JPWO2004035779A1 - ウイルスエンベロープを用いた生体分子の導入方法ならびにそのための組成物およびシステム - Google Patents
ウイルスエンベロープを用いた生体分子の導入方法ならびにそのための組成物およびシステム Download PDFInfo
- Publication number
- JPWO2004035779A1 JPWO2004035779A1 JP2004544733A JP2004544733A JPWO2004035779A1 JP WO2004035779 A1 JPWO2004035779 A1 JP WO2004035779A1 JP 2004544733 A JP2004544733 A JP 2004544733A JP 2004544733 A JP2004544733 A JP 2004544733A JP WO2004035779 A1 JPWO2004035779 A1 JP WO2004035779A1
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- biomolecule
- kit
- glycosaminoglycan
- viral envelope
- envelope
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 137
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 94
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims description 49
- 229920002683 Glycosaminoglycan Polymers 0.000 claims abstract description 93
- 210000004779 membrane envelope Anatomy 0.000 claims abstract description 79
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 claims abstract description 68
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 claims abstract description 45
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 144
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 91
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 68
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 64
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 claims description 63
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 claims description 62
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 61
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 55
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 55
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 51
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 47
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 33
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 31
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 29
- 210000001715 carotid artery Anatomy 0.000 claims description 27
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 claims description 22
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 claims description 22
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 claims description 22
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 claims description 22
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 claims description 22
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 claims description 22
- 210000003657 middle cerebral artery Anatomy 0.000 claims description 20
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 claims description 17
- 230000019635 sulfation Effects 0.000 claims description 14
- 238000005670 sulfation reaction Methods 0.000 claims description 14
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 claims description 13
- 210000001103 thalamus Anatomy 0.000 claims description 13
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims description 12
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 11
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 claims description 11
- 238000007914 intraventricular administration Methods 0.000 claims description 10
- 102100021866 Hepatocyte growth factor Human genes 0.000 claims 4
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 abstract description 23
- 238000002716 delivery method Methods 0.000 abstract description 5
- 210000000133 brain stem Anatomy 0.000 abstract description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 54
- 241000711408 Murine respirovirus Species 0.000 description 51
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 50
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 50
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 42
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 35
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 34
- YMHOBZXQZVXHBM-UHFFFAOYSA-N 2,5-dimethoxy-4-bromophenethylamine Chemical compound COC1=CC(CCN)=C(OC)C=C1Br YMHOBZXQZVXHBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 30
- 241000545067 Venus Species 0.000 description 30
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 30
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 29
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 25
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 24
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 23
- 210000003128 head Anatomy 0.000 description 23
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 22
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 22
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 21
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 21
- 102000003745 Hepatocyte Growth Factor Human genes 0.000 description 20
- 108090000100 Hepatocyte Growth Factor Proteins 0.000 description 20
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 19
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 19
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 18
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 18
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 17
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 17
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 17
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 17
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 17
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 16
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 16
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 description 15
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 15
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 14
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 14
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 14
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 13
- 210000001168 carotid artery common Anatomy 0.000 description 12
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 12
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 11
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 11
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 10
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 10
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 10
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 10
- -1 phosphate ester Chemical class 0.000 description 10
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 9
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 9
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 8
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 8
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 8
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 8
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 8
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 8
- SQDAZGGFXASXDW-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-2-(trifluoromethoxy)pyridine Chemical compound FC(F)(F)OC1=CC=C(Br)C=N1 SQDAZGGFXASXDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 229920002971 Heparan sulfate Polymers 0.000 description 7
- 101001092197 Homo sapiens RNA binding protein fox-1 homolog 3 Proteins 0.000 description 7
- 102100035530 RNA binding protein fox-1 homolog 3 Human genes 0.000 description 7
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 7
- 230000009471 action Effects 0.000 description 7
- 229940100198 alkylating agent Drugs 0.000 description 7
- 239000002168 alkylating agent Substances 0.000 description 7
- 206010008118 cerebral infarction Diseases 0.000 description 7
- 230000006870 function Effects 0.000 description 7
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 7
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 7
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 7
- 210000003140 lateral ventricle Anatomy 0.000 description 7
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 7
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 7
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 7
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 7
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 7
- MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N 2-Amino-2-Deoxy-Hexose Chemical compound NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 6
- 201000006474 Brain Ischemia Diseases 0.000 description 6
- 206010008089 Cerebral artery occlusion Diseases 0.000 description 6
- 206010008120 Cerebral ischaemia Diseases 0.000 description 6
- 229920001287 Chondroitin sulfate Polymers 0.000 description 6
- AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N Glycolic acid Chemical compound OCC(O)=O AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 6
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 6
- 230000008499 blood brain barrier function Effects 0.000 description 6
- 210000001218 blood-brain barrier Anatomy 0.000 description 6
- 229940059329 chondroitin sulfate Drugs 0.000 description 6
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 6
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 6
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 6
- 239000003055 low molecular weight heparin Substances 0.000 description 6
- 229940127215 low-molecular weight heparin Drugs 0.000 description 6
- 201000007309 middle cerebral artery infarction Diseases 0.000 description 6
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 6
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 6
- 101710193519 Glial fibrillary acidic protein Proteins 0.000 description 5
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 5
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N Lactic Acid Natural products CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 5
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 description 5
- 230000029936 alkylation Effects 0.000 description 5
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 5
- 239000002585 base Substances 0.000 description 5
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 5
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 5
- 210000000269 carotid artery external Anatomy 0.000 description 5
- 210000004004 carotid artery internal Anatomy 0.000 description 5
- 210000002987 choroid plexus Anatomy 0.000 description 5
- 210000003618 cortical neuron Anatomy 0.000 description 5
- 239000008298 dragée Substances 0.000 description 5
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 5
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 5
- 210000005046 glial fibrillary acidic protein Anatomy 0.000 description 5
- 241000411851 herbal medicine Species 0.000 description 5
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 5
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 5
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 5
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 230000002861 ventricular Effects 0.000 description 5
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 4
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 4
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 4
- 102100039289 Glial fibrillary acidic protein Human genes 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 4
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 4
- KXNPVXPOPUZYGB-XYVMCAHJSA-N argatroban Chemical compound OC(=O)[C@H]1C[C@H](C)CCN1C(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NS(=O)(=O)C1=CC=CC2=C1NC[C@H](C)C2 KXNPVXPOPUZYGB-XYVMCAHJSA-N 0.000 description 4
- 229960003856 argatroban Drugs 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- AVJBPWGFOQAPRH-FWMKGIEWSA-L dermatan sulfate Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@H](OS([O-])(=O)=O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](C([O-])=O)O1 AVJBPWGFOQAPRH-FWMKGIEWSA-L 0.000 description 4
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 4
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 4
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 4
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 4
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 4
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 4
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 description 4
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 210000003625 skull Anatomy 0.000 description 4
- 210000002330 subarachnoid space Anatomy 0.000 description 4
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 description 4
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 4
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 4
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 4
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 4
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 4
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 description 4
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 description 3
- MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 2-amino-2-deoxy-D-glucopyranose Chemical compound N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 0.000 description 3
- 208000014644 Brain disease Diseases 0.000 description 3
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 3
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 3
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 3
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 3
- 229920000045 Dermatan sulfate Polymers 0.000 description 3
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 3
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 3
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 3
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 3
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- VEZXCJBBBCKRPI-UHFFFAOYSA-N beta-propiolactone Chemical compound O=C1CCO1 VEZXCJBBBCKRPI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 210000001627 cerebral artery Anatomy 0.000 description 3
- 210000003710 cerebral cortex Anatomy 0.000 description 3
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 3
- 208000026106 cerebrovascular disease Diseases 0.000 description 3
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 3
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 3
- 210000003703 cisterna magna Anatomy 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 229940051593 dermatan sulfate Drugs 0.000 description 3
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 3
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 3
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 3
- 239000004083 gastrointestinal agent Substances 0.000 description 3
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 3
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 3
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 3
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 3
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 3
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 3
- 231100001039 immunological change Toxicity 0.000 description 3
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 3
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 3
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 210000002418 meninge Anatomy 0.000 description 3
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 3
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 3
- 230000000394 mitotic effect Effects 0.000 description 3
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 3
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 3
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 3
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 3
- 229960000380 propiolactone Drugs 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- 230000010410 reperfusion Effects 0.000 description 3
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 3
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 3
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 3
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 3
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 3
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 3
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L sulfate group Chemical group S(=O)(=O)([O-])[O-] QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 3
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 3
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 3
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 3
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 3
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 3
- GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N (±)-α-Tocopherol Chemical compound OC1=C(C)C(C)=C2OC(CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YEJRWHAVMIAJKC-UHFFFAOYSA-N 4-Butyrolactone Chemical compound O=C1CCCO1 YEJRWHAVMIAJKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000215068 Acacia senegal Species 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- 108090000715 Brain-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 description 2
- 102000004219 Brain-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 description 2
- 101100170173 Caenorhabditis elegans del-1 gene Proteins 0.000 description 2
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 2
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 2
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 description 2
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 2
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000084 Gum arabic Polymers 0.000 description 2
- 102100032742 Histone-lysine N-methyltransferase SETD2 Human genes 0.000 description 2
- 101000654725 Homo sapiens Histone-lysine N-methyltransferase SETD2 Proteins 0.000 description 2
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 description 2
- 229920000288 Keratan sulfate Polymers 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 2
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 2
- 102000015336 Nerve Growth Factor Human genes 0.000 description 2
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 2
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 241000711504 Paramyxoviridae Species 0.000 description 2
- 208000037581 Persistent Infection Diseases 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 2
- 241000700157 Rattus norvegicus Species 0.000 description 2
- 208000035415 Reinfection Diseases 0.000 description 2
- 102000019197 Superoxide Dismutase Human genes 0.000 description 2
- 108010012715 Superoxide dismutase Proteins 0.000 description 2
- 102000003978 Tissue Plasminogen Activator Human genes 0.000 description 2
- 108090000373 Tissue Plasminogen Activator Proteins 0.000 description 2
- GWEVSGVZZGPLCZ-UHFFFAOYSA-N Titan oxide Chemical compound O=[Ti]=O GWEVSGVZZGPLCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000010489 acacia gum Nutrition 0.000 description 2
- 239000000205 acacia gum Substances 0.000 description 2
- DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal;sodium Chemical compound [Na].CC(O)=O.OCC(O)C(O)C(O)C(O)C=O DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 2
- 230000002491 angiogenic effect Effects 0.000 description 2
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000000954 anitussive effect Effects 0.000 description 2
- 230000002424 anti-apoptotic effect Effects 0.000 description 2
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 2
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 2
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 2
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 2
- 239000003908 antipruritic agent Substances 0.000 description 2
- 229940124584 antitussives Drugs 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 2
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 239000000560 biocompatible material Substances 0.000 description 2
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 2
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 2
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 2
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- GZUXJHMPEANEGY-UHFFFAOYSA-N bromomethane Chemical compound BrC GZUXJHMPEANEGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 2
- 239000002327 cardiovascular agent Substances 0.000 description 2
- 229940125692 cardiovascular agent Drugs 0.000 description 2
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 2
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 2
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 238000011260 co-administration Methods 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000001054 cortical effect Effects 0.000 description 2
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 2
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 210000000219 ependymocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 description 2
- 239000003172 expectorant agent Substances 0.000 description 2
- 230000003419 expectorant effect Effects 0.000 description 2
- 229940066493 expectorants Drugs 0.000 description 2
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 2
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 2
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 2
- 229940127227 gastrointestinal drug Drugs 0.000 description 2
- 239000007903 gelatin capsule Substances 0.000 description 2
- 238000012637 gene transfection Methods 0.000 description 2
- 229960002442 glucosamine Drugs 0.000 description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 2
- 238000007490 hematoxylin and eosin (H&E) staining Methods 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 238000000185 intracerebroventricular administration Methods 0.000 description 2
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 2
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- KXCLCNHUUKTANI-RBIYJLQWSA-N keratan Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@H](COS(O)(=O)=O)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@H](O[C@@H](O[C@H]3[C@H]([C@@H](COS(O)(=O)=O)O[C@@H](O)[C@@H]3O)O)[C@H](NC(C)=O)[C@H]2O)COS(O)(=O)=O)O[C@H](COS(O)(=O)=O)[C@@H]1O KXCLCNHUUKTANI-RBIYJLQWSA-N 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 2
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 2
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 2
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 2
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 2
- 229940053128 nerve growth factor Drugs 0.000 description 2
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003791 organic solvent mixture Substances 0.000 description 2
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 2
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 2
- 150000004804 polysaccharides Chemical class 0.000 description 2
- 229920001296 polysiloxane Polymers 0.000 description 2
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 2
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 2
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 2
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 235000019812 sodium carboxymethyl cellulose Nutrition 0.000 description 2
- 229920001027 sodium carboxymethylcellulose Polymers 0.000 description 2
- 239000007901 soft capsule Substances 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 2
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 2
- 239000000021 stimulant Substances 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N sulfuric acid group Chemical group S(O)(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 2
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 2
- 239000000454 talc Substances 0.000 description 2
- 229910052623 talc Inorganic materials 0.000 description 2
- 229960000187 tissue plasminogen activator Drugs 0.000 description 2
- 235000015961 tonic Nutrition 0.000 description 2
- 230000001256 tonic effect Effects 0.000 description 2
- 229960000716 tonics Drugs 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 2
- LNAZSHAWQACDHT-XIYTZBAFSA-N (2r,3r,4s,5r,6s)-4,5-dimethoxy-2-(methoxymethyl)-3-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3,4,5-trimethoxy-6-(methoxymethyl)oxan-2-yl]oxy-6-[(2r,3r,4s,5r,6r)-4,5,6-trimethoxy-2-(methoxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxane Chemical compound CO[C@@H]1[C@@H](OC)[C@H](OC)[C@@H](COC)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](OC)[C@@H](OC)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](OC)[C@H](OC)O[C@@H]2COC)OC)O[C@@H]1COC LNAZSHAWQACDHT-XIYTZBAFSA-N 0.000 description 1
- AIEZTKLTLCMZIA-CZSXTPSTSA-N (2r,4r)-1-[(2s)-5-(diaminomethylideneamino)-2-[(3-methyl-1,2,3,4-tetrahydroquinolin-8-yl)sulfonylamino]pentanoyl]-4-methylpiperidine-2-carboxylic acid;hydrate Chemical compound O.OC(=O)[C@H]1C[C@H](C)CCN1C(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NS(=O)(=O)C1=CC=CC2=C1NCC(C)C2 AIEZTKLTLCMZIA-CZSXTPSTSA-N 0.000 description 1
- ATCFYQUZTYQTJN-AXDSSHIGSA-N (2s)-2-amino-4-benzylpentanedioic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 ATCFYQUZTYQTJN-AXDSSHIGSA-N 0.000 description 1
- BJEPYKJPYRNKOW-REOHCLBHSA-N (S)-malic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CYNYIHKIEHGYOZ-UHFFFAOYSA-N 1-bromopropane Chemical compound CCCBr CYNYIHKIEHGYOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-2,4-dioxo-1,3-diazinane-5-carboximidamide Chemical compound CN1CC(C(N)=N)C(=O)NC1=O IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 description 1
- FPIPGXGPPPQFEQ-UHFFFAOYSA-N 13-cis retinol Natural products OCC=C(C)C=CC=C(C)C=CC1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MSWZFWKMSRAUBD-GASJEMHNSA-N 2-amino-2-deoxy-D-galactopyranose Chemical compound N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- SJZRECIVHVDYJC-UHFFFAOYSA-N 4-hydroxybutyric acid Chemical compound OCCCC(O)=O SJZRECIVHVDYJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical class N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013607 AAV vector Substances 0.000 description 1
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 102100021569 Apoptosis regulator Bcl-2 Human genes 0.000 description 1
- 208000031104 Arterial Occlusive disease Diseases 0.000 description 1
- 241000416162 Astragalus gummifer Species 0.000 description 1
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 241000701412 Baculoviridae Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 101100008047 Caenorhabditis elegans cut-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100297347 Caenorhabditis elegans pgl-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000055006 Calcitonin Human genes 0.000 description 1
- 108060001064 Calcitonin Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 206010048964 Carotid artery occlusion Diseases 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 206010010904 Convulsion Diseases 0.000 description 1
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 description 1
- 229920001651 Cyanoacrylate Polymers 0.000 description 1
- ZZZCUOFIHGPKAK-UHFFFAOYSA-N D-erythro-ascorbic acid Natural products OCC1OC(=O)C(O)=C1O ZZZCUOFIHGPKAK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010012289 Dementia Diseases 0.000 description 1
- 206010012335 Dependence Diseases 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- LVGKNOAMLMIIKO-UHFFFAOYSA-N Elaidinsaeure-aethylester Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(=O)OCC LVGKNOAMLMIIKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000792859 Enema Species 0.000 description 1
- 102400001368 Epidermal growth factor Human genes 0.000 description 1
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 1
- 108700039887 Essential Genes Proteins 0.000 description 1
- DNXHEGUUPJUMQT-CBZIJGRNSA-N Estrone Chemical compound OC1=CC=C2[C@H]3CC[C@](C)(C(CC4)=O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 DNXHEGUUPJUMQT-CBZIJGRNSA-N 0.000 description 1
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 description 1
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 description 1
- 241000710781 Flaviviridae Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N Galacturonsaeure Natural products O=CC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000053171 Glial Fibrillary Acidic Human genes 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 201000005569 Gout Diseases 0.000 description 1
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 1
- 102000009465 Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010009202 Growth Factor Receptors Proteins 0.000 description 1
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 1
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 1
- 102000008055 Heparan Sulfate Proteoglycans Human genes 0.000 description 1
- 208000009889 Herpes Simplex Diseases 0.000 description 1
- 241000700586 Herpesviridae Species 0.000 description 1
- 101000971171 Homo sapiens Apoptosis regulator Bcl-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000746373 Homo sapiens Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Proteins 0.000 description 1
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 1
- 241000700588 Human alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- 208000031226 Hyperlipidaemia Diseases 0.000 description 1
- 206010061216 Infarction Diseases 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102100023915 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N Ketamine Chemical compound C=1C=CC=C(Cl)C=1C1(NC)CCCCC1=O YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical group C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 1
- 102000009151 Luteinizing Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010073521 Luteinizing Hormone Proteins 0.000 description 1
- 102000008072 Lymphokines Human genes 0.000 description 1
- 108010074338 Lymphokines Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 201000005505 Measles Diseases 0.000 description 1
- 208000009433 Moyamoya Disease Diseases 0.000 description 1
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 description 1
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 1
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 1
- 102000019040 Nuclear Antigens Human genes 0.000 description 1
- 108010051791 Nuclear Antigens Proteins 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000712464 Orthomyxoviridae Species 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 1
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 1
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 102000003982 Parathyroid hormone Human genes 0.000 description 1
- 108090000445 Parathyroid hormone Proteins 0.000 description 1
- 241000150350 Peribunyaviridae Species 0.000 description 1
- 229920002732 Polyanhydride Polymers 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 241000700625 Poxviridae Species 0.000 description 1
- 102000007327 Protamines Human genes 0.000 description 1
- 108010007568 Protamines Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 1
- 102000016611 Proteoglycans Human genes 0.000 description 1
- 108010067787 Proteoglycans Proteins 0.000 description 1
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012564 Q sepharose fast flow resin Substances 0.000 description 1
- 108700005075 Regulator Genes Proteins 0.000 description 1
- 241000712907 Retroviridae Species 0.000 description 1
- 241000711931 Rhabdoviridae Species 0.000 description 1
- 241000606701 Rickettsia Species 0.000 description 1
- 241000702670 Rotavirus Species 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000580858 Simian-Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 1
- 229920002125 Sokalan® Polymers 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- 101710198474 Spike protein Proteins 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 108090000054 Syndecan-2 Proteins 0.000 description 1
- 239000004809 Teflon Substances 0.000 description 1
- 229920006362 Teflon® Polymers 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Chemical group CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Chemical group 0.000 description 1
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 1
- 241000710924 Togaviridae Species 0.000 description 1
- 229920001615 Tragacanth Polymers 0.000 description 1
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 244000098338 Triticum aestivum Species 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 1
- FPIPGXGPPPQFEQ-BOOMUCAASA-N Vitamin A Natural products OC/C=C(/C)\C=C\C=C(\C)/C=C/C1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-BOOMUCAASA-N 0.000 description 1
- 229930003270 Vitamin B Natural products 0.000 description 1
- 229930003268 Vitamin C Natural products 0.000 description 1
- 229930003316 Vitamin D Natural products 0.000 description 1
- QYSXJUFSXHHAJI-XFEUOLMDSA-N Vitamin D3 Natural products C1(/[C@@H]2CC[C@@H]([C@]2(CCC1)C)[C@H](C)CCCC(C)C)=C/C=C1\C[C@@H](O)CCC1=C QYSXJUFSXHHAJI-XFEUOLMDSA-N 0.000 description 1
- 229930003427 Vitamin E Natural products 0.000 description 1
- 229930003448 Vitamin K Natural products 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- LUXUAZKGQZPOBZ-SAXJAHGMSA-N [(3S,4S,5S,6R)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl] (Z)-octadec-9-enoate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OC1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O LUXUAZKGQZPOBZ-SAXJAHGMSA-N 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 230000001919 adrenal effect Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 235000010419 agar Nutrition 0.000 description 1
- 239000003732 agents acting on the eye Substances 0.000 description 1
- 230000004931 aggregating effect Effects 0.000 description 1
- 239000003905 agrochemical Substances 0.000 description 1
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 1
- 239000000783 alginic acid Substances 0.000 description 1
- 229960001126 alginic acid Drugs 0.000 description 1
- 150000004781 alginic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 150000001350 alkyl halides Chemical class 0.000 description 1
- 229940045714 alkyl sulfonate alkylating agent Drugs 0.000 description 1
- 150000008052 alkyl sulfonates Chemical class 0.000 description 1
- FPIPGXGPPPQFEQ-OVSJKPMPSA-N all-trans-retinol Chemical compound OC\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-OVSJKPMPSA-N 0.000 description 1
- AEMOLEFTQBMNLQ-WAXACMCWSA-N alpha-D-glucuronic acid Chemical compound O[C@H]1O[C@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-WAXACMCWSA-N 0.000 description 1
- BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N alpha-hydroxysuccinic acid Natural products OC(=O)C(O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K aluminium phosphate Chemical compound O1[Al]2OP1(=O)O2 ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- DIZPMCHEQGEION-UHFFFAOYSA-H aluminium sulfate (anhydrous) Chemical compound [Al+3].[Al+3].[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O DIZPMCHEQGEION-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 239000003263 anabolic agent Substances 0.000 description 1
- 229940070021 anabolic steroids Drugs 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 230000000202 analgesic effect Effects 0.000 description 1
- 229940035676 analgesics Drugs 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000002870 angiogenesis inducing agent Substances 0.000 description 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 1
- 229940069428 antacid Drugs 0.000 description 1
- 239000003159 antacid agent Substances 0.000 description 1
- 239000000730 antalgic agent Substances 0.000 description 1
- 239000000921 anthelmintic agent Substances 0.000 description 1
- 229940124339 anthelmintic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000003556 anti-epileptic effect Effects 0.000 description 1
- 229940121363 anti-inflammatory agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002260 anti-inflammatory agent Substances 0.000 description 1
- 230000000340 anti-metabolite Effects 0.000 description 1
- 230000001754 anti-pyretic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 230000002921 anti-spasmodic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001147 anti-toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- 239000001961 anticonvulsive agent Substances 0.000 description 1
- 229940125714 antidiarrheal agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003793 antidiarrheal agent Substances 0.000 description 1
- 239000000729 antidote Substances 0.000 description 1
- 229940075522 antidotes Drugs 0.000 description 1
- 229960003965 antiepileptics Drugs 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 229940030225 antihemorrhagics Drugs 0.000 description 1
- 229940125715 antihistaminic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000000739 antihistaminic agent Substances 0.000 description 1
- 239000002220 antihypertensive agent Substances 0.000 description 1
- 229940127088 antihypertensive drug Drugs 0.000 description 1
- 229940100197 antimetabolite Drugs 0.000 description 1
- 239000002256 antimetabolite Substances 0.000 description 1
- 239000003972 antineoplastic antibiotic Substances 0.000 description 1
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 1
- 239000000939 antiparkinson agent Substances 0.000 description 1
- 239000003904 antiprotozoal agent Substances 0.000 description 1
- 239000002221 antipyretic Substances 0.000 description 1
- 229940124575 antispasmodic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003434 antitussive agent Substances 0.000 description 1
- 239000003699 antiulcer agent Substances 0.000 description 1
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 description 1
- 239000002249 anxiolytic agent Substances 0.000 description 1
- 230000000949 anxiolytic effect Effects 0.000 description 1
- 229940005530 anxiolytics Drugs 0.000 description 1
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 description 1
- 230000002763 arrhythmic effect Effects 0.000 description 1
- 208000021328 arterial occlusion Diseases 0.000 description 1
- 210000001130 astrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 210000000467 autonomic pathway Anatomy 0.000 description 1
- 239000003855 balanced salt solution Substances 0.000 description 1
- 238000013142 basic testing Methods 0.000 description 1
- 230000003542 behavioural effect Effects 0.000 description 1
- MSWZFWKMSRAUBD-QZABAPFNSA-N beta-D-glucosamine Chemical compound N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-QZABAPFNSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002306 biochemical method Methods 0.000 description 1
- 229920002988 biodegradable polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000004621 biodegradable polymer Substances 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000002051 biphasic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000010836 blood and blood product Substances 0.000 description 1
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 1
- 229940125691 blood product Drugs 0.000 description 1
- 239000003633 blood substitute Substances 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 210000004958 brain cell Anatomy 0.000 description 1
- RDHPKYGYEGBMSE-UHFFFAOYSA-N bromoethane Chemical compound CCBr RDHPKYGYEGBMSE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940124630 bronchodilator Drugs 0.000 description 1
- 239000000168 bronchodilator agent Substances 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 229930188620 butyrolactone Natural products 0.000 description 1
- 229960004015 calcitonin Drugs 0.000 description 1
- BBBFJLBPOGFECG-VJVYQDLKSA-N calcitonin Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(N)=O)C(C)C)C(=O)[C@@H]1CSSC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1 BBBFJLBPOGFECG-VJVYQDLKSA-N 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 210000004413 cardiac myocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000000496 cardiotonic agent Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000034303 cell budding Effects 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 235000010980 cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000003576 central nervous system agent Substances 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 210000000038 chest Anatomy 0.000 description 1
- 229930002875 chlorophyll Natural products 0.000 description 1
- 235000019804 chlorophyll Nutrition 0.000 description 1
- ATNHDLDRLWWWCB-AENOIHSZSA-M chlorophyll a Chemical compound C1([C@@H](C(=O)OC)C(=O)C2=C3C)=C2N2C3=CC(C(CC)=C3C)=[N+]4C3=CC3=C(C=C)C(C)=C5N3[Mg-2]42[N+]2=C1[C@@H](CCC(=O)OC\C=C(/C)CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)[C@H](C)C2=C5 ATNHDLDRLWWWCB-AENOIHSZSA-M 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 235000008504 concentrate Nutrition 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 210000001608 connective tissue cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000036461 convulsion Effects 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 239000013256 coordination polymer Substances 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002354 daily effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 239000000645 desinfectant Substances 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 150000008050 dialkyl sulfates Chemical class 0.000 description 1
- DENRZWYUOJLTMF-UHFFFAOYSA-N diethyl sulfate Chemical compound CCOS(=O)(=O)OCC DENRZWYUOJLTMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940008406 diethyl sulfate Drugs 0.000 description 1
- 229940079919 digestives enzyme preparation Drugs 0.000 description 1
- UGMCXQCYOVCMTB-UHFFFAOYSA-K dihydroxy(stearato)aluminium Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)O[Al](O)O UGMCXQCYOVCMTB-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- VAYGXNSJCAHWJZ-UHFFFAOYSA-N dimethyl sulfate Chemical compound COS(=O)(=O)OC VAYGXNSJCAHWJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PCHPORCSPXIHLZ-UHFFFAOYSA-N diphenhydramine hydrochloride Chemical compound [Cl-].C=1C=CC=CC=1C(OCC[NH+](C)C)C1=CC=CC=C1 PCHPORCSPXIHLZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 239000007884 disintegrant Substances 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 239000002934 diuretic Substances 0.000 description 1
- 229940030606 diuretics Drugs 0.000 description 1
- 239000000890 drug combination Substances 0.000 description 1
- 239000003974 emollient agent Substances 0.000 description 1
- 230000001804 emulsifying effect Effects 0.000 description 1
- 239000007920 enema Substances 0.000 description 1
- 229940079360 enema for constipation Drugs 0.000 description 1
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical group 0.000 description 1
- LVGKNOAMLMIIKO-QXMHVHEDSA-N ethyl oleate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC LVGKNOAMLMIIKO-QXMHVHEDSA-N 0.000 description 1
- 229940093471 ethyl oleate Drugs 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 210000003414 extremity Anatomy 0.000 description 1
- 230000001815 facial effect Effects 0.000 description 1
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000010685 fatty oil Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000002073 fluorescence micrograph Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 235000019138 food restriction Nutrition 0.000 description 1
- 235000013350 formula milk Nutrition 0.000 description 1
- 229940087051 fragmin Drugs 0.000 description 1
- 239000003205 fragrance Substances 0.000 description 1
- 210000005153 frontal cortex Anatomy 0.000 description 1
- WIGCFUFOHFEKBI-UHFFFAOYSA-N gamma-tocopherol Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC1CCC2C(C)C(O)C(C)C(C)C2O1 WIGCFUFOHFEKBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940125695 gastrointestinal agent Drugs 0.000 description 1
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000003193 general anesthetic agent Substances 0.000 description 1
- 229940005494 general anesthetics Drugs 0.000 description 1
- 231100000722 genetic damage Toxicity 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002518 glial effect Effects 0.000 description 1
- 150000002302 glucosamines Chemical class 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- BCQZXOMGPXTTIC-UHFFFAOYSA-N halothane Chemical compound FC(F)(F)C(Cl)Br BCQZXOMGPXTTIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003132 halothane Drugs 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 1
- 230000002949 hemolytic effect Effects 0.000 description 1
- 208000014617 hemorrhoid Diseases 0.000 description 1
- 239000002874 hemostatic agent Substances 0.000 description 1
- 150000002402 hexoses Chemical class 0.000 description 1
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000036732 histological change Effects 0.000 description 1
- 229940125697 hormonal agent Drugs 0.000 description 1
- 230000006658 host protein synthesis Effects 0.000 description 1
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 1
- 210000004754 hybrid cell Anatomy 0.000 description 1
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 1
- 239000001866 hydroxypropyl methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010979 hydroxypropyl methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229920003088 hydroxypropyl methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- UFVKGYZPFZQRLF-UHFFFAOYSA-N hydroxypropyl methyl cellulose Chemical compound OC1C(O)C(OC)OC(CO)C1OC1C(O)C(O)C(OC2C(C(O)C(OC3C(C(O)C(O)C(CO)O3)O)C(CO)O2)O)C(CO)O1 UFVKGYZPFZQRLF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000147 hypnotic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000960 hypophysis hormone Substances 0.000 description 1
- 210000003016 hypothalamus Anatomy 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 230000007574 infarction Effects 0.000 description 1
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- HVTICUPFWKNHNG-UHFFFAOYSA-N iodoethane Chemical compound CCI HVTICUPFWKNHNG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- INQOMBQAUSQDDS-UHFFFAOYSA-N iodomethane Chemical compound IC INQOMBQAUSQDDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000023589 ischemic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000000302 ischemic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N isomaltotriose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O)O1 FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N 0.000 description 1
- 229960003299 ketamine Drugs 0.000 description 1
- 239000004922 lacquer Substances 0.000 description 1
- 239000008141 laxative Substances 0.000 description 1
- 229940125722 laxative agent Drugs 0.000 description 1
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 1
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 description 1
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 201000002818 limb ischemia Diseases 0.000 description 1
- 229940057995 liquid paraffin Drugs 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 239000003589 local anesthetic agent Substances 0.000 description 1
- 229960005015 local anesthetics Drugs 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 229940040129 luteinizing hormone Drugs 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001630 malic acid Substances 0.000 description 1
- 235000011090 malic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000034217 membrane fusion Effects 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 150000002736 metal compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229940102396 methyl bromide Drugs 0.000 description 1
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010981 methylcellulose Nutrition 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 1
- 102000021160 microtubule binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091011150 microtubule binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 210000004925 microvascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003801 milling Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- 239000003158 myorelaxant agent Substances 0.000 description 1
- PVWOIHVRPOBWPI-UHFFFAOYSA-N n-propyl iodide Chemical compound CCCI PVWOIHVRPOBWPI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001577 neostriatum Anatomy 0.000 description 1
- 230000007971 neurological deficit Effects 0.000 description 1
- 230000007121 neuropathological change Effects 0.000 description 1
- 231100000956 nontoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 108010058731 nopaline synthase Proteins 0.000 description 1
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 1
- 229920002113 octoxynol Polymers 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 1
- 210000000956 olfactory bulb Anatomy 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 230000000771 oncological effect Effects 0.000 description 1
- 229940125702 ophthalmic agent Drugs 0.000 description 1
- 210000004789 organ system Anatomy 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 208000022196 parasitic skin disease Diseases 0.000 description 1
- 239000000199 parathyroid hormone Substances 0.000 description 1
- 229960001319 parathyroid hormone Drugs 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 210000000578 peripheral nerve Anatomy 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- SHUZOJHMOBOZST-UHFFFAOYSA-N phylloquinone Natural products CC(C)CCCCC(C)CCC(C)CCCC(=CCC1=C(C)C(=O)c2ccccc2C1=O)C SHUZOJHMOBOZST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 239000004014 plasticizer Substances 0.000 description 1
- 229920000729 poly(L-lysine) polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920001308 poly(aminoacid) Polymers 0.000 description 1
- 229920000058 polyacrylate Polymers 0.000 description 1
- 229920000867 polyelectrolyte Polymers 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 229920000193 polymethacrylate Polymers 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920001343 polytetrafluoroethylene Polymers 0.000 description 1
- 239000004810 polytetrafluoroethylene Substances 0.000 description 1
- 229920002635 polyurethane Polymers 0.000 description 1
- 239000004814 polyurethane Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 229950008679 protamine sulfate Drugs 0.000 description 1
- 239000002213 purine nucleotide Substances 0.000 description 1
- 239000002719 pyrimidine nucleotide Substances 0.000 description 1
- 150000003230 pyrimidines Chemical class 0.000 description 1
- 229940121896 radiopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 239000012217 radiopharmaceutical Substances 0.000 description 1
- 230000002799 radiopharmaceutical effect Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 102000037983 regulatory factors Human genes 0.000 description 1
- 108091008025 regulatory factors Proteins 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 239000003169 respiratory stimulant agent Substances 0.000 description 1
- 229940066293 respiratory stimulants Drugs 0.000 description 1
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 229940125723 sedative agent Drugs 0.000 description 1
- 239000000932 sedative agent Substances 0.000 description 1
- 229940000045 sensory organ drug Drugs 0.000 description 1
- UQDJGEHQDNVPGU-UHFFFAOYSA-N serine phosphoethanolamine Chemical compound [NH3+]CCOP([O-])(=O)OCC([NH3+])C([O-])=O UQDJGEHQDNVPGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000008159 sesame oil Substances 0.000 description 1
- 235000011803 sesame oil Nutrition 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N sialic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)OC1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N 0.000 description 1
- 229940125706 skeletal muscle relaxant agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 1
- 235000010413 sodium alginate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000661 sodium alginate Substances 0.000 description 1
- 229940005550 sodium alginate Drugs 0.000 description 1
- 239000012439 solid excipient Substances 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 235000012222 talc Nutrition 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 231100001274 therapeutic index Toxicity 0.000 description 1
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 description 1
- 239000004408 titanium dioxide Substances 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 235000010487 tragacanth Nutrition 0.000 description 1
- 239000000196 tragacanth Substances 0.000 description 1
- 229940116362 tragacanth Drugs 0.000 description 1
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 239000000814 tuberculostatic agent Substances 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 1
- 238000009281 ultraviolet germicidal irradiation Methods 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 210000001364 upper extremity Anatomy 0.000 description 1
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 239000005526 vasoconstrictor agent Substances 0.000 description 1
- 229940124549 vasodilator Drugs 0.000 description 1
- 239000003071 vasodilator agent Substances 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 230000006648 viral gene expression Effects 0.000 description 1
- 208000037911 visceral disease Diseases 0.000 description 1
- 235000019155 vitamin A Nutrition 0.000 description 1
- 239000011719 vitamin A Substances 0.000 description 1
- 235000019156 vitamin B Nutrition 0.000 description 1
- 239000011720 vitamin B Substances 0.000 description 1
- 235000019154 vitamin C Nutrition 0.000 description 1
- 239000011718 vitamin C Substances 0.000 description 1
- 235000019166 vitamin D Nutrition 0.000 description 1
- 239000011710 vitamin D Substances 0.000 description 1
- 150000003710 vitamin D derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 235000019165 vitamin E Nutrition 0.000 description 1
- 229940046009 vitamin E Drugs 0.000 description 1
- 239000011709 vitamin E Substances 0.000 description 1
- 235000019168 vitamin K Nutrition 0.000 description 1
- 239000011712 vitamin K Substances 0.000 description 1
- 150000003721 vitamin K derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229940045997 vitamin a Drugs 0.000 description 1
- 229940046008 vitamin d Drugs 0.000 description 1
- 229940046010 vitamin k Drugs 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 230000003313 weakening effect Effects 0.000 description 1
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 1
- 235000016804 zinc Nutrition 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
- A61K38/1825—Fibroblast growth factor [FGF]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
- A61K38/1833—Hepatocyte growth factor; Scatter factor; Tumor cytotoxic factor II
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
- A61K38/1858—Platelet-derived growth factor [PDGF]
- A61K38/1866—Vascular endothelial growth factor [VEGF]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
- A61K47/6901—Conjugates being cells, cell fragments, viruses, ghosts, red blood cells or viral vectors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
- A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
- A61K48/0075—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the delivery route, e.g. oral, subcutaneous
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5258—Virus-like particles
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/14011—Parvoviridae
- C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
- C12N2750/14132—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/14011—Parvoviridae
- C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
- C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16032—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2760/16043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/18011—Paramyxoviridae
- C12N2760/18811—Sendai virus
- C12N2760/18832—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/18011—Paramyxoviridae
- C12N2760/18811—Sendai virus
- C12N2760/18841—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2760/18843—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Neurology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
本発明では、脳・中枢神経系への効率よい送達の方法を提供すること、およびウイルスエンベロープを用いたより効率の高い送達方法を提供することを課題とした。生体分子を細胞に導入するためのシステムであって、A)生体分子;B)ウイルスエンベロープ;およびC)グリコサミノグリカン、を含む、システムが提供される。また、脳内に生体分子を送達する方法であって、A)頭部または頸部の動脈を一過的に閉鎖する工程;およびB)該頭部または頸部の動脈が閉鎖されている間に、生体分子を脳内に導入する工程、を包含する、方法が提供される。
Description
本発明は、生体分子を直接投与することに関連する新規治療方法に関する。より詳細には、本発明は、ウイルスエンベロープを用いた生体分子の投与に関する。本発明はまた、脳への効率よい生体分子の送達方法にも関する。
遺伝子機能解析、遺伝子治療などのために、培養細胞、生体組織などに対して遺伝子を導入する目的で、多くのウイルス法および非ウイルス法が開発されている(Mulligan、Science、260、926〜932、1993年およびLedley、Human Gene Therapy、第6巻、1129〜1144、1995年)。一般に細胞へ遺伝子を送達するためには、ウイルス法がより効果的である。しかしウイルスベクターは、親ウイルス由来の親遺伝子必須遺伝子要素の同時導入、ウイルス遺伝子の発現、免疫原性などのため問題を生じ得る。一方、非ウイルス法の一つであるリポソーム法は細胞傷害性および免疫原性はウイルス法より少ないが、生体組織内への遺伝子導入効率においてはウイルスベクターに比し劣る傾向にある。
HVJはエーリッヒ腫瘍細胞を融合させるとして注目され(岡田、微研ジャーナル、1、103−110、1958年)、細胞膜融合活性(以下融合活性とする)の解明が進められると共に遺伝子導入ベクターとしての利用が検討されてきたウイルスである。一方、HVJは免疫原性が高く、特にNPタンパク質が大量に生産されるとCTLを誘導することが知られており(Cole G.A.らJournal of Immunology 158、4301〜4309、1997年)、さらに宿主のタンパク質合成が阻害される懸念もある。そこで遺伝子、タンパク質などを封入したリポソームと予め紫外線照射により不活性化しておいたHVJとを融合することで融合粒子(HVJ−リポソーム)を作製する方法が考案され、これにより培養細胞、生体などへの非侵襲の遺伝子導入が可能となった(米国特許第5,631,237号、Dzauら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、93、11421〜11425、1996年および金田ら、Molecular Medicine Today、5、298〜303、1999年)。しかしながら、リポソームとウイルスエンベロープという2つの異なるベシクルを調製する必要があり煩雑であること、また融合活性においても、リポソームとの融合により平均粒子径がHVJの1.3倍に増大する融合粒子は、HVJのそれの1/10以下に低下するなどの欠点を有していることが判明している。さらに、従来のHVJに基づくベクターでは、遺伝子導入が不可能な組織、極めて低効率である組織なども存在した。
本発明者らは、遺伝子、オリゴヌクレオチドなどを培養細胞、生体などに導入するための種々の新規な不活性化ウイルスエンベロープベクターを提供している(WO01/57204)。即ち、HVJをはじめ種々のエンベロープウイルスのゲノムを不活性化したウイルスエンベロープ中に遺伝子などを封入することにより、培養細胞、生体組織などに対して簡便かつ高効率で遺伝子などを導入することが可能で、細胞に対する毒性が低いベクターが調製される。
本発明者らは、経済的に安価で、有効かつ一定品質を保証できる不活性化ウイルスエンベロープの工業的製法としてアルキル化剤で処理する方法を開発した。
ほとんどの疾患について何らかの解決策が見出されている現代において、脳の疾患および障害は、解決策がさほど見出されていない最後の領域といえ、その治療および予防に対する需要は年々増えるばかりである。脳疾患の中でも、大脳動脈のアテローム性動脈硬化症、モヤモヤ病などによって引き起こされる大脳閉塞疾患は、しばしば、脳の慢性的な灌流不足を引き起こす。このような状態は、大脳虚血事象を導くのみでなく痴呆を含む神経病理学変化もまた導く(Kalaria RN,Bhatti SU,Lust WD,Perry G.,Ann N Y Acad Sci.1993;695:190−3.;Kudo T,Takeda M,Tanimukai S,Nishimura T.,Stroke.1993;24:259−64;discussion 265.;Kurumatani T,Kudo T,Ikura Y,Takeda M.,Stroke.1998;29:1058−62.;およびSekhon LH,Morgan MK,Spence I,Weber NC.,Stroke.1994;25:1022−7)が、灌流不足を改善するための有効な処置は、未だ確立されていない。
近年、前臨床研究によって、血管内皮増殖因子(VEGF)、線維芽細胞増殖因子(FGF)および肝細胞増殖因子(HGF)のような血管形成増殖因子が、動物脳虚血モデルにおいて側副血管の発達を刺激し得ることが示された(Harrigan MR,Ennis SR,Masada T,Keep RF.,Neurosurgery.2002;50:589−98;Lyons MK,Anderson RE,Meyer FB.,Brain Res.1991;558:315−20.;およびYoshimura S,et al.,Hypertension.2002;39:1028−34.)。これは、治療的新脈管形成として知られている。血管形成増殖因子の遺伝子移入を用いた治療新脈管形成の効力は、重篤の肢虚血または心筋梗塞を有するヒト患者において報告されている(Baumgartner I,et al.,Circulation.1998;97:1114−23.;Losordo DW,et al.,Circulation.1998;98:2800−4.;Symes JF,et al.,Ann Thorac Surg.1999;68:830−6;discussion 836−7.;およびRosengart TK,et al.,Circulation.1999;100:468−74.)。従って、治療的新脈管形成に関する戦略は、安全かつ有効な遺伝子移入方法がヒトに対して開発され得る場合、大脳虚血に罹患する患者のための治療法として使用され得るといえる。この観点に鑑みると、現在の遺伝子移入技術は、理想的とはいえないかもしれない。中枢神経系(CNS)への遺伝子移入は、アデノ随伴ウイルス(AAV)(Fan D,et al.,Neurosci Lett.1998;248:61−4)、レトロウイルス(Franceschini IA,et al.,J Neurosci Res.2001;65:208−19)、アデノウイルス(Miyaguchi K,Maeda Y,Collin C,Sihag RK.,Brain Res Bull.2000;51:195−202.)、および単純疱疹ウイルス 1(Johnson PA,Yoshida K,Gage FH,Friedmann T.,Brain Res Mol Brain Res.1992;12:95−102.)を含む種々のウイルスベクターを用いて達成されている。これらのベクター系は、ヒト遺伝子治療に関して利点および不利益を有する。これらの方法は、CNSへのインビボ遺伝子移入には有効であるが、安全性および産生量のような多数の問題が、ヒト遺伝子治療に関して生じている。
これらの問題を克服するために、本発明者らは、新規の非ウイルスベクター系である、HVJ(Hemagglutinating Virus of Japan=センダイウイルス)エンベロープベクターを上述のように開発し、利用している。このベクター系は、ウイルスエンベロープおよびリポソームを用いた第1世代のHVJベースの遺伝子移入(HVJリポソーム方法)(Yamada K,et al.,Am J Physiol.1996;271:R1212−20;Kaneda Y,et al.,Exp Cell Res.1987;173:56−69.)に基づいて開発された。第1世代のHVJベクターは、ラットおよび霊長類のCNSへのトランスフェクションに対して大きな可能性を有するが(Yamada K.et al.前出;Hagihara Y,et al.,Gene Ther.2000;7:759−63.)、複雑な手順および保存の困難さなどの理論上の不利益がある。新規の非ウイルスベクター系である、HVJ−エンベロープ(HVJ−E)ベクターは、外来遺伝子を移入するためにHVJのエンベロープのみを利用する。
HVJはエーリッヒ腫瘍細胞を融合させるとして注目され(岡田、微研ジャーナル、1、103−110、1958年)、細胞膜融合活性(以下融合活性とする)の解明が進められると共に遺伝子導入ベクターとしての利用が検討されてきたウイルスである。一方、HVJは免疫原性が高く、特にNPタンパク質が大量に生産されるとCTLを誘導することが知られており(Cole G.A.らJournal of Immunology 158、4301〜4309、1997年)、さらに宿主のタンパク質合成が阻害される懸念もある。そこで遺伝子、タンパク質などを封入したリポソームと予め紫外線照射により不活性化しておいたHVJとを融合することで融合粒子(HVJ−リポソーム)を作製する方法が考案され、これにより培養細胞、生体などへの非侵襲の遺伝子導入が可能となった(米国特許第5,631,237号、Dzauら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、93、11421〜11425、1996年および金田ら、Molecular Medicine Today、5、298〜303、1999年)。しかしながら、リポソームとウイルスエンベロープという2つの異なるベシクルを調製する必要があり煩雑であること、また融合活性においても、リポソームとの融合により平均粒子径がHVJの1.3倍に増大する融合粒子は、HVJのそれの1/10以下に低下するなどの欠点を有していることが判明している。さらに、従来のHVJに基づくベクターでは、遺伝子導入が不可能な組織、極めて低効率である組織なども存在した。
本発明者らは、遺伝子、オリゴヌクレオチドなどを培養細胞、生体などに導入するための種々の新規な不活性化ウイルスエンベロープベクターを提供している(WO01/57204)。即ち、HVJをはじめ種々のエンベロープウイルスのゲノムを不活性化したウイルスエンベロープ中に遺伝子などを封入することにより、培養細胞、生体組織などに対して簡便かつ高効率で遺伝子などを導入することが可能で、細胞に対する毒性が低いベクターが調製される。
本発明者らは、経済的に安価で、有効かつ一定品質を保証できる不活性化ウイルスエンベロープの工業的製法としてアルキル化剤で処理する方法を開発した。
ほとんどの疾患について何らかの解決策が見出されている現代において、脳の疾患および障害は、解決策がさほど見出されていない最後の領域といえ、その治療および予防に対する需要は年々増えるばかりである。脳疾患の中でも、大脳動脈のアテローム性動脈硬化症、モヤモヤ病などによって引き起こされる大脳閉塞疾患は、しばしば、脳の慢性的な灌流不足を引き起こす。このような状態は、大脳虚血事象を導くのみでなく痴呆を含む神経病理学変化もまた導く(Kalaria RN,Bhatti SU,Lust WD,Perry G.,Ann N Y Acad Sci.1993;695:190−3.;Kudo T,Takeda M,Tanimukai S,Nishimura T.,Stroke.1993;24:259−64;discussion 265.;Kurumatani T,Kudo T,Ikura Y,Takeda M.,Stroke.1998;29:1058−62.;およびSekhon LH,Morgan MK,Spence I,Weber NC.,Stroke.1994;25:1022−7)が、灌流不足を改善するための有効な処置は、未だ確立されていない。
近年、前臨床研究によって、血管内皮増殖因子(VEGF)、線維芽細胞増殖因子(FGF)および肝細胞増殖因子(HGF)のような血管形成増殖因子が、動物脳虚血モデルにおいて側副血管の発達を刺激し得ることが示された(Harrigan MR,Ennis SR,Masada T,Keep RF.,Neurosurgery.2002;50:589−98;Lyons MK,Anderson RE,Meyer FB.,Brain Res.1991;558:315−20.;およびYoshimura S,et al.,Hypertension.2002;39:1028−34.)。これは、治療的新脈管形成として知られている。血管形成増殖因子の遺伝子移入を用いた治療新脈管形成の効力は、重篤の肢虚血または心筋梗塞を有するヒト患者において報告されている(Baumgartner I,et al.,Circulation.1998;97:1114−23.;Losordo DW,et al.,Circulation.1998;98:2800−4.;Symes JF,et al.,Ann Thorac Surg.1999;68:830−6;discussion 836−7.;およびRosengart TK,et al.,Circulation.1999;100:468−74.)。従って、治療的新脈管形成に関する戦略は、安全かつ有効な遺伝子移入方法がヒトに対して開発され得る場合、大脳虚血に罹患する患者のための治療法として使用され得るといえる。この観点に鑑みると、現在の遺伝子移入技術は、理想的とはいえないかもしれない。中枢神経系(CNS)への遺伝子移入は、アデノ随伴ウイルス(AAV)(Fan D,et al.,Neurosci Lett.1998;248:61−4)、レトロウイルス(Franceschini IA,et al.,J Neurosci Res.2001;65:208−19)、アデノウイルス(Miyaguchi K,Maeda Y,Collin C,Sihag RK.,Brain Res Bull.2000;51:195−202.)、および単純疱疹ウイルス 1(Johnson PA,Yoshida K,Gage FH,Friedmann T.,Brain Res Mol Brain Res.1992;12:95−102.)を含む種々のウイルスベクターを用いて達成されている。これらのベクター系は、ヒト遺伝子治療に関して利点および不利益を有する。これらの方法は、CNSへのインビボ遺伝子移入には有効であるが、安全性および産生量のような多数の問題が、ヒト遺伝子治療に関して生じている。
これらの問題を克服するために、本発明者らは、新規の非ウイルスベクター系である、HVJ(Hemagglutinating Virus of Japan=センダイウイルス)エンベロープベクターを上述のように開発し、利用している。このベクター系は、ウイルスエンベロープおよびリポソームを用いた第1世代のHVJベースの遺伝子移入(HVJリポソーム方法)(Yamada K,et al.,Am J Physiol.1996;271:R1212−20;Kaneda Y,et al.,Exp Cell Res.1987;173:56−69.)に基づいて開発された。第1世代のHVJベクターは、ラットおよび霊長類のCNSへのトランスフェクションに対して大きな可能性を有するが(Yamada K.et al.前出;Hagihara Y,et al.,Gene Ther.2000;7:759−63.)、複雑な手順および保存の困難さなどの理論上の不利益がある。新規の非ウイルスベクター系である、HVJ−エンベロープ(HVJ−E)ベクターは、外来遺伝子を移入するためにHVJのエンベロープのみを利用する。
これらの状況にかんがみ、当該分野において、インビトロおよびインビボの両方で、ウイルスエンベロープを用いた脳・中枢神経系(CNS)への効率よい生体分子の送達(例えば、遺伝子導入)のための方法が所望されている。
また、ウイルスエンベロープを用いた生体分子の送達の効率は、まだまだ充分高いといえない。したがって、ウイルスエンベロープを用いた生体分子のより効率の高い送達のためのシステムおよび方法を開発することが当該分野において求められている。
そこで、本発明では、脳・中枢神経系への効率よい送達の方法を提供すること、およびウイルスエンベロープを用いたより効率の高い送達方法を提供することを課題とした。
また、ウイルスエンベロープを用いた生体分子の送達の効率は、まだまだ充分高いといえない。したがって、ウイルスエンベロープを用いた生体分子のより効率の高い送達のためのシステムおよび方法を開発することが当該分野において求められている。
そこで、本発明では、脳・中枢神経系への効率よい送達の方法を提供すること、およびウイルスエンベロープを用いたより効率の高い送達方法を提供することを課題とした。
本発明者らは、上記課題について、鋭意研究を重ねた結果、グリコサミノグリカンをウイルスエンベロープ系に添加することによって解決されることを見出した。
本発明者らはまた、脳または頸部の動脈をいったん閉じた後、ウイルスエンベロープ系を用いて生体分子を投与すると、効率よく脳にその生体分子が送達されることを見出し、上記課題を解決した。
したがって、本発明は以下を提供する。
(1) 生体分子を細胞に導入するためのシステムであって、
1)生体分子;
2)ウイルスエンベロープ;および
3)グリコサミノグリカン、
を含む、システム。
(2) 上記ウイルスエンベロープは、不活性化されている、項目1に記載のシステム。
(3) 上記グリコサミノグリカンは、ヘパリンである、項目1に記載のシステム。
(4) 上記グリコサミノグリカンの分子量は、少なくとも10,000kDaである、項目1に記載のシステム。
(5) 上記グリコサミノグリカンは、少なくとも50U/ml含まれる、項目1に記載のシステム。
(6) 上記ヘパリンの分子量は、12,000〜15,000kDaである、項目3に記載のシステム。
(7) 上記ヘパリンの硫酸化の程度は、薬学的に許容可能である、項目3に記載のシステム。
(8) 上記ウイルスエンベロープは、RNAウイルスのエンベロープである、項目1に記載のシステム。
(9) 上記ウイルスエンベロープは、パラミクソウイルス属のウイルスのエンベロープである、項目1に記載のシステム。
(10) 上記ウイルスエンベロープは、HVJのエンベロープである、項目1に記載のシステム。
(11) 上記生体分子は、核酸、ポリペプチド、脂質、糖、およびそれらの複合分子からなる群より選択される、項目1に記載のシステム。
(12) 上記生体分子は、核酸を含む、項目1に記載のシステム。
(13) 上記生体分子は、ポリペプチドを含む、項目1に記載のシステム。
(14) 上記生体分子は、血管内皮増殖因子(VEGF)、線維芽細胞増殖因子(FGF)および肝細胞増殖因子(HGF)からなる群より選択される遺伝子をコードする核酸である、項目1に記載のシステム。
(15) 上記生体分子は、血管内皮増殖因子(VEGF)、線維芽細胞増殖因子(FGF)および肝細胞増殖因子(HGF)からなる群より選択されるポリペプチドである、項目1に記載のシステム。
(16) 上記ヘパリンと、上記生体分子および上記ウイルスエンベロープとは、同じ組成物中に含有される、項目1に記載のシステム。
(17) 上記ヘパリンと、上記生体分子および上記ウイルスエンベロープとは、異なる組成物中に含有される、項目1に記載のシステム。
(18) 上記生体分子は、上記ウイルスエンベロープ中に含有される、項目1に記載のシステム。
(19) 生体分子を細胞に導入するための方法であって、
1)ウイルスエンベロープおよび生体分子を含む組成物を上記細胞に投与する工程;および
2)グリコサミノグリカンを上記細胞に投与する工程、
を包含する、方法。
(20) 上記グリコサミノグリカンを投与する工程は、上記組成物を投与する工程と同時に行われる、項目19に記載の方法。
(21) 上記グリコサミノグリカンを投与する工程は、上記組成物を投与する工程の前に行われる、項目19に記載の方法。
(22) 上記グリコサミノグリカンを投与する工程は、上記組成物を投与する工程の後に行われる、項目19に記載の方法。
(23) 生体分子を細胞に導入するための医薬を製造するための、グリコサミノグリカンの使用であって、上記医薬は、
1)生体分子;
2)ウイルスエンベロープ;および
3)グリコサミノグリカン、
を含む、使用。
(24) 脳内に生体分子を送達する方法であって、
1)頭部または頸部の動脈を一過的に閉鎖する工程;および
2)上記頭部または頸部の動脈が閉鎖されている間に、生体分子を脳内に導入する工程、
を包含する、方法。
(25) 上記生体分子は、核酸、ポリペプチド、脂質、糖、およびそれらの複合分子からなる群より選択される、項目24に記載の方法。
(26) 上記生体分子は、核酸を含む、項目24に記載の方法。
(27) 上記生体分子は、上記生体分子は、血管内皮増殖因子(VEGF)、線維芽細胞増殖因子(FGF)および肝細胞増殖因子(HGF)からなる群より選択される遺伝子をコードする核酸である、項目24に記載の方法。
(28) 上記核酸は、ベクターによって送達される、項目26に記載の方法。
(29) 上記生体分子は、ウイルスエンベロープとともに導入される、項目24に記載の方法。
(30) 上記ウイルスエンベロープは、不活性化されている、項目29に記載の方法。
(31) 上記ウイルスエンベロープは、RNAウイルスのエンベロープである、項目29に記載の方法。
(32) 上記ウイルスエンベロープは、パラミクソウイルス属のウイルスのエンベロープである、項目29に記載の方法。
(33) 上記ウイルスエンベロープは、HVJのエンベロープである、項目29に記載の方法。
(34) 上記生体分子は、グリコサミノグリカンとともに導入される、項目24に記載の方法。
(35) 上記グリコサミノグリカンは、ヘパリンである、項目34に記載の方法。
(36) 上記グリコサミノグリカンの分子量は、少なくとも10,000kDaである、項目34に記載の方法。
(37) 上記グリコサミノグリカンは、少なくとも50U/ml含まれる、項目34に記載の方法。
(38) 上記ヘパリンの分子量は、12,000〜15,000kDaである、項目35に記載の方法。
(39) 上記ヘパリンの硫酸化の程度は、薬学的に許容可能である、項目35に記載の方法。
(40) 上記グリコサミノグリカンは、上記生体分子と同時に投与される、項目34に記載の方法。
(41) 上記グリコサミノグリカンは、上記生体分子の投与の前に投与される、項目34に記載の方法。
(42) 上記グリコサミノグリカンは、上記生体分子の投与の後に投与される、項目34に記載の方法。
(43) 上記頭部または頸部の動脈は、1分間〜120分間閉鎖される、項目24に記載の方法。
(44) 上記脳および頸部の動脈は、中大脳動脈または頸動脈である、項目24に記載の方法。
(45) 上記脳および頸部の動脈は、中大脳動脈である、項目24に記載の方法。
(46) 上記生体分子は、頸動脈、視床、脳室内または髄腔内に投与される、項目24に記載の方法。
(47) 上記生体分子は、頸動脈に投与される、項目24に記載の方法。
(48) 脳内に生体分子を送達するためのキットであって、
1)生体分子;ならびに
2)上記生体分子を投与する方法を指示する指示書であって、上記方法は、
A)頭部または頸部の動脈を一過的に閉鎖する工程;および
B)上記頭部または頸部の動脈が閉鎖されている間に、上記生体分子を脳内に導入する工程、
を包含する、指示書、
を備える、キット。
(49) 上記生体分子は、核酸、ポリペプチド、脂質、糖、およびそれらの複合分子からなる群より選択される、項目48に記載のキット。
(50) 上記生体分子は、核酸を含む、項目48に記載のキット。
(51) 上記生体分子は、血管内皮増殖因子(VEGF)、線維芽細胞増殖因子(FGF)および肝細胞増殖因子(HGF)からなる群より選択される遺伝子をコードする核酸である、項目48に記載のキット。
(52) 上記核酸は、ベクターによって送達される、項目48に記載のキット。
(53) さらにウイルスエンベロープを含む、項目48に記載のキット。
(54) 上記ウイルスエンベロープは、不活性化されている、項目53に記載のキット。
(55) 上記ウイルスエンベロープは、RNAウイルスのエンベロープである、項目53に記載のキット。
(56) 上記ウイルスエンベロープは、パラミクソウイルス属のウイルスのエンベロープである、項目53に記載のキット。
(57) 上記ウイルスエンベロープは、HVJのエンベロープである、項目53に記載のキット。
(58) さらにグリコサミノグリカンを含む、項目48に記載のキット。
(59) 上記グリコサミノグリカンは、ヘパリンである、項目58に記載のキット。
(60) 上記グリコサミノグリカンの分子量は、少なくとも10,000kDaである、項目58に記載のキット。
(61) 上記グリコサミノグリカンは、少なくとも50U/ml含まれる、項目58に記載のキット。
(62) 上記ヘパリンの分子量は、12,000〜15,000kDaである、項目59に記載のキット。
(63) 上記ヘパリンの硫酸化の程度は、薬学的に許容可能である、項目59に記載のキット。
(64) 上記グリコサミノグリカンは、上記生体分子と同時に投与される、項目58に記載のキット。
(65) 上記グリコサミノグリカンは、上記生体分子の投与の前に投与される、項目58に記載のキット。
(66) 上記グリコサミノグリカンは、上記生体分子の投与の後に投与される、項目58に記載のキット。
(67) 上記頭部または頸部の動脈は、1分間〜120分間閉鎖される、項目48に記載のキット。
(68) 上記脳および頸部の動脈は、中大脳動脈または頸動脈である、項目48に記載のキット。
(69) 上記脳および頸部の動脈は、中大脳動脈である、項目48に記載のキット。
(70) 上記生体分子は、頸動脈、視床、脳室内または髄腔内に投与される、項目48に記載のキット。
(71) 上記生体分子は、頸動脈に投与される、項目48に記載のキット。
(72) 脳内に生体分子を送達するためのキットを製造するための生体分子の使用であって、上記キットは、
1)生体分子;ならびに
2)上記生体分子を投与する方法を指示する指示書であって、上記方法は、
A)頭部または頸部の動脈を一過的に閉鎖する工程;および
B)上記頭部または頸部の動脈が閉鎖されている間に、上記生体分子を脳内に導入する工程、
を包含する、指示書、
を備える、使用。
本発明の作用および効果は、本明細書の記載から当業者に明らかであることが理解される。
本発明者らはまた、脳または頸部の動脈をいったん閉じた後、ウイルスエンベロープ系を用いて生体分子を投与すると、効率よく脳にその生体分子が送達されることを見出し、上記課題を解決した。
したがって、本発明は以下を提供する。
(1) 生体分子を細胞に導入するためのシステムであって、
1)生体分子;
2)ウイルスエンベロープ;および
3)グリコサミノグリカン、
を含む、システム。
(2) 上記ウイルスエンベロープは、不活性化されている、項目1に記載のシステム。
(3) 上記グリコサミノグリカンは、ヘパリンである、項目1に記載のシステム。
(4) 上記グリコサミノグリカンの分子量は、少なくとも10,000kDaである、項目1に記載のシステム。
(5) 上記グリコサミノグリカンは、少なくとも50U/ml含まれる、項目1に記載のシステム。
(6) 上記ヘパリンの分子量は、12,000〜15,000kDaである、項目3に記載のシステム。
(7) 上記ヘパリンの硫酸化の程度は、薬学的に許容可能である、項目3に記載のシステム。
(8) 上記ウイルスエンベロープは、RNAウイルスのエンベロープである、項目1に記載のシステム。
(9) 上記ウイルスエンベロープは、パラミクソウイルス属のウイルスのエンベロープである、項目1に記載のシステム。
(10) 上記ウイルスエンベロープは、HVJのエンベロープである、項目1に記載のシステム。
(11) 上記生体分子は、核酸、ポリペプチド、脂質、糖、およびそれらの複合分子からなる群より選択される、項目1に記載のシステム。
(12) 上記生体分子は、核酸を含む、項目1に記載のシステム。
(13) 上記生体分子は、ポリペプチドを含む、項目1に記載のシステム。
(14) 上記生体分子は、血管内皮増殖因子(VEGF)、線維芽細胞増殖因子(FGF)および肝細胞増殖因子(HGF)からなる群より選択される遺伝子をコードする核酸である、項目1に記載のシステム。
(15) 上記生体分子は、血管内皮増殖因子(VEGF)、線維芽細胞増殖因子(FGF)および肝細胞増殖因子(HGF)からなる群より選択されるポリペプチドである、項目1に記載のシステム。
(16) 上記ヘパリンと、上記生体分子および上記ウイルスエンベロープとは、同じ組成物中に含有される、項目1に記載のシステム。
(17) 上記ヘパリンと、上記生体分子および上記ウイルスエンベロープとは、異なる組成物中に含有される、項目1に記載のシステム。
(18) 上記生体分子は、上記ウイルスエンベロープ中に含有される、項目1に記載のシステム。
(19) 生体分子を細胞に導入するための方法であって、
1)ウイルスエンベロープおよび生体分子を含む組成物を上記細胞に投与する工程;および
2)グリコサミノグリカンを上記細胞に投与する工程、
を包含する、方法。
(20) 上記グリコサミノグリカンを投与する工程は、上記組成物を投与する工程と同時に行われる、項目19に記載の方法。
(21) 上記グリコサミノグリカンを投与する工程は、上記組成物を投与する工程の前に行われる、項目19に記載の方法。
(22) 上記グリコサミノグリカンを投与する工程は、上記組成物を投与する工程の後に行われる、項目19に記載の方法。
(23) 生体分子を細胞に導入するための医薬を製造するための、グリコサミノグリカンの使用であって、上記医薬は、
1)生体分子;
2)ウイルスエンベロープ;および
3)グリコサミノグリカン、
を含む、使用。
(24) 脳内に生体分子を送達する方法であって、
1)頭部または頸部の動脈を一過的に閉鎖する工程;および
2)上記頭部または頸部の動脈が閉鎖されている間に、生体分子を脳内に導入する工程、
を包含する、方法。
(25) 上記生体分子は、核酸、ポリペプチド、脂質、糖、およびそれらの複合分子からなる群より選択される、項目24に記載の方法。
(26) 上記生体分子は、核酸を含む、項目24に記載の方法。
(27) 上記生体分子は、上記生体分子は、血管内皮増殖因子(VEGF)、線維芽細胞増殖因子(FGF)および肝細胞増殖因子(HGF)からなる群より選択される遺伝子をコードする核酸である、項目24に記載の方法。
(28) 上記核酸は、ベクターによって送達される、項目26に記載の方法。
(29) 上記生体分子は、ウイルスエンベロープとともに導入される、項目24に記載の方法。
(30) 上記ウイルスエンベロープは、不活性化されている、項目29に記載の方法。
(31) 上記ウイルスエンベロープは、RNAウイルスのエンベロープである、項目29に記載の方法。
(32) 上記ウイルスエンベロープは、パラミクソウイルス属のウイルスのエンベロープである、項目29に記載の方法。
(33) 上記ウイルスエンベロープは、HVJのエンベロープである、項目29に記載の方法。
(34) 上記生体分子は、グリコサミノグリカンとともに導入される、項目24に記載の方法。
(35) 上記グリコサミノグリカンは、ヘパリンである、項目34に記載の方法。
(36) 上記グリコサミノグリカンの分子量は、少なくとも10,000kDaである、項目34に記載の方法。
(37) 上記グリコサミノグリカンは、少なくとも50U/ml含まれる、項目34に記載の方法。
(38) 上記ヘパリンの分子量は、12,000〜15,000kDaである、項目35に記載の方法。
(39) 上記ヘパリンの硫酸化の程度は、薬学的に許容可能である、項目35に記載の方法。
(40) 上記グリコサミノグリカンは、上記生体分子と同時に投与される、項目34に記載の方法。
(41) 上記グリコサミノグリカンは、上記生体分子の投与の前に投与される、項目34に記載の方法。
(42) 上記グリコサミノグリカンは、上記生体分子の投与の後に投与される、項目34に記載の方法。
(43) 上記頭部または頸部の動脈は、1分間〜120分間閉鎖される、項目24に記載の方法。
(44) 上記脳および頸部の動脈は、中大脳動脈または頸動脈である、項目24に記載の方法。
(45) 上記脳および頸部の動脈は、中大脳動脈である、項目24に記載の方法。
(46) 上記生体分子は、頸動脈、視床、脳室内または髄腔内に投与される、項目24に記載の方法。
(47) 上記生体分子は、頸動脈に投与される、項目24に記載の方法。
(48) 脳内に生体分子を送達するためのキットであって、
1)生体分子;ならびに
2)上記生体分子を投与する方法を指示する指示書であって、上記方法は、
A)頭部または頸部の動脈を一過的に閉鎖する工程;および
B)上記頭部または頸部の動脈が閉鎖されている間に、上記生体分子を脳内に導入する工程、
を包含する、指示書、
を備える、キット。
(49) 上記生体分子は、核酸、ポリペプチド、脂質、糖、およびそれらの複合分子からなる群より選択される、項目48に記載のキット。
(50) 上記生体分子は、核酸を含む、項目48に記載のキット。
(51) 上記生体分子は、血管内皮増殖因子(VEGF)、線維芽細胞増殖因子(FGF)および肝細胞増殖因子(HGF)からなる群より選択される遺伝子をコードする核酸である、項目48に記載のキット。
(52) 上記核酸は、ベクターによって送達される、項目48に記載のキット。
(53) さらにウイルスエンベロープを含む、項目48に記載のキット。
(54) 上記ウイルスエンベロープは、不活性化されている、項目53に記載のキット。
(55) 上記ウイルスエンベロープは、RNAウイルスのエンベロープである、項目53に記載のキット。
(56) 上記ウイルスエンベロープは、パラミクソウイルス属のウイルスのエンベロープである、項目53に記載のキット。
(57) 上記ウイルスエンベロープは、HVJのエンベロープである、項目53に記載のキット。
(58) さらにグリコサミノグリカンを含む、項目48に記載のキット。
(59) 上記グリコサミノグリカンは、ヘパリンである、項目58に記載のキット。
(60) 上記グリコサミノグリカンの分子量は、少なくとも10,000kDaである、項目58に記載のキット。
(61) 上記グリコサミノグリカンは、少なくとも50U/ml含まれる、項目58に記載のキット。
(62) 上記ヘパリンの分子量は、12,000〜15,000kDaである、項目59に記載のキット。
(63) 上記ヘパリンの硫酸化の程度は、薬学的に許容可能である、項目59に記載のキット。
(64) 上記グリコサミノグリカンは、上記生体分子と同時に投与される、項目58に記載のキット。
(65) 上記グリコサミノグリカンは、上記生体分子の投与の前に投与される、項目58に記載のキット。
(66) 上記グリコサミノグリカンは、上記生体分子の投与の後に投与される、項目58に記載のキット。
(67) 上記頭部または頸部の動脈は、1分間〜120分間閉鎖される、項目48に記載のキット。
(68) 上記脳および頸部の動脈は、中大脳動脈または頸動脈である、項目48に記載のキット。
(69) 上記脳および頸部の動脈は、中大脳動脈である、項目48に記載のキット。
(70) 上記生体分子は、頸動脈、視床、脳室内または髄腔内に投与される、項目48に記載のキット。
(71) 上記生体分子は、頸動脈に投与される、項目48に記載のキット。
(72) 脳内に生体分子を送達するためのキットを製造するための生体分子の使用であって、上記キットは、
1)生体分子;ならびに
2)上記生体分子を投与する方法を指示する指示書であって、上記方法は、
A)頭部または頸部の動脈を一過的に閉鎖する工程;および
B)上記頭部または頸部の動脈が閉鎖されている間に、上記生体分子を脳内に導入する工程、
を包含する、指示書、
を備える、使用。
本発明の作用および効果は、本明細書の記載から当業者に明らかであることが理解される。
図1は、HVJ−Eベクターを用いてVenus遺伝子でトランスフェクトした、培養ラット大脳皮質ニューロンおよびグリア細胞の代表例。Venusの走査型共焦点レーザー顕微鏡の画像(a,d,g)、MAP2の免疫蛍光染色の画像(b)、NeuNの免疫蛍光染色の画像(d)、GFAPの免疫蛍光染色の画像(h)、および混合した画像(c,f,i)。Venusを発現する細胞のほとんどは、MAP2またはNeuNについて免疫ポジティブであった(a〜f)。これらの実験は、少なくとも5回繰り返した。
図2は、定位注射を用いたEGFPプラスミドの脳へのインビボ遺伝子移入。走査型共焦点レーザー顕微鏡の蛍光画像。視床への定位注射(a,b)は、その注射部位における限定された発現を示した。側脳室への定位注射(c,d)は、脈絡叢および脳室上衣細胞における発現を示す(e,f)。CP:脈絡叢、LV:側脳室、Str:線条、EP:脳室上衣細胞層。これらの実験は、少なくとも3回繰り返した。
図3は、大槽を介した注射によるVenusプラスミドの脳へのインビボ遺伝子移入。OB:嗅球、FC:前頭皮質、M:髄膜。これらの実験は、少なくとも3回繰り返した。
図4は、中大脳動脈の一過性閉塞後の、頸動脈を介したVenus遺伝子移入に起因する蛍光。60分間の左中大脳動脈の一過性閉塞の、3日後の冠状縫合切断。Venus遺伝子を有するHVJ−Eベクターを、再灌流の間に左頸動脈に注入した。遺伝子発現は、梗塞病変においてのみ観察され、一方、蛍光は対側半球の中に検出され得なかった。これらの実験は、少なくとも3回繰り返した。
図5は、中大脳動脈の一過性閉塞後の頸動脈への遺伝子移入後の、損傷半球および対側半球の中のルシフェラーゼ活性。ルシフェラーゼ活性を、60分間の左中大脳動脈の一過性閉塞の1日後に測定した。ルシフェラーゼ遺伝子を含むHVJ−Eベクターを、再灌流の間に左頸動脈に注入した。各群についてn=5。
図6は、ルシフェラーゼ活性に対するヘパリンの影響。ルシフェラーゼ活性を、大槽を介したpGL3ルシフェラーゼ遺伝子のトランスフェクトの1日後に測定した。ヘパリンを、0、10、50、または100U/mlの濃度でベクターに添加した。**0、10および100U/mlに対してP<0.05。各群についてn=3。
図2は、定位注射を用いたEGFPプラスミドの脳へのインビボ遺伝子移入。走査型共焦点レーザー顕微鏡の蛍光画像。視床への定位注射(a,b)は、その注射部位における限定された発現を示した。側脳室への定位注射(c,d)は、脈絡叢および脳室上衣細胞における発現を示す(e,f)。CP:脈絡叢、LV:側脳室、Str:線条、EP:脳室上衣細胞層。これらの実験は、少なくとも3回繰り返した。
図3は、大槽を介した注射によるVenusプラスミドの脳へのインビボ遺伝子移入。OB:嗅球、FC:前頭皮質、M:髄膜。これらの実験は、少なくとも3回繰り返した。
図4は、中大脳動脈の一過性閉塞後の、頸動脈を介したVenus遺伝子移入に起因する蛍光。60分間の左中大脳動脈の一過性閉塞の、3日後の冠状縫合切断。Venus遺伝子を有するHVJ−Eベクターを、再灌流の間に左頸動脈に注入した。遺伝子発現は、梗塞病変においてのみ観察され、一方、蛍光は対側半球の中に検出され得なかった。これらの実験は、少なくとも3回繰り返した。
図5は、中大脳動脈の一過性閉塞後の頸動脈への遺伝子移入後の、損傷半球および対側半球の中のルシフェラーゼ活性。ルシフェラーゼ活性を、60分間の左中大脳動脈の一過性閉塞の1日後に測定した。ルシフェラーゼ遺伝子を含むHVJ−Eベクターを、再灌流の間に左頸動脈に注入した。各群についてn=5。
図6は、ルシフェラーゼ活性に対するヘパリンの影響。ルシフェラーゼ活性を、大槽を介したpGL3ルシフェラーゼ遺伝子のトランスフェクトの1日後に測定した。ヘパリンを、0、10、50、または100U/mlの濃度でベクターに添加した。**0、10および100U/mlに対してP<0.05。各群についてn=3。
以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。
本明細書において「ウイルス」とは、DNAまたはRNAのいずれかをゲノムとして有する、感染細胞内だけで増殖する感染性の微小構造体をいう。ウイルスとしては、レトロウイルス科、トガウイルス科、コロナウイルス科、フラビウイルス科、パラミクソウイルス科、オルトミクソウイルス科、ブニヤウイルス科、ラブドウイルス科、ポックスウイルス科、ヘルペスウイルス科、バキュロウイルス科およびヘパドナウイルス科からなる群より選択される科に属するウイルスが挙げられる。本明細書において好ましくは、使用されるウイルスは、オルトミクソウイルス科のインフルエンザウイルスまたはセンダイウイルスであり得る。本明細書においてより好ましくは、使用されるウイルスは、センダイウイルスである。
本明細書において「センダイウイルス」または「HVJ」(Hemagglutinating virus of Japan)とは、互換的に用いられ、パラミクソウイルス科パラミクソウイルス属に属する、細胞融合作用を有するウイルスをいう。M.Kuroyaら(1953)がセンダイウイルスとして報告した。ゲノムは,約15500塩基長のマイナス鎖RNAである。センダイウイルスのウイルス粒子にはエンベロープがあり、直径150〜300nmの多形性を示す。センダイウイルスは、RNAポリメラーゼを有する。熱に不安定で,ほとんどあらゆる種類の赤血球を凝集し、溶血性も示す。発育鶏卵および/または各種動物の腎臓由来培養細胞の細胞質中で増殖する。センダイウイルスは、株細胞に感染させた場合は持続感染を起こしやすい。種々の細胞を融合する能力をもつことから、細胞のヘテロカリオン形成、雑種細胞の作製などの細胞融合に広く利用されている。
本明細書において「(ウイルス)エンベロープ」とは、センダイウイルスなどの特定のウイルスに存在するヌクレオキャプシドの周囲を取り囲む脂質二重層を基本とする膜構造をいう。エンベロープは、通常、細胞から出芽によって成熟するウイルスにみられる。エンベロープは、概してウイルス遺伝子によりコードされたスパイクタンパク質からなる小突起構造物と宿主由来の脂質とからなる。したがって、「(ウイルス)エンベロープベクター」は、エンベロープをベクター(運び屋)として利用する際の名称であり、本明細書では、場合に応じて(ウイルス)エンベロープと互換可能に使用され得る。
本明細書において「グリコサミノグリカン」とは、ヘキソサミンを主成分とする多糖をいう。そのようなグリコサミノグリカンとしては、例えば、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、およびそれらの混合物が挙げられるがそれらに限定されない。ここで、ヘキソサミンとは、ヘキソースの水酸基がアミノ基に置きかわった化合物をいう。グリコサミノグリカンは上述のような分類が通常されているが、明確な分類が難しい場合もあり、例えば一部にコンドロイチン硫酸構造、一部にデルマタン硫酸構造をもったものなども報告されている。Streptococcus(Group A)によっても合成分泌されるヒアルロン酸を除けば、ほぼすべてのグリコサミノグリカンは動物細胞(主に結合組織系の細胞)によってつくられるプロテオグリカンの側鎖成分であり、コア蛋白質部分を酵素分解するか、あるいは蛋白質中のセリンまたはスレオニンに結合しているエステル型の場合は,アルカリ処理で蛋白質とグリコサミノグリカン側鎖の結合を切断することによって得られる。グリコサミノグリカンの陰イオン性で高分子の構造は多数の水分子を含ませるのに有用である。本明細書では、グリコサミノグリカンは、グルコサミノグリカンおよびガラクトサミノグリカンの両方を含む。ガラクトサミノグリカンとは、ガラクトサミンを含むグリコサミノグリカンであり、例示として、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸などが挙げられる。グルコサミノグリカンは、グルコサミンを含むグリコサミノグリカンであり、例えば、ヘパリン、ヘパラン硫酸などが挙げられる。
本明細書において「ヘパリン」とは、基本的にD−グルコサミンとD−グルクロン酸とからなる(例えば、交互に重合した)グリコサミノグリカンをいう。硫酸はほとんどすべてのグルコサミンの2,6位のアミノ基のほか、その6位の水酸基、ウロン酸の2位にも結合している。動物のマスト細胞が合成し、硫酸基、カルボキシル基が多く存在することから、負電荷をもつ高分子電解質である。血液凝固抑制作用を有する。
本明細書において「硫酸化」とは、硫酸基がある置換基(例えば、アミノ基、水酸基など)に置き換わることをいう。硫酸化の程度は、その分子の電荷の程度を決定する重要な因子であり、細胞膜表面の郷土に変化を与えることにより、本発明のウイルスエンベロープの送達効率にも影響を与え得ると考えられる。したがって、好ましくは、硫酸化の程度として、薬学的に許容可能であるものが使用される。
本明細書において使用される用語「生体分子」とは、生体に関連する分子をいう。本明細書において「生体」とは、生物学的な有機体をいい、動物、植物、菌類、ウイルスなどを含むがそれらに限定されない。生体分子は、生体から抽出される分子を包含するが、それに限定されず、生体に影響を与え得る分子であれば生体分子の定義に入る。したがって、コンビナトリアルケミストリなどで合成された分子、医薬品として利用され得る低分子(たとえば、低分子リガンドなど)もまた生体への効果が意図され得るかぎり、生体分子の定義に入る。そのような生体分子には、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、核酸(例えば、cDNA、ゲノムDNAのようなDNA、mRNAのようなRNAを含む)、ポリサッカリド、オリゴサッカリド、脂質、低分子(例えば、ホルモン、リガンド、情報伝達物質、有機低分子など)、これらの複合分子などが包含されるがそれらに限定されない。好ましくは、生体分子は、核酸またはタンパク質を含む。別の好ましい実施形態では、生体分子は、核酸(例えば、ゲノムDNAまたはcDNA、あるいはPCRなどによって合成されたDNA)である。他の好ましい実施形態では、生体分子はタンパク質であり得る。
本明細書において「生物学的活性」とは、ある因子(例えば、ウイルス、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド)が、生体内において有し得る活性のことをいい、種々の機能を発揮する活性が包含される。例えば、ある因子が転写因子である場合、転写活性を調節する活性を包含する。ある因子がウイルスである場合、その生物学的活性は、そのウイルスが持つ感染活性を包含する。別の例では、ある因子がリガンドである場合、そのリガンドが対応するレセプターへの結合を包含する。そのような生物学的活性は、「不活性化」され得る。
本明細書において「不活性化」とは、ウイルス(例えば、センダイウイルス)について言及されるとき、ゲノムが不活性化されることをいう。不活性化されたウイルスは、複製欠損である。不活性化は、本明細書において記載される方法(例えば、アルキル化など)によって達成される。そのような不活性化の方法としては、例えば、(a)ウイルス(例えば、HVJ)をアルキル化剤で処理して不活性化する工程、(b)ウイルスまたは不活性化されたウイルスの濃縮液を得る工程、並びに(c)ウイルスまたは不活性化されたウイルスをカラムクロマトグラフィー次いで限外濾過により精製する工程を含む方法、ならびにこれらの工程の順序を入れ替えた方法などが挙げられるがそれらに限定されない。
本明細書において「アルキル化」とは、有機化合物の水素原子をアルキル基で置換する作用を有すことをいい、「アルキル化剤」(alkylating agent)とは、アルキル基を与える化合物をいう。アルキル化剤としては、例えば、ハロゲン化アルキル,硫酸ジアルキル、スルホン酸アルキル、アルキル亜鉛などの有機金属化合物が挙げられる。好ましいアルキル化剤としては、β−プロピオラクトン、ブチロラクトン、ヨウ化メチル、ヨウ化エチル、ヨウ化プロピル、臭化メチル、臭化エチル、臭化プロピル、ジメチル硫酸、ジエチル硫酸などが挙げられるがそれらに限定されない。
本明細書において、「核酸」、「核酸分子」、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、特に言及する場合を除き互換的に用いられ、一連のヌクレオチドからなる高分子(重合体)をいう。ヌクレオチドとは、部分がリン酸エステルになっているヌクレオシドをいう。塩基部分としては、ピリミジン塩基またはプリン塩基のヌクレオチド(ピリミジンヌクレオチドおよびプリンヌクレオチド)がある。ポリヌクレオチドとしては、DNAまたはRNAが挙げられる。
本明細書において「ヌクレオチド」は、天然のものでも非天然のものでもよい。「誘導体ヌクレオチド」とは、天然に存在するヌクレオチドとは異なるがもとのヌクレオチドと同様の機能を有するものをいう。そのような誘導体ヌクレオチドは、当該分野において周知である。
本明細書において、核酸分子の「断片(フラグメント)」とは、参照核酸分子の全長よりも短く、本発明の因子としての使用に充分な長さを有するポリヌクレオチドをいう。したがって、本明細書におけるフラグメントは、全長のポリヌクレオチド(長さがn)に対して、1〜n−1までの配列長さを有するポリヌクレオチドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリヌクレオチドの場合、5、6、7、8、9、10、15,20、25、30、40、50、75、100およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ(例えば、11など)もまた、下限として適切であり得る。相同性は、たとえばAltschulら(J.Mol.Biol.215,403−410(1990))が開発したアルゴリズムを使用した検索プログラムBLASTをデフォルトパラメータを用いることにより、scoreで類似度が示される。
本明細書において、「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」は、互換的に用いられ、一連のアミノ酸からなる高分子をいう。アミノ酸は、炭素原子にカルボキシル基およびアミノ基を有する有機分子をいう。本明細書において好ましくは、アミノ酸は、天然に存在する20種類のアミノ酸であるがこれらに限定されない。
本明細書において、「遺伝子」とは、遺伝形質を規定する因子をいう。通常染色体上に一定の順序に配列している。タンパク質の一次構造を規定する構造遺伝子といい、その発現を左右する調節遺伝子という。本明細書では、「遺伝子」は、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」ならびに/あるいは「タンパク質」「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」をさすことがある。
本明細書で使用される場合、「外来遺伝子」とは、遺伝子導入ベクター内に含まれる、ウイルス以外の起源の核酸配列をいう。本発明の1つの局面において、この外来遺伝子は、遺伝子導入ベクターによって導入された遺伝子が発現するために適切な調節配列(例えば、転写に必要なプロモーター、エンハンサー、ターミネーター、およびポリA付加シグナル、ならびに翻訳に必要なリボゾーム結合部位、開始コドン、終止コドンなど)と作動可能に連結される。本発明の別の局面において、外来遺伝子は、この外来遺伝子の発現のための調節配列を含まない。本発明のさらなる局面において、外来遺伝子は、オリゴヌクレオチドまたはデコイ核酸である。
本明細書において「遺伝子ライブラリー」とは、天然より単離された核酸配列または合成の核酸配列を含む、核酸ライブラリーである。天然より単離された核酸配列の供給源としては、真核生物細胞、原核生物細胞、またはウイルス由来の、ゲノム配列、cDNA配列が挙げられるが、これらに限定されない。天然より単離された配列に、任意の配列(例えば、シグナル、タグなど)を付加したライブラリーもまた、本発明の遺伝子ライブラリーに含まれる。1つの実施態様において、遺伝子ライブラリーは、その中に含まれる核酸配列の、転写および/または翻訳をもたらすプロモーターなどの配列を含む。
本明細書において「スクリーニング」とは、遺伝子ライブラリーのようなライブラリーに対して所望の活性または機能を有するメンバーを選択することまたはそのようなアッセイをいう。そのようなスクリーニングの方法は、当該分野において公知である。
本明細書で使用される場合、「遺伝子導入」とは、生体内またはインビトロにおいて、標的細胞内に、天然、合成または組換えの所望の遺伝子または遺伝子断片を、導入された遺伝子がその機能を維持するように、導入することをいう。本発明において導入される遺伝子または遺伝子断片は、特定の配列を有するDNA、RNAまたはこれらの合成アナログである核酸を包含する。また、本明細書において使用される場合、遺伝子導入、トランスフェクション、およびトランスフェクトは、互換可能に使用される。
本明細書で使用される場合、「遺伝子導入活性」とは、ベクターによる「遺伝子導入」の活性をいい、導入された遺伝子の機能(例えば、発現ベクターの場合、コードされるタンパク質の発現および/またはそのタンパク質の活性など)を指標として検出され得る。
本明細書において遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどの「発現」とは、その遺伝子などがインビボで一定の作用を受けて、別の形態になることをいう。好ましくは、遺伝子、ポリヌクレオチドなどが、転写および翻訳されて、ポリペプチドの形態になることをいうが、転写されてmRNAが作製されることもまた発現の一態様であり得る。より好ましくは、そのようなポリペプチドの形態は、翻訳後プロセシングを受けたものであり得る。本明細書において、遺伝子の発現の「調節」には、遺伝子発現の増強、減少、誘導、消失、遅延化、早期化などが挙げられるがそれらに限定されない。
本明細書において処置の対象とされる遺伝子としては、例えば、酵素、ホルモン、リンホカイン、受容体、成長因子、調節タンパク質、免疫系に影響を与えるポリペプチド、免疫調節因子、抗体などをコードする遺伝子が挙げられるがそれらに限定されない。具体的には、これらの遺伝子は、例えば、ヒト成長ホルモン、インスリン、インターロイキン2、腫瘍壊死因子、神経成長因子(NGF)、表皮増殖因子、組織プラスミノーゲンアクチベーター(TPA)、因子VIII:C、カルシトニン、チミジンキナーゼ、インターフェロン、顆粒球マクロファージ(GMCSF)、エリスロポエチン(EPO)、肝細胞増殖因子(HGF)などをコードする遺伝子があげられるがそれらに限定されない。これら遺伝子は、本発明の医薬において、核酸形態またはポリペプチドの形態で存在し得る。
本明細書において遺伝子について言及する場合、「ベクター」とは、目的のポリヌクレオチド配列を目的の細胞へと移入させることができるものをいう。そのようなベクターとしては、動物個体などの宿主細胞において自律複製が可能であるか、または染色体中への組込みが可能で、本発明のポリヌクレオチドの転写に適した位置にプロモーターを含有しているものが例示される。本明細書において、ベクターはプラスミドであり得る。
「発現ベクター」は、構造遺伝子およびその発現を調節するプロモーターに加えて種々の調節エレメントが宿主の細胞中で作動し得る状態で連結されている核酸配列をいう。調節エレメントは、好ましくは、ターミネーター、薬剤耐性遺伝子のような選択マーカーおよび、エンハンサーを含み得る。生物(例えば、動物)の発現ベクターのタイプおよび使用される調節エレメントの種類が、宿主細胞に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。ヒトの場合、本発明に用いる発現ベクターはさらにpCAGGS(Niwa H et al,Gene;108:193−9(1991))を含み得る。
「組換えベクター」とは、目的のポリヌクレオチド配列を目的の細胞へと移入させることができるベクターをいう。そのようなベクターとしては、動物個体などの宿主細胞において自律複製が可能、または染色体中への組込みが可能で、本発明のポリヌクレオチドの転写に適した位置にプロモーターを含有しているものが例示される。
動物細胞に対する「組換えベクター」としては、pcDNAI/Amp、pcDNAI、pCDM8(いずれもフナコシより市販)、pAGE107(特開平3−22979、Cytotechnology,3,133(1990))、pREP4(Invitrogen)、pAGE103(J.Biochem.,101,1307(1987))、pAMo、pAMoA(J.Biol.Chem.,268,22782−22787(1993))、pCAGGS(Niwa H et al,Gene;108:193−9(1991))などが例示される。
「ターミネーター」は、遺伝子のタンパク質をコードする領域の下流に位置し、DNAがmRNAに転写される際の転写の終結、ポリA配列の付加に関与する配列である。ターミネーターは、mRNAの安定性に関与して遺伝子の発現量に影響を及ぼすことが知られている。ターミネーターとしては、哺乳動物由来のターミネーターのほかに、CaMV35Sターミネーター、ノパリン合成酵素遺伝子のターミネーター(Tnos)、タバコPR1a遺伝子のターミネーターが挙げられるが、これに限定されない。
本明細書において用いられる「プロモーター」とは、遺伝子の転写の開始部位を決定し、またその頻度を直接的に調節するDNA上の領域をいい、RNAポリメラーゼが結合して転写を始める塩基配列である。プロモーターの領域は、通常、推定タンパク質コード領域の第1エキソンの上流約2kbp以内の領域であることが多いので、DNA解析用ソフトウエアを用いてゲノム塩基配列中のタンパク質コード領域を予測すれば、プロモータ領域を推定することはできる。推定プロモーター領域は、構造遺伝子ごとに変動するが、通常構造遺伝子の上流にあるが、これらに限定されず、構造遺伝子の下流にもあり得る。好ましくは、推定プロモーター領域は、第一エキソン翻訳開始点から上流約2kbp以内に存在する。
本明細書において、遺伝子の発現について用いられる場合、一般に、「部位特異性」とは、生物(例えば、動物)の部位(例えば、動物の場合、心臓、心筋細胞など)におけるその遺伝子の発現の特異性をいう。「時期特異性」とは、生物(たとえば、動物)の特定の段階(例えば、発作時など)に応じたその遺伝子の発現の特異性をいう。そのような特異性は、適切なプロモーターを選択することによって、所望の生物に導入することができる。
本明細書において医薬として利用され得るワクチンとしては、例えば、癌、後天性免疫不全症候群、麻疹、単純疱疹などためのワクチンが挙げられるがそれらに限定されない。これらワクチンは、本発明の医薬において、核酸形態またはペプチドの形態で存在し得る。
本発明は、上記のエンベロープを単独で、または安定化化合物、希釈剤、担体、または別の成分または薬剤のような他の薬剤と組み合わせて含む薬学的組成物および医薬を提供する。好ましくは、本発明は、ワクチン形態、遺伝子治療に適した形態であり得る。
本発明の薬学的組成物および医薬は、エンベロープが患部の細胞内または目的とする組織の細胞内に取り込まれるような形態で用いられ得る。
本発明の薬学的組成物および医薬は、任意の無菌生体適合性薬学的キャリア(生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、および水を含むが、それらに限定されない)中で投与され得る。これらの分子のいずれも、適切な賦形剤、アジュバント、および/または薬学的に受容可能なキャリアと混合する薬学的組成物中にて、単独で、あるいは他の薬剤と組み合わせて患者に投与され得る。本発明のある実施形態において、薬学的に受容可能なキャリアーは薬学的に不活性である。
本発明の薬学的組成物および医薬の投与は、経口または非経口により達成される。非経口送達の方法としては、局所、動脈内(例えば、頸動脈を介する)、筋肉内、皮下、髄内、クモ膜下腔内、脳室内、静脈内、腹腔内、または鼻孔内の投与が挙げられる。本発明は、処置部位に到達する経路であれば、どのような経路でもよい。
本明細書において「頭部」とは、頭蓋骨とその内容および関連構造からなる身体の部位をいう。本明細書において「頭部」は脳を包含する。
本明細書において「頸部」とは、脊椎動物の体で,頭部と上肢の間に見られる領域をいう。本明細書において、頭部・頸部または頭頸部という場合は、首より上の部分をさすことがある。
本明細書において「一過的」とは、ある処置を講じたときに、その処置が一時的に続くことをいう。したがって、処置を中止した後には、その処置の効果がなくなるか減弱する。
本明細書において「動脈」とは、血液を心臓から体各部に送り出す血管をいう。したがって、「脳動脈」は、脳に存在する動脈をいう。
本明細書において動脈または血管を「閉鎖する」とは、血流がその処置をしない場合に比べて顕著に減ずるかまたは停止するような処置を講じることをいう。好ましくは、閉鎖する際には出血を生じさせないことが好ましい。動脈または血管を閉鎖する手段としては、バルーンカテーテル、クリッピングなどが使用されるがそれらに限定されない。
本明細書において生体分子をある空間(例えば、細胞内)に「導入する」とは、その生体分子が別の空間からその空間に移動されることをいう。そのような導入には、どのような手段を用いてもよく、能動的であっても受動的であってもよい。
本明細書において「システム」とは、多くの構成要素からなる物をいい、医薬、農薬、組成物(例えば、薬学的組成物)、ワクチン、キットなどの概念を包含する。
本発明では、導入にはウイルスエンベロープが使用されるが、ウイルスエンベロープに加えて、本発明の組成物および医薬は、賦形剤または薬学的に使用できる製剤を調製するために、エンベロープのプロセシングを促進する他の化合物を含む、適切な、薬学的に受容可能なキャリアーを含み得る。処方および投与のための技術のさらなる詳細は、例えば、日本薬局方の最新版および最新追補、「REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES」(Maack Publishing Co.,Easton,PA)の最終版に記載されている。
本明細書において経口投与のための薬学的組成物は、投与に適した投与形において当該分野で周知の薬学的に受容可能なキャリアを用いて処方され得る。このようなキャリアは、薬学的組成物が患者による摂取に適した錠剤、丸剤、糖衣剤、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁物などに処方されることを可能とする。
経口使用のための薬学的組成物は、活性化合物を固体賦形剤と組合せ、所望により得られた混合物を粉砕し、所望ならば、錠剤または糖衣剤のコアを得るために、適切なさらなる化合物を添加した後、顆粒の混合物をプロセシングすることを介して得られ得る。適切な賦形剤は炭水化物またはタンパク質充填剤であり、以下を含むが、それらに限定されない:ラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトールを含む糖;トウモロコシ、コムギ、イネ、ジャガイモ、または他の植物由来のデンプン;メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、またはカルボキシメチルセルロースナトリウムのようなセルロース;ならびにアラビアゴムおよびトラガカントゴムを含むゴム;ならびにゼラチンおよびコラーゲンのようなタンパク質。所望ならば、架橋されたポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸またはその塩(例えば、アルギン酸ナトリウム)のような崩壊剤または可溶化剤が添加され得る。
糖衣剤コアは、濃縮糖溶液のような適切なコーティングとともに提供される。これはまた、アラビアガム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポルゲル、ポリエチレングリコール、および/または二酸化チタン、ラツカー溶液、および適切な有機溶媒または溶媒混合液をも含有し得る。製品同定のため、または活性化合物の量(すなわち用量)を特徴付けるために、染料または色素が錠剤または糖衣剤に添加され得る。
経口で使用され得る薬学的組成物は、例えば、ゼラチンカプセル、ゼラチンおよびコーティング(例えば、グリセロールまたはソルビトール)よりなるソフト封着カプセルを含む。ゼラチンカプセルは、ラクトースまたは澱粉のような充填剤またはバインダー、タルクまたはステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、および所望により安定化剤と混合した活性な成分を含有し得る。ソフトカプセルでは、エンベロープは、安定化剤とともにまたはともなわずに、脂肪油、流動パラフィンまたは液状ポリエチレングリコールのような適切な液体に溶解または懸濁され得る。
非経口投与用の薬学的製剤は活性化合物の水溶液を含む。注射のために、本発明の薬学的組成物は水溶液、好ましくはハンクスの溶液、リンゲル溶液、または緩衝化生理食塩水のような生理学的に適合する緩衝液中に処方され得る。水性注射懸濁物は、懸濁物の粘度を増加させる物質(例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール、またはデキストラン)を含有し得る。さらに、活性化合物の懸濁物は、適切な油状注射懸濁物として調製され得る。適切な親油性溶媒またはビヒクルは、ゴマ油のような脂肪酸、あるいはオレイン酸エチルまたはトリグリセリドのような合成脂肪酸エステル、またはリポソームを含む。所望により、懸濁物は、高濃度溶液の製剤を可能にする安定化剤または化合物の溶解度を増加させる適切な薬剤または試薬を含有し得る。
本発明の薬学的組成物は、当該分野で公知の様式と同様の様式(例えば、従来的な混合、溶解、顆粒化、糖衣剤作製、水簸、乳化、カプセル化、包括、または凍結乾燥の手段によって)で製造され得る。
本発明の薬学的組成物は、本発明のエンベロープが意図される目的を達成するのに有効な量で含有される組成物を含む。「治療的有効量」または「薬理学的有効量」は当業者に十分に認識される用語であり、意図される薬理学的結果を生じるために有効な薬剤の量をいう。従って、治療的有効量は、処置されるべき疾患の徴候を軽減するのに十分な量である。所定の適用のための有効量(例えば、治療的有効量)を確認する1つの有用なアッセイは、標的疾患の回復の程度を測定することである。実際に投与される量は、処置が適用されるべき個体に依存し、好ましくは、所望の効果が顕著な副作用をともなうことなく達成されるように最適化された量である。治療的有効用量の決定は十分に当業者の能力内にある。
いずれの化合物についても、治療的有効用量は、細胞培養アッセイまたは任意の適切な動物モデルのいずれかにおいて、最初に見積もられ得る。動物モデルはまた、所望の濃度範囲および投与経路を達成するために用いられる。次いで、このような情報を用いて、ヒトにおける投与に有用な用量および経路を決定することができる。
治療的有効量とは、疾患の徴候または状態を軽減するエンベロープの量をいう。このような化合物の治療効果および毒性は、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順(例えば、ED50、集団の50%において治療的に有効な用量;およびLD50、集団の50%に対して致死的である用量)によって決定され得る。治療効果と毒性効果との間の用量比は治療係数であり、それは比率ED50/LD50として表され得る。大きな治療係数を呈する薬学的組成物が好ましい。細胞培養アッセイおよび動物実験から得られたデータが、ヒトでの使用のための量の範囲を公式化するのに使用される。このような化合物の用量は、好ましくは、毒性をほとんどまたは全くともなわないED50を含む循環濃度の範囲内にある。この用量は、使用される投与形態、患者の感受性、および投与経路に依存してこの範囲内で変化する。一例として、エンベロープの投与量は、年齢その他の患者の条件、疾患の種類、使用するエンベロープの種類等により適宜選択される。
ヒトに本発明のエンベロープベクターを利用して生体分子を投与する場合、1被験体あたり、400〜400,000HAU相当の、好ましくは1,200〜120,000HAU相当の、より好ましくは4,000〜40,000HAU相当のエンベロープベクターが投与され得る。投与されるエンベロープ中に含まれる外来遺伝子の量は、1被験体あたり、2〜2,000μg、好ましくは6〜600μg、より好ましくは20〜200μgであり得る。
本明細書において「HAU」とは、ニワトリ赤血球0.5%を凝集可能なウイルスの活性をいう。1HAUは、ほぼ2400万ウイルス粒子に相当する(Okada,Y.ら、Biken Journal 4,209−213、1961)。上記の量は、例えば、1日1回から数回投与することができる。
正確な用量は、治療されるべき患者を考慮して、個々の臨床医によって選択される。用量および投与は、十分なレベルの活性部分を提供するか、または所望の効果を維持するように調整される。考慮され得るさらなる因子としては、疾患状態の重症度(例えば、腫瘍のサイズおよび位置;患者の年齢、体重、および性別;投与の食餌制限時間、および頻度、薬物組合せ、反応感受性、および治療に対する耐性/応答)が挙げられる。特定の製剤の半減期およびクリアランス速度に応じて、持続作用性薬学的組成物は、3〜4日毎に、毎週、または2週間に1回、投与され得る。特定の用量および送達の方法に関するガイダンスは当該分野で公知の文献に提供されている。
本発明の組成物および医薬はまた、生体親和性材料を含み得る。この生体親和性材料は、例えば、シリコーン、コラーゲン、ゼラチン、グリコール酸・乳酸の共重合体、エチレンビニル酢酸共重合体、ポリウレタン、ポリエチレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリプロピレン、ポリアクリレート、ポリメタクリレートからなる群より選択される少なくとも1つを含み得る。成型が容易であることからシリコーンが好ましい。生分解性高分子の例としては、コラーゲン、ゼラチン、α−ヒロドキシカルボン酸類(例えば、グリコール酸、乳酸、ヒドロキシ酪酸など)、ヒドロキシジカルボン酸類(例えば、リンゴ酸など)およびヒドロキシトリカルボン酸(例えば、クエン酸など)からなる群より選択される1種以上から無触媒脱水重縮合により合成された重合体、共重合体またはこれらの混合物、ポリ−α−シアノアクリル酸エステル、ポリアミノ酸(例えば、ポリ−γ−ベンジル−L−グルタミン酸など)、無水マレイン酸系共重合体(例えば、スチレン−マレイン酸共重合体など)のポリ酸無水物などが挙げられる。重合の形式は、ランダム、ブロック、グラフトのいずれでもよく、α−ヒドロキシカルボン酸類、ヒドロキシジカルボン酸類、ヒドロキシトリカルボン酸類が分子内に光学活性中心を有する場合、D−体、L−体、DL−体のいずれでも用いることが可能である。好ましくは、グリコール酸・乳酸の共重合体が使用され得る。
本発明の組成物および医薬は、徐放性形態で提供され得る。徐放性形態の剤型は、本発明において使用され得る限り、当該分野で公知の任意の形態であり得る。そのような形態としては、例えば、ロッド状(ペレット状、シリンダー状、針状など)、錠剤形態、ディスク状、球状、シート状のような製剤であり得る。徐放性形態を調製する方法は、当該分野において公知であり、例えば、日本薬局方、米国薬局方および他の国の薬局方などに記載されている。徐放剤(持続性投与剤)を製造する方法としては、例えば、複合体から薬物の解離を利用する方法、水性懸濁注射液とする方法、油性注射液または油性懸濁注射液とする方法、乳濁製注射液(o/w型、w/o型の乳濁製注射液など)とする方法などが挙げられる。
本発明の組成物および医薬は、通常は医師の監督のもとで実施されるが、その国の監督官庁および法律が許容する場合は、医師の監督なしに実施することができる。
本発明はまた、ワクチン形態でも提供され得る。ワクチンとは、ある種の疾患(例えば、伝染病、感染症など)の予防(または治療)のため使用される抗原の諸形態(例えば、タンパク質、DNA)をいう。感染、伝播、流行などの諸形式にしたがい、生きた弱毒病原体(生ワクチンlive vaccine)、不活化病原体(またはその一部)、病原体代謝物(毒素、毒素の不活化物すなわちトキソイドなど)、DNAワクチンなどが使用される.ワクチン接種(vaccination)により生物(ヒト・家畜・媒介動物)の体内に能動的につくられる免疫(体液性免疫、細胞性免疫、または両者)が病原体の感染、伝播、流行などを阻止する。
本発明に係るワクチンの剤形は特に問わず、また、その製造も当該分野で用いられている自体公知の方法に従ってよい。また、本発明に係るワクチンは、種々のアジュバントを含む乳濁液としてもよい。アジュバントは、含まない形態を投与した場合よりも、少ない量のワクチンを用いて、少ない投与量で、持続する高レベルの免疫性を持続させるのを助けるものである。アジュバントの例には、フロインドのアジュバント(完全または不完全)、アジュバント65(落下生油、マンナイドモノオレエートおよびアルミニウムモノステアレートを含む)、および水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムまたはミョウバンのごとき鉱物ゲルがある。ヒトおよび食用動物のためのワクチンには、アジュバント65を用いるのが好ましい。また、商業的動物用ワクチンには、鉱物ゲルを用いるのが好ましい。
本発明に係るワクチンには、上記アジュバントの他に例えば、希釈剤、香料、防腐剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、界面活性剤、可塑剤などから選択される1または2以上の製剤用添加物を含有させてもよい。
本発明に係るワクチンの投与経路は、特に限定されないが、非経口的に投与することが好ましい。非経口投与としては、例えば、頸動脈内、静脈内、動脈内、皮下、真皮内、筋肉内または腹腔内の投与が挙げられる。好ましくは、頸動脈内投与で本発明のワクチンが投与され得る。
本発明に係るワクチンの1回の投与量は、投与の目的により、また感染が初感染か再感染かにより、さらに患者の年齢および体重、症状および疾患の重篤度などの種々の条件に応じて適宜選択することが可能である。再感染により惹起される病気の治療を目的とする場合、本発明に係るワクチンの投与量は、体重1kgあたり約0.01ng〜10mg程度、より好ましくは約0.1ng〜1mg程度であり得る。
本発明に係るワクチンの投与回数は、上記のような種々の条件により異なるので、一概には言えないが、日単位から週単位の間隔で繰り返して投与するのが好ましい。中でも、約2〜4週間程度の間隔で、数回、好ましくは約1〜2回程度投与するのが好ましい。疾患症候学または抗体価を用いる基本的な検査により疾患の状態をモニターしながら投与回数(投与時間)を決定するのがより好ましい。
本明細書において、病因因子(例えば、ウイルス(例えば、HIV、インフルエンザウイルス、ロタウイルスなど)または細菌)を処置または予防するための組成物(例えば、ワクチン)が提供される。そのような組成物は、例えば、その病因因子の遺伝子またはタンパク質を少なくとも1つ含む。含まれる外来遺伝子は、全長が好ましいが、免疫を惹起し得るエピトープを少なくとも一つ含んでいれば、部分配列でもよい。本明細書において、「エピトープ」とは、構造の明らかな抗原決定基をいう。エピトープを決定する方法は、当該分野において周知であり、そのようなエピトープは、核酸またはアミノ酸の一次配列が提供されると、当業者はそのような周知慣用技術を用いて決定することができる。エピトープとして使用するためには、少なくとも3アミノ酸の長さの配列が必要であり、好ましくは、この配列は、少なくとも4アミノ酸、5アミノ酸、6アミノ酸、7アミノ酸、8アミノ酸、9アミノ酸、10アミノ酸、15アミノ酸、20アミノ酸、25アミノ酸の長さの配列が必要であり得る。
本明細書において「中和抗体」とは、酵素、毒素、細菌またはウイルスなど抗原の生物学的活性を中和する、中和反応に関与する抗体をいう。中和抗体は。ウイルスが結合すると活性が失われる。中和反応とは、抗原が中和抗体と結合すると、それらの活性が消失あるいは低下する反応をいう。ワクチンを投与すると、中和抗体ができ、その中和抗体の働きにより、病因を駆逐する働きが達成される。
本明細書において「遺伝子治療」または「遺伝子療法」とは、遺伝子の傷害(または欠陥)に起因する疾患を、患者に健全な核酸(例えば、DNA)を導入することにより、または改変された核酸(例えば、DNA)を導入することにより治療しようとする方法をいう。遺伝子治療には、裸で核酸を注入する工程を利用する方法もあるが、何らかのベクターを利用することが多く、本発明では、ウイルスエンベロープをそのようなベクターとして使用し得る。
本発明は、組成物および医薬を含むキット形態でも提供される。このキットは、本発明の組成物および医薬;ならびにこの組成物および医薬を投与する指針を与える指示書を備える。ここで、上記指示書は、組成物および医薬の適切な投与方法を指示する文言が記載されている。この指示書は、本発明が実施される国の監督官庁(例えば、日本であれば厚生労働省、米国であれば食品医薬品局(FDA)など)が規定した様式に従って作成され、その監督官庁により承認を受けた旨が明記される。指示書は、いわゆる添付文書(package insert)であり、通常は紙媒体で提供されるが、それに限定されず、例えば、電子媒体(例えば、インターネットで提供されるホームページ、電子メール)のような形態でも提供され得る。
本発明の方法において使用される組成物および医薬の量は、使用目的、対象疾患(種類、重篤度など)、被験体の年齢、体重、性別、既往歴、細胞生理活性物質の形態または種類、細胞の形態または種類などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。
本発明の方法を被検体(または患者)に対して施す頻度もまた、使用目的、対象疾患(種類、重篤度など)、患者の年齢、体重、性別、既往歴、および治療経過などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。頻度としては、例えば、毎日−数ヶ月に1回(例えば、1週間に1回−1ヶ月に1回)の投与が挙げられる。1週間−1ヶ月に1回の投与を、経過を見ながら施すことが好ましい。
本発明の組成物および医薬は、宿主に導入されるべき物質または医薬成分を含む。そのような物質または医薬成分は、生体高分子であり得る。好ましくは、生体高分子は、核酸、ポリペプチド、糖、脂質、およびそれらの複合体からなる群より選択される。好ましくは、医薬成分は、導入される宿主において発現されるポリペプチドをコードする核酸であり得る。
本発明の組成物および医薬は、1つ以上のさらなる医薬成分を含み得る。そのような成分としては、例えば、さらなる医薬成分として、例えば、以下が挙げられるがそれらに限定されない成分がその薬学的組成物に含有され得る:
中枢神経系用薬(例えば、全身麻酔剤、催眠鎮静剤、抗不安剤、抗てんかん剤、解熱鎮痛消炎剤、興奮剤、抗パーキンソン剤、精神神経用剤、総合感冒剤、その他の中枢神経系用薬など);
末梢神経用剤(例えば、局所麻酔剤、骨格筋弛緩剤、自律神経剤、鎮けい剤など);
感覚器官用薬(例えば、眼科用剤、耳鼻科用剤、鎮暈剤など);
循環器官用薬(例えば、、強心剤、不整脈用剤、利尿剤、血圧降下剤、血管収縮剤、血管拡張剤、高脂血症用剤、その他の循環器官用薬など);
呼吸器官用薬(例えば、呼吸促進剤、鎮咳剤、去痰剤、鎮咳去痰剤、気管支拡張剤、含嗽剤など);
消化器官用薬(例えば、止瀉剤、整腸剤、消化性潰瘍用剤、健胃消化剤、制酸剤、下剤、浣腸剤、利胆剤、その他の消化器官用薬など);
ホルモン剤(例えば、脳下垂体ホルモン剤、唾液腺ホルモン剤、甲状腺、副甲状腺ホルモン剤、蛋白同化ステロイド剤、副腎ホルモン剤、男性ホルモン剤、卵胞ホルモン剤、黄体ホルモン剤、混合ホルモン剤、その他のホルモン剤など);
泌尿生殖器官および肛門用薬(例えば、泌尿器官用剤、生殖器官用剤、子宮収縮剤、痔疾用剤、他の泌尿生殖器管、肛門用薬など);
外皮用薬(例えば、外皮用殺菌消毒剤、創傷保護剤、化膿性疾患用剤、鎮痛剤、鎮痒剤、収斂剤、消炎剤、寄生性皮膚疾患用剤、皮膚軟化剤、毛髪用剤、その他の外皮用剤など);
歯科口腔用剤;
その他の個々の器官系用薬;
ビタミン剤(例えば、ビタミンA剤、ビタミンD剤、ビタミンB剤、ビタミンC剤、ビタミンE剤、ビタミンK剤、混合ビタミン剤、その他のビタミン剤など);
滋養強壮薬(例えば、カルシウム剤、無機質製剤、糖類剤、蛋白アミノ酸製剤、臓器製剤、乳幼児用剤、その他の滋養強壮剤など);
血液および体液用薬(例えば、血液代用剤、止血剤、血液凝固阻止剤、その他の血液.体液用剤など);
人工透析用薬(例えば、人工腎臓透析用剤、腹膜透析用剤など);
その他の代謝性医薬品(例えば、臓疾患用剤、解毒剤、習慣性中毒用剤、痛風治療剤、酵素製剤、糖尿病用剤、他に分類されない代謝性薬など);
細胞賦活用剤(例えば、クロロフィル製剤、色素製剤、その他の細胞賦活用剤など);
腫瘍用薬(例えば、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗腫瘍性抗生物質製剤、抗腫瘍性植物成分製剤、その他の腫瘍用剤など);
放射性医薬品;
アレルギー用薬(例えば、抗ヒスタミン剤、刺激療法剤、非特異性免疫原製剤、その他のアレルギー用薬、生薬および漢方処方に基づく医薬品、生薬、漢方製剤、その他の生薬漢方処方に基づく製剤など);
抗生物質製剤(例えば、グラム陽性菌に作用する、グラム陰性菌に作用する、グラム陽・陰性菌に作用、グラム陽性菌マイコプラズマ作用、グラム陽性陰性.リケッチアに作用、抗酸菌に作用するもの、カビに作用するもの、その他の抗生物質製剤など);
化学療法剤(例えば、サルファ剤、抗結核剤、合成抗菌剤、抗ウィルス剤、その他の化学療法剤など);
生物学的製剤(例えば、ワクチン類、毒素.トキソイド類、抗毒素.抗レプトスピラ血清、血液製剤類、生物学的試験用製剤類、その他の生物学的製剤、抗原虫剤、駆虫剤など);
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり、慣用されるものであり、例えば、Ausubel F.A.ら編(1988)、Current Protocols in Molecular Biology、Wiley、New York、NY;Sambrook Jら (1987)Molecular Cloning: A Laboratory Manual,2nd Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY、別冊実験医学「遺伝子導入&発現解析実験法」羊土社、1997などに記載される。
ウイルス(例えば、HVJ)はニワトリの受精卵への種ウイルスの接種により増殖されたものが一般に使用され得るが、サル、ヒトなどの培養細胞、培養組織への持続感染系(培養液中にトリプシンなどの加水分解酵素を添加する)を利用して増殖させたもの、クローニングされたウイルスゲノムを培養細胞に感染させ持続感染をおこさせて増殖させたものおよびこれらの変異株のすべてが本発明で使用可能である。また、他の方法で入手可能なウイルス(例えば、HVJ)も使用することが可能である。組換え型HVJ(Hasan M.K.ら、Journal of General Virology、78、2813〜2830、1997年またはYonemitsu Y.ら Nature Biotechnology 18、970〜973、2000年)なども使用可能である。HVJとして何れのものでも良いが、Z株(例えば、寄託番号ATCC VA 2388またはCharles River SPAFASから販売されているものが使用できる)またはCanteII株(例えば、M.D.Johnston J.Gen.Virol.、56、175〜184、1981年に記載されたものまたはCharles River SPAFASから販売されているものが使用できる)がより望ましい。
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。
本明細書において「ウイルス」とは、DNAまたはRNAのいずれかをゲノムとして有する、感染細胞内だけで増殖する感染性の微小構造体をいう。ウイルスとしては、レトロウイルス科、トガウイルス科、コロナウイルス科、フラビウイルス科、パラミクソウイルス科、オルトミクソウイルス科、ブニヤウイルス科、ラブドウイルス科、ポックスウイルス科、ヘルペスウイルス科、バキュロウイルス科およびヘパドナウイルス科からなる群より選択される科に属するウイルスが挙げられる。本明細書において好ましくは、使用されるウイルスは、オルトミクソウイルス科のインフルエンザウイルスまたはセンダイウイルスであり得る。本明細書においてより好ましくは、使用されるウイルスは、センダイウイルスである。
本明細書において「センダイウイルス」または「HVJ」(Hemagglutinating virus of Japan)とは、互換的に用いられ、パラミクソウイルス科パラミクソウイルス属に属する、細胞融合作用を有するウイルスをいう。M.Kuroyaら(1953)がセンダイウイルスとして報告した。ゲノムは,約15500塩基長のマイナス鎖RNAである。センダイウイルスのウイルス粒子にはエンベロープがあり、直径150〜300nmの多形性を示す。センダイウイルスは、RNAポリメラーゼを有する。熱に不安定で,ほとんどあらゆる種類の赤血球を凝集し、溶血性も示す。発育鶏卵および/または各種動物の腎臓由来培養細胞の細胞質中で増殖する。センダイウイルスは、株細胞に感染させた場合は持続感染を起こしやすい。種々の細胞を融合する能力をもつことから、細胞のヘテロカリオン形成、雑種細胞の作製などの細胞融合に広く利用されている。
本明細書において「(ウイルス)エンベロープ」とは、センダイウイルスなどの特定のウイルスに存在するヌクレオキャプシドの周囲を取り囲む脂質二重層を基本とする膜構造をいう。エンベロープは、通常、細胞から出芽によって成熟するウイルスにみられる。エンベロープは、概してウイルス遺伝子によりコードされたスパイクタンパク質からなる小突起構造物と宿主由来の脂質とからなる。したがって、「(ウイルス)エンベロープベクター」は、エンベロープをベクター(運び屋)として利用する際の名称であり、本明細書では、場合に応じて(ウイルス)エンベロープと互換可能に使用され得る。
本明細書において「グリコサミノグリカン」とは、ヘキソサミンを主成分とする多糖をいう。そのようなグリコサミノグリカンとしては、例えば、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、およびそれらの混合物が挙げられるがそれらに限定されない。ここで、ヘキソサミンとは、ヘキソースの水酸基がアミノ基に置きかわった化合物をいう。グリコサミノグリカンは上述のような分類が通常されているが、明確な分類が難しい場合もあり、例えば一部にコンドロイチン硫酸構造、一部にデルマタン硫酸構造をもったものなども報告されている。Streptococcus(Group A)によっても合成分泌されるヒアルロン酸を除けば、ほぼすべてのグリコサミノグリカンは動物細胞(主に結合組織系の細胞)によってつくられるプロテオグリカンの側鎖成分であり、コア蛋白質部分を酵素分解するか、あるいは蛋白質中のセリンまたはスレオニンに結合しているエステル型の場合は,アルカリ処理で蛋白質とグリコサミノグリカン側鎖の結合を切断することによって得られる。グリコサミノグリカンの陰イオン性で高分子の構造は多数の水分子を含ませるのに有用である。本明細書では、グリコサミノグリカンは、グルコサミノグリカンおよびガラクトサミノグリカンの両方を含む。ガラクトサミノグリカンとは、ガラクトサミンを含むグリコサミノグリカンであり、例示として、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸などが挙げられる。グルコサミノグリカンは、グルコサミンを含むグリコサミノグリカンであり、例えば、ヘパリン、ヘパラン硫酸などが挙げられる。
本明細書において「ヘパリン」とは、基本的にD−グルコサミンとD−グルクロン酸とからなる(例えば、交互に重合した)グリコサミノグリカンをいう。硫酸はほとんどすべてのグルコサミンの2,6位のアミノ基のほか、その6位の水酸基、ウロン酸の2位にも結合している。動物のマスト細胞が合成し、硫酸基、カルボキシル基が多く存在することから、負電荷をもつ高分子電解質である。血液凝固抑制作用を有する。
本明細書において「硫酸化」とは、硫酸基がある置換基(例えば、アミノ基、水酸基など)に置き換わることをいう。硫酸化の程度は、その分子の電荷の程度を決定する重要な因子であり、細胞膜表面の郷土に変化を与えることにより、本発明のウイルスエンベロープの送達効率にも影響を与え得ると考えられる。したがって、好ましくは、硫酸化の程度として、薬学的に許容可能であるものが使用される。
本明細書において使用される用語「生体分子」とは、生体に関連する分子をいう。本明細書において「生体」とは、生物学的な有機体をいい、動物、植物、菌類、ウイルスなどを含むがそれらに限定されない。生体分子は、生体から抽出される分子を包含するが、それに限定されず、生体に影響を与え得る分子であれば生体分子の定義に入る。したがって、コンビナトリアルケミストリなどで合成された分子、医薬品として利用され得る低分子(たとえば、低分子リガンドなど)もまた生体への効果が意図され得るかぎり、生体分子の定義に入る。そのような生体分子には、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、核酸(例えば、cDNA、ゲノムDNAのようなDNA、mRNAのようなRNAを含む)、ポリサッカリド、オリゴサッカリド、脂質、低分子(例えば、ホルモン、リガンド、情報伝達物質、有機低分子など)、これらの複合分子などが包含されるがそれらに限定されない。好ましくは、生体分子は、核酸またはタンパク質を含む。別の好ましい実施形態では、生体分子は、核酸(例えば、ゲノムDNAまたはcDNA、あるいはPCRなどによって合成されたDNA)である。他の好ましい実施形態では、生体分子はタンパク質であり得る。
本明細書において「生物学的活性」とは、ある因子(例えば、ウイルス、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド)が、生体内において有し得る活性のことをいい、種々の機能を発揮する活性が包含される。例えば、ある因子が転写因子である場合、転写活性を調節する活性を包含する。ある因子がウイルスである場合、その生物学的活性は、そのウイルスが持つ感染活性を包含する。別の例では、ある因子がリガンドである場合、そのリガンドが対応するレセプターへの結合を包含する。そのような生物学的活性は、「不活性化」され得る。
本明細書において「不活性化」とは、ウイルス(例えば、センダイウイルス)について言及されるとき、ゲノムが不活性化されることをいう。不活性化されたウイルスは、複製欠損である。不活性化は、本明細書において記載される方法(例えば、アルキル化など)によって達成される。そのような不活性化の方法としては、例えば、(a)ウイルス(例えば、HVJ)をアルキル化剤で処理して不活性化する工程、(b)ウイルスまたは不活性化されたウイルスの濃縮液を得る工程、並びに(c)ウイルスまたは不活性化されたウイルスをカラムクロマトグラフィー次いで限外濾過により精製する工程を含む方法、ならびにこれらの工程の順序を入れ替えた方法などが挙げられるがそれらに限定されない。
本明細書において「アルキル化」とは、有機化合物の水素原子をアルキル基で置換する作用を有すことをいい、「アルキル化剤」(alkylating agent)とは、アルキル基を与える化合物をいう。アルキル化剤としては、例えば、ハロゲン化アルキル,硫酸ジアルキル、スルホン酸アルキル、アルキル亜鉛などの有機金属化合物が挙げられる。好ましいアルキル化剤としては、β−プロピオラクトン、ブチロラクトン、ヨウ化メチル、ヨウ化エチル、ヨウ化プロピル、臭化メチル、臭化エチル、臭化プロピル、ジメチル硫酸、ジエチル硫酸などが挙げられるがそれらに限定されない。
本明細書において、「核酸」、「核酸分子」、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、特に言及する場合を除き互換的に用いられ、一連のヌクレオチドからなる高分子(重合体)をいう。ヌクレオチドとは、部分がリン酸エステルになっているヌクレオシドをいう。塩基部分としては、ピリミジン塩基またはプリン塩基のヌクレオチド(ピリミジンヌクレオチドおよびプリンヌクレオチド)がある。ポリヌクレオチドとしては、DNAまたはRNAが挙げられる。
本明細書において「ヌクレオチド」は、天然のものでも非天然のものでもよい。「誘導体ヌクレオチド」とは、天然に存在するヌクレオチドとは異なるがもとのヌクレオチドと同様の機能を有するものをいう。そのような誘導体ヌクレオチドは、当該分野において周知である。
本明細書において、核酸分子の「断片(フラグメント)」とは、参照核酸分子の全長よりも短く、本発明の因子としての使用に充分な長さを有するポリヌクレオチドをいう。したがって、本明細書におけるフラグメントは、全長のポリヌクレオチド(長さがn)に対して、1〜n−1までの配列長さを有するポリヌクレオチドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリヌクレオチドの場合、5、6、7、8、9、10、15,20、25、30、40、50、75、100およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ(例えば、11など)もまた、下限として適切であり得る。相同性は、たとえばAltschulら(J.Mol.Biol.215,403−410(1990))が開発したアルゴリズムを使用した検索プログラムBLASTをデフォルトパラメータを用いることにより、scoreで類似度が示される。
本明細書において、「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」は、互換的に用いられ、一連のアミノ酸からなる高分子をいう。アミノ酸は、炭素原子にカルボキシル基およびアミノ基を有する有機分子をいう。本明細書において好ましくは、アミノ酸は、天然に存在する20種類のアミノ酸であるがこれらに限定されない。
本明細書において、「遺伝子」とは、遺伝形質を規定する因子をいう。通常染色体上に一定の順序に配列している。タンパク質の一次構造を規定する構造遺伝子といい、その発現を左右する調節遺伝子という。本明細書では、「遺伝子」は、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」ならびに/あるいは「タンパク質」「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」をさすことがある。
本明細書で使用される場合、「外来遺伝子」とは、遺伝子導入ベクター内に含まれる、ウイルス以外の起源の核酸配列をいう。本発明の1つの局面において、この外来遺伝子は、遺伝子導入ベクターによって導入された遺伝子が発現するために適切な調節配列(例えば、転写に必要なプロモーター、エンハンサー、ターミネーター、およびポリA付加シグナル、ならびに翻訳に必要なリボゾーム結合部位、開始コドン、終止コドンなど)と作動可能に連結される。本発明の別の局面において、外来遺伝子は、この外来遺伝子の発現のための調節配列を含まない。本発明のさらなる局面において、外来遺伝子は、オリゴヌクレオチドまたはデコイ核酸である。
本明細書において「遺伝子ライブラリー」とは、天然より単離された核酸配列または合成の核酸配列を含む、核酸ライブラリーである。天然より単離された核酸配列の供給源としては、真核生物細胞、原核生物細胞、またはウイルス由来の、ゲノム配列、cDNA配列が挙げられるが、これらに限定されない。天然より単離された配列に、任意の配列(例えば、シグナル、タグなど)を付加したライブラリーもまた、本発明の遺伝子ライブラリーに含まれる。1つの実施態様において、遺伝子ライブラリーは、その中に含まれる核酸配列の、転写および/または翻訳をもたらすプロモーターなどの配列を含む。
本明細書において「スクリーニング」とは、遺伝子ライブラリーのようなライブラリーに対して所望の活性または機能を有するメンバーを選択することまたはそのようなアッセイをいう。そのようなスクリーニングの方法は、当該分野において公知である。
本明細書で使用される場合、「遺伝子導入」とは、生体内またはインビトロにおいて、標的細胞内に、天然、合成または組換えの所望の遺伝子または遺伝子断片を、導入された遺伝子がその機能を維持するように、導入することをいう。本発明において導入される遺伝子または遺伝子断片は、特定の配列を有するDNA、RNAまたはこれらの合成アナログである核酸を包含する。また、本明細書において使用される場合、遺伝子導入、トランスフェクション、およびトランスフェクトは、互換可能に使用される。
本明細書で使用される場合、「遺伝子導入活性」とは、ベクターによる「遺伝子導入」の活性をいい、導入された遺伝子の機能(例えば、発現ベクターの場合、コードされるタンパク質の発現および/またはそのタンパク質の活性など)を指標として検出され得る。
本明細書において遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどの「発現」とは、その遺伝子などがインビボで一定の作用を受けて、別の形態になることをいう。好ましくは、遺伝子、ポリヌクレオチドなどが、転写および翻訳されて、ポリペプチドの形態になることをいうが、転写されてmRNAが作製されることもまた発現の一態様であり得る。より好ましくは、そのようなポリペプチドの形態は、翻訳後プロセシングを受けたものであり得る。本明細書において、遺伝子の発現の「調節」には、遺伝子発現の増強、減少、誘導、消失、遅延化、早期化などが挙げられるがそれらに限定されない。
本明細書において処置の対象とされる遺伝子としては、例えば、酵素、ホルモン、リンホカイン、受容体、成長因子、調節タンパク質、免疫系に影響を与えるポリペプチド、免疫調節因子、抗体などをコードする遺伝子が挙げられるがそれらに限定されない。具体的には、これらの遺伝子は、例えば、ヒト成長ホルモン、インスリン、インターロイキン2、腫瘍壊死因子、神経成長因子(NGF)、表皮増殖因子、組織プラスミノーゲンアクチベーター(TPA)、因子VIII:C、カルシトニン、チミジンキナーゼ、インターフェロン、顆粒球マクロファージ(GMCSF)、エリスロポエチン(EPO)、肝細胞増殖因子(HGF)などをコードする遺伝子があげられるがそれらに限定されない。これら遺伝子は、本発明の医薬において、核酸形態またはポリペプチドの形態で存在し得る。
本明細書において遺伝子について言及する場合、「ベクター」とは、目的のポリヌクレオチド配列を目的の細胞へと移入させることができるものをいう。そのようなベクターとしては、動物個体などの宿主細胞において自律複製が可能であるか、または染色体中への組込みが可能で、本発明のポリヌクレオチドの転写に適した位置にプロモーターを含有しているものが例示される。本明細書において、ベクターはプラスミドであり得る。
「発現ベクター」は、構造遺伝子およびその発現を調節するプロモーターに加えて種々の調節エレメントが宿主の細胞中で作動し得る状態で連結されている核酸配列をいう。調節エレメントは、好ましくは、ターミネーター、薬剤耐性遺伝子のような選択マーカーおよび、エンハンサーを含み得る。生物(例えば、動物)の発現ベクターのタイプおよび使用される調節エレメントの種類が、宿主細胞に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。ヒトの場合、本発明に用いる発現ベクターはさらにpCAGGS(Niwa H et al,Gene;108:193−9(1991))を含み得る。
「組換えベクター」とは、目的のポリヌクレオチド配列を目的の細胞へと移入させることができるベクターをいう。そのようなベクターとしては、動物個体などの宿主細胞において自律複製が可能、または染色体中への組込みが可能で、本発明のポリヌクレオチドの転写に適した位置にプロモーターを含有しているものが例示される。
動物細胞に対する「組換えベクター」としては、pcDNAI/Amp、pcDNAI、pCDM8(いずれもフナコシより市販)、pAGE107(特開平3−22979、Cytotechnology,3,133(1990))、pREP4(Invitrogen)、pAGE103(J.Biochem.,101,1307(1987))、pAMo、pAMoA(J.Biol.Chem.,268,22782−22787(1993))、pCAGGS(Niwa H et al,Gene;108:193−9(1991))などが例示される。
「ターミネーター」は、遺伝子のタンパク質をコードする領域の下流に位置し、DNAがmRNAに転写される際の転写の終結、ポリA配列の付加に関与する配列である。ターミネーターは、mRNAの安定性に関与して遺伝子の発現量に影響を及ぼすことが知られている。ターミネーターとしては、哺乳動物由来のターミネーターのほかに、CaMV35Sターミネーター、ノパリン合成酵素遺伝子のターミネーター(Tnos)、タバコPR1a遺伝子のターミネーターが挙げられるが、これに限定されない。
本明細書において用いられる「プロモーター」とは、遺伝子の転写の開始部位を決定し、またその頻度を直接的に調節するDNA上の領域をいい、RNAポリメラーゼが結合して転写を始める塩基配列である。プロモーターの領域は、通常、推定タンパク質コード領域の第1エキソンの上流約2kbp以内の領域であることが多いので、DNA解析用ソフトウエアを用いてゲノム塩基配列中のタンパク質コード領域を予測すれば、プロモータ領域を推定することはできる。推定プロモーター領域は、構造遺伝子ごとに変動するが、通常構造遺伝子の上流にあるが、これらに限定されず、構造遺伝子の下流にもあり得る。好ましくは、推定プロモーター領域は、第一エキソン翻訳開始点から上流約2kbp以内に存在する。
本明細書において、遺伝子の発現について用いられる場合、一般に、「部位特異性」とは、生物(例えば、動物)の部位(例えば、動物の場合、心臓、心筋細胞など)におけるその遺伝子の発現の特異性をいう。「時期特異性」とは、生物(たとえば、動物)の特定の段階(例えば、発作時など)に応じたその遺伝子の発現の特異性をいう。そのような特異性は、適切なプロモーターを選択することによって、所望の生物に導入することができる。
本明細書において医薬として利用され得るワクチンとしては、例えば、癌、後天性免疫不全症候群、麻疹、単純疱疹などためのワクチンが挙げられるがそれらに限定されない。これらワクチンは、本発明の医薬において、核酸形態またはペプチドの形態で存在し得る。
本発明は、上記のエンベロープを単独で、または安定化化合物、希釈剤、担体、または別の成分または薬剤のような他の薬剤と組み合わせて含む薬学的組成物および医薬を提供する。好ましくは、本発明は、ワクチン形態、遺伝子治療に適した形態であり得る。
本発明の薬学的組成物および医薬は、エンベロープが患部の細胞内または目的とする組織の細胞内に取り込まれるような形態で用いられ得る。
本発明の薬学的組成物および医薬は、任意の無菌生体適合性薬学的キャリア(生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、および水を含むが、それらに限定されない)中で投与され得る。これらの分子のいずれも、適切な賦形剤、アジュバント、および/または薬学的に受容可能なキャリアと混合する薬学的組成物中にて、単独で、あるいは他の薬剤と組み合わせて患者に投与され得る。本発明のある実施形態において、薬学的に受容可能なキャリアーは薬学的に不活性である。
本発明の薬学的組成物および医薬の投与は、経口または非経口により達成される。非経口送達の方法としては、局所、動脈内(例えば、頸動脈を介する)、筋肉内、皮下、髄内、クモ膜下腔内、脳室内、静脈内、腹腔内、または鼻孔内の投与が挙げられる。本発明は、処置部位に到達する経路であれば、どのような経路でもよい。
本明細書において「頭部」とは、頭蓋骨とその内容および関連構造からなる身体の部位をいう。本明細書において「頭部」は脳を包含する。
本明細書において「頸部」とは、脊椎動物の体で,頭部と上肢の間に見られる領域をいう。本明細書において、頭部・頸部または頭頸部という場合は、首より上の部分をさすことがある。
本明細書において「一過的」とは、ある処置を講じたときに、その処置が一時的に続くことをいう。したがって、処置を中止した後には、その処置の効果がなくなるか減弱する。
本明細書において「動脈」とは、血液を心臓から体各部に送り出す血管をいう。したがって、「脳動脈」は、脳に存在する動脈をいう。
本明細書において動脈または血管を「閉鎖する」とは、血流がその処置をしない場合に比べて顕著に減ずるかまたは停止するような処置を講じることをいう。好ましくは、閉鎖する際には出血を生じさせないことが好ましい。動脈または血管を閉鎖する手段としては、バルーンカテーテル、クリッピングなどが使用されるがそれらに限定されない。
本明細書において生体分子をある空間(例えば、細胞内)に「導入する」とは、その生体分子が別の空間からその空間に移動されることをいう。そのような導入には、どのような手段を用いてもよく、能動的であっても受動的であってもよい。
本明細書において「システム」とは、多くの構成要素からなる物をいい、医薬、農薬、組成物(例えば、薬学的組成物)、ワクチン、キットなどの概念を包含する。
本発明では、導入にはウイルスエンベロープが使用されるが、ウイルスエンベロープに加えて、本発明の組成物および医薬は、賦形剤または薬学的に使用できる製剤を調製するために、エンベロープのプロセシングを促進する他の化合物を含む、適切な、薬学的に受容可能なキャリアーを含み得る。処方および投与のための技術のさらなる詳細は、例えば、日本薬局方の最新版および最新追補、「REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES」(Maack Publishing Co.,Easton,PA)の最終版に記載されている。
本明細書において経口投与のための薬学的組成物は、投与に適した投与形において当該分野で周知の薬学的に受容可能なキャリアを用いて処方され得る。このようなキャリアは、薬学的組成物が患者による摂取に適した錠剤、丸剤、糖衣剤、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁物などに処方されることを可能とする。
経口使用のための薬学的組成物は、活性化合物を固体賦形剤と組合せ、所望により得られた混合物を粉砕し、所望ならば、錠剤または糖衣剤のコアを得るために、適切なさらなる化合物を添加した後、顆粒の混合物をプロセシングすることを介して得られ得る。適切な賦形剤は炭水化物またはタンパク質充填剤であり、以下を含むが、それらに限定されない:ラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトールを含む糖;トウモロコシ、コムギ、イネ、ジャガイモ、または他の植物由来のデンプン;メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、またはカルボキシメチルセルロースナトリウムのようなセルロース;ならびにアラビアゴムおよびトラガカントゴムを含むゴム;ならびにゼラチンおよびコラーゲンのようなタンパク質。所望ならば、架橋されたポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸またはその塩(例えば、アルギン酸ナトリウム)のような崩壊剤または可溶化剤が添加され得る。
糖衣剤コアは、濃縮糖溶液のような適切なコーティングとともに提供される。これはまた、アラビアガム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポルゲル、ポリエチレングリコール、および/または二酸化チタン、ラツカー溶液、および適切な有機溶媒または溶媒混合液をも含有し得る。製品同定のため、または活性化合物の量(すなわち用量)を特徴付けるために、染料または色素が錠剤または糖衣剤に添加され得る。
経口で使用され得る薬学的組成物は、例えば、ゼラチンカプセル、ゼラチンおよびコーティング(例えば、グリセロールまたはソルビトール)よりなるソフト封着カプセルを含む。ゼラチンカプセルは、ラクトースまたは澱粉のような充填剤またはバインダー、タルクまたはステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、および所望により安定化剤と混合した活性な成分を含有し得る。ソフトカプセルでは、エンベロープは、安定化剤とともにまたはともなわずに、脂肪油、流動パラフィンまたは液状ポリエチレングリコールのような適切な液体に溶解または懸濁され得る。
非経口投与用の薬学的製剤は活性化合物の水溶液を含む。注射のために、本発明の薬学的組成物は水溶液、好ましくはハンクスの溶液、リンゲル溶液、または緩衝化生理食塩水のような生理学的に適合する緩衝液中に処方され得る。水性注射懸濁物は、懸濁物の粘度を増加させる物質(例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール、またはデキストラン)を含有し得る。さらに、活性化合物の懸濁物は、適切な油状注射懸濁物として調製され得る。適切な親油性溶媒またはビヒクルは、ゴマ油のような脂肪酸、あるいはオレイン酸エチルまたはトリグリセリドのような合成脂肪酸エステル、またはリポソームを含む。所望により、懸濁物は、高濃度溶液の製剤を可能にする安定化剤または化合物の溶解度を増加させる適切な薬剤または試薬を含有し得る。
本発明の薬学的組成物は、当該分野で公知の様式と同様の様式(例えば、従来的な混合、溶解、顆粒化、糖衣剤作製、水簸、乳化、カプセル化、包括、または凍結乾燥の手段によって)で製造され得る。
本発明の薬学的組成物は、本発明のエンベロープが意図される目的を達成するのに有効な量で含有される組成物を含む。「治療的有効量」または「薬理学的有効量」は当業者に十分に認識される用語であり、意図される薬理学的結果を生じるために有効な薬剤の量をいう。従って、治療的有効量は、処置されるべき疾患の徴候を軽減するのに十分な量である。所定の適用のための有効量(例えば、治療的有効量)を確認する1つの有用なアッセイは、標的疾患の回復の程度を測定することである。実際に投与される量は、処置が適用されるべき個体に依存し、好ましくは、所望の効果が顕著な副作用をともなうことなく達成されるように最適化された量である。治療的有効用量の決定は十分に当業者の能力内にある。
いずれの化合物についても、治療的有効用量は、細胞培養アッセイまたは任意の適切な動物モデルのいずれかにおいて、最初に見積もられ得る。動物モデルはまた、所望の濃度範囲および投与経路を達成するために用いられる。次いで、このような情報を用いて、ヒトにおける投与に有用な用量および経路を決定することができる。
治療的有効量とは、疾患の徴候または状態を軽減するエンベロープの量をいう。このような化合物の治療効果および毒性は、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順(例えば、ED50、集団の50%において治療的に有効な用量;およびLD50、集団の50%に対して致死的である用量)によって決定され得る。治療効果と毒性効果との間の用量比は治療係数であり、それは比率ED50/LD50として表され得る。大きな治療係数を呈する薬学的組成物が好ましい。細胞培養アッセイおよび動物実験から得られたデータが、ヒトでの使用のための量の範囲を公式化するのに使用される。このような化合物の用量は、好ましくは、毒性をほとんどまたは全くともなわないED50を含む循環濃度の範囲内にある。この用量は、使用される投与形態、患者の感受性、および投与経路に依存してこの範囲内で変化する。一例として、エンベロープの投与量は、年齢その他の患者の条件、疾患の種類、使用するエンベロープの種類等により適宜選択される。
ヒトに本発明のエンベロープベクターを利用して生体分子を投与する場合、1被験体あたり、400〜400,000HAU相当の、好ましくは1,200〜120,000HAU相当の、より好ましくは4,000〜40,000HAU相当のエンベロープベクターが投与され得る。投与されるエンベロープ中に含まれる外来遺伝子の量は、1被験体あたり、2〜2,000μg、好ましくは6〜600μg、より好ましくは20〜200μgであり得る。
本明細書において「HAU」とは、ニワトリ赤血球0.5%を凝集可能なウイルスの活性をいう。1HAUは、ほぼ2400万ウイルス粒子に相当する(Okada,Y.ら、Biken Journal 4,209−213、1961)。上記の量は、例えば、1日1回から数回投与することができる。
正確な用量は、治療されるべき患者を考慮して、個々の臨床医によって選択される。用量および投与は、十分なレベルの活性部分を提供するか、または所望の効果を維持するように調整される。考慮され得るさらなる因子としては、疾患状態の重症度(例えば、腫瘍のサイズおよび位置;患者の年齢、体重、および性別;投与の食餌制限時間、および頻度、薬物組合せ、反応感受性、および治療に対する耐性/応答)が挙げられる。特定の製剤の半減期およびクリアランス速度に応じて、持続作用性薬学的組成物は、3〜4日毎に、毎週、または2週間に1回、投与され得る。特定の用量および送達の方法に関するガイダンスは当該分野で公知の文献に提供されている。
本発明の組成物および医薬はまた、生体親和性材料を含み得る。この生体親和性材料は、例えば、シリコーン、コラーゲン、ゼラチン、グリコール酸・乳酸の共重合体、エチレンビニル酢酸共重合体、ポリウレタン、ポリエチレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリプロピレン、ポリアクリレート、ポリメタクリレートからなる群より選択される少なくとも1つを含み得る。成型が容易であることからシリコーンが好ましい。生分解性高分子の例としては、コラーゲン、ゼラチン、α−ヒロドキシカルボン酸類(例えば、グリコール酸、乳酸、ヒドロキシ酪酸など)、ヒドロキシジカルボン酸類(例えば、リンゴ酸など)およびヒドロキシトリカルボン酸(例えば、クエン酸など)からなる群より選択される1種以上から無触媒脱水重縮合により合成された重合体、共重合体またはこれらの混合物、ポリ−α−シアノアクリル酸エステル、ポリアミノ酸(例えば、ポリ−γ−ベンジル−L−グルタミン酸など)、無水マレイン酸系共重合体(例えば、スチレン−マレイン酸共重合体など)のポリ酸無水物などが挙げられる。重合の形式は、ランダム、ブロック、グラフトのいずれでもよく、α−ヒドロキシカルボン酸類、ヒドロキシジカルボン酸類、ヒドロキシトリカルボン酸類が分子内に光学活性中心を有する場合、D−体、L−体、DL−体のいずれでも用いることが可能である。好ましくは、グリコール酸・乳酸の共重合体が使用され得る。
本発明の組成物および医薬は、徐放性形態で提供され得る。徐放性形態の剤型は、本発明において使用され得る限り、当該分野で公知の任意の形態であり得る。そのような形態としては、例えば、ロッド状(ペレット状、シリンダー状、針状など)、錠剤形態、ディスク状、球状、シート状のような製剤であり得る。徐放性形態を調製する方法は、当該分野において公知であり、例えば、日本薬局方、米国薬局方および他の国の薬局方などに記載されている。徐放剤(持続性投与剤)を製造する方法としては、例えば、複合体から薬物の解離を利用する方法、水性懸濁注射液とする方法、油性注射液または油性懸濁注射液とする方法、乳濁製注射液(o/w型、w/o型の乳濁製注射液など)とする方法などが挙げられる。
本発明の組成物および医薬は、通常は医師の監督のもとで実施されるが、その国の監督官庁および法律が許容する場合は、医師の監督なしに実施することができる。
本発明はまた、ワクチン形態でも提供され得る。ワクチンとは、ある種の疾患(例えば、伝染病、感染症など)の予防(または治療)のため使用される抗原の諸形態(例えば、タンパク質、DNA)をいう。感染、伝播、流行などの諸形式にしたがい、生きた弱毒病原体(生ワクチンlive vaccine)、不活化病原体(またはその一部)、病原体代謝物(毒素、毒素の不活化物すなわちトキソイドなど)、DNAワクチンなどが使用される.ワクチン接種(vaccination)により生物(ヒト・家畜・媒介動物)の体内に能動的につくられる免疫(体液性免疫、細胞性免疫、または両者)が病原体の感染、伝播、流行などを阻止する。
本発明に係るワクチンの剤形は特に問わず、また、その製造も当該分野で用いられている自体公知の方法に従ってよい。また、本発明に係るワクチンは、種々のアジュバントを含む乳濁液としてもよい。アジュバントは、含まない形態を投与した場合よりも、少ない量のワクチンを用いて、少ない投与量で、持続する高レベルの免疫性を持続させるのを助けるものである。アジュバントの例には、フロインドのアジュバント(完全または不完全)、アジュバント65(落下生油、マンナイドモノオレエートおよびアルミニウムモノステアレートを含む)、および水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムまたはミョウバンのごとき鉱物ゲルがある。ヒトおよび食用動物のためのワクチンには、アジュバント65を用いるのが好ましい。また、商業的動物用ワクチンには、鉱物ゲルを用いるのが好ましい。
本発明に係るワクチンには、上記アジュバントの他に例えば、希釈剤、香料、防腐剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、界面活性剤、可塑剤などから選択される1または2以上の製剤用添加物を含有させてもよい。
本発明に係るワクチンの投与経路は、特に限定されないが、非経口的に投与することが好ましい。非経口投与としては、例えば、頸動脈内、静脈内、動脈内、皮下、真皮内、筋肉内または腹腔内の投与が挙げられる。好ましくは、頸動脈内投与で本発明のワクチンが投与され得る。
本発明に係るワクチンの1回の投与量は、投与の目的により、また感染が初感染か再感染かにより、さらに患者の年齢および体重、症状および疾患の重篤度などの種々の条件に応じて適宜選択することが可能である。再感染により惹起される病気の治療を目的とする場合、本発明に係るワクチンの投与量は、体重1kgあたり約0.01ng〜10mg程度、より好ましくは約0.1ng〜1mg程度であり得る。
本発明に係るワクチンの投与回数は、上記のような種々の条件により異なるので、一概には言えないが、日単位から週単位の間隔で繰り返して投与するのが好ましい。中でも、約2〜4週間程度の間隔で、数回、好ましくは約1〜2回程度投与するのが好ましい。疾患症候学または抗体価を用いる基本的な検査により疾患の状態をモニターしながら投与回数(投与時間)を決定するのがより好ましい。
本明細書において、病因因子(例えば、ウイルス(例えば、HIV、インフルエンザウイルス、ロタウイルスなど)または細菌)を処置または予防するための組成物(例えば、ワクチン)が提供される。そのような組成物は、例えば、その病因因子の遺伝子またはタンパク質を少なくとも1つ含む。含まれる外来遺伝子は、全長が好ましいが、免疫を惹起し得るエピトープを少なくとも一つ含んでいれば、部分配列でもよい。本明細書において、「エピトープ」とは、構造の明らかな抗原決定基をいう。エピトープを決定する方法は、当該分野において周知であり、そのようなエピトープは、核酸またはアミノ酸の一次配列が提供されると、当業者はそのような周知慣用技術を用いて決定することができる。エピトープとして使用するためには、少なくとも3アミノ酸の長さの配列が必要であり、好ましくは、この配列は、少なくとも4アミノ酸、5アミノ酸、6アミノ酸、7アミノ酸、8アミノ酸、9アミノ酸、10アミノ酸、15アミノ酸、20アミノ酸、25アミノ酸の長さの配列が必要であり得る。
本明細書において「中和抗体」とは、酵素、毒素、細菌またはウイルスなど抗原の生物学的活性を中和する、中和反応に関与する抗体をいう。中和抗体は。ウイルスが結合すると活性が失われる。中和反応とは、抗原が中和抗体と結合すると、それらの活性が消失あるいは低下する反応をいう。ワクチンを投与すると、中和抗体ができ、その中和抗体の働きにより、病因を駆逐する働きが達成される。
本明細書において「遺伝子治療」または「遺伝子療法」とは、遺伝子の傷害(または欠陥)に起因する疾患を、患者に健全な核酸(例えば、DNA)を導入することにより、または改変された核酸(例えば、DNA)を導入することにより治療しようとする方法をいう。遺伝子治療には、裸で核酸を注入する工程を利用する方法もあるが、何らかのベクターを利用することが多く、本発明では、ウイルスエンベロープをそのようなベクターとして使用し得る。
本発明は、組成物および医薬を含むキット形態でも提供される。このキットは、本発明の組成物および医薬;ならびにこの組成物および医薬を投与する指針を与える指示書を備える。ここで、上記指示書は、組成物および医薬の適切な投与方法を指示する文言が記載されている。この指示書は、本発明が実施される国の監督官庁(例えば、日本であれば厚生労働省、米国であれば食品医薬品局(FDA)など)が規定した様式に従って作成され、その監督官庁により承認を受けた旨が明記される。指示書は、いわゆる添付文書(package insert)であり、通常は紙媒体で提供されるが、それに限定されず、例えば、電子媒体(例えば、インターネットで提供されるホームページ、電子メール)のような形態でも提供され得る。
本発明の方法において使用される組成物および医薬の量は、使用目的、対象疾患(種類、重篤度など)、被験体の年齢、体重、性別、既往歴、細胞生理活性物質の形態または種類、細胞の形態または種類などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。
本発明の方法を被検体(または患者)に対して施す頻度もまた、使用目的、対象疾患(種類、重篤度など)、患者の年齢、体重、性別、既往歴、および治療経過などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。頻度としては、例えば、毎日−数ヶ月に1回(例えば、1週間に1回−1ヶ月に1回)の投与が挙げられる。1週間−1ヶ月に1回の投与を、経過を見ながら施すことが好ましい。
本発明の組成物および医薬は、宿主に導入されるべき物質または医薬成分を含む。そのような物質または医薬成分は、生体高分子であり得る。好ましくは、生体高分子は、核酸、ポリペプチド、糖、脂質、およびそれらの複合体からなる群より選択される。好ましくは、医薬成分は、導入される宿主において発現されるポリペプチドをコードする核酸であり得る。
本発明の組成物および医薬は、1つ以上のさらなる医薬成分を含み得る。そのような成分としては、例えば、さらなる医薬成分として、例えば、以下が挙げられるがそれらに限定されない成分がその薬学的組成物に含有され得る:
中枢神経系用薬(例えば、全身麻酔剤、催眠鎮静剤、抗不安剤、抗てんかん剤、解熱鎮痛消炎剤、興奮剤、抗パーキンソン剤、精神神経用剤、総合感冒剤、その他の中枢神経系用薬など);
末梢神経用剤(例えば、局所麻酔剤、骨格筋弛緩剤、自律神経剤、鎮けい剤など);
感覚器官用薬(例えば、眼科用剤、耳鼻科用剤、鎮暈剤など);
循環器官用薬(例えば、、強心剤、不整脈用剤、利尿剤、血圧降下剤、血管収縮剤、血管拡張剤、高脂血症用剤、その他の循環器官用薬など);
呼吸器官用薬(例えば、呼吸促進剤、鎮咳剤、去痰剤、鎮咳去痰剤、気管支拡張剤、含嗽剤など);
消化器官用薬(例えば、止瀉剤、整腸剤、消化性潰瘍用剤、健胃消化剤、制酸剤、下剤、浣腸剤、利胆剤、その他の消化器官用薬など);
ホルモン剤(例えば、脳下垂体ホルモン剤、唾液腺ホルモン剤、甲状腺、副甲状腺ホルモン剤、蛋白同化ステロイド剤、副腎ホルモン剤、男性ホルモン剤、卵胞ホルモン剤、黄体ホルモン剤、混合ホルモン剤、その他のホルモン剤など);
泌尿生殖器官および肛門用薬(例えば、泌尿器官用剤、生殖器官用剤、子宮収縮剤、痔疾用剤、他の泌尿生殖器管、肛門用薬など);
外皮用薬(例えば、外皮用殺菌消毒剤、創傷保護剤、化膿性疾患用剤、鎮痛剤、鎮痒剤、収斂剤、消炎剤、寄生性皮膚疾患用剤、皮膚軟化剤、毛髪用剤、その他の外皮用剤など);
歯科口腔用剤;
その他の個々の器官系用薬;
ビタミン剤(例えば、ビタミンA剤、ビタミンD剤、ビタミンB剤、ビタミンC剤、ビタミンE剤、ビタミンK剤、混合ビタミン剤、その他のビタミン剤など);
滋養強壮薬(例えば、カルシウム剤、無機質製剤、糖類剤、蛋白アミノ酸製剤、臓器製剤、乳幼児用剤、その他の滋養強壮剤など);
血液および体液用薬(例えば、血液代用剤、止血剤、血液凝固阻止剤、その他の血液.体液用剤など);
人工透析用薬(例えば、人工腎臓透析用剤、腹膜透析用剤など);
その他の代謝性医薬品(例えば、臓疾患用剤、解毒剤、習慣性中毒用剤、痛風治療剤、酵素製剤、糖尿病用剤、他に分類されない代謝性薬など);
細胞賦活用剤(例えば、クロロフィル製剤、色素製剤、その他の細胞賦活用剤など);
腫瘍用薬(例えば、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗腫瘍性抗生物質製剤、抗腫瘍性植物成分製剤、その他の腫瘍用剤など);
放射性医薬品;
アレルギー用薬(例えば、抗ヒスタミン剤、刺激療法剤、非特異性免疫原製剤、その他のアレルギー用薬、生薬および漢方処方に基づく医薬品、生薬、漢方製剤、その他の生薬漢方処方に基づく製剤など);
抗生物質製剤(例えば、グラム陽性菌に作用する、グラム陰性菌に作用する、グラム陽・陰性菌に作用、グラム陽性菌マイコプラズマ作用、グラム陽性陰性.リケッチアに作用、抗酸菌に作用するもの、カビに作用するもの、その他の抗生物質製剤など);
化学療法剤(例えば、サルファ剤、抗結核剤、合成抗菌剤、抗ウィルス剤、その他の化学療法剤など);
生物学的製剤(例えば、ワクチン類、毒素.トキソイド類、抗毒素.抗レプトスピラ血清、血液製剤類、生物学的試験用製剤類、その他の生物学的製剤、抗原虫剤、駆虫剤など);
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり、慣用されるものであり、例えば、Ausubel F.A.ら編(1988)、Current Protocols in Molecular Biology、Wiley、New York、NY;Sambrook Jら (1987)Molecular Cloning: A Laboratory Manual,2nd Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY、別冊実験医学「遺伝子導入&発現解析実験法」羊土社、1997などに記載される。
ウイルス(例えば、HVJ)はニワトリの受精卵への種ウイルスの接種により増殖されたものが一般に使用され得るが、サル、ヒトなどの培養細胞、培養組織への持続感染系(培養液中にトリプシンなどの加水分解酵素を添加する)を利用して増殖させたもの、クローニングされたウイルスゲノムを培養細胞に感染させ持続感染をおこさせて増殖させたものおよびこれらの変異株のすべてが本発明で使用可能である。また、他の方法で入手可能なウイルス(例えば、HVJ)も使用することが可能である。組換え型HVJ(Hasan M.K.ら、Journal of General Virology、78、2813〜2830、1997年またはYonemitsu Y.ら Nature Biotechnology 18、970〜973、2000年)なども使用可能である。HVJとして何れのものでも良いが、Z株(例えば、寄託番号ATCC VA 2388またはCharles River SPAFASから販売されているものが使用できる)またはCanteII株(例えば、M.D.Johnston J.Gen.Virol.、56、175〜184、1981年に記載されたものまたはCharles River SPAFASから販売されているものが使用できる)がより望ましい。
1つの局面において、本発明は、生体分子を細胞に導入するためのシステムを提供する。このシステムは、1)生体分子;2)ウイルスエンベロープ;および3)グリコサミノグリカン、を含む。生体分子をウイルスエンベロープを利用して細胞に導入することを改善するために、本発明ではグリコサミノグリカン(例えば、ヘパリン)が効果があることが明らかになった。理論に束縛されないが、グリコサミノグリカンを添加することにより細胞の強度が変化する(弱くなる)という効果があり、そのために生体分子の細胞への導入が促進されるものと考えられる。したがって、使用される分子としては、どのようなグリコサミノグリカンでもよいが、好ましくは、グルコサミン残基を有するグルコサミノグリカンが使用され、より好ましくは、ヘパリンが使用され得る。理論に束縛されないが、グルコサミノグリカンは、残基としてグルコサミンを有し、血液脳関門の通過を容易にするという効果を有すると考えられることからより好ましいと考えられる。ヘパリンの中でも、高分子量(例えば、10,000kDa以上、より好ましくは11,000kDa以上、さらに好ましくは12,000kDa以上)のヘパリンが好ましく、より好ましくは、平均分子量が12,000kDa〜15,000kDaのものが使用される。しかし、それよりも低い分子量のものでも使用され得る。硫酸化の程度も効率に影響与えるようである。したがって、好ましいヘパリンとしては、硫酸化の程度が薬学的に許容可能なのものが使用される。また、上述のように、ヘパリン以外の分子も使用可能である。そのような分子としては、例えば、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパラン硫酸ならびにそれらの混合物および重合物などが挙げられるがそれらに限定されない。理論に束縛されないが、これらの分子は、硫酸分子を有しており、生体内での送達を容易にする働きがあると考えられるからである。そのようなグリコサミノグリカンは、本発明のシステム中で、通常少なくとも1U/ml含まれる。好ましくは、グリコサミノグリカンは、少なくとも5U/ml、より好ましくは10U/ml、さらに好ましくは、50U/ml、もっとも好ましくは100U/ml本発明のシステム中に含まれ得る。
1つの実施形態において、本発明において使用されるウイルスエンベロープは、不活性化されている。不活性化は、紫外線照射による不活性化、アルキル化によるものなどが挙げられるがそれらに限定されない。
1つの実施形態において、本発明において使用されるウイルスエンベロープは、RNAウイルスのエンベロープであり得る。好ましくはそのウイルスエンベロープは、パラミクソウイルス属のウイルス(例えば、HVJ、インフルエンザウイルス)のエンベロープであり、より好ましくは、HVJのエンベロープであり得る。
本発明のシステムによって導入される生体分子は、上述のようなものであればどのような分子でもよいが、通常、核酸、ポリペプチド、脂質、糖、およびそれらの複合分子からなる群より選択されるものであり得る。好ましくは、そのような生体分子は、核酸またはポリペプチドを含む。ある実施形態では、そのような生体分子は核酸を含む。別の実施形態では、そのような生体分子は、ポリペプチドを含む。
特定の実施形態において、本発明により導入される生体分子は、血管内皮増殖因子(VEGF)、線維芽細胞増殖因子(FGF)および肝細胞増殖因子(HGF)からなる群より選択される遺伝子をコードする核酸である。
別の実施形態において、本発明により導入される生体分子は、血管内皮増殖因子(VEGF)、線維芽細胞増殖因子(FGF)および肝細胞増殖因子(HGF)からなる群より選択されるポリペプチドである。
好ましい実施形態において、グリコサミノグリカン(例えば、ヘパリン)と、生体分子およびウイルスエンベロープとは、同じ組成物中に含有されていてもよい。その場合の組成物中の均一性は問われない。
別の好ましい実施形態では、グリコサミノグリカン(例えば、ヘパリン)と、生体分子およびウイルスエンベロープとは、異なる組成物中に含有されていてもよい。この場合、2種類の組成物は、投与は同時であってもよく、異なる時間であってもよい。ここで、生体分子は、好ましくは、ウイルスエンベロープ中に含有される。生体分子が効率よく送達されるからである。
別の局面において、本発明は、生体分子を細胞に導入するための方法を提供する。この方法は、1)ウイルスエンベロープおよび生体分子を含む組成物を該細胞に投与する工程;および2)グリコサミノグリカンを該細胞に投与する工程、を包含する。生体分子(例えば、核酸またはポリペプチド)、ウイルスエンベロープ(例えば、HVJのエンベロープ)およびグリコサミノグリカン(例えば、ヘパリン)について好ましい実施形態は、本明細書において上述したとおりである。
ここで、グリコサミノグリカン(例えば、ヘパリン)を投与する工程は、ウイルスエンベロープおよび生体分子を含む組成物を投与する工程と同時に行われても、前に行われても、後に行われてもよい。好ましくは、組成物とグリコサミノグリカンとは、同時または少し前に投与される。組成物とグリコサミノグリカンとは、より好ましくは同時に投与される。同時に投与する場合は、グリコサミノグリカンは組成物中に含まれていても含まれていなくてもよい。
別の局面において、本発明は、生体分子を細胞に導入するための医薬を製造するための、グリコサミノグリカンの使用を提供する。この使用において、本発明の医薬は、1)生体分子;2)ウイルスエンベロープ;および3)グリコサミノグリカン、を含む。生体分子(例えば、核酸またはポリペプチド)、ウイルスエンベロープ(例えば、HVJのエンベロープ)およびグリコサミノグリカン(例えば、ヘパリン)について好ましい実施形態は、本明細書において上述したとおりである。
別の局面において、本発明は、脳内に生体分子を送達する方法を提供する。この方法は、1)頭部または頸部の動脈を一過的に閉鎖する工程;および2)該頭部または頸部の動脈が閉鎖されている間に、生体分子を脳内に導入する工程、を包含する。ここで、一過的に動脈を閉鎖することによって、生体分子が脳内に効率よく(例えば、2倍以上)導入されたことは、予想外の効果である。なぜなら、血液脳関門(BBB)が存在することにより、血管と脳とは明確に区別されているため、生体分子の脳内への導入が行かないと考えられていたからである。一過的に閉鎖する方法は、バルーンカテーテル、クリッピング、生理的には脳梗塞などが挙げられる。バルーンカテーテル、クリッピングが好ましい。一過的とは、ここでは、生体分子を投与するのに十分な時間(例えば、少なくとも1分、少なくとも5分など)であるが、好ましくは、1〜120分間であり得る。
1つの実施形態において、生体分子は、本明細書において上述のものであればどのような分子でもよいが、好ましくは、核酸、ポリペプチド、脂質、糖、およびそれらの複合分子からなる群より選択される。好ましい実施形態では、その生体分子は、核酸を含む。
好ましい実施形態において、この生体分子は、前記生体分子は、血管内皮増殖因子(VEGF)、線維芽細胞増殖因子(FGF)、肝細胞増殖因子(HGF)、HIF−1、Del−1などの血管新生因子、Bcl−2などの抗アポトーシス因子、BDNFなどの脳保護因子およびMn−SODなどの抗酸化因子からなる群より選択される遺伝子をコードする核酸である。
好ましい実施形態では、導入される核酸は、ベクターによって送達される。そのようなベクターは、必要に応じて、プロモーター、エンハンサーなどの転写調節配列などを含み得る。好ましくは、ベクターは、発現ベクターであり得る。ベクターの構築は当該分野において周知である。
1つの実施形態において、生体分子は、ウイルスエンベロープとともに導入される。好ましくは、本発明において使用されるウイルスエンベロープは、不活性化されている。不活性化することによって、望ましくない毒性などを軽減することができる。不活性化は、どのような方法であってもよいが、UV照射、アルキル化剤の使用などが挙げられるがそれらに限定されない。
別の実施形態において、ウイルスエンベロープは、RNAウイルスのエンベロープであり得る。好ましくは、使用されるウイルスエンベロープは、パラミクソウイルス属のウイルス(例えば、HVJ、インフルエンザウイルス)のエンベロープである。もっとも好ましくは、使用されるウイルスエンベロープは、HVJのエンベロープである。
好ましい実施形態において、生体分子の脳への導入は、前記生体分子は、グリコサミノグリカンとともに行われ得る。ここで、グリコサミノグリカンは、どのような分子であってもよいが、好ましくは、ヘパリンである。グリコサミノグリカンであれば、どのような分子でも使用することができるが、好ましくは、グリコサミノグリカンの分子量は、少なくとも10,000kDaである、より好ましくは、少なくとも11,000kDaであり、さらに好ましくは、少なくとも12,000kDaであり得る。好ましい実施形態において、ヘパリンの分子量は、12,000〜15,000kDaである。
ある実施形態において、使用されるグリコサミノグリカンは、少なくとも50U/ml組成物中に含まれる。
ここで、グリコサミノグリカン(例えば、ヘパリン)の硫酸化の程度は、薬学的に許容可能であることが好ましい。
ある実施形態において、上記グリコサミノグリカンは、生体分子と同時に投与されても、その前に投与されても、その後に投与されてもよい。好ましくは、グリコサミノグリカンと生体分子は同時に投与される。
好ましい実施形態において、上記頭部または頸部の動脈は、1分間〜120分間閉鎖される。
1つの実施形態において、脳および頸部の動脈は、中大脳動脈または頸動脈である。好ましい実施形態において、上記脳および頸部の動脈は、中大脳動脈である。
1つの実施形態において、上記生体分子は、頸動脈、視床、脳室内または髄腔内に投与される。
好ましい実施形態において、上記生体分子は、頸動脈に投与される。頸動脈が好ましいのは、脳実質臓器へ広範囲に血流を供給するからである。
別の局面において、本発明は、脳内に生体分子を送達するためのキットを提供する。このキットは、1)生体分子;ならびに2)この生体分子を投与する方法を指示する指示書を備える。ここで、この方法は、A)頭部または頸部の動脈を一過的に閉鎖する工程;およびB)該頭部または頸部の動脈が閉鎖されている間に、該生体分子を脳内に導入する工程、を包含する。一過的に閉鎖する方法は上述したとおりである。
キットに含まれる生体分子は、どのような分子でもよいが、好ましくは、核酸、ポリペプチド、脂質、糖、およびそれらの複合分子からなる群より選択される。好ましくは、この生体分子は、核酸を含む。
ここで含まれる生体分子として好ましいものは、血管内皮増殖因子(VEGF)、線維芽細胞増殖因子(FGF)、肝細胞増殖因子(HGF)、HIF−1、Del−1などの血管新生因子、Bcl−2などの抗アポトーシス因子、BDNFなどの脳保護因子およびMn−SODなどの抗酸化因子からなる群より選択される遺伝子をコードする核酸である。
キットに含まれる核酸は、ベクターによって送達される。ここで使用されるベクターは、その核酸を発現することができるものであればどのようなものでもよい。好ましくは、哺乳動物(好ましくはヒト)において効率よく発現される、ベクターである。
好ましい実施形態では、本発明のこのキットは、さらにウイルスエンベロープを含む。
ここで、上記ウイルスエンベロープは、不活性化されていることが好ましい。それにより副作用が回避されるからである。
好ましくは、ウイルスエンベロープは、RNAウイルスのエンベロープである。
より好ましくは、ウイルスエンベロープは、パラミクソウイルス属のウイルス(例えば、HVJ、インフルエンザウイルスなど)のエンベロープである。
もっとも好ましくは、ウイルスエンベロープは、HVJのエンベロープである。
本発明のキットはさらに、グリコサミノグリカンを含んでいてもよい。
ここで、好ましくは、グリコサミノグリカンは、ヘパリンであるがそれに限定されない。
1つの実施形態において、グリコサミノグリカンの分子量は、少なくとも10,000kDaであり、より好ましくは、少なくとも11,000kDaであり、より好ましくは少なくとも12,000kDaである。より好ましくは、ヘパリンの分子量は、12,000〜15,000kDaである
1つの実施形態において、本発明のキットに含まれるグリコサミノグリカンは、少なくとも50U/ml含まれる。
好ましい実施形態では、グリコサミノグリカン(例えば、ヘパリン)の硫酸化の程度は、薬学的に許容可能である。
好ましい実施形態では、上記グリコサミノグリカンは、上記生体分子と同時に、前に、または後に投与され得る。より好ましくは、生体分子とグリコサミノグリカンは同時に投与される。
本発明のキットにおける好ましい実施形態において、上記頭部または頸部の動脈は、1分間〜120分間閉鎖される。好ましい実施形態において、上記脳および頸部の動脈は、中大脳動脈または頸動脈である。上記脳および頸部の動脈は、中大脳動脈である。
本発明のキットにおける好ましい実施形態において、上記生体分子は、頸動脈、視床、脳室内または髄腔内に投与されるが、これらに限定されない。
本発明のキットにおける好ましい実施形態において、上記生体分子は、頸動脈に投与されることが好ましい。
別の局面において、本発明は、脳内に生体分子を送達するためのキットを製造するための生体分子の使用を提供する。ここで、このキットは、1)生体分子;ならびに2)該生体分子を投与する方法を指示する指示書であって、この方法は、A)頭部または頸部の動脈を一過的に閉鎖する工程;およびB)該頭部または頸部の動脈が閉鎖されている間に、該生体分子を脳内に導入する工程、を包含する、指示書、を備える。
このように、本発明において、本発明者らは、インビトロおよびインビボの両方で、ウイルスエンベロープ(例えば、HVJ−Eベクター)を用いたCNSへの遺伝子移入の可能性を研究した。以下の実施例に示されるように、Venusレポーター遺伝子を用ると、蛍光が、ラット大脳皮質ニューロンおよびグリア細胞において検出され得た。インビボにおいて、レポーター遺伝子(VenusまたはEGFP)は、免疫学的な変化を誘導せずに、視床への直接注射によってか、脳室内注射によってか、または髄腔内注射によって、ラットの脳に好首尾にトランスフェクトされた。遺伝子発現は、総頸動脈を介した動脈内注入後に観察されなかったが、ベクターが中大脳動脈の一過性閉塞後に注射された場合、EGFPまたはルシフェラーゼ活性は、損傷した半球の中でのみ検出され得た。最後に、トランスフェクション効率を増加するために、ヘパリンの影響を試験した。ルシフェラーゼ活性は、50U/ml ヘパリンの添加によって顕著に増強された(P<0.05)。
結論として、HVJ−Eベクターは、いずれもの明らかな毒性も伴わずに、遺伝子をCNSにトランスフェクトする高い効力を有する。HVJ−Eベクターは、種々の遺伝子の役割を研究するためおよび脳血管疾患を処置するために有用であり得る。
以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、以下の実施例は、例示の目的のみに提供される。従って、本発明の範囲は、上記発明の詳細な説明にも下記実施例にも限定されるものではなく、特許請求の範囲によってのみ限定される。
1つの実施形態において、本発明において使用されるウイルスエンベロープは、不活性化されている。不活性化は、紫外線照射による不活性化、アルキル化によるものなどが挙げられるがそれらに限定されない。
1つの実施形態において、本発明において使用されるウイルスエンベロープは、RNAウイルスのエンベロープであり得る。好ましくはそのウイルスエンベロープは、パラミクソウイルス属のウイルス(例えば、HVJ、インフルエンザウイルス)のエンベロープであり、より好ましくは、HVJのエンベロープであり得る。
本発明のシステムによって導入される生体分子は、上述のようなものであればどのような分子でもよいが、通常、核酸、ポリペプチド、脂質、糖、およびそれらの複合分子からなる群より選択されるものであり得る。好ましくは、そのような生体分子は、核酸またはポリペプチドを含む。ある実施形態では、そのような生体分子は核酸を含む。別の実施形態では、そのような生体分子は、ポリペプチドを含む。
特定の実施形態において、本発明により導入される生体分子は、血管内皮増殖因子(VEGF)、線維芽細胞増殖因子(FGF)および肝細胞増殖因子(HGF)からなる群より選択される遺伝子をコードする核酸である。
別の実施形態において、本発明により導入される生体分子は、血管内皮増殖因子(VEGF)、線維芽細胞増殖因子(FGF)および肝細胞増殖因子(HGF)からなる群より選択されるポリペプチドである。
好ましい実施形態において、グリコサミノグリカン(例えば、ヘパリン)と、生体分子およびウイルスエンベロープとは、同じ組成物中に含有されていてもよい。その場合の組成物中の均一性は問われない。
別の好ましい実施形態では、グリコサミノグリカン(例えば、ヘパリン)と、生体分子およびウイルスエンベロープとは、異なる組成物中に含有されていてもよい。この場合、2種類の組成物は、投与は同時であってもよく、異なる時間であってもよい。ここで、生体分子は、好ましくは、ウイルスエンベロープ中に含有される。生体分子が効率よく送達されるからである。
別の局面において、本発明は、生体分子を細胞に導入するための方法を提供する。この方法は、1)ウイルスエンベロープおよび生体分子を含む組成物を該細胞に投与する工程;および2)グリコサミノグリカンを該細胞に投与する工程、を包含する。生体分子(例えば、核酸またはポリペプチド)、ウイルスエンベロープ(例えば、HVJのエンベロープ)およびグリコサミノグリカン(例えば、ヘパリン)について好ましい実施形態は、本明細書において上述したとおりである。
ここで、グリコサミノグリカン(例えば、ヘパリン)を投与する工程は、ウイルスエンベロープおよび生体分子を含む組成物を投与する工程と同時に行われても、前に行われても、後に行われてもよい。好ましくは、組成物とグリコサミノグリカンとは、同時または少し前に投与される。組成物とグリコサミノグリカンとは、より好ましくは同時に投与される。同時に投与する場合は、グリコサミノグリカンは組成物中に含まれていても含まれていなくてもよい。
別の局面において、本発明は、生体分子を細胞に導入するための医薬を製造するための、グリコサミノグリカンの使用を提供する。この使用において、本発明の医薬は、1)生体分子;2)ウイルスエンベロープ;および3)グリコサミノグリカン、を含む。生体分子(例えば、核酸またはポリペプチド)、ウイルスエンベロープ(例えば、HVJのエンベロープ)およびグリコサミノグリカン(例えば、ヘパリン)について好ましい実施形態は、本明細書において上述したとおりである。
別の局面において、本発明は、脳内に生体分子を送達する方法を提供する。この方法は、1)頭部または頸部の動脈を一過的に閉鎖する工程;および2)該頭部または頸部の動脈が閉鎖されている間に、生体分子を脳内に導入する工程、を包含する。ここで、一過的に動脈を閉鎖することによって、生体分子が脳内に効率よく(例えば、2倍以上)導入されたことは、予想外の効果である。なぜなら、血液脳関門(BBB)が存在することにより、血管と脳とは明確に区別されているため、生体分子の脳内への導入が行かないと考えられていたからである。一過的に閉鎖する方法は、バルーンカテーテル、クリッピング、生理的には脳梗塞などが挙げられる。バルーンカテーテル、クリッピングが好ましい。一過的とは、ここでは、生体分子を投与するのに十分な時間(例えば、少なくとも1分、少なくとも5分など)であるが、好ましくは、1〜120分間であり得る。
1つの実施形態において、生体分子は、本明細書において上述のものであればどのような分子でもよいが、好ましくは、核酸、ポリペプチド、脂質、糖、およびそれらの複合分子からなる群より選択される。好ましい実施形態では、その生体分子は、核酸を含む。
好ましい実施形態において、この生体分子は、前記生体分子は、血管内皮増殖因子(VEGF)、線維芽細胞増殖因子(FGF)、肝細胞増殖因子(HGF)、HIF−1、Del−1などの血管新生因子、Bcl−2などの抗アポトーシス因子、BDNFなどの脳保護因子およびMn−SODなどの抗酸化因子からなる群より選択される遺伝子をコードする核酸である。
好ましい実施形態では、導入される核酸は、ベクターによって送達される。そのようなベクターは、必要に応じて、プロモーター、エンハンサーなどの転写調節配列などを含み得る。好ましくは、ベクターは、発現ベクターであり得る。ベクターの構築は当該分野において周知である。
1つの実施形態において、生体分子は、ウイルスエンベロープとともに導入される。好ましくは、本発明において使用されるウイルスエンベロープは、不活性化されている。不活性化することによって、望ましくない毒性などを軽減することができる。不活性化は、どのような方法であってもよいが、UV照射、アルキル化剤の使用などが挙げられるがそれらに限定されない。
別の実施形態において、ウイルスエンベロープは、RNAウイルスのエンベロープであり得る。好ましくは、使用されるウイルスエンベロープは、パラミクソウイルス属のウイルス(例えば、HVJ、インフルエンザウイルス)のエンベロープである。もっとも好ましくは、使用されるウイルスエンベロープは、HVJのエンベロープである。
好ましい実施形態において、生体分子の脳への導入は、前記生体分子は、グリコサミノグリカンとともに行われ得る。ここで、グリコサミノグリカンは、どのような分子であってもよいが、好ましくは、ヘパリンである。グリコサミノグリカンであれば、どのような分子でも使用することができるが、好ましくは、グリコサミノグリカンの分子量は、少なくとも10,000kDaである、より好ましくは、少なくとも11,000kDaであり、さらに好ましくは、少なくとも12,000kDaであり得る。好ましい実施形態において、ヘパリンの分子量は、12,000〜15,000kDaである。
ある実施形態において、使用されるグリコサミノグリカンは、少なくとも50U/ml組成物中に含まれる。
ここで、グリコサミノグリカン(例えば、ヘパリン)の硫酸化の程度は、薬学的に許容可能であることが好ましい。
ある実施形態において、上記グリコサミノグリカンは、生体分子と同時に投与されても、その前に投与されても、その後に投与されてもよい。好ましくは、グリコサミノグリカンと生体分子は同時に投与される。
好ましい実施形態において、上記頭部または頸部の動脈は、1分間〜120分間閉鎖される。
1つの実施形態において、脳および頸部の動脈は、中大脳動脈または頸動脈である。好ましい実施形態において、上記脳および頸部の動脈は、中大脳動脈である。
1つの実施形態において、上記生体分子は、頸動脈、視床、脳室内または髄腔内に投与される。
好ましい実施形態において、上記生体分子は、頸動脈に投与される。頸動脈が好ましいのは、脳実質臓器へ広範囲に血流を供給するからである。
別の局面において、本発明は、脳内に生体分子を送達するためのキットを提供する。このキットは、1)生体分子;ならびに2)この生体分子を投与する方法を指示する指示書を備える。ここで、この方法は、A)頭部または頸部の動脈を一過的に閉鎖する工程;およびB)該頭部または頸部の動脈が閉鎖されている間に、該生体分子を脳内に導入する工程、を包含する。一過的に閉鎖する方法は上述したとおりである。
キットに含まれる生体分子は、どのような分子でもよいが、好ましくは、核酸、ポリペプチド、脂質、糖、およびそれらの複合分子からなる群より選択される。好ましくは、この生体分子は、核酸を含む。
ここで含まれる生体分子として好ましいものは、血管内皮増殖因子(VEGF)、線維芽細胞増殖因子(FGF)、肝細胞増殖因子(HGF)、HIF−1、Del−1などの血管新生因子、Bcl−2などの抗アポトーシス因子、BDNFなどの脳保護因子およびMn−SODなどの抗酸化因子からなる群より選択される遺伝子をコードする核酸である。
キットに含まれる核酸は、ベクターによって送達される。ここで使用されるベクターは、その核酸を発現することができるものであればどのようなものでもよい。好ましくは、哺乳動物(好ましくはヒト)において効率よく発現される、ベクターである。
好ましい実施形態では、本発明のこのキットは、さらにウイルスエンベロープを含む。
ここで、上記ウイルスエンベロープは、不活性化されていることが好ましい。それにより副作用が回避されるからである。
好ましくは、ウイルスエンベロープは、RNAウイルスのエンベロープである。
より好ましくは、ウイルスエンベロープは、パラミクソウイルス属のウイルス(例えば、HVJ、インフルエンザウイルスなど)のエンベロープである。
もっとも好ましくは、ウイルスエンベロープは、HVJのエンベロープである。
本発明のキットはさらに、グリコサミノグリカンを含んでいてもよい。
ここで、好ましくは、グリコサミノグリカンは、ヘパリンであるがそれに限定されない。
1つの実施形態において、グリコサミノグリカンの分子量は、少なくとも10,000kDaであり、より好ましくは、少なくとも11,000kDaであり、より好ましくは少なくとも12,000kDaである。より好ましくは、ヘパリンの分子量は、12,000〜15,000kDaである
1つの実施形態において、本発明のキットに含まれるグリコサミノグリカンは、少なくとも50U/ml含まれる。
好ましい実施形態では、グリコサミノグリカン(例えば、ヘパリン)の硫酸化の程度は、薬学的に許容可能である。
好ましい実施形態では、上記グリコサミノグリカンは、上記生体分子と同時に、前に、または後に投与され得る。より好ましくは、生体分子とグリコサミノグリカンは同時に投与される。
本発明のキットにおける好ましい実施形態において、上記頭部または頸部の動脈は、1分間〜120分間閉鎖される。好ましい実施形態において、上記脳および頸部の動脈は、中大脳動脈または頸動脈である。上記脳および頸部の動脈は、中大脳動脈である。
本発明のキットにおける好ましい実施形態において、上記生体分子は、頸動脈、視床、脳室内または髄腔内に投与されるが、これらに限定されない。
本発明のキットにおける好ましい実施形態において、上記生体分子は、頸動脈に投与されることが好ましい。
別の局面において、本発明は、脳内に生体分子を送達するためのキットを製造するための生体分子の使用を提供する。ここで、このキットは、1)生体分子;ならびに2)該生体分子を投与する方法を指示する指示書であって、この方法は、A)頭部または頸部の動脈を一過的に閉鎖する工程;およびB)該頭部または頸部の動脈が閉鎖されている間に、該生体分子を脳内に導入する工程、を包含する、指示書、を備える。
このように、本発明において、本発明者らは、インビトロおよびインビボの両方で、ウイルスエンベロープ(例えば、HVJ−Eベクター)を用いたCNSへの遺伝子移入の可能性を研究した。以下の実施例に示されるように、Venusレポーター遺伝子を用ると、蛍光が、ラット大脳皮質ニューロンおよびグリア細胞において検出され得た。インビボにおいて、レポーター遺伝子(VenusまたはEGFP)は、免疫学的な変化を誘導せずに、視床への直接注射によってか、脳室内注射によってか、または髄腔内注射によって、ラットの脳に好首尾にトランスフェクトされた。遺伝子発現は、総頸動脈を介した動脈内注入後に観察されなかったが、ベクターが中大脳動脈の一過性閉塞後に注射された場合、EGFPまたはルシフェラーゼ活性は、損傷した半球の中でのみ検出され得た。最後に、トランスフェクション効率を増加するために、ヘパリンの影響を試験した。ルシフェラーゼ活性は、50U/ml ヘパリンの添加によって顕著に増強された(P<0.05)。
結論として、HVJ−Eベクターは、いずれもの明らかな毒性も伴わずに、遺伝子をCNSにトランスフェクトする高い効力を有する。HVJ−Eベクターは、種々の遺伝子の役割を研究するためおよび脳血管疾患を処置するために有用であり得る。
以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、以下の実施例は、例示の目的のみに提供される。従って、本発明の範囲は、上記発明の詳細な説明にも下記実施例にも限定されるものではなく、特許請求の範囲によってのみ限定される。
(実施例1:HVJを用いた方法)
(材料および方法)
(HVJ−エンベロープベクター)
10,000赤血球凝集素単位のUV不活性化HVJ(Z株)を、200μgプラスミドDNAおよび0.3% Triton Xと混合し、平衡塩溶液(BSS:137mM NaCl、5.4mM KCl、10mM Tris−HCl、pH7.6)を用いて洗浄し、そしてリン酸緩衝化生理食塩水(pH7.5)を用いて、大脳内注射のために10μlに、髄腔内注入または動脈内注入のために100μlに、および培養細胞のために400μlに調整した。インビトロ研究のために、硫酸プロタミン(Nakalai Tesque,Japan)を、ベクターを用いた処理前に培養プレートへ10μg/ウェルで添加し、トランスフェクション効率を増強した。ヘパリン(Aventis,Japan)、低分子量のヘパリン(Fragmin(登録商標),Kissei,Japan)、またはアルガトロバン(Slonnon(登録商標),Daiichi,Japan)との同時注射の場合、これらをリン酸緩衝化生理食塩水と混合し、ベクターに添加した。
(プラスミドDNA)
pEGFP−C1を、Clontech(CA,USA)から購入した。pCMV−ルシフェラーゼーGL3(pcLuc−GL3:7.4kb)を、pGL3−Promoter Vector(Promega Corp.,Madison,WI,USA)由来のルシフェラーゼ遺伝子を、Hind III部位およびBam HI部位でpcDNA3(5.4kb)(Invitrogen,San Diego,CA,USA)にクローニングすることによって構築した。プラスミドを、QIAGENプラスミド単離キット(Hilden,Germany)を用いて精製した。pCMV−LacZ(9.2kb)は、pSV−β−ガラクトシダーゼ(Promega)のHind III−Bam HI フラグメントをpcDNA3に挿入することによって構築した。Venus/pCS219は、Dr.Nagai(Laboratory for Cell Function and Dynamics,Advanced Technology Development Center,Brain Science Institute,RIKEN,Japan)から好意により寄贈された。
(Venusに起因する蛍光の測定)
Venusの発現を、蛍光顕微鏡の下、注射の96時間後に試験した。より正確な画像を、共焦点レーザー顕微鏡(BioRad,Hercules,CA,USA)を用いて得た。
(ルシフェラーゼ活性のアッセイ)
ルシフェラーゼ遺伝子でトランスフェクトされたラットを、トランスフェクトの24時間後に麻酔下で屠殺した。器官(脳、肺、脾臓、肝臓)を、回収し、そして個別にFALCON 50ml チューブ中に置いた。ルシフェラーゼ活性のアッセイを、以前に記載されたように実施した(Brewer GJ,Torricelli JR,Evege EK,Price PJ.,J Neurosci Res.1993;35:567−76.)。ルシフェラーゼレベルを、組織抽出物のタンパク質濃度を測定することによって標準化した(Brewer GJ,Torricelli JR,Evege EK,Price PJ.,J Neurosci Res.1993;35:567−76.)。ルシフェラーゼ単位を、組織タンパク質1グラムあたりの相対光単位(RLU)として表した。
(インビトロ遺伝子移入)
ラット胚大脳皮質ニューロンを、妊娠19日の妊娠Wistarラット(Charles River Japan,Atsugi,Japan)から得て、培養した(Belayev L,et al.,Stroke.1996;27:1616−22;discussion 1623FF09。簡単に言うと、大脳皮質を切断し、そして個々の細胞を、パパインを用いた処理によって単離し、L−15 Levovitz(Invitrogen,CA,USA)培地に粉砕した。細胞を、ポリ−D−リジンでコートされた24ウェルプラスチック培養ディッシュ上にDMEM(Invitrogen,CA,USA)/B−27(Invitrogen)を用いて、37℃、95%大気−5% CO2の加湿雰囲気中でプレートに播いた。培地を、第1日目および第4日目に交換した。第7日目のMAP2に対する免疫ポジティブ細胞の割合は、92.9%であった。トランスフェクション前、培地を、新鮮な500μl DMEM/ウェルに交換した。Venus遺伝子を含むHVJ−Eベクター(250 HAU)を、各ウェルに添加し、37℃で10分間放置した。トランスフェクション後、培地を、新鮮なDMEM/B−27に交換し、そしてこのディッシュを37℃でインキュベートした。Venusの発現を、走査型共焦点レーザー顕微鏡画像を用いてトランスフェクションの2日後に観察した。トランスフェクション効率を、(Venusを発現する細胞の数/NeuN−免疫反応細胞の数)×100(%)として計算した。この効率の平均をとるために、5ヶ所の視野を無作為に選択し、そして細胞数を計数した。
(免疫組織化学研究)
インビトロで培養された細胞を、4% パラホルムアルデヒドを用いて37℃で15分間固定し、そして0.5% Triton X−100を用いて10分間処理した。この細胞を、2% ヤギ血清、ウシ血清アルブミン(5mg/ml)、およびグリシン(50mM)を含むPBSを用いてブロックした。それから、この細胞を、NeuNに対するモノクローナル抗体(1:1000,Chemicon,Temecula,CA,USA)、マウスモノクローナル抗体MAP2(1:1000,Sigma−Aldrich,Saint Louis,MO,USA)またはGFAP(1:1000,Sigma−Aldrich)を用いて、一晩4℃でインキュベートした。PBSを用いた洗浄後、Alexa Flour 546(Molecular Probes,Eugene,Oregon,USA)を、二次抗体として適用し、そしてこのディッシュを、1時間室温でインキュベートした。画像を、共焦点レーザー顕微鏡(BioRad,Hercules,CA,USA)を用いて分析した。
(正常ラットにおけるインビボ遺伝子移入)
雄性のWistarラット(270〜300g;Charles River Japan)を、本発明に使用した。全ての手順は、Osaka Universityのガイドラインに従って、実施した。ラットを、ケタミン(Sankyo,Japan)を用いて麻酔し、頭蓋をあらわにしながら定位フレーム(Narishige Scientific Instrument Laboratory,Tokyo,Japan)に配置した。特別設計したテフロンコネクタ(FEPチューブ、Bioanalytical Systems,West Lafayette,IN)を備えるステンレス鋼のカニューレ(30ゲージ;Beckton Dickinson,Franklin Lakes,NJ)を、視床(ブレグマの後方3.8mm、中線の側方2.4mm、および頭蓋表面下5.0mm)または側脳室(ブレグマの後方0.48mm、中線の側方0.8mmm、および頭蓋表面下3.8mm)に導入した。VenusまたはEGFP遺伝子を含むHVJ−Eベクターを、1.0μl/分の速度で注射した。注入後、この注入カニューレを取り出した。痙攣または四肢の異常な動きのような行動変化はいずれの動物においても観察されなかった。
クモ膜下腔への注入のために、各動物の頭部を、腹臥位に固定し、そして環椎後頭膜を、後頭大脳中線の切開によって露出させた。ステンレスカニューレ(27ゲージ;Beckton Dickinson)を、大槽(クモ膜下腔)に導入した。ルシフェラーゼまたはVenus遺伝子を含むHVJ−Eベクター(100μl)を、100μlのCSFを除去した後に50μl/分の速度で注入した。次いで、この動物を、頭部を下にして30分間置いた。総頸動脈に注入するために、左総頸動脈、左外頸動脈、および左内頸動脈を、手術顕微鏡(Konan,Japan)下での正中切開を介して単離した。左総頸動脈および内頸動脈を一時的に連結させ、そしてPE−50カテーテル(Clay Adams,Parsippany,NY,USA)を、左外頸動脈を切り落とすことによって左総頸動脈に導入した。EGFPまたはルシフェラーゼ遺伝子を含むHVJ−Eベクター(100μl)を、25μl/分の速度で注射した。注射後、カニューレを取り出し、そして総頸動脈への血流を、結紮を放すことによって回復させた。各手順において、EGFPまたはVenusは、トランスフェクションの4日後に観察され、そしてルシフェラーゼ活性は、トランスフェクションの1日後に測定した。脾臓、肺、および肝臓中のルシフェラーゼ活性をまた、髄腔内注射の1日後に測定した。全てのラットは、投与後に体重減少も活性の損失も示さなかった。ベクター投与後の組織学的変化を明確にするために、冠状縫合切断のHE染色を、脳室内注射および髄腔内注射の3日後に実施した。この冠状縫合切断を、ブレグマから+1.0mm、−3.30mm、−5.30mm、−11.30mm、および−14.60mmで作製した。
(一過性の中大脳動脈閉塞後のインビボ遺伝子移入)
中大脳動脈閉塞モデルを作製するために、左中大脳動脈を、以前に記載されたように(Belayev L et al.,Stroke 27,1616−1622(1996))、ポリ−L−リジンコートされた4−0ナイロンをMCAの起点に配置することによって、閉塞させた。簡単に言うと、動物を顔面マスクを用いてハロタン(70% N2Oおよび30% O2の混合物中に1〜3.5%)で麻酔した。直腸温度を、フィードバック調節された加熱パッドを用いた手術手段の間、終始37±1℃に維持した。手術顕微鏡の下、左総頸動脈、左外頸動脈、および左内頸動脈を、正中切開を介して単離した。60分後、総頸動脈および内頸動脈を、一過性に連結し、そして4−0ナイロンを取り出し、そして動脈を10分間、再灌流させた。それから、総頸動脈および内頸動脈を、再び一過性に連結させ、そしてPE−50カテーテルを、上記のように外頸動脈から総頸動脈に配置し、そしてベクターを、連結を放した後に20μl/分の速度で注射した。注射後、PE−50カテーテルを取り出し、そして外頸動脈を6−0ナイロンと連結させた。ルシフェラーゼまたはEGFPの発現は、注入の1日後または3日後に観察された。
(結果)
(培養ラット大脳皮質細胞へのトランスフェクション)
CNSに遺伝子を移入する有効な方法を開発するために、本発明者らは、最初にレポーター遺伝子(Venus遺伝子)を培養ラット大脳皮質細胞(E19)にトランスフェクトした。なぜなら、このVenusレポーター遺伝子の使用は、容易に検出されるトランスフェクション方法として報告されているからである。アクセプターとしてのVenusの使用は、脳薄片における確実な蛍光シグナルの初期検出を可能にすることが、報告される(Nagai T,et al.,Nat Biotechnol.2002;20:87−90.)。トランスフェクションの2日後、培養ラット大脳皮質細胞は、培養細胞中に容易に検出可能な蛍光を示した(図1a、1d、1g)。免疫組織化学染色を用いると、細胞は、MAP2(微小管結合蛋白2;ニューロンマーカー)、NeuN(ニューロン核抗原;ニューロンマーカー)、またはGFAP(グリア原線維酸性タンパク質;グリアおよび神経膠星状細胞マーカー)について免疫ポジティブであった(図1c、1f、および1i)。ニューロン細胞へのトランスフェクション効率は、Venusポジティブ細胞数/NeuNポジティブ細胞数から計算した場合、26.7±6.4%であったが、コントロールベクターでトランスフェクトされた細胞においてポジティブ細胞は検出され得なかった。細胞死は、HVJ−Eベクターを用いたトランスフェクト後に観察されなかった。
(脳へのインビボ遺伝子移入)
次に、本発明者らは、Venus遺伝子の脳へのトランスフェクションを試験した。最初に、本発明者らは、増強された緑色蛍光タンパク質(EGFP)遺伝子を含むHVJ−Eベクターを、視床下部または側脳室に注射した。EGFP遺伝子の視床への定位注射の使用は、注射部位における限定された発現を示した(図2a)。側脳室への定位注射によって、蛍光は、脈絡叢および脳室上衣細胞において検出され得た(図2b、c)。予期せぬことに、ポジティブ細胞は、ニューロン中で検出されなかった。対照的に、蛍光のポジティブ染色は、コントロールベクターでトランスフェクトされた脳またはトランスフェクトされていない脳において検出され得なかった。従って、本発明者らは、クモ膜下腔への注射を用いた。本実験において、本発明者らは、EGFPの代わりにVenusを使用した。なぜなら、Venusレポーター遺伝子の使用は、容易に検出されるトランスフェクション方法であるからである。大槽を介した脳脊髄液への注射によって、髄膜においては広汎性のVenus発現であるが、脈絡叢においてもニューロンにおいてもそうではない発現が明らかになった(図3a、3b)。重要なことに、脳室内注射または髄腔内注射の3日後における冠状縫合切断のHE染色が、炎症性の変化を示さなかった。
(一過性中大脳動脈閉塞後のCNSへの遺伝子移入)
臨床設定にある大脳虚血疾患の処置を考慮すると、定位フレームを用いた側脳室への注射よりも、クモ膜下腔への注入を用いるほうが最良のようである。大脳虚血におけるHVJ−Eベクターを用いた遺伝子治療の可能性をさらに探索するために、本発明者らは、最終的に、頸動脈を介したCNSへの遺伝子移入を試験した。しかし、頸動脈への動脈内注入は、注射の3日後および7日後において脳および微小血管内皮細胞に導入遺伝子の発現をほとんど生成しなかった。この問題を克服するために、本発明者らは、大脳虚血後の遺伝子移入が、CNSへの異なるトランスフェクション効率を示すかもしれないと仮説をたてた。なぜなら、大脳虚血は、血液脳関門に変化を引き起こすからである(Belayev L,Busto R,Zhao W,Ginsberg MD.,Brain Res.1996;739:88−96.;Kuroiwa T,Ting P,Martinez H,Klatzo I.,Acta Neuropathol.1985;68:122−9.;およびNeumann−Haefelin T,et al.,Stroke.2000;31:1965−72;discussion 1972−3.)。従って、本発明者らは、Venus遺伝子を含むHVJ−Eベクターを、60分間の一過性中大脳動脈閉塞後に頸動脈に注入した。興味深いことに、Venusに起因する蛍光が、一過性閉塞の3日後に梗塞した大脳皮質において検出され得た(図4)。CNSへのトランスフェクションの可能性を、ルシフェラーゼ遺伝子を用いた実験によって確認した。注射の24時間後のルシフェラーゼ活性は、対側半球においてよりも梗塞した半球においてはるかに高かった(図5、P<0.05)。対照的に、ルシフェラーゼ活性は、脾臓、肺、および肝臓において検出され得なかった。
最後に、本発明者らは、ヘパリンの同時投与がトランスフェクション効率を増加するか否かをさらに調査した。ルシフェラーゼ遺伝子を含むHVJ−Eベクターを作製した後、ヘパリンを10、50、または100U/mlの濃度でこのベクターに添加した。HVJ−Eベクターを、大槽を介してCSFに注射した。図6に示されるように、ルシフェラーゼ活性は、50U/ml ヘパリンの添加によって顕著に増強された(P<0.05)。ヘパリンを用いたトランスフェクション効率における増加の機構を明らかにするために、本発明者らは、1、5、10、50、100、もしくは200U/mlの濃度の低分子量ヘパリン(LMWH)、または0.1もしくは0.2mg/mlの濃度のアルガトロバンの影響を試験した。低分子量ヘパリンもアルガトロバンも両方とも、ルシフェラーゼ活性に影響を与えなかった。
(考察)
以前、本発明者らは、ラットおよび霊長類のCNSへのトランスフェクションに関するHVJ−リポソーム方法の効力を報告している(Yamada K,et al.,Am J Physiol.1996;271:R1212−20.;Hagihara Y,et al.,Gene Ther.2000;7:759−63.;およびHayashi K,et al.,Gene Ther.2001;8:1167−73.)。HVJ−リポソーム方法は、種々の細胞および組織へのトランスフェクションのために、リポソームの組み合わせおよびHVJエンベロープ(Kaneda Y,Saeki Y,Morishita R.,Mol Med Today.1999;5:298−303.)由来のタンパク質の融合活性を利用する。しかし、HVJ−リポソーム小胞を作製することは非常に長期にわたり、そして複雑な手順である。さらに、長期保存は、不可能であり得る。これらの問題は、ヒト遺伝子治療のためのHVJ−リポソーム複合体の用法に影響を及ぼし得る。これらの問題を克服するために、本発明者らは、最近、第2世代のHVJベクター、いわゆるHVJ−Eベクターを開発した。HVJ−Eベクターを産生するために、ウイルスゲノムを完全に破壊した後、導入遺伝子をHVJのエンベロープに挿入した。HVJ−リポソームベクターと比較した場合のHVJ−Eベクターの利点は、以下である:1)HVJ−Eベクターは、作製が容易である、2)産生には、ほとんど時間をとらない(90分未満)、そして、3)HVJ−Eベクターは、長期間(少なくとも6ヶ月)保存可能である。本発明において、本発明者らは、インビボおよびインビトロの両方で、HVJ−Eベクターを用いたCNSへの遺伝子移入の可能性を示す。インビトロ研究において、レポーター遺伝子は、細胞死を誘導することなくニューロン(MAP2ポジティブ細胞またはNeuNポジティブ細胞)および大グリア細胞(GFAPポジティブ細胞)において好首尾に発現された。非ウイルスベクターを用いると、有糸分裂細胞は良好にトランスフェクトされるが、非有糸分裂細胞(例えば、休止(G0)ニューロン)は、ほとんどトランスフェクトされない(Berry M,et al.,Curr Opin Mol Ther.2001;3:338−49.)。しかし、本発明において、レポーター遺伝子を、HVJ−Eベクターを用いて非有糸分裂ニューロンに良好にトランスフェクトした。有効なトランスフェクションは、ニューロンの表面上に豊富にあるシアル酸に対するウイルスレポーターの存在に起因して、達成され得る。
重要なことに、HVJ−Eベクターを用いた遺伝子発現の分布は、CNSへのインビボ遺伝子移入のためのHVJ−リポソームを用いた遺伝子発現の分布と異なった。髄腔内注射後、β−ガラクトシダーゼ遺伝子発現が、HVJ−リポソーム方法を用いた大脳実質において観察されたが(Hagihara Y,et al.,Gene Ther.2000;7:759−63.;およびHayashi K,et al.,Gene Ther.2001;8:1167−73.)、HVJ−Eベクターを用いると遺伝子発現は髄膜のみで検出された。その上、脳室内カチオン性リポソーム(HVJカチオン性リポソーム)媒介遺伝子移入は、大脳実質における発現を示したが(Zou LL,et al.,Gene Ther.1999;6:994−1005.)、一方、HVJ−Eベクター媒介遺伝子トランスフェクションは、脈絡叢および脳室上衣細胞においてのみ導入遺伝子発現を示した。HVJ−Eベクターの視床への直接注入がニューロンへのトランスフェクションを生じることを考慮すると、リポソームの存在は、軟髄膜または脳室上衣細胞を交差することに重要であるのかもしれない。本発明者らおよび他の者は、定位フレームを用いた側脳室への投与を用いるいくつか遺伝子移入方法の高いトランスフェクション効率を報告しているが(Yoshimura S,et al.,Hypertension.2002;39:1028−34.;およびYukawa H,et al.,Gene Ther.2000;7:942−9.)、その技術は、かなり侵襲性である。幸運にも、本発明者らは、導入遺伝子発現が、大槽への注射後に脳表面上で観察されたことを見出した。さらに、本発明は、CNSへの遺伝子移入が、一過性頸動脈閉塞後の再疎通の間にHVJ−Eベクターの動脈内注射を介して可能であったことを明らかに示す。一過性中大脳動脈閉塞後の血液脳関門の破壊が論議の的となっているが(Belayev L,Busto R,Zhao W,Ginsberg MD.,Brain Res.1996;739:88−96.;Kuroiwa T,Ting P,Martinez H,Klatzo I.,Acta Neuropathol.1985;68:122−9.;およびNeumann−Haefelin T,et al.,Stroke.2000;31:1965−72;discussion 1972−3.)、Kuroiwaらは、一過性中大脳動脈閉塞の1時間後の血液脳関門の二相性の開放を実証し、この開放は、閉塞を放し、次いで5時間および72時間の再灌流の15分後に生じた(Kuroiwa T,Ting P,Martinez H,Klatzo I.,Acta Neuropathol.1985;68:122−9.)。この制限された期間中のHVJ−Eベクターの注入は、動脈内手段を介した大脳実質への治療遺伝子のトランスフェクションを可能にする。
ヘパリンの同時投与がHVJ−Eベクターを用いたトランスフェクションの効率を増加したことは、注目すべきことである。これは、AAVベクターを用いたヘパリンとの同時注入がより高くそしてより同質の遺伝子発現を誘導したという報告(Mastakov MY,Baer K,Kotin RM,During MJ.,Mol Ther.2002;5:371−80.29.;およびNguyen JB,Sanchez−Pernaute R,Cunningham J,Bankiewicz KS.,Neuroreport.2001;12:1961−4.)に類似する。ヘパリンがウイルス結合レセプターのひとつである、2,3−連結シアリックテオグリアシッド(sialic teoglyacid)に影響を与え、トランスフェクションの効率を高めたか、またはヘパリンがウイルス表面に結合して、細胞表面上のHSPGとの相互作用を制限し得ると推測された。この機構を明らかにするために、本発明者らは、LMWHおよびアルガトロバンのような類似の物質の影響を試験した。しかし、これらの分子を用いてトランスフェクション効率の増加は観察されなかった。特に、従来のヘパリン(12,000〜15,000kDa)とLMWH(5000kDa)との間の差異は、分子の大きさおよび硫酸化の程度のみである(Ishai−Michaeli R,et al.,Biochemistry.1992;31:2080−8.)。おそらく、これらの因子は、HVJ−Eベクターと標的細胞表面との間の相互作用に影響を及ぼし得る。
ここで、本発明は、いずれの明らかな毒性も伴わない、インビボおよびインビトロでの、CNSへのHVJ−Eベクターを用いた高いトランスフェクション効率を示すが、遺伝子発現の部位は、種々の投与経路間で異なった。一過性動脈閉塞後の動脈内注射による好首尾な遺伝子トランスフェクションは、大脳虚血の処置のための有望な手段を提供する。さらに、本発明者らの知る限り、副作用の証拠はない。HVJは、ヒトに対して病原性ではなく(Okada Y.,Methods Enzymol 1993;2211,18−41.;およびOkada Y,Tadokoro J.,Exp Cell Res 1962;26,108−118.)、そしてHVJ融合活性を損失することなく適切な化学修飾によって完全に不活性化される。本発明において、髄腔内投与または脳室内投与は、動物の体重を減少させず、神経学的な欠損も引き起こさず、炎症性の変化も引き起こさなかった。さらに、髄腔内注射後にいずれの他の器官においても、ルシフェラーゼ活性は観察されなかった。従って、HVJ−Eベクターは、脳へのトランスフェクションに安全なようである。免疫原性に関して、5回のHVJ−リポソーム方法によるプラスミドDNAおよびアンチセンスODNの反復投与は、生物学的効果のいずれの損失もHVJに対する抗体の産生も引き起こさなかった(Morishita R,Gibbons GH,Kaneda Y,Ogihara T,Dzau VJ.,Biochem Biophys Res Commun 2000;273:666−674;およびHirano T,et al.,Gene Ther 1998;5:459−464.)。これらの理由から、HVJ−Eベクターは、脳血管疾患の処置のための適切な遺伝子移入方法であり得る。
(実施例2:他のウイルスベクターを用いた送達)
インフルエンザウイルスの調製:
オルトミクソウイルス科のインフルエンザウイルスを、原則的にWO96/05294に記載されるように、孵化鶏卵から得、増殖させた。簡潔には以下のとおりである。受精卵の選択は注意深く行わなければならず、専用に確保された健全な農場より入手したものでなければならない。受精卵を37.8℃の培養器に9〜12日間入れ、尿嚢にインフルエンザウィルスを接種する前に、卵をろうそくの光に透かして胚の成長および胚の生存を確認した。
その後、最適条件でウィルスに感染させるために、温度および湿度を制御した培養インキュベータ中で2〜3日間卵を培養した。これらの条件はインフルエンザの株と使用したウィルス種に依存していた。5±3℃に急冷して培養を停止した。その後、感染した卵から多量のウィルス粒子を含む尿嚢液を取り出す。こうして得られたウィルスを含む尿嚢液を、迅速に精製して不純物(例えばオバルブミンを含むタンパク質、レシチン、バクテリア等)を除去するために、回収した材料を遠心分離して上澄液を取り、限外濾過で20倍まで濃縮してからウィルスの精製を行った。
(アルキル化処理)
使用直前に、10mM KH2PO4中に0.01% β−プロピオラクトンの調製をした。作業中は低温に保ち素早く作業を行った。
上述のように得たインフルエンザウイルス濃縮液にβ−プロピオラクトンを添加し、氷上で60分間インキュベートした。その後2時間、37℃でインキュベートした。エッペンドルフチューブにチューブあたり適量し、15,000rpm、15分遠心し、沈澱を−20℃で保存した。これを必要に応じて、このインフルエンザウイルスを限外濾過した。
上記サンプルを、500KMWCO(A/G Technology、Needham、Massachusetts)を用いた限外濾過法により約10倍濃縮した。緩衝液として、50mM NaCl、1mM MgCl2、2%マンニトール、20mM Tris(pH7.5)を用いた。ほぼ100%のインフルエンザウイルスエンベロープの回収率であり優れた結果が得られた。
Q−Sepharose FF(アマシャムファルマシアバイオテクKK、Tokyo)によるカラムクロマトグラフィー法(緩衝液:20mM Tris−HCl(pH7.5)buffer、0.2〜1M NaCl))でインフルエンザウイルスエンベロープを精製した。40〜50%の回収率であり、純度は99%以上であった。
このようにしてインフルエンザウイルス含有漿尿液からの不活性化インフルエンザウイルスエンベロープを製造した。
インフルエンザウイルスエンベロープを用いた脳への送達について調べた。本発明者らは、インビトロおよびインビボの両方で、インフルエンザウイルスエンベロープを用いたCNSへの遺伝子移入の可能性を実施例1に記載のように調べたところ、Venusレポーター遺伝子を用ると、蛍光が、ラット大脳皮質ニューロンおよびグリア細胞において検出され得た。インビボにおいて、レポーター遺伝子(VenusまたはEGFP)は、免疫学的な変化を誘導せずに、視床への直接注射によってか、脳室内注射によってか、または髄腔内注射によって、ラットの脳に好首尾にトランスフェクトされた。遺伝子発現は、総頸動脈を介した動脈内注入後に観察されなかったが、ベクターが中大脳動脈の一過性閉塞後に注射された場合、EGFPまたはルシフェラーゼ活性は、損傷した半球の中でのみ検出され得た。最後に、トランスフェクション効率を増加するために、ヘパリンの影響を試験した。ルシフェラーゼ活性は、50U/mlヘパリンの添加によって顕著に増強された。
このように、HVJ−Eベクターのみならず、他のウイルス由来のものでも脳動脈の一過性閉塞後での脳への遺伝子導入効率が顕著に上昇し、ヘパリンの添加がインフルエンザウイルスエンベロープの生体分子送達効率を上昇させることが見出された。
(実施例3:アデノ随伴ウイルスを用いた方法)
次に、アデノ随伴ウイルスを用いて、実施例1および2と同様の実験を行った。アデノ随伴ウイルスは、AAV Helper−Free System(Stratagene)を使用した。
アルキル化処理は、実施例2に記載されるように行った。
アデノ随伴ウイルスエンベロープを用いた脳への送達について調べた。本発明者らは、インビトロおよびインビボの両方で、アデノ随伴ウイルスエンベロープを用いたCNSへの遺伝子移入の可能性を実施例1に記載のように調べたところ、Venusレポーター遺伝子を用ると、蛍光が、ラット大脳皮質ニューロンおよびグリア細胞において検出され得た。インビボにおいて、レポーター遺伝子(VenusまたはEGFP)は、免疫学的な変化を誘導せずに、視床への直接注射によってか、脳室内注射によってか、または髄腔内注射によって、ラットの脳に好首尾にトランスフェクトされた。遺伝子発現は、総頸動脈を介した動脈内注入後に観察されなかったが、ベクターが中大脳動脈の一過性閉塞後に注射された場合、EGFPまたはルシフェラーゼ活性は、損傷した半球の中でのみ検出され得た。最後に、トランスフェクション効率を増加するために、ヘパリンの影響を試験した。ルシフェラーゼ活性は、50U/mlヘパリンの添加によって顕著に増強された。
(実施例4:ヘパラン硫酸)
実施例1〜3におけるヘパリンに代えて、ヘパラン硫酸(生化学工業(株)およびSigma−Aldrich Japanから購入可能)を用いてHVJ、インフルエンザウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターを用いた場合に、同様な効果が見られるかどうか実証する。
実験の結果、ヘパラン硫酸を用いた場合でも、脳への遺伝子導入効率が上昇することが確認される。従って、グルコサミノグリカン一般で本発明の効果があることが実証される。
(実施例5:コンドロイチン硫酸)
実施例1〜3におけるヘパリンに代えて、コンドロイチン硫酸(生化学工業(株)およびSigma−Aldrich Japanから購入可能)を用いてHVJ、インフルエンザウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターを用いた場合に、同様な効果が見られるかどうか実証する。
実験の結果、コンドロイチン硫酸を用いた場合でも、脳への遺伝子導入効率が上昇することが確認される。従って、グルコサミノグリカン、ガラクトサミノグリカンを含め、グリコサミノグリカン一般で本発明の効果が実証される。
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
(材料および方法)
(HVJ−エンベロープベクター)
10,000赤血球凝集素単位のUV不活性化HVJ(Z株)を、200μgプラスミドDNAおよび0.3% Triton Xと混合し、平衡塩溶液(BSS:137mM NaCl、5.4mM KCl、10mM Tris−HCl、pH7.6)を用いて洗浄し、そしてリン酸緩衝化生理食塩水(pH7.5)を用いて、大脳内注射のために10μlに、髄腔内注入または動脈内注入のために100μlに、および培養細胞のために400μlに調整した。インビトロ研究のために、硫酸プロタミン(Nakalai Tesque,Japan)を、ベクターを用いた処理前に培養プレートへ10μg/ウェルで添加し、トランスフェクション効率を増強した。ヘパリン(Aventis,Japan)、低分子量のヘパリン(Fragmin(登録商標),Kissei,Japan)、またはアルガトロバン(Slonnon(登録商標),Daiichi,Japan)との同時注射の場合、これらをリン酸緩衝化生理食塩水と混合し、ベクターに添加した。
(プラスミドDNA)
pEGFP−C1を、Clontech(CA,USA)から購入した。pCMV−ルシフェラーゼーGL3(pcLuc−GL3:7.4kb)を、pGL3−Promoter Vector(Promega Corp.,Madison,WI,USA)由来のルシフェラーゼ遺伝子を、Hind III部位およびBam HI部位でpcDNA3(5.4kb)(Invitrogen,San Diego,CA,USA)にクローニングすることによって構築した。プラスミドを、QIAGENプラスミド単離キット(Hilden,Germany)を用いて精製した。pCMV−LacZ(9.2kb)は、pSV−β−ガラクトシダーゼ(Promega)のHind III−Bam HI フラグメントをpcDNA3に挿入することによって構築した。Venus/pCS219は、Dr.Nagai(Laboratory for Cell Function and Dynamics,Advanced Technology Development Center,Brain Science Institute,RIKEN,Japan)から好意により寄贈された。
(Venusに起因する蛍光の測定)
Venusの発現を、蛍光顕微鏡の下、注射の96時間後に試験した。より正確な画像を、共焦点レーザー顕微鏡(BioRad,Hercules,CA,USA)を用いて得た。
(ルシフェラーゼ活性のアッセイ)
ルシフェラーゼ遺伝子でトランスフェクトされたラットを、トランスフェクトの24時間後に麻酔下で屠殺した。器官(脳、肺、脾臓、肝臓)を、回収し、そして個別にFALCON 50ml チューブ中に置いた。ルシフェラーゼ活性のアッセイを、以前に記載されたように実施した(Brewer GJ,Torricelli JR,Evege EK,Price PJ.,J Neurosci Res.1993;35:567−76.)。ルシフェラーゼレベルを、組織抽出物のタンパク質濃度を測定することによって標準化した(Brewer GJ,Torricelli JR,Evege EK,Price PJ.,J Neurosci Res.1993;35:567−76.)。ルシフェラーゼ単位を、組織タンパク質1グラムあたりの相対光単位(RLU)として表した。
(インビトロ遺伝子移入)
ラット胚大脳皮質ニューロンを、妊娠19日の妊娠Wistarラット(Charles River Japan,Atsugi,Japan)から得て、培養した(Belayev L,et al.,Stroke.1996;27:1616−22;discussion 1623FF09。簡単に言うと、大脳皮質を切断し、そして個々の細胞を、パパインを用いた処理によって単離し、L−15 Levovitz(Invitrogen,CA,USA)培地に粉砕した。細胞を、ポリ−D−リジンでコートされた24ウェルプラスチック培養ディッシュ上にDMEM(Invitrogen,CA,USA)/B−27(Invitrogen)を用いて、37℃、95%大気−5% CO2の加湿雰囲気中でプレートに播いた。培地を、第1日目および第4日目に交換した。第7日目のMAP2に対する免疫ポジティブ細胞の割合は、92.9%であった。トランスフェクション前、培地を、新鮮な500μl DMEM/ウェルに交換した。Venus遺伝子を含むHVJ−Eベクター(250 HAU)を、各ウェルに添加し、37℃で10分間放置した。トランスフェクション後、培地を、新鮮なDMEM/B−27に交換し、そしてこのディッシュを37℃でインキュベートした。Venusの発現を、走査型共焦点レーザー顕微鏡画像を用いてトランスフェクションの2日後に観察した。トランスフェクション効率を、(Venusを発現する細胞の数/NeuN−免疫反応細胞の数)×100(%)として計算した。この効率の平均をとるために、5ヶ所の視野を無作為に選択し、そして細胞数を計数した。
(免疫組織化学研究)
インビトロで培養された細胞を、4% パラホルムアルデヒドを用いて37℃で15分間固定し、そして0.5% Triton X−100を用いて10分間処理した。この細胞を、2% ヤギ血清、ウシ血清アルブミン(5mg/ml)、およびグリシン(50mM)を含むPBSを用いてブロックした。それから、この細胞を、NeuNに対するモノクローナル抗体(1:1000,Chemicon,Temecula,CA,USA)、マウスモノクローナル抗体MAP2(1:1000,Sigma−Aldrich,Saint Louis,MO,USA)またはGFAP(1:1000,Sigma−Aldrich)を用いて、一晩4℃でインキュベートした。PBSを用いた洗浄後、Alexa Flour 546(Molecular Probes,Eugene,Oregon,USA)を、二次抗体として適用し、そしてこのディッシュを、1時間室温でインキュベートした。画像を、共焦点レーザー顕微鏡(BioRad,Hercules,CA,USA)を用いて分析した。
(正常ラットにおけるインビボ遺伝子移入)
雄性のWistarラット(270〜300g;Charles River Japan)を、本発明に使用した。全ての手順は、Osaka Universityのガイドラインに従って、実施した。ラットを、ケタミン(Sankyo,Japan)を用いて麻酔し、頭蓋をあらわにしながら定位フレーム(Narishige Scientific Instrument Laboratory,Tokyo,Japan)に配置した。特別設計したテフロンコネクタ(FEPチューブ、Bioanalytical Systems,West Lafayette,IN)を備えるステンレス鋼のカニューレ(30ゲージ;Beckton Dickinson,Franklin Lakes,NJ)を、視床(ブレグマの後方3.8mm、中線の側方2.4mm、および頭蓋表面下5.0mm)または側脳室(ブレグマの後方0.48mm、中線の側方0.8mmm、および頭蓋表面下3.8mm)に導入した。VenusまたはEGFP遺伝子を含むHVJ−Eベクターを、1.0μl/分の速度で注射した。注入後、この注入カニューレを取り出した。痙攣または四肢の異常な動きのような行動変化はいずれの動物においても観察されなかった。
クモ膜下腔への注入のために、各動物の頭部を、腹臥位に固定し、そして環椎後頭膜を、後頭大脳中線の切開によって露出させた。ステンレスカニューレ(27ゲージ;Beckton Dickinson)を、大槽(クモ膜下腔)に導入した。ルシフェラーゼまたはVenus遺伝子を含むHVJ−Eベクター(100μl)を、100μlのCSFを除去した後に50μl/分の速度で注入した。次いで、この動物を、頭部を下にして30分間置いた。総頸動脈に注入するために、左総頸動脈、左外頸動脈、および左内頸動脈を、手術顕微鏡(Konan,Japan)下での正中切開を介して単離した。左総頸動脈および内頸動脈を一時的に連結させ、そしてPE−50カテーテル(Clay Adams,Parsippany,NY,USA)を、左外頸動脈を切り落とすことによって左総頸動脈に導入した。EGFPまたはルシフェラーゼ遺伝子を含むHVJ−Eベクター(100μl)を、25μl/分の速度で注射した。注射後、カニューレを取り出し、そして総頸動脈への血流を、結紮を放すことによって回復させた。各手順において、EGFPまたはVenusは、トランスフェクションの4日後に観察され、そしてルシフェラーゼ活性は、トランスフェクションの1日後に測定した。脾臓、肺、および肝臓中のルシフェラーゼ活性をまた、髄腔内注射の1日後に測定した。全てのラットは、投与後に体重減少も活性の損失も示さなかった。ベクター投与後の組織学的変化を明確にするために、冠状縫合切断のHE染色を、脳室内注射および髄腔内注射の3日後に実施した。この冠状縫合切断を、ブレグマから+1.0mm、−3.30mm、−5.30mm、−11.30mm、および−14.60mmで作製した。
(一過性の中大脳動脈閉塞後のインビボ遺伝子移入)
中大脳動脈閉塞モデルを作製するために、左中大脳動脈を、以前に記載されたように(Belayev L et al.,Stroke 27,1616−1622(1996))、ポリ−L−リジンコートされた4−0ナイロンをMCAの起点に配置することによって、閉塞させた。簡単に言うと、動物を顔面マスクを用いてハロタン(70% N2Oおよび30% O2の混合物中に1〜3.5%)で麻酔した。直腸温度を、フィードバック調節された加熱パッドを用いた手術手段の間、終始37±1℃に維持した。手術顕微鏡の下、左総頸動脈、左外頸動脈、および左内頸動脈を、正中切開を介して単離した。60分後、総頸動脈および内頸動脈を、一過性に連結し、そして4−0ナイロンを取り出し、そして動脈を10分間、再灌流させた。それから、総頸動脈および内頸動脈を、再び一過性に連結させ、そしてPE−50カテーテルを、上記のように外頸動脈から総頸動脈に配置し、そしてベクターを、連結を放した後に20μl/分の速度で注射した。注射後、PE−50カテーテルを取り出し、そして外頸動脈を6−0ナイロンと連結させた。ルシフェラーゼまたはEGFPの発現は、注入の1日後または3日後に観察された。
(結果)
(培養ラット大脳皮質細胞へのトランスフェクション)
CNSに遺伝子を移入する有効な方法を開発するために、本発明者らは、最初にレポーター遺伝子(Venus遺伝子)を培養ラット大脳皮質細胞(E19)にトランスフェクトした。なぜなら、このVenusレポーター遺伝子の使用は、容易に検出されるトランスフェクション方法として報告されているからである。アクセプターとしてのVenusの使用は、脳薄片における確実な蛍光シグナルの初期検出を可能にすることが、報告される(Nagai T,et al.,Nat Biotechnol.2002;20:87−90.)。トランスフェクションの2日後、培養ラット大脳皮質細胞は、培養細胞中に容易に検出可能な蛍光を示した(図1a、1d、1g)。免疫組織化学染色を用いると、細胞は、MAP2(微小管結合蛋白2;ニューロンマーカー)、NeuN(ニューロン核抗原;ニューロンマーカー)、またはGFAP(グリア原線維酸性タンパク質;グリアおよび神経膠星状細胞マーカー)について免疫ポジティブであった(図1c、1f、および1i)。ニューロン細胞へのトランスフェクション効率は、Venusポジティブ細胞数/NeuNポジティブ細胞数から計算した場合、26.7±6.4%であったが、コントロールベクターでトランスフェクトされた細胞においてポジティブ細胞は検出され得なかった。細胞死は、HVJ−Eベクターを用いたトランスフェクト後に観察されなかった。
(脳へのインビボ遺伝子移入)
次に、本発明者らは、Venus遺伝子の脳へのトランスフェクションを試験した。最初に、本発明者らは、増強された緑色蛍光タンパク質(EGFP)遺伝子を含むHVJ−Eベクターを、視床下部または側脳室に注射した。EGFP遺伝子の視床への定位注射の使用は、注射部位における限定された発現を示した(図2a)。側脳室への定位注射によって、蛍光は、脈絡叢および脳室上衣細胞において検出され得た(図2b、c)。予期せぬことに、ポジティブ細胞は、ニューロン中で検出されなかった。対照的に、蛍光のポジティブ染色は、コントロールベクターでトランスフェクトされた脳またはトランスフェクトされていない脳において検出され得なかった。従って、本発明者らは、クモ膜下腔への注射を用いた。本実験において、本発明者らは、EGFPの代わりにVenusを使用した。なぜなら、Venusレポーター遺伝子の使用は、容易に検出されるトランスフェクション方法であるからである。大槽を介した脳脊髄液への注射によって、髄膜においては広汎性のVenus発現であるが、脈絡叢においてもニューロンにおいてもそうではない発現が明らかになった(図3a、3b)。重要なことに、脳室内注射または髄腔内注射の3日後における冠状縫合切断のHE染色が、炎症性の変化を示さなかった。
(一過性中大脳動脈閉塞後のCNSへの遺伝子移入)
臨床設定にある大脳虚血疾患の処置を考慮すると、定位フレームを用いた側脳室への注射よりも、クモ膜下腔への注入を用いるほうが最良のようである。大脳虚血におけるHVJ−Eベクターを用いた遺伝子治療の可能性をさらに探索するために、本発明者らは、最終的に、頸動脈を介したCNSへの遺伝子移入を試験した。しかし、頸動脈への動脈内注入は、注射の3日後および7日後において脳および微小血管内皮細胞に導入遺伝子の発現をほとんど生成しなかった。この問題を克服するために、本発明者らは、大脳虚血後の遺伝子移入が、CNSへの異なるトランスフェクション効率を示すかもしれないと仮説をたてた。なぜなら、大脳虚血は、血液脳関門に変化を引き起こすからである(Belayev L,Busto R,Zhao W,Ginsberg MD.,Brain Res.1996;739:88−96.;Kuroiwa T,Ting P,Martinez H,Klatzo I.,Acta Neuropathol.1985;68:122−9.;およびNeumann−Haefelin T,et al.,Stroke.2000;31:1965−72;discussion 1972−3.)。従って、本発明者らは、Venus遺伝子を含むHVJ−Eベクターを、60分間の一過性中大脳動脈閉塞後に頸動脈に注入した。興味深いことに、Venusに起因する蛍光が、一過性閉塞の3日後に梗塞した大脳皮質において検出され得た(図4)。CNSへのトランスフェクションの可能性を、ルシフェラーゼ遺伝子を用いた実験によって確認した。注射の24時間後のルシフェラーゼ活性は、対側半球においてよりも梗塞した半球においてはるかに高かった(図5、P<0.05)。対照的に、ルシフェラーゼ活性は、脾臓、肺、および肝臓において検出され得なかった。
最後に、本発明者らは、ヘパリンの同時投与がトランスフェクション効率を増加するか否かをさらに調査した。ルシフェラーゼ遺伝子を含むHVJ−Eベクターを作製した後、ヘパリンを10、50、または100U/mlの濃度でこのベクターに添加した。HVJ−Eベクターを、大槽を介してCSFに注射した。図6に示されるように、ルシフェラーゼ活性は、50U/ml ヘパリンの添加によって顕著に増強された(P<0.05)。ヘパリンを用いたトランスフェクション効率における増加の機構を明らかにするために、本発明者らは、1、5、10、50、100、もしくは200U/mlの濃度の低分子量ヘパリン(LMWH)、または0.1もしくは0.2mg/mlの濃度のアルガトロバンの影響を試験した。低分子量ヘパリンもアルガトロバンも両方とも、ルシフェラーゼ活性に影響を与えなかった。
(考察)
以前、本発明者らは、ラットおよび霊長類のCNSへのトランスフェクションに関するHVJ−リポソーム方法の効力を報告している(Yamada K,et al.,Am J Physiol.1996;271:R1212−20.;Hagihara Y,et al.,Gene Ther.2000;7:759−63.;およびHayashi K,et al.,Gene Ther.2001;8:1167−73.)。HVJ−リポソーム方法は、種々の細胞および組織へのトランスフェクションのために、リポソームの組み合わせおよびHVJエンベロープ(Kaneda Y,Saeki Y,Morishita R.,Mol Med Today.1999;5:298−303.)由来のタンパク質の融合活性を利用する。しかし、HVJ−リポソーム小胞を作製することは非常に長期にわたり、そして複雑な手順である。さらに、長期保存は、不可能であり得る。これらの問題は、ヒト遺伝子治療のためのHVJ−リポソーム複合体の用法に影響を及ぼし得る。これらの問題を克服するために、本発明者らは、最近、第2世代のHVJベクター、いわゆるHVJ−Eベクターを開発した。HVJ−Eベクターを産生するために、ウイルスゲノムを完全に破壊した後、導入遺伝子をHVJのエンベロープに挿入した。HVJ−リポソームベクターと比較した場合のHVJ−Eベクターの利点は、以下である:1)HVJ−Eベクターは、作製が容易である、2)産生には、ほとんど時間をとらない(90分未満)、そして、3)HVJ−Eベクターは、長期間(少なくとも6ヶ月)保存可能である。本発明において、本発明者らは、インビボおよびインビトロの両方で、HVJ−Eベクターを用いたCNSへの遺伝子移入の可能性を示す。インビトロ研究において、レポーター遺伝子は、細胞死を誘導することなくニューロン(MAP2ポジティブ細胞またはNeuNポジティブ細胞)および大グリア細胞(GFAPポジティブ細胞)において好首尾に発現された。非ウイルスベクターを用いると、有糸分裂細胞は良好にトランスフェクトされるが、非有糸分裂細胞(例えば、休止(G0)ニューロン)は、ほとんどトランスフェクトされない(Berry M,et al.,Curr Opin Mol Ther.2001;3:338−49.)。しかし、本発明において、レポーター遺伝子を、HVJ−Eベクターを用いて非有糸分裂ニューロンに良好にトランスフェクトした。有効なトランスフェクションは、ニューロンの表面上に豊富にあるシアル酸に対するウイルスレポーターの存在に起因して、達成され得る。
重要なことに、HVJ−Eベクターを用いた遺伝子発現の分布は、CNSへのインビボ遺伝子移入のためのHVJ−リポソームを用いた遺伝子発現の分布と異なった。髄腔内注射後、β−ガラクトシダーゼ遺伝子発現が、HVJ−リポソーム方法を用いた大脳実質において観察されたが(Hagihara Y,et al.,Gene Ther.2000;7:759−63.;およびHayashi K,et al.,Gene Ther.2001;8:1167−73.)、HVJ−Eベクターを用いると遺伝子発現は髄膜のみで検出された。その上、脳室内カチオン性リポソーム(HVJカチオン性リポソーム)媒介遺伝子移入は、大脳実質における発現を示したが(Zou LL,et al.,Gene Ther.1999;6:994−1005.)、一方、HVJ−Eベクター媒介遺伝子トランスフェクションは、脈絡叢および脳室上衣細胞においてのみ導入遺伝子発現を示した。HVJ−Eベクターの視床への直接注入がニューロンへのトランスフェクションを生じることを考慮すると、リポソームの存在は、軟髄膜または脳室上衣細胞を交差することに重要であるのかもしれない。本発明者らおよび他の者は、定位フレームを用いた側脳室への投与を用いるいくつか遺伝子移入方法の高いトランスフェクション効率を報告しているが(Yoshimura S,et al.,Hypertension.2002;39:1028−34.;およびYukawa H,et al.,Gene Ther.2000;7:942−9.)、その技術は、かなり侵襲性である。幸運にも、本発明者らは、導入遺伝子発現が、大槽への注射後に脳表面上で観察されたことを見出した。さらに、本発明は、CNSへの遺伝子移入が、一過性頸動脈閉塞後の再疎通の間にHVJ−Eベクターの動脈内注射を介して可能であったことを明らかに示す。一過性中大脳動脈閉塞後の血液脳関門の破壊が論議の的となっているが(Belayev L,Busto R,Zhao W,Ginsberg MD.,Brain Res.1996;739:88−96.;Kuroiwa T,Ting P,Martinez H,Klatzo I.,Acta Neuropathol.1985;68:122−9.;およびNeumann−Haefelin T,et al.,Stroke.2000;31:1965−72;discussion 1972−3.)、Kuroiwaらは、一過性中大脳動脈閉塞の1時間後の血液脳関門の二相性の開放を実証し、この開放は、閉塞を放し、次いで5時間および72時間の再灌流の15分後に生じた(Kuroiwa T,Ting P,Martinez H,Klatzo I.,Acta Neuropathol.1985;68:122−9.)。この制限された期間中のHVJ−Eベクターの注入は、動脈内手段を介した大脳実質への治療遺伝子のトランスフェクションを可能にする。
ヘパリンの同時投与がHVJ−Eベクターを用いたトランスフェクションの効率を増加したことは、注目すべきことである。これは、AAVベクターを用いたヘパリンとの同時注入がより高くそしてより同質の遺伝子発現を誘導したという報告(Mastakov MY,Baer K,Kotin RM,During MJ.,Mol Ther.2002;5:371−80.29.;およびNguyen JB,Sanchez−Pernaute R,Cunningham J,Bankiewicz KS.,Neuroreport.2001;12:1961−4.)に類似する。ヘパリンがウイルス結合レセプターのひとつである、2,3−連結シアリックテオグリアシッド(sialic teoglyacid)に影響を与え、トランスフェクションの効率を高めたか、またはヘパリンがウイルス表面に結合して、細胞表面上のHSPGとの相互作用を制限し得ると推測された。この機構を明らかにするために、本発明者らは、LMWHおよびアルガトロバンのような類似の物質の影響を試験した。しかし、これらの分子を用いてトランスフェクション効率の増加は観察されなかった。特に、従来のヘパリン(12,000〜15,000kDa)とLMWH(5000kDa)との間の差異は、分子の大きさおよび硫酸化の程度のみである(Ishai−Michaeli R,et al.,Biochemistry.1992;31:2080−8.)。おそらく、これらの因子は、HVJ−Eベクターと標的細胞表面との間の相互作用に影響を及ぼし得る。
ここで、本発明は、いずれの明らかな毒性も伴わない、インビボおよびインビトロでの、CNSへのHVJ−Eベクターを用いた高いトランスフェクション効率を示すが、遺伝子発現の部位は、種々の投与経路間で異なった。一過性動脈閉塞後の動脈内注射による好首尾な遺伝子トランスフェクションは、大脳虚血の処置のための有望な手段を提供する。さらに、本発明者らの知る限り、副作用の証拠はない。HVJは、ヒトに対して病原性ではなく(Okada Y.,Methods Enzymol 1993;2211,18−41.;およびOkada Y,Tadokoro J.,Exp Cell Res 1962;26,108−118.)、そしてHVJ融合活性を損失することなく適切な化学修飾によって完全に不活性化される。本発明において、髄腔内投与または脳室内投与は、動物の体重を減少させず、神経学的な欠損も引き起こさず、炎症性の変化も引き起こさなかった。さらに、髄腔内注射後にいずれの他の器官においても、ルシフェラーゼ活性は観察されなかった。従って、HVJ−Eベクターは、脳へのトランスフェクションに安全なようである。免疫原性に関して、5回のHVJ−リポソーム方法によるプラスミドDNAおよびアンチセンスODNの反復投与は、生物学的効果のいずれの損失もHVJに対する抗体の産生も引き起こさなかった(Morishita R,Gibbons GH,Kaneda Y,Ogihara T,Dzau VJ.,Biochem Biophys Res Commun 2000;273:666−674;およびHirano T,et al.,Gene Ther 1998;5:459−464.)。これらの理由から、HVJ−Eベクターは、脳血管疾患の処置のための適切な遺伝子移入方法であり得る。
(実施例2:他のウイルスベクターを用いた送達)
インフルエンザウイルスの調製:
オルトミクソウイルス科のインフルエンザウイルスを、原則的にWO96/05294に記載されるように、孵化鶏卵から得、増殖させた。簡潔には以下のとおりである。受精卵の選択は注意深く行わなければならず、専用に確保された健全な農場より入手したものでなければならない。受精卵を37.8℃の培養器に9〜12日間入れ、尿嚢にインフルエンザウィルスを接種する前に、卵をろうそくの光に透かして胚の成長および胚の生存を確認した。
その後、最適条件でウィルスに感染させるために、温度および湿度を制御した培養インキュベータ中で2〜3日間卵を培養した。これらの条件はインフルエンザの株と使用したウィルス種に依存していた。5±3℃に急冷して培養を停止した。その後、感染した卵から多量のウィルス粒子を含む尿嚢液を取り出す。こうして得られたウィルスを含む尿嚢液を、迅速に精製して不純物(例えばオバルブミンを含むタンパク質、レシチン、バクテリア等)を除去するために、回収した材料を遠心分離して上澄液を取り、限外濾過で20倍まで濃縮してからウィルスの精製を行った。
(アルキル化処理)
使用直前に、10mM KH2PO4中に0.01% β−プロピオラクトンの調製をした。作業中は低温に保ち素早く作業を行った。
上述のように得たインフルエンザウイルス濃縮液にβ−プロピオラクトンを添加し、氷上で60分間インキュベートした。その後2時間、37℃でインキュベートした。エッペンドルフチューブにチューブあたり適量し、15,000rpm、15分遠心し、沈澱を−20℃で保存した。これを必要に応じて、このインフルエンザウイルスを限外濾過した。
上記サンプルを、500KMWCO(A/G Technology、Needham、Massachusetts)を用いた限外濾過法により約10倍濃縮した。緩衝液として、50mM NaCl、1mM MgCl2、2%マンニトール、20mM Tris(pH7.5)を用いた。ほぼ100%のインフルエンザウイルスエンベロープの回収率であり優れた結果が得られた。
Q−Sepharose FF(アマシャムファルマシアバイオテクKK、Tokyo)によるカラムクロマトグラフィー法(緩衝液:20mM Tris−HCl(pH7.5)buffer、0.2〜1M NaCl))でインフルエンザウイルスエンベロープを精製した。40〜50%の回収率であり、純度は99%以上であった。
このようにしてインフルエンザウイルス含有漿尿液からの不活性化インフルエンザウイルスエンベロープを製造した。
インフルエンザウイルスエンベロープを用いた脳への送達について調べた。本発明者らは、インビトロおよびインビボの両方で、インフルエンザウイルスエンベロープを用いたCNSへの遺伝子移入の可能性を実施例1に記載のように調べたところ、Venusレポーター遺伝子を用ると、蛍光が、ラット大脳皮質ニューロンおよびグリア細胞において検出され得た。インビボにおいて、レポーター遺伝子(VenusまたはEGFP)は、免疫学的な変化を誘導せずに、視床への直接注射によってか、脳室内注射によってか、または髄腔内注射によって、ラットの脳に好首尾にトランスフェクトされた。遺伝子発現は、総頸動脈を介した動脈内注入後に観察されなかったが、ベクターが中大脳動脈の一過性閉塞後に注射された場合、EGFPまたはルシフェラーゼ活性は、損傷した半球の中でのみ検出され得た。最後に、トランスフェクション効率を増加するために、ヘパリンの影響を試験した。ルシフェラーゼ活性は、50U/mlヘパリンの添加によって顕著に増強された。
このように、HVJ−Eベクターのみならず、他のウイルス由来のものでも脳動脈の一過性閉塞後での脳への遺伝子導入効率が顕著に上昇し、ヘパリンの添加がインフルエンザウイルスエンベロープの生体分子送達効率を上昇させることが見出された。
(実施例3:アデノ随伴ウイルスを用いた方法)
次に、アデノ随伴ウイルスを用いて、実施例1および2と同様の実験を行った。アデノ随伴ウイルスは、AAV Helper−Free System(Stratagene)を使用した。
アルキル化処理は、実施例2に記載されるように行った。
アデノ随伴ウイルスエンベロープを用いた脳への送達について調べた。本発明者らは、インビトロおよびインビボの両方で、アデノ随伴ウイルスエンベロープを用いたCNSへの遺伝子移入の可能性を実施例1に記載のように調べたところ、Venusレポーター遺伝子を用ると、蛍光が、ラット大脳皮質ニューロンおよびグリア細胞において検出され得た。インビボにおいて、レポーター遺伝子(VenusまたはEGFP)は、免疫学的な変化を誘導せずに、視床への直接注射によってか、脳室内注射によってか、または髄腔内注射によって、ラットの脳に好首尾にトランスフェクトされた。遺伝子発現は、総頸動脈を介した動脈内注入後に観察されなかったが、ベクターが中大脳動脈の一過性閉塞後に注射された場合、EGFPまたはルシフェラーゼ活性は、損傷した半球の中でのみ検出され得た。最後に、トランスフェクション効率を増加するために、ヘパリンの影響を試験した。ルシフェラーゼ活性は、50U/mlヘパリンの添加によって顕著に増強された。
(実施例4:ヘパラン硫酸)
実施例1〜3におけるヘパリンに代えて、ヘパラン硫酸(生化学工業(株)およびSigma−Aldrich Japanから購入可能)を用いてHVJ、インフルエンザウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターを用いた場合に、同様な効果が見られるかどうか実証する。
実験の結果、ヘパラン硫酸を用いた場合でも、脳への遺伝子導入効率が上昇することが確認される。従って、グルコサミノグリカン一般で本発明の効果があることが実証される。
(実施例5:コンドロイチン硫酸)
実施例1〜3におけるヘパリンに代えて、コンドロイチン硫酸(生化学工業(株)およびSigma−Aldrich Japanから購入可能)を用いてHVJ、インフルエンザウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターを用いた場合に、同様な効果が見られるかどうか実証する。
実験の結果、コンドロイチン硫酸を用いた場合でも、脳への遺伝子導入効率が上昇することが確認される。従って、グルコサミノグリカン、ガラクトサミノグリカンを含め、グリコサミノグリカン一般で本発明の効果が実証される。
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
インビトロおよびインビボの両方で、ウイルスエンベロープを用いた脳・中枢神経系(CNS)への効率よい生体分子の送達(例えば、遺伝子導入)のための方法が提供された。また、ウイルスエンベロープを用いた生体分子のより効率の高い送達のためのシステムおよび方法が提供された。したがって、本発明は、生体分子を効率よく神経系へと投与する技術を提供し、その技術は、種々の薬剤の投与に応用され得るという産業上の利用可能性を提供する。
本発明は、医師以外に、例えば、製薬企業などが業として本発明の組成物などを生産することができることから、産業上の利用可能性または有用性は十分にあると考えられる。本発明の方法もまた、純粋な医療目的の治療方法に加え、事業目的の治験そのものとして有用であることから、産業上の利用可能性がある。また、本発明の治療方法を間接的または直接的に実施することが、医療業周辺の産業において利用する可能性が十分考えられることから、産業上の利用可能性または有用性は十分にある。
本発明は、医師以外に、例えば、製薬企業などが業として本発明の組成物などを生産することができることから、産業上の利用可能性または有用性は十分にあると考えられる。本発明の方法もまた、純粋な医療目的の治療方法に加え、事業目的の治験そのものとして有用であることから、産業上の利用可能性がある。また、本発明の治療方法を間接的または直接的に実施することが、医療業周辺の産業において利用する可能性が十分考えられることから、産業上の利用可能性または有用性は十分にある。
Claims (72)
- 生体分子を細胞に導入するためのシステムであって、
A)生体分子;
B)ウイルスエンベロープ;および
C)グリコサミノグリカン、
を含む、システム。 - 前記ウイルスエンベロープは、不活性化されている、請求項1に記載のシステム。
- 前記グリコサミノグリカンは、ヘパリンである、請求項1に記載のシステム。
- 前記グリコサミノグリカンの分子量は、少なくとも10,000kDaである、請求項1に記載のシステム。
- 前記グリコサミノグリカンは、少なくとも50U/ml含まれる、請求項1に記載のシステム。
- 前記ヘパリンの分子量は、12,000〜15,000kDaである、請求項3に記載のシステム。
- 前記ヘパリンの硫酸化の程度は、薬学的に許容可能である、請求項3に記載のシステム。
- 前記ウイルスエンベロープは、RNAウイルスのエンベロープである、請求項1に記載のシステム。
- 前記ウイルスエンベロープは、パラミクソウイルス属のウイルスのエンベロープである、請求項1に記載のシステム。
- 前記ウイルスエンベロープは、HVJのエンベロープである、請求項1に記載のシステム。
- 前記生体分子は、核酸、ポリペプチド、脂質、糖、およびそれらの複合分子からなる群より選択される、請求項1に記載のシステム。
- 前記生体分子は、核酸を含む、請求項1に記載のシステム。
- 前記生体分子は、ポリペプチドを含む、請求項1に記載のシステム。
- 前記生体分子は、血管内皮増殖因子VEGF.、線維芽細胞増殖因子FGF.および肝細胞増殖因子HGF.からなる群より選択される遺伝子をコードする核酸である、請求項1に記載のシステム。
- 前記生体分子は、血管内皮増殖因子VEGF.、線維芽細胞増殖因子FGF.および肝細胞増殖因子HGF.からなる群より選択されるポリペプチドである、請求項1に記載のシステム。
- 前記ヘパリンと、前記生体分子および前記ウイルスエンベロープとは、同じ組成物中に含有される、請求項1に記載のシステム。
- 前記ヘパリンと、前記生体分子および前記ウイルスエンベロープとは、異なる組成物中に含有される、請求項1に記載のシステム。
- 前記生体分子は、前記ウイルスエンベロープ中に含有される、請求項1に記載のシステム。
- 生体分子を細胞に導入するための方法であって、
A)ウイルスエンベロープおよび生体分子を含む組成物を該細胞に投与する工程;および
B)グリコサミノグリカンを該細胞に投与する工程、
を包含する、方法。 - 前記グリコサミノグリカンを投与する工程は、前記組成物を投与する工程と同時に行われる、請求項19に記載の方法。
- 前記グリコサミノグリカンを投与する工程は、前記組成物を投与する工程の前に行われる、請求項19に記載の方法。
- 前記グリコサミノグリカンを投与する工程は、前記組成物を投与する工程の後に行われる、請求項19に記載の方法。
- 生体分子を細胞に導入するための医薬を製造するための、グリコサミノグリカンの使用であって、該医薬は、
A)生体分子;
B)ウイルスエンベロープ;および
C)グリコサミノグリカン、
を含む、使用。 - 脳内に生体分子を送達する方法であって、
A)頭部または頸部の動脈を一過的に閉鎖する工程;および
B)該頭部または頸部の動脈が閉鎖されている間に、生体分子を脳内に導入する工程、
を包含する、方法。 - 前記生体分子は、核酸、ポリペプチド、脂質、糖、およびそれらの複合分子からなる群より選択される、請求項24に記載の方法。
- 前記生体分子は、核酸を含む、請求項24に記載の方法。
- 前記生体分子は、前記生体分子は、血管内皮増殖因子VEGF.、線維芽細胞増殖因子FGF.および肝細胞増殖因子HGF.からなる群より選択される遺伝子をコードする核酸である、請求項24に記載の方法。
- 前記核酸は、ベクターによって送達される、請求項26に記載の方法。
- 前記生体分子は、ウイルスエンベロープとともに導入される、請求項24に記載の方法。
- 前記ウイルスエンベロープは、不活性化されている、請求項29に記載の方法。
- 前記ウイルスエンベロープは、RNAウイルスのエンベロープである、請求項29に記載の方法。
- 前記ウイルスエンベロープは、パラミクソウイルス属のウイルスのエンベロープである、請求項29に記載の方法。
- 前記ウイルスエンベロープは、HVJのエンベロープである、請求項29に記載の方法。
- 前記生体分子は、グリコサミノグリカンとともに導入される、請求項24に記載の方法。
- 前記グリコサミノグリカンは、ヘパリンである、請求項34に記載の方法。
- 前記グリコサミノグリカンの分子量は、少なくとも10,000kDaである、請求項34に記載の方法。
- 前記グリコサミノグリカンは、少なくとも50U/ml含まれる、請求項34に記載の方法。
- 前記ヘパリンの分子量は、12,000〜15,000kDaである、請求項35に記載の方法。
- 前記ヘパリンの硫酸化の程度は、薬学的に許容可能である、請求項35に記載の方法。
- 前記グリコサミノグリカンは、前記生体分子と同時に投与される、請求項34に記載の方法。
- 前記グリコサミノグリカンは、前記生体分子の投与の前に投与される、請求項34に記載の方法。
- 前記グリコサミノグリカンは、前記生体分子の投与の後に投与される、請求項34に記載の方法。
- 前記頭部または頸部の動脈は、1分間〜120分間閉鎖される、請求項24に記載の方法。
- 前記脳および頸部の動脈は、中大脳動脈または頸動脈である、請求項24に記載の方法。
- 前記脳および頸部の動脈は、中大脳動脈である、請求項24に記載の方法。
- 前記生体分子は、頸動脈、視床、脳室内または髄腔内に投与される、請求項24に記載の方法。
- 前記生体分子は、頸動脈に投与される、請求項24に記載の方法。
- 脳内に生体分子を送達するためのキットであって、
A)生体分子;ならびに
B)該生体分子を投与する方法を指示する指示書であって、該方法は、
a)頭部または頸部の動脈を一過的に閉鎖する工程;および
b)該頭部または頸部の動脈が閉鎖されている間に、該生体分子を脳内に導入する工程、
を包含する、指示書、
を備える、キット。 - 前記生体分子は、核酸、ポリペプチド、脂質、糖、およびそれらの複合分子からなる群より選択される、請求項48に記載のキット。
- 前記生体分子は、核酸を含む、請求項48に記載のキット。
- 前記生体分子は、血管内皮増殖因子VEGF.、線維芽細胞増殖因子FGF.および肝細胞増殖因子HGF.からなる群より選択される遺伝子をコードする核酸である、請求項48に記載のキット。
- 前記核酸は、ベクターによって送達される、請求項48に記載のキット。
- さらにウイルスエンベロープを含む、請求項48に記載のキット。
- 前記ウイルスエンベロープは、不活性化されている、請求項53に記載のキット。
- 前記ウイルスエンベロープは、RNAウイルスのエンベロープである、請求項53に記載のキット。
- 前記ウイルスエンベロープは、パラミクソウイルス属のウイルスのエンベロープである、請求項53に記載のキット。
- 前記ウイルスエンベロープは、HVJのエンベロープである、請求項53に記載のキット。
- さらにグリコサミノグリカンを含む、請求項48に記載のキット。
- 前記グリコサミノグリカンは、ヘパリンである、請求項58に記載のキット。
- 前記グリコサミノグリカンの分子量は、少なくとも10,000kDaである、請求項58に記載のキット。
- 前記グリコサミノグリカンは、少なくとも50U/ml含まれる、請求項58に記載のキット。
- 前記ヘパリンの分子量は、12,000〜15,000kDaである、請求項59に記載のキット。
- 前記ヘパリンの硫酸化の程度は、薬学的に許容可能である、請求項59に記載のキット。
- 前記グリコサミノグリカンは、前記生体分子と同時に投与される、請求項58に記載のキット。
- 前記グリコサミノグリカンは、前記生体分子の投与の前に投与される、請求項58に記載のキット。
- 前記グリコサミノグリカンは、前記生体分子の投与の後に投与される、請求項58に記載のキット。
- 前記頭部または頸部の動脈は、1分間〜120分間閉鎖される、請求項48に記載のキット。
- 前記脳および頸部の動脈は、中大脳動脈または頸動脈である、請求項48に記載のキット。
- 前記脳および頸部の動脈は、中大脳動脈である、請求項48に記載のキット。
- 前記生体分子は、頸動脈、視床、脳室内または髄腔内に投与される、請求項48に記載のキット。
- 前記生体分子は、頸動脈に投与される、請求項48に記載のキット。
- 脳内に生体分子を送達するためのキットを製造するための生体分子の使用であって、該キットは、
A)生体分子;ならびに
B)該生体分子を投与する方法を指示する指示書であって、該方法は、
a)頭部または頸部の動脈を一過的に閉鎖する工程;および
b)該頭部または頸部の動脈が閉鎖されている間に、該生体分子を脳内に導入する工程、
を包含する、指示書、
を備える、使用。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2002247812 | 2002-08-27 | ||
JP2002247812 | 2002-08-27 | ||
PCT/JP2003/010675 WO2004035779A1 (ja) | 2002-08-27 | 2003-08-22 | ウイルスエンベロープを用いた生体分子の導入方法ならびにそのための組成物およびシステム |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2004035779A1 true JPWO2004035779A1 (ja) | 2006-02-16 |
Family
ID=32104895
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2004544733A Pending JPWO2004035779A1 (ja) | 2002-08-27 | 2003-08-22 | ウイルスエンベロープを用いた生体分子の導入方法ならびにそのための組成物およびシステム |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US7504098B2 (ja) |
EP (1) | EP1535993A4 (ja) |
JP (1) | JPWO2004035779A1 (ja) |
CN (1) | CN1697879A (ja) |
AU (1) | AU2003257675A1 (ja) |
CA (1) | CA2497313A1 (ja) |
WO (1) | WO2004035779A1 (ja) |
Families Citing this family (16)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1697879A (zh) | 2002-08-27 | 2005-11-16 | 安琪士多摩奇株式会社 | 利用病毒包膜导入生物分子的方法及其组合物和体系 |
JPWO2004078213A1 (ja) * | 2003-03-06 | 2006-06-08 | 千佳子 錦織 | 対象物質導入用組成物及び対象物質導入方法 |
ATE495760T1 (de) * | 2004-06-14 | 2011-02-15 | Ishihara Sangyo Kaisha | Gefriergetrocknete zusammensetzung aus einer inaktivierten virushülle mit membranfusionsaktivität |
JP4848142B2 (ja) * | 2004-06-14 | 2011-12-28 | 石原産業株式会社 | 膜融合活性のある不活性化ウイルスエンベロープの凍結乾燥組成物 |
WO2009103808A2 (en) * | 2008-02-20 | 2009-08-27 | Devgen N.V. | Methods and compositions for increasing rna interference |
EP3252068A3 (en) | 2009-10-12 | 2018-03-14 | Larry J. Smith | Methods and compositions for modulating gene expression using oligonucleotide based drugs administered in vivo or in vitro |
JP5775673B2 (ja) * | 2010-02-05 | 2015-09-09 | ジェノミディア株式会社 | Il−2含有hvj−eベクター及びそれを含む脳腫瘍治療剤 |
WO2011108930A1 (en) | 2010-03-04 | 2011-09-09 | Interna Technologies Bv | A MiRNA MOLECULE DEFINED BY ITS SOURCE AND ITS DIAGNOSTIC AND THERAPEUTIC USES IN DISEASES OR CONDITIONS ASSOCIATED WITH EMT |
WO2012005572A1 (en) | 2010-07-06 | 2012-01-12 | Interna Technologies Bv | Mirna and its diagnostic and therapeutic uses in diseases or conditions associated with melanoma, or in diseases or conditions associated with activated braf pathway |
EP2474617A1 (en) | 2011-01-11 | 2012-07-11 | InteRNA Technologies BV | Mir for treating neo-angiogenesis |
ES2886147T3 (es) | 2011-12-22 | 2021-12-16 | Interna Tech B V | MiARN para el tratamiento del cáncer de cabeza y de cuello |
WO2014072357A1 (en) | 2012-11-06 | 2014-05-15 | Interna Technologies B.V. | Combination for use in treating diseases or conditions associated with melanoma, or treating diseases or conditions associated with activated b-raf pathway |
US11166995B2 (en) | 2016-11-01 | 2021-11-09 | Osaka University | Anticancer agent comprising HVJ-E and immune checkpoint protein inhibitor |
WO2018105630A1 (ja) | 2016-12-06 | 2018-06-14 | 国立大学法人大阪大学 | 新規プリオノイド病用治療薬 |
EP3704250A1 (en) | 2017-11-03 | 2020-09-09 | InteRNA Technologies B.V. | Mirna molecule, equivalent, antagomir, or source thereof for treating and/or diagnosing a condition and/or a disease associated with neuronal deficiency or for neuronal (re)generation |
WO2020171889A1 (en) | 2019-02-19 | 2020-08-27 | University Of Rochester | Blocking lipid accumulation or inflammation in thyroid eye disease |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2000076553A1 (en) * | 1999-06-11 | 2000-12-21 | Neurovir Therapeutics, Inc. | Use of viral vectors and charged molecules for gene therapy |
WO2001057204A1 (fr) * | 2000-02-02 | 2001-08-09 | Yasufumi Kaneda | Vecteur d'enveloppe virale pour transfert de gene |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4745053A (en) * | 1983-07-08 | 1988-05-17 | Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyojo | Process for producing human interferon and method for assaying the interferon productivity of blood |
US5631237A (en) | 1992-12-22 | 1997-05-20 | Dzau; Victor J. | Method for producing in vivo delivery of therapeutic agents via liposomes |
JP2002247812A (ja) | 2000-12-12 | 2002-08-30 | Fuji Electric Co Ltd | 回転電機用固定子コイルの製造方法および製造装置 |
WO2002078439A2 (en) * | 2001-03-30 | 2002-10-10 | The Arizona Board Of Regents On Behalf Of The University Of Arizona | Prevascularized constructs for implantation to provide blood perfusion |
US7182944B2 (en) * | 2001-04-25 | 2007-02-27 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Methods of increasing distribution of nucleic acids |
CN1697879A (zh) | 2002-08-27 | 2005-11-16 | 安琪士多摩奇株式会社 | 利用病毒包膜导入生物分子的方法及其组合物和体系 |
-
2003
- 2003-08-22 CN CNA038246902A patent/CN1697879A/zh active Pending
- 2003-08-22 JP JP2004544733A patent/JPWO2004035779A1/ja active Pending
- 2003-08-22 EP EP03808863A patent/EP1535993A4/en not_active Withdrawn
- 2003-08-22 CA CA002497313A patent/CA2497313A1/en not_active Abandoned
- 2003-08-22 WO PCT/JP2003/010675 patent/WO2004035779A1/ja active Application Filing
- 2003-08-22 AU AU2003257675A patent/AU2003257675A1/en not_active Abandoned
-
2005
- 2005-02-25 US US11/067,109 patent/US7504098B2/en not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2000076553A1 (en) * | 1999-06-11 | 2000-12-21 | Neurovir Therapeutics, Inc. | Use of viral vectors and charged molecules for gene therapy |
WO2001057204A1 (fr) * | 2000-02-02 | 2001-08-09 | Yasufumi Kaneda | Vecteur d'enveloppe virale pour transfert de gene |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
JPN5005005810, NGUYEN JB, NEUROREPORT, 20010703, V12 N9, P1961−1964 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2004035779A1 (ja) | 2004-04-29 |
CN1697879A (zh) | 2005-11-16 |
EP1535993A4 (en) | 2007-03-21 |
AU2003257675A2 (en) | 2004-05-04 |
US20060002894A1 (en) | 2006-01-05 |
CA2497313A1 (en) | 2004-04-29 |
US7504098B2 (en) | 2009-03-17 |
EP1535993A1 (en) | 2005-06-01 |
AU2003257675A1 (en) | 2004-05-04 |
WO2004035779A8 (ja) | 2004-07-08 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US7504098B2 (en) | Method for introducing a biological molecule using a viral envelope and heparin and system therefore | |
RU2297425C2 (ru) | Полипептиды, происходящие из триптофанил-трнк-синтетазы, и их применение для регуляции развития кровеносных сосудов | |
CN113663073B (zh) | 一种靶向s蛋白棕榈酰化的多肽在制备广谱抗冠状病毒药物中的应用 | |
DK2007895T3 (en) | Compositions and Methods for Therapy of Cystic Fibrosis | |
JP7384672B2 (ja) | C末端cdnf断片及びc末端manf断片、それらを含む医薬組成物、並びにそれらの使用 | |
WO2021042944A1 (zh) | 肌肉靶向的微环dna基因治疗 | |
BR112021008832A2 (pt) | Proteínas de núcleo de mininucleossoma e uso em distribuição de ácido nucleico | |
US11981911B2 (en) | Compositions and methods for inhibiting viral vector-induced inflammatory responses | |
CA2406233A1 (en) | Compositions for drug delivery | |
US20040253272A1 (en) | Process for producing inactivated virus envelopes | |
JP2023504773A (ja) | 眼遺伝子送達のためのaavベクター変異体 | |
Vasquez et al. | Replication-Deficient Adenovirus Vector Transfer ofgfpReporter Gene into Supraoptic Nucleus and Subfornical Organ Neurons | |
TW202003015A (zh) | C端腦部多巴胺神經滋養因子(cdnf)及中腦星狀細胞-衍生之神經滋養因子(manf)片段、包含彼之醫藥組成物及其用途 | |
US7074399B2 (en) | Treatment of inflammation with p20 | |
CA3190597A1 (en) | Compositions and methods for the treatment of ocular neuroinflammation | |
JP2002065278A (ja) | Hvjの融合タンパク質を含有する遺伝子移入ビヒクル | |
Baum et al. | Salivary glands as a model for craniofacial applications of gene transfer | |
US20030125239A1 (en) | Compositions for drug delivery | |
WO2022166771A1 (zh) | 3'utr的构建方法和应用 | |
WO2024100176A1 (en) | Controlled gene therapy of ocular diseases | |
WO2023158300A1 (en) | Polyomaviral gene delivery vector particle comprising a nucleic acid sequence encoding a phosphatase activity-possessing polypeptide | |
WO1999047157A1 (en) | Use of il-10 to treat major depressive disorder | |
BR102020023425A2 (pt) | Vetor biológico para tratamento de doenças neurodegenerativas com base em terapia gênica | |
CN117417417A (zh) | 视网膜靶向性的新型腺相关病毒血清型、其制备方法及应用 | |
EP1170373A1 (en) | Peptide-mediated ocular cell transfection |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20060707 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20060707 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20100329 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20100716 |