WO2001018196A1 - Procede de detection de mycotoxines de trichothecene et leur reactif - Google Patents

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WO2001018196A1
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trichothecene
antibody fragment
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Hiroaki Kohno
Yuriko Hashimoto
Takumi Yoshizawa
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Kyowa Medex Co., Ltd.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/14—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from fungi, algea or lichens

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting a trichothecene mycotoxin and its reagent.
  • the present invention relates to a method for immunologically quantifying a trichothecene mycotoxin contained in agricultural products, foods, feeds, and the like, a reagent for immunologically quantifying the mycotoxin, a kit, and a monoclonal antibody used therein.
  • Mycotoxins are secondary metabolites produced by fungi and are defined as compounds that have some harmful effects on humans and animals through foods and feeds, and are distinguished from bacterial toxins.
  • Mycotoxins unlike bacterial toxins, are low-molecular substances and are known to have a wide variety of properties. Their chemical structures are diverse and their adverse effects on living organisms are also varied. Some of them are harmful to the human body, such as those that show strong acute toxicity when entering the human body, and those that are carcinogenic and have a tumorigenic effect on the kidneys and liver. Because mycotoxins are low molecular substances, they are difficult to decompose and remove under normal food processing and cooking conditions. When mycotoxins are ingested into edible livestock via highly stable feedstuffs, etc., they remain in the meat and dairy products, and are eventually ingested by the human body, indicating toxicity.
  • Mycotoxin contamination can occur through various routes s, primary contamination of crops caused by fungal invasion during crop cultivation, harvesting, storage and processing, and livestock and fishery products (meat, Milk, eggs, etc.).
  • Primary pollution has regional characteristics depending on various factors such as crop species (fungal substrate), types of fungi in the cultivation environment, and environmental conditions (temperature, humidity, precipitation, etc.).
  • mycotoxins that contaminate major grains such as wheat and corn are trichothecene mycotoxins.
  • Deoxvaleno is a typical trichothecene mycotoxin
  • T-2 T-12 toxin
  • the main producing bacteria are fc Fusarium graminearum ⁇ F. culmorum, F. sporotnchioiaesi 'suspended in the soil, ⁇ ,. If natural conditions such as T / JP00 / 06100 degrees and precipitation are satisfied, crops can be easily infected and mycotoxin contamination of crops spreads.
  • trichothecene mycotoxins Many derivatives of trichothecene mycotoxins exist, and these derivatives are also toxic.To know the state of contamination by trichothecene mycotoxins, it is necessary to use a rather comprehensive method rather than to determine individual derivatives separately. It is desirable to be able to quantitatively determine.
  • the substances to be quantified are contaminated with trichothecene mycotoxins, mainly wheat and corn, meat and milk of livestock that ate this grain, processed foods that further processed this meat and milk, There are a wide variety of processed foods made from grains. As the mycotoxin contamination is diluted as it is processed, it is necessary to quantify low concentrations of trichothecene mycotoxins. Therefore, a highly sensitive quantification method is desired.
  • the major trichothecene mycotoxins are DON, NIV, and T-2, and the separate quantification of each of these three species is important in knowing the location and status of contamination.
  • an antibody having high affinity and high specificity to a target trichothecene mycotoxin, particularly a monoclonal antibody is desirable.
  • Various documents are known which disclose monoclonal antibodies against trichothecene mycotoxins. Japanese Patent Publication No.
  • a polyclonal antibody against 4,15-diacetyl NIV using a substance obtained by binding a carrier protein to the carbon at position 3 as an immunogen is disclosed in Applied and Environmental Microbiology, May 1993, 59: 1264-1268. There is no disclosure of production of a monoclonal antibody using any immunogen.
  • Food Addit. Contain "5: 629 (1988) and J. Agric. Foo, d Chem., 36: 663 (1988) also disclose monoclonal antibodies to T-12 and DON.
  • the monoclonal antibody according to the present invention has the following characteristics and is superior to the above-mentioned known monoclonal antibodies.
  • KTM-249 has a significantly higher affinity than the antibody (3E2) of Dietrich et al. (Natural Toxins, 3: 288 (1995)). is there. KTM-249 is also an antibody for the purpose of the present invention, showing the same reactivity as acetylT-2 and HT-2 as T-2.
  • the anti-T one 2 monoclonal antibody IVT 10092 of USP4772551, 0. 50% inhibition value T- 2 023, acetylT- 2 at 0.0 94 (50% of Cho ⁇ 2 inhibiting I straight of 100 0 / If it is set to 0 , it is 0.023 / 0.094 ⁇ about 25% reactivity) and HT-2 is 1 (0.023 / 1 2.3% reactivity).
  • KTM-249 can detect a wide range of T-2 derivatives (T-12 derivatives have strong selectivity) and do not react with other DON or NIV derivatives. V,;), whereas IVI-10092 is an antibody with high selectivity for T-12 only.
  • ⁇ —240 is clearly different in reactivity from the antibody (5B2) of Dietrich et al. (Natural Toxins, 3: 288 (1995)), for example, 5B2 has about 6 times the reactivity to diacety-to-DON compared to 3-acety-to-DON In addition, the reactivity against triacety DON is weaker than that of 3-acety DON, whereas the reactivity of KTM-240 to diacety DON is about 50 times that of 15-acety DON. -There are twice as many acety to DON. In addition, KTM-240 shows strong reactivity with the acetyl derivative of MV, whereas 5B2 has no reactivity with these compounds, and therefore cannot be used for the purpose of detecting DON and NIV simultaneously.
  • the anti-T-12 toxin monoclonal antibody described in JP-B 5-43358 has about 3% cross-reactivity with HT-2, whereas KTM-249 has the same activity as HT-2, T-2 and acety-T-12.
  • the antibody of Chiba et al. [Food Addit. Contam., 5: 629 (1988)] has a reactivity with HT-2 of 0.5% or less of 3 ⁇ 4T-2, but ⁇ -249 of the present invention is strong in both ⁇ -2. react.
  • the antibody DON-1 of Casale et al. [J. Agric. Food Chem., 36: 663 (1988)] and the KTM-240 of the present invention are clearly different in reactivity.
  • Antibody DON-1 reacts strongly with 3-acetyHDON, reacts well with DON, and reacts weakly with NIV, but does not react with 15-acety DON.
  • the KTM-240 of the present invention does not react with DON or NIV, but reacts strongly with diacety DON or triacety NIV. There is also reactivity to 15-acety-tribute DON, and its strength is stronger than that to 3-acety-tribute DON.
  • DONs, NIVs, and T-2 The need to quantify low-concentration antigens with high affinity requires high-affinity antibodies.
  • the objective antibody of the present invention is required to have high productivity, high reproducibility, and uniform specificity, it is desirable that the antibody be a monoclonal antibody or an antibody fragment thereof.
  • Fab, Fab ', F (ab) are used as antibody fragments. And so on.
  • Examples of the method for producing the antibody fragment of the present invention include a method in which the antibody produced by the hybridoma is treated with an enzyme such as pepsin or a reduction treatment, an mRNA is extracted from the hybridoma, cDNA is prepared, and then the expression vector for prokaryote is prepared.
  • Ru force s Agerare a method obtained by expressing by introducing the vector into a prokaryote or eukaryote.
  • Trichothecene mycotoxins are low-molecular substances called haptens, which have low immunogenicity by themselves. Therefore, when preparing an antibody against a trichothecene mycotoxin, it is necessary to immunize the mycotoxin in a form that is recognized as an antigen by the living body, for example, by binding the mycotoxin to one carrier substance.
  • the present inventors have noted that the difference in the binding site between this carrier substance and the trichothecene mycotoxin affects the affinity and specificity of the antibody obtained; ⁇ the trichothecene mycotoxin is poorly soluble in water. Therefore, when dissolving, generally, an organic solvent has been used.
  • the present inventor dissolves the trichothecene mycotoxin using an aqueous solution containing no organic solvent, binds it to a carrier substance, and obtains the compound represented by the formula (I)
  • R 1 represents 0H or acyloxy
  • R 2 , R 3 and R 4 are the same or different and represent H, OH or acyloxy
  • Z 1 represents ⁇ COCH 2 CH (CH 3 ) 2
  • H hereinafter, the above-mentioned formula (I) compound a compound represented by the (D, cormorants
  • acylated trichothecene mycotoxin as an immunogen allows for specificity and parental control. It was also found that monoclonal antibodies could be obtained with high compatibility.
  • R lb , R 3b and R 4b are the same or different and represent OH or acyloxy, R 2b represents H, OH or acyloxy, and when R 2 3 ⁇ 4 or OH, R lb , R 3b and R 4b (Wherein at least one group is represented by acyloxy) (hereinafter, the compound represented by the above formula (III) is referred to as compound ( ⁇ )) and the compound represented by the formula (IV )
  • R le , R 2c and R 3c are the same or different and represent OH or acyloxy, and at least one of R 2c and R 3c is represented by acyloxy).
  • trichothecene mycotoxins in a sample can be quantified in a lump, or can be quantified roughly into three types: DONs, N1Vs, and T-2s. It has been found that the present invention can be performed, and the present invention has been completed. '
  • acyl in acyloxy represents a substituted or unsubstituted lower acyl group or a substituted or unsubstituted aromatic acyl group.
  • the lower acyl group represents a straight-chain or branched alkanoyl group having 1 to 12 carbon atoms. Specific examples include formyl, acetyl, propionyl, butyryl, isobutyryl, valeryl, isovaleryl, bivaloyl, hexanol, heptanyl, otatanyl, decanoyl, dodecanoyl and the like.
  • Aromatic acyl groups include benzoyl and naphthoyl.
  • Examples of the substituent in the substituted lower acyl group include hydroxy and carboxy.
  • Examples of the substituent in the substituted aromatic acyl group include lower alkyl, hydroxy, lower alkoxy, halogen, carboxy and the like.
  • the lower alkyl moiety of lower alkyl and lower alkoxy is a straight or branched lower alkyl having from! To 6 carbon atoms such as methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butyl. , Pentyl, hexyl, etc., and halogen means each atom of fluorine, chlorine, bromine or iodine.
  • the NIVs include -valenol (NIV), 4-acetylnivalenol, 3,4-diacetylnivalenol, 4,15-diacetylnivalenol, 3,4,15-triacetylnivalenol , 4,7,15-triacetyl nivalenol, 3,4,7,15-tetraacetyl nivalenol and the like, and DONs include deoxynivalenol (DON) and 3-acetyl deoxynil Valenol, 3-Acetyl deoxynivalenol, 15-Acetyl deoxynivalenol, 3,15-Diacetyldeoxynivalenol, 3, 7, 15-Triacetyl deoxynivalenol Examples of T-2 include HT-2, T-12, and acetyl T-12. The present invention relates to the following (1) to (40).
  • R la , R 3a and R 4a are the same or different and each represents ⁇ H or acyloxy
  • a compound represented by the above formula (II) wherein R 4a is OH in COCH 3 a compound represented by the above formula ( ⁇ ) wherein R la and R 4a are OH and R 3a is OCOCH 3 1-2, R la , R 3a, and R ⁇ OCOCH 3, which are represented by the above-mentioned formula (II) and have a high order of compound 1-1> compound 1-2> compound 1-3 Gukatsu type (A)
  • R 1A , R 3A and R 4A are the same or different and each represents OH or acyloxy).
  • R 1B , R 2B and R 3B are the same or different and each represents ⁇ H or acyloxy).
  • R lb, R 3b and R 4b represents OH or Ashinoreokishi same or different, R 2b is H, represent OH or Ashiruokishi and R lb when the R zb is H or ⁇ _H, R 3b and one group with least one of R b has an affinity with respect to the compound represented by represented by) by Ashiruokishi, R the degree of affinity is R lb and R 3b in R 2 3 ⁇ 4 in OCOCH 3 4
  • the compound 2-3 is represented by the compound 2-3 represented by the above formula (111), wherein ⁇ 1 ⁇ 1 "1 is 1 and ⁇ ⁇ 1 1 is 0 to 0 1 to [ 3 ].
  • R 1C , R 2C and R 3c are the same or different and each represents OH or acyloxy) or a monoclonal antibody or an antibody fragment thereof which does not substantially react with the compound represented by the formula:
  • R le , R 2e and R 3c are the same or different and represent OH or acyloxy, and at least one of R 2c and R is represented by acyl / reoxy
  • R lc is OH
  • R 2c and R 3c are OCOCH 3
  • the compounds 3-1 represented by the above formula (IV), R lc , R 2c and R 3 In the compound 3-2 represented by the above formula (IV), which is OCOCH 3 , the compound 3-1> the compound 3-2 and the compound represented by the formula (D)
  • R 1D , R 3D and R 4D are the same or different and represent OH or acyloxy and represent R 2D ttH, OH or acyloxy) or a monoclonal antibody which does not substantially react with the compound represented by The antibody fragment.
  • R 1 represents ⁇ or acyloxy
  • R 2 , R 3 and R 4 are the same or different and represent H, OH or acyloxy
  • Z 1 represents OCOCH 2 CH (CH 3 ) 2
  • Z 2 Is the force representing H
  • a hybridoma cell producing a monoclonal antibody according to any of (1) to (6) above, wherein the hybridoma cell produces the monoclonal antibody.
  • An immunological method comprising reacting a sample containing a trichothecene mycotoxin with one or more of the monoclonal antibodies or antibody fragments thereof described in (1) to (6) above. And a method for quantifying a trichothecene mycotoxin in a sample.
  • the trichothecene mycotoxin is selected from the group consisting of deoxvalenol (DON), divalenol (NIV) and T-12 toxin (T-12) and derivatives thereof (18) or (19) The method according to the above.
  • T / JP00 / 06100 A method for quantifying DON, NIV and their derivatives from the quantified value obtained by the method described in (18) or (19).
  • a reagent for immunological quantification of a trichothecene mycotoxin comprising as an active ingredient at least one of the monoclonal antibodies or the antibody fragments thereof according to any one of the above (1) to (6).
  • a kit for immunological quantification of a trichothecene mycotoxin comprising a plate on which the reagent and the antigen according to the above (28) are immobilized.
  • a kit for immunological quantification of a trichothecene mycotoxin comprising an antibody fragment and a reagent for detecting the label of the antibody or the antibody fragment.
  • (31) detecting the antigen-immobilized plate, the labeled monoclonal antibody according to any of (1) to (6) or their antibody fragments, and the label of the antibody or the antibody fragment;
  • a kit for the immunological quantification of trichothecene mycotoxins which contains a sample pretreatment solution for conversion into a sample.
  • a plate on which the reagent or antigen described in (28) above is immobilized, a labeled antibody or an antibody which reacts with the labeled monoclonal antibody or antibody fragment thereof in any one of (1) to (6) above A reagent for detecting a body fragment, a label of the antibody or the antibody fragment, and a compound for converting a hydroxyl group in the compound represented by D into an OR group (where R is as defined above)
  • a sample containing a trichothecene mycotoxin is treated with a liquid containing an organic solvent to extract the trichothecene mycotoxin from the sample, and the trichothecene mycotoxin in the sample is extracted by the method described in (18) or (19) above.
  • a method for quantifying mycotoxins is described in (18) or (19) above.
  • a sample containing a microorganism that produces a trichothecene mycotoxin is inoculated into a medium and cultured, and the trichothecene mycotoxin produced in the culture is added to the above (1) to (6).
  • a sample containing a microorganism that produces a trichothecene mycotoxin is inoculated into a medium and cultured, and the trichothecene mycotoxin produced in the culture is added to any of the above (1) to (6).
  • Monoclonal antibodies are prepared by fusing antibody-producing cells obtained from an animal to which an immunogen has been administered with permanent growth cells such as myeloma cells to produce hybridoma cells, and culturing the hybridoma cells or administering the hybridoma cells to an animal. It can be prepared by causing the animal to undergo ascites carcinoma, and separating and purifying the culture solution or ascites.
  • the anti-trichothecene mycotoxin monoclonal antibody of the present invention it is necessary to use a complex obtained by binding an antigen for immunization to a polymer carrier (also referred to as a carrier substance) as an immunogen.
  • the immunizing antigen may be obtained from a sample by purification or may be obtained by a chemical synthesis method.
  • the trichothecene mycotoxin used is an acylated one.
  • the 3-position substituent of this acylated trichothecene-based mycotoxin is used as a cross-linking group and combined with a polymer carrier and used as an immunogen, the monoclonal antibody of the present invention can be efficiently obtained.
  • the compound represented by is used.
  • the sample was obtained by inoculating a strain such as Fusarium graminearum ⁇ F. culmorum ⁇ F. sporotrichioides into an appropriate medium, culturing it at about room temperature for about 20 days, and purifying from this culture by an appropriate method.
  • a suitable medium for example, a commercially available medium such as a potato dextrose medium may be used, or a medium prepared by adding polished rice to distilled water, allowing it to stand and infiltrating, and then sterilizing with autoclave may be used.
  • the culture is extracted with acetonitrile Z water (3: 1 v / v), etc., and the extract is purified by passing through a florisil 'anhydrous sodium sulfate multilayer column or silica gel' anhydrous sodium sulfate multilayer column. And a purification method by a recrystallization method.
  • a grain actually contaminated with mold may be purified and collected as a starting material.
  • various purification methods can be used, such as a method using a TLC plate and a method using HPLC, the method is not particularly limited as long as the target substance can be purified. Of course, purchase and use a commercial product as a sample.
  • the polymer carrier has a reactive group that causes a condensation reaction with a carboxyl group, an amino group, a hydroxyl group, or the like of the immunizing antigen, and can impart immunogenicity to the compound by being linked to the immunizing antigen; Any high molecular substance that enhances the immunogenicity of the compound may be used.
  • Specific high-molecular substances include, for example, proteins such as serum albumin (BSA), globulin, polypeptide limpet hemocyan (KLH), thyroglobulin, polysaccharides such as dextran and cepharose, polystyrene, and acrylic rubber. Latex particles, such as polyperididylic acid and polyadenylic acid, and synthetic polymers such as MAP (multiple antigen peptide).
  • Methods for binding these macromolecular substances to trichothecene mycotoxins include the method using an amino group described in Nobuo Sakado, Immunological Experiment Procedures, p.151, Shunsuke Migita et al., Nankodo (1995) (Carbodiimide method).
  • mice examples include mice, rats, hamsters, rabbits, guinea pigs, goats, sheep, peas, and chickens, and the use of mice, rats, hamsters and the like is preferred.
  • the immunization method can be performed using the method described in Nishimichi, Toshima, Shinsei Kagaku Jikken Lecture 1: 389 (1990), Tokyo Kagaku Dojin, and others.
  • the immunogen is emulsified into Freund's complete or incomplete adjuvant and administered intraperitoneally, subcutaneously, intramuscularly, or the like.
  • 1.0 g to 300 // g of immunogen per dose is administered at a fixed interval of 7 to 30 days, preferably 12 to 16 days, two or more times, preferably 2 to 4 times, to increase immunity. Can be completed.
  • Sources for collecting antibody-producing cells include the spleen, lymph nodes, and peripheral blood of the immunized animal.
  • so-called in vitro immunization is performed by extracting antibody-producing cells from the spleen, lymph nodes, peripheral blood, etc. of non-immunized animals and directly immunizing these cells to produce antibody-producing cells (Arai, Ota, Medicine, 6:43 (1988)) may be used.
  • Myeloma cells used for cell fusion between antibody-producing cells and myeloma cells are not particularly limited, but it is preferable to use a cell line derived from an animal of the same species as the antibody-producing cells. In order to efficiently select only cells that have undergone appropriate cell fusion,
  • myeloma cells Having myeloma cells is preferred.
  • 8-azaguanine-resistant myeloma cells cannot grow in a medium containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine (HAT medium), but cells in which these cells and normal cells are fused can grow in HAT medium. And is preferably used because it can be distinguished from unfused myeloma cells. Specific examples include P3X63-Ag, P3X-Ag8-Ul, and SP2 / 0-Agl4. These myeloma cells are available from RIKEN Cell Development Bank, Ltd.
  • the cells after cell fusion are suspended in a selection medium, and only the fused cells are grown in a culture vessel such as a 96-well culture plate that is advantageous for selection of target cells.
  • the selection medium refers to a medium in which only cells having a specific drug marker or the like can selectively grow.
  • the selection medium refers to a medium in which only cells having a specific drug marker or the like can selectively grow.
  • the above-mentioned antibody-producing cells are fused with P3X63-Ag myeloma cells and only cells that have undergone cell fusion are selected efficiently, the fact that myeloma cells are resistant to 8-azaguanine is used.
  • Te HAT selective medium (1 X 10 one 4 mol / L hypoxanthine, 4 X 10 one 7 mol / L aminopterin, 10% FCS pressurized RPMI-1640 medium containing 2 X 10 one 5 mol / L thymidine) and
  • HAT selective medium (1 X 10 one 4 mol / L hypoxanthine, 4 X 10 one 7 mol / L aminopterin, 10% FCS pressurized RPMI-1640 medium containing 2 X 10 one 5
  • the fused cells When only the fused cells have selectively grown, select only those cells that are producing antibodies to the target substance. This selection is carried out by examining the presence or absence of the target antibody in the culture supernatant of the fused cells using, for example, a method such as Enzyme Immunity Assay Radioimnoassy.
  • the selected cells are monoclonally cloned using, for example, the limiting dilution method ⁇ soft agar medium method to obtain a monoclonal antibody-producing, hybridoma cell line.
  • Monoclonal antibody is obtained by culturing the hybridoma cell line in an appropriate medium, collecting the culture solution, Alternatively, the cell line can be transplanted into the peritoneal cavity of an animal and grown in ascites to recover ascites and obtained from the culture or ascites.
  • the antibody in the culture solution or ascites can be purified and used as needed. Examples of purification methods include salting-out fractionation using ammonium sulfate, ion exchange chromatography, gel filtration column chromatography, affinity column chromatography using protein A and protein G, and solidification of antigen. Methods such as affinity column chromatography using the phased gel are used alone or in combination.
  • an anti-trichothecene mycotoxin monoclonal antibody can be obtained.
  • Specific monoclonal antibodies obtained include the monoclonal antibodies named KTM-205, KTM-240 and KTM-249.
  • Monoclonal antibody KTM-205 has affinity for the compound represented by the formula (II), and the degree of affinity is similar to that of compound 1-1, compound 1-2 and compound 113. These are monoclonal antibodies which are higher in the order of 1> compound 1-2> compound 1-3 and substantially do not react with the compound represented by formula (A) or (B).
  • Monoclonal antibody KTM-240 has affinity for the compound represented by formula (III), and the degree of affinity is similar to that of compound 2-1, compound 2-2 and compound 2-3.
  • Compound 2-2> A monoclonal antibody which is higher in the order of compound 2-3 and does not substantially react with the compound represented by the formula (C).
  • Monoclonal antibody KTM-249 has affinity for the compound represented by the formula (IV), and the degree of affinity is similar to that of compound 3-1 and compound 3-2. > A monoclonal antibody that is higher in the order of compound 3-2 and does not substantially react with the compound represented by formula (D). 2.Quantification method of trichothecene mycotoxin
  • the trichothecene mycotoxin contained in the sample containing the trichothecene mycotoxin can be quantified by any method as long as the trichothecene mycotoxin can be measured by an immunological method.
  • a method for quantifying a trichothecene mycotoxin by an immunological method using an antibody fragment is preferred.
  • Samples containing mycotoxins include all substances that may contain mycotoxins, such as crops, processed products of the crops, and environmental factors in which the crops are fielded.
  • the crops include, but are not limited to, crops such as rice, wheat, beans, corn, and potatoes. Regardless of whether the crop is vegetated in a field such as a field or the like, it may be present in a market.
  • the processed crops include foods and beverages processed from the above crops as raw materials.
  • feed which is a food product for livestock, and meat, milk, eggs, or processed products thereof of livestock such as pigs, pests, and chickens that consume the feed are included in the sample containing mycotoxins.
  • the environmental factors that cause crops to be cultivated include various factors that constitute the crop environment. Specific examples include inorganic factors such as water and soil, microorganisms that adhere to the inorganic factors, and spores of microorganisms floating in the air, and organic residues such as plant stumps.
  • the mycotoxin can be collected by collecting the sample containing the trichothecene-based mycotoxin as it is, or after fragmenting the sample, by applying an organic solvent to the sample, extracting the mycotoxin, and collecting the extract.
  • Any method can be used to subdivide the sample, as long as the mycotoxin is not degraded or disappeared, but any method such as grinding using a mortar and pestle, ultrasonic waves, a mill, a hammer, etc. And a method of shearing with a fine force using a blade.
  • the organic solvent may be any organic solvent, but preferably is a water-soluble organic solvent such as methyl alcohol, ethyl alcohol, propyl alcohol, acetonitrile, dimethyl sulfoxide and dimethylformamide. And so on.
  • the content of the organic solvent is at least 25%, preferably at least 50%, more preferably at least 75 ° / 0 , of the total amount of the extracted solution.
  • Trichothecene mycotoxins extracted with an organic solvent and have it extracted by volatilizing the organic solvent, the extract by passed through a column of the column, can be force s recovered.
  • the pretreatment step of the present invention includes a step of converting a part of a trichothecene mycotoxin to another derivative, and a step of converting a part of a retrichothecene mycotoxin to another derivative.
  • Acylation preferably partial acetylation.
  • the acetylation will be described.
  • the acetylation is performed by dissolving the compound by adding an appropriate solvent, and adding acetic anhydride and a base to react.
  • a solvent a halogen-based organic solvent such as dichloromethane and chloroform, a general solvent that does not react with acetic anhydride such as dimethyl ether, DMF DMSO, and dichloromethane can be used.
  • an organic base such as pyridine and triethylamine
  • an inorganic base such as sodium bicarbonate and potassium carbonate
  • pyridine is preferred because it can serve as both a base and a solvent.
  • the concentration of acetic anhydride is 0.1 to 10000 times, preferably about 0.5 to 10 times the weight of the dried sample, but needs to be adjusted according to the amount of organic solvent to be added.
  • the reaction temperature is from ice-cooling to the boiling point of the solvent; the power is as low as possible; preferably about 30 ° C. to 50 ° C., more preferably about 45 ° C.
  • these acetylation conditions need not be particularly limited as long as the purpose can be achieved.
  • the reaction may be terminated immediately after the start of the reaction, or may take about one week in some cases, but is preferably one hour or less in consideration of operability.
  • Means for forcibly terminating the reaction may be any of a method of removing a base and acetic anhydride and a method of adding an alkali.
  • the base and acetic anhydride can be removed immediately by volatilization.
  • aqueous sodium bicarbonate is preferably used as the alkali to be added.
  • the compound represented by ( ⁇ ) and the formula (IV) can be quantified using an immunological method. Further, the sample Ichi ⁇ Komada medium (K 2 HP0 4 lg, KC1 0.5g, MgS0 4 -7H 2 0 0.5g, Fe-EDTA O.Olg, L- ⁇ scan aspartic 2 g, D-galactose 20g, pentachloronitrobenzene 75% wettable powder lg, co Ichirusan'na thorium 0.5g, NaB 4 O 7 '10H 2 O lg, streptomycin sulfate 0.3 g, agar 15 g, distilled water 1000m, pH3.8- 4.0) selective medium, such as After inoculation, the microorganisms grown on the medium are selected and then inoculated into the culture medium to immunize the compounds represented by the formulas ( ⁇ ), ( ⁇ ) and (IV) produced in the medium. It can also be quantified using a biological method.
  • the culture medium may be any medium as long as the microorganism can grow.
  • the amount of distilled water is preferably 1 to 10 times the amount of milled rice, and the standing time is preferably about 15 minutes to half a day.
  • the immunological method of the present invention includes any known immunological method.
  • various high-sensitivity immunoassay methods such as radioimmunoassay using a radioisotope as a label, enzymatic immunoassay using an enzyme, fluorescent immunoassay using a fluorescent substance, and luminescent immunoassay using a luminescent substance are used. can give.
  • the immunological method is a method of measuring the amount of the antibody or the amount of the antigen using the antigens or antibodies that have been subjected to the various labels described above.
  • any known method for detecting or measuring an antigen may be used! / And are the methods that the competition method and the sandwich method are most suitable for.
  • the competitive methods include (1) binding of an antibody or an antibody fragment between a labeled antigen and an antigen in a sample. (2) a method for competing with a labeled antibody or antibody fragment for binding between an antigen in a liquid sample or a standard substance and an immobilized antigen, (3) a method for competing A method of competing the binding of the labeled antibody or antibody fragment with a labeled antigen and an antigen in a sample or a standard substance can be used.
  • a primary solid phase antibody in which an antibody or antibody fragment is bound to an appropriate solid phase such as beads, tubes, or plates, reacts with a standard substance or an antigen in a sample, and then the solid phase antibody (or antibody) Fragment) and reacted with the secondary antibody or antibody fragment) and the resulting solid phase antibody (or antibody fragment)-antigen-secondary antibody or antibody fragment) complex
  • the detection method is generally to label the secondary antibody (or antibody fragment) with various substances, and to detect this labeling substance.
  • Various labeling substances such as radioisotopes, enzymes, fluorescent substances, luminescent substances, metals, etc. Is used. These methods are in solution
  • the main method used to measure antigen is force, which is a qualitative or quantitative measure of trichothecene mycotoxins present in tissue, intracellular, nitrocellulose membranes, and nylon membranes. Can also be detected.
  • the present invention provides a reagent or kit for immunological quantification of a trichothecene mycotoxin.
  • a kit is composed of a combination of instruments or reagents, but if it contains a substance that is essentially the same as each of the components described below, or a substance that is essentially the same as a part of the components, the configuration or form is It may be different.
  • the immunological quantification reagent of the present invention contains the monoclonal antibody of the present invention or an antibody fragment thereof as an active ingredient.
  • the kit of the present invention contains a hydroxyl group in the compound represented by the formula (I) represented by OR (where R is as defined above). It contains a sample pretreatment solution for conversion into a group to be converted and the monoclonal antibody of the present invention or an antibody fragment thereof.
  • the kit for immunological quantification of the present invention also includes, if necessary, a sample diluent, a quantification plate, a secondary labeled anti-mouse antibody, a reagent for detecting a labeled substance, and a standard substance. .
  • a sample liquid containing a protein such as BSA or casein in a surfactant, a buffer or the like can be used.
  • a quantification plate a plate in which an antigen or the like is immobilized on a 96-well microplate made of a material such as polystyrene is used.
  • Secondary labeled anti-mouse antibodies include horseradish peroxidase (HRP ⁇ ⁇ )
  • HRP ⁇ ⁇ horseradish peroxidase
  • a mixture of a labeling enzyme such as alkaline phosphatase and ⁇ -galactosidase of the small intestine, mixed with a buffer, a protein such as BSA and casein, and a preservative is used.
  • a reagent for detecting a label for example, in the case of horseradish peroxidase, tetramethylbenzidine or orthophenylenediamine is a main component depending on the above-mentioned labeling enzyme.
  • the anti-trichototecene-based mycotoxin monoclonal antibody of the present invention or an antibody fragment thereof may be directly labeled with a labeling enzyme.
  • P ⁇ 6100 is also good.
  • Examples of the sample containing a microorganism that produces a trichothecene mycotoxin include environmental factors in the field of crops, such as water, soil, air, spores floating in the air, and organic residues such as plant stumps.
  • Microorganisms that produce trichothecene mycotoxins form ascospores on plants remaining in the field, for example, organic residues such as rice stumps. When environmental conditions such as rainfall and humidity are met, ascospores fly into the air and are transmitted to cereals during flowering and ripening.
  • Trichothecene mycotoxin-producing strains when cultured in a culture medium, express
  • trichothecene mycotoxins containing compounds represented by ( ⁇ ), formula (m) or formula (IV).
  • the type and production amount of the trichothecene mycotoxin varies depending on the microorganism strain that produces the trichothecene mycotoxin.
  • the microorganisms producing the trichothecene mycotoxin were present in the sample. can do.
  • the type of trichothecene mycotoxin produced by the microorganism strain is detected using the immunological method described in the above item 2, and the amount of the trichothecene mycotoxin is quantified. The strain can be identified.
  • the state of environmental pollution in the field can also be known.
  • the above-described sample is directly inoculated into a culture medium to grow the microorganism, and the formula ( ⁇ ), the formula By measuring the compound represented by (in) or the formula (iv), contamination by a microorganism producing trichothecene mycotoxin is detected.
  • Komada medium K 2 HP0 4 lg, KC1 0.5g, MgS0 4 -7H 2 0 0.5g, Fe-EDTA O.Olg, L- Asuparagin 2 g, D-galacto Ichisu 20g, pentachloronitrosyl base Nze down 75% wettable powder lg, sodium cholate 0.5g, NaB 4 O 7 '10H 2 O ig, sulfate streptomycin emissions 0.3 g, agar 15 g, distilled water 1000 mL, was inoculated into a selective medium, such as pH3.8-4.0), After culturing, this is inoculated into a culture medium, and the compound represented by formula ( ⁇ ), formula (HI) or formula (IV) produced in the medium is measured, and the contamination of microorganisms is measured.
  • a selective medium such as pH3.8-4.0
  • a variety of media can be used for cultivation.
  • polished rice is preferably placed in an autoclavable container, allowed to soak in a fixed amount of distilled water for a certain period of time, and then sterilized by autoclaving.
  • FIG. 1 shows a calibration curve of a trichothecene-based mycotoxin quantification system using KTM-205.
  • FIG. 2 shows a calibration curve of a trichothecene-based mycotoxin quantification system using KTM-240.
  • FIG. 3 shows a calibration curve of a trichothecene-based mycotoxin quantification system using KTM-249.
  • FIG. 4 shows a calibration curve of a trichothecene-based mycotoxin quantification system using KTM-240 and KTM-249.
  • FIG. 5 shows the correlation between the quantified value of the trichothecene mycotoxin by the ELISA method of the present invention and the quantified value obtained by quantifying the same sample by GC-MS.
  • FIG. 6 shows the results of measurement of trichothecene-based mycotoxins in a culture medium obtained by inoculating .graminearum into rice medium and using KTM-240.
  • FIG. 7 shows the results of measurement of trichothecene mycotoxins in the medium in which the strains isolated from the rice strains in each field were cultured. 100 BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • the compound is N7769 manufactured by Sigma,
  • the compound of No. used was T4887 manufactured by Sigma.
  • the resulting solution was subjected to silica gel thin-layer chromatography, gas chromatography, and gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) to obtain the compound of the formula (b-1): 4, 15- After confirming the presence of diacetylnivalenol 3-hemisuccinate and the formula (b-2): T-23-hemisuccinate, the solution was concentrated to dryness under reduced pressure.
  • GC-MS gas chromatography-mass spectrometry
  • 0.5 mg of the above concentrated dried product containing the compounds of the formulas (b-1) and (b-2) was added to 50 // L of 10 mM phosphate buffer pH 7.4 (hereinafter abbreviated as PBS) containing 140 mM NaCl. ).
  • PBS 10 mM phosphate buffer pH 7.4
  • 0.01% of TritonX-100 was added to the above buffer, and the dissolution was assisted with a probe-type ultrasonic generator (Model UR-200P, Tomi Issei).
  • the solution was mixed with 0.5 mL of an aqueous solution (20 mg ZmL) of mocyanin (hereinafter abbreviated as KLH) in a keyhole bottle.
  • KLH mocyanin
  • EDC [1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide] was added, and the mixture was reacted at room temperature for 6 hours. After completion of the reaction, the solution was dialyzed against PBS, and the dialyzed product was used as a trichothecene-based mycotoxin derivative [formula (b-1)]-KLH aqueous solution and a trichothecene-based mycotoxin derivative [formula (b-2)]-KLH aqueous solution.
  • the protein concentration in the aqueous solution was quantified using the serum albumin (hereinafter abbreviated as BSA) as a standard using the owry method protein quantification kit (Bio-Rad).
  • BSA serum albumin
  • a conjugate solution was also prepared.
  • Trichothecene mycotoxin derivatives [formula (b-1) or (b-2)] — 0.1 mg KLH were administered subcutaneously to the back of male 6-week-old Balb c mice under the same conditions as Freund's complete adjuvant. . Thereafter, the equivalent mixture O.lmg / animal was subcutaneously administered twice every three weeks subcutaneously to the back, and three weeks later, a trichothecene mycotoxin derivative [formula (b-1) or formula (b) dissolved in PBS from the tail vein. -2)] One KLH was administered in 0.1 mgZ animals, and 3 days later, antibody-producing cells were collected from the spleen as described below.
  • Immune animal power The spleen is aseptically excised, dissociated in serum-free RPMI-1640 medium (Nissui Pharmaceutical), passed through a 100-mesh mesh to form single cells, and suspended in hypotonic solution. After turbidity and lysis of erythrocytes, the cells were centrifugally washed three times with RPMI-1640 medium containing no serum to obtain antibody-producing cells.
  • mouse myeloid cell P3X—Ag8—U1 was supplemented with 10% fetal calf serum (FCS) and RPMI—1640.
  • FCS fetal calf serum
  • RPMI fetal calf serum
  • the antibody-producing cell suspension obtained as described above and the mouse myeloma cell P3X_Ag8-U1 suspension were mixed at a ratio of 10: 1, centrifuged at 1200 rpm for 5 minutes, and the culture solution was removed. To the remaining cells, slowly add 1 mL of 50% polyethylene glycol 1500 solution (Boehringer's Manno, Im), and gradually add 50 mL of serum-free RPMI-1640 medium, and centrifuge at 1200 rpm for 5 minutes.
  • HAT medium (1 X 10- 4 M hypoxanthine, 4 X 10 one 7 M aminopterin, 10% FCS pressurized RPMI-1640 medium containing 2 X 10- 5 M thymidine) 1 X 10 6 was suspended so as to be cells ZML, it was dispensed suspensions each Ueru 200 mu L not a One minute 96-well microtiter one plate. The cells were cultured as they were in a carbon dioxide incubator at 37 ° C. in air containing 5% carbon dioxide. After 10 days, colonies of all hybridomas were observed.
  • the antibody titer in the culture supernatant was quantified by the ELISA method as described below for the purpose of selecting the wells containing the cells producing the target antibody.
  • 50 L of a trichothecene-based mycotoxin derivative [Formula (b-1) or Formula (b-2)]-BSA conjugate solution (20 / zg / mL 0.1 M carbonate buffer pH 9.5 ) was dispensed and allowed to stand at 4 ° C overnight.
  • reaction plate was washed three times with PBS, 250% / L of a 1% BSAZPBS solution was dispensed, allowed to stand at room temperature for 1 hour, and each well was washed three times with PBS to prepare a reaction plate.
  • a reaction plate was charged with 50 / L of the culture supernatant diluted 11-fold with PBS containing 0.1% BSA, and allowed to react at room temperature for 3 hours. After completion of the reaction plate 0.05 0 /.
  • PBS containing Tween20 50 ⁇ L of peroxidase (POD) -labeled anti-mouse immunoglobulins-perforated IgG (Dako) was added and reacted at room temperature for 1 hour.
  • POD peroxidase
  • the plate was washed 5 times with PBS containing 0. 05% Tween20, 50 ⁇ L TMB color reagent solution (inter one Jiwen Co.) was added, reacted at room temperature for 30 minutes, the last 5 0 M L ImolZL sulfuric acid aqueous solution was added, and the absorbance at 450 nm was measured using a microplate reader (MTP-120, Corona Electric). Cells in the wells showing absorbance of 1.0 or more were selected.
  • Cloning was performed by the limiting dilution method. 1 x 10 7 cells in the well obtained above Dilute to 0.5 ZmL with 10% FCS-supplemented RPMI-1640 medium containing mL of thymocytes, and dispense 200 ⁇ L into each well of a 96-well microtiter plate. At 37 ° C. 10 to 14 days after the start of the culture, each well was observed, a well with one growing colony was selected, and the antibody titer in the culture supernatant was quantified by the above ELISA method to determine the cell line producing the target antibody. Included elements are selected. Further, the same operation was repeated twice to obtain a monoclonal antibody-producing cell line stably producing the target antibody.
  • the immunoglobulin class of the antibody produced by the obtained strain was identified for the antibody in the culture supernatant, and the antibody produced was IgGl type except for IgG3 or IgM. Was collected.
  • mice Male BalbZc mice over 8 weeks of age were injected intraperitoneally with 0. SmLZ pristane (2, 6, 10, 14-tetramethylpentadecane) and bred for 2 weeks.
  • mice were inoculated intraperitoneally with 1 ⁇ 10 6 Z monoclonal antibody-producing cells.
  • Trichothecene mycotoxin derivative [Formula (b-1) or Formula (b-2)] prepared in Example 1 in a 96-well microtiter plate (Nunc)-BSA conjugate solution (20 / gZmL 0.1 M carbonate The buffer solution (pH 9.5) was dispensed and allowed to stand at 4 ° C overnight. After washing the plate three times with PBS, 250 // L of a 1% BSA / PBS solution was dispensed, allowed to stand at room temperature for 1 hour, and each well was washed three times with PBS to prepare a reaction plate.
  • the plate is washed 5 times with PBS containing 0.05% Tween20, and then 50 L of POD labeling-anti-mouse immunoglobulins- ⁇ sagi IgG is added, and the mixture is reacted at room temperature for 1 hour. After washing 5 times with PBS containing 05% Tween20, add 50 // L of TMB color development solution (Intergen), react for 30 minutes at room temperature, and finally add 50 reaction stop solution, and add The absorbance at 450 nm was measured with a reader.
  • TMB color development solution Intergen
  • the reactivity of each antibody against various trichothecene-based mycotoxins was determined by plotting the concentration-absorbance curves of the various trichothecene-based mycotoxins used in the reaction and the reaction inhibition rate of various trichothecene-based mycotoxins when the absorbance of the control was set to 100%. Relative determination. Based on the results, suitable monoclonal antibodies were selected from the monoclonal antibody-producing strains established in Example 1, and KTM-205, KTM-240, and KTM- Named 249. Based on the criteria for selection, among the antibody-producing strains shown in Example 1, KTM-205 exhibited the lowest concentration of inhibition by the compound represented by formula (II), and showed the results shown in formula (A) or (B).
  • KTM-240 should have the lowest concentration of inhibition by the compound of the formula ⁇ ), and should not be substantially inhibited by the compound of the formula (C).
  • KTM-240 should have the lowest concentration of inhibition by the compound of the formula ⁇ ), and should not be substantially inhibited by the compound of the formula (C).
  • Table 1 shows the specificity of each antibody.
  • Hybridoma cells producing these antibodies are KTM-205 (FERM BP-6835), KTM-240 (FERM BP-6836), and KTM-249 (FERM BP-6837), respectively. As of August 11, 1999, it has been deposited with the Institute of Biotechnology and Industrial Technology, the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, 1-3-1 Tsukuba East, Ibaraki, Japan (zip code 305-0046).
  • Example 3 Quantification of trichothecene mycotoxin in sample
  • Trichothecene mycotoxin derivative [Formula (b-1) or Formula (b-2)] prepared in Example 1 at 50 / L in a 96-well microtiter plate-BSA conjugate solution (20 / ig gmL 0.1 M A carbonate buffer (PH9.5) was dispensed and allowed to stand at 4 ° C overnight. After washing the plate three times with PBS, dispense 300 ⁇ L of 1% BSA / PBS solution or 1% skim milk / PBS and leave it at room temperature for 1 hour. Each well was washed three times with BS to prepare a reaction plate.
  • 160 ⁇ L of the stock solution was placed in a tube with an lmL cap, concentrated and dried under a stream of air, and further placed in a vacuum desiccator for 24 hours to completely dry it.
  • 50 / L of dry pyridine was added to the tube, the dried product was completely dissolved, 25 ⁇ L of acetic anhydride was added, the tube was sealed, and the tube was allowed to stand at 45 ° C. for 45 minutes.
  • 100 L of ethanol and 6611-? 900 / iL of 83 solution (0.05% Tween-20, 10 mM phosphate buffer pH 7.4 containing 140 mM NaCl) was added and used as a sample for quantification.
  • samples of NIV, DON, and T-2 were treated in the same manner as described above, and further diluted with a Tween-PBS solution to an appropriate concentration to prepare a dilution series, which was used as a standard solution.
  • each well of the reaction plate add a sample for quantification, each standard solution, or Tween-PBS solution (10 mM phosphate buffer pH 7.4 containing 0.05% Tween-20 and 140 mM NaCl) as a 50 / x LZ well as a control.
  • Tween-PBS solution 10 mM phosphate buffer pH 7.4 containing 0.05% Tween-20 and 140 mM NaCl
  • KTM-205 solution SOOngZml ⁇ 0.1% BSA kamencho 66 1 1-? 83 solution
  • the @ 10 ⁇ [-240 solution 30013 ⁇ 4 / 111 level 0.1% BSA
  • Tween-PBS solution 3 KTM-249 solution (300 ng ZmL, 0.1% BSA3 ⁇ 4H Tween-PBS solution), or a mixed solution of an equal volume of 2 and 3, add 50 ⁇ L / ⁇ , and shake well. The reaction was carried out at room temperature for 45 minutes with shaking and stirring. After washing the plate 5 times with Tween-PBS solution, add 100 ⁇ L of the HRP-labeled anti-mouse immunoglobulin-zoo-heron antibody solution (300 ng ZmL 0.1./. BSA force [J Tween-PBS] to each well. Solution), and reacted at room temperature for 30 minutes with shaking and stirring.
  • HRP-labeled anti-mouse immunoglobulin-zoo-heron antibody solution 300 ng ZmL 0.1./. BSA force [J Tween-PBS]
  • a calibration curve was prepared by taking the concentration of the standard as a logarithm on the X-axis and the corresponding inhibition rate result on the ⁇ -axis.
  • the respective calibration curves are shown in FIGS. 1, 2, 3 and 4. Using this calibration curve, the results of the inhibition rate of each sample were applied to the calibration curve, and the concentration of each trichothecene mycotoxin in each sample was calculated by the following method.
  • the concentrations of MV and its derivatives were calculated from the KTM-205 reaction level, the concentrations of NIV, DON and their derivatives were calculated from the results of the KTM-240 reaction level, and the concentrations of DON and its derivatives were calculated from the results of the KTM-240 reaction level. It was calculated by subtracting the results from 205 reactions.
  • the concentrations of T-2 and its derivatives were calculated from the results of KTM-249 reaction.
  • the total concentration of NIV, DON, T-2 and their derivatives was calculated from the sum of the results of the KTM-240 reaction and the KTM-249 reaction.
  • Example 4 Comparative Example: Measurement by GC-MS
  • the obtained diluent was subjected to a gas chromatography mass spectrometer (GC-MS, Shimadzu GCMS-QP2000) to quantify various trichothecene mycotoxins.
  • the measurement conditions were as follows. Capillary ram (Shimadzu HiCap-CBP1), column temperature maintained at 120 ° C for 5 minutes, 8 ° C up to .280 ° C // minute, inlet and interface temperatures at 280 ° C, ion source temperature Is 270 ° C, ionization voltage is 70eV, scan speed (35 ⁇ 700mZz) is 1.5scan / sec, sampling speed is 5 points / sec.
  • FIG. 5 shows the correlation between the results of simultaneous quantification of DON and NIV using KT [-240 and the results of quantifying DON and NIV separately by GC-MS and summing the results.
  • a culture medium (rice medium). 3 / 7' ⁇ / ⁇ ? / ⁇ / ⁇ , ⁇ Choice stored in culture medium. -15624), and cultured at room temperature (20 to 25 ° C). 500 L of the culture supernatant was collected every 5 days. The culture medium was not inoculated at all, cultured at room temperature (20 to 25 ° C.), and 500 ⁇ L of the culture supernatant was collected every 5 cells as a control.
  • the sample for measurement which had been frozen and stored was thawed at room temperature, stirred well, and L was taken in a tube with a cap of 1 mL and concentrated under air stream to dryness.
  • 100 ⁇ L of ethanol and 900 ⁇ L of Tween-PBS solution (0.05 mM Tween-20, 10 mM phosphate buffer ⁇ 7.4 containing 140 mM NaCl) were added, and this was used as the following measurement sample. .
  • Tween—PBS solution (0.05% Tween—20, 10 mM phosphate buffer pH 7.4 containing 140 mM NaCl) was added to each well of the reaction plate for each measurement sample or control.
  • a culture medium 50 g of polished rice was placed in a 500 mL Erlenmeyer flask, 150 mL of distilled water was added, and the mixture was allowed to soak at room temperature for 1 hour, and then autoclaved at 120 ° C. for 25 minutes to prepare a culture medium.
  • the culture medium was dispensed by lmL into a test tube (10 mL) for autoclave sterilization and stoppered with a sterile cotton plug to prepare a culture test tube.
  • the ascitic husks formed in the rice plant collected from each field were cut off with a sharp knife, and inoculated into a Petri dish containing Komada's medium. After culturing for about one day, the formed colony was inoculated into a culture test tube and cultured at room temperature (20 to 25 ° C) for 5 days. After completion of the culture, collect 500 ⁇ L of the culture supernatant, add 2.5 mL of ethanol _ water (3: 1 v / v) to each sample, and use a homogenizer (Histocon NS-50: Nichion Medical Science Instruments). The mixture was ground and centrifuged at 3000 rpm for 10 minutes, and the obtained supernatant was used as a sample for measurement.
  • the sample for measurement was stirred well, and 500 L of the sample was placed in a tube with a cap of 1 mL and concentrated under air stream to dryness. To this was added 450 ⁇ L of 50 / zL of ethanol and 450 ⁇ L of Tween-PBS solution (10 mM Tween-20, lOmM phosphate buffer pH 7.4 containing 140 mM NaCl), and mixed it with the following measurement sample. did.
  • Tween-PBS solution (0.05% Tween-20, lOmM phosphate buffer pH 7.4 containing 140 mM NaCl) was added to each well of the reaction plate as each measurement sample or control.
  • 1KTM-205 300 ng / mL, 0.1 ⁇ SABSA calo Tween—PBS solution
  • 2KTM-240 solution 300 ngZm, 0.1% BSA calo (n-PBS solution) 50 ⁇ L was added, and the mixture was sufficiently stirred, and then reacted at room temperature for 45 minutes with shaking and stirring.
  • Trichothecene mycotoxin was detected in the culture medium of the rice isolates collected from fields A, B, and D, and trichothecene mycotoxin was detected in the culture medium of the rice isolates collected from field C. Not detected. Therefore, in fields A, B, and D, where the possibility that trichothecene mycotoxin-producing bacteria had already been contaminated, field C was denied. Furthermore, the results of A, B, and D indicated that Field A was contaminated with strains that mainly produce DON, and Fields B and D were contaminated with strains that produced NIV.
  • trichothecene mycotoxins present in agricultural products, foods and drinks, feeds, and the like can be easily and accurately quantified and detected.

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Description

明 細 書
トリコテセン系マイコトキシンの検出方法及びその試薬 技術分野
本発明は、農作物、食品および飼料等に含まれるトリコテセン系マイコトキシンを免疫学的 に定量する方法、該マイコトキシンの免疫学的定量用試薬ならびにキットおよびそれらに使 用するモノクローナル抗体に関する。
背景技術
マイコトキシンは、真菌によって生産される二次代謝産物で食品や飼料などを介して人畜 になんらかの有害作用を示す化合物と定義され、細菌毒素などと区別されている。マイコト キシンは細菌毒素などと異なり低分子物質であり、多様な物質力 れまで知られている。そ れらの化学構造は多様であり、生体に対する有害作用も様々である。中には人体に入ると 強い急性毒性を示すもの、また、発癌性、腎臓や肝臓に対する催腫瘍性が認められるもの など、人体にとって有害なものが少なくなレ、。マイコトキシンは低分子物質であるがゆえに通 常の食品加工、調理条件下では分解や除去が困難である。また、マイコトキシンは安定性が 高ぐ飼料等を経て食用家畜に摂取された場合、その食肉中や乳製品などに残留し、最終 的に人体に摂取され、毒性を示す。
マイコトキシン汚染は様々なルートで発生する力 s、農作物栽培から収穫、貯蔵、加工の過 程で真菌の侵入によって起こる農作物の一次汚染と、汚染飼料の給餌に伴って起る畜水産 物（肉、乳、卵など)への二次汚染に大別される。一次汚染は農作物種 (真菌の基質）、その 栽培環境に棲息する真菌の種類、環境条件 (気温、湿度、降水量等)などの諸要因によつ て地域的特性が認められる。
麦類やトウモロコシなどの主要穀物を汚染する代表的なマイコトキシンとしてトリコテセン系 マイコトキシンがあげられる。代表的なトリコテセン系マイコトキシンとしてはデォキシュバレノ
—ル（DON)、二バレノール（NIV)、 T一 2トキシン（T—2)がある。それらの主たる生産菌で fc Fusarium graminearum^ F. culmorum, F. sporotnchioiaesi'ま土 中に'吊 i し、 显、 . T/JP00/06100 度、降水量などの自然条件が満たされれば容易に作物に感染し、作物のマイコトキシン汚 染が広がる。
食品汚染、飼料汚染を防止する目的でトリコテセン系マイコトキシンについては世界各国 で食品や飼料中の残留濃度等に規制が設けられている。従って、食品や飼料中のトリコテ セン系マイコトキシンを迅速かつ正確に定量することは重要である。
従来のトリコテセン系マイコトキシン定量は、薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトダラ フィ一、ガスクロマトグラフィー、マススぺタトロメトリー、動物を用いたバイオアツセィなどを単 独であるいはこれらの組み合わせで行われていた。さらに近年になって免疫学的定量法が 考案され、使用されるに至っている。免疫学的定量法は、迅速、簡便でかつ特異性が高ぐ また感度の面でも優れた方法で、ホルモンや生体内物質の定量を始め様々な分野で広く応 用されている。特にモノクローナル抗体取得技術力応用されるようになり、免疫学的定量法 は飛躍的に進歩した。
トリコテセン系マイコトキシンには多くの誘導体が存在し、かつそれら誘導体も毒性を有し ていることから、トリコテセン系マイコトキシンによる汚染状態を知るには、個々の誘導体を分 別定量するのではなぐある程度包括的に定量できることが望ましい。また、定量の対象とな るものは麦、トウモロコシを中心とするトリコテセン系マイコトキシンに汚染され^物、この穀 物を食した家畜の肉や乳、さらこの肉や乳を加工した加工食品、汚染穀物を原料とした加工 食品等多岐に亘る。し力 )加工されるに従って、マイコトキシン汚染は希釈されるので、低濃 度のトリコテセン系マイコトキシンを定量する必要がある。従って、感度の高い定量方法が望 まれている。
一方、主要なトリコテセン系マイコトキシンは DON、 NIVおよび T— 2であり、この 3種をそ れぞれ分別定量することは、汚染された場所や状況を知る上で重要なことである。このような 要求に合ったトリコテセン系マイコトキシンの免疫学的定量法を構築する場合には、目的と するトリコテセン系マイコトキシンに対し親和性が高く、かつ特異性の高い抗体、特にモノクロ ーナル抗体が望ましい。 トリコテセン系マイコトキシンに対するモノクローナル抗体を開示した文献は種々知られて いる。特公平 5— 43358には T一 2とキャリアー蛋白質とを結合させた免疫原を用いてマウス を免疫して得られる T— 2に特異的に反応するモノクローナル抗体およびこの抗体を用いた T— 2類の測定法が開示されている。 Dietrichらは、 T— 2に対するモノクローナル抗体や 3 位がァセチル化した DONに対するモノクローナル抗体を取得してレ、る（Natural Toxins 3:288-293 1995)。また、 USP4879248には 8位の置換基を架橋基に利用してキャリアータン パク質を結合させて抗体を取得することが開示されている。しかし親和性が高ぐかつ本発 明の目的にあった特異性を持ったモノクローナル抗体は開示されていない。
3位の炭素にキャリアータンパク質を結合させた物質を免疫原とした 4, 15-diacetyl NIV に対するポリクローナル抗体は、 Applied and Environmental Microbiology, May 1993,59 : 1264- 1268に開示されてレ、る力 同様な免疫原を用いるモノクローナル抗体の製造にっレヽ ては開示されていない。さらに Food Addit. Contain" 5: 629 (1988) や J. Agric. Foo,d Chem., 36: 663 (1988)にも T一 2や DONに対するモノクローナル抗体が開示されている。
本願発明によるモノクローナル抗体は下記の特徴を持ち、上記公知のモノクローナル抗体 より優れている。
KTM— 249は Dietrichら（Natural Toxins, 3: 288(1995))の抗体（3E2)に比較し、親和性が 顕著に高ぐ T一 2の検出限界力 ¾.0001ng/mL程度と高感度である。また KTM— 249は acetylT— 2や HT— 2にも T—2と同程度の反応性を示し、本発明の目的にかなった抗体で ある。
さらに、 KTM— 249は HT—2および T一 2に対し同程度の反応性を有し（T— 2 = HT— 2 = 100%)、 acetylT— 2に対しては、 78%の反応性を示す。一方、 USP4772551の抗 T一 2モノクローナル抗体 IVT— 10092では、 50%阻害値が T— 2で 0. 023、 acetylT— 2で 0. 0 94 (丁ー2に対する50%阻害ィ直を1000/0とすると、 0. 023/0. 094^約 25%の反応性）、 HT— 2で 1 (0. 023/1 =2. 3%の反応性）である。従って、 KTM— 249は広く T— 2誘導 体を検出できる（T一 2誘導体には選択性が強い力 他の DONや NIV誘導体とは反応しな V、；)のに対し、 IVI— 10092は T一 2のみに選択性が強レ、抗体である。
ΚΤΜ— 240は Dietrichら（Natural Toxins, 3: 288(1995))の抗体（5B2)とは反応性が明らか に異なり、例えば 5B2は diacetyト DONに対する反応性は 3- acety卜 DONの 6倍程度、また triacety卜 DONに対する反応性は 3- acety卜 DONより弱いのに対し、 KTM— 240は diacety卜 DONに対する反応性は 15- acety卜 DONの約 50倍、また triacety卜 DONに対する反応性も 15 - acetyト DONの 2倍ある。また KTM— 240は MVのァセチル体とも強レ、反応性を示すのに対 し、 5B2にはこれら化合物との反応性はなく、従って DONと NIVとを同時に検出する目的には 使用できない。
特公平 5-43358記載の抗 T一 2トキシンモノクローナル抗体は HT- 2との交差反応性が約 3%なのに対し、 KTM— 249は HT— 2、 T— 2さらには acety卜 T一 2とも同程度の反応性を 示し、 T— 2関連トキシンを一括して測定すると 、う本発明の目的にかなった抗体である。
Chibaら [Food Addit. Contam., 5: 629(1988)]の抗体は、 HT— 2との反応性 ¾T—2の 0. 5%以下だが、本発明の ΚΤΜ— 249は ΗΤ— 2とも強く反応する。
Casaleら [J.Agric.Food Chem., 36: 663(1988)]の抗体 DON - 1と本発明の KTM— 240とは 明らかに反応性が異なる。抗体 DON - 1は 3-acetyHDONと強く反応し、 DONとも良く反応し、 NIVとも弱いが反応し、一方 15 - acety卜 DONとは反応しなレ、。本発明の KTM— 240は DON や NIVとは反応しなレ、が、 diacety卜 DONや triacety卜 NIVと強く反応する。 15- acety卜 DONに 対する反応性もあり、し力も 3- acety卜 DONに対する反応性よりも強い。
発明の開示
トリコテセン系マイコトキシンの免疫学的定量のためには、多くの誘導体が存在するトリコテ セン系マイコトキシンを包括的に定量でき、かつ DON類、 NIV類、 T— 2類という 3種に大 別して定量できる特異性を持ち、しかも低濃度の抗原を定量する必要から親和性の高い抗 体が要求される。さらに本発明の目的とする抗体は、生産性や再現性の高さ、特異性の均 一さが求められるためにモノクローナル抗体またはそれらの抗体断片であることが望ましレ、。 抗体断片としては、 Fab、 Fab '、 F(ab)。などがあげられる。 本発明の抗体断片の製造法としては、ハイプリドーマが産生した抗体をペプシン等の酵素 処理あるいは還元処理する方法、ハイプリドーマから mRNAを抽出し、 cDNAを調製したのち に原核生物用発現べクタ一あるいは真核生物用発現べクタ一に揷入し、該ベクターを原核 生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させることにより得る方法など力 sあげられ る。
トリコテセン系マイコトキシンはレ、わゆるハプテンと呼ばれる低分子物質で、それ単独では 免疫原性が低い。従って、トリコテセン系マイコトキシンに対する抗体を作製する場合は、該 マイコトキシンをキャリア一物質に結合させるなど生体にとって抗原と認識される形にしてか ら免疫する必要がある。本発明者は、このキャリアー物質とトリコテセン系マイコトキシンとの 結合部位の違いにより、得られる抗体の親和性や特異性が影響を受けることに注目し;^ト リコテセン系マイコトキシンは水に対し難溶性の為、溶解する際、一般的に有機溶媒が用い られてきた。本発明者は有機溶媒を含まなレ、水溶液を用いてトリコテセン系マイコトキシンを 溶解し、キャリアー物質と結合させ、式 (I)
Figure imgf000006_0001
(式中、 R1は 0Hまたはァシルォキシを表し、 R2、 R3および R4は同一または異なって H、 OHま たはァシルォキシを表し、 Z1は〇COCH2CH(CH3)2を表し、 Z2は Hを表すカ Z1と Z2がー緒に なって =0を表す)で表される化合物（以下、上述の式 (I)で表される化合物を化合物 (Dと 、う） の 3位の置換基を架橋基に利用してキャリア一物質を結合させ、この結合物を免疫原として 用いることにより、親和性の非常に高い抗体を取得できることを見出した。
さらにァシル化されたトリコテセン系マイコトキシンを免疫原に利用することで、特異性、親 100 和性の高レ、モノクローナル抗体が取得できることも見レ、だした。
またさらに試料中のトリコテセン系マイコトキシンを式 (II)
Figure imgf000007_0001
(式中、 Rla、 R3aおよび R4aは、同一または異なって OHまたはァシルォキシを表す）で表される 化合物（以下、上述の式 (II)で表される化合物を化合物 (II)という）、式 (ΠΙ)
Figure imgf000007_0002
(式中、 Rlb、 R3bおよび R4bは同一または異なって OHまたはァシルォキシを表し、 R2bは H、 OH またはァシルォキシを表し、かつ R2 ¾または OHのときには Rlb、 R3bおよび R4bのうち少なくと も 1つの基がァシルォキシで表される）で表される化合物（以下、上述の式 (III)で表される化 合物を化合物 (ΠΙ)とレ、う）および式 (IV)
Figure imgf000007_0003
(式中、 Rle、 R2cおよび R3cは同一または異なって OHまたはァシルォキシを表し、かつ 、 R2c および R3cのうち少なくとも 1つの基がァシルォキシで表される）で表される化合物に変換した 後に、本発明のモノクローナル抗体を利用して、試料中のトリコテセン系マイコトキシンを一 括定量することができ、また、 DON類、 N1V類、 T- 2類という 3種に大別して定量することも可 能になることを見いだし、本発明を完成させるに至った。 '
なお、上述の各式中の定義において、ァシルォキシにおけるァシルは、置換もしくは非置 換の低級ァシル基、または置換もしくは非置換の芳香族ァシル基を表す。低級ァシル基は、 直鎖もしくは分枝状の炭素数 1〜12のアルカノィル基を表す。具体的には、ホルミル、ァセ チル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、バレリル、イソバレリル、ビバロイル、へキサノィ ル、ヘプタノィル、オタタノィル、デカノィル、ドデカノィルなどがあげられる。芳香族ァシル基 はべンゾィル、ナフトイルなどがあげられる。置換低級ァシル基における置換基としては、ヒ ドロキシ、カルボキシなどがあげられる。置換芳香族ァシル基における置換基としては、低級 アルキル、ヒドロキシ、低級アルコキシ、ハロゲン、カルボキシなどがあげられる。低級アルキ ルおよび低級アルコキシの低級アルキル部分は、直鎖もしくは分枝状の炭素数:!〜 6の低級 アルキル、例えばメチル、ェチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、 sec—ブチ ル、 tert—ブチル、ペンチル、へキシルなどを表し、ハロゲンは、フッ素、塩素、臭素またはョ ゥ素の各原子を意味する。
本発明における NIV類としては、 -バレノール（NIV)、 4—ァセチルニバレノール、 3, 4— ジァセチルニバレノール、 4, 15—ジァセチルニバレノール、 3， 4, 15—トリァセチルニバレノ ール、 4, 7， 15—トリァセチルニバレノール、 3， 4, 7, 15—テトラァセチルニバレノールなどが あげられ、 DON類としては、デォキシニバレノール（DON)、 3—ァセチルデォキシニバレノ ール、 3—ァセチルデォキシニバレノール、 15—ァセチルデォキシュバレノール、 3, 15—ジ ァセチルデォキシニバレノール、 3， 7, 15—トリァセチルデォキシニバレノ一ルなどがあげら れ、 T— 2類としては、 HT— 2、 T一 2、ァセチル T一 2などがあげられる。 本発明は以下の（1)〜（40)に関するものである。
(1) 式 (Π) 0/06100
Figure imgf000009_0001
(式中、 Rla、 R3aおよび R4aは、同一または異なって〇Hまたはァシルォキシを表す）で表される 化合物に対し親和性を有し、その親和性の程度力 ¾laおよび R3aが〇COCH3で R4aが OHであ る上記式 (II)で表される化合物 1一 1、 Rlaおよび R4aが OHで R3aが OCOCH3である上記式 (Π)で 表される化合物 1—2、 Rla、 R3aおよび R^^OCOCH3である上記式 (II)で表される化合物 1一 3 において、化合物 1一 1 >化合物 1一 2 >化合物 1一 3の順で高ぐかつ式 (A)
Figure imgf000009_0002
(式中、 R1A、 R3Aおよび R4Aは同一または異なって OHまたはァシルォキシを表す）で表される 化合物おょぴ式 (B)
Figure imgf000009_0003
(式中、 R1B、 R2Bおよび R3Bは同一または異なって〇Hまたはァシルォキシを表す）で表される 化合物とは実質的に反応しないモノクローナル抗体またはその抗体断片。
(2) ハイブリド一マ細胞株 KTM— 205が生産する上記（1)記載のモノクローナル抗体 KT M 205またはその抗体断片
(3) 式 (III)
Figure imgf000010_0001
(式中、 Rlb、 R3bおよび R4bは同一または異なって OHまたはアシノレオキシを表し、 R2bは H、 OH またはァシルォキシを表し、かつ Rzbが Hまたは〇Hのときには Rlb、 R3bおよび R bのうち少なくと も 1つの基がァシルォキシで表される）で表される化合物に対し親和性を有し、その親和性 の程度が Rlbおよび R3bが OCOCH3で R2 ¾で R4¾SOHである上記式 (III)で表される化合物 2 —1、 Rlb、 R3bおよび R4b力 SOCOCH3で R2bが Hである上記式 (III)で表される化合物 2— 2、 お ょび1^カ¾1"1で{^ぉょび1^が0じ0 1~[3でぁる上記式(111)で表される化合物2-3にぉぃて、 化合物 2— 1 >化合物 2— 2 >化合物 2— 3の順で高ぐかつ式 (C)
Figure imgf000010_0002
(式中、 R1C、 R2Cおよび R3cは同一または異なって OHまたはァシルォキシを表す）で表される 化合物とは実質的に反応しないモノクローナル抗体またはその抗体断片。
(4) ハイプリドーマ細胞株 KTM— 240が生産する上記（3)記載のモノクローナル抗体 KT M— 240またはその抗体断片。
(5) 式 (IV)
Figure imgf000011_0001
(式中、 Rle、 R2eおよび R3cは同一または異なって OHまたはァシルォキシを表し、かつ 、 R2c および R のうち少なくとも 1つの基がァシ /レオキシで表される）で表される化合物に対し親和 性を有し、その親和性の程度が Rlcが OHで R2cおよび R3cが OCOCH3である上記式 (IV)で表さ れる化合物 3— 1、 Rlc、 R2cおよび R3 OCOCH3である上記式 (IV)で表される化合物 3— 2に おいて、化合物 3—1 >化合物 3— 2であり、かつ式 (D)
Figure imgf000011_0002
(式中、 R1D、 R3Dおよび R4Dは同一または異なって OHまたはァシルォキシを表し、 R2DttH、 OHまたはァシルォキシを表す)で表される化合物とは実質的に反応しなレヽモノクローナル 抗体またはその抗体断片。
(6) ハイプリドーマ細胞株 KTM— 249が生産する上記（5)記載のモノクローナル抗体 KT M— 249またはその抗体断片。
(7) 上記（1)または (2)記載のモノクローナル抗体を生産する能力を有するハイプリドーマ 細胞。
(8) 上記（3)または（4)記載のモノクローナル抗体を生産する能力を有するハイブリドーマ 細胞。
(9) 上記（5)または（6)記載のモノクローナル抗体を生産する能力を有するハイブリド一マ 細胞。
(10) FERM BP— 6835として工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている 上記 (7)記載のハイブリド一マ細胞。
(11) FERM BP— 6836として工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている 上記（8)記載のハイプリドーマ細胞。
(12) FERM BP— 6837として工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている 上記 (9)記載のハイブリドーマ細胞。
(13) 式 (0
Figure imgf000012_0001
(式中、 R1は Ηまたはァシルォキシを表し、 R2、 R3および R4は同一または異なって H、 OHまた はァシルォキシ 表し、 Z1は OCOCH2CH(CH3)2を表し、 Z2は Hを表す力、 Z1と Z2が一緒にな つて =0を表す。ただし、 R\ R2、 R3および R4のうち少なくとも 1つは OHである。）で表される化 合物において、少なくとも 1つの水酸基をァシルォキシに変換し、かつ 3位の炭素にキャリア 一物質を結合させた物質を動物に投与して免疫させ、該免疫動物から採取される抗体産生 細胞と永久増殖細胞とを融合させ、上記（1 )〜（6)項の!/、ずれかに記載のモノクロ一ナル抗 体を生産するハイプリドーマ細胞を得ることを特徴とするハイブリド一マ細胞の製造方法。
(14) 式 (I)の R2がァシルォキシである上記 (13)記載の製造方法。
(15) 式 (I)で表される化合物において、少なくとも 1つの水酸基をァシルォキシに変換した 化合物の 3位の炭素とキャリア一物質との結合力 位の置換基を架橋基とする結合である上 記（13)記載の製造方法。 CT/JP00/06100
(16) 式 (I)で表される化合物において、少なくとも 1つの水酸基を OR (式中、 Rは置換もし くは非置換の低級ァシル基、または置換もしくは非置換の芳香族ァシル基を表す)で表され る基に変換した化合物を有機溶媒以外の溶媒または有機溶媒を含んだ溶媒以外の溶媒に 溶角 したものをキャリア一物質と結合させる上記（13)記載の製造方法。
(17) 有機溶媒以外の溶媒または有機溶媒を含んだ溶媒以外の溶媒が水である上記（1 6)記載の製造方法。
(18) トリコテセン系マイコトキシンを含有する試料に上記（1)〜（6)のレ、ずれかに記載のモ ノクローナル抗体またはそれらの抗体断片の 1つ以上を作用させることを含む免疫学的方法 により、試料中トリコテセン系マイコトキシンの定量を行う方法。
(19) 少なくとも 1つの水酸基を有する式 (I)で表される化合物において、少なくとも 1つの水 酸基を OR (式中、 Rは置換もしくは非置換の低級ァシル基、または置換もしくは非置換の芳 香族ァシル基を表す）で表される基に変換し、これに上記ひ)〜 (6)のいずれかに記載のモノ クローナル抗体またはそれらの抗体断片の 1つ以上を作用させることを含む免疫学的方法 により、試料中トリコテセン系マイコトキシンの定量を行う方法。
(20) トリコテセン系マイコトキシンがデォキシュバレノール（DON)、二バレノール（NIV) および T一 2トキシン (T一 2)ならびにそれらの誘導体からなる群から選ばれるものである上 記（18)または（19)記載の方法。
(21) 上記（3)または (4)記載のモノクローナル抗体またはその抗体断片を用いて上記（1 8)または（19)記載の方法により得られる定量値と上記（5)または（6)記載のモノクローナル 抗体またはそれらの抗体断片を用いて上記（18)または（19)記載の方法により得られる定 量値とを計算することによる、試料中の DON、 NIVおよび T一 2ならびにそれらの誘導体の 総量を定量する方法。
(22) 上記（1)または (2)記載のモノクローナル抗体またはそれらの抗体断片を用いて上 記（18)または（19)記載の方法により、試料中の NIVおよびその誘導体を定量する方法。
(23) 上記 (3)または (4)記載のモノクローナル抗体またはそれらの抗体断片を用いて上 T/JP00/06100 記（18)または（19)記載の方法により得られる定量値から DON、 NIVおよびそれらの誘導 体を定量する方法。
(24) 上記（3)または (4)記載のモノクローナル抗体またはそれらの抗体断片を用いて上 記（18)または（19)記載の方法により得られる定量値と上記（1)または (2)記載のモノクロ一 ナル抗体またはその抗体断片を用いて上記（18)または（19)記載の方法により得られる定 量値とを計算することによる、試料中の DONおよびその誘導体を定量する方法。
(25) 上記（5)または（6)記載のモノクローナル抗体またはそれらの抗体断片を用いて上 記（18)または（19)記載の方法により試料中の T一 2およびその誘導体を定量する方法。
(26) 免疫学的方法が、ラジオィムノアツセィ、ェンザィムィムノアツセィ、蛍光ィムノアッセ ィおよび発光ィムノアッセイカ 選ばれる上記（18)または（19)記載の方法。
(27) 免疫学的方法が、競合法およびサンドイッチ法力^選ばれる上記（18)または（19) 記載の方法。
(28) 上記（1)〜（6)のいずれかに記載のモ クローナル抗体またはそれらの抗体断片の 1種以上を有効成分として含有する、トリコテセン系マイコトキシンの免疫学的定量用試薬。
(29) 上記 (28)記載の試薬および抗原を固相化したプレートを含んでなる、トリコテセン系 マイコトキシンの免疫学的定量用キット。
(30) 上記 (28)記載の試薬、抗原を固相化したプレート、標識された上記（1)〜（6)のい ずれかに記載のモノクローナル抗体ある 、はそれらの抗体断片に反応する抗体あるいは抗 体断片、および該抗体あるいは該抗体断片の標識を検出する試薬を含んでなる、トリコテセ ン系マイコトキシンの免疫学的定量用キット。
(31) 抗原を固相化したプレート、標識された上記（1)〜（6)のいずれかに記載のモノクロ —ナル抗体あるいはそれらの抗体断片、および該抗体あるいは該抗体断片の標識を検出 する試薬を含んでなる、トリコテセン系マイコトキシンの免疫学的定量用キット。
(32) 上記 (28)記載の試薬および式 (I)で表される化合物中の水酸基を OR (式中、 Rは前 記と同義である）で表される基に変換するための検体前処理液を含んでなる、トリコテセン系 100 マイコトキシンの免疫学的定量用キット。
(33) 上記 (28)記載の試薬、抗原を固相化したプレートおよび式 (I)で表される化合物中の 水酸基を OR (式中、 Rは前記と同義である）で表される基に変換するための検体前処理液含 んでなる、トリコテセン系マイコトキシンの免疫学的定量用キット。
(34) 上記 (28)記載の試薬、抗原を固相化したプレート、標識された上記（1) ~ (6)のい ずれかに記載のモノクローナル抗体あるいはそれらの抗体断片に反応する抗体あるいは抗 体断片、該抗体あるいは該抗体断片の標識を検出する試薬および式 (Dで表される化合物 中の水酸基を OR (式中、 Rは前記と同義である）で表される基に変換するための検体前処理 液を含んでなる、トリコテセン系マイコトキシンの免疫学的定量用キット。
(35) 抗原を固相化したプレート、標識された上記ひ）〜（6)のいずれかに記載のモノクロ ーナル抗体あるいはそれらの抗体断片、該抗体あるいは該抗体断片の標識を検出する試 薬おょぴ式 (I)で表される化合物中の水酸基を OR (式中、 Rは前記と同義である）で表される 基に変換するための検体前処理液を含んでなる、トリコテセン系マイコトキシンの免疫学的 定量用キット。
(36) トリコテセン系マイコトキシンを含有する試料を有機溶媒を含有する液で処理して、該 試料からトリコテセン系マイコトキシンを抽出し、上記（18)または（19)記載の方法により、試 料中のトリコテセン系マイコトキシンの定量を行う方法。
(37) 有機溶媒が、水溶性の有機溶媒であることを特徴とする、上記 (36)記載の方法。
(38) 水溶性の有機溶媒が、メチルアルコール、エチルアルコール、プロピルアルコール、 ァセトニトリル、ジメチルスルフォキシドおよびジメチルフオルムアミドからなる群力 ^選ばれる 1種以上であることを特徴とする上記 (36)または (37)記載の方法。
(39) トリコテセン系マイコトキシンを生産する微生物を含有する試料を培地に接種して培 養し、培養物中に生産されるトリコテセン系マイコトキシンに上記（1)〜（6)のレ、ずれかに記 載のモノクローナル抗体またはその抗体断片の 1つ以上を作用させることを含む免疫学的 方法により、試料中のトリコテセン系マイコトキシンを生産する微生物を検出する方法。 (40) トリコテセン系マイコトキシンを生産する微生物を含有する試料を培地に接種して培 養し、培養物中に生産されるトリコテセン系マイコトキシンに上記（1 )〜（6)のいずれかに記 載のモノクローナル抗体またはその抗体断片の 1つ以上を作用させることを含む免疫学的 方法により、試料中のトリコテセン系マイコトキシンを生産する微生物を判別する方法。
1. トリコテセン系マイコトキシンに対するモノクローナル抗体の製造法
本発明のトリコテセン系マイコトキシンに対するモノクローナル抗体の製造法について説明 する。
モノクローナル抗体は、免疫原を投与した動物力 得られる抗体産生細胞と永久増殖細 胞たとえば骨髄腫細胞とを融合させてハイプリドーマ細胞を製造し、該ハイブリドーマ細胞を 培養するか、動物に投与して該動物を腹水癌化させ、該培養液または腹水を分離、精製す ることにより調製することができる。
本発明の抗トリコテセン系マイコトキシンモノクローナル抗体を取得するためには、免疫用 抗原を高分子担体 (キャリアー物質ともいう）に結合して得た複合体を免疫原とすることが必 要である。免疫用抗原は、試料から精製によって取得してもよいし、化学合成方法によって 取得しても構わない。この際のトリコテセン系マイコトキシンはァシル化したものを用いる。こ のァシル化トリコテセン系マイコトキシンの 3位の置換基を架橋基に利用して高分子担体と結 合させ免疫原として用いると本発明の目的とするモノクローナル抗体が効率良く取得でき る。
免疫用抗原としては、上記式 (I)で表される化合物中の水酸基を OR (式中、 Rは前記と同義 である）で表される基に変換した化合物、好ましくは式 (b— 1)
Figure imgf000017_0001
で表される化合物が用 ヽられる。
試料としては、 Fusarium graminearum^ F. culmorum^ F. sporotrichioidesなどの 株を、適 当な培地に接種後、室温付近で 20日間程度培養し、この培養物から適当な方法で精製し て得たものが使用できる。適当な培地とは、例えばポテトデキストロース培地のような市販の 培地を用いてもよいし、精白米を蒸留水を加えて放置浸潤後、オートクレープ滅菌して作製 した培地を用いてもよい。また、精製方法としては、例えば培養物をァセトニトリル Z水 (3 : 1 v/v)などで抽出し、抽出物をフロリジル'無水硫酸ナトリウム重層カラムや、シリカゲル '無水 硫酸ナトリウム重層カラムに通して精製する方法や、再結晶法による精製法が用いられる。 また、実際にカビに汚染された穀物を出発材料として精製し採取しても構わない。精製法も TLCプレートを用いる方法、 HPLCを用いる方法等、色々な手段が取り得るが、 目的物質 が精製できれば特に限定するものではない。もちろん、試料として市販品を購入して用いて ちょレヽ。
高分子担体は免疫用抗原のカルボキシル基、アミノ基、水酸基等と縮合反応を起こす反 応基を有し、かつ免疫用抗原に連結されることにより該化合物に免疫原性を付与し得るか、 該化合物が持つ免疫原性を高める高分子物質であればよい。
具体的高分子物質としては、例えばゥシ血清アルブミン（BSA)、グロブリン、キ一ホ一ルリ ンペットへモシァェン（KLH)、サイログロブリンなどの蛋白質、デキストラン、セファロ一ス等 の多糖類、ポリスチレン、アクリルゴムなどからなるラテックス粒子、ポリゥリジル酸、ポリアデニ ル酸等のポリ核酸、 MAP(multiple antigen peptide)などの合成高分子などがあげられる。トリ コテセン系マイコトキシンにこれら高分子物質を結合させる方法としては、坂戸信夫、免疫実 験操作法、 p.151,右田俊介ら編、南江堂 (1995)に記載のアミノ基を用いる方法 (カルボジィ ミド法、 ダルタルアルデヒド法、ジイソシァネート法）、カルボキシル基を用レヽる方法（活性ェ ステル法、混合酸無水物法、ァシルアジド法）、 SH基を用いる方法（MBS法、 SPDP法）、 水酸基を用いる方法 (ブロムシアン法、過ヨウ素酸酸化法）などが使用できる。これらの方法 においては、有機溶媒もしくは有機溶媒を含む溶液でトリコテセン系マイコトキシンを溶解せ ず水性媒体で溶解することが動物中で十分な抗原性を発揮させる上で重要である。
免疫原を投与する動物としてはマウス、ラット、ハムスター、ゥサギ、モルモット、ャギ、ヒッジ、 ゥマ、ニヮトリなどがあげられ、マウス、ラット、ハムスター等を用いるのが好ましい。
免疫方法としては、西道、豊島、新生化学実験講座 1： 389(1990)、東京化学同人等に記 載の方法を用レ、て行うことができる。例えば免疫原をフロイントの完全または不完全アジュバ ントにェマルジヨン化し、腹腔内、皮下、筋肉内等に投与することにより行われる。例えば、 1 回あたり 1. 0 g〜300 // gの免疫原を 7ないし 30日、好ましくは 12ないし 16日の一定間隔 を置いて 2回以上好ましくは 2回〜 4回投与し、免疫を完成させることができる。
抗体産生細胞の採取源としては免疫した動物の脾臓、リンパ節、末梢血液などが挙げられ る。また免疫を行っていない動物の脾臓、リンパ節、末梢血液等より抗体産生担当細胞を取 り出し、これら細胞に対し直接免疫を行って抗体産生細胞とする所謂 in vitro 免疫（新井、 太田、実験医学、 6:43(1988))を行った細胞を用いても構わない。
抗体産生細胞と骨髄腫細胞との細胞融合を行う際使用する骨髄腫細胞に特に限定はな レ、が、抗体産生細胞と同種の動物由来の細胞株を使用するのが好ましレ、。 また適切に細胞融合が行われた細胞のみを効率よく選択するために、特定の薬物マ一力
—を有する骨髄腫細胞が好ましレ、。例えば 8—ァザグァニン耐性の骨髄腫細胞はヒポキサ ンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含有した培地 (HAT培地）中では生育できないが、こ の細胞と正常細胞とが融合した細胞は HAT培地中で生育できるようになり、未融合の骨髄 腫細胞と区別できることから好んで使用される。具体的には P3 X 63— Ag、 P3 X -Ag8- Ul、 SP2/0—Agl4などが挙げられる。これら骨髄腫細胞は理化学研究所細胞開発銀 行力ら入手できる。
細胞融合は Kohlerと Milstein (Nature, 256: 495(1975))によって開発され、急速に発展し、 様々に改良されてきた方法が応用できる。良く用いられる方法としては抗体産生細胞と骨髄 腫細胞を 10〜3： 1の割合で混合し、 30〜50%のポリエチレングリコール（平均分子量 150 0-6000)を融合剤に用いて処理する方法がある。また電気パルスによる融合も行われるこ とがある（大河内ら、実験医学、 6: 50(1988))。
細胞融合を終えた細胞は選択培地に浮遊させ、 96ゥエル培養プレートのような目的細胞 選択に有利な培養容器を用いて融合細胞のみを生育させる。
選択培地とは、ある特定の薬物マーカー等を有する細胞のみが選択的に生育できる培地 をいう。例えば前述の抗体産生細胞と P3 X 63— Ag骨髄腫細胞を融合し、細胞融合が行わ れた細胞のみを効率良く選択する場合には、骨髄腫細胞が 8—ァザグァニン耐性であること を利用して、 HAT選択培地（1 X 10一4 mol/Lヒポキサンチン、 4 X 10一7 mol/Lアミノプテリン、 2 X 10一5 mol/Lチミジンを含む 10%FCS加 RPMI― 1640培地）などが用レ、られる。
融合細胞のみが選択的に生育した段階で、 目的物質に対する抗体を産生している細胞の みを選択する。この選択は融合細胞の培養上清中の目的抗体の有無を、例えばェンザィム ィムノアツセィゃラジオィムノアッセィなどの方法を用いて調べて行う。選択された細胞をたと えば限界希釈法ゃ軟寒天培地法などを用いて単クローン化し、モノクローナル抗体産生ノ、 イブリドーマ細胞株を得る。
モノクローナル抗体はハイプリドーマ細胞株を適当な培地で培養してその培養液を回収し、 あるいは細胞株を動物の腹腔内に移植して腹水中で増殖させて腹水を回収し、それら培養 液または腹水から得ることができる。培養液あるいは腹水中の抗体は必要に応じて精製して 使用することができる。精製方法としては例えば硫酸アンモニゥムを用いた塩析分画法、ィ オン交換クロマトグラフィー法、ゲル濾過カラムクロマトグラフィー法、プロテイン Aやプロティ ン Gを用いたァフィ二ティカラムクロマトグラフィー法、抗原を固相化したゲルを用いるァフィ 二ティカラムクロマトグラフィー法などの方法が単独または組み合わせて用いられる。
上記方法により、抗トリコテセン系マイコトキシンモノクローナル抗体を得ることができる。得 られる具体的モノクローナル抗体としては、 KTM— 205、 KTM— 240および KTM— 249 と名づけたモノクロ一ナル抗体があげられる。
モノクローナル抗体 KTM— 205は、式 (II)で表される化合物に対し親和性を有し、その親 和性の程度が化合物 1— 1、化合物 1一 2および化合物 1一 3において、化合物 1一 1 >化合 物 1一 2 >化合物 1—3の順で高ぐかつ式 (A)または (B)で表される化合物とは実質的に反 応しなレ、モノクローナル抗体である。
モノクローナル抗体 KTM— 240は、式 (III)で表される化合物に対し親和性を有し、その親 和性の程度が化合物 2— 1、化合物 2— 2および化合物 2— 3におレ、て化合物 2 - 1 >化合 物 2— 2〉化合物 2— 3の順で高ぐかつ式 (C)で表される化合物とは実質的に反応しない モノクローナル抗体である。
モノクローナル抗体 KTM— 249は、式 (IV)で表される化合物に対し親和性を有し、その親 和性の程度が化合物 3 - 1および化合物 3 - 2におレ、て、化合物 3 - 1 >化合物 3— 2の順 で高ぐかつ式 (D)で表される化合物とは実質的に反応しないモノクローナル抗体である。 2.トリコテセン系マイコトキシンの定量方法
トリコテセン系マイコトキシンを含有する試料中に含まれるトリコテセン系マイコトキシンの定 量方法としては、トリコテセン系マイコトキシンを免疫学的方法により測定できればレ、かなるも のでもよいが、本発明のモノクローナル抗体またはそれらの抗体断片を用いた免疫学的方 法により、トリコテセン系マイコトキシンを定量する方法が好ましレ、。 マイコトキシンを含有する試料としては、作物、該作物の加工品、該作物を圃場する環境 要因など、マイコトキシンが含有している可能性を有する物質すベてを包含する。
作物としては、農作物であればレ、かなるものも包含するが、米、麦類、豆類、トウモロコシ、 芋類などがあげられる。作物は、該作物が田畑などの圃場に植生するものであっても、市場 に存在するものであってもよぐその存在場所は問わなレ、。
作物の加工品としては、上記作物を原料として加工された飲食品であればレ、かなるものも 包含する。
また、家畜のための食用品であるいわゆる飼料、飼料を摂取するブタ、ゥシ、鶏などの家 畜の肉、乳、卵、またはそれらの加工品もマイコトキシンを含有する試料に包含される。 作物を圃場する環境要因としては、作物の環境を構成する諸要素力 'あげられる。具体的 には、水分、土壌、などの無機的要因、無機的要因に付着して生息する微生物、およぴ空 気中に浮遊する微生物の胞子、植物の切り株などの有機的残渣などがあげられる。
上述したマイコトキシンを含有する試料のほとんどは固形物である。したがって、試料から マイコトキシンを抽出する必要の無い場合を除いては、試料からマイコトキシンを回収し、通 常免疫学的定量法にぉレ、て扱レ、やすレ、液体試料とする前処理工程を含んでもょレ \前処 理工程にっレ、て以下に述べる。
マイコトキシンの回収は、トリコテセン系マイコトキシンを含有する試料をそのまま、または細 分化したのちに、試料に有機溶媒を作用させて、マイコトキシンを抽出させ、抽出液を回収 することにより ί亍うことができる。
試料を細分化する方法としては、マイコトキシンが分解されたり、消失しなければ、いかな る方法を用いてもよいが、乳鉢と乳棒などを用いてすりつぶす方法、超音波、ミル、ハンマー などを用いて摩砕する方法、刃を用いて細力べ剪断する方法などがあげられる。
上記方法により細分化された試料、またはそのままの形態の試料を有機溶媒を作用させる 方法としては、直接、有機溶媒に試料を浸漬する方法があげられ、また抽出効率をあげるた めの操作として、攪拌操作、超音波処理などがあげられる。 T/JP00/06100 有機溶媒としては、有機溶媒であればいかなるものでもよいが、好ましくは水溶性の有機 溶媒、例えばメチルアルコール、エチルアルコール、プロピルアルコール、ァセトニトリル、ジ メチルスルフォキシドおよびジメチルフオルムアミドなどがあげられる。有機溶媒の含量として は、全抽出溶液量の 25%以上、好ましくは 50%以上、さらに好ましくは 75°/0以上である。 有機溶媒で抽出されたトリコテセン系マイコトキシンは、有機溶媒を揮発させて抽出させた り、抽出液をカラムに通塔させることにより、回収すること力 sできる。
さらに本発明の前処理工程には、トリコテセン系マイコトキシンの一部を別の誘導体に変換 する工程を含んで 、てもよレ トリコテセン系マイコトキシンの一部を別の誘導体に変換する 工程としては、部分ァシル化、好ましくは部分ァセチル化があげられる。以下、ァセチル化に ついて説明する。
ァセチル化は、化合物に適当な溶媒を加えて溶解し、無水酢酸および塩基を加えて反応 させることにより行われる。溶媒としては、ジクロロメタン、クロ口ホルムなどのハロゲン系有機 溶媒、ジェチルエーテル、 DMF DMSO、ジクロロメタンなどの無水酢酸とは反応しない一 般的な溶媒などを用いることができる。
塩基としては、ピリジン、トリェチルァミンなどの有機塩基、重曹、炭酸カリウムなどの無機塩 基を用いることができる。このうち、ピリジンは塩基と溶媒とを兼ねることができるので好適で ある。
部分ァセチルイヒにおレ、て目的の部位のみをァセチル化するためには、無水酢酸の濃度、 反応温度および反応時間を調節することが必要となる。また、その際には、ァセチル化の前 に試料を十分に乾固させ、反応温度は高温にならないこと、さらには一定温度に保って反 応させ、かつ反応時間も一定にするのが望ましい。
さらに、反応を規定の時間以上に反応させないためには反応を適当な時間後強制的に終 了させる必要がある。
無水酢酸の濃度は、試料乾固物の重量に対し、 0. 1倍力ら 10000倍、好ましくは 0. 5から 10倍程度であるが、加える有機溶媒量に応じて調節が必要である。 0 反応温度は氷冷下から用レ、た溶媒の沸点まで用レ、ること力;できる力;、望ましくは 30°Cから 50°C程度、さらに好ましくは 45°Cである。ただし、これらァセチル化条件は目的を達し得る のであれば、特に限定する必要はない。代表的な例は乾固した試料力 s20mgである場合に ピリジン 50 μ Lと無水酢酸を 25 μ L加え、反応温度 45°Cのとき、反応時間 45分間程度が好 ましい。
反応は反応開始後直ちに終了させても構わないし、場合によっては 1週間程度かけても構 わないが、操作性を考盧すれば 1時間以内が好ましい。強制的な反応終了の手段としては、 塩基と無水酢酸を除去する方法、またはアルカリを添加する方法のいずれでもよい。塩基と 無水酢酸は揮発させることにより、直ちに除去することができる。添加するアルカリとしては、 好ましくは重曹水があげられる。
しかし、これらァセチルイヒ条件は目的を達し得るのであれば、特に限定する必要はない。 上述したトリコテセン系マイコトキシンを含有する試料のうち、作物を圃場する環境要因な どトリコテセン系マイコトキシンを生産する微生物が含有されている可能性のある試料につい ては、有機溶媒による抽出工程や部分ァセチル工程のどちらか、または両方を行わなくても、 直接培養用培地に接種して微生物を増殖させることにより、培地中に生産される式（π )、式
(ΠΙ)および式 (IV)で表される化合物を免疫学的方法を用いて定量することができる。また、 試料を一且駒田培地（K2HP04 lg, KC1 0.5g, MgS04-7H20 0.5g, Fe-EDTA O.Olg, L-ァス パラギン 2g、 D-ガラクトース 20g、ペンタクロロニトロベンゼン 75%水和剤 lg、 コ一ル酸ナ トリウム 0.5g、 NaB4O7' 10H2O lg, 硫酸ストレプトマイシン 0.3g、寒天 15g、 蒸留水 1000mし、 pH3.8- 4.0)などの選択培地に接種後、培地上で増殖した微生物の選択を行った 後に培養用培地に接種して、培地中に生産される式（Π )、式（ΙΠ )および式 (IV)で表される 化合物を免疫学的方法を用いて定量することもできる。
また、空中に浮遊する微生物を捕獲する場合には、駒田培地を入れたシャーレを地上約 90cmの位置に設置し、一定時間シャーレを解放して胞子を捕獲し、このシャーレを室温 (2 0〜25°C)で一週間程度培養し、出現したコロニーを検体とすることもできる。 00 培養用培地は、微生物が増殖するのであればいかなるものでもよいが、具体的には精白 米をオートクレープ可能な容器に入れ、これに一定量の蒸留水で一定時間放置して浸潤さ せてから、ォ一トクレーブにかけて滅菌したものが好適に使用できる。蒸留水は、精白米量 の 1倍〜 10倍の量が好まし 放置時間は、 15分〜半日程度が好ましい。
本突明の免疫学的方法としては、任意の公知の免疫学的方法があげられる。
具体的には、標識物に放射性同位体を用いるラジオィムノアツセィ、酵素を用いるェンザ ィムィムノアツセィ、蛍光体を用いる蛍光ィムノアツセィ、発光体を用いる発光ィムノアッセィ など各種高感度免疫定量法があげられる。
免疫学的方法とは、上述した各種標識を施した抗原または抗体を用いて、抗体量または 抗原量を測定する方法である。本発明の免疫学的方法としては、抗原の検出または測定を 行う公知の方法であればレ、かなる方法でもよ！/、が、競合法やサンドイッチ法がもっとも適合 する方法である。
これら方法には種々の変法があるが、例えば競合法としては、（1)抗体または抗体断片と の結合を、標識された抗原と試料中あるレ、は標準物質中の抗原との間で競合させる方法、 (2)標識された抗体または抗体断片との結合を、液相試料中あるいは標準物質中の抗原と 固相化された抗原との間で競合させる方法、（3)固相化された抗体または抗体断片との結 合を、標識された抗原と試料あるいは標準物質中の抗原との間で競合させる方法などがあ げられる。
サンドイッチ法にはビーズ、チューブ、プレートなどの適当な固相に抗体または抗体断片を 結合させた 1次固相抗体と標準物質や試料中の抗原とを反応させ、次に固相抗体 (または 抗体断片）と結合した抗原と 2次抗体ほたは抗体断片）とを反応させ、得られる固相抗体 (ま たは抗体断片） -抗原一 2次抗体ほたは抗体断片）の 3者複合体の形成をなんらかの方法 で検出するのが一般的である。検出方法は 2次抗体 (または抗体断片）を種々物質で標識し ておき、この標識物質を検出する方法が一般的で、標識物質として放射性同位体、酵素、 蛍光体、発光体、金属などさまざまなものが用いられる。これらの方法は溶液内に存在する 抗原を測定するのに主に用いられている方法である力 さらに組織中、細胞内、ニトロセル 口一ス膜ゃナイロン膜などの検査用濾過膜上に存在するトリコテセン系マイコトキシンを定性 的あるいは定量的に検出することも可能である。
本発明はトリコテセン系マイコトキシンの免疫学的定量用試薬またはキットを提供する。キッ トとは、機器または試薬の組み合わせにより構成されるが、以下に述べる各構成要素と本質 的に同一、またはその一部と本質的に同一な物質が含まれていれば、構成または形態が異 なっていてもよい。
本発明の免疫学的定量用試薬には、本発明のモノクローナル抗体またはその抗体断片を 有効成分として含有する。また、ァシル化工程を必要とする試料を測定する場合、本発明の キットには、式（I)で表される化合物中の水酸基を OR (式中、 Rは前記と同義である）で表さ れる基に変換するための検体前処理液と本発明のモノクローナル抗体またはその抗体断片 とを含む。
また、必要に応じて、試料の希釈液、定量用プレート、 2次用標識体抗マウス抗体、標識体 の検出用試薬、標準物質なども上記の本発明の免疫学的定量用キットに含まれる。
試料の希釈液としては、界面活性剤、緩衝剤などに BSAやカゼインなどのタンパク質を含 む検体液を用いることができる。定量用プレートとしては、ポリスチレンなどの材質でできた 9 6ゥェルのマイクロタ一プレートに抗原等を固相化したものが用いられる。 2次用標識体抗マ ウス抗体としては、ゥサギ抗マウスィムノグロブリンズ抗体等の、本発明の抗トリコテセン系マ ィコトキシンモノクローナル抗体または抗体断片に親和性を有する抗体に西洋ヮサビペルォ キシダーゼ（HRP)ゃゥシ小腸アルカリフォスファタ一ゼ、 β一ガラクトシダーゼなどの標識用 酵素をラベルしたものに、緩衝剤、 BSAやカゼインなどのタンパク質、防腐剤などを混合し たものが用いられる。標識体の検出用試薬としては前記の標識用酵素に応じて、例えば西 洋ヮサビペルォキシダーゼであれば、テトラメチルベンジジンやオルトフエ二レンジァミンなど が主な構成要素となる。また本発明の試薬において、本発明の抗トリコテセン系マイコトキシ ンモノクローナル抗体またはその抗体断片には直接標識酵素でラベルされたものを用いて P麵 6100 もよい。さらに、本発明の免疫学的定量用キットを構成する場合には、列記した各構成要素 を全て含む必要はなぐまた新たな構成要素を付加しても構わなレ、。
3.トリコテセン系マイコトキシンを生産する微生物の判別方法
トリコテセン系マイコトキシンを生産する微生物を含有する試料としては、作物を圃場する 環境要因、すなわち、水分、土壌、空気、空気中に浮遊する胞子、植物の切り株などの有機 的残渣などがあげられる。
トリコテセン系マイコトキシンを生産する微生物は、圃場に残存する植物、例えばイネ切り 株などの有機物残渣に子のう殻を形成する。降雨、多湿などの環境条件が満たされると、子 のう胞子が空中に飛散し、開花、登熟中の穀類に伝染する。
したがって、圃場のトリコテセン系マイコトキシンを生産する微生物による汚染状態と、該 微生物のマイコトキシン生産能を明らかにすることは、マイコトキシン被害の発生を予測し、 その対策を講じる上で極めて重要である。
トリコテセン系マイコトキシン生産株は、その微生物株を培地内で培養すると、培地内に式
( π )、式（m)または式 (IV)で表される化合物を含むトリコテセン系マイコトキシンを特異的 に生産する。トリコテセン系マイコトキシンの種類および産生量は、トリコテセン系マイコトキシ ンを生産する微生物株により異なる。
したがって、試料を培養した培地内にこれらの化合物が存在することを前記 2記載の免疫 学的方法を用いて検出することにより、試料中にトリコテセン系マイコトキシンを生産する微 生物が存在することが確認することができる。さらに、前記 2記載の免疫学的方法を用いて、 微生物株が産生するトリコテセン系マイコトキシンの種類を検出し、またトリコテセン系マイコ トキシンの定量をすることにより、生産されるトリコテセン系マイコトキシンの種類により微生物 株を判別することができる。
さらに、圃場に存在するトリコテセン系マイコトキシンを生産する微生物の種類を前記 2記 載の免疫学的方法で判別することにより、圃場の環境汚染の状態も知ることができる。
上述の試料は、直接培養用培地に接種して微生物を増殖させ、培地内の式（π )、式 (in)または式 (iv)で表される化合物を測定して、トリコテセン系マイコトキシンを生産する微 生物による汚染を検出する。さらに、一旦駒田培地（K2HP04 lg, KC1 0.5g, MgS04-7H20 0.5g, Fe-EDTA O.Olg, L-ァスパラギン 2g、 D-ガラクト一ス 20g、ペンタクロロニトロべンゼ ン 75%水和剤 lg、 コール酸ナトリウム 0.5g、 NaB4O7' 10H2O ig、 硫酸ストレプトマイシ ン 0.3g、寒天 15g、 蒸留水 1000mL、pH3.8-4.0)などの選択培地に接種し、培養を行つ た後、これを培養用培地に接種して、培地中に産生される式（Π )、式（HI)または式 (IV)で 表される化合物を測定し、微生物の汚染を検知しても力まわなレ、。また、空中に浮遊する菌 を捕獲する場合には、駒田培地を入れたシャーレを地上約 90cmの位置に設置し、一定時 間シャーレを解放して胞子を捕獲し、このシャーレを室温 (20〜25°C)で一週間程度培養し、 出現したコロニーを利用すると便利で良レヽ。
培養用の培地は、様々なものが利用できる力 たとえば精白米をオートクレープ可能な容 器にいれ、一定量の蒸留水で一定時間放置して浸潤させてから、オートクレープにかけて 滅菌したものが好適に使用できる。
図面の簡単な説明
第 1図は、 KTM— 205を用いたトリコテセン系マイコトキシン定量系の検量線を示す。
第 2図は、 KTM— 240を用いたトリコテセン系マイコトキシン定量系の検量線を示す。
第 3図は、 KTM— 249を用いたトリコテセン系マイコトキシン定量系の検量線を示す。
第 4図は、 KTM— 240と KTM— 249を用いたトリコテセン系マイコトキシン定量系の検量 線を示す。
第 5図は、本発明の ELISA法によるトリコテセン系マイコトキシンの定量値と同一試料を G C一 MSで定量したときの定量値との相関を示す。
第 6図は、米培地に . graminearumを接種し培養した培地中のトリコテセン系マイコトキシ ンを、 KTM— 240を用いて測定した結果を示す。
第 7図は、各圃場の稲株より分離した菌株を培養した培地中のトリコテセン系マイコトキシン の測定結果を示す。 100 発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を実施例を用いて説明する。
実施例 1 (モノクローナル抗体の製造）
a)各種化合物
式 (a— 1)
Figure imgf000028_0001
の化合物はシグマ社製の N7769を、
式 (a - 2)
Figure imgf000028_0002
の化合物はシグマ社製の T4887を用いた。
b)免疫用抗原の調製
式 (a— 1) : 4， 15- diacetylnivalenolおよび式（a— 2) :T— 2の化合物 50mgをそれぞれ 7mL 容のねじ栓付試験管にとり、乾燥ピリジン lmLと酸無水物 35mgを加えた後、 Metal Block Bath (ャマト科学 (株）、 YH- 121)で 100°C、 3時間反応させた。反応物を濃縮乾固してピリジ ンを除去し、クロ口ホルム 4mLを加えて水洗（lmL X 4回）した後、クロ口ホルム層を無水硫 酸ナトリウムで脱水した。得られる溶液をシリカゲル薄層クロマトグラフィー、ガスクロマトグラ フィ一およびガスクロマトグラフィー質量分析（GC— MS)にかけ、式 (b— 1) : 4, 15 - diacetylnivalenol 3-hemisuccinate および式 (b— 2) : T- 2 3 - hemisuccinateのィ匕合物の存在を 確認した後、この溶液を減圧下濃縮乾固した。
式 (b— 1)および (b— 2)の化合物を含む上記濃縮乾固物 0· 5mgを、それぞれ 140mMNa C1を含む 50 // Lの 10mM リン酸緩衝液 pH7. 4 (以下 PBSと略記する）に溶解した。溶解 を助けるため、上記緩衝液に TritonX— 100を 0. 01 %加え、さらにプローブ型の超音波発 生装置 (モデル UR— 200P、トミ一精ェ社)で溶解を捕助した。溶解液をキ一ホールリンぺ ットへモシァニン（以下 KLHと略記する）水溶液（20mgZmL) 0. 5mLと混合した。混合液 の pHを 7· 5に合わせた後、 20mgの EDC[ 1—ェチル— 3—（3—ジメチルァミノプロピル） カルポジイミド]を加え、室温で 6時間反応させた。反応終了後 PBSに対し透析をおこない、 透析物をトリコテセン系マイコトキシン誘導体 [式 (b—l)]—KLH水溶液およびトリコテセン 系マイコトキシン誘導体 [式 (b— 2)]— KLH水溶液とした。水溶液中のタンパク質濃度をゥシ 血清アルブミン（以下 BSAと略記する）をスタンダードとしてし owry法タンパク質定量試薬キッ ト (Bio - Rad社)で定量した。 KLHに代えて BSAを用いる以外は、上記と同様の方法でトリコテ セン系マイコトキシン誘導体 [式 (b— 1)]—BSAコンジュゲート溶液およびトリコテセン系マイ コトキシン誘導体 [式 (b— 2)]— BS Aコンジュゲ一ト溶液も調製した。
c)モノクローナル抗体の調製
6週令の雄 Balb cマウスの背中皮下にフロインドの完全アジュバントと等量混合したトリコ テセン系マイコトキシン誘導体 [式 (b—1)または式 (b— 2)]— KLHを 0. lmgZ匹投与した。 以後該等量混合物 O.lmg/匹を背中皮下に 3週間毎に 2回投与し、その 3週間後、尾静脈 より PBSに溶解したトリコテセン系マイコトキシン誘導体 [式 (b— 1)または式 (b― 2)]一 KLH を 0. lmgZ匹投与し、 3日後に抗体産生細胞を下記のとおり脾臓より採取した。
免疫動物力 脾臓を無菌的に摘出し、血清を含まなレ、RPMI— 1640培地（日水製薬）中 にて解し、 100メッシュの網を通過させて単独細胞化し、低張液中に懸濁し赤血球を溶解し た後、血清を含まなレ、RPMI— 1640培地で 3回遠心洗浄し抗体産生細胞を得た。
一方マウスミエ口一マ細胞 P3X— Ag8— U1を 10%牛胎児血清（FCS)加 RPMI— 1640 培地で培養して対数増殖期で細胞を回収し、血清を含まない RPMI— 1640培地で 3回遠 心洗浄した。
上記のとおり得られた抗体産生細胞懸濁液とマウスミエローマ細胞 P3X_Ag8— U1懸濁 液を 10 : 1の比率で混合し、 1200rpmで 5分間遠心分離し、培養液を取り除いた。残った細 胞に 50%ポリエチレングリコール 1500液（ベーリンガ一'マンノ、ィム社） lmLをゆっくり加え、 さらに血清を含まない RPMI— 1640培地 50mLを徐々に加えてから 1200rpmで 5分間遠 心分離して培地を取り除き、残った細胞を HAT培地（1 X 10—4Mヒポキサンチン、 4 X 10一7 Mアミノプテリン、 2 X 10—5Mチミジンを含む 10%FCS加 RPMI— 1640培地）に 1 X 106細 胞 ZmLとなるよう懸濁し、懸濁液を 96ウェルマイクロタイタ一プレートに各ゥエル 200 μ Lず つ分注した。細胞はこのままの状態で炭酸ガスインキュベータ一にて 5%炭酸ガスを含む空 気中、 37°Cで培養した。 10日後全ゥエル ί 、イブリドーマのコロニーが観察された。
目的抗体を産生してレ、る細胞を含むゥエルを選択する目的で、下記のとおり培養上清中 の抗体価を ELISA法で定量した。 96ウェルマイクロタイタ一プレートに 50 Lのトリコテセン 系マイコトキシン誘導体 [式 (b—1)または式 (b— 2)]— BSAコンジュゲート溶液 (20 /z g/m L 0. 1M炭酸緩衝液 pH9. 5)を分注し、 4°Cで一夜静置した。プレートを PBSで 3回洗 浄した後、 1%BSAZPBS溶液 250 / Lを分注して室温で 1時間静置し、 PBSで各ゥエルを 3回洗浄して反応用プレートとした。反応用プレートに 0. 1 %の BSAを含む PBSで 11倍に 希釈した培養上清 50 / Lを入れ、室温で 3時間静置反応させた。反応終了後プレートを 0. 050/。Tween20を含む PBSで 5回洗浄した後、 50 μ Lのペルォキシダ一ゼ（POD)標識一 抗マウスィムノグロブリンズ—ゥサギ IgG (ダコ社)を加え、室温で 1時間反応させた。反応後 プレートを 0. 05%Tween20を含む PBSで 5回洗浄した後、 50 μ Lの TMB発色試薬溶液 (インタ一ジヱン社)を加え、 30分間室温で反応させ、最後に 50 M Lの ImolZL硫酸水溶 液を加え、マイクロプレートリーダ一（MTP— 120、コロナ電気）で 450nmの吸光度を測定 した。 1. 0以上の吸光度を示したゥエルの細胞を選択した。
クローニングは限界希釈法でおこなった。上記で得られたゥエル内の細胞を 1 X 107個 mLの胸腺細胞を含む 10%FCS加 RPMI— 1640培地にて 0. 5個 ZmLになるよう希釈し、 96ウェルマイクロタイタ一プレートの各ゥヱルに 200 μ L分注し、 5%炭酸ガスインキュベータ 一にて 37°Cで培養を行った。培養開始 10〜14日後に各ゥエルを観察し、生育コロニーが 1 個 ウエルのゥエルを選び出し、その培養上清中抗体価を上記 ELISA法にて定量し、目的 抗体を産生している細胞株を含むゥエルを選択した。さらに同様の操作を 2回繰り返し、安 定して目的抗体を産生するモノクローナル抗体産生細胞株を得た。得られた株が産生する 抗体の免疫グロブリンクラスをモノクローナル抗体タイピングキット（ザィメット社)を用い、培 養上清中の抗体について同定し、産生抗体が IgG3または IgMのものは除き、 IgGlタイプ のものを採取した。
8週令以上の雄 BalbZcマウスの腹腔内に 0. SmLZ匹のプリスタン（2, 6, 10, 14—テト ラメチルペンタデカン)を注入し、 2週間飼育した。
このマウスに 1 X 106Z匹のモノクローナル抗体産生細胞を腹腔内接種した。
7〜14日後、マウス腹腔に十分腹水が貯留した時点で、腹腔から 18Gの注射針を用いて 腹水を回収し、 3000rpmで 10分間遠心分離して上清を回収した。この上清を結合緩衝液 (3M NaCl、 1. 5Mグリシン pH8. 9)で 3倍に希釈し、結合緩衝液で平衡化したプロティ ン Aカラムに通液した。カラムを PBSで洗浄した後、 50mMグリシン/ HC1緩衝液（PH2. 5) で抗体を溶出した。溶出液は 1Mリン酸緩衝液 (pH7. 5)で直ちに中性化した。回収した抗 体液を PBSに対して十分透析を行レ、、精製モノクローナル抗体を含む液を得た。
実施例 2 (抗体の特異性検討）
96ウェルマイクロタイタ一プレート (ヌンク社）に の実施例 1で作製したトリコテセン系 マイコトキシン誘導体 [式 (b— 1)または式 (b—2)]— BSAコンジュゲート溶液（20/ gZmL 0. 1M炭酸緩衝液 pH9. 5)を分注し、 4°Cで一夜静置した。プレートを PBSで 3回洗浄し た後、 1%BSA/PBS溶液 250 // Lを分注して室温で 1時間静置し、 PBSで各ゥヱルを 3回 洗浄して反応用プレートとした。該反応用プレートに、種々濃度の各種トリコテセン系マイコト キシン誘導体を加えた 0. 1 %BSAカロ 0. ImolZLリン酸緩衝液（ρΗ7· 4)または 0. 1 %BS A加 0· ImolZLリン酸緩衝液（pH7. 4)のみ（コントロール：阻害 0%)を 50 μ L加え、これ に、実施例 1で取得した抗体を 0. 1 %BSA加 0. lmol Xリン酸緩衝液 (pH7. 4)で 100η gZmLに希釈したものをプレートを撹拌しながら 50 L分注、混合して 4°Cで一夜静置反応 させた。反応終了後プレートを 0. 05%Tween20を含む PBSで 5回洗浄した後、 POD標識 ー抗マウスィムノグロブリンズ—ゥサギ IgGを 50 L加え、室温で 1時間反応させ f o反応後 プレートを 0. 05%Tween20を含む PBSで 5回洗浄した後、 50 // Lの TMB発色溶液 (イン タージェン社）を加え、 30分間室温で反応させ、最後に 50 しの反応停止液を加え、マイク 口プレートリーダ一で 450nmの吸光度を測定した。各抗体の各種トリコテセン系マイコトキシ ンに対する反応性は、反応に用いた各種トリコテセン系マイコトキシンの濃度 吸光度曲線 を作成し、コントロールの吸光度を 100%としたときの、各種トリコテセン系マイコトキシン誘 導体の反応阻害率から相対決定した。この結果をもとに、実施例 1で確立したモノクローナ ル抗体産生株から目的に適ったものを選択し、それぞれの産生株および産生モノクローナ ル抗体を KTM— 205、 KTM— 240、 KTM— 249と命名した。選択の基準は、実施例 1で 示した抗体産生株の内、 KTM— 205は式 (II)で示す化合物による阻害が最も低濃度で得ら れ、かつ式 (A)または (B)に示す化合物には実質阻害されないものとし、 KTM— 240は式 αιι)で示す化合物による阻害が最も低濃度で得られ、かつ式 (C)で示す化合物には実質阻 害されないものとし、また ΚΤΜ— 249は式 (IV)で示す化合物による阻害が最も低濃度で得 られ、かつ式 (D)で示す化合物には実質阻害されないものとした。各抗体の特異性を第 1表 に示した。
第 1表 各抗体の反応性
Figure imgf000033_0001
注） 最も反応した物質との反応性を 1とした時の相対反応性で表現した
* ：実質的に反応性が確認出来ない これら抗体を生産するハイブリドーマ細胞はそれぞれ KTM— 205 (FERM BP— 683 5)、 KTM— 240 (FERM BP— 6836)、 KTM— 249 (FERM BP— 6837)として、平成 11年 8月 11日付けで工業技術院生命工学工業技術研究所、 日本国茨城県つくば巿東 1丁 目 1番 3号 (郵便番号 305— 0046)に寄託されている。 実施例 3 (試料中のトリコテセン系マイコトキシンの定量） a)反応用プレート
96ウェルマイクロタイタ一プレートに 50 / Lの実施例 1で作製したトリコテセン系マイコトキ シン誘導体 [式 (b— 1)または式 (b— 2)]— BSAコンジュゲート溶液（20 /i gZmL 0. 1M炭 酸緩衝液 PH9. 5)を分注し、 4°Cで一夜静置した。プレートを PBSで 3回洗浄した後、 1 % BSA/PBS溶液または 1 %スキムミルク /PBS 300 μ Lを分注して室温で 1時間静置し、 Ρ BSで各ゥエルを 3回洗浄して反応用プレートとした。
b)定量用試料調製
収穫産地の異なる粉末ムギ（各々 1 Og)にメタノール Z水（3 : 1) 40mLを加え、 90分間 時々攪拌しながら室温で静置して抽出した。抽出液を濾紙にて濾過し、濾液を回収した。濾 液 2mLに等量のメタノールを加え、 4°Cで 4時間静置し、その後 4°C、 3000rpm、 15分間遠 心分離して上清を回収し、 4°Cに保存した。
保存溶液 160 μ Lを lmL容キャップ付きチューブに取り、気流下で濃縮、乾固し、さらに 真空デシケータ内に一昼夜置き、完全に乾固させた。チューブに乾燥ピリジン 50 / Lを添 加し、乾固物を完全に溶解させさらに無水酢酸 25 μ Lを加えた後、チューブを密栓し、 4 5°Cで 45分間静置した。気流下でピリジンと酢酸を完全に揮発させた後、エタノール 100 L及び丁 6611—？83溶液（0. 05%Tween— 20、 140mM NaClを含む 10mMリン酸緩 衝液 pH7. 4) 900 /i Lを加え、これを定量用試料とした。同様の操作で、 NIV、 DON、 T —2の標品を上記同様処理し、さらに適当濃度となるよう Tween— PBS溶液で希釈して希 釈系列を作製し、スタンダード溶液とした。
c)測定操作
反応用プレートの各ゥエルに定量用試料、各スタンダード溶液またはコントロールとして Tw een—PBS溶液（0. 05%Tween— 20および 140mMNaClを含む 10mMリン酸緩衝液 p H7. 4)を 50 /x LZゥエル加え、さらに各ゥエルに① KTM— 205溶液（SOOngZml^ 0. 1%BSAカ卩 丁 6611—？83溶液）、または@10^[— 240溶液（3001¾ /111レ 0. 1%BS A加 Tween— PBS溶液）、または③ KTM— 249溶液（300ngZmL、 0. 1 %BSA¾H Tween— PBS溶液）、または②と③の等量混合液を 50 μ L/ゥエル加え、十分攪持した後、 振とう攪拌しながら室温で 45分間反応させた。プレートを Tween— PBS溶液で 5回洗浄し た後、各ゥエルに 100 μ Lノウエルの HRP標識ー抗マウスィムノグロブリンズーゥサギ抗体 溶液（300ngZmL 0. 1。/。BSA力 [J Tween— PBS溶液）を加え、振とう攪拌しながら室温 で 30分間反応させた。プレートを 5回 Tween— PBS溶液で洗浄した後、 100 / Lの TMB 溶液 (インタージユン社)を加え、振とう攪拌しながら室温で 30分間喑所反応させ、反応終了 後 lmol/L硫酸水溶液をゥエル当たり 50 / L加えて反応を停止し、プレートリーダ一（コロ ナ電気社、 MTP- 120)で波長 450nmの吸光度を測定した。 d)濃度算出 測定結果を以下の式に当てはめ各反応ゥエルの阻害率を算出した。コント口—ル吸光度と は、試料溶液やスタンダード溶液の代わりに Tween— PBS溶液 (0. 05%Tween— 20、 1 40mM NaClを含む 10mMリン酸緩衝液 ρΗ7· 4)のみを用いたゥエルの吸光度を示す。
(コント口 -<
阻靜（％)： X I 0 0
(コントロー 雄
スタンダードの濃度を対数で X軸に、それに該当する上記阻害率結果を γ軸にとり、検量 線を作成した。それぞれの検量線を図 1、 2、 3および 4に示す。この検量線を用レ、、各試料 の阻害率結果を検量線に適用し、各試料のそれぞれのトリコテセン系マイコトキシンの濃度 を以下の方法で算出した。
MVおよびその誘導体の濃度は KTM— 205反応ゥエルから算出し、 NIV、 DONおよび それらの誘導体濃度は KTM— 240反応ゥエル結果から算出し、 DONおよびその誘導体 濃度は KTM— 240反応ゥエル結果から KTM— 205反応ゥエル結果を減ずることで算出し た。 T— 2およびその誘導体濃度は KTM— 249反応ゥエル結果より算出した。 NIV、 DON, T-2およびそれらの誘導体の総濃度は KTM— 240反応ゥエル結果と KTM— 249反応ゥ エル結果との合計より算出した。
実施例 4 (比較例: GC— MSによる測定） 実施例 3で用いた試料と同じサンプル (粉末ムギ）を用いて、 GC— MSによるトリコテセン 系マイコトキシンの定量を行った。 a)サンプル調製
実施例 3で調製した各種粉末ムギサンプル保存溶液 160 μ Lを lmL容キャップ付きチュ —ブに取り、気流下で濃縮 '乾固し、さらに真空デシケータ内に一昼夜置き、完全に乾固さ せた。これにトリメチルシリル化剤（N—トリメチルシリルイミダゾール： N， O—ビストリメチルシ リルァセトアミド：トリメチルクロロシラン、 3 : 3 : 2、 V/VZV) 25 // 1を加えて密栓し、 50°Cで 2 0分間反応した。ついで n—へキサン 500 で希釈し、水 200 / 1で水洗後、 η—へキサン層 400 β 1を等量の η—へキサンで希釈した。
b) GC— MSによる測定
得られた希釈液をガスクロマトグラフィー質量分析計（GC— MS、島津 GCMS― QP200 0)にかけ各種トリコテセン系マイコトキシンを定量した。測定条件は以下のとおりであった。 キヤビラリ一力ラム（Shimadzu HiCap- CBP1)、カラム温度は 120°C5分間保持、.280°Cまで 8°C //分昇温、注入口およびインターフエ一ス温度は 280°C、イオン源温度は 270°C、ィォ ン化電圧は 70eV、スキャン速度（35〜700mZz)は 1. 5scan/sec、サンプリング速度は 5 points/ sec。
c)実施例 3との比較
図 5に示すように、それぞれの定量値は実施例 3で行つた本発明利用結果と大変良く一致 した。図 5は、 KT [— 240を用いて DONと NIVとを同時に定量した結果と GC— MSで DO Nと NIVとを別々に定量し、これを合計した結果との相関を示す。
実施例 5 (トリコテセン系マイコトキシン産生微生物の増殖確認）
a)測定用サンプルの調製
精白米 50gを 500mL三角フラスコに採り、蒸留水 150mLを加えて室温で 1時間放置浸 潤させてから 120°C、 25分間オートクレープにかけ、培養用培地 (米培地)を作製した。培 養用培地に保存株尸 ·3/7'ί/Λ? / ^ /^， ^丁じ。- 15624) を接種し、室温（20〜25°C)で 培養し、培養上清を 5日毎に 500 Lづっ回収した。培養用培地に何も接種せず、室温 (2 0〜25°C)で培養し、培養上清を 5曰毎に 500 μ Lづっ回収したものを対照とした。回収した 各サンプルにァセトニトリル Ζ水（3 : 1 v/v) 2. 5mLを加え、ホモゲナイザー（ヒストコン NS- 50 :日音医理科機器）で摩砕してから 3000rpmで 10分間遠心分離し、得られた上清を 直ちに— 80°Cで凍結保存し、測定用サンプルとした。 PC画画 00 b)微生物増殖の確認
96ウェルマイクロタイタ一プレー卜に 50 μ Lの実施例 1で作製したトリコテセン系マイコトキ シン（式 b— 1)一 BSAコンジュゲート溶液（20 / gZmL 0. 1M炭酸緩衝液 pH9. 5)を 分注し、 4°Cで一夜静置した。プレートを PBSで 3回洗浄した後、 1 %BSAZPBS溶液また は 1%スキムミルク ZPBS 300 / Lを分注して室温で 1時間静置し、 PBSで各ゥエルを 3回 洗浄して反応用プレートとした。
凍結保存してあった測定用サンプルを室温で融解した後、良く攪拌して Lを lmL容 キャップ付きチューブに取り、気流下で濃縮'乾固した。これにエタノール 100 // L及び Twe en— PBS溶液（0. 05%Tween— 20、 140mM NaClを含む 10mMリン酸緩衝液 ρΗ7· 4) 900 μ Lを加え、これを以下の測定用試料とした。
反応用プレートの各ゥエルに各測定用試料またはコントロールとして Tween— PBS溶液 (0. 05%Tween— 20、 140mM NaClを含む 10mMリン酸緩衝液 pH7. 4)を
ゥエル加え、さらに各ゥエルに KTM— 240溶液（SOOngZml^ 0. 1 %BSA加 Tween
— PBS溶液) 50 // Lを加えて十分攪拌した後、振とう攪拌しながら室温で 45分間反応させ た。プレートを Tween— PBS溶液で 5回洗浄した後、各ゥエルに 100 /z ゥエルの HRP標 識一抗マウスィムノグロプリンス'一ゥサギ抗体溶液（3 OOngZmL 0. 1 %BSAカ卩 Tween
— PBS溶液)を加え、振とう攪拌しながら室温で 30分間反応させた。プレートを 5回 Tween
— PBS溶液で洗浄した後、 100 /i Lの TMB溶液 (インタージェン社)を加え、振とう攪拌しな がら室温で 30分間喑所反応させ、反応終了後 ImolZLの硫酸水溶液をゥエル当たり 50 L加えて反応を停止し、プレートリーダー（コロナ電気社、 MTP— 120)で波長 450nmの吸 光度を測定した。
結果を第 6図に示す。微生物の増殖とともに、吸光度は減少し、微生物が増殖していること、 並びに、増殖してレ、る微生物がトリコテセン系マイコトキシン産生微生物であることが確認で きた。
実施例 6 (トリコテセン系マイコトキシン産生菌の存在確認） a)測定用サンプルの調製
精白米 50gを 500mL三角フラスコに採り、蒸留水 150mLを加えて室温で 1時間放置浸 潤させてから 120°C、 25分間ォ一トクレーブにかけ、培養用培地を作製した。培養用培地を ォ一トクレーブ滅菌した培養用試験管（l OmL)に lmLずつ分注し、滅菌綿栓にて栓をして 培養用試験管を作製した。
各圃場より回収した稲株 (地上より 5cm以内の茎部分を 2cmほど刈り取ったもの）に形成 されている子嚢殻を鋭利な刃物で切り取り、駒田培地を入れたシャーレに接種して室温で 2 日間ほど培養した後、形成されたコロニーを培養用試験管に接種し、室温 (20〜25°C)で 5 日間培養した。培養終了後、培養上清を 500 μ Lづっ回収し、各サンプルにエタノール _ 水（3 : 1 v/v) 2. 5mLを加え、ホモゲナイザ一（ヒストコン NS- 50 :日音医理科機器）で摩碎 して力 3000rpmで 10分間遠心分離し、得られた上清を測定用サンプルとした。
b)微生物増殖の確認
96ウェルマイクロタイタ一プレートに 50 Lの実施例 1で作製したトリコテセン系マイコトキ シン (式 b—l)— BSAコンジュゲート溶液（20 z gノ mL 0. 1M炭酸緩衝液 pH9. 5)を 分注し、 4°Cで一夜静置した。プレートを PBSで 3回洗浄した後、 1 %BSAZPBS溶液また は 1%スキムミルク ZPBS 300 /i Lを分注して室温で 1時間静置し、 PBSで各ゥエルを 3回 洗浄して反応用プレートとした。
測定用サンプルを良く攪拌してその 500 Lを lmL容キャップ付きチューブに取り、気流 下で濃縮'乾固した。これにエタノール 50 /z L及び Tween— PBS溶液（0. 05%Tween- 20、 140mM NaClを含む lOmMリン酸緩衝液 pH7. 4) 450 μ Lを力 Bえ、これを以下の 測定用試料とした。
反応用プレートの各ゥエルに各測定用試料またはコントロールとして Tween— PBS溶液 (0. 05 %Tween— 20、 140mM NaClを含む l OmMリン酸緩衝液 pH7. 4)を 50 / LZ ウエノレカ [1え、さらに各ゥェゾレに① KTM— 205溶夜（300ng/mL、 0. 1 <½BSAカロ Twee n— PBS溶液） 50 L、または② KTM— 240溶 ί夜（300ngZmし、 0. 1 %BSAカロ Twee n— PBS溶液） 50 μ Lを加えて十分攪拌した後、振とう攪拌しながら室温で 45分間反応させ た。プレートを Tween— PBS溶液で 5回洗浄した後、各ゥエルに 100 μ Lノウエルの HRP標 識ー抗マウスィムノグロブリンズ—ゥサギ抗体溶液（300ng/mL 0. 1 %BSA加 Tween
— PBS溶液)を加え、振とう攪拌しながら室温で 30分間反応させた。プレートを 5回 Tween
— PBS溶液で洗浄した後、 100 / Lの TMB溶液 (インタ一ジヱン社）を加え、振とう攪拌しな 力 室温で 30分間喑所反応させ、反応終了後 lmol Xの硫酸水溶液をゥエル当たり 50 // L加えて反応を停止し、プレートリーダー（コロナ電気社、 MTP— 120)で波長 450nmの吸 光度を測定した。
結果を第 7図に示す。圃場 A、 B、 Dから採取した稲株力 の分離菌株を培養した培地中 にトリコテセン系マイコトキシンが検出され、圃場 C力 採取した稲株力 の分離菌株を培養 した培地中にはトリコテセン系マイコトキシンは検出されなかった。従って圃場 A， B, Dはトリ コテセン系マイコトキシン産生菌によってすでに汚染されている可能性が示された力 圃場 Cでは、その可能性が否定された。さらに、 A, B, Dの結果から、圃場 Aは DONを主に産生 する菌株に、圃場 B、 Dは NIVを産生する菌株に汚染されていることが示された。
産業上の利用可能性
本発明のモノクローナル抗体またはそれらの抗体断片を用いて、農作物、飲食品、飼料等 に存在するトリコテセン系マイコトキシンを簡便かつ正確に定量および検出することができ る。

Claims

請求の範囲
式 (II)
Figure imgf000040_0001
(式中、 Rla、 R3aおよび R4aは、同一または異なって OHまたはァシルォキシを表す）で表される 化合物に対し親和性を有し、その親和性の程度が Rlaおよび R3i^OCOCH3で R4 0Hであ る上記式 (II)で表される化合物 1— 1、 Rlaおよび R4aが OHで R3aが OCOCH3である上記式 (II)で 表される化合物 1— 2、 R'\ R3aおよび R4WOCOCH3である上記式 (II)で表される化合物 1— 3 において、化合物 1一 1 >化合物 1一 2〉化合物 1一 3の順で高く、かつ式 (A)
Figure imgf000040_0002
(式中、 R1A、 R3Aおよび R4Aは同一または異なって OHまたはァシルォキシを表す）で表される 化合物おょぴ式 (B)
Figure imgf000040_0003
(式中、 R1B、 R2Bおよび R3Bは同一または異なって OHまたはァシルォキシを表す）で表される 化合物とは実質的に反応しないモノクローナル抗体またはその抗体断片。
2. ハイプリドーマ細胞株 KTM— 205が生産する請求項 1記載のモノクローナル抗体 KT
M— 205またはその抗体断片。
3. 式 (III)
Figure imgf000041_0001
(式中、 Rlb、 R3bおよび R 4»は同一または異なって OHまたはァシルォキシを表し、 R2bは H、 OH またはァシルォキシを表し、かつ R2b力 SHまたは OHのときには Rlb、 R3bおよび R4bのうち少なくと も 1つの基がァシルォキシで表される）で表される化合物に対し親和性を有し、その親和性 の程度カ^1 bおよび R3bが OCOCH3で R2bが Hで R4¾SOHである上記式 Gil)で表される化合物 2 一 1、 Rlb、 R3bおよび R4l^OCOCH3で R2bが Hである上記式 (III)で表される化合物 2— 2、 Rlbお よび R4b力 SOHで R2bおよび R3bが OCOCH3である上記式 (III)で表される化合物 2— 3において、 化合物 2— 1 >化合物 2— 2〉化合物 2— 3の順で高く、かつ式 (C)
Figure imgf000041_0002
(式中、 R1C、 R2Cおよび R3cは同一または異なって OHまたはァシルォキシを表す）で表される 化合物とは実質的に反応しないモノクローナル抗体またはその抗体断片。
4. ハイプリドーマ細胞株 KTM— 240が生産する請求項 3記載のモノクロ一ナル抗体 KT
M一 240またはその抗体断片。
5. 式 (IV)
Figure imgf000042_0001
(式中、 Rlc、 R2cおよび R3cは同一または異なって OHまたはアシノレオキシを表し、かつ 、 R2c および R3cのうち少なくとも 1つの基がァシルォキシで表される）で表される化合物に対し親和 性を有し、その親和性の程度が Rlcが〇Hで R2cおよび R3cが OCOCH3である上記式 (IV)で表さ れる化合物 3— 1、 Rlc、 R2cおよび R3cが OCOCH3である上記式 0V)で表される化合物 3— 2に ぉレ、て、化合物 3— 1〉化合物 3— 2であり、かつ式 (D)
Figure imgf000042_0002
(式中、 RID、 R3。および R4Dは同一または異なって OHまたはァシルォキシを表し、 R2Dは H、 OHまたはァシルォキシを表す)で表される化合物とは実質的に反応しないモノクローナル 抗体またはその抗体断片。
6. ハイブリド一マ細胞株 KTM— 249が生産する請求項 5記載のモノクローナル抗体 KT M— 249またはその抗体断片。
7. 請求項 1または 2記載のモノクローナル抗体を生産する能力を有するハイプリドーマ細 胞。
8. 請求項 3または 4記載のモノクローナル抗体を生産する能力を有するハイブリド一マ細 胞。
9. 請求項 5または 6記載のモノクローナル抗体を生産する能力を有するハイブリド一マ細 胞。
10. FERM BP— 6835として工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている 請求項 7記載のハイプリドーマ細胞。
1 1. FERM BP— 6836として工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている 請求項 8記載のハイプリドーマ細胞。
12. FERM BP— 6837として工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている 請求項 9記載のハイプリドーマ細胞。
13. 式 (I)
(i)
Figure imgf000043_0001
(式中、 Rlは Hまたはァシルォキシを表し、 R2、 R3および R4は同一または異なって H、 OHまた はァシルォキシを表し、 Z1は OC〇CH2CH(CH3)2を表し、 Z2は Hを表す力、 Z1と Z2が一緒にな つて =0を表す。ただし、 R R R3および R4のうち少なくとも 1つは OHである。）で表される化 合物において、少なくとも 1つの水酸基をァシルォキシに変換し、かつ 3位の炭素にキャリア 一物質を結合させた物質を動物に投与して免疫させ、該免疫動物から採取される抗体産生 細胞と永久増殖細胞とを融合させ、請求項 1〜6項のいずれかに記載のモノクローナル抗体 を生産する/、イブリドーマ細胞を得ることを特徴とするハイブリド一マ細胞の製造方法。
14. 式 (I)の R2がァシルォキシである請求項 13記載の製造方法。
15. 式 (I)で表される化合物において、少なくとも 1つの水酸基をァシルォキシに変換した 化合物の 3位の炭素とキャリア一物質との結合力; 3位の置換基を架橋基とする結合である請 求項 13記載の製造方法。
16. 式 (I)で表される化合物において、少なくとも 1つの水酸基を OR (式中、 Rは置換もしく は非置換の低級ァシル基、または置換もしくは非置換の芳香族ァシル基を表す)で表される 基に変換した化合物を有機溶媒以外の溶媒または有機溶媒を含んだ溶媒以外の溶媒に溶 解したものをキャリアー物質と結合させる請求項 13記載の製造方法。
17. 有機溶媒以外の溶媒または有機溶媒を含んだ溶媒以外の溶媒が水である請求項 1 6)記載の製造方法。 '
18. トリコテセン系マイコトキシンを含有する試料に請求項 1〜6のいずれかに記載のモノ クロ一ナル抗体またはそれらの抗体断片の 1つ以上を作用させることを含む免疫学的方法 により、試料中トリコテセン系マイコトキシンの定量を行う方法。
19. 少なくとも 1つの水酸基を有する式 (I)で表される化合物において、少なくとも 1つの水 酸基を OR (式中、 Rは置換もしくは非置換の低級ァシル基、または置換もしくは非置換の芳 香族ァシル基を表す)で表される基に変換し、これに請求項 1〜6のレ、ずれかに記載のモノ クローナル抗体またはそれらの抗体断片の 1つ以上を作用させることを含む免疫学的方法 により、試料中トリコテセン系マイコトキシンの定量を行う方法。
20. トリコテセン系マイコトキシンがデォキシニバレノール（DON)、二バレノール（NIV)お よび T— 2トキシン (T一 2)ならびにそれらの誘導体力 なる群力ら選ばれるものである請求 項 18または 19記載の方法。
21. 請求項 3または 4記載のモノクローナル抗体またはその抗体断片を用いて請求項 18 または 19記載の方法により得られる定量値と請求項 5または 6記載のモノクローナル抗体ま たはそれらの抗体断片を用いて請求項 18または 19記載の方法により得られる定量値とを計 算することによる、試料中の DON、 NIVおよび T一 2ならびにそれらの誘導体の総量を定量 する方法。
22. 請求項 1または 2記載のモノクローナル抗体またはそれらの抗体断片を用レ、て請求項 18または 19記載の方法により、試料中の NIVおよびその誘導体を定量する方法。
23. 請求項 3または 4記載のモノクローナル抗体またはそれらの抗体断片を用いて請求項 18または 19記載の方法により得られる定量値から DON、 NIVおよびそれらの誘導体を定 量する方法。
24. 請求項 3または 4記載のモノクローナル抗体またはそれらの抗体断片を用いて請求項 18または 19記載の方法により得られる定量値と請求項 1または 2記載のモノクローナル抗体 またはその抗体断片を用いて請求項 18または 19記載の方法により得られる定量値とを計 算することによる、試料中の DONおよびその誘導体を定量する方法。
25. 請求項 5または 6記載のモノクローナル抗体またはそれらの抗体断片を用いて請求項 18または 19記載の方法により試料中の T一 2およびその誘導体を定量する方法。
26. 免疫学的方法が、ラジオィムノアツセィ、ェンザィムィムノアツセィ、蛍光ィムノアッセィ および発光ィムノアッセィから選ばれる請求項 18または 19記載の方法。
27. 免疫学的方法が、競合法およびサンドイッチ法から選ばれる請求項 18または 19記載 の方法。
28. 請求項 1〜6のレ、ずれかに記載のモノクローナル抗体またはそれらの抗体断片の 1種 以上を有効成分として含有する、トリコテセン系マイコトキシンの免疫学的定量用試薬。
29. 請求項 28記載の試薬および抗原を固相化したプレートを含んでなる、トリコテセン系 マイコトキシンの免疫学的定量用キット。
30. 請求項 28記載の試薬、抗原を固相化したプレート、標識された請求項 1〜6のいずれ かに記載のモノクローナル抗体あるいはそれらの抗体断片に反応する抗体あるいは抗体断 片、および該抗体あるいは該抗体断片の標識を検出する試薬を含んでなる、トリコテセン系 マイコトキシンの免疫学的定量用キット。
31. 抗原を固相化したプレート、標識された請求項 1〜6のいずれかに記載のモノクロ一 ナル抗体あるいはそれらの抗体断片、および該抗体あるレ、は該抗体断片の標識を検出す る試薬を含んでなる、トリコテセン系マイコトキシンの免疫学的定量用キット。
32. 請求項 28記載の試薬および式 (0で表される化合物中の水酸基を OR (式中、 Rは前記 と同義である）で表される基に変換するための検体前処理液を含んでなる、トリコテセン系マ ィコトキシンの免疫学的定量用キット。
33. 請求項 28記載の試薬、抗原を固相化したプレートおよび式 (I)で表される化合物中の 水酸基を OR (式中、 Rは前記と同義である）で表される基に変換するための検体前処理液含 んでなる、トリコテセン系マイコトキシンの免疫学的定量用キット。
34. 請求項 28記載の試薬、抗原を固相化したプレート、標識された請求項 1〜6のいずれ かに記載のモノクローナル抗体あるいはそれらの抗体断片に反応する抗体あるいは抗体断 片、該抗体あるいは該抗体断片の標識を検出する試薬および式 (I)で表される化合物中の 水酸基を OR (式中、 Rは前記と同義である）で表される基に変換するための検体前処理液を 含んでなる、トリコテセン系マイコトキシンの免疫学的定量用キット。
35. 抗原を固相化したプレート、標識された請求項 1〜6のいずれかに記載のモノクロ一 ナル抗体あるいはそれらの抗体断片、該抗体あるいは該抗体断片の標識を検出する試薬 および式 (Dで表される化合物中の水酸基を OR (式中、 Rは前記と同義である）で表される基 に変換するための検体前処理液を含んでなる、トリコテセン系マイコトキシンの免疫学的定 量用キット。
36. トリコテセン系マイコトキシンを含有する試料を有機溶媒を含有する液で処理して、該 試料からトリコテセン系マイコトキシンを抽出し、請求項 18または 19記載の方法により、試料 中のトリコテセン系マイコトキシンの定量を行う方法。
37. 有機溶媒が、水溶性の有機溶媒であることを特徴とする、請求項 36記載の方法。
38. 水溶性の有機溶媒が、メチルアルコール、エチルアルコール、プロピルアルコール、 ァセトニトリル、ジメチルスルフォキシドおよびジメチルフオルムアミド力 なる群力 選ばれる 1種以上であることを特徴とする請求項 36または 37記載の方法。
39. トリコテセン系マイコトキシンを生産する微生物を含有する試料を培地に接種して培養 し、培養物中に生産されるトリコテセン系マイコトキシンに請求項 1〜6のいずれかに記載の モノクローナル抗体またはその抗体断片の 1つ以上を作用させることを含む免疫学的方法 により、試料中のトリコテセン系マイコトキシンを生産する微生物を検出する方法。
40. トリコテセン系マイコトキシンを生産する微生物を含有する試料を培地に接種して培養 し、培養物中に生産されるトリコテセン系マイコトキシンに請求項 1〜6のいずれかに記載の モノクローナル抗体またはその抗体断片の 1つ以上を作用させることを含む免疫学的方法 により、試料中のトリコテセン系マイコトキシンを生産する微生物を判別する方法。
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