TWI303663B

TWI303663B - Inactivated virus envelope

Info

Publication number: TWI303663B
Application number: TW090102208A
Authority: TW
Inventors: Kaneda Yasufumi
Original assignee: Kaneda Yasufumi; Anges Mg Inc
Priority date: 2000-02-02
Filing date: 2001-02-02
Publication date: 2008-12-01
Also published as: DE60131498D1; CN1657103A; CN1365388A; CN100542614C; AU3057801A; AU769385B2; KR100776475B1; EP1170363A1; KR20070059182A; US20040219674A1; WO2001057204A1; CN101302536A; US7279333B2; DE60131498T2; CA2369491A1; US20030013195A1; KR20020004987A; US20050239188A1; DE60131498T8; US7803621B2

Description

13 03 6旁丞0102208號專利申請案中文說明書替換頁(93年1月） A7 B7

五、發明説明（技術分野本發明係關於一種在試管内及活體内導入基因用之安全及高效率載體。更特定而言，本發明係關於用病毒或去活化病毒，尤其是去活化HVJ (仙台病毒，Sendai virus)，製備之基因導入用載體。再者，本說明書之基因導入用載體亦可被用於基因治療及高通量篩選。背景技術為了基因治療，開發多種基因導入用之病毒法及非病毒法（合成法 KMulligan，Science，260，926- 932 (1993)以及 Ledley，Human Gene Therapy，vol.6，1 129- 1 144 (1995)) 〇 — 般而言，在將基因送達細胞上，病毒法比非病毒法有效。但是，病毒類載體，由於來自親代病毒之必需基因要素之同時導入、病毒基因之遺漏表現、免疫原性及宿主染色體組構造之改變，而可能發生安全性上之問題。一般而言，非病毒類載體之細胞傷害性及免疫原性較少。但是，大部分的非病毒法在基因導入效率（尤其是導入活體内）上，比病毒類載體差。因此，病毒類及非病毒類載體兩方面皆有限制及長處。所以，經由開發具高效率及低毒性之基因導入體内用載體，一類載體系統之限制可藉導入他類系統之有利點而加以補償。另一方面，已知HVJ之免疫原性高，尤其是ΝΡ蛋白質被大量生產以及謗導 CTL (Cole，G.A· et al·，J_ Immunology 158, 4301〜4309 (1997))。又，擔心宿主之蛋白質合成被抑本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 紫加(0102208號專利申請案中文說明書替換頁(93年1月） Μ年/月%修正替換頁 Α7 Β7五、發明説明（） 2 就HVJ言之，藉著離心病毒融合蛋白質及用層析管柱操作精製融合蛋白質而再構成脂質膜之方法所製成之粒子，由於病毒具有之其他蛋白質（主要為Μ蛋白質）失去，在融合活性上為必要之F1及ΗΝ蛋白質之比率無法保持與野生型病毒相同，因此有所謂融合活性變低之缺點。再者，於再構成之時，由於融合蛋白質被插入脂質膜之方向性不限於與野生型病毒相同者，因此可能出現未知之抗原提示。又，雖然亦曾報告加入新穎分子而再構成之方法（Uchida， T. et al·，J· Cell. Biol. 80，10〜20，1979)，但由於用該方法完成之粒子之膜組成與原來病毒粒子有很大差異，所以原來病毒機能喪失之危險性大。一先前方法將基因及蛋白質封入微脂粒，然後將其與去活化HVJ融合，以形成融合粒子（以HVJ-微脂粒為代表），該方法可以將基因非侵襲性地導入培養細胞及身體組織中，其被頻繁用於全世界之動物實驗層級（Dzau，V. J. et al·， Piroc. Natl. Acad. Sci. USA，93，11421 〜1 1425 (1996)以及 Kaneda，Y. et al·，Molecular Medicine Today，5，298〜303 (1999))。但是已知該法具有下列缺點：病毒及微脂粒為二相異囊泡（vesicle)，準備彼等需要複雜手段，以及藉與微脂粒融合以致平均直徑比病毒粒子大1.3倍之融合粒子，融合活性降至病毒之10%以下。再者，利用先前以HVJ為基礎之載體之場合，亦存在無法導入基因之組織及導入基因效率極低之組織。此表示基 -5 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐)

13 03 $63)102208號專利申請案中文說明書替換頁(93年1月） A7 B7 五、發明説明（） 3 於先前方法之基因治療之對象組織有所限制。為了人類基因治療，期望開發一種能安全、高效率且簡便地製備，以及可將基因導入廣範圍身體組織之病毒類載體。因此，本發明之目的為開發一種能克服先前之再構成 HVJ載體法或HVJ-微脂粒法之缺點，而對於廣範圍培養細胞及身體組織而言，係安全、高效率且簡便之基因導入用病毒類載體。發明之揭示本發明之一方面係提供一種使用去活化病毒之安全且高效率之基因導入用載體。在病毒之染色體組被去活化之去活化病毒中，由於病毒蛋白質未被複製，所以安全且細胞毒性及抗原性亦低。藉著將基因封入病毒外套膜載體（為一種利用不活性化病毒之基因導入用載體）中，可以製備對 .培養細胞及身體組織而言為安全、高效率且簡便之基因導入用載體。本發明之另一方面係提供一種可以將病毒導入廣範圍體内組織之病毒外套膜載體。在一實施態樣中，被使用之病毒為HVJ。在身體内，藉本發明之病毒外套膜載體導入基因之組織例如為肝臟、骨骼肌、子宮、腦、眼部、頸動脈、皮膚、血管、肺、心臟、腎臟、脾臟、癌組織、神經、B淋巴球及呼吸器官之組織，但不限於此等組織。本發明之再一方面係提供一種將基因導入浮游細胞之簡便方法。使用本發明之病毒外套膜載體而將基因導入浮游 -6 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) I303$^)3〇1〇2208 號專利申請案一一一一-- 中文說明書替換頁(93年1月） g 戸%7月f日修(々正替換頁五、發明説明（） 4 細胞之方法，例如為包含將浮游細胞與病毒外套膜載體於硫酸魚精蛋白存在下混合之步騾及將該混合液施以離心力之步驟之基因導入方法。在本發明之一方面中，藉著使用本發明之基因導入用載體於短時間内封入大量基因，可以高效率將基因迅速導入培養細胞及身體組織中。因此，在本發明之再一方面中，可提供一種利用本發明之基因導入用載體之染色體組大量迅速解析系統。在本發明之一特定方面中，基因導入用載體可以於-2(TC 凍結之狀態長時間（至少2〜3個月以上）保存。因而該基因導入用載體例如可以凍結狀態密封、貯藏及輸送。在本發明之一特定方面中，於試管中，較佳將有基因導入活性之基因導入用載體提供給70%以上，更佳80%以上，特佳9 0 %以上，最佳9 5 %以上之細胞。在本發明之一方面中，於製備去活化病毒2個月後製成基因導入用病毒外套膜載體之場合，提供一種保持60%以上，較佳70%以上，更佳80%以上，最佳90%以上之基因導入活性之基因導入用載體。在本發明之又一方面中，於局部投與至體内之場合，較佳將有基因導入活性之基因導入用載體提供給較佳30%以上，更佳40%以上，特佳50%以上，最佳60%以上之組織細胞中。在本發明之一方面中，提供一種含有不活性化病毒外套膜之基因導入用載體。本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1303663 A7 B7 五、發明說明（5 ) 在本發明之一方面中，爲製備基因導入用載體所使用之病毒可爲野生型病毒，也可爲重組型病毒。在本發明之一方面中，所使用之病毒爲選自反錄病毒科、披版病毒科、狀病毒科、黃病毒科、副黏液病毒科、正黏液病毒科、本揚病毒（Bunyavirus)科、狂犬病毒科、痘病毒科、疱療病毒科、桿狀病毒科及肝脱氧核糖核酸病毒科所組成群中之科所屬之病毒。又，在本發明之一特定方面中，所使用之病毒爲HVJ。又，在本發明之再一方面中，使用 Hasan, M.K.等人（Journal of General Virology， 78，2813〜2820 (1997))或Yonemitsu，Y. (Nature Biotechnology 18, 970〜973 (2000))等人記載之重組型仙台病毒，製備基因導入用載體。在本發明之另一方面中，提供一種將基因導入動物身體内組織之基因導入用載體。在製備本發明之基因導入用載體之方法中，將病毒不活性化之步驟非一定必要。因此，在本發明之一方面中，未進行將病毒去活化之步驟，而係藉著包含下列步驟之方法製成基因導入用載體： 1) 將病毒與外來基因混合之步驟，以及 2) 將該混合液凍結融解，或將該混合液再與界面活性劑混合之步驟。在本發明之另一方面中，提供一種供基因導入用之不活性化病毒外套膜載體之製法，該方法包含下列步驟：將病毒不活性化之步驟； -8 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝售經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1303663 A7

13 03 $63)102208號專利申請案 (声)正替換頁中文說明書替換頁(93年1月）五、發明説明（圖1為將H VJ外套膜載體凍結融解各種次數，並轉仇拉、細胞後，外來基因（蟲螢光素酶基因）之表現（蟲 =捂養性）程度之測定結果。素酶活圖2為在製備添加至培養細胞之hvj外套膜載體時、病毒數為相同之條件下轉染培養細胞之場合，蟲 2又活性之測定結果。赏尤素酶圖3為將HVJ外套膜載體之外來基因（蟲螢光素酶、體）之量做各種改變之場合，蟲螢光素酶活 j載果。心判疋結圖4為在改變HVJ外套膜載體製備用緩衝液之種類、尸合’蟲勞光素酶活性之測定結果。，苟圖5為使用去活性化HVJ_微脂粒（先前之基因導入用之基因導入法與本發明方法之比較結果。 v 圖6為顯示用界面活性劑去活性化之HVJ外套膜载體、法之概略圖。 1 圖^7為HVJ、以UV去活化之HVJ及HVJ外套膜載體之蛋白質剖析圖，其係顯示使用界面活性劑製備之Hvj外套載體所含蛋白質之SDS-PAGE圖譜。圖8為使用HVJ外套膜載體之陰性染色法之電子顯微鏡，昭片。（1)未處理之HVJ ; (2)未含DNA ,但經辛基葡萄糖芬處理之HVJ; (3)經辛基葡萄糖苷處理且含有DNa之hVj。圖9A〜C表示辛基葡萄糖甞對於藉由HVJ外套膜載體之基 f Ϊ入的影響，在該圖所示之各辛基葡萄糖甞濃度、辛基葡萄糖甞處理HVJ之各種時間、有超音波處理或無超音波處理以及載體之各使用體積下，基因導入效率之圖，其中基因導入效率以蟲螢光素酶活性表示。八張尺度適财® g家鮮(CNS) A4規格(⑽χ 297公-------— 13 03备6&102208號專利申請案 ------ 中文說明書替換頁(93年1月} ^7衫年，月少日修0正替換頁五、發明説明（） — 8 圖10A及10B表示硫酸魚精蛋白對於經由ΗVJ外套膜載體之基因導入的影響，在該圖所示之各硫酸魚精蛋白（PS)濃度及各轉染時間下，基因導入效率之圖，其中基因導入效率以蟲螢光素酶活性表示。圖11Α及11Β表示DNA量對於使用以辛基葡萄糖:y：處理後凍結之HVJ外套膜之基因表現之影響，及DNA量對於藉由 H VJ外套膜載體之基因表現之影響，在該圖所示之各DNA 量（實驗所使用之量）及各保存溫度下，基因導入效率之圖，其中基因導入效率以蟲螢光素酶活性表示。圖12表示HVJ力價對於基因表現之影響，為在使用該圖所示之各 HAU力價之HVJ製備HVJ外套膜載體及進行基因導入時，基因導入效率之圖，其中基因導入效率以蟲螢光素酶活性表示。圖13Α表示在UV去活化中照射量之研究，為在該圖所示之各 UV照射量下，以蟲螢光素酶活性表示之基因導入效率之圖。圖13Β表示在BPL去活化中處理濃度之研究，為在該圖所示之各/3 -丙内酯（BPL)濃度下，基因導入效率之圖，其中基因導入效率以蟲螢光素酶活性表示。圖14表示SAS感染時間及硫酸魚精蛋白濃度之影響，為在該圖所示之各硫酸魚精蛋白濃度及各轉染之培育時間下，對於人類舌部之扁平上皮癌（SAS)之基因導入效率之圖，其中該基因導入效率以蟲螢光素酶活性表示。圖15表示HAEC感染時間及硫酸魚精蛋白濃度之影響，為在該圖所示之各硫酸魚精蛋白濃度及各轉染之培育時間下，對於人類大動脈内皮細胞（HAEC)之基因導入效率之圖，其中該基因導入效率以蟲螢光素酶活性表示。圖16Α為在使用本發明之HVJ外套膜載體及HVJ-AVE (人造病毒外套）微脂粒下，對於小鼠肝臟之基因導入效率之圖，其中該基因導入效率以蟲螢光素酶活性表示。圖16Β為在使用本發明之HVJ外套膜載體及HVJ· AVE(人 _____- 11 _ 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210X 297公釐） D 03备&δ)ΐ〇22〇8號專利申請案中文說明書替換頁(93年1月） Α7 Β7 ’V〆日修(^正替換頁五、發明説明（） 9 造病毒外套）微脂粒下，對於小鼠子宮之基因導入效率之圖，其中該基因導入效率以蟲螢光素酶活性表示。圖16C為使用本發明之HVJ外套膜載體將pEB-CMV-LacZ 導入小鼠子宮後，進行子宮組織之LacZ染色之結果。藉著 LacZ染色’主要在子宮内膜之腺上皮上檢測到LacZ基因之表現。圖16D為將含i〇,〇〇〇HAU之pEGFP- 1之HVJ外套膜載體，經由小腦延髓池或經由頸動脈投與至SD大鼠（雄性，體重 300〜400公克）之結果。投與後第3〜4日屠殺之，製作活體切片’然後在螢光顯微鏡下觀察。 ① 經由小腦延髓池投與確認基因被導入腦之表面。另一方面，未確認基因被導入腦之深部。未確認基因被導入脈絡叢。 ② ，③經由頸動脈投與確認在遲行投與之左側具有意義之高表現。確認不僅在腦表面部分，在基底核部亦有表現。亦確認在對側腦之腦表面有表現。在對側腦之腦表面之表現被認為係藉側副流流至對側。圖16E為PCMV-NK4體積依存性地抑制被VEGF謗導之血管新生之結果之顯示圖，其中該pCMV-NK4為表現變異型 HGF之載體，該變異型HGF會抑制HGF機能。圖16F為將HVJ外套膜載體注入氣管而進行之基因導入之結果之顯示圖。圖17A及17B顯示將寡核甞酸導入細胞之翌日，用螢光顯本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1303663 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 ------El_______ 五、發明說明（1〇 ) 微鏡觀察細胞之螢光之結果。在培育丨0分鐘之場合，寡核棼酸導入效率爲約10% (圖17B)。另一方面，在培育時間爲60分鐘之場合，寡核苷酸被導入80%以上之細胞中（圖 17A) 〇圖18爲以人類白血病細胞株ccrf- CEM、NALM- 6、K-562爲對象進行導入實驗之結果。此等細胞株，爲使用 HVJ-微脂粒及現有微脂粒試藥[Gibc brl之脂質泛可停 (lipofectin)及脂質泛可停胺（lip〇fectamine)等]時導入效率極低之細胞株（尤其是CCRF-CEM及NALM-6)。在添加硫酸魚精蛋白600〜1000 a g/ml，及於10000 rpm或 15000 rpm下離心1〇分鐘或2〇分鐘之條件下，可以得到高蟲螢光素酶活性。未觀察到有意義之細胞毒性。又，離心及硫酸魚精蛋白二者在導入上皆爲必要。圖19顯示基因導入癌組織之結果。在爲癌組織之腫瘤塊中可以見到基因表現，尤其在硫酸魚精蛋白爲5〇〇 a g/ml 時’可以得到鬲基因導入活性。在使用比此濃度低之硫酸魚精蛋白之場合，無法檢測出基因表現。圖20顯示使用疱疹病毒外套膜載體將基因導入細胞之結果。雖然總蟲螢光素酶活性低，但藉著用Triton_xi〇〇處理 5刀鐘，此製作導入效率高之載體。又未使用硫酸魚精蛋白之製法，導入效率高。藉形態學觀察，各樣品皆未被見到細胞毒性。圖21顯示使用在-8(rc保存後之疱疹病毒外套膜載體將基因導入細胞之結果。在使用添加10%血清之培養基之場 -13 - 尺度適《??5^準（CNS)A4規格咖x 297公釐） -- (請先閱讀背面之注音心事項再填寫本頁) 裝--------—訂---------. 1303663 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（11 合，導入效率比無血清培養基者高，200 W之載體溶液（推定量：2.8 X 1〇7病毒粒子/凹穴）比loo"溶液（推定量：4 χ 1〇7病毒粒子/凹穴）活性高。實施本發明之最佳形態 (定義）在本説明書中，「基因導入」意指在活體内或試管内，將天然、合成或重組之期望基因或基因片段，以能維持被導入基因之機能之方式導入標的細胞中。在本發明中，被導入之基因或基因片段包含具有特定序列之DNA或RNA或其合成類似物之核酸。又在本説明書中，基因導入及轉染可以交換使用。在本説明書中，「基因導入用載體」、「基因載體」或「病毒外套膜載體」意謂將外來基因封入病毒外套膜中而成之載體。製備基因導入用載體所使用之病毒可爲野生型病毒或重組型病毒。在本發明之一方面中，所使用之病毒爲選自反綠病毒科、披膜病毒科、冠狀病毒科、黃病毒科、副黏液病毒科、正黏液病毒科、本揚病毒（Bunyavirus)科、狂犬病毒科、症病毒科、疱疹病毒科、桿狀病毒科及肝脱氧核糖核酸病毒科所組成群中之科所屬之病毒。又，在本發明之特定方面中，所使用之病毒爲HVJ。在本説明書中，「基因導入活性」意謂藉載體導入基因之活性，當以被導入基因之機能（例如在表現载體之場合’被編碼蛋白質之表現及/或蛋白質活性等）爲指標時，裝 .—訂---------. f請先閱讀背面之>i音？事項再填寫本頁) -14 - 1303663 A7 B7 五、發明說明（12 ) 其可被檢測出。、在本説明書中，「不活性化」意謂染色體組被不活性化心病毒。該不活性化病毒，複製能力缺損。該不活性化較佳藉UV處理或烷化劑處理而達成。在本％明書中，「外來基因」意謂基因導入用載體所包含之病毒以外之起源之核酸序列。在本發明之一方面中， =外來基因與能使被基因導入用載體導入之基因表現之適當碉節序列可操縱式地連鎖，其中該調節序列例如爲轉綠所必需之促進子、加強子、終止子及聚A附加信號，以及 $澤所必需之核糖體結合部位、起始密碼子及終止密碼子等。在本發明之另一方面中，外來基因不包含供外來基因表現之調節序列。在本發明之再一方面中，外來基因爲寡核誓酸或誘_核酸。、基因導入用載體内所含之核酸，雖以DNA或RNA之核酸分子爲代表，但被導入之核酸分子亦可包含核酸類似物分子基因導入用載體内所含之分子種類可爲單種基因分子’亦可爲複數種基因分子。、在本説明書中，「基因庫」意謂包含從天然單離之核酸序列及合成核酸序列之核酸庫。從天然單離之核酸序列之供給源例如爲眞核生物細胞、原核生物細胞、或來自病毒 (染色體組及cDNA序列，但不限於此等來源。將任意序列（例如信號、標籤等）附加至從天然單離之序列所成之庫耶被包含在本發明之基因庫中。在一實施態樣中，基因庫包含使其中所含核酸序列轉錄及/或轉譯之促進子等序 (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁) 裝

ϋ n ϋ n ϋ 一· 口、K I n ·ϋ ϋ ϋ I ϋ I 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -15 - 13〇3663

發明說明經濟部智慧財產局員工消費合作社印製用在本説明書中，「HVJ」及「仙台病毒」可以交換使病t本％明書中’「HAU」*謂可將G,5%雞紅血球凝集之 ^^性’ 1 HAU相當於約2彻萬個病毒粒子（〇kada，Υ· -Biken Journal 45 209^213, 1961) 〇 (基因治療） -治繚用核酸構築物，可以利用本發明之基因導入用載 :、以局邵或全身万式投與。在此種核酸構築物包含蛋白 :編碼序列之場合中，該蛋白質之表現藉使用内因性哺〒4 ’促進子或異種之促進子而被謗導。該編碼序列之表現可爲構成性或可被調節。口在知本發明I基因導人用載體用於基因治療用組合物之琢口 ’本發明載體之投與，藉將懸浮於pBS (鱗酸緩衝化生理食鹽水）或生理食鹽水之載體懸浮液直接注入局部（例如癌組織内、肝臟内、肌肉内及腦内等)或投與至血管内(例如動脈内、靜脈内及門靜脈内）而達成。在-實施態樣中，基因導入用載體，一般而言藉著將該基因導入用載體，以能以單位用量注入之形態（例如溶液、懸浮液或乳液）與醫藥上容許之載劑（即在所使用之投藥量及濃度下對接受者無毒性，且與配方之其他成分能相容者）混合，可以製成配方。該配方較佳不含氧化劑及其他公知對於基因導入用載體有害之化合物。載劑（carrier)宜包含微量之添加物，如增強等張性及化 -16 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ------------裝--------—訂--------- (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁) 1303663 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 五、發明說明（Μ ) 二女：性，物質。此等物質，在使用之投藥量及濃度下對万;接雙者爲非毒性，其包含緩衝劑諸如磷酸、擰檬酸、琥 =、乙酸及其他有機酸或彼等之鹽；抗氧化劑諸如抗壞二；低*子量（不滿10殘基）多肽（例如聚精胺酸或三 /蛋白質（例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白親水 ,聚合物(例如聚乙烯吡咯啶酮）；胺基酸(例如甘油、榖胺酸、、天冬胺酸或精胺酸）；單糖、雙糖及碳水化合物（包含纖維素或其衍生物、葡萄糖、甘露糖或糊精）；螯合劑(例如EDTA);糖醇（例如甘露醇或山梨醇）；離子（例如鈉）；及/或非離子性界面活性劑（例如聚山梨酸）*pEG。、^基因I入職體之醫藥組合物ϋ溶液貯藏於單位容器或多用量容器（例如密封之安訊或小瓶）中。、本發明尚提供一種醫藥包裝或套組，其包含一個以上裝滿本發明醫藥組合物之一種以上成分之容器，再者，本發明之多肽可與其他治療化合物合用。只包含本發明之基因導入用載體之醫藥組合物，係在考量各患者义臨床狀態（例如應被預防或治療之狀態）、包含基因導入用載體之組合物之送達部位、標的組織、投^ 法、投與計劃及本技藝人士公知之其他因素下，以與實施基準一致之模式處方及投與。因此，在本説明書中，、基因導入用載體之「有效量」或適切投與量藉考慮此項而決定。、舉例言之，將本發明之基因載體投與至小鼠之場合，對於每隻小鼠投與20〜20,000 HAU，較佳6〇〜6 〇〇〇 Ηα^，更 -17 - (請先閱讀背面之注咅？事項再填寫本頁) 裝--------丨訂--------- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4 χ 297公^丁經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1303663 A7 B7 五、發明說明（15) 佳200〜2,000 HAU之基因載體。被投與之基因載體中所含之外來基因之量爲每隻小鼠〇·1〜100/^g，較佳0.3〜30"g，更佳1〜10 # g。又，將本發明之基因載體投與至人類之場合，對於每個被驗者投與400〜400,000 HAU，較佳1，2〇〇〜120,000 HAU，更佳4,000〜40,000 HAU之基因載體。被投與之基因載體中所含之外來基因之量爲每個被驗者2〜2,000 a g，較佳6〜600^ g，更佳20〜200 # g 〇以下之實施例僅爲例示，非意圖限定本發明。實施例 1 .使用凍結融解製備基因導入用載體以及該載體之使用 (實施例1 :藉凍結融解製備HVJ外套膜載體）使用蟲螢光素酶基因做爲外來基因，將重組HVJ病毒凍結融解各種次數後，將基因導入培養細胞中。在TE500 中，將750 " g之蟲螢光素酶表現載體pcOriPLuc (Saeki and Kaneda et al·，Human Gene Therapy，11，471 〜479 (2000))與各種濃度之HVJ病毒混合。將HVJ病毒之濃度調製成10，25，50，100 HAU/"1。將該溶液分割成12份，各藉乾冰保存於4°C使之凍結，然後融解，如此反覆最多達 30次。將完成預定次數之凍結融解後之溶液添加至BHK-21 細胞（24 凹穴，4 X 104 細胞 / 皿，0.5 ml DMEM，10% FCS)之培養基中，於37°C及5% C02下反應20分鐘後，藉 PBS洗淨，添加0.5 ml之新鮮培養液並培養24小時。除去培養基，將1 X細胞培養物溶裂試劑（Promega公司） -18 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -----I ---訂--------- #· 1303663 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 --------B7____ 五、發明說明（16 ) 500 //1加至細胞上並溶解細胞後，移至顯微試管並離心，用Promega蟲螢光素酶測定系統及[以咖丨光度計測足所得上π液2〇 " 1中之蟲螢光素酶活性。對各溶液進次測定，並求其平均値。、、口果如圖1所不。隨著重組HVJ病毒之凍結融解次數增加，蟲t光素酶活性上彳，2〇次滚結融解後所冑察到之蟲螢光素酶表現爲3次凍結融解者之1〇倍以上。從該結以，認在本實施例所用之條件下，重組Hvj病毒之滚結融解次數較佳爲5次以上，更佳爲約15〜2〇次。 (實施例2 :藉凍結融解製備之HVJ外套膜載體之基因導入效率）與^施例1同樣，將重組HVJ病毒凍結融解3〇次後，於添力至很主、、’田胞之病母數爲相同之條件下，調查對細胞之基因導入效率。結果被示於圖2中。在該圖2中，例如χ轴爲5〇〇 hau之場合，病毒濃度爲1〇HAU/;<1之溶液之添加量爲5〇^，而 100HAU/W之溶液之添加量則爲。如該圖2所示，病毒濃度爲10〇HAU/"l之溶液’與該濃度爲1()〜麵AU//zl 之溶液相較，基因表現效率降低約5〇%。從該結果可以確認，在本實施例之條件下，重組病毒濃度以1〇〜5〇hau//H 之範圍爲較佳。又，將重組HVJ病毒凍結融解29次後，進行第川次之凍結，在該凍結狀態保存丨星期後，將其融解並添加至細胞中。結果，該冷柬保存丨星期之重組HVJ病毒與連續進行3〇 -19 - 本紙張尺度適財國國家標準（CNS)A4 (21G X 297公釐)---------------^ Μ--------—tr--------- f讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1303663 A7 厂 _B7 _ 五、發明說明（17 ) 次凍結融解之病毒顯示相同程度之蟲螢光素酶基因表現。 (貫施例3 :使用蟲螢光素酶表現載體之基因導入效率之測定）將蟲螢光素酶表現載體之量做各種改變而製備H VJ外套膜載體，然後調查對寄主細胞之基因導入效率。 HVJ病毒量爲每1 # 1 ΤΕ含50 HAU。蟲螢光素酶表現載體 pcOriPLuc之量爲每 1"1 ΤΕ含 0.05，0.1，0.25，〇.5，υ， 15，2·0，3·0，5·5 //g。最終溶液量做成1〇〇以1並進行2〇次滚結融解後，藉與實施例1相同之方法測定蟲螢光素酶活性。結果如圖3所示。爲外來基因之表現載體pc〇ripLuc (約 9.5 kb)之添加量達1.5 //g之前，表現量呈量依存性地增加。添加量在1.5 yg以上時，表現量大體沒有變化。從以上結果可以確認在本實施例所用之條件下，在基因導入上較佳使用1.5 "g/ W以上之外來基因DNA。 (實施例4 :緩衝液之種類對於基因導入效率之影響）改變在製備HVJ外套膜載體時所用之緩衝液之種類，並調查對宿主細胞之基因導入效率。 HVJ病毒之量爲每1W緩衝液含50 HAU，蟲螢光素酶表現載體pcOriPLuc之量爲i5"g//H。緩衝液爲TE、pBS、

BSS (137 mM NaCl ’ 5.4mM KC1，l〇 Tris-HCl，pH 7.5)，以及使用在此等緩衝液中添加最終濃度爲〇、2〇 mM、40mM、60瘦之蔬糖者。將最終溶液量做成並進行20次柬結融解後，以與實施例i相同之方法測定蟲 -20 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公髮) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝

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經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1303663 五、發明說明（18) 螢光素酶活性。結果如圖4所示。在本實施例所用之條件下，確認供製備重組H VJ病毒用之緩衝液以單獨之te爲較佳。 (實施例5 : AVE(人造病毒外套）型載體與本發明之hvj外套膜載體之比較）將使用先前基因導入用載體：HVJ-微脂粒[基因導入效率最優之 AVE 型（Saeki，Y· et al·，Human Gene 几⑽爪 8, 2133〜2141 (1997))之基因導入與本發明之方法比較。 HVJ-微月曰粒或HVJ病毒之量爲每1 v ιτΕ含50 HAU，蟲榮光素酶表現載體pcOriPLuc之量爲i.5//g/w。又，重組HVJ 病毒之凍結融解次數爲2次或15次。其他條件，除了以人類胎兒腎細胞株HEK293爲宿主細胞以外，與實施例1相同〇結果如圖5所示。將HVJ外套膜載體重覆凍結融解丨5次之本發明方法，在基因導入效率上比使用HVJ-微脂粒之先前方法優異。 (實施例6 :合成寡核甞酸之導入效率）將以FITC (異硫氰酸螢光素）螢光標識之合成寡核嘗酸 (20 bp)以1 mg/ml之濃度與不活性化HVJ病毒混合，將該溶液凍結融解20次後，與BHK-21細胞反應20分鐘。π小時後觀察螢光信號，結果觀察到約100%之細胞之核内集積勞光。從該結果可以確認本發明方法在將合成核酸導入細胞方面亦有效。 (實施例7 : GFP基因之導入效率） -21 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ^--------—tr--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1303663 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（19) 將GFP (綠色螢光蛋白質）基因與不活性化HVJ病毒之混合溶液凍結融解20次後，將2 ng- 5 ^ 1注入大鼠之大腦中。結果’在注入部位觀察到螢光信號。又，將包含gfp基因之HVJ外套膜載體凍結並保存3個月後，注入大鼠之大腦中’在相同注入部位觀察因GFP基因表現所產生之螢光信號。從以上結果可以確認本發明之方法確實能將基因導入身體内。亦可以確認HVJ外套膜載體可以凍結保存。 2 ·使用界面活性劑製備基因導入用載體及該載體之使用 (實施例8 :使用界面活性劑製備不活性化HVj外套膜載體）使用界面活性劑製備不活性化HVJ外套膜載體之方法之概要被示於圖6中。 (1 : HVJ之增殖） HVJ，雖然一般使用經由將種病毒接種於難之受精卵而被增殖者，但利用病毒持續感染猴子及人類等之培養細胞或培養組織而被增殖者，以及使被選殖之病毒染色體組感染培養細胞並使之持續感染而被增殖者，全部可加以利用0 在本實施例中，HVJ之增殖如下述進行：使用SPF (無特殊致病物）之受精卵使hVj之種病毒增殖，並進行分離及精製，將所得之HVJ(Z種）分注於細胞保存用試管中，加入10% DMSO,然後保存於液態氮中。購入剛受精後之難蛋’裝入培育器（SHOWA-FURANKI P-03型；可以收納約300個雞蛋）中，在36.5。〇及溼度爲 -22- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（21〇 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

ϋ ϋ ϋ mmmt _ϋ 1 一 π ·ϋ n I- ·ϋ «ϋ I I I # 1303663 A7 五、發明說明（2〇 ) 4〇〇/。以上之條件下，培育10〜14日。在暗室中，使用檢蛋器（電燈之光從口徑約i.5 cm之窗通過射出者）確認胚之生存以及氣室與漿尿膜，在漿尿膜之約5mm上方用鉛筆記綠病毒注入處所（選定除去大血管之場所）。用多肽溶液（將 10/〇多肽與0.2% NaCl混合’用NaOH將PH値調整至7.2，然後用熱壓詻滅菌，並保存於4°C者）將種病毒（從液態氮取出稀釋500倍，並置於4°C。將難蛋用吡啶甲酸醯胼及醇消毒’在病毒注入處所總計開1000個小孔，將經稀釋之種病毒〇·1 ml用附有26號針之1 ml注射針筒將經稀釋之種病毒〇·1 ml注入漿尿腔内。用經巴斯德滅菌之吸量管將熔化: 石蠟（熔點50〜52。〇置於孔上，以將孔封閉。將蛋放入培 S為中’在36.5C及澄度爲40%以上之條件下彡立育3日。接下來，將接種蛋置於4°C 一夜。翌日，將蛋之氣室部分^ 鑷子弄破，將附有18號針之1〇 ml注射針筒插入漿尿膜中，吸取漿尿液，收集在滅菌瓶中，然後保存於。 (2 : HVJ之精製） HVJ，藉離心精製法、管柱層析精製法或該領域公知之其他精製方法精製。 (2.1 :藉離心之精製方法）簡言之，回收被增殖之病毒，然後以低速離心除去培養液及漿尿液中之組織及細胞碎片。其之上清液藉高速離心 (27,500 x g，30分鐘）以及利用蔗糖密度梯度（3〇〜6〇% 力之超離心（62,800 X g，90分鐘）而予以精製。精製期間，應注意儘可能緩和地處理病毒，以及在fc保存。 -23 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） C請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁)

n I ϋ ϋ I n ϋ 一OJI ϋ ϋ ϋ I ϋ n ·ϋ I #· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1303663 A7 B7 五、發明說明（21) 在本實施例中，具體而言’藉下述方法精製H VJ。

將約100 ml之含HVJ漿尿液（收集含有HVJ之雞蛋之漿尿液並保存於4°C )用廣口吸量管加至2支50 ml之離心試管中 [參照Saeki，Y· and Kaneda，Y·:供輸送基因、寡核苷酸及蛋白質用之經蛋白質修飾之微脂粒’ Cell Biology : A laboratory handbook (第 2 版），J.E. Celis 編（Academic Press Inc·，SanDiego)第4卷，127〜135，1998]，用低速離心機在 3000 rpm下，於4°C離心10分鐘（制動器關掉），然後將蛋之組織片除去。

離心後，將上清液分注於4支3 5 ml之離心試管（高速離心用）中，用角轉子於27,000 g離心30分鐘（加速裝置制動器打開）。除去上清液，對於沉澱，每試管加入約5 ml之BSS (10 mM Tris -HCL (pH 7.5)，137 mM NaCl，5.4 mM KC1 ; 以熱壓器滅菌，保存於4°C)(可以PBS代替BSS)，如此靜置一夜。用廣口吸量管緩慢地吸入及放出以鬆開沉澱並收集於1支試管中，同樣地用角轉子於27,000 g離心30分鐘。除去上清液，在沉澱中加入約10 ml BSS，同樣地於4°C靜置一夜。用廣口吸量管緩慢地吸入及放出以鬆開沉澱，用低速離心機於3000 rpm及4°C離心10分鐘（制動器關掉），以除去未被除淨之组織片及病毒凝集塊。將上清液裝入新的滅菌試管中做爲精製病毒，並於4°C保存。在0· 1 ml該病毒液中加入〇·9 ml BS S，用分光光度計測定 540 nm處之吸收，然後將病毒力價換算成紅血球凝集活性 (HAU)。540 nm之吸收値1相當於約15,〇〇〇 HAU。HAU被認 -24 - 本紙張尺度適用㈣目家鮮(CNS)A4規格(·21〇 X 297公釐） (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁)

ϋ ·ϋ ϋ ϋ n 1_1 一-口、I n 1 l^i 1_1 1 1 I 0 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1303663 A7 B7 五、發明說明（22 ) 爲與融合活性約成比例。又，實際上亦可使用雞紅血球液 (0·5% )測定難紅血球凝集活性（參照動物細胞利用實用化手册，REALIZE INC·(内田、大石、古尺編集），259〜268 頁，1984)。再者’於需要時可以利用蔗糖密度梯度精製HVJ。具體而言’將病毒懸浮液加載在含多層化60%及30%蔗糖溶液 (以熱壓器滅菌）之離心試管中，於62,800 X g進行密度梯度離心120分鐘。離心後，回收在6〇%蔗糖溶液層上見到之帶。將回收之病毒懸浮液在以BSS或PBS做爲外液下，於4。〇進行一夜之透析，以除去蔗糖。在未立即使用之場合，在病毒懸浮液中加入甘油（已用熱壓器滅菌）及〇·5Μ EDTA液 (已用熱壓器滅菌）並使其濃度分別爲1〇%及2〜1〇 mM，繼而於-80°C緩和凍結，最後保存在液態氮中（凍結保存時，可用10 mM DMSO代替甘油及〇·5 M EDTA液）。 (2.2 :藉管柱層析及限外過濾之精製方法）藉S柱層析之精製方法，可以替代藉離心之精製方法，而適用於本發明。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注咅？事項再填寫本頁) 0 簡言之，精製係經由使用分子量去除界限爲5〇,〇〇〇之濾器進行限外過濾而濃縮，以及使用離子交換層析（〇·3μ〜ιμ NaCl)進行溶出而達成。具體而言，在本實施例中，使用下述方法以管柱層析精製 HVJ 〇採集漿尿液後，經80 "m〜10 之膜式濾器過濾。將〇·〇〇6〜〇·〇〇8% BPL (最終濃度）加至漿尿液中（4〇c，1小 -25- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4 π i¥) 1303663 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（23) 時），以使HVJ不活性化。藉著將漿尿液在37°C培育2小時，而使BPL不活性化。藉著使用500 KMWCO (麻薩諸塞州尼德漢郡A/G技術公司）之切線流限外過濾法濃縮約1〇倍。用含50 mM NaCl、 ImM MgCl2、2%甘露醇及20 mM Tris (ρΗ7·5)之溶液做爲緩衝液。根據HAU測定，得到約100%之HVJ回收率之優異結果。使用藉Q瓊脂糖凝膠FF (東京之AMERSHAM-PHARMACIA 生物科技股份有限公司）之管柱層析法（緩衝液：20 mM TrisHCl (ρΗ7·5)、0.2〜1 M NaCl)精製 HVJ。回收率爲 40〜50%以及純度爲99%以上。藉著使用500 KMWCO (A/G技術公司）之切線流限外過濾法將HVJ之溶析份濃縮。 (3 : HVJ之不活性化） HVJ之不活性化爲必要之場合，如下文所記載，藉紫外線照射或烷化劑處理而進行。 (3.1 ··紫外線照射法）取1 ml HVJ懸浮液置於帶蓋玻璃皿中，以99或198毫焦耳 /cm2之量照射。雖然亦可使用伽瑪射線（5〜20 gray)，但是無法完全不活性化。 (3.2 :藉烷化劑處理）在即將使用前，於10 mM KH2P〇4中進行0.01% 0 -丙内酯之製備。在作業過程中保持低溫並極快作業。在剛精製之HVJ懸浮液中添加/?-丙内酯並使其最終濃度 -26- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁) 0 mm— ϋ ·ϋ ϋ ϋ I 一一口、I ϋ ϋ ϋ ϋ ^1 «ϋ .0 1303663 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 五、發明說明（24 ) 爲0·01%、，然後在冰上培育60分鐘。其後，於3rc培育2小時。將其分注於埃潘道爾夫試管中，每試管平均10,000 ΗΑϋ，然後於15，_ rpm離心15分鐘，並將沉殿保存於Κ。亦可按照上述〈不活性化④，不將沉殿保存於H，而是藉如此之界面活性劑處理導入DNA，而做成載體。 (4 ·· HVJ外套膜載體之製備）在保存之HVJ中加入包含2〇〇〜綱⑽卜來基因之溶液9M 並用吸量官使之充分懸浮。該溶液在_ 2〇r下至少可以保存3個月。若與HVJ混合之前，在DNA中添加硫酸魚精蛋白，則表現效率增強2倍以上。將該混合液置於冰上i分鐘，添加“丨〇〇%)之辛基葡萄糖甞並在冰上振搖15秒，然後在冰上靜置45秒。用界面活性劑處理之時間，以丨〜5分鐘爲較佳。辛基葡萄糖誓以外，亦可以使用Trit〇n-Xl00 (第三辛基苯氧基聚乙氧基乙醇）、011八？8(3-[(3-膽醯胺丙基）-二甲基銨]-1_丙磺酸）、 NP-40 (壬基苯氧基聚乙氧基乙醇）等界面活性劑。丁出⑽ X100、NP-40及CHAPS之較佳最終濃度各爲〇 24〜〇 8〇%、· 0.04〜0.12% 及 1.2〜2.0%。添加1 ml冷BSS，立即於15,〇〇〇 rpm離心υ分鐘。在生成之沉殺中添加300 //1之PBS或生理食鹽水等，渦轉並用吸量管使之懸浮。該懸浮液可被直接用於基因導入，亦可保= 於-20°C後再用於基因導入。該HVJ外套膜載體，於保存至少2個月後，仍維持相同程度之基因導入效率。 (實施例9 :在HVJ外套膜載體中F1與HN蛋白質之比率） 27 - 私紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ---------^-------- Φ 1303663 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（25 ) (1 :樣品之製備） (0將相當於10,000 HAU之精製HVJ在15,000 rpm下離心15 分鐘，然後將沉澱懸浮於300/Π之PBS中並保存於-20°C。 (ii) 將相當於10,000 HAU之精製HVJ用紫外線照射（198毫焦耳/cm2)後，在15,000 rpm下離心15分鐘，然後將沉澱懸浮於300/d之PBS中並保存於-20°C。 (iii) 將相當於10,000 HAU之精製HVJ用紫外線照射（198毫焦耳/ cm2)後，在15,000 rpm下離心15分鐘，將200 eg之pcLuci DNA(溶液92//1)加至沉澱中，藉吸量管吸取及放出而使之懸浮。置於冰上，加入8jul之辛基葡萄糖苷（10%)，用手震盪試管15秒，然後靜置於冰上45秒，加入1 ml冷BSS，立刻於15,000 rpm下離心15分鐘後，將其懸浮於300 /H之PBS 中並保存於-20°C。 (2 :蛋白質電泳）在3種樣品之5，10及20^1中加入5倍量之Laemli樣品緩衝液’然後進行10% SDS-聚丙晞醯胺凝膠電泳。電泳終了後’用科麥西藍（Coomassie Blue)染色，脱染色後，將其在赛路纷紙上乾燥。 (3 :蛋白質檢定）電泳’將被染色樣品置於LAS 2000 (東京，富士軟片）中 (圖7)，測定相當於F1及hn之蛋白質帶之濃度。對於每一種樣品’電泳三種不同量，計算出各個之F丨/ HN密度，求得每個樣品之平均値及標準偏差。 (4.結果） -28 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝

—.1 l__i mBW ϋ· n ϋ ΙΒ1 Βϋ ϋ ·ϋ I !3〇3663 A7 五、發明說明（26 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 在⑴，（ii)及（iii)之樣品中，F1/HN之比一致爲約1.7。若考量F1之分子量爲51 kDa，HN之分子量爲約68 kDa，則其莫耳比爲約2·3。在使用F1及HN之再構成微脂粒中融合之最適値，與所謂F1/HN爲約2之報告（Εχρ· Cell Res· 142, 95〜101 ’ 1985)沒有矛盾。在其他研究者報告之某些再構成型中’該比與野生型病毒者相同（j. Virol. 67, 33 12〜33 18, 1993)。其他蛋白質組成在hVj及HVJ外套膜載體中亦大體相同。 (實施例10 : HVJ外套膜載體之DNA封入及封入率） (1 ·· HVJ外套膜載體（DNA封入、未封入）之電子顯微鏡照片）如前述將 pSFV-LacZ (14.5 kb) 130 " g封入 1〇,〇〇〇 HAU之 HVJ (被紫外線不活性化）中，而做成hvj外套膜載體。將封入後之HVJ外套膜載體懸浮於300 /H之PBS中並保存於-20°C。10日後，將i i懸浮液置於栅網上，藉陰性染色法用電子顯微鏡觀察。使用未封入DNA之HVJ外套膜載體做爲對照。 (結果）經濟部智慧財產局員工消費合作社印製將結果示於圖8中。HVJ外套膜載體與曾被觀察之HVJ病毒本身在輪廓上多爲大體同型。與未封入DNA者相較，使用DNA者在HVJ外套膜載體内見到電子密度濃之構造物。另一方面’未封入DNA者，内部透過性高，推定病毒染色體組被破壞或喪失。 (2 : HVJ外套膜載體之〇ΝΑ封入率）如前述將 157"g pCLuci (7.4 kb)封入6,700 HAU之 HVJ (用 -29 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1303663 A7 B7 五、發明說明（27) 紫外線不活性化）中，做成HVJ外套膜載體。將HVJ外套膜載體懸浮於300 /Π之BSS中，用15單位球菌核酸酶、2 mM CaCl2&20#g/ml RNase A於20°C處理30分鐘，然後對1公升 PBS透析（4°C，一夜）。用1% SDS於37°C處理1分鐘。用 500 /il酚及500 氯仿-異戊醇處理，其後用乙醇沉澱。將該沉澱懸浮於100 jul之BSS，然後用分光光度計測定於260 nm及280 nm之吸光率。 (結果）回收率爲85.7%，若換算成HVJ外套膜載體之DNA封入效率，則爲 3.8%。在將 279 //gipcLuci封入 10,000 HAU之 HVJ 之場合，封入效率爲7.2%。從以上可知，10,000 HAU之HVJ之DNA封入效率，在使用辛基葡萄糖茹之場合雖被推定爲約6〜7%，但隨著所用之DNA量，可能多少有些變化。又，已知若使硫酸魚精蛋白與DNA及HVJ外套膜載體共存則導入效率上升，這應是 HVJ外套膜載體之DNA封入效率上升之原因。再者，推定 Triton-X100及NP-40可使封入效率上升約10〜40%。 (實施例11 :藉由HVJ外套膜載體將基因導入細胞内） (1 :基因導入方法）將1，000 HAU份置於埃潘道爾夫試管（30/Π)中，然後加入 5 # 1之硫酸魚精蛋白（1 mg/ml)。交換BHK- 21細胞（前一曰，每凹穴爲200,000個，接種在6個凹穴中）之培養基，在每一個凹穴中添加0.5 ml培養基（10%FCS-DMEM)。在每個凹穴中，添加上述載體（相當於1,000 HAU)與硫酸魚精蛋白 -30 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

· I n ϋ «ϋ ϋ H ϋ^δ,， I n ϋ n ϋ -ϋ ·ϋ I 0 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1303663

五、發明說明（28) 之混合液，將該皿前後左右搖動以使載體與細胞充分混合’然後在培育器中，於37°C及5% C〇2下放置10分鐘。 (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁) 交換培養基，在培育器中，於37t及5% c〇2下放置—夜 (16〜24小時），然後調查基因表現。在蟲螢光素酶 (pcLuci ;具有CMV啓動子之蟲螢光素酶基因）之場合，用〇·5 ml細胞溶裂緩衝液（Pr〇mega&司）溶解細胞。該墙液中之活性用蟲螢光素酶測定套組（Pr〇niega)測定。在綠色螢光蛋白溢（pCMV- GFPE ; Promega)之場合，本身用螢光顯微鏡觀察，在400倍率下觀察5〜8視野，並計算發出螢光細胞之比率。 (2 :在培養細胞中賦予導入效率之條件之檢討）培養細胞使用BHK-21細胞。 (2.1 :在製備HVJ外套膜載體時辛基葡萄糖甞（〇g)之濃度之檢討） (1)在基因導入方法中，加入以下之變更，然後調查辛基葡萄糖苷（OG)之各濃度（製成HVJ外套膜載體時所用〇g 之最終濃度）對於經由HVJ外套膜載體之基因導入之影響： (A) 辛基葡萄糖苷濃度·· 1，2，3% ; 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製製成HVJ外套膜載體時，不活性化hvj藉〇g處理之時間：1分鐘，5分鐘及1 〇分鐘；進行或不進行超音波處理。 (B) 辛基葡萄糖:y：濃度：〇125〜1.25% ; 用於轉染之載體體積·· 1〇#1，100//1。 (C) 辛基葡萄糖:y：濃度：〇.55〜〇 8% ; -31 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 13〇3663

轉染時間：3〇分鐘，一夜（o/N)。將結果示於圖9中。 (2·2 :將基因導入細胞之條件，硫酸魚精蛋白⑽之濃度及處理時間），（1)在基因導入方法中，加入以下之變更，然後調查硫酸魚精蛋白對於經由HVJ外套膜載體之基因導入之影響·· (A) &敗魚精蛋白·· 〇〜" g/mi培養基；轉染時間：20，40，60分鐘。 (B) 硫酸魚精蛋白：〇〜4〇//g/ml培養基；轉染時間：5，1〇，20分鐘。將結果示於圖1 〇中。 (2.3封入HVJ外套膜載體之DNA濃度對於基因表現量之影響） ” (1)在基因導入方法中，加入以下之變更，然後調查實驗所用之DNA量對於經由HVj外套膜載體之基因表現量之影響： (A) DNA量·· 20〜20〇eg 〇將HVJ外套膜載體於-20X：或-80X：保存5日。 (B) DNA 量：180 〜360jug/HVJ 10,000 HAU。將結果示於圖11中。 (2·4:基因導入所使用之HVJ力價對於基因表現量之影響） (1)在基因導入方法中，加入以下之變更，然後調查實驗所用之HVJ力價對於經由HVJ外套膜載體之基因表現量之影響： -32 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) --------—訂-------- 參經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1303663 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（30 ) 使用5,000，10,000及20,000HAU之力價之HVJ製備HVJ外套膜載體，其各個採用相當於250，500，1，000及 2,000HAU之量轉染BHK-21細胞。將結果示於圖12中。 (2·5 : HVJ不活性化條件對於HVJ外套膜載體之基因導入效率之影響） (1)在基因導入方法中，加入以下之變更，然後調查H VJ 之不活性化方法（UV或-丙内酯）對於ΒΗΚ- 21細胞中之蟲螢光素酶基因表現之影響。 (Α)不活性化所用之UV照射量·· 〇〜231毫焦耳/cm2。 (B) HVJ處理所用之A -丙内酯（BPL)之濃度：〇〜0.025%。將結果示於圖13中。 (實施例12 · H VJ外套膜載體對於各種細胞之基因導入）藉實施例11記載之方法將基因導入人類舌部之爲平上皮癌（SAS)中。將結果示於圖14中。基因導入之時，硫酸魚精蛋白濃度以及轉染時之培育時間如圖14所記載者變化，然後根據蟲螢光素酶基因之表現測定基因導入之效率。在進行轉染之條件之範園内，雖然在使用2〇〇/^g/mUt酸魚精蛋白及轉染處理60分鐘之場合基因導入效率最大，但是可以預測若將硫酸魚精蛋白濃度進一步增加，則基因導入效率將進一步增加。藉實施例11記載之方法將基因導入人類大動脈内皮細胞 (HAEC)中。將結果示於圖15中。基因導入之時，硫酸魚精蛋白濃度以及轉染時之培育時間如圖15所記載者變化，然 (請先閱讀背面之注咅？事項再填寫本頁) _ 裝--------丨訂---------# -33 1303663 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（31) 後根據蟲螢光素酶基因之表現測定基因導入之效率。在進行轉染之條件之範園内，雖然在使用丨00 A g/ml硫酸魚精蛋白及轉染處理60分鐘之場合基因導入效率最大，但是可以預測若將硫酸魚精蛋白濃度進一步增加，則基因導入效率將進一步增加。 (實施例13 : HVJ外套膜載體對於各種身體組織之基因導入）在本實施例中，例示使用實施例丨丨記載之H Vj外套膜載體對於各種身體組織之基因導入。 (13.1 :小鼠肝臟） HVJ外套膜載體，藉將〇·8%辛基葡萄糖苷及2〇〇"g之 pcLuci置於冰上1分鐘，然後懸浮於3〇〇wi 1>6§而製備。將製得之懸浮液之1/ 10量（相當於1，000 HAU)(3〇/^)用7〇Αί1 之PBS稀釋（全量1〇〇 "1)，然後注入小鼠（C57BL/6)之肝臟之一葉中。 HVJ-AVE (人造病毒外套）微脂粒，藉著使用2〇〇/^之 pcLuci並渦轉/排出，然後進行蔗糖梯度離心（62,〇〇〇 g，9〇分鐘）而製備。接下來，將該製備物離心（27,〇〇〇 g，3〇分鐘）及做成小丸，然後懸浮於500 〆1之PBS中。將loo〆1之該樣品注入小鼠（C57BL/6)肝臟之一葉中。 24小時後，單離被注入之肝臟葉，然後用pr〇mega公司之蟲螢光素酶測定系統測定該葉之蟲螢光素酶活性。將結果示於圖16A中。從該結果可以明白，本發明之hvj外套膜載體，與以前之HVJ-AVE微脂粒相較，顯示約高2倍之基因導入效率。 -34 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁) π裝

In··· — — 一口、 1.— 1 I 1_1 11 1^ I 參 A7

1303663 五、發明說明（32 ) (13.2小鼠子宮） X” 3相同之方法製備HVJ外套膜裁體。將及⑽^ 之樣品用卿稀釋成_小’然後注人小鼠之輸卵管，並將子客頸結紮10分鐘。24小時後’將小鼠子宮頸單離，用 promega公司之蟲螢光素酶測定系統測定該子宮之蟲榮光素酶活性。將結果示於圖16中。藉著本發明之HVJ外套膜載體，可以將基因導人小鼠子宮，但是藉著先前使用HVJ- AVE微脂粒（万法，無法觀察到對於子宮組織有可檢出程度之基因導入。，含有pcLuci之HVJ外套膜載體以與131同樣之方法製備。爲了 LacZ之表現，含有pEB_CMV-LacZ (13处）之hvj外套膜載體藉由使用200 ^ g質體而製備。將此等，外套膜載體如上述注入子宮中。將結果藉著LacZ染色，主要在子宮内膜之腺上皮上檢測出。^基因之表現。 (13.3 :大鼠腦）以與上文記載之製備含pcLuci之HVJ外套膜載體之相同方法，製備含有pEGFP-Ι (將水母之綠色螢光蛋白質基因（約 0·7 kb)插入具巨細胞病毒啓動子之表現載體而得之載體，購自加州帕羅奥圖之Clontech公司）之HVJ外套膜載體。將 30 β 1載體（爲製備物之1/1〇，相當於！，〇〇〇 hau)經由頭動脈注入或經由小腦延髓池注入髓腔内，而投與至sd大氣 (Spraque-Dawley大鼠）中。於基因導入後3〜4日，屠殺大鼠’製備未固定化之腦切片，然後於螢光顯微鏡下觀察榮 -35 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) Γ裝 —訂---------. 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1303663 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（33) 光。如圖16D所示之結果，在經由頸動脈注入及經由小腦延髓池注入髓腔内之任一場合，在腦内觀察到綠色螢光蛋白質（GFP)之表現。相對於此，在使用HVJ-AVE微脂粒同樣進行經由大鼠頸動脈之基因導入之場合，在腦内未觀察到GFP表現。(13.4 :兔眼）將爲人類HGF (肝細胞增殖因子）基因之突變體之NK4 cDNA (1.4 kb)選殖入pCDNA3 (加州聖地牙哥市之In Vitrogen公司）之Hind ΙΙΙ/XbaI部位所得之pCMV-NK4，係從大阪大學醫學系研究所之中村敏一敎授分讓而得。除了使用 400 βg或 800 βg之pCMV-NK4以及 10,000HAU之不活性化HVJ以外，以與上文記載之製備含pcLuci之HVJ外套膜載體之相同方法，製備HVJ外套膜載體。pCMV-NK4 爲表現變異型HGF之載體，該變異型HGF會抑制HGF機能。將50 β 1載體（製備物之1 / 6)注入兔之角膜組織中，該角膜組織曾用會謗導新血管形成之重組VEGF小丸處理。放置7日後，將兔子屠殺，並觀察眼中之新血管形成。將結果示於圖16Ε中。pCMV-NK4能體積依存性地抑制被 VEGF謗導之血管新生。 (13.5 :大鼠肺動脈）以與上文記載之製備含pcLuci之HVJ外套膜載體之相同方法，製備含有pSV- LacZ (威斯康辛州麥迪遜市之proinega公司）之HVJ外套膜載體，該pSV-LacZ具有在SV40啓動子控制下之LacZ基因。將50/d載體（製備物之1/6)注入大鼠之氣 -36 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) Γ裝 ϋ I n I^0JI I 蜃參 1303663 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（34) 管中。基因導入3日後，屠殺大鼠，將組織用1%戊二醛固定化’然後用X-gal將動脈中之LacZ之表現可見化。將結果示於圖16F中。在支氣管上皮上見到Lacz染色。又，從肺動脈導入HVJ外套膜載體之時，在支氣管上皮上見到基因表現（未將數據TF出）。 (實施例14 :病毒外套膜載體做爲藥物輸送系統（Dds)之機能）本發明之基因導入用載體在做爲供寡核苷酸或謗餌核酸治療用之藥物輸送系統上亦有用。 (14.1:螢光標識之寡核甞酸之導入）使用本發明之病毒外套膜載體將螢光標識之寡核苷酸導入細胞中。將5’以FITC標識之寡核茫酸（20聚物）（5，-CCTTGAA GGGATTTCCCTCC-3，）194"g/92；ul BSS 與 1〇,〇〇〇 HAU 之 HVJ (用紫外線198毫焦耳/cm2不活性化）之沉澱混合，添加 TritonX-l〇〇 (最終濃度爲0.24%)，在冰上處理1分鐘，加入 1 ml之BSS，然後離心（15,〇〇〇 rpm，15分鐘，4X：)。在沉澱中加入100"1之PBS並於·2〇Ό保存。1個月後融解，將10/Π 份與5 之硫酸魚精蛋白混合，然後與5〇〇萬個βηΚ-21細胞（0.5 ml培養基）一起培育（1〇分鐘及60分鐘）。在導入之翌曰，用螢光顯微鏡觀察細胞之螢光，如圖17B所示，在培育1 〇分鐘之場合，寡核：¾:酸導入效率雖爲約丨〇%，但如圖 17A所示，在培育60分鐘之場合，8〇%以上之細胞被導入寡核棼酸。 -37 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) Γ裝

ϋ n i__i n I 一口，I ϋ n ϋ >ϋ ϋ iai I 參 1303663 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（35 ) (14.2 :藉Stat 6謗餌核酸治療接觸性皮膚炎）使用本發明之病毒外套膜載體將謗I耳核酸導入細胞中。將具有Stat 6之DNA結合序列之雙股核酸[5’-GATCAAGACC TTTTCCCAAGAATCTAT- 3* 及 3，- CATGTTCTGGAAAAGGGT TCTTAGATA-5f (Wang? LH et al. ： Blood 95，1249〜1257, 2000)] 250 #g/300 /H BSS與 30,000 HAU之 HVJ(用紫夕卜線 99 毫焦耳/cm2不活性化）之沉澱混合，添加TritonX- 100 (最終濃度爲0.24%)，在冰上處理1分鐘，加入1 ml之BSS，然後離心（15,000 rpm，15分鐘，4°C )。在沉澱中加入300 // 1之 PBS並於-20°C保存。將該HVJ外套膜載體注入大鼠皮下時，會抑制IgE謗發之過敏及延遲型皮膚反應。 (實施例I5 :對於浮游系細胞之基因導入）進行以人類白血病細胞系CCRF-CEM、NALM· 6及K-562 爲對象之基因導入實驗。將pCMV-蟲螢光素酶200/^g (92/Π)與10,000 HAU之不活性化HVJ (用紫外線99毫焦耳/cm2不活性化）之沉澱混合，添加TritonX· 100 (最終濃度爲0.24%)，在冰上處理1分鐘，加入1 ml之BSS，然後離心（15,000 rpm，15分鐘，4°C )。在沉澱中加入300 /Π之PBS而製得HVJ外套膜載體。將該載體 60//1 (相當於2,000 HAU)，硫酸魚精蛋白及400萬個浮游細胞在1.5 ml之埃潘道爾夫試管中混合，然後於10,000〜 15,000 rpm及20°C離心10分鐘。之後，在沉澱中加入培養液，然後移至培養皿，並於1日後測定細胞之蟲螢光素酶活性。 -38- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 了I 0 I n -1 n I 一一口、I 1^ ϋ n «ϋ n ϋ 参 1303663 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 ___ B7_____ 五、發明說明（36 ) 所用之細胞株雖然爲在使用HVJ-微脂粒及現有微脂粒試藥[Gibco BRL之脂質泛可停（Lipofectin)、月旨質泛可停胺 (Lipofetamine)等]之場合導入效率極低之細胞株（尤其是 CCRF- CEM、NALM- 6)，但如圖18所示，當使用本發明之載體時，觀察到對此等細胞之高效率基因導入。較佳之基因導入條件爲添加硫酸魚精蛋白6 〇〇〜1，〇〇〇 "g/ml ’ 以及在 10,000 rpm或 15,000 rpm、20°C 下離心 10 分鐘。未曾見到HVJ外套膜載體引起有意義的細胞毒性。又，離心以及添加硫酸魚精蛋白二者爲基因導入所必需。 (實施例16 :對癌組織之基因導入）將pCMV-蟲螢光素酶354 //g (92 "1)與34,000 HAU之不活性化HVJ (用紫外線99毫焦耳/ cm2不活性化）之沉澱混合，添加TritonX-100 (最終濃度爲0.24%)，在冰上處理1分鐘，加入11111之688，然後離心（1〇,〇00〜15,〇〇〇卬111，1〇分鐘， 20°C)。在沉澱中加入300 " 1之PBS並保存於_2〇°C。1日後’與石；敗魚精蛋白5 00 g/ m 1或10〇〇 " g/ m 1混合，將其之 100注入小鼠黑色素瘤B16-F1之腫瘤塊（直徑7〜8 mm)中， 1曰後，測定蟲螢光素酶活性。如圖丨9所示，在腫瘤塊中可見到基因表現。較佳之硫酸魚精蛋白濃度爲5〇〇 " g/ m卜但是，硫酸魚精蛋白濃度比該濃度低時，無法檢測出基因表現。 (實施例17 :疱疹病毒外套膜載體之製備） (Π.1 :不活性病毒之製備） 1型單疱疹病毒（HSV- 1)(101°溶斑形成單位/ml)由大阪大 -39 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注咅？事項再填寫本頁) 裝參 13 03 _6)3[)102208號專利申請案中文說明書替換頁(93年1月）五、發明説明（） A7 B7

學醫學系研究所細菌學講座之山西教授提供。該病毒之去活化條件利用在培養猿猴細胞（Vero細胞）中病毒溶斑之形成而檢討。在用0.05%冷-丙内酯（BPL)將病毒不活性化之場合，Vero細胞中溶斑出現之頻率為9.1 X 10_4 (溶斑/Vero 細胞）。另一方面，用紫外線200及400毫焦耳/cm2照射將病毒不活性化之場合，溶斑出現之頻率各為4·3 X 10_ 4及2.2 X 10""5 (溶斑 / Ver〇細胞）。 (17.2:用不活性化病毒進行之基因導入）將100/zl之HSV_1 (109粒子）用620 //1之PBS稀釋後，以紫外線400毫焦耳/cm2照射，將其之10%量（72 //1)與DNA (pCMV-蟲螢光素酶8.83 /zg/ /zl)混合，在冰上添加3% Triton-ΧΙΟΟ 1 (最終濃度為 0.24%)，於其後1，2，3， 4，5及6分鐘，添加1 ml之PBS並稀釋。將各樣品100//1導入 BHK-21細胞中（ό凹穴平皿中）。將細胞在含10%牛胎血清 (FCS)之杜百可氏最少必需培養基（0.5 ml/凹穴）中培養。又，在另一實驗中，將各樣品100//1與硫酸魚精蛋白5 混合後，導入BHK-21細胞中。將其放置在37°C、5%C02之培育器中60分鐘後，將培養液用10% FCS_DME交換。22小時後，測定蟲螢光素酶活性。如圖20所示，確認藉著使用本發明方法製備之單疱疹病毒外套膜載體，可以獲得高效率之基因導入。藉形態學觀察，各樣品皆未被見到細胞毒性。接下來將用Triton-XI00處理5分鐘之單疱疹病毒外套膜載體在-80 °C保存2日後，予以解凍，然後再度添加至本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1303663 Α7 Β7 五、發明說明（38) BHK- 21細胞並測定導入效率。這回導入6〇分鐘後，加入 10% FCS-DME (2.5 ml/凹穴），然後培養一夜並測定活性。檢討血清之影響及載體量。如圖21所示，即使於· 80。〇保存2日後，仍可確認有高效率之基因導入。使用添加1〇〇/0血清之培養基者在導入效率上比使用無血清培養基者高，200 W載體溶液（推定量：2.8 X 1〇7病毒粒子/凹穴）之基因導入活性比1〇〇 W溶液（推定量：1·4 X 107病毒粒子/凹穴）者高。 (17·3 :使用不活性化病毒之基因導入）經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注咅3事項再填寫本頁) 如上文所揭示者，本技藝人士當知使用該界面活性劑做成外套膜載體之技術不僅適用於HVJ，亦可適用於有脂質膜之廣义外套膜病毒。因此，本技藝人士，依照本發明之揭不’將可使用其他外套膜病毒，輕易地製備基因導入用外套膜載體。所以可以做成反錄病毒科、披膜病毒科、冠狀病毒科、黃病毒科、副黏液病毒科、正黏液病毒科、本，病毒（Bunyavirus)科、狂犬病毒科、痘病毒科、疱疹病毒科、桿狀病毒科及肝脱氧核糖核酸病毒科之病毒之外套膜載體。藉著彼等，可以利用病毒具有之組織指向性而實現對特定咨官之標的導入。舉例言之，單疱疹病毒之外套膜，體可以做爲神經指向性載體，EB病毒（伯基特淋巴瘤病毒t之外套膜載體可做爲B淋巴球指向性載體，以及流行性感冒病毒之外套膜載體可做爲呼吸器官指向性載體。攸上述可以明白，本發明之特定實施態樣係以例示之目的而被圮載在本説明書中，本技藝人士可在不偏離本發明 ___ -41 - G張尺度剌㈣iii^s)A4規格⑽χ撕公着)--- 13 0¾¾簡G8號專利申請案中文說明書替換頁(93年！月）五、發明説明（ /m 1匕替換頁 39 2意圖及範園下進行各種改變。具體而言，本說明書之眘 :例f ^係記載有關使用不活性化Η V J之基因導：用二，本技蟄人士從本說明書之揭示，當能製： :㈣以外之病毒不活性化及製備本發明之基 = =以及在不進行去活化步驟下製備本發明之基因導入= 限^ 本發明不受隨附之中請專利範圍以外之部分產業上之利用可能性本發明提供一種操作簡便，但基因導基因導入方法。藉此，基因庫之迅速筛選變成二能= 頁 f供=包含本發明之病毒外套膜載體之高通量篩選^套 =，者’本申請案提供之病毒外套膜載體可以長時間滚 ~保存’同時由於沒有要事製備之必要’因而作業步驟大中=簡化’而可以藉導入載體之大量製備，獲得均質之基因 ::。更且，本發明之基因導入用載體與先前以hvj為基礎製備之載體相較’可以得到較高效率之基因導入，而且可將基因導人比先前方法更廣範圍之身體組織内。 —本發明亦提供一種包含本發明之基因導入用載體以供醫樂品投與之藥物輸送系統，藥物之篩選系統以及基因治療用載體。 ‘ 42 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐）

Claims

丫 ά/η

13 03祕&01〇22〇8號專利中請案 AS 中文申請專利範圍替換本(97年i月）六、申請專利範園 1. 一種仙台病4 (Ηνη之去活化病毒外套膜，其係由病毒本體精製分離出，且作為融合活性所必需之病毒蛋白質之F1蛋白質/HN蛋白質之含有比率與野生型病毒相同。 2·如申請專利冑圍第！項之去活化病毒外套膜，纟未與脂小體融合。 3.如申請專利範圍第丨項之去活化病毒外套膜，其中上述 Η V J為野生型或重組型。 4·如申請專利範圍第2項之去活化病毒外套膜，其中上述 H V J為野生型或重組型。 5.如申請專利範圍第丨至4項中任一項之去活化病毒外套膜’其中上述去活性化係藉由照射紫外線或以烷化劑處理而達成。 6·如申請專利範圍第1至4項中任一項之去活化病毒外套膜，其係上述HVJ於精製後，藉由照射 3 3〜19 8m J/Cm2之紫外線後再進行離心分離而調製者。 7·如申請專利範圍第1至4項中任一項之去活化病毒外套膜，其係上述HVJ於精製後，藉由照射 3 3〜16 5m J/cm2之紫外線後再進行離心分離而調製者。 8·如申請專利範圍第1至4項中任一項之去活化病毒外套膜’其係將精製Η V J以燒化劑處理後再進行離心分離者。 69164-970114.doc 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210 X 297公釐) 1303663 - C8 D8 六、申請專利範園其中烷化其中β-丙其中β -丙 9. 如申請專利範圍第8項之去活化病毒外套膜劑係β -丙内酿。 10. 如申請專利範圍第9項之去活化病毒外套膜内酯之處理濃度為0 · 0 0 2 5〜0 · 0 2 5 %。 11. 如申請專利範圍第9項之去活化病毒外套膜内酯之處理濃度為0.0 0 7 5〜0 · 0 2 5 %。 69164-970114.doc -2- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210 X 297公釐)