied, dass die humane embryonale Nierenzelllinie HEK293 als Wirtszelle verwendet wurde.
  • Die Ergebnisse sind in 5 dargestellt. Es wurde bestätigt, dass das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, das 15-mal das Gefrieren und Auftauen des HVJ-Hüllvektors wiederholt, hinsichtlich der Effizienz des Gentransfers ungleich besser ist als das konventionelle Verfahren, das HVJ-Liposom verwendet.
  • Beispiel 6: Einführungseffizienz eines synthetischen Oligonukleotids
  • Ein synthetisches Oligonukleotid (20 bp), das mit FITC (Fluorescein-Isothiocyanat) fluoreszenzmarkiert ist, wurde mit einer Konzentration von 1 mg/ml mit dem inaktivierten HVJ-Virus gemischt. Nachdem diese Lösung 20-mal eingefroren und aufgetaut worden war, ließ man die Lösung für 20 Minuten mit BHK-21-Zellen reagieren. Das Fluoreszenzsignal wurde 17 Stunden später beobachtet. Als Ergebnis wurde eine Fluoreszenzakkumulation in den Zellkernen von nahezu 100% der Zellen beobachtet. Ausgehend von diesen Ergebnissen wurde bestätigt, dass das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung auch wirksam ist, um eine synthetische Nukleinsäure in Zellen einzuführen.
  • Beispiel 7: Einführungseffizienz des GFP-Gens
  • Nachdem eine gemischte Lösung von GFP(Grünes Fluoreszenzprotein)-Gen und inaktiviertem HVJ-Virus 20-mal eingefroren und wieder aufgetaut worden war, wurden 2 ng–5 μl der gemischten Lösung in ein Rattenhirn injiziert. Als Ergebnis wurde ein Fluoreszenzsignal an der Injektionsstelle beobachtet. Darüber hinaus wurde ein HVJ-Hüllvektor, der das GFP-Gen verwendet, eingefroren und für 3 Monate gelagert und danach in ein Rattenhirn injiziert. Es wurde in ähnlicher Weise ein Fluoreszenzsignal aufgrund der Expression des GFP-Gens an der Injektionsstelle beobachtet.
  • Anhand der obigen Ergebnisse wurde bestätigt, dass das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung mit Sicherheit befähigt ist, die Genübertragung auch in vivo zu realisieren. Darüber hinaus wurde außerdem bestätigt, dass die gefrorene Lagerung eines HVJ-Hüllvektors möglich ist.
  • 2. Herstellung eines Gentransfervektors unter Einsatz eines Detergens, sowie dessen Verwendung
  • Beispiel 8: Herstellung eines inaktivierten HVJ-Hüllvektors unter Verwendung eines Detergens
  • Ein Herstellungsverfahren für einen inaktivierten HVJ-Hüllvektor unter Verwendung eines Detergens ist schematisch in 6 dargestellt.
  • 1: Anzucht von HVJ
  • Im allgemeinen kann HVJ verwendet werden, das durch Animpfen eines befruchteten Hühnereis mit dem Impf-Virus vermehrt wurde. Ebenfalls anwendbar sind jedoch auch die folgenden: HVJ, das unter Verwendung kultivierter Zellen (z. B. Affen- oder Menschen-Zellen) vermehrt wurde, oder HVJ, das durch ein anhaltendes Infektionssystem (d. h. eine Kulturlösung, bei der eine Hydrolase, wie etwa Trypsin, zu dem kultivierten Gewebe hinzu gegeben wird) vermehrt wurde, oder HVJ, das durch Infizieren kultivierter Zellen mit kloniertem Virusgenom zum Bewirken anhaltender Infektion vermehrt wurde.
  • Im folgenden Beispiel wurde die Vermehrung von HVJ wie folgt durchgeführt.
  • HVJ-Impfvirus wurde unter Verwendung eines SPF-(spezifisch pathogenfreien, befruchteten) Eis herangezüchtet. Das isolierte und gereinigte HVJ (Z-Spezies) wurde in einem Röhrchen zur Lagerung von Zellen dispensiert und in flüssigem Stickstoff mit 10% an zugegebenem DMSO gelagert. So wurde HVJ hergestellt.
  • Es wurden Hühnereier unmittelbar nach der Befruchtung erhalten und in einen Inkubator eingebracht (SHOWA-FURANKI P-03 Typ; befähigt zum Aufnehmen von etwa 300 Hühnereiern), und diese wurden für 10 bis 14 Tage unter den Bedingungen von 36,5°C und 40% oder mehr Feuchtigkeit herangezüchtet. In einer Dunkelkammer wurde die Lebensfähigkeit des Embryos, ebenso wie eine Luftkammer und eine Chorioallantois bestätigt, indem man einen Eiertester verwendete (einer, bei dem Licht von einer Glühbirne durch ein Fenster mit einem Durchmesser von etwa 1,5 cm geleitet wird). Eine mit einem Virus injizierte Stelle wurde mit einem Stift etwa 5 mm oberhalb der Chorioallantois markiert (die Position wurde so ausgewählt, dass sie alle dicken Blutgefäße vermied). Das Impfvirus (das aus dem flüssigen Stickstoff entnommen wurde) wurde 500-fach mit einer Polypeptonlösung verdünnt (in der 1% Polypepton, 0,2% NaCl gemischt wurden, und die so hergestellt wurde, dass sie einen pH von 7,2 besaß, eingestellt mit 1 M NaOH, gefolgt von Autoklavieren/Sterilisieren und Lagerung bei 4°C) und dann auf 4°C belassen. Das Ei wurde mit IsodineTM und Alkohol desinfiziert. Es wurde mit einem Picker ein kleines Loch an der mit Virus injizierten Stelle erzeugt. Unter Verwendung einer mit einer Nadel versehenen 1 ml-Spritze (Eichgröße 26) wurden 0,1 ml des verdünnten Impfvirus injiziert, um so in der Chorioallantois-Höhle zu sein. Geschmolzenes Paraffin (Schmelzpunkt: 50 bis 52°C) wurde unter Verwendung einer Pasteurpipette auf das Loch aufgebracht, um dieses zu verschließen. Das Ei wurde in einen Inkubator eingesetzt und für drei Tage unter den Bedingungen von 36,5°C und 40% oder mehr Feuchtigkeit herangezüchtet. Danach beließ man das angebrütete Ei über Nacht auf 4°C. Am folgenden Tag wurde der Luftkammerbereich des Eis mit einer Pinzette aufgebrochen, und eine 10 ml-Spritze mit einer Nadel der Eichgröße 18 wurde in die Chorioallantois eingesetzt, um die Chorioallantois-Flüssigkeit abzusaugen, die in einer sterilisierten Flasche gesammelt und bei 4°C gelagert wurde.
  • 2: Reinigung von HVJ
  • HVJ kann durch ein Reinigungsverfahren gereinigt werden, das Zentrifugation verwendet, ein Reinigungsverfahren, das eine Säule verwendet oder beliebige andere Reinigungsverfahren, die in der Technik bekannt sind.
  • 2.1: Reinigungsverfahren durch Zentrifugation
  • Kurz dargestellt, wurde eine Lösung, die vermehrtes Virus enthält, gesammelt, und die Lösung wurde bei niedriger Geschwindigkeit zentrifugiert, um Gewebe oder Zelltrümmer in der Kulturlösung und der Chorioallantois-Flüssigkeit zu entfernen. Ein Überstand hiervon wurde durch Hochgeschwindigkeits-Zentrifugation (27.500 × g, 30 Minuten) und Ultrazentrifugation (62.800 × g, 90 Minuten) unter Verwendung eines Sucrose-Dichtegradienten (30% bis 60% w/v) gereinigt. Es sollte dabei vorsichtig vorgegangen werden, um das Virus während der Reinigung so sanft wie möglich zu behandeln, und das Virus wurde dann bei 4°C gelagert.
  • Spezifisch ausgedrückt war es bei dem vorliegenden Beispiel so, dass HVJ durch das folgende Verfahren gereinigt wurde.
  • Etwa 100 ml an HVJ-enthaltender Chorioallantois-Flüssigkeit (die Chorioallantois-Flüssigkeit aus einem Hühnerei, enthaltend HVJ, die gesammelt und bei 4°C gelagert wurde) wurde mittels einer Pipette des Typs Komagome mit breiter Mündung in zwei 50 ml-Zentrifugenröhrchen eingebracht (siehe Saeki, Y. und Kaneda, Y.: Protein modified liposomes (HVJ-liposomes) for the delivery of genes, oligonucleotides and Proteins. Cell Biology; A laboratory handbook (2. Auflage), herausgegeben von J. E. Celis (Academic Press Inc., San Diego), Band 4, 127 bis 135, 1998), und mit einer Niedriggeschwindigkeits-Zentrifuge bei 3.000 rpm und 4°C für 10 Minuten zentrifugiert (die Bremsen wurden abgeschaltet). So wurden die Gewebetrümmer aus dem Ei entfernt.
  • Nach der Zentrifugation wurde der Überstand auf vier 35 ml-Zentrifugenröhrchen (konzipiert für die Hochgeschwindigkeits-Zentrifugation) verteilt und für 30 Minuten mit einem Winkelrotor bei 27.000 g zentrifugiert (der Beschleuniger und die Bremsen waren eingeschaltet). Der Überstand wurde entfernt, BSS (10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 137 mM NaCl, 5,4 mM KCl; autoklaviert und gelagert bei 4°C) (das BSS ist durch PBS ersetzbar) wurde in einer Menge von etwa 5 ml pro Röhrchen zu dem Präzipitat hinzugegeben, und man ließ dies über Nacht bei 4°C stehen. Durch sanftes Pipettieren mit einer Komagome-Typ-Pipette mit weiter Mündung wurde das Präzipitat herausgelöst und in einem Röhrchen gesammelt, und es wurde in entsprechender Weise für 30 Minuten mit einem Winkelrotor bei 27.000 g zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt, und etwa 10 ml an BSS wurden zu dem Präzipitat hinzugegeben, und man ließ das Präzipitat über Nacht bei 4°C stehen. Durch sanftes Pipettieren mit einer Komagome-Typ-Pipette mit weiter Mündung wurde das Präzipitat herausgelöst und für 10 Minuten mit einer Niedriggeschwindigkeitszentrifuge bei 3.000 rpm und 4°C zentrifugiert (die Bremsen waren abgeschaltet), wodurch die Gewebetrümmer und agglutinierte Massen von Virus, die nicht vollständig entfernt worden waren, entfernt wurden. Der Überstand wurde in ein frisches sterilisiertes Röhrchen gebracht und bei 4°C als das gereinigte Virus gelagert.
  • Zu 0,1 ml dieser Viruslösung wurden 0,9 ml an BSS hinzu gegeben, und die Extinktion bei 540 nm wurde mit einem Spektrophotometer gemessen. Der Virustiter wurde in eine Erythrozyten-Agglutinationsaktivität (HAU) umgesetzt. Ein Extinktionswert 1 bei 540 nm entspricht ungefähr 15.000 HAU. Es wird berücksichtigt, dass HAU weitgehend proportional zur Fusionsaktivität ist. Alternativ kann die Erythrozyten-Agglutinationsaktivität gemessen werden, indem man tatsächlich eine Lösung verwendet, die Hühnererythrozyten (0,5%) enthält (siehe DOUBUTSU SAIBO RIYO JITSUYOKA MANUAL oder „Practice Manual for Using Animal Cells"), REALIZE INC. (herausgegeben von Uchida, Oishi, Furusawa, S. 259 bis 268, 1984).
  • Weiterhin kann eine Reinigung von HVJ unter Verwendung eines Sucrose-Dichtegradienten durchgeführt werden, wenn nötig. Spezifisch wird eine Virussuspension auf ein Zentrifugenröhrchen gegeben, in dem 60%ige und 30%ige Sucroselösungen (per Autoklav sterilisiert) geschichtet wurden, und es wird für 120 Minuten bei 62.800 × g eine Dichtegradienten-Zentrifugation durchgeführt. Nach der Zentrifugation wird eine Bande wiedergewonnen, die auf der Schicht der 60%igen Sucroselösung beobachtet wird. Die wiedergewonnene Virussuspension wird über Nacht bei 4°C gegen eine äußere Lösung von BSS oder PBS dialysiert, wodurch die Sucrose entfernt wird. In dem Fall, in dem die Virussuspension nicht unmittelbar verwendet werden soll, werden Glycerol (per Autoklav sterilisiert) und eine 0,5 M EDTA-Lösung (per Autoklav sterilisiert) zu der Virussuspension hinzugegeben, um Endkonzentrationen von 10% bzw. 2 bis 10 mM zu erreichen, und diese Ansätze werden vorsichtig bei –80°C eingefroren und schließlich in flüssigem Stickstoff gelagert (die gefrorene Lagerung kann mit 10 mM DMSO anstelle von Glycerol und einer 0,5 M EDTA-Lösung erreicht werden).
  • 2.2: Reinigungsverfahren, das Säulen und Ultrafiltration verwendet
  • Anstelle des Reinigungsverfahrens durch Zentrifugation ist die Reinigung von HVJ unter Verwendung von Säulen ebenfalls auf die vorliegende Erfindung anwendbar.
  • Kurz dargestellt, wurden eine Konzentrierung (etwa 10-fach) über Ultrafiltration unter Verwendung eines Filters mit einer molekularen Gewichtsausschlussgrenze von 50.000 und Flution über Ionenaustausch-Chromatographie (0,3 M bis 1 M NaCl) durchgeführt, um eine Reinigung zu erreichen.
  • Spezifisch war es im vorliegenden Beispiel so, dass das folgende Verfahren verwendet wurde, um HVJ durch Säulen zu reinigen.
  • Nachdem eine Chorioallantois-Flüssigkeit gesammelt worden war, wurde diese Flüssigkeit durch einen Membranfilter (80 μm bis 10 μm) filtriert. Zu der Chorioallantois-Flüssigkeit wurden 0,006 bis 0,008% BPL (Endkonzentration) hinzugegeben (4°C, 1 Stunde), um HVJ zu inaktivieren. Die Chorioallantois-Flüssigkeit wurde für 2 Stunden bei 37°C inkubiert, wodurch BPL inaktiviert wurde.
  • Durch ein Tangentialfluss-Ultrafiltrationsverfahren unter Verwendung von 500KMWCO (A/G Technology, Needham, Massachusetts) wurde eine etwa 10-fache Konzentrierung erreicht. Als Puffer wurde 50 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 2% Mannitol und 20 mM Tris (pH 7,5) verwendet. Ein HAU-Assay zeigte eine HVJ-Ausbeute von etwa 100% an. Somit wurden exzellente Ergebnisse erhalten.
  • Durch ein Verfahren der Säulenchromatographie (Puffer: 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 0,2 bis 1 M NaCl) unter Verwendung von Q-Sepharose FF (Amersham Pharmacia Biotech KK, Tokyo) wurde HVJ gereinigt. Die Ausbeute betrug 40 bis 50%, und die Reinheit betrug 99% oder mehr.
  • Eine HVJ-Fraktion wurde durch ein Tangentialfluss-Ultrafiltrationsverfahren unter Verwendung von 500KMWCO (A/G Technology) konzentriert.
  • 3: Inaktivierung von HVJ
  • In dem Fall, in dem es nötig war, HVJ zu inaktivieren, wurde dies durch UV-Lichtbestrahlung oder durch die Behandlung mit einem Alkylierungsmittel, wie unten beschrieben, durchgeführt.
  • 3.1: Verfahren der UV-Lichtbestrahlung
  • Ein Milliliter einer HVJ-Suspension wurde in eine Schale mit einem Durchmesser von 30 mm eingebracht und einer Bestrahlung bei 99 oder 198 mJ/cm2 unterzogen. Obwohl die Bestrahlung mit Gamma-Strahlen ebenfalls anwendbar ist (5 bis 20 Gy), erbringt diese keine vollständige Inaktivierung.
  • 3.2: Behandlung unter Verwendung eines Alkylierungsmittels
  • Unmittelbar vor der Verwendung wurde 0,01% β-Propiolacton in 10 mM KH2PO hergestellt. Die Lösung wurde während der Herstellung auf niedriger Temperatur gehalten, und die Operation wurde rasch durchgeführt.
  • Zu der unmittelbar nach der Reinigung erhaltenen HVJ-Suspension wurde β-Propiolacton hinzugegeben, um schließlich auf 0,01% zu kommen, und dieser Ansatz wurde für 60 Minuten auf Eis inkubiert. Danach wurde das Gemisch für 2 Stunden bei 37°C inkubiert. Das Gemisch wurde in einer Menge von 10.000 HAU pro Röhrchen auf Eppendorf-Röhrchen verteilt und für 15 Minuten bei 15.000 rpm zentrifugiert. Das Präzipitat wurde bei –20°C gelagert. Statt das zuvor genannte Inaktivierungsverfahren zu verwenden, ohne das Präzipitat bei –20°C zu lagern, kann man es auch ermöglichen, dass DNA durch eine Detergens-Behandlung eingebaut wird, um einen Vektor zu konstruieren.
  • 4: Konstruktion eines HVJ-Hüllvektors
  • Zu dem HVJ, das gelagert worden war, wurden 92 μl einer Lösung, enthaltend 200 bis 800 μg an exogener DNA, hinzugegeben, wobei durch Pipettieren ein gutes Suspendieren erlaubt wurde. Diese Lösung kann für mindestens 3 Monate bei –20°C gelagert werden. Durch Zugeben von Protaminsulfat zu der DNA vor dem Mischen mit HVJ wurde die Expressionseffizienz zweifach oder mehr gesteigert.
  • Dieses Gemisch wurde für eine Minute auf Eis gestellt, und es wurden 8 μl an Octylglucosid (10%) hinzugegeben. Das Röhrchen wurde auf Eis für 15 Sekunden geschüttelt, und man ließ es für weitere 45 Sekunden auf Eis stehen. Die Behandlungszeit mit dem Detergens beträgt bevorzugt 1 bis 5 Minuten. Anstelle von Octylglucosid können auch Detergentien, wie etwa Triton-X100 (t-Octylphenoxypolyethoxyethanol), CHAPS (3-[(3-Cholamidopropyl)-dimethylammonio]-1-propansulfonat) oder NP-40 (Nonylphenoxy-Polyethoxyethanol), ebenfalls verwendet werden. Die Endkonzentrationen an Triton-X100, NP-40 und CHAPS betragen bevorzugt 0,24 bis 0,80%, 0,04 bis 0,12% bzw. 1,2 bis 2,0%.
  • Es wurde ein Milliliter an kaltem BSS hinzugegeben, und die Lösung wurde umgehend für 15 Minuten bei 15.000 rpm zentrifugiert. Zu dem resultierenden Präzipitat wurden 300 μl an PBS oder Saline etc. hinzugeben, und man suspendierte dies über Vortexen oder Pipettieren. Die Suspension kann sofort für die Genübertragung verwendet werden, oder sie kann nach einer Lagerung bei –20°C für die Genübertragung verwendet werden. Für eine Lagerzeit von wenigstens 2 Monaten behält dieser HVJ-Hüllvektor das gleiche Niveau der Gentransfereffizienz bei.
  • Beispiel 9: Verhältnis zwischen F1-Protein und HN-Protein im HVJ-Hüllvektor
  • 1: Proben-Präparation
    • (i) Eine Menge an gereinigtem HVJ, die äquivalent zu 10.000 HAU war, wurde für 15 Minuten bei 15.000 rpm zentrifugiert, und das Präzipitat wurde in 300 μl PBS suspendiert und bei –20°C gelagert.
    • (ii) Eine Menge an gereinigtem HVJ, die äquivalent zu 10.000 HAU war, wurde der UV-Lichtbestrahlung (198 mJ/cm2) unterworfen und danach für 15 Minuten bei 15.000 rpm zentrifugiert, und das Präzipitat wurde in 300 μl PBS suspendiert und bei –20°C gelagert.
    • (iii) Eine Menge an gereinigtem HVJ, die äquivalent zu 10.000 HAU war, wurde der UV-Lichtbestrahlung (198 mJ/cm2) unterworfen und danach für 15 Minuten bei 15.000 rpm zentrifugiert. Zu dem Präzipitat wurden 200 μg an pcLuci-DNA (Lösung 92 μl) hinzugefügt, und man suspendierte dies durch Pipettieren. Die Suspension wurde auf Eis gestellt, und es wurden 8 μl an Octylglucosid (10%) hinzugegeben. Das Röhrchen wurde für 15 Sekunden per Hand geschüttelt und für 45 Sekunden auf Eis gesetzt. Es wurde ein Milliliter an kaltem BSS hinzugefügt und unverzüglich für 15 Minuten bei 15.000 rpm zentrifugiert. Danach wurde das Präzipitat in 300 μl PBS suspendiert und bei –20°C gelagert.
  • 2: Protein-Elektrophorese
  • Ein 5×-Lämmli-Probenpuffer wurde zu den drei Arten von Proben hinzugegeben (5, 10, 20 μl), und es wurde eine 10% SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese durchgeführt. Nach der Elektrophorese wurde das Gel mit Coomassie Blau angefärbt. Nach dem Entfärben wurde das Gel auf Cellophanpapier befestigt und getrocknet.
  • 3: Protein-Identifizierung
  • Die Probe, die der Elektrophorese und Anfärbung unterzogen worden war, wurde in einen LAS2000 (Fuji Film, Tokyo) (7) eingesetzt, und die Konzentration von Proteinbanden, die F1 und HN entsprechen, wurde gemessen. Pro Probentyp wurden drei verschiedene Mengen der Elektrophorese unterzogen. Die F1/HN-Dichte wurde jeweils berechnet, und es wurde ein Mittelwert und eine Standardabweichung für jede Probe berechnet.
  • 4: Ergebnisse
  • F1/HN betrug in konsistenter Weise etwa 1,7 für die Proben (i), (ii) und (iii). Wenn man die Molekulargewichte von F1 (51 kD) und HN (68 kDa) berücksichtigt, so wäre das molare Verhältnis etwa 2,3. Dies steht auch in Übereinstimmung mit dem Bericht (Exp. Cell Res. 142, 95 bis 101, 1985), dass die optimale Fusion für ein wiederhergestelltes Liposom bei Verwendung von F1 und H bei einem F1/HN-Verhältnis von etwa 2 erreicht werden kann. Bei den wiederhergestellten Typen, die von anderen Forschern beschrieben wurden, ist dieses Verhältnis abweichend von dem des wildtypischen Virus (J. Virol. 67, 3312 bis 3318, 1993). Die übrigen Proteinzusammensetzungen waren zwischen HVJ und dem HVJ-Hüllvektor ebenfalls weitgehend gleich.
  • Beispiel 10: DNA-Einkapselung in den HVJ-Hüllvektor und Einkapselungsrate
  • 1: Elektronenmikroskopische Bilder von HVJ-Hüllvektor mit eingekapselter DNA oder uneingekapselt
  • Wie oben beschrieben, wurden 130 μg an pSFV-LacZ (14,5 kb) in HVJ (durch UV-Licht inaktiviert) mit 10.000 HAU eingekapselt, und es wurde ein HVJ-Hüllvektor hergestellt.
  • Der HVJ-Hüllvektor wurde nach dem Einkapseln in 300 μl PBS suspendiert und bei –20°C gelagert. Zehn Tage später wurde 1 μl der Suspension auf ein Gitterchen gesetzt und über Elektronenmikroskopie mittels Negativfärbung betrachtet. Als Kontrolle wurde ein HVJ-Hüllvektor verwendet, bei dem keine DNA eingekapselt war.
  • Ergebnisse:
  • Die Ergebnisse sind in 8 dargestellt. Eine Mehrzahl der HVJ-Hüllvektoren besaß im Wesentlichen dieselbe äußere Anordnung wie die des HVJ-Virus, der in der Vergangenheit selbst betrachtet wurde. Im Vergleich mit dem HVJ-Hüllvektor, bei dem keine DNA eingekapselt war, wurde bei dem HVJ-Hüllvektor, bei dem DNA verwendet wurde, eine Struktur mit einer hohen Elektronendichte beobachtet. Auf der anderen Seite zeigten die nicht eingekapselten HVJ-Hüllvektoren einen hohen inneren Transmissionsgrad, und es wurde vermutet, dass das Virusgenom zerstört worden war oder verloren gegangen war.
  • 2: DNA-Einkapselungsrate in HVJ-Hüllvektor
  • pcLuci (7,4 kb), 157 μg, wurde in HVJ (UV-Licht-inaktiviert) mit 6.700 HAU in der vorstehend genannten Weise eingekapselt, wodurch ein HVJ-Hüllvektor hergestellt wurde. Der HVJ-Hüllvektor wurde in 300 μl BSS suspendiert und mit 15 Unit an Micrococcus-Nuklease, 2 mM CaCl2 und 20 μg/ml an RNase A bei 20°C für 30 Minuten behandelt und dann gegen einen Liter PBS (4°C, über Nacht) dialysiert. Der HVJ-Hüllvektor wurde mit 1% SDS für 1 Minute bei 37°C behandelt. Der HVJ-Hüllvektor wurde mit 500 μl Phenol und 500 μl Chloroform-Isoamylalkohol behandelt und danach der Ethanol-Präzipitation unterzogen. Das Präzipitat wurde in 100 μl BSS suspendiert, und Messungen bei 260 nm oder 280 nm wurden mit einem Spektrophotometer aufgenommen.
  • Ergebnisse:
  • Die Ausbeute betrug 85,7%. Gemäß Umrechnung hieraus betrug die DNA-Einbau-Effizienz in den HVJ-Hüllvektor 3,8%. Die Einbaueffizienz in dem Fall, bei dem der Einbau von 279 μg an pcLuci in HVJ mit 10.000 HAU erfolgte, betrug 7,2%.
  • Ausgehend von dem Obigen wird die DNA-Einbau-Effizienz in HVJ mit 10.000 HAU auf etwa 6 bis 7% in dem Fall geschätzt, wenn Octylglucosid verwendet wird, jedoch kann dies in Abhängigkeit von der Menge der verwendeten DNA etwas variieren. Darüber hinaus ist herausgefunden worden, dass die Einbaueffizienz zunimmt, wenn Protaminsulfat zusammen mit der DNA und dem HVJ-Hüllvektor vorliegt; man nimmt an, dass dies daran liegt, dass die Effizienz der DNA-Einkapselung in den HVJ-Hüllvektor gesteigert wurde. Es wird vermutet, dass die Effizienz mit Triton-X100 oder NP-40 weiter bis auf etwa 10 bis 40% gesteigert werden kann.
  • Beispiel 11: Gentransfer auf Zellen über einen HVJ-Hüllvektor
  • 1: Gentransferverfahren
  • Ein Mengenäquivalent von 1.000 HAU wurde in ein Eppendorf-Röhrchen (30 μl) eingebracht, und es wurden 5 μl Protaminsulfat (1 mg/ml) hinzugegeben. Das Medium für BHK-21-Zellen (die am Vortag in sechs Wells in einer Menge von 200.000 Zellen pro Well ausgesät worden waren) wurde ausgetauscht, und es wurden 0,5 ml an Medium (10% FCS-DMEM) pro Well hinzugegeben. Zu jedem Well wurde ein Gemisch des vorstehend genannten Vektors (äquivalent zu 1.000 HAU) und Protaminsulfat hinzugegeben, und die Platte wurde vorwärts und rückwärts und von rechts nach links geschüttelt, wodurch der Vektor und die Zellen gut gemischt wurden. Man beließ das Gemisch für 10 Minuten bei 37°C in einem 5% CO2-Inkubator.
  • Das Medium wurde ausgetauscht, und man beließ den Ansatz über Nacht (16 h bis 24 h) auf 37°C in einem 5% CO2-Inkubator, wonach die Genexpression untersucht wurde. Wie für die Luciferase (pcLuci: ein Luciferasegen mit einem CMV-Promotor) wurden die Zellen mit 0,5 ml eines Zelllyse-Puffers (Promega) lysiert, und die Aktivität in 20 μl der Lösung wurde unter Verwendung eines Luciferase-Assay-Kits (Promega) gemessen. Wie bei dem grünen Fluoreszenzprotein (pCMV-GFPE; Promega) wurden die Zellen unter Fluoreszenzmikroskopie in ihrer intakten Form betrachtet, und es wurden 5 bis 8 Felder mit einer Vergrößerungsrate von 400 betrachtet, und das Mengenverhältnis der Zellen, die Fluoreszenz erzeugten, wurde berechnet.
  • 2: Untersuchung der Bedingungen, die im Bezug auf die Einführungseffizienz für die kultivierten Zellen auferlegt wurden
  • BHK-21-Zellen wurden als die kultivierten Zellen verwendet.
  • 2.1: Untersuchung der Octylglucosid(OG)-Konzentration bei der Herstellung von HVJ-Hüllvektor
  • Die folgenden Modifikationen wurden an dem Gentransferverfahren von (1) oben vorgenommen, und die Wirkungen von Octylglucosid (OG) auf den Gentransfer über den HVJ-Hüllvektor bei den folgenden Konzentrationen (d. h. der Endkonzentration an OG, das für die Herstellung des HVJ-Hüllvektors verwendet wurde) wurden untersucht:
    • (A) Konzentration von Octylglucosid: 1, 2 oder 3%; Die Zeitspanne, für die das inaktivierte HVJ zur Zeit der Herstellung des HVJ-Hüllvektors mit OG behandelt wurde, war wie folgt: 1 Minute, 5 Minuten oder 10 Minuten; eine Ultraschallbehandlung wurde durchgeführt (Ultraschall) oder nicht durchgeführt.
    • (B) Octylglucosid-Konzentration: 0,125 bis 1,25%; Das Volumen des für die Transformation verwendeten Vektors betrug: 10 μl, 100 μl.
    • (C) Octylglucosid: 0,55 bis 0,8%; Transfektionsdauer: 30 Minuten, über Nacht (O/N).
  • Die Ergebnisse sind in 9 dargestellt.
  • 2.2: Bedingungen des Gentransfers in Zellen, Konzentration/Behandlungszeit von Protaminsulfat (PS)
  • Es wurden die folgenden Modifikationen am Gentransferverfahren von (1) oben vorgenommen, und die Auswirkungen von Protaminsulfat auf den Gentransfer über den HVJ-Hüllvektor wurden untersucht:
    • (A) Protaminsulfat: 0 bis 100 μg/ml Medium; Transfektionszeit: 20, 40 oder 60 Minuten.
    • (B) Protaminsulfat: 0 bis 40 μg/ml Medium; Transfektionszeit: 5, 10 oder 20 Minuten.
  • Die Ergebnisse sind in 10 dargestellt.
  • 2.3: Wirkungen der Konzentration an DNA, die im HVJ-Hüllvektor eingekapselt ist, auf das Niveau der Genexpression
  • Es wurden die folgenden Modifikationen an dem Gentransferverfahren von (1) vorgenommen, und die Auswirkungen der Menge an DNA, die für den Versuch verwendet wurde, auf das Niveau der Genexpression über den HVJ-Hüllvektor wurde untersucht:
    • (A) Menge an DNA: 20 bis 200 μg; Der HVJ-Hüllvektor wurde bei –20°C oder –80°C für fünf Tage gelagert.
    • (B) Menge an DNA: 180 bis 360 μg/HVJ 10.000 HAU.
  • Die Ergebnisse sind in 11 dargestellt.
  • 2.4: Wirkungen des Titers von für den Gentransfer verwendetem HVJ auf das Niveau der Genexpression
  • Es wurden die folgenden Modifikationen an dem Gentransferverfahren von (1) vorgenommen, und die Wirkungen der Titer von HVJ, das für den Gentransfer über den HVJ-Hüllvektor verwendet wurde, auf die Menge an Genexpression wurden untersucht:
    Durch die Verwendung von HVJ mit einem Titer von 5.000, 10.000 oder 20.000 HAU wurden HVJ-Hüllvektoren hergestellt, und BHK-21-Zellen wurden mit Mengen davon transfiziert, die äquivalent waren zu 250, 500, 1.000 oder 2.000 HAU.
  • Die Ergebnisse sind in 12 dargestellt.
  • 2.5: Auswirkungen der HVJ-inaktivierten Bedingungen auf die Gentransfereffizienz des HVJ-Hüllvektors
  • Es wurden die folgenden Modifikationen am Gentransferverfahren von (1) vorgenommen, und die Auswirkungen des HVJ-Inaktivierungsverfahrens (UV oder β-Propiolacton) auf die Luciferasegen-Expression in BHK-21-Zellen wurden untersucht.
    • (A) Bestrahlungsmenge, die für die UV-Inaktivierung verwendet wurde: 0 bis 231 mJ/cm2.
    • (B) β-Propiolacton(BPL)-Konzentration, die für die HVJ-Behandlung verwendet wird: 0 bis 0,025%.
  • Die Ergebnisse sind in 13 angezeigt.
  • Beispiel 12: Gentransfer durch den HVJ-Hüllvektor in verschiedene Zellen
  • Bei einem Schuppenzellkarzinom (SAS) auf einer menschlichen Zunge wurde der Gentransfer gemäß dem Verfahren durchgeführt, wie es in Beispiel 11 beschrieben ist. Die Ergebnisse sind in 14 dargestellt. Beim Gentransfer wurden die Protaminsulfat-Konzentration und die Inkubationszeit für die Transfektion variiert, wie in 14 gezeigt, und die Effizienz des Gentransfers wurde auf Basis der Expression des Luciferasegens gemessen. Unter den für die Transfektion verwendeten Bedingungen war die Effizienz der Genübertragung in dem Fall maximal, bei dem eine Transfektionsbehandlung für 60 Minuten unter Verwendung von 200 μg/ml an Protaminsulfat durchgeführt wurde. Jedoch erwartet man weitere Steigerungen der Gentransfereffizienz durch eine weitere Erhöhung der Protaminsulfat-Konzentration.
  • Die Geneinführung wurde für humane Aorten-Endothelzellen (HAEC) gemäß dem in Beispiel 11 beschriebenen Verfahren durchgeführt. Die Ergebnisse sind in 15 dargestellt.
  • Beim Gentransfer wurden die Protaminsulfat-Konzentration und die Inkubationszeit für die Transfektion variiert, wie in 15 gezeigt, und die Gentransfereffizienz wurde auf Basis der Expression des Luciferasegens gemessen. Unter den für die Transfektion verwendeten Bedingungen war die Gentransfereffizienz in dem Fall maximal, wenn eine Transfektionsbehandlung für 60 Minuten unter Verwendung von 100 μg/ml an Protaminsulfat durchgeführt wurde. Jedoch werden weitere Steigerungen hinsichtlich der Gentransfereffizienz erwartet, wenn man die Protaminsulfat-Konzentration weiter erhöht.
  • Beispiel 13: Gentransfer durch den HVJ-Hüllvektor in verschiedene Typen von in vivo-Gewebe
  • Das vorliegende Beispiel veranschaulicht Beispiele des Gentransfers in verschiedene Typen von In vivo-Geweben unter Verwendung des HVJ-Hüllvektors, der in Beispiel 11 beschrieben ist.
  • 13.1: Mausleber
  • Ein HVJ-Hüllvektor wurde hergestellt, indem man 0,8% Octylglucosid mit 200 μg an pcLuci für 1 Minute auf Eis beließ, gefolgt von Suspendieren in 300 μl PBS. Ein Zehntel, 30 μl (entsprechend 1.000 HAU) der vorbereiteten Suspension wurde mit 70 μl an PBS verdünnt (Gesamtmenge: 100 μl), und die verdünnte Lösung wurde in einen Lappen einer Maus-(C57BL/6)-Leber injiziert.
  • Ein HVJ-AVE(Künstliches Virushüll)-Liposom wurde durch Vortexen/Extrusion mit 200 μg pcLuci, gefolgt von Sucrosegradienten-Zentrifugation (62.000 g, 90 Minuten), hergestellt. Danach wurde die Präparation durch Zentrifugation (27.000 g, 30 Minuten) pelletiert, und das Pellet wurde in 500 μl PBS suspendiert. Hundert Mikroliter der Probe wurden in einen Lappen einer Maus-(C57BL/6)-Leber injiziert.
  • 24 Stunden später wurde der Leberlappen nach der Injektion isoliert, und die Luciferaseaktivität des Lappens wurde unter Verwendung von Luciferase Assay System (Promega) bestimmt.
  • Die Ergebnisse sind in 16A dargestellt. Wie aus diesen Ergebnissen klar wird, zeigte der HVJ-Hüllvektor gemäß der vorliegenden Erfindung eine bemerkenswert hohe Gentransfereffizienz, die etwa zweimal so hoch war wie die eines konventionellen HVJ-AVE-Liposoms.
  • 13.2: Mausuterus
  • Ein HVJ-Hüllvektor wurde hergestellt, wie in 13.1 beschrieben. Fünfzig Mikroliter und hundert Mikroliter der Probe wurden mit PBS auf 500 μl verdünnt, dies wurde in den Eileiter einer Maus infundiert, und die Zervix wurde für 10 Minuten abgebunden. 24 Stunden später wurde der Mausuterus isoliert, und die Luciferaseaktivität des Lappens oder Uterus wurde unter Verwendung eines Luciferase-Assay-Systems (Promega) untersucht. Die Ergebnisse sind in 16B gezeigt. Während der HVJ-Hüllvektor gemäß der vorliegenden Erfindung den Gentransfer in den Mausuterus erlaubte, zeigte das Verfahren, das HVJ-AVE-Liposom verwendete, kein detektierbares Niveau an Gentransfer in das Uterusgewebe.
  • Ein HVJ-Hüllvektor, der pcLuci enthält, wurde hergestellt wie in 13.1 beschrieben. Für die LacZ-Expression wurde ein HVJ-Hüllvektor, der pEB-CMV-LacZ (13 kb) enthält, unter Verwendung von 200 μg des Plasmids hergestellt. HVJ-Hüllvektoren, die diese Vektoren enthalten, wurden in den Uterus injiziert wie oben beschrieben. Die Ergebnisse sind in 16C dargestellt. Durch die LacZ-Färbung wurde die Expression des LacZ-Gens hauptsächlich im Drüsenepithel des Endometriums detektiert.
  • 13.3: Rattengehirn
  • Ein HVJ-Hüllvektor, der pEGFP-1 (d. h. ein Vektor, bei dem ein grünes Fluoreszenzprotein-Gen (etwa 0,7 kb)) aus einer Qualle enthält, wird in einen Expressionsvektor mit einem Cytomegalievirus-Promotor eingebaut (erhältlich bei Clontech (Palo Alto, CA)); dabei erfolgte die Herstellung durch ein Verfahren, das ähnlich dem vorstehend genannten Verfahren zur Herstellung eines HVJ-Hüllvektors, der pcLuci enthält, ist. Dreißig Mikroliter des Vektors (äquivalent zu 1.000 HAU, 1/10 der Präparation) wurden entweder in die Halsschlagader oder über die Cisterna magna in den intrathekalen Raum von SD-Ratten (Sprague-Dawley-Ratten) injiziert. Drei bis vier Tage nach der Genübertragung wurden die Ratten getötet, und es wurden Hirnschnitte ohne Fixierung hergestellt. Die Fluoreszenz wurde unter Fluoreszenzmikroskopie beobachtet. Wie durch die Ergebnisse, die in 16D gezeigt sind, angezeigt, wurde die intracerebrale Expression von grünem Fluoreszenzprotein (GFP) sowohl bei der Injektion in die Halsschlagader als auch bei der Injektion in den intrathekalen Raum über die Cisterna Magna beobachtet. Auf der anderen Seite wurde eine intracerebrale GFP-Expression nicht beobachtet, wenn ein entsprechender Gentransfer über die Rattenhalsschlagader unter Verwendung von HVJ-AVE-Liposom durchgeführt wurde.
  • 13.4: Kaninchenauge
  • pCMV-NK4, das konstruiert worden war, indem man NK4-cDNA (1,4 kb), eine Mutante des Gens von humanem HGF (Hepatozyten-Wachstumsfaktor), an der HindIII/XbaI-Stelle von pCDNA3 (In Vitrogen, San Diego, CA) einklonierte, wurde freundlicher Weise von Professor Toshikazu NAKAMURA et al. von der Osaka University, Graduate School of Medicine, zur Verfügung gestellt.
  • Ein HVJ-Hüllvektor wurde durch ein Verfahren hergestellt, das ähnlich dem vorstehend genannten Verfahren zur Herstellung eines HVJ-Hüllvektors ist, der pcLuci enthält, mit dem Unterschied, dass entweder 400 oder 800 μg an pCMV-NK4 mit inaktiviertem HVJ von 10.000 HAU verwendet wurden. pCMV-NK4 ist ein Vektor, der ein mutantes HGF exprimiert, das die HGF- Funktion inhibiert. Fünfzig Mikroliter des Vektors (1/6 der Präparation) wurde in das Augenhornhautgewebe von Kaninchen injiziert, das mit einem Pellet aus rekombinantem VEGF behandelt worden war, um Angiogenese zu induzieren. Sieben Tage nach der Behandlung wurden die Kaninchen getötet, und die Angiogenese im Auge wurde beobachtet. Die Ergebnisse sind in 16E gezeigt. pCMV-NK4 supprimierte die durch VEGF induzierte Angiogenese in einer dosisabhängigen Weise.
  • 13.5: Ratten-Pulmonalarterie
  • Ein HVJ-Hüllvektor, der pSV-LacZ (Promega, Madison, WI) enthält, das ein LacZ-Gen unter der Kontrolle von SV40-Promotor aufweist, wurde durch ein Verfahren hergestellt, das ähnlich dem vorstehend genannten Verfahren zur Herstellung eines HVJ-Hüllvektors, der pcLuci enthält, ist. Fünfzig Mikroliter des Vektors (1/6 der Präparation) wurden in die Luftröhre einer Ratte injiziert. Drei Tage nach der Genübertragung wurden die Ratten getötet, und die Expression von LacZ in der Arterie wurde nach dem Fixieren des Gewebes mit 1% Glutaraldehyd mittels X-Gal sichtbar gemacht. Die Ergebnisse sind in 16F gezeigt. Genexpression wurde im Bronchialepithel auch in dem Fall beobachtet, wenn der HVJ-Hüllvektor über die Pulmonalarterie eingeführt wurde (Daten nicht gezeigt).
  • Beispiel 14: Funktionen eines Virus-Hüllvektors als ein Arzneimittel-Auslieferungssystem (DDS)
  • Der Gentransfervektor gemäß der vorliegenden Erfindung ist auch nützlich als Arzneimittelauslieferungssystem für Oligonukleotide oder die Therapie mit einer Köder-Nukleinsäure.
  • 14.1: Einführung fluoreszenter Oligonukleotide
  • Durch Verwendung des Virushüllvektors gemäß der vorliegenden Erfindung wurden fluoreszenzmarkierte Oligonukleotide in die Zellen eingeführt.
  • 20-mer-Oligonukleotide (5'-CCTTgAAGGGATTTCCCTCC-3') (194 μg/92 μl an BSS), die an der 5'-Position mit FITC markiert worden waren, wurden mit einem Präzipitat von HVJ mit 10.000 HAU (das mit 198 mJ/cm2 an UV-Licht inaktiviert worden war) gemischt. Es wurde Triton X-100 (Endkonzentration: 0,24%) hinzugegeben, und das Gemisch wurde für 1 Minute einer Behandlung auf Eis unterzogen. Es wurde ein Milliliter an BSS hinzugegeben, und das Gemisch wurde zentrifugiert (15.000 rpm, 15 Minuten, 4°C). Zu dem Präzipitat wurden 100 μl an PBS hinzugegeben, und das Gemisch wurde bei –20°C gelagert. Einen Monat später wurde das Gemisch aufgetaut, und 10 μl davon wurden mit 5 μg an Protaminsulfat gemischt und mit 5.000.000 BHK-21-Zellen (in 0,5 ml Medium) inkubiert (10 Minuten, 60 Minuten). Am nächsten Tag nach der Einführung wurde die Zellfluoreszenz unter Fluoreszenzmikroskopie betrachtet. Als Ergebnis wurde eine Oligonukleotid-Einführungseffizienz von etwa 10% nach 10 Minuten erhalten, wie in 17B gezeigt, wogegen die Oligonukleotide nach 60 Minuten in 80% oder mehr der Zellen eingeführt wurden, wie in 17A gezeigt.
  • 14.2: Therapie für Kontaktdermatitis unter Verwendung von Stat6-Köder-Nukleinsäuren
  • Durch Verwendung des Virushüllvektors gemäß der vorliegenden Erfindung wurden Köder-Nukleinsäuren in Zellen eingeführt.
  • Doppelsträngige Nukleinsäuren mit einer Stat6-DNA-Bindesequenz (5'-GATCAAGACCTTTTCCCAAGAATCTAT-3' und 3'-CATGTTCTGGAAAAGGGTTCTTAGATA-5', (Wang, L. H. et al.: Blood 95, 1249 bis 1257, 2000)) (250 μg/300 μl an BSS) wurden mit einem Präzipitat von HVJ mit 30.000 HAU (das durch 99 mJ/cm2 an UV-Licht inaktiviert worden war) gemischt.
  • Triton X-100 (Endkonzentration: 0,24%) wurde hinzugegeben, und das Gemisch wurde einer Behandlung auf Eis für 1 Minute unterzogen. Es wurde ein Milliliter an BSS hinzugegeben, und das Gemisch wurde zentrifugiert (15.000 rpm, 15 Minuten, 4°C). Zu dem Präzipitat wurden 300 μl an PBS hinzugegeben, und das Gemisch wurde bei –20°C gelagert. Dieser HVJ-Hüllvektor wurde für die subkutane Injektion in Mäuse verwendet, was zur Suppression einer IgE-induzierten Allergie und verzögerter entzündlicher Hautreaktion führte.
  • Beispiel 15: Gentransfer auf Suspensionszellen
  • Unter Verwendung von CCRF-CEM, NALM-6, K-562, die humanen Leukämiezellen ähneln, wurde ein Gentransferexperiment durchgeführt.
  • Zweihundert Mikrogramm an pCMV-Luciferase (92 μl) wurden mit einem Präzipitat von inaktiviertem HVJ (UV-Licht, 99 mJ/cm2) von 10.000 HAU gemischt.
  • Triton X-100 (Endkonzentration: 0,24%) wurde hinzugegeben, und das Gemisch wurde einer Behandlung auf Eis für 1 Minute unterzogen. Es wurde ein Milliliter an BSS hinzugegeben, und das Gemisch wurde zentrifugiert (15.000 rpm, 15 Minuten, 4°C). Zu dem Präzipitat wurden 300 μl an PBS hinzugegeben, wodurch ein HVJ-Hüllvektor hergestellt wurde. Sechzig Mikroliter des Vektors (äquivalent zu 2.000 HAU), Protaminsulfat und 4.000.000 Suspensionszellen wurden in einem 1,5-ml-Eppendorfröhrchen gemischt und wurden einer Zentrifugation (10.000 bis 15.000 rpm, 10 Minuten, 20°C) unterzogen. Danach wurde eine Kulturlösung zu dem Präzipitat hinzugegeben, und das Gemisch wurde auf eine Kulturschale aufgebracht. Einen Tag später wurde die Luciferaseaktivität der Zellen gemessen.
  • Die verwendeten Zelllinien (insbesondere CCRF-CEM und NALM-6) zeigen eine sehr geringe Einführungseffizienz in dem Fall, wenn HVJ-Liposomen oder bestehende Liposom-Reagenzien (Lipofectamin, Lipofectin von Gibco BRL, etc.) verwendet werden. Jedoch wurde, wie in 18 gezeigt, ein hocheffizienter Gentransfer auf diese Zelllinien beobachtet.
  • Die bevorzugten Bedingungen des Gentransfers wurden als die folgenden Bedingungen bestimmt: Zugabe von 600 bis 1.000 μg/ml an Protaminsulfat und eine Zentrifugation bei 10.000 rpm oder 15.000 rpm für 10 Minuten bei 20°C. Es wurde keine signifikante, mit dem HVJ-Hüllvektor assoziierte Zytotoxizität beobachtet. Es wurden sowohl Zentrifugation als auch die Zugabe von Protaminsulfat für die Genübertragung benötigt.
  • Beispiel 16: Gentransfer auf Krebsgewebe
  • 354 Mikrogramm an pCMV-Luciferase (92 μl) wurden mit einem Präzipitat von inaktiviertem HVJ (UV-Licht, 99 mJ/cm2) mit 34.000 HAU gemischt. Triton X-100 (Endkonzentration: 0,24%) wurde hinzugegeben, und das Gemisch wurde einer Behandlung auf Eis für eine Minute unterzogen. Es wurde ein Milliliter an BSS hinzugegeben, und das Gemisch wurde zentrifugiert (10.000 bis 15.000 rpm, 10 Minuten, 20°C). Zu dem Präzipitat wurden 300 μl an PBS hinzugegeben, und das Gemisch wurde bei –20°C gelagert. Einen Tag später wurde das Gemisch mit 500 μg/ml oder 1.000 μg/ml an Protaminsulfat gemischt. Hundert Mikroliter hiervon wurden in eine Tumormasse des Maus-Melanoms B16-F1 (Durchmesser: 7 bis 8 mm) injiziert. Einen Tag später wurde die Luciferaseaktivität gemessen. Wie in 19 gezeigt, wurde Genexpression in der Tumormasse beobachtet. Die bevorzugte Protaminsulfat-Konzentration betrug 500 μg/ml. Auf der anderen Seite war die Genexpression bei niedrigeren Protaminsulfat-Konzentrationen nicht detektierbar.
  • Beispiel 17: Herstellung von Herpesvirus-Hüllvektoren
  • 17.1: Herstellung von inaktiviertem Virus
  • Herpes simplex-Virus Typ 1 (HSV-1) (1010 Plaque-bildende Einheiten/ml) wurden freundlicher Weise von Professor Yamanishi von der Universität Osaka, Graduate School of Medicine, Abteilung für Bakteriologie, zur Verfügung gestellt. Die Inaktivierungsbedingungen für dieses Virus wurden auf Basis der viralen Plaquebildung in kultivierten Affenzellen (Vero-Zellen) untersucht. Wenn das Virus mit β-Propiolacton (BPL) 0,05% inaktiviert wurde, so erschienen die Plaques in den Vero-Zellen mit einer Häufigkeit von 9,1 × 10–4 (Plaques/Vero-Zellen). Wenn das Virus durch Bestrahlung mit 200 oder 400 mJ/cm2 an UV-Licht inaktiviert wurde, war es auf der anderen Seite so, dass die Häufigkeiten 4,3 × 10–4 bzw. 2,2 × 10–6 (Plaques/Vero-Zellen) betrugen.
  • 17.2: Gentransfer unter Nutzung von inaktiviertem Virus
  • Nachdem 100 μl an HSV-1 (109 Partikel) mit 620 μl PBS verdünnt worden waren, wurde die verdünnte Lösung mit 400 mJ/cm2 an UV-Licht bestrahlt. Zehn Prozent hiervon (72 μl) wurden mit DNA gemischt (pCMV-Luciferase 8,83 μg/μl). Acht Mikroliter an 3% Triton X-100 (Endkonzentration: 0,24%) wurden hinzugegeben, und es erfolgte eine Zugabe von 1 ml PBS 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 Minuten später, wodurch die Lösung verdünnt wurde. Hundert Mikroliter jeder Probe wurden mit weiterer Behandlung in BHK-21-Zellen (in einer 6-Well-Platte) eingeführt. Die Zellen wurden in Dulbeccos essentiellem Minimalmedium (DME) (0,5 ml/Well), enthaltend 10% fetales Kälberserum (FCS), kultiviert. In einem anderen Versuch wurden 100 μl jeder Probe mit 5 μg an Protaminsulfat gemischt, was danach in BHK-21 eingeführt wurde. Nachdem man die Proben für 60 Minuten in einem Inkubator belassen hatte (37°C, 5% CO2) wurde die Kulturlösung durch 10% FCS-DME ersetzt. Die Luciferase-Aktivität wurde 22 Stunden später gemessen. Wie in 20 gezeigt, wurde ein hochgradig effizienter Gentransfer durch den Herpesvirus-Hüllvektor, der durch das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt wurde, bestätigt. Keine der Proben zeigte irgendwelche Zytotoxizität bei einer morphologischen Betrachtung.
  • Danach wurde ein Herpesvirus-Hüllvektor, der für 5 Minuten mit Triton X-100 behandelt und für zwei Tage bei –80°C gelagert worden war, wieder aufgetaut und wiederum zu BHK-21-Zellen hinzugegeben, und die Einführungseffizienz wurde gemessen. Dieses Mal wurden 10% FCS-DME (2,5 ml/Well) in 60 Minuten ab der Einführung hinzugegeben, es wurde dann über Nacht kultiviert, wonach die Aktivität gemessen wurde. Die Wirkungen des Serums und der Mengen an Vektor wurden untersucht.
  • Wie in 21 gezeigt, wurde selbst nach zwei Tagen der Lagerung bei –80°C ein hochgradig effizienter Gentransfer bestätigt. Bei dem Medium, zu dem 10% Serum hinzugegeben worden waren, wurde eine höhere Einführungseffizienz gezeigt als bei dem serumfreien Medium. Bei 200 μl der Vektorlösung (geschätzte Menge: 2,8 × 107 Viruspartikel/Well) wurde eine höhere Gentransferaktivität gezeigt als bei 100 μl der Lösung (geschätzte Menge: 1,4 × 107 Viruspartikel/Well).
  • 17.3: Gentransfer unter Verwendung von inaktiviertem Virus
  • Aus der obigen Offenbarung wird Fachleuten auf dem Gebiet klar werden, dass die vorliegende Technik der Erzeugung eines Hüllvektors durch Verwendung eines Detergens nicht nur auf HVJ anwendbar ist, sondern auch auf ein breites Spektrum von Hüllviren, die Lipidmembranen besitzen. Entsprechend ist es offensichtlich, dass Fachleute auf dem Gebiet leicht Hüllvektoren für den Gentransfer durch Verwendung beliebiger anderer Hüllviren in Übereinstimmung mit der Offenbarung der vorliegenden Erfindung herstellen können. Folglich kann ein Hüllvektor unter Verwendung eines Virus der Retroviridae, Togaviridae, Coronaviridae, Flaviviridae, Paramyxoviridae, Orthomyxoviridae, Bunyaviridae, Rhabdoviridae, Poxviridae, Herpesviridae, Baculoviridae und Hepadnaviridae etc. hergestellt werden. Es wird somit ins Auge gefasst, dass die Einführung eines Ziels in spezifische Organe unter Verwendung der Gewebegerichtetheit der Viren realisiert werden kann. Beispielsweise wäre ein Hüllvektor unter Verwendung von Herpes simplex-Virus als ein auf Nerven abzielender Vektor anwendbar; ein Hüllvektor unter Verwendung von Epstein-Barr-Virus wäre als ein auf B-Lymphozyten abzielender Vektor anwendbar; und ein Hüllvektor unter Verwendung von Influenzavirus wäre als ein auf Atmungsorgane abzielender Vektor anwendbar.
  • Somit werden spezifische Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung bei der vorliegenden Schrift im Hinblick auf veranschaulichende Aufgabenstellungen beschrieben. Spezifisch, obwohl, die Beispiele in der vorliegenden Schrift im Hinblick auf Gentransfervektoren beschrieben sind, die inaktiviertes HVJ verwenden, sollte Fachleuten auf Basis der Offenbarung in der vorliegenden Schrift klar sein, dass ein Gentransfervektor gemäß der vorliegenden Erfindung durch die Inaktivierung anderer Viren als HVJ hergestellt werden kann, und dass ein Gentransfervektor gemäß der vorliegenden Erfindung auch ohne einen Inaktivierungsschritt hergestellt werden kann, indem man ein ähnliches Präparationsverfahren verwendet. Entsprechend wird die vorliegende Erfindung nur durch die angefügten Ansprüche eingeschränkt.
  • Industrielle Anwendbarkeit
  • Es wird ein neues Gentransferverfahren bereitgestellt, das einen einfachen Betrieb erlaubt und dennoch eine hervorragende Gentransfereffizienz bereitstellt. Es wird ins Auge gefasst, dass dies eine schnelle Durchmusterung von Genbibliotheken erlaubt. Es wird außerdem ein Kit zum Hochdurchsatz-Screenen bereitgestellt, das den Virushüllvektor gemäß der vorliegenden Erfindung enthält. Darüber hinaus kann der Virushüllvektor, der gemäß der vorliegenden Anwendung bereitgestellt wird, eine lange Zeitspanne der Lagerung im gefrorenen Zustand tolerieren, sodass er nicht bei der Verwendung hergestellt werden muss. Als Ergebnis kann der Arbeitsablauf stark vereinfacht werden, und ein gleichförmiger Gentransfer auf Basis eines in Massen produzierten Einführungsvektors kann verwirklicht werden. Weiterhin erlaubt der Gentransfervektor gemäß der vorliegenden Erfindung einen effizienteren Gentransfer als beliebige konventionelle Vektoren, die auf Basis von HVJ hergestellt werden, und er ermöglicht den Gentransfer in ein breiteres Spektrum von In vivo-Geweben als konventionelle Verfahren.
  • Es werden ferner Arzneimittel-Auslieferungssysteme für die Verabreichung medizinischer Wirkstoffe und Systeme zum Screenen von Wirkstoffen, sowie Vektoren für die Gentherapie bereitgestellt, die den Gentransfervektor gemäß der vorliegenden Erfindung enthalten.

Claims (15)

  1. Gentransfervektor, welcher im wesentlichen aus einer Virushülle und einem exogenen Gen besteht, wobei der Vektor hergestellt wird durch eine Stufe des Inaktivierens eines Virus durch Inaktivieren des Genoms darin, so daß es hinsichtlich Replikation defizient ist, gefolgt von einer Stufe des Mischens eines exogenen Gens mit dem inaktivierten Virus und zwei- oder mehrmaligem Einfrieren und Auftauen des Gemischs, oder einer Stufe des Mischens eines exogenen Gens mit dem inaktivierten Virus in der Gegenwart eines Detergens, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Octylglucosid, Triton-X100, CHAPS und NP-40.
  2. Gentransfervektor nach Anspruch 1, wobei die Virushülle von einem Wildtypvirus oder einem rekombinanten Virus abgeleitet ist.
  3. Gentransfervektor nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Virushülle von einem Virus abgeleitet ist, welches zu einer Familie gehört, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Retroviridae, Togaviridae, Coronaviridae, Flaviviridae, Paramyxoviridae, Orthomyxoviridae, Bunyaviridae, Rhabdoviridae, Poxviridae, Herpesviridae, Baculoviridae und Hepadnaviridae.
  4. Gentransfervektor nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei das Virus HVJ (Sendai-Virus) ist.
  5. Gentransfervektor nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei das Detergens Octylglucosid ist.
  6. Gentransfervektor nach Anspruch 5, wobei das Verhältnis von F1-Protein zu HN-Protein in der Virushülle das gleiche ist wie in dem Ausgangsvirus.
  7. Gentransfervektor nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei dem exogenen Gen vor dem Mischen Protaminsulfat zugegeben wird.
  8. Gentransfervektor nach einem der vorangegangenen Ansprüche für das Einbringen eines Gens in Tiergewebe in vivo.
  9. Gentransfervektor nach Anspruch 8, wobei das Gewebe aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Leber-, Skelettmuskel-, Uterus-, Gehirn-, Augen-, Halsschlagader-, Haut-, Blutgefäß-, Lungen-, Herz-, Nieren-, Milz-, Krebsgewebe, Nerven-, B-Lymphozyten- und Atemtraktgewebe.
  10. Pharmazeutische Zusammensetzung für die Gentherapie, welche einen Gentransfervektor nach einem der vorangegangenen Ansprüche umfaßt.
  11. Kit zum Screenen einer Genbibliothek, welches einen Gentransfervektor nach einem der Ansprüche 1 bis 9 umfaßt.
  12. Verfahren zur Herstellung eines Gentransfervektors, welcher aus einer Virushülle und einem darin eingekapselten exogenen Gen besteht, wobei das Verfahren folgendes umfaßt: eine Stufe des Inaktivierens eines Virus durch Inaktivieren des Genoms darin, so daß es hinsichtlich Replikation defizient ist, gefolgt von einer Stufe des Mischens eines exogenen Gens mit dem inaktivierten Virus und zwei- oder mehrmaligem Einfrieren und Auftauen des Gemischs.
  13. Verfahren zur Herstellung eines Gentransfervektors, welcher aus einer Virushülle und einem darin eingekapselten exogenen Gen besteht, wobei das Verfahren folgendes umfaßt: eine Stufe des Inaktivierens eines Virus durch Inaktivieren des Genoms darin, so daß es hinsichtlich Replikation defizient ist, gefolgt von einer Stufe des Mischens eines exogenen Gens mit dem inaktivierten Virus in der Gegenwart eines Detergens, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Octylglucosid, Triton X-100, CHAPS und NP-40.
  14. Verfahren zum Einbringen eines Gens in ein isoliertes Tiergewebe, wobei das Verfahren die Stufen umfaßt, bei denen man einen Gentransfervektor nach einem der Ansprüche 1 bis 9 herstellt, welcher ein gewünschtes exogenes Gen enthält, und das Gen durch den Gentransfervektor in das isolierte Tiergewebe einbringt.
  15. Verfahren zum Einbringen eines exogenen Gens in eine suspendierte Zelle, wobei das Verfahren die Stufen umfaßt, bei denen man die suspendierte Zelle mit dem Gentransfervektor nach einem der Ansprüche 1 bis 9 in der Gegenwart von Protaminsulfat mischt und das Gemisch zentrifugiert.
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