WO2001005996A1 - Procede d'obtention de derives optiquement actifs du pyridineethanol - Google Patents

Procede d'obtention de derives optiquement actifs du pyridineethanol Download PDF

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WO2001005996A1
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pyridine
atom
genus
candida
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PCT/JP2000/004237
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Shigeru Kawano
Miho Horikawa
Yoshihiko Yasohara
Junzo Hasegawa
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Kaneka Corporation
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/10—Nitrogen as only ring hetero atom
    • C12P17/12—Nitrogen as only ring hetero atom containing a six-membered hetero ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
    • C12P41/002—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by oxidation/reduction reactions

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing an optically active pyridine ethanol derivative. More specifically, the present invention relates to a method for producing an optically active polycyclic pyridine ethanol derivative by allowing an enzyme or an enzyme source to act on a polycyclic acetyltyl pyridine derivative.
  • the present invention also relates to a novel enzyme which can be used in the above production method, a DNA encoding the enzyme, a recombinant vector containing the DNA, and a transformant containing the recombinant vector.
  • the present invention relates to a method for producing an optically active polycyclic pyridine ethanol derivative by allowing the above novel enzyme or the above transformant to act on the optically inactive polycyclic pyridine ethanol derivative.
  • optically active pyridine ethanol derivative is a compound useful as a synthetic raw material and an intermediate for pharmaceuticals, agricultural chemicals and the like that require optical activity.
  • a method for producing a polycyclic optically active pyridineethanol derivative includes a racemic 5- (1-hydroxyl) furo [2,3-c] pyridine or 5- (1-hydroxyl) ylpyridine.
  • Methods for optical resolution of methylfuro [2,3-c] pyridine by asymmetric esterification reaction using pig kidney lipase 'type 2 (W096335678), racemic 7-chloro 5- (1—Hydroxyshetinole) lip [2,3-c] Pyridine is optically resolved by Candida 'antactica' lipase (C and i_d aantarctica 1 ipase)! Methods (thinlet, 41 (1 999)) are known. However, since these methods are optical resolutions, the yield of one solid is as low as 50% at most, which is not satisfactory.
  • the present inventors have conducted extensive studies to develop an efficient method for producing an optically active polycyclic pyridine ethanol derivative.As a result, the acetyl pyridine derivative is stereoselectively reduced and converted to an optically active pyridine ethanol derivative. The inventors have found an enzyme source with no ability to report so far, and have completed the present invention.
  • the present invention provides a compound represented by the general formula [1]:
  • R 2 are bonded to each other to contain at least one heteroatom selected from the group consisting of an oxygen atom, a sulfur atom and a nitrogen atom, and to have a substituent.
  • R 3 and R 4 may be the same or different, and may have a hydrogen atom, a halogen atom, a hydroxyl group, an alkyl group having 1 to 12 carbon atoms which may have a substituent, or a substituent
  • An acetylviridine derivative represented by an alkoxy group having 1 to 12 carbon atoms The enzyme or enzyme source having reducing activity is acted on to reduce stereoselectively.
  • R 2 , R 3 and R 4 are the same as above, and * represents an asymmetric carbon).
  • Q represents an oxygen atom, a sulfur atom, or a general formula —N (D) —, wherein N is a nitrogen atom, and D represents a hydrogen atom or a monovalent protecting group).
  • R 3 , R 4 , R 5 and R 6 are the same or different, and each represents a hydrogen atom, a halogen atom, a hydroxyl group, an optionally substituted alkyl group having 1 to 12 carbon atoms, or a substituent.
  • An alkenyl group having 1 to 12 carbon atoms which may be possessed is reacted with an enzyme having an asymmetric reduction activity or an enzyme source to stereoselectively reduce the acetyl pyridine derivative.
  • the present invention also relates to an enzyme having the following physicochemical properties (1) to (3):
  • the present invention relates to DNAs encoding these enzymes or DNAs comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing.
  • the present invention also relates to a recombinant vector containing these DNAs, and a transformant containing the recombinant vector.
  • R 2 may be bonded to each other, contain at least one heteroatom selected from the group consisting of an oxygen atom, a sulfur atom, and a nitrogen atom, and may have a substituent 5 monocyclic heterocycle to 8-membered, or, this monocyclic heterocycle will have another ring is fused, and to form a polycyclic heterocyclic ring which may have a substituent.
  • R 3 And R 4 are the same or different and are a hydrogen atom, a halogen atom, a hydroxyl group, an alkyl group having 1 to 12 carbon atoms which may have a substituent, or a carbon number which may have a substituent
  • the above enzyme and / or the above transformant are allowed to act on the pyridine ethanol derivative represented by the formula (1 to 12), and the R-form pyridine ethanol derivative is preferentially oxidized, and the remaining S-form pyridine is obtained.
  • R 2 , R 3 and R 4 are the same as described above, and * represents an asymmetric carbon).
  • Q represents an oxygen atom, a sulfur atom, or a general formula N (D) 1 (where N is a nitrogen atom and D represents a hydrogen atom or a monovalent protecting group).
  • R 3 , R 4 , R 5 and R 6 may be the same or different, and may have a hydrogen atom, a halogen atom, a hydroxyl group, an alkyl group having 1 to 12 carbon atoms which may have a substituent, or a substituent.
  • the above enzyme and Z or the above transformant are allowed to act on the pyridine ethanol derivative represented by the following formula (1), and the R-form pyridine ethanol derivative is preferentially oxidized and remains.
  • the acetyl pyridine derivative used as a substrate in the production method of the present invention is represented by the following general formula [1].
  • R 2 are bonded to each other to contain at least one hetero atom selected from the group consisting of an oxygen atom, a sulfur atom and a nitrogen atom, and to have a substituent. May form a 5- to 8-membered monocyclic heterocyclic ring, or may be obtained by condensing another ring with the monocyclic heterocyclic ring and optionally having a substituent. Form a heterocycle.
  • examples of the 5-membered monocyclic heterocyclic ring include a furan ring, a dihydroblan ring, a pyrrole ring, a pyrroline ring, a dehydrodioxolane ring, a pyrazole ring, a virazoline ring, an imidazole ring, an oxazole ring, Examples include an isoxazole ring, an oxaziazole ring, a triazole ring, a thiazole ring, a thiophene ring, and a dihydrothiophene ring.
  • Examples of the 6-membered monocyclic heterocycle include a pyran ring, a dihydropyran ring, a pyridine ring, a dihydropyridine ring, a tetrahydropyridine ring, a dehydrodoxane ring, a dehydromorpholine ring, a pyridazine ring, and a dehydropyridazine.
  • Ring, a pyrimidine ring, a dihydropyrimidine ring, a tetrahydropyrimidine ring, a pyrazine ring, and a dihydropyrazine ring Ring, a pyrimidine ring, a dihydropyrimidine ring, a tetrahydropyrimidine ring, a pyrazine ring, and a dihydropyrazine ring.
  • Examples of the 7-membered monocyclic heterocycle include a cycloheptane ring, a cycloheptadiene ring, a cycloheptatriene ring, and a thiazepine ring substituted with a nitrogen atom, an oxygen atom or a sulfur atom.
  • Examples of the 8-membered monocyclic heterocycle include a cyclootaten ring, a cyclooctadiene ring, and a cyclooctatetraene ring substituted with a nitrogen atom, an oxygen atom or a sulfur atom.
  • polycyclic heterocycle examples include benzofuran ring, isobenzofuran ring, chromene ring, indolizine ring, indole ring, isoindole ring, isoquinoline ring, phthalazine ring, naphthyridine ring, quinosaline ring, and benzothiophene ring. And hydrogenated rings thereof.
  • Any of these heterocycles may have a substituent. Examples of such a substituent include a halogen atom, a hydroxyl group, an alkyl group having 1 to 12 carbon atoms, and an alkoxy group having 1 to 12 carbon atoms.
  • a 5-membered monocyclic heterocyclic ring is preferable, a substituted or unsubstituted furan ring is more preferable, and a furan ring is particularly preferable.
  • 1 3 and 13 ⁇ 4 4 are the same or different, a hydrogen atom, a halogen atom, a hydroxyl group, carbon atoms which may have a substituent 1 to 1 2 Al
  • Specific examples include a hydrogen atom, a chlorine atom, a bromine atom, a fluorine atom, a hydroxyl group, a methyl group, an ethyl group, a methoxy group, and an ethoxy group.
  • R 3 and R 4 are preferably a hydrogen atom or a chlorine atom, and more preferably a hydrogen atom.
  • Q is an oxygen atom, a sulfur atom, or a general formula — N (D)-(where N is a nitrogen atom, and D represents a hydrogen atom or a monovalent protecting group. ).
  • the monovalent protecting group is a commonly well-known group for protecting an amino group such as an acetyl group, a methoxycarbonyl group, and a benzyl group.
  • Q is preferably an oxygen atom.
  • R 3 , R 4 , R 5 and R 6 are the same or different and are a hydrogen atom, a halogen atom, a hydroxyl group, an alkyl group having 1 to 12 carbon atoms which may have a substituent, or And represents an alkoxy group having 1 to 12 carbon atoms which may have a substituent.
  • R 3 and R 4 in the above general formula [1] can be mentioned.
  • Q is an oxygen atom
  • R 3 is a hydrogen atom or a chlorine atom
  • R 4 is a hydrogen atom
  • R 5 is a hydrogen atom
  • the substrate used in the production method of the present invention has a general formula [3] wherein Q is an oxygen atom, and R 3 , R 4 , R 5 and R 6 are all hydrogen atoms. ], That is, 5_acetylfuro [2,3-c] pyridine.
  • the acetyltilidine derivative represented by the general formula [1] can be easily obtained by a known production method.
  • 5-acetylfuro [2,3-c] pyridine can be synthesized by the method described in Japanese Patent Application No. 9113335 (EP 911335).
  • 5-Acetyl-7-chloroph [2,3-c] pyridine is prepared by the method described in J. Org. Chem., 63, 7851 (1998).
  • 1-Hydroxityl) furo [2,3-c] pyridine can be synthesized and obtained by oxidizing the hydroxyl group.
  • the enzyme or enzyme source used in the production method of the present invention may be an acetylviridine derivative.
  • Those derived from microorganisms capable of converting [1] to an optically active pyridineethanol derivative [2] can be used.
  • cells of such microorganisms, culture solutions or processed products thereof, or enzymes obtained from such microorganisms can be used. These may be used alone or in combination of two or more.
  • Microorganisms having the ability to convert an acetyltilidine derivative [1] to an optically active pyridineethanol derivative [2] can be screened by the method described below. For example, when 5-acetylfuro [2,3-c] pyridine is used as the acetyltilidine derivative [1], the procedure is as follows.
  • the cells were collected by centrifugation, suspended in 1-5 ml of phosphate buffer containing 2-10% of glucose, and 2.5-25 mg of 5-acetylph [2,3-c] pyridine was prepared in advance. Shake at 30 for 2-3 days, in addition to the test tube. At this time, cells obtained by centrifugation and dried in a desiccator or with acetone can also be used.
  • NAD + oxidized nicotinamide dodenine dinucleotide
  • NAD + reduced nicotinamide dodenine dinucleotide
  • NADP + oxidized nicotinamide adenine dinucleotide phosphate
  • NADPH reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate
  • glucose Dehydrogenase or formate dehydrogenase may be added.
  • any microorganism can be used as long as it has the ability to convert an acetyltilidine derivative [1] to an optically active pyridineethanol derivative [2].
  • Genus genus Corynebacteri um, genus Jensenia, genus Ochhrobactr um, genus Pseudomonas, genus Rhodococcus Microorganisms belonging to the genus Tsukamure 11a).
  • Genus Kisolen (P ach V so 1 en), genus Pichia, genus Rhodosporidium (Rhodosporidium), genus Rhodotorula, succa
  • Trigonopsis Trichosporon
  • Genus Wii 1 1 opsis genus Yamadaz yma
  • genus Zygo s_ acchar omy ces genus A / galigenes
  • genus Bacillus Bacillus (Baci 1 1 us)
  • brevibacterium Genus B revibacteri urn, genus Cellomomonas, genus Corynebacterium J3 ⁇ 4, genus Jensenia, genus Ochhrobactrum (Ochrobactr um), sudomonas do
  • Rhodococcus Rh odococcus
  • Tsu mosquito Murera T suk amu re 1 1 a
  • a microorganism belonging to the genus is preferable.
  • the genus Candida When the absolute configuration is to be converted to an R-form pyridine ethanol derivative, the genus Candida, the genus Ogataea (Q gataea), the genus Pichia, and the yamada zyma Microorganisms belonging to the genus, genus Brevibacteri urn, and genus Corynebacterium (Cor V nebacteri urn) are preferred.
  • varsatiris (C andidaversati 1 is) IFO 190 8; Cyanida mogi (C andidamoii) IFO 04 36; Cyanida da vegensis (C andidanorveensis) IFO 102 0; Candida 'parapsilosis (C andidaarapsi 1) Pseudotropicalis (C andid a.
  • pseudotrooica 1 is_) IAM 4 840, Candidarugosa (C andidarugosa) IFO 0 750, Candida Coleidaora (C andidao 1) eophila) CB S 2 219, Candida Stellata (C andidaste 1 lata) IFO 0 70 1, Candida 'tropicalis (C andidatroicali _s_) IFO 00 006, Candida-bodyny (C andidabodinii) I FO 10 5 74, Candida siteana (C andidaaitoana) IFO 0 380, Candida 'Albicans (C andidaalbicans) IFO 0 759, Candida' Carioida ligniola (C andida _cari_ osi 1 i 3 ⁇ 4_n ico 1 a IFO 1 910, Cyanida.
  • Cryptococcus humico 1a CB S 189 96 Cryptococcus 'Teleus (Cryptoco c_c usterreu _s_) IFO 0 7 2 7, Clabispora' Rushitanye (C 1 a V ispora) 1 u s_i taniae) I FO 1 0 1 9, Deno Rio Myces' Don Sennii (D ebar Vo my ce s_ hansenii) IFO 00 8 2, De / Ryo My ses.
  • Mouth Danensis (P jchiarhodanensis) I FO 1272, Pichia trehalophilus (P ichiatrehalohila) I FO 1 282, Pichia.
  • Pichiawickerhamil I FO 1 278, Rhodosporium 'diobobatum (Rhods D ori _d ium diobovatum) IFO 0688, Rhodosporium sp.
  • Rho odsporidium toru 1 oides I FO 0559, Rhodotorla la 'Araucariae (Rh odotorul ⁇ _ raucariae) I FO 1 0053, Rhodotorula 1 Glutinis (Rho odotorulag 1 utinis) IFO 1 99 Dairenensi _s_) I FO 04 15, Rhodotonula Ira Graminis (R odotorula graminis) IFO 0 190, Saccharomycopsis fibrigera (S acchar fibulipsi) ra) IFO 0 10 4, Saccharomycopsis maranga (S acchar omy cop sisma 1 anga) IFO 1 710, Pseudomyces' Occidenta Occidetalis I FO 0371, Spolidioboras • Johnsonii (S poridiobo 1 us J_o_h
  • Seus S porobol omv cesroseus IFO 1106, Schizoblastosporion kobayashi (S chizoblastosporionkob a V asii) I FO 1 644, Stefanoascus sifeliii (tep h_a n_o asc u_s_ ciferri i_) IFO 1 854, Tonoreraspora.
  • Grobosa (Toru 1 asporag 1 obosa) IFO 00 16 -Aquatil (T richosporon cutaneum) ATCC 223 10, Trichosporon 'Trichosporoncutane um I FO 1 198, Trichos Trichosporonfermentans ATCC 1 0 6 7 5, Willopsis' Corpas Bar 'Severolens (W illopsissaturnusvar .suaveo 1 ens) IFO 0 8 09, Willopsis'Satainasu' Noichi 'Murakii (W i 1 1 opsissaturnusvar.
  • Xyloso oxidant (A 1 ca 1 igenesxylosoxidans) IFO 1 3 4 9 5, Alcaligenes xyloso oxidant .subspice dentrificans (A 1 ca 1 i R enesxylosoxidan _s_ subsp .dentrifican s_) IFO 1 2 6 6 9, Nosylas megaterium 1 usme 3 ⁇ 4 ateri um) Asciens (B aci 1 1 usa my 1 oli a_u efaciens) I FO 3 0 2 2, Brevibacterium 'Insertum' (B revibacterium incertum) IFO 1 2 1 4 5 ⁇ Cellulomonas' Fuimi (Cellulo mo nasfimi) I AM 1 2 107, Corynebacterium sp., ATCC 2124, Jensenia canicorria IFO 139,14, Ochrobactrum spices (Ochrobactr urn
  • IFO 12 950 Pseudomonas s_ stutzeri (P seudomona s_ stutzeri) IFO 1 359, 6 Pseudp mo naschlororaphis IFO 394, Pseudomonas memdocina I FO 1 4 1 6 2, Rhodococcuserythropoli s I FO 12 3 2 0, Rhodococcus. Rhodococcus. Rhodococcus rhodochrous IFO 3 338, Pokkamlera 'J ⁇ suka mu re 1 1 a D aur ome tabo 1 a) IFO 122160 and the like.
  • microorganisms can generally be obtained from readily available or purchased stocks, but can also be isolated from nature.
  • a strain having advantageous properties can be obtained by performing a mutation in these microorganisms by this reaction.
  • any culture medium containing a nutrient source that these microorganisms can usually utilize can be used.
  • sugars such as glucose, sucrose, and maltose
  • organic acids such as lactic acid, acetic acid, citric acid, and propionic acid
  • alcohols such as ethanol and glycerin
  • hydrocarbons such as paraffin
  • oils and fats such as soybean oil and rapeseed oil , Or carbon sources such as mixtures thereof
  • nitrogen sources such as ammonium sulfate, ammonium phosphate, urea, yeast extract, meat extract, peptone, corn steep liquor
  • other nutrients such as inorganic salts and vitamins
  • An ordinary medium in which the source is appropriately mixed and blended can be used. These media may be appropriately selected depending on the type of microorganism used.
  • Microorganisms can be cultured under general conditions, for example, aerobically at pH 4.0 to 9.5, temperature range of 20 to 45 ° C for 10 to 96 hours. Is preferred.
  • a microorganism is reacted with the acetyltilidine derivative [1]
  • a culture solution containing cells of the microorganism can be used for the reaction as it is, but a concentrate of the culture solution can also be used.
  • components in the culture solution adversely affect the reaction, cells obtained by treating the culture solution by centrifugation or the like, or cells treated with the cells can also be used.
  • the treated cells of the above microorganisms are not particularly limited.
  • an enzyme that catalyzes an asymmetric reduction reaction may be purified from the culture and used.
  • the acetylviridine derivative [1] as a substrate may be added all at once in the early stage of the reaction, or may be added in portions as the reaction progresses.
  • the temperature during the reaction is usually from 10 to 60 ° C, preferably from 20 to 4, and the pH during the reaction is from 2.5 to 9, preferably from 5 to 9.
  • the amount of the enzyme or enzyme source in the reaction solution may be appropriately determined according to the ability to reduce these substrates.
  • the substrate concentration in the reaction solution is preferably from 0.01 to 50% (w / v), more preferably from 0.1 to 30 ° / o (w / v).
  • the reaction is usually performed with shaking or aeration and agitation.
  • the reaction time is appropriately determined depending on the substrate concentration, the amount of the enzyme or the enzyme source, and other reaction conditions. Usually, it is preferable to set each condition so that the reaction is completed in 2 to 168 hours.
  • an energy source such as glucose, ethanol, or isopropanol to the reaction solution at a ratio of 0.5 to 30% because excellent results can be obtained.
  • the reaction can also be promoted by adding a coenzyme such as NADH or NADPH which is generally required for the reduction reaction by a biological method. In this case, specifically, these are added directly to the reaction solution.
  • a coenzyme such as NADH or NADPH which is generally required for the reduction reaction by a biological method.
  • these are added directly to the reaction solution.
  • a surfactant such as Triton (manufactured by Nakarai Tesque Co., Ltd.), Span (manufactured by Kanto Chemical Co., Ltd.), or Tween (manufactured by Nakarai Testa Co., Ltd.)
  • a surfactant such as Triton (manufactured by Nakarai Tesque Co., Ltd.), Span (manufactured by Kanto Chemical Co., Ltd.), or Tween (manufactured by Nakarai Testa Co., Ltd.)
  • Water-insoluble organic compounds such as ethyl acetate, butyl acetate, isopropyl ether, toluene, and hexane are used to avoid the inhibition of the reaction by the acetyl pyridine derivative [1] and Z or the optically active pyridine ethanol derivative [2].
  • a solvent may be added to the reaction solution.
  • Water-soluble organic solvents such as methanol, ethanol, acetone, tetrahydrofuran, and dimethyl sulfoxide can be added to increase the solubility of the acetyltilidine derivative [1].
  • the enzyme of the present invention DNA encoding the enzyme, a recombinant vector containing the DNA, and a transformant containing the recombinant vector will be described in detail.
  • the enzyme of the present invention has the following physicochemical properties (1) to (3):
  • an enzyme having the following physicochemical properties (4) to (6) in addition to the above physicochemical properties (1) to (3).
  • Inhibitor Inhibited by mercury ions.
  • the reducing activity of the enzyme is determined by adding lO OmM phosphate buffer (pH 6.5) to 1 mM of substrate, 0.25 mM of coenzyme NADH, and 0.35 of dimethyl sulfoxide. % (vo 1 / vo 1) and enzyme solution 3. Perform the reaction in Oml reaction solution at 30 ° C for 3 minutes and measure the decrease in absorbance at 340 nm wavelength.
  • “reduction activity is very low” means that the reduction activity for the substrate is 10% or less when the reduction activity for 5-acetylfuro [2,3-c] pyridine is 100%.
  • the molecular weight is determined by calculating from the relative elution time of the standard protein by gel filtration analysis using a TSK-G 3000 SW (7.8 mm ID X 30 cm) (manufactured by Tosoh Ichi Co., Ltd.) column. I do.
  • the molecular weight of the subunit is determined by 20% SDS-polyacrylamide gel electrophoresis analysis from the relative mobility of the standard protein.
  • the optimum pH and optimum temperature of the enzyme are determined, for example, by measuring the reducing activity while changing the reaction pH and reaction temperature of the reducing activity measuring system.
  • the inhibitor is determined, for example, by adding various compounds to a reducing activity measuring system and measuring the reducing activity.
  • the microorganism used as a source of the enzyme of the present invention is a stereo-selective reduction of 5-acetylfuro [2,3-c] pyridine to give 5- (1- (R) -hydroxyxethyl) [2,3-] c]
  • Any microorganism that has an enzyme that produces pyridine may be used.
  • the strain may be either a wild strain or a mutant strain, and further, a recombinant microorganism derived by a genetic technique such as cell fusion or genetic manipulation may be used.
  • a microorganism belonging to the genus Candida (Candida) is used. More preferred is Candida's Maris (Candaria Maris), and particularly preferred is Candida's Maris (Candaria Maris) IFO 10003 strain.
  • the following enzymes have the ability to stereoselectively reduce 5-acetylfuro [2,3-c] pyridine to form 5- (1- (R) -hydroxyxyl) furo [2,3-c] pyridine.
  • An example of a method for obtaining the enzyme of the present invention from a microorganism will be described, but the present invention is not limited thereto.
  • Microorganisms containing enzymes that produce 5- (1- (R) -hydroxyxethyl) furo [2,3-c] pyridine are reduced to an appropriate medium, and the cells are centrifuged from the culture solution Thereafter, the cells are suspended in an appropriate buffer, and the cells are disrupted or dissolved using a physical method such as glass beads, a biochemical method such as an enzyme, and the like. By removing solids in the solution, a crude enzyme solution can be obtained. Alternatively, a crude enzyme solution can be obtained from the culture solution by the same purification method as described above.
  • the crude enzyme solution can be purified using a method commonly used by those skilled in the art, for example, ammonium sulfate precipitation, dialysis, and chromatography alone or in combination.
  • a method commonly used by those skilled in the art for example, ammonium sulfate precipitation, dialysis, and chromatography alone or in combination.
  • chromatography hydrophobic chromatography, ion exchange chromatography, and gel filtration chromatography can be used alone or in combination.
  • the enzyme of the present invention may be a natural enzyme obtained from a microorganism as described above, or may be a recombinant enzyme.
  • Examples of the natural enzyme include an enzyme having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
  • the enzyme of the present invention comprises an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted and Z- or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, and comprises 5-acetylfuro [2, 3].
  • — C It may be one that has the activity of stereoselectively reducing pyridine to produce 5- (1- (R) —hydroxyxethyl) furo [2,3-c] pyridine.
  • one or several amino acids are deleted, substituted, and Z or added by a well-known method such as site-directed mutagenesis. Deletion, substitution, or addition.
  • Having the activity of stereoselectively reducing 5 _acetylfuro [2,3-c] pyridine to form 5- (1- (R) -hydroxyethyl) furo [2,3-c] pyridine means that When reacted with 5-acetylfuro [2,3-c] pyridin, it is 10% or more, preferably 40% or more, when an enzyme having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the sequence listing is used. It is particularly preferable to produce 5- (1-1 (R) -hydroxyxethyl) furo [2,3-c] pyridine with a yield of 60% or more. To measure the yield, the above-described high performance liquid chromatography is used.
  • DNA encoding the enzyme can be obtained by a method known to those skilled in the art. By introducing this DNA into another microorganism to obtain a recombinant microorganism and culturing it, it is possible to produce a large amount of an enzyme source that can be used in the production method of the present invention.
  • the purified enzyme is digested with an appropriate endopeptidase, and the fragment cleaved by reverse-phase HP LC is purified. Then, a partial amino acid sequence is determined by a protein sequencer. Then, based on the obtained partial amino acid sequence, a PCR (PolymeraseChaneReactin) primer is synthesized.
  • a PCR PolymeraseChaneReactin primer is synthesized.
  • chromosomal DNA of the microorganism is prepared from the microorganism as a source of the DNA by a conventional DNA isolation method, for example, the Hereford method (Ce 11, 18, 1261 (11979)). I do.
  • telomere sequence a part of the DNA encoding the enzyme is amplified (core sequence), and the nucleotide sequence is determined.
  • the nucleotide sequence can be determined by the didoxy chain termination method or the like. For example, it can be carried out using ABI 373 A DNA Sequencer (produced by Applied Biostems) or the like.
  • the chromosomal DNA of the microorganism is digested with a restriction enzyme having no recognition sequence in the core sequence, and the resulting DNA fragment is self-circulated with T4 ligase.
  • type III DNA is prepared for reverse PCR (Nucleic Acids Res. 16, 186 (1988)).
  • a primer is synthesized as a starting point of DNA synthesis toward the outside of the core sequence, and a region around the core sequence is amplified by reverse PCR.
  • the DNA sequence of the entire coding region of the target enzyme can be clarified.
  • the DNA encoding the enzyme of the present invention can be obtained from the chromosomal DNA of the microorganism by a method such as PCR.
  • a DNA encoding the enzyme of the present invention is incorporated into a vector, and the enzyme gene can be expressed in a transformant obtained by introducing the DNA into a host.
  • a vector used for this purpose any vector that can express the enzyme gene in an appropriate host can be used. Either can be used.
  • Such vectors include, for example, plasmid vectors, phage vectors, cosmid vectors, and the like.
  • a shuttle vector capable of gene exchange with another host can be used.
  • Such vectors include operably linked promoters (1 a cUV5 promoter, tr ⁇ promoter, trc promoter, tac promoter, lpp promoter, tuf B promoter, rec A promoter, p L promoter) and the like. It can be suitably used as an expression vector containing an expression unit containing a control factor and operably linked to the DNA of the present invention.
  • p UCNT WO 94/036 13
  • the like can be suitably used.
  • regulatory refers to a nucleotide sequence having a functional promoter and any associated transcription elements (eg, enhancer, CCAAT box, TATA box, SPI site, etc.).
  • operably linked refers to a state in which a DNA and various regulatory elements such as a promoter and an enhancer that regulate its expression can operate in a host cell so that a gene is expressed. Means to be connected. It is well known to those skilled in the art that the types and types of regulatory factors can vary depending on the host.
  • Examples of the host into which the recombinant vector containing the DNA of the present invention is introduced include bacteria, yeasts, filamentous fungi, plant cells, animal cells, etc., and Escherichia coli is particularly preferred.
  • the DNA of the present invention can be introduced into a host cell by a conventional method. When Escherichia coli is used as a host cell, the DNA of the present invention can be introduced by, for example, the calcium chloride method.
  • the acetylethylpyridine derivative [1] is stereoselectively reduced to obtain a pyridineethanol derivative having an R-configuration in absolute configuration, and particularly preferably 5-acetylfuro [2,3-c].
  • pyridine is stereoselectively reduced to obtain 5- (1- (R) -hydroxyethyl) furo [2,3-c] pyridine
  • NADH is required as a coenzyme. It can be carried out by adding the required amount of NADH to the reaction system.
  • coenzyme regeneration ability an enzyme having the ability to convert the oxidized coenzyme (NAD +) to the reduced form (NAD H) (hereinafter referred to as coenzyme regeneration ability) is used together with its substrate, that is, the coenzyme regeneration system is used in the present invention.
  • coenzyme regeneration ability an enzyme having the ability to convert the oxidized coenzyme (NAD +) to the reduced form (NAD H)
  • coenzyme regeneration ability an enzyme having the ability to convert the oxidized coenzyme (NAD +) to the reduced form (NAD H) (hereinafter referred to as coenzyme regeneration ability) is used together with its substrate, that is, the coenzyme regeneration system is used in the present invention.
  • coenzyme regeneration ability As the enzyme, hydrogenase, formate dehydrogenase, alcohol dehydrogenase, glucose 16-phosphate dehydrogenase, glucose dehydrogenase and the like can be used.
  • Such a reaction can also be carried out by adding a coenzyme regeneration system into the asymmetric reduction reaction system, but it is transformed by both the DNA encoding the enzyme of the present invention and the DNA encoding glucose dehydrogenase.
  • a transformant When a transformant is used, the reaction can be carried out efficiently without separately preparing an enzyme having a coenzyme regeneration ability and adding it to the reaction system.
  • Such a transformant can be produced by incorporating the DNA encoding the enzyme of the present invention and the DNA encoding the glucose dehydrogenase into the same vector and introducing them into a host, and It can also be produced by incorporating these two types of DNA into two types of vectors having different incompatibility groups, respectively, and introducing them into the same host.
  • a transformant containing a recombinant vector containing DNA encoding the enzyme of the present invention and DNA encoding glucose dehydrogenase and a first transformant containing DNA encoding the enzyme of the present invention.
  • a second recombinant vector containing DNA encoding glucose dehydrogenase is a transformant containing a recombinant vector containing DNA encoding the enzyme of the present invention and DNA encoding glucose dehydrogenase.
  • the regeneration reaction of NADH can be performed simultaneously by adding a substrate for the regeneration to the reaction system.
  • the use of expensive coenzyme can be greatly reduced without adding an enzyme having coenzyme regeneration ability to the reaction system.
  • NADH can be regenerated by adding isopropanol to the reduction reaction system.
  • 5- (1— (R— ) —Hydroxitytil) Flo [2,3-c] pyridin can be produced as follows. However, it is not limited to the following method. First, the substrate 5-acetylfuro [2,3-c] pyridine [1], a coenzyme such as NAD +, and a culture of the transformant or a processed product thereof are added to an appropriate solvent. The reaction is carried out with stirring under pH adjustment. The reaction is at a temperature of 10-70 The pH of the reaction solution is maintained at 4 to 10 during the reaction.
  • the reaction can be carried out batchwise or continuously.
  • the reaction substrate can be added at a charged concentration of 0.1% to 70% (w / v).
  • the processed product of the transformant means, for example, a crude enzyme solution, a cultured cell, a freeze-dried cell, an acetone-dried cell, a ground product thereof, or a mixture thereof. Further, they can be used by immobilizing the enzyme itself or bacterial cells by known means.
  • the amount of coenzyme used can be reduced by further adding glucose to the reaction system. It is possible to greatly reduce.
  • the pyridine ethanol derivative used as a substrate in the production method of the present invention is represented by the following general formula [5].
  • R 2 are the same as those mentioned in the above general formula [1]. Among them, a 5-membered monocyclic heterocyclic ring is preferable, a substituted or unsubstituted furan ring is more preferable, and a furan ring is particularly preferable.
  • R 3 and R 4 are also the same as those mentioned in the general formula [1], preferably a hydrogen atom or a chlorine atom, and more preferably a hydrogen atom.
  • the pyridineethanol derivative [5] is not particularly limited as long as the optical purity is less than 100%. It can be completely racemic or has some optical purity May be used.
  • Q is the same as that mentioned in the general formula [3].
  • Q is preferably an oxygen atom.
  • R 3 , R 4 , R 5 and R 6 are the same as those mentioned in the general formula [3].
  • Q is an oxygen atom
  • R 3 is a hydrogen atom or a chlorine atom
  • R 4 is a hydrogen atom
  • R 5 is a hydrogen atom.
  • R 6 is a hydrogen atom or a methyl group.
  • the substrate used in the production method of the present invention has a general formula [7] in which Q is an oxygen atom and R 3 , R 4 , R 5 and R 6 are all hydrogen atoms. , That is, 5- (1-hydroxyshethyl) furo [2,3-c] pyridine.
  • the pyridineethanol derivative represented by the general formula [5] can be easily obtained by a known production method.
  • 5- (1-hydroxyxethyl) furo [2,3-c] pyridine can be synthesized by the method described in European Patent Application No. 91 1 335 (EP 911 335).
  • NAD + is required as a coenzyme. It can also be carried out by adding NAD + in the required amount to the reaction system.
  • an enzyme capable of converting the reduced coenzyme to an oxidized form By performing the reaction in combination with the enzyme of the present invention together with the quality, the amount of expensive coenzyme used can be largely eliminated.
  • a microorganism containing an enzyme capable of converting the reduced coenzyme to an oxidized form or a processed product thereof may be used.
  • an enzyme having the ability to convert the reduced coenzyme into an oxidized form for example, NADH oxidase, NADH dehydrogenase and the like can be used.
  • NAD + regeneration reaction can be performed simultaneously by adding a substrate for the regeneration to the reaction system.
  • the amount of expensive coenzyme used can be greatly reduced without adding another enzyme having the ability to regenerate NAD +.
  • NAD + can be regenerated by adding acetone to the reaction system.
  • the reaction proceeds by NAD + present in the cells, and NADH generated by reduction of NAD + is reoxidized in the cells, so that the coenzyme It can be performed without adding an enzyme having NAD + regeneration ability.
  • the method for collecting the optically active pyridine ethanol derivative obtained by any of the above methods is not particularly limited. Ethyl acetate, toluene, t-butyl methyl ether, hexane Extraction with a solvent such as the above, dehydration, and purification by distillation, crystallization, or silica gel column chromatography can easily provide highly pure optically active pyridineethanol derivatives. BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
  • FIG. 1 shows the nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of DNA determined in Example 21.
  • FIG. 2 shows a method for producing the recombinant vector pNTFP of Example 22 and the recombinant vector pNTFPG of Example 23, and their structures.
  • PH7 liquid medium
  • Tables 1 and 2 summarize the amount, optical purity, and absolute configuration of the product, 5- (1-hydroxyhexyl) furo [2,3-c] pyridine, per reaction solution.
  • Candida cariosilignicnla IFO 1910 1.44 100.0 s
  • Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces cerevisiae
  • Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces cerevisiae
  • Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces cerevisiae
  • Example 4 Candidatropica 1 1 s
  • Yeast extract 3 g phosphorus 6.5 g of diammonium hydrogen oxyate, 1 g of potassium dihydrogen phosphate, 0.8 g of magnesium sulfate heptahydrate, 6 Omg of zinc sulfate heptahydrate, 9 Omg of iron sulfate heptahydrate, 9 Omg of copper sulfate pentahydrate
  • Liquid culture medium consisting of 5 mg of hydrate, 1 Omg of manganese sulfate tetrahydrate, and 1 mg of sodium chloride lO Omg (each 90 Om1)
  • Adekinol 225 ml, 2 drops of Adekinol were placed in a 2 L volumetric flask and sterilized, and 25 ml of a sterilized 40% glucose aqueous solution and Candida.tropica obtained by the culture method described in Example 1 were added thereto.
  • a squirrel (C andidatropica 1 is) IFO 0006 culture solution (2.5 ml) was aseptically inoculated and cultured with shaking at 30 ° C for 24 hours. After the culture, 300 ml of the culture solution was centrifuged to collect the cells, and the cells were suspended in 100 ml of 10 OmM phosphate buffer (pH 6.5).
  • Example 5 Preparation of cell-free extract from Candidaintermedia IFO 0761 and use of the same to prepare 5_ (1—) from 5-acetylfuro [2,3-c] pyridine (S) —Hydroxyshethyl) Synthesis of Flo [2,3-c] pyridine
  • Cultivation in a 5 L jar arm mentor was performed in the same manner as described in Example 3, except that the stirring speed was 700 rpm, the aeration rate was 1.5 LZ, and the culture time was changed to 16 hours. .
  • C andidaintermedia I FO 0761 was cultured. After culturing, the obtained culture solution 94 Om 1 was The cells were collected by centrifugation, washed twice with 100 ml of 10 OmM phosphate buffer (pH 6.5), and washed with 4 OO ml of wet cells to a concentration of 5 mM.] 3-Mercaptoethanol was added.
  • the suspension was suspended in 200 ml of 10 OmM phosphate buffer (pH 6.5), and the cells were disrupted with a beat beater (manufactured by BioSpec Products). The bacterial cell residue was removed by centrifugation, and ammonium sulfate was added to achieve a saturation of 80 ° / 0, and then the supernatant was removed by centrifugation. The obtained precipitate was suspended in 15 ml of 10 OmM phosphate buffer ( ⁇ ⁇ ⁇ 6.5) to which 5 mM of mercaptoethanol was added, and 3 The resultant was dialyzed against 10 OmM phosphate buffer (pH 6.5) to which mercaptoethanol was added to obtain 64.5 ml of a cell-free extract.
  • a beat beater manufactured by BioSpec Products
  • Example 7 Preparation of acetone-dried cells of Candida maris IFO 1003, and the use of 5- (1-3) from 5-acetylfuro [2,3—c] pyridine — (R) —Hydroxitytil) Synthesis of furo [2,3-c] pyridine Yeast extract 3 g, diammonium hydrogen phosphate 6.5 g, potassium dihydrogen phosphate lg, magnesium sulfate heptahydrate 0.8 g, zinc sulfate heptahydrate 6 Omg, iron sulfate heptahydrate 9 Omg , A liquid culture medium consisting of 5 mg of copper sulfate pentahydrate, 1 Omg of manganese sulfate tetrahydrate and 10 Omg of sodium chloride (both per 90 Om1), and 1 drop of Adekinol to 50 Om1 It was put in a Nosaka flask and sterilized, and 5 ml of a sterilized 40% glucose
  • Example 8 Preparation of cell-free extract from Candida maris IFO 10003, and use of 5-acetylfuro [2,3-c] pyridine from 5- (1- (R) -Hydroxyschechinole) Synthesis of flow [2,3-c] pyridine
  • Candida was cultured in the same manner as described in Example 3, except that the culture in the 5 L jar armmenter was changed to a stirring speed of 300 rpm, an aeration rate of 0.75 L / min, and a culture time of 76 hours.
  • 'Culcus (C andida maris) I FO 1000 3 was cultured. Cells were collected from the obtained culture solution (215 Om1) by centrifugation, washed with 500 ml of 10 OmM phosphate buffer (pH 6.5), and the wet cells were removed. The cells were suspended in 43 Oml of 10 OmM phosphate buffer (pH 6.5) to which jS-mercaptoethanol was added to a concentration of 5 mM, and the cells were beat-bited (BioSpec.
  • [2,3-c] pyridine 0.25 g, NAD + 30 mg, glucose 2.5 g, glucose dehydrogenase (trade name: GLUC DH "Amano" II, Amano Pharmaceutical Co., Ltd.) 30 24 ml of the cell-free extract was added to the three-necked flask containing the OU to perform a reduction reaction. The reaction was carried out at 30 ° C. with stirring while adjusting the pH of the reaction solution to 6.5 with a 5N aqueous sodium hydroxide solution. A part of the reaction solution was periodically analyzed by HPLC, and when the substrate was dead, 0.25 g of the substrate was further added to continue the reaction. The reaction was carried out for about 72 hours while repeating this operation. After the completion of the reaction, the amount of 5- (1-hydroxyhydric) furo [2,3-c] pyridine produced was 2.2 g. Yield 88%, optical purity (R) 100% e.e.
  • Example 9 5— (1— (R) from 5-Acetylfuro [2,3-c] pyridine Using Cell-free Extract of Candida maris IFO1000 ) —Hydroxitytil) Flow [2,3-c] pyridine Synthesis)
  • a 5-acetylf [2,3- c] A reduction reaction was performed by adding 0.25 g of pyridine, 40 mg of NAD +, 0.25 g of sodium formate, and 120 U of formate dehydrogenase (manufactured by F1uka).
  • the reaction was carried out at 30 with stirring while adjusting the pH of the reaction solution to 6.5 with 5N formic acid. A part of the reaction solution was periodically analyzed by HPLC, and when the substrate was dead, 0.25 g of the substrate was further added to continue the reaction. The reaction was carried out for about 93 hours while repeating this operation. After completion of the reaction, the amount of 5_ (1-hydroxyhydricyl) furo [2,3-c] pyridine produced was 1.8 g. Yield 72%, optical purity (R) 100% e.e.
  • Example 11 1 5-Acetylfuro [2,3-c] Pyridine Using Cell-free Extract of Candida maris IFO 10003 5- (1- (R) -Hydroxitytil ) Synthesis of flow [2,3-c] pyridine
  • pH sulfuric acid Liquid medium
  • Table 5 summarizes the amount, optical purity, and absolute configuration of the product 5- (1-hydroxyl) -17-chlorobutamate [2,3-c] pyridine per reaction solution.
  • the reduction activity was measured by adding l-OmM phosphate buffer (pH 6.5) to the substrate 5-acetylfuro [2,3-c] pyridine 1 mM, NADH 0.25 mM, dimethyl sulfoxide 0.3% (V o 1 / vo 1) Including the enzyme solution 0.05 ml 3.
  • the reaction was carried out in an Oml reaction solution for 30 to 3 minutes, and the decrease in absorbance at a wavelength of 340 nm was measured. This was used as standard reaction conditions for measurement of reduction activity. Under these reaction conditions, the enzyme activity that oxidizes l / mo1 NADH to NAD + per minute was defined as 1 unit.
  • Liquid medium consisting of the above composition was put into a 5 L jar arm mentor, and sterilized by adding 25 L and 5 drops of decanol, and sterilized with 25 Om 1 of sterilized 40% glucose aqueous solution and 50 ml of seed seed. , And cultivated for 140 hours at a culture temperature of 30 ° C, a stirring speed of 300 rpm, and an aeration rate of 0.3 L / min. During culture, when the pH was lower than 5.5, the pH was adjusted to 5.5 with a 5N aqueous sodium hydroxide solution.
  • the cells were collected by centrifugation from 10 L of the culture solution obtained by the above culture method, washed twice with 5 L of physiological saline, and the wet cells were washed with 5 mM / 3-mercaptoethanol and ⁇ 0
  • the cells were suspended in 100 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5) 12 O Oml containing 1 mM PMS F, and the cells were disrupted with Dynomill (Dyno-Mi11). Cell residue was removed by centrifugation to obtain 1760 ml of a cell-free extract.
  • the activity was measured under the standard reaction conditions for measurement of reduction activity described in Example 14 while changing only the temperature to 20 to 80 ° C. As a result, the optimum temperature was 50-55 ° C.
  • Example 14 Under the standard reaction conditions for the measurement of reduction activity described in Example 14, the activity was measured using acetic acid buffer, phosphate buffer, and tris-hydrochloride buffer as the buffer and changing the pH in the range of 3.5 to 9.0. Was done. As a result, the optimum pH was 5.0 to 6.0.
  • Example 14 Under the standard reaction conditions for measurement of reduction activity described in Example 14, various compounds and metal salts as inhibitors were added to the concentrations shown in Table 7, and the activity was measured. Table 7 shows the relative activities when the activity when no inhibitor was added was 100%. As a result, the enzyme activity was inhibited by mercury ions.
  • Oxidation activity was measured by adding lO OmM phosphate buffer (pH 8.0) to 1 mM NAD + 0.25 mM substrate, 0.3% dimethyl sulfoxide (V o 1 o 1) and 0.05 ml of enzyme solution. The reaction was carried out in an Oml reaction solution at 30 ° C for 3 minutes, and the increase in absorbance at a wavelength of 340 nm was measured. This was used as the standard reaction condition for measuring the oxidatively active substrate. Under these reaction conditions, the enzymatic activity for reducing 1 / zmol of NAD + to NADH per minute was defined as 1 unit.
  • Table 10 shows that 100% of the oxidizing activity was obtained when 5 (1- (R) -hydroxyl shetyl) furo [23-c] pyridine was used as the substrate. The relative activity was shown as As a result, it had oxidizing activity for various compounds. Table 10
  • Example 19 Synthesis of 5- (1- (R) -hydroxyxethyl) furo [2,3-c] pyridine from 5-Acetylfuro [2,3-c] pyridine by FPDH) 0.1M phosphoric acid containing 5 units of the obtained FPDHO. 5 units, 5-acetylfuro [2,3-c] pyridine 5 mg, glucose 20 mg, NAD + O. 5 mg, glucose dehydrogenase (manufactured by Amano Pharmaceutical) 4 units 0.5 ml of buffer solution (pH 6.5) was stirred at 3 for 17 hours. After the reaction, analysis was performed in the same manner as in Example 1. As a result, the optical purity was 100 ° / at a conversion of 100%.
  • e The 5- (1— (R) —hydroxyxethyl) furo [2,3-c] pyridine of e.
  • Chromosome DNA was extracted from the culture of Candida's Maris IFO 10003 according to the method described in Herford (Cel, 18, 261 (17979)).
  • the purified FPDH obtained as in Example 14 was denatured in the presence of 8 M urea, and then digested with achromopactor-derived lysyl endopeptidase (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). Sequence was determined by the Edman method. In consideration of the DNA sequence expected from this amino acid sequence, two types of PCR primers (primer 1: 5′—GGNGCNATHGTNAAYATGGG—3 ′, primer: 2: 5, one CCDATNGGRTGYTGNGTDAT—3) were synthesized.
  • Primer 1 and Primer 2 Two types of primers (Primer 1 and Primer 2) 100 pmo 1 each, 660 ng chromosomal DNA, 20 nmo each dNTP, ExT aq (Takara Shuzo Co., Ltd.) 2. Prepare EXT aq buffer solution 1001 containing 5 U Then, heat denaturation (95 ° C, 1 minute), annealing (40, 1 minute) and extension reaction (65, 2 minutes) were performed for 40 cycles. After cooling to 4, the DNA was confirmed by agarose gel electrophoresis.
  • the amplified DNA was subcloned into pT7B1ueVector (manufactured by Novagen), and its nucleotide sequence was determined. As a result, the amplified DNA was composed of 230 bases including the primer sequence.
  • the sequence is the double-underlined DNA sequence in the DNA sequence shown in FIG. Hereinafter, this sequence is referred to as “core sequence”.
  • GGAGCGGCC ACATACG Complementary sequence near the 5'-side of the core sequence Based on AGTGAATGG (Primer 3) and the sequence AGACA CCATTGCTTGATATTTGCCC (Primer-1) close to one side, two PCR primers (Primer-3 and Primer-4) having the same sequences were synthesized.
  • AGTGAATGG Primary 3
  • AGACA CCATTGCTTGATATTTGCCC Primary 3
  • Primer-4 two PCR primers having the same sequences were synthesized.
  • the reverse PCR type II first, the chromosomal DNA of Candida maris IFO 10003 was digested with the restriction enzyme PstI, and the digest was self-closed using T4 DNA ligase.
  • FIG. 1 summarizes the entire nucleotide sequence and the deduced amino acid sequence encoded by the DNA.
  • the single underlined portion represents the amino acid sequence of the peptide fragment generated by digesting purified FPDH with lysyl peptidase, which can be determined by the Edman method.
  • the amino acid sequence of FPDH derived from Candida's Maris I FO10003 is shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
  • the nucleotide sequence of the DNA encoding the above FPDH is shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing.
  • FPDH In order to express FPDH in Escherichia coli, a recombinant vector used for transformation was prepared. First, a double-stranded DNA in which an NdeI site was added to the start codon of the FPDH structural gene, and a new stop codon and an EcoRI site were added immediately after the stop codon was obtained by the following method. .
  • Primer 5 (5'-CGCCATATGTCCTACAATTTTGCCAAC-3,) having an NdeI site added to the start codon of the FPDH structural gene, and the entirety of the FPDH structural gene Primer 6 (5, -GCGGAATTCTTATTATC) with a new stop codon and an EcoRI site added immediately after the codon TTGCGGTATAACCACC-3,) was synthesized.
  • FIG. 2 shows the preparation method and structure of pNTFP.
  • Bacillus megaterium Sine-Dalgarn of Escherichia coli 5 bases upstream from the start codon of the gene for glucose dehydrogenase (hereinafter referred to as GDH) from IAM 1030 strain.
  • GDH glucose dehydrogenase
  • Escherichia coli HB101 (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) was transformed using the recombinant vector pNTF P obtained in Example 22 and the recombinant vector pNTF PG obtained in Example 23. Recombinant E. coli HB101 (pNTFP) and HB101 (pNTFPG) were obtained.
  • Escherichia coli HB101 (pNTF P) and HB101 (pNTF PG), respectively, have accession numbers FERM BP—71 16 (deposited on April 11, 2000) and FERM B P-71 1 7 (Deposit date: April 11, 2000) Institute of Biotechnology, Institute of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (address: 1-3-1, Higashi, Tsukuba, Ibaraki, S-Homeland) Has been deposited.
  • Bacillus megaterium obtained by double digesting plasmid pGDA2 (J. Biol. Chem., 264, 6381 (1 989)) with EcoRI and PstI. us me gateri um) and insert a DNA fragment of about 0.9 kb containing the GDH gene into the EcoRI-PstI site of plasmid pSTV28 (Takara Shuzo Co., Ltd.) to obtain the recombinant vector pSTVG. It was constructed. Escherichia coli HB101 (pNTFP, pSTVG) was transformed with this pSTVG at a high transfection rate by transforming E. coli HB101 (pNTFP), which had been made competent by the calcium chloride method in advance, into a high transfection rate. Obtained easily.
  • the recombinant Escherichia coli HB101 (pNTFP) obtained in Example 24 was mixed with 120 ⁇ g / m 1 of ampicillin in 2 XYT medium (Bacto 'tryptone 1.6% (w / v), Yeast extract 1.0% (w / v), NaC 10.5% (w / v), pH 7.0), and after collecting the cells, 100 mM Tris-HCl buffer (pH 7) And sonicated to obtain a cell-free extract.
  • the FPDH activity of this cell-free extract was measured by the method described in Example 14. The results are shown in Table 11 as specific activities. Bacteria 3 ⁇ 4 ⁇ name F PDH specific activity (U / mg)
  • E. coli HB 10 12.7 E. coli HB 10 (p NTFP) has a clearer FPDH activity compared to E. coli HB 01 (p UCNT), which is a vector plasmid-only transformant. Increased power S was seen.
  • Example 26 Simultaneous expression of FPDH and GDH in recombinant Escherichia coli
  • Recombinant Escherichia coli HB101 (pNTFPG) and recombinant Escherichia coli HB101 (pNTFP, pSVTG) obtained in Example 24 was treated in the same manner as in Example 25, and the FPDH activity and GDH activity were measured for the cell-free extract obtained.
  • To measure the GDH activity add the substrate glucose 0.1 ⁇ coenzyme NAD ⁇ + 2 mM and the enzyme to 1 M Tris-HCl buffer ( ⁇ 80) and measure the increase in absorbance at 340 mM at 25 ° C. It was done by doing.
  • E. coli HB101 (pNTF PG) and E. coli HB101 (pNTFP, pSVTG) showed clearer FPDH and GDH compared to E. coli HB101 (pUCNT), a transformant containing only vector plasmid. There was an increase in activity.
  • Example 27 5- (1- (R) -H) from 5-acetylfuro [2,3-c] pyridine by recombinant Escherichia coli transfected with FPDH gene under the condition of adding isopropanol to the reaction system. Dloxityl) Synthesis of flow [2,3-c] pyridine) The recombinant E.
  • Example 24 coli HB101 (pNTFP) obtained in Example 24 was sterilized in a 500-ml Sakaguchi flask at 5 Om 1 in 2 XYT medium. , And cultured with shaking at 37 for 18 hours. 1 ml of the obtained culture solution was adjusted to pH 7.0, and 5 O-acetylfuro [2,3-c] pyridine 5 Omg, isopropanol 1501 and NAD + 0.22 mg were added thereto. The mixture was stirred at 30 ° C for 7.5 hours. After completion of the reaction, the conversion and optical purity of the product, 5- (1-hydroxyshethyl) furo [2,3-c] pyridine, were measured by the same analytical method as in Example 1. The conversion was 95%. 7%, optical purity (R) 100% e.e.
  • the recombinant Escherichia coli HB101 (pNTFP) obtained in Example 24 was inoculated into a sterilized 50 ml 2 XYT medium in a 500 ml 1 volume Sakaguchi flask, and cultured with shaking at 37 for 18 hours. did. 540 units of glucose dehydrogenase (manufactured by Amano Pharmaceutical Co., Ltd.), 1.0 g of 5-acetylfuro [2,3-c] pyridine, 1.0 g of NAD + 3 mg, and 3 g of glucose were added to 2 Om 1 of the obtained culture solution. The mixture was stirred at 30 for 29 hours while adjusting the pH to 6.5 by dropwise addition of a 2.5 M aqueous sodium hydroxide solution. After completion of the reaction, the conversion and optical purity of the product 5_ (1-hydroxyethyl) furo [2,3-c] pyridine were measured by the same analytical method as in Example 1. 7.1%, optical purity (R) was 100% e.e.
  • the recombinant E. coli HB101 (p NTFPG) obtained in Example 24 was A sterilized 5 Om 1 2XYT medium was inoculated in a Sakaguchi flask, and cultured with shaking at 37 ° C for 18 hours.
  • 5-Ocetylfuro [2,3-c] pyridine 1.O g, NAD + 3 mg and glucose 3 g were added to the obtained culture medium 2 Om 1, and a 2.5 M aqueous sodium hydroxide solution was added dropwise. The mixture was stirred at 30 ° C. while adjusting to pH 6.5. Six hours after the reaction, 1.O g of 5-acetylfuro [2,3-c] pyridine and 3.O g of glucose were additionally added.
  • the recombinant Escherichia coli HB101 (pNTFPG) obtained in Example 24 was inoculated into a sterilized 5 Om1 2X YT medium in a 500 ml Sakaguchi flask and shaken at 37 ° C for 18 hours. Cultured. 5-Ocetylfuro [2,3-c] pyridine 4 Og, NAD + 3 mg, glucose 6 g, butyl acetate 2 Oml were added to the obtained culture solution 2 Om 1, and a 5 M sodium hydroxide aqueous solution was added. Was adjusted to pH 6.5 by dropwise addition, and the mixture was stirred at 30.
  • the recombinant E. coli HB101 (pNTFP) obtained in Example 24 was 5 Om 1 of 2 XYT medium sterilized in a mouth flask was inoculated, and cultured with shaking at 37 for 18 hours. 1 ml of the obtained culture solution was adjusted to pH 6.5, and 10 mg of 5— (1-hydroxyhydric) furo [2,3—c] pyridine (optical purity was 0% ee) and 50% acetone / 1 and NAD + O. 1 mg were added, and the mixture was stirred at 3 for 7 hours.
  • the recombinant Escherichia coli HB101 (pNTFP) obtained in Example 24 was inoculated into 5 Om1 of 2XYT medium sterilized in a 500-ml Sakaguchi flask and shaken at 37 "3 ⁇ 4 for 18 hours. 1 ml of the obtained culture solution was adjusted to pH 6.5, and 10 mg of 5- (1-hydroxyhexyl) furo [2,3-c] pyridine (optical purity was 0% e ) was added and stirred for 7 hours at 30.
  • an optically active pyridineethanol derivative can be produced in high yield by reducing the acetyl pyridine derivative by the action of an enzyme or an enzyme source having an asymmetric reduction activity.
  • a novel enzyme, D encoding the enzyme Provided are a NA, a recombinant vector containing the DNA, and a transformant containing the recombinant vector. Further, the use of the enzyme and the transformant enables efficient production of an optically active pyridineethanol derivative.

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Description

明 細 書
光学活性ピリジンェタノール誘導体の製造方法 技術分野
本発 は、 光学活性ピリジンエタノール誘導体の製造法に関する。 更に詳しく は、 多環式ァセチルビリジン誘導体に酵素または酵素源を作用させることによる 光学活性な多環式ピリジンエタノール誘導体の製造法に関する。
また本発明は、 上記製造法に使用できる新規の酵素、 該酵素をコードする DN A、 該 DNAを含有する組換えベクター、 及び、 該組換えベクターを含む形質転 換体に関する。
さらに本発明は、 光学不活性な多環式ピリジンエタノール誘導体に上記新規の 酵素または上記形質転換体を作用させることによる光学活性な多環式ピリジンェ タノール誘導体の製造方法に関する。 背景技術
光学活性ピリジンエタノール誘導体は、 光学活性を必要とする医薬品、 農薬等 の合成原料及び中間体として有用な化合物である。
単環式の光学活性ピリジンエタノール誘導体の製造方法としては、 ァセチルビ リジンを、 パン酵母などの微生物を用いて、 もっとも単純な光学活性ピリジンェ タノール誘導体であるヒ ドロキシェチルピリジンに変換する方法などが知られて いる （特開昭 6 1 - 2 2 7 9 1 ) 。
また、 多環式の光学活性ピリジンエタノール誘導体の製造方法としては、 ラセ ミ体の 5— (1—ヒ ドロキシェチル） フロ [2， 3— c] ピリジン、 もしくは 5 ― (1—ヒ ドロキシェチル） 一3—メチルフロ [2， 3 - c ] ピリジンを、 豚鸱 臓リパーゼ 'タイプ 2を用いた不斉エステル化反応により光学分割する方法 （W 09 6 3 56 7 8) 、 ラセミ体の 7—クロ口一 5— (1—ヒ ドロキシェチノレ） フ 口 [2， 3 - c ] ピリジンをキャンディダ 'アンタクチカ ' リパーゼ (C a n d i_d a a n t a r c t i c a 1 i p a s e ) を用!/、た不¾"エステノレィ匕反応に より光学分割する方法 （シンレッ ト， 4 1 (1 9 9 9) ) などが知られている。 しかしこれらの方法は光学分割であるため、 一方の立体の収率は最高でも 50% と低く、 満足いくものではない。
また、 5— (1—ァセチル） 一 7—クロロー 3—メチルフロ [2， 3 - c ] ピ リジンをテトラヒ ドロフラン中 （一） 一クロロジイソピノカンフェイルボラン （ c h l o r o d i i s o p i n o c amp h e y 1 b o r a n e) ¾r用いて化'ギ 的に還元することにより （S) —7—クロロー 5— （1—ヒ ドロキシェチル） 一 3—メチルフロ [2， 3— c] ピリジンを取得する方法 （ジャーナル 'ォブ .ォ ーガエック 'ケミストリー， 63, 785 1 (1 998) ) があるが、 高価な還 元剤を多量に使用するためにその工業的実施は困難である。 発明の開示
本発明者らは、 光学活性な多環式ピリジンエタノール誘導体の効率的な製造法 を開発すベく検討を重ねた結果、 ァセチルビリジン誘導体を立体選択的に還元し、 光学活性ピリジンエタノール誘導体に変換する能力を有する今までに報告例のな い酵素源を発見し、 本発明を完成するに至った。
すなわち、 本発明は、 一般式 [1] ：
Figure imgf000004_0001
(式中、 と R2は両者が互いに結合して、 酸素原子、 硫黄原子おょぴ窒素原 子からなる群より選ばれる少なくとも 1つのへテロ原子を含み、 かつ置換基を有 していてもよい 5〜 8員の単環性複素環、 又は、 この単環性複素環に他の環が縮 合してなり、 かつ置換基を有していてもよい多環性複素環を形成する。 R3及び R4は、 同一又は異なって、 水素原子、 ハロゲン原子、 水酸基、 置換基を有して いてもよい炭素数 1〜1 2のアルキル基、 又は、 置換基を有していてもよい炭素 数 1〜1 2のアルコキシ基を示す） で示されるァセチルビリジン誘導体を、 不斉 還元活性を有する酵素または酵素源を作用させて、 立体選択的に還元する、 一般 式 [2] ：
Figure imgf000005_0001
(式中、 R2、 R3及び R4は、 前記と同じであり、 *は不斉炭素を表す） で示される光学活性ピリジンエタノール誘導体の製造方法に関する。
好ましい実施態様としては、 一般式 [3] ：
Figure imgf000005_0002
(式中、 Qは、 酸素原子、 硫黄原子、 又は、 一般式— N (D) - (ここで、 Nは 窒素原子であり、 Dは水素原子または 1価の保護基を表す） を示す。 R3、 R4、 R5及び R6は、 同一又は異なって、 水素原子、 ハロゲン原子、 水酸基、 置換基 を有していてもよい炭素数 1〜1 2のアルキル基、 又は、 置換基を有していても よい炭素数 1〜1 2のアルコキシ基を示す） で示されるァセチルビリジン誘導体 を、 不斉還元活性を有する酵素または酵素源を作用させて、 立体選択的に還元す る、 一般式 [4] ：
Figure imgf000005_0003
(式中、 Q、 R3、 R4、 R5及ぴ1¾6は、 前記と同じであり、 *は不斉炭素を表 す） で示される光学活性ピリジンエタノ一ル誘導体の製造方法に関する。
また本発明は以下の （1) から （3) の理化学的性質を有する酵素に関する ：
(1) 作用：還元型ニコチンアミ ド ·アデニンジヌクレオチドを補酵素として、 5—ァセチルフロ [2， 3— c] ピリジンを立体選択的に還元し、 5— (1— ( R) ーヒ ドロキシェチル） フロ [2， 3— c] ピリジンを生成する、
(2) 特異性：ケトン及びアルデヒ ドに対して還元活性を有しているが、 炭素環 ケトン及び α—ケト酸の α位ケトンに対する還元活性は非常に低い、
( 3 ) 分子量：ゲル濾過分析において約 60000の分子量を示し、 S D Sポリ アク リルアミ ド電気泳動分析において約 29000の分子量を示す。
あるいは、 以下の （a) 又は （b) の酵素にも関する ：
( a ) 配列表の配列番号 1で示されるァミノ酸配列からなる酵素；
(b) 配列表の配列番号 1で示されるアミノ酸配列において 1若しくは数個のァ ミノ酸が欠失、 置換およびノまたは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ 5— ァセチルフロ [2， 3— c] ピリジンを立体選択的に還元して 5— (1— (R) —ヒ ドロキシェチル） フロ [2， 3 -c] ピリジンを生成する活性を有する酵素。 上記製造方法において、 上記酵素としてこれらの酵素を用いると、 絶対配置が R体である光学活性ピリジンエタノール誘導体が得られる。
更に本発明は、 これらの酵素をコードする DNA、 又は、 配列表の配列番号 2 で示される塩基配列からなる DNAに関する。 また、 これらの DNAを含有する 組換えべクタ一、 及び、 該組換えべクタ一を含む形質転換体にも関する。
上記製造方法において、 上記酵素源としてこの形質転換体を用いると、 絶対配 置が R体である光学活性ピリジンエタノール誘導体が得られる。
更にまた、 本発明は、 一般式 [5] ：
Figure imgf000006_0001
(式中、 と R2は両者が互いに結合して、 酸素原子、 硫黄原子および窒素原 子からなる群より選ばれる少なくとも 1つのへテロ原子を含み、 かつ置換基を有 していてもよい 5〜 8員の単環性複素環、 又は、 この単環性複素環に他の環が縮 合してなり、 かつ置換基を有していてもよい多環性複素環を形成する。 R3及び R4は、 同一又は異なって、 水素原子、 ハロゲン原子、 水酸基、 置換基を有して いてもよい炭素数 1〜1 2のアルキル基、 又は、 置換基を有していてもよい炭素 数 1〜 1 2のアルコキシ基を示す） で示されるピリジンエタノール誘導体に、 上 記酵素及び 又は上記形質転換体を作用させ、 R体のピリジンエタノール誘導体 を優先的に酸化し、 残存する S体のピリジンエタノール誘導体を取得する、 一般 式 [6] ：
Figure imgf000007_0001
(式中、 R2、 R3及び R4は、 前記と同じであり、 *は不斉炭素を表す） で示される絶対配置が S体の光学活性ピリジンエタノール誘導体の製造方法に関 する。
好ましい実施形態としては、 一般式 [7] ：
Figure imgf000007_0002
(式中、 Qは、 酸素原子、 硫黄原子、 又は、 一般式一 N (D) 一 （ここで、 Nは 窒素原子であり、 Dは水素原子または 1価の保護基を表す） を示す。 R3、 R4、 R5及び R6は、 同一又は異なって、 水素原子、 ハロゲン原子、 水酸基、 置換基 を有していてもよい炭素数 1〜1 2のアルキル基、 又は、 置換基を有していても よい炭素数 1〜1 2のアルコキシ基を示す） で示されるピリジンエタノール誘導 体に、 上記酵素及び Z又は上記形質転換体を作用させ、 R体のピリジンエタノー ル誘導体を優先的に酸化し、 残存する S体のピリジンエタノール誘導体を取得す る、 一般式 [8] ：
Figure imgf000008_0001
(式中、 Q、 R3、 R4、 R5及び R6は、 前記と同じであり、 *は不斉炭素を表 す） で示される絶対配置が S体の光学活性ピリジンエタノール誘導体の製造方法 に関する。 以下、 本発明について詳述する。
まず、 ァセチルビリジン誘導体 [1] に不斉還元活性を有する酵素または酵素 源を作用させて、 立体選択的に還元することによる光学活性ピリジンエタノール 誘導体 [2] の製造方法について、 詳述する。
本発明の製造方法で基質として用いられるァセチルビリジン誘導体は、 次の一 般式 [1] で示される。
[1]
Figure imgf000008_0002
上記一般式 [ 1 ] において、 と R 2は両者が互いに結合して、 酸素原子、 硫黄原子および窒素原子からなる群より選ばれる少なくとも 1つのへテロ原子を 含み、 かつ置換基を有していてもよい 5〜8員の単環性複素環を形成するか、 又 は、 この単環性複素環にさらに別の環が縮合してなり、 かつ置換基を有していて もよい多環性複素環を形成する。
具体的には、 5員の単環性複素環としては、 例えば、 フラン環、 ジヒ ドロブラ ン環、 ピロール環、 ピロリン環、 デヒ ドロジォキソラン環、 ピラゾール環、 ビラ ゾリン環、 イミダゾール環、 ォキサゾール環、 イソォキサゾール環、 ォキサジァ ゾール環、 トリァゾ一ル環、 チアゾール環、 チォフェン環、 及びジヒ ドロチオフ ェン環などが挙げられる。 6員の単環性複素環としては、 例えば、 ピラン環、 ジ ヒ ドロピラン環、 ピリジン環、 ジヒ ドロピリジン環、 テトラヒ ドロピリジン環、 デヒ ドロジォキサン環、 デヒ ドロモルホリン環、 ピリダジン環、 デヒ ドロピリダ ジン環、 ピリミジン環、 ジヒ ドロピリミジン環、 テトラヒ ドロピリミジン環、 ピ ラジン環、 及びジヒ ドロピラジン環などが挙げられる。 7員の単環性複素環とし ては、 例えば、 窒素原子、 酸素原子または硫黄原子で置換された、 シクロへプタ ン環、 シクロへブタジエン環、 シクロヘプタトリエン環、 及びチアゼピン環など が挙げられる。 8員の単環性複素環としては、 例えば、 窒素原子、 酸素原子また は硫黄原子で置換された、 シクロオタテン環、 シクロォクタジェン環、 及びシク ロォクタテトラェン環などが挙げられる。 また、 多環性複素環としては、 例えば、 ベンゾフラン環、 イソべンゾフラン環、 クロメン環、 インドリジン環、 インドー ル環、 イソインドール環、 イソキノリン環、 フタラジン環、 ナフチリジン環、 キ ノザリン環、 ベンゾチォフェン環や、 これらの水素化された環などが挙げられる。 これらの複素環は、 いずれも置換基を有していても良い。 このような置換基と しては、 例えば、 ハロゲン原子、 水酸基、 炭素数 1〜1 2のアルキル基、 及び炭 素数 1〜 1 2のアルコキシ基などが挙げられる。
上記複素環のうち、 5員の単環性複素環が好ましく、 より好ましくは置換また は無置換のフラン環であり、 特に好ましいのはフラン環である。
また、 上記一般式 [ 1 ] において、 1 3及び1¾ 4は、 同一又は異なって、 水素 原子、 ハロゲン原子、 水酸基、 置換基を有していてもよい炭素数 1〜1 2のアル キル基、 又は、 置換基を有していてもよい炭素数 1〜 1 2のアルコキシ基を示す。 具体的には、 水素原子、 塩素原子、 臭素原子、 フッ素原子、 水酸基、 メチル基、 ェチル基、 メ トキシ基、 及びエトキシ基等を挙げることができる。 上記アルキル 基及びアルコキシ基が有していてもよい置換基としては、 水酸基、 ハロゲン原子、 炭素数 1〜 1 2のアルコキシ基などが挙げられる。 R3及び R4としては水素原 子または塩素原子が好ましく、 より好ましくは水素原子である。
上記一般式 [1] で示されるァセチルビリジン誘導体のうち、 特に好ましいも のは、 次の一般式 [3] で示される。
Figure imgf000010_0001
上記一般式 [3] において、 Qは、 酸素原子、 硫黄原子、 又は、 一般式— N ( D) - (ここで、 Nは窒素原子であり、 Dは水素原子または 1価の保護基を表す ) を示す。 上記 1価の保護基とは、 ァセチル基、 メ トキシカルボニル基、 ベンジ ル基などの一般的によく知られた、 アミノ基を保護するための基である。 Qとし ては酸素原子が好ましい。
また、 R3、 R4、 R5及び R6は、 同一又は異なって、 水素原子、 ハロゲン原 子、 水酸基、 置換基を有していてもよい炭素数 1〜1 2のアルキル基、 又は、 置 換基を有していてもよい炭素数 1〜1 2のアルコキシ基を示す。 具体的には、 上 記一般式 [1] における R3及び R4について例示したものと同様のものが挙げ られる。
好適な態様によれば、 本発明の製造方法で使用される基質は、 Qが酸素原子で あり、 R3が水素原子または塩素原子であり、 R4が水素原子であり、 R5が水素 原子であり、 R6が水素原子またはメチル基である一般式 [3] で表される化合 物である。 特に好適な態様によれば、 本発明の製造方法で使用される基質は、 Qが酸素原 子であり、 R3、 R4、 R5及び R6がいずれも水素原子である一般式 [3] で表 される化合物、 すなわち 5 _ァセチルフロ [2， 3— c] ピリジンである。
上記一般式 [1] で示されるァセチルビリジン誘導体は、 公知の製造方法で容 易に入手できる。 例えば、 5—ァセチルフロ [2， 3— c] ピリジンは、 ョ一口 ッパ特許 9 1 1 33 5号明細書 （EP 9 1 1 33 5) に記載された方法により合 成可能である。 また、 5—ァセチルー 7—クロロフ口 [2， 3 - c ] ピリジンは、 J . O r g. Ch em. ， 63， 785 1 (1 998) に記載の方法により 7— クロ口一 5— （1—ヒ ドロキシェチル） フロ [2， 3 - c ] ピリジンを合成し、 これの水酸基を酸化することにより取得できる。
本発明の製造方法で使用される酵素または酵素源は、 ァセチルビリジン誘導体
[1] を光学活性なピリジンエタノール誘導体 [2] に変換する能力を有する微 生物に由来するものを用いることができる。 例えば、 このような微生物の菌体、 培養液もしくはそれらの処理物、 又は、 このような微生物から得られる酵素など が使用できる。 これらを単独で用いても、 2種以上組み合わせて用いても良い。 ァセチルビリジン誘導体 [1] を光学活性なピリジンエタノール誘導体 [2] に変換する能力を有する微生物は、 以下に説明する方法によってスクリーニング することができる。 例えば、 ァセチルビリジン誘導体 [1] として 5—ァセチル フロ [2， 3— c] ピリジンを用いた場合、 以下のようにして行う。 グルコース 40 g、 酵母エキス 3 g、 リン酸水素二アンモニゥム 6. 5 g、 リン酸二水素力 リウム 1 g、 硫酸マグネシウム 7水和物 0. 8 g、 硫酸亜鉛 7水和物 6 Omg、 硫酸鉄 7水和物 90mg、 硫酸銅 5水和物 5mg、 硫酸マンガン 4水和物 10 m g、 塩化ナトリウム 1 0 Omg (いずれも 1 L当たり） の組成からなる液体培地 (pH7) 5m 1を試験管に入れて殺菌後、 無菌的に微生物を接種し、 30 で 2〜3日間振とう培養する。 その後、 菌体を遠心分離により集め、 グルコース 2 〜10%を含んだリン酸緩衝液 l〜5m 1 に懸濁し、 あらかじめ 5—ァセチルフ 口 [2， 3— c] ピリジンを 2. 5〜25 mgいれた試験管に加えて、 2〜3日 間 30でで振とうする。 この際、 遠心分離により得た菌体をデシケーター中また はアセトンにより乾燥したものを用いることもできる。 更に、 このような微生物 またはその処理物と 5—ァセチルフロ [2， 3 - c] ピリジンを反応させる際に、 酸化型ニコチンアミ ドアデニンジヌクレオチド （以下、 NAD+と略する） 、 還 元型ニコチンアミ ドアデニンジヌクレオチド （以下、 NADHと略する） 、 酸化 型ニコチンアミ ドアデニンジヌクレオチドりん酸 （以下、 NAD P +と略する） 、 還元型ニコチンアミ ドアデニンジヌクレオチドりん酸 （以下、 NADPHと略す る） などと、 グルコース脱水素酵素またはギ酸脱水素酵素とを添加してもよい。 変換反応ののち、 反応液の 5倍体積の酢酸ェチルを加えて抽出を行ない、 生成物 を高速液体クロマトグラフィー （カラム： ダイセル化学工業株式会社製 Ch i r a 1 p a k AS、 溶離液：へキサン Zエタノール/ジェチルァミン = 9 2 8 Z 0. 1、 流速： 1 m l / i n、 検出： 2 54 n m、 力ラム温度：室温、 溶出 時間： 5—ァセチルフロ [2， 3 - c ] ピリジン 8. 8分、 5— （1— (R) ― ヒ ドロキシェチル） フロ [2， 3 - c ] ピリジン 1 1. 7分、 5— (1— (S) ーヒ ドロキシェチル） フロ [2， 3— c] ピリジン 1 7. 5分） により分析する。 本発明に使用できる微生物としては、 ァセチルビリジン誘導体 [1] を光学活 性ピリジンエタノール誘導体 [2] に変換する能力を有する微生物であればいず れも使用できる。 例えば、 ァシュべィ (A s h b V a ) 属、 キャンディダ (C a n d j d a) 属、 クリプトコッカス ( r v p t o c o_ c c_u_s ) 属、 クラビス ポラ (C I a v i s p o r a ) 属、 デノ リォマイセス (D e_b a r y omy c e ） 属、 ディボダスカス (D i p o d a s c u s ) 属、 ガラク トマイセス (G a 1 a c t o m v c e s ) 属、 ゲォトリカム (Ge o t r i c h um) 属、 ギラモ ンデラ (Gu i l l i e r mo n d e l l a) 属、 ハンセニァスポラ (Ha n s e n i a s p o_r a ) 属、 ノヽンセヌラ (Ji a n s e_n u 1 a ) 属、 ノヽィホピキァ (Hy p h o 2_i c h i a一) 属、 ィサツチエンキァ ( I s s a t c h e n k i a ) 属、 クルイべロマイセス (K 1 u V V e r o m v c e s ) 属、 クライシァ （ϋ u r a i s h i a) 属、 ロダロマイセス ( L o d d e r o m y c e s ) 属、 メシ ュニコヮ (M¾_J_ s c h n i k o w i a_) 属、 ォガタエア (O g a t a e a ) 属、 パキソレン (P a c h v s o 1 e n) 属、 ピキア (P i c h i a ) 属、 口 ドスポ リディゥム (Rh o d s p o r i d i um) 属、 ロドトルーラ (R h o d o t o r u 1 a ) 、 サッカロマイコプシス (S a c c h a r omv c o p s i s ) fe、 シュヮニォマイセス (S c hwa n n i omv c e s ) 属、 スポリディオボラス (S p o r i d i o b o 1 u s ) 属、 スポロボロマイセス (S p o r o b o 1 o m v c e s ) 属、 シゾブラス卜スポジオン (S c h i z o b l a s t o s p o r i o n) 属、 ステファノァスカス (S t e p h a n o a s c u s) 属、 トノレラス ポラ (To r u l a s p o r a) 属、 トリゴノプシス (T r i g o n o p s i s ) 属、 トリコスポロン (T r i c h o s p o r o n) 属、 ウイロプシス (W 1 1
1 0 O_S_ i s_) 属、 ヤマダジ一マ (Y a m a d a z v m a_) 属、 チゴサッカロマ イセス (Z v g o s a c c h a r omv c e s) 属、 アル力リゲネス ( A 1 c a
1 1 g e n e s ) 属、 バシラス (B a c i l l u s ) 属、 ブレビパクテリゥム （ B r e v i b a c t e r i u m) 属、 セル口モナス (C e 1 1 u 1 om o n a s
) 属、 コリネノ クテリゥム (Co r y n e b a c t e r i um) 属、 ジェンセニ ァ ( J e n s e n i a ) 属、 ォクロノくク トラム (Oc h r o b a c t r um) 属、 シュ一ドモナス (P s e u d o m o n a s ) 属、 ロ ドコッカス (Rh o d o c o e c u s) 属、 ッカムレラ (T s u k amu r e 1 1 a) 属に属する微生物等が 挙げられる。
特に、 絶対配置が S体のピリジンエタノール誘導体に変換しょうとする場合に は、 ァシュべィ (A s h b V a ) 属、 キャンディダ (C a n d i d a) 属、 タリ プトコッカス (C r y p t o c o c c u s ) 属、 クラビスポラ (C 1 a v i s_2_
0 r a ) 属、 デバリオマイセス (D e b a r y omy c e s ) 属、 ディボダス力 ス (D i p o d a s c u s) 属、 ガラク トマイセス ( a l a c t omv c e s
) 属、 ゲォトリカム (G e o t r i c h um) 属、 ギラモンデラ (Gu i 1 1 i e rmo n d e l l a) ノヽンセニフスホフ （Ha n s e n i a s p o r a— ) 属、 ノヽンセヌラ (Ha n s e n u l a) 属、 ノヽィホピキア (Hjy p h o p i c h
1 a ) 属、 ィサッチェンキア (I s s a t c h e n k i a) 属、 クゾレイべロマィ セス (K l u y v e r omy c e s) 属、 クライシァ (K u r a i s h i a ) 属、 ロダロマイセス (L o d d e r omy c e s_) 属、 メシュニコヮ (M e t s c h n i k o w i a ) 属、 ォガタエア (O g a t a e a ) 属、 ノヽ。キソレン （P a c h V s o 1 e n) 属、 ピキア (P i c h i a ) 属、 口 ドスポリディウム (Rh o d s p o r i d i um) 属、 ロ ドトノレーラ （Rh o d o t o r u l a) 属、 サッカ ロマィコプシス (S a c c h a r omy c o p s i s ) 属、 シュヮニォマイセス (S c hwa n n i omy c e s) 厲、 スポリディォホフス (S p o r i d i o b o l u s) 属、 スポロボロマイセス (S p o r o b o l omy c e s_) 属、 シ ゾブラストスポリオン (S c h i z o b 1 a s t o s p o r i o n) 属、 ステフ ァノアスカス (S t e p h a n o a s_c u s_) 属、 トノレラスポラ （T o r u 1 a. s p o r a) 属、 トリゴノプシス. (T r i g o n o p s i s) 属、 トリコスポロ ン (T r i c h o s p o r o n) 属、 ウイロプシス (W i 1 1 o p s i s ) 属、 ヤマダジーマ (Yama d a z yma) 属、 チゴサッカロマイセス (Z y g o s_ a c c h a r omy c e s 属、 ァ /レカリゲネス (A l g a l i g e n e s) 属、 バシラス (B a c i 1 1 u s ) 属、 ブレビバクテリウム (B r e v i b a c t e r i urn) 属、 セ /レロモナス (C e l l u l omo n a s) 属、 コリネノ クテリ ゥム (C o r y n e b a c t e r i u m) J¾、 シェンセニァ (J e n s e n i a ) 属、 ォクロバタ トラム (Oc h r o b a c t r um) 属、 シユードモナス （ s e_u d o m o n a s 厲、 ロドコッカス (Rh o d o c o c c u s) 属、 ッカ ムレラ (T s u k amu r e 1 1 a) 属に属する微生物が好ましい。
また、 絶対配置が R体のピリジンエタノール誘導体に変換しようとする場合に は、 キャンディダ (C a n d i d a) 属、 ォガタエア (Q g a t a e a ) 属、 ピ キア (P i c h i a ) 属、 ヤマダジーマ (Y ama d a z yma) 属、 ブレビバ クテリゥム (B r e v i b a c t e r i urn) 属、 コリネバクテリゥム (Co r V n e b a c t e r i urn) 属に属する微生物が好ましい。
具体的な例としては、 絶対配置が S体のピリジンエタノール誘導体を得る場合 には、 ァシュべィ · ゴシッピ (A s h b V a g o s s v p i i ) I FO 05 60、 キャンディダ 'フェン二力 (C a n d i d a f e n n i c a ) CB S 608 7、 キャンデイダ -ギラモンディ (C a n d i d a g u i 1 1 i e r m o n d i i ) I FO 0454、 キャンディダ 'インタ一メディア (C a n d i d a i n t e rme d i a) I F O 0 761、 キャンディダ 'クルセィ （ a n d i d a k r u s e i ) I F O 001 1、 キャンディダ ·マグノリェ （ C a n d i d a m a g n o 1 i a e_) I FO 0705、 キャンディダ ·マノレ トーサ (C a n d i d a ma l t o s a) CBS 561 2、 キヤンディダ · ヴアーサチリス (C a n d i d a v e r s a t i 1 i s ) I F O 1 90 8、 キヤンディダ ·モギー (C a n d i d a m o i i ) I FO 0 4 3 6、 キ ヤンディダ · ノ一ベジェンシス (C a n d i d a n o r v e e n s i s ) I F O 1 0 2 0、 キャンディダ 'パラプシロシス (C a n d i d a a r a p s i 1 o s i s ) I F O 0 5 8 5、 キャンディダ 'シユードトロピカリス （ C a n d i d a. p s e u d o t r o o i c a 1 i s_) I AM 4 840、 キヤ ンデイダ -ノレゴーサ (C a n d i d a r u g o s a ) I F O 0 750、 キヤ ンデイダ .ォレオフイラ (C a n d i d a o 1 e o p h i l a ) CB S 2 2 1 9、 キャンディダ .ステラタ (C a n d i d a s t e 1 l a t a) I F O 0 70 1、 キャンディダ ' トロピカリス (C a n d i d a t r o i c a l i _s_) I F O 0 00 6、 キャンデイダ -ボディニイ (C a n d i d a b o d i n i i ) I FO 1 0 5 74、 キャンディダ ·サイ トアナ (C a n d i d a a i t o a n a ) I F O 0 3 80、 キャンディダ 'アルビカンス (C a n d i d a a l b i c a n s ) I FO 0 7 5 9、 キャンディダ 'カリオシリグニコ ーラ (C a n d i d a _c a r i_ o s i 1 i ¾_n i c o 1 a I F O 1 9 1 0、 キヤンディダ . ソラニ (C a n d i d a s o 1 a n i ) I F O 0 76 2、 キ ヤンデイダ 'テヌイス (C a n d i d a t e n u i s ) I F O 0 7 1 6、 ク リプトコッカス ·アルビダス ·バー 'アルビダス (C r y p t o c o c c u s a 1 b i d u s v a r . a 1 b i d u s ) I F O 0 3 7 8、 クリプトコッカ ス . フミコーラ (C r y p t o c o c c u s h u m i c o 1 a ) CB S 1 8 96、 クリプトコッカス 'テレウス (C r y p t o c o c_c u s t e r r e u _s_) I FO 0 7 2 7, クラビスポラ 'ルシタニェ (C 1 a V i s p o r a 1 u s_i t a n i a e ) I FO 1 0 1 9、 デノ リオマイセス 'ノヽンセニイ （D e b a r V o my c e s_ h a n s e n i i ) I F O 00 8 2、 デ/くリォマィ セス .マラマ (D e b a r y omy c e s m a r a m a ) I F O 066 8、 デバリォマイセス ·カルソニイ (D e b a r y omv c e s c a r s o n i i ) I F O 0 94 6、 デバリオマイセス 'カステリィ (D e b a r y omy c e 丄 c a s t e 1 1 i i ) I FO 1 3 5 9、 ディボダスカス ·ォべテンシス （ D i_p o d a_s c u s o v e t e n s i s ) I F O 1 20 1、 ディポダス力 ス 'テトラスノ 一" ^ (D i p o d a s c u s t e t r a s p e rma) CBS 765. 70、 ガラク トマイセス · レシィ (G a 1 a c t o m v c e s r e e s s i i ) CBS 1 79. 60、 ゲォトリカム 'キャンディダム (Ge o t r i c h um c a n d i d urn) CB S 1 78. 71、 ゲォトリカム ' フラ グランス (Ge o t r i c h um f r a g r a n s) CB S 1 64. 32、 ゲォトリカム .キャンディダム (Ge o t r i c h um c a n d i d um) C B S 1 87. 67, ギラモンデラ 'セレノスポラ (Gu i 1 1 i e r mo n d e 1 1 _ s e l e n o s p o r a) I F O 1 850、 ノヽンセニァスポラ ·ノ ルビエンシス (H a n s e n i a s p o r a v a l b v e n s i s) I F O 01 1 5、 ノヽンセヌラ 'ポリモーファ DL 1 (H a n s e n u 1 a o l y mo r p h a D L 1 ) AKU 4752、 ハイホピキア ·バートニイ (Hy h o p i c h i a b u r t o n i i ) I FO 0844、 ィサッチェンキア · オリエンタリス (丄 s s a_t c h e n k i a o r i e n t a l i s.) I F O 1 279、 クノレイベロマイセス · ラクテイス (K 1 u V V e r o m γ c _e s_ 丄 _a c t i s ) I FO 1090、 クノレイべロマイセス ·サーモ トレランス (K 1 u v v e r omy c e s t h e r mo t o l e r a n s) I F O 0662、 クライシァ .カプスラータ (Ku r a i s h i a c a p s u l a t a ) I FO
0721、 ロダロマイセス 'ェロンギスポラス (L o d d e r omy c e s e l o n g i s p o r u s) I F O 1 6 76、 メシュニコヮ ' ビクスビダ一タ (M e t s c h n i k o w i a b i c_u s o i d a t a ) I F O 1408、 メシュニコヮ ·グルェシ (M e t s c h n i k ow i a _g r u e s s i i ) I FO 0749、 ォガタエア · ミヌータ ·バー · ミヌータ (Q g a t a e a m i n u t a v a r . m i n u t a ) I FO 0975、 ォガタエア · ミヌータ ' ノ 一 -ノンファ一メンタス (_0 g a t a e a m i n u t a v a r . n o n f e rme n t a n s) I FO 1 473、 ォガタエア 'ポリモーファ (O g a t a e a p o l ymo r p h a) I FO 0799、 ノヽ。キソレン ·タンノフィ ラス (P a c h y s o l e n t a n n o p h i 1 u s ) I FO 1007、 ピ キア . 口ダネンシス (P j c h i a r h o d a n e n s i s ) I FO 1 27 2、 ピキア · トレハロフィラス （P i c h i a t r e h a l o h i l a) I F O 1 282、 ピキア . ウィッカーノヽミィ (P i c h i a w i c k e r h a m i l ) I FO 1 278、 ロ ドスポリディウム 'ディオボバツム (Rh o d s D o r i _d i u m d i o b o v a t u m) I F O 0688、 ロ ドスポリ ディウム ·スファェロカ一ノ ム (Rh o d s p o r i d i um s p h a e r o c a r p u m) I FO 1438、 口 ドスポリディゥム · トルロイデス （Rh o d s p o r i d i u m t o r u 1 o i d e s ) I FO 0559、 ロドトル一 ラ 'アラウカリエ （Rh o d o t o r u l §_ r a u c a r i a e) I FO 1 0053、 ロドトル一ラ .グルチニス (Rh o d o t o r u l a g 1 u t i n i s ) I F O 1 099、 ロ ドトル一ラ ·グルチニス ·バー ·ダイレネンシス (Rn o d o t o r u l a _g 1 u t i n i s v a r . d a i r e n e n s i _s_) I FO 04 1 5、 ロ ドトノレ一ラ · グラミニス (Rh o d o t o r u l a g r a m i n i s ) I F O 0 1 90、 サッカロマイコプシス ·フイブリゲラ (S a c c h a r omv c o p s i s f i b u l i g_e r a) I F O 0 10 4、 サッカロマイコプシス ·マランガ (S a c c h a r omy c op s i s m a 1 a n g a ) I FO 1 710、 シュヮニォマイセス 'オシデンタリス 'バー •オシアンタリス (S c hwa n n i omy c e s o c c i d e n t a 1 i s v a r . o c c i d e t a l i s) I FO 0371、 スポリディオボラス •ジョンソニイ (S p o r i d i o b o 1 u s J_o_h n s o n i i ) I FO 6903、 スポロボロマイセス 'サ /レモ二カラー (S p o r o b o 1 o m v c e _s_ s a l mo n i c o l o r) I AM 1 2249、 スポロボロマイセス · 口 セウス S p o r o b o l omv c e s r o s e u s ) I F O 1 1 06、 シ ゾブラストスポリオン · コバヤシ (S c h i z o b l a s t o s p o r i o n k o b a V a s i i ) I FO 1 644、 ステファノァスカス ·シフエリイ （ t e p h_a n_o a s c u_s_ c i f e r r i i_) I F O 1 854、 トノレラスポ ラ .グロボサ (T o r u 1 a s p o r a g 1 o b o s a ) I F O 00 1 6、 トリゴノプシス .バリアビリス (T r i g o n o p s i s v a r i a b i 1 i _s_) I FO 0671、 トリコスポロン -アクアチル （T r i c h o s p o r o n. a q u a t i 1 e ) ATCC 223 10、 トリコスポロン 'キユタネゥム (T r i c h o s p o r o n c u t a n e um) I FO 1 1 98、 トリコス ポロン · ファ一メンタンス (T r i c h o s p o r o n f e r m e n t a n s ) ATCC 1 0 6 7 5、 ウイロプシス 'サターナス ·バー ' シュアべロレンス (W i l l o p s i s s a t u r n u s v a r . s u a v e o 1 e n s ) I FO 0 8 0 9、 ウイロプシス 'サタ一ナス 'ノ一'ムラキイ (W i 1 1 o p s i s s a t u r n u s v a r . m r a k i i ) I FO 0 8 9 5、 ヤマダジ 一マ ·ノヽプ口フイラ (Y a m a d a z y m a h a p 1 o D h i 1 a ) I F O 0 9 4 7、 チゴサッカロマイセス ·ノくィリ (Z V g o s a_c c h a r omv c e _s_ b a i 1 i i ) I FO 0 4 8 8、 チゴサッカロマイセス 'ノレキシ （ Z y g_ o s a c c h a r o my c e s o u x i i ) I F O 0 4 9 3、 アル力リゲ ネス .キシロソオキシダント (A 1 c a 1 i g e n e s x y l o s o x i d a n s ) I F O 1 3 4 9 5、 アルカリゲネス ·キシロソオキシダント .サブスピ ーズ ·デントリフイカンス (A 1 c a 1 i R e n e s x y l o s o x i d a n _s_ s u b s p . d e n t r i f i c a n s_) I F O 1 2 6 6 9、 ノ シラス •メガテリウム ( B a c_j_ 1 1 u s m e ¾ a t e r i um) 、 ノくシラス ·ァミ ロ リケファシェンス (B a c i 1 1 u s a my 1 o l i a_u e f a c i e n s ) I FO 3 0 2 2、 ブレビバタテリゥム 'インサータム (B r e v i b a c t e r i u m i n c e r t u m) I F O 1 2 1 4 5、 セルロモナス ' フイミ ( C e l l u l o mo n a s f i m i ) I AM 1 2 1 0 7、 コリネバクテリウ ム ·スピーシス、 (C o r y n e b a c t e r i u m s p . ) ATCC 2 1 2 4 5、 ジェンセニァ ·カニクノレリア ( J e n s e n i a _c a n i c r u r i a ) I FO 1 3 9 1 4、 ォクロバク トラム 'スピ一シズ （O c h r o b a c t r urn s p . ) I F O 1 2 9 5 0、 シユードモナス 'スタツチェリ （P s e u d o m o n a s_ s t u t z e r i ) I F O 1 3 5 9 6、 シユードモナス ·ク ロロラフイス (P s e u d p mo n a s c h l o r o r a p h i s ) I F O 3 9 0 4、 シユードモナス ·メンドシナ (P s e u d o m o n a s me n d o c i n a ) I FO 1 4 1 6 2、 ロ ドコッカス 'エリス口ポリス （R h o d o c o c c u s e r y t h r o p o l i s ) I FO 1 2 3 2 0、 ロドコッカス . ロードクロウス (Rh o d o c o c c u s r h o d o c h r o u s ) I F O 3 3 3 8、 ッカムレラ 'パゥロメタボラ （J s u k a mu r e 1 1 a D a u r ome t a b o 1 a) I FO 1 21 60などが挙げられる。
また、 絶対配置が R体のピリジンエタノール誘導体を得る場合には、 キャンデ イダ ·ェシェルシィ （C a n d i d a_ e t c h e 1 1 s i i ) I FO 1 94 2、 キャンディダ ' ラクテイスコンデンシィ (C a n d i d a 1 a c t i s - c o n d e n s i ) I FO 1 286、 キヤンディダ 'マリス (Ca n d i d a ma r i s ) I FO 10003、 ォガタエア · ウイッカーハミィ (Q g a t a e a w i c k e r h am i i ) I F O 1 706、 ピキア 'ファリノーサ （ P i c h i a f a r i n o s a ) I FO 0602、 ピキア 'メンブラナエフ ァシェンス (P i c h i a memb r a n a e f a c i e n s ) I F O 04 60、 ピキア 'ナガニシィ (P i c h i a n a g a n i s h i i ) I FO 1 670、 ヤマダジ一マ . ファリノーサ (Y ama d a z yma. f a r i n o s a) I F O 0534、 ブレビバクテリウム 'ィオデイナム （ B r e v i b a c t e r i um i o d i n a m) I FO 3558、 コリネバクテリゥム ·ァセ 卜 シドフィフム ( o r y n e b a c t e r i u m a c e c t o a c i α o h i 1 um) ATCC 2 1476などが挙げられる。
これら微生物は一般に、 入手または購入が容易な保存株から得ることができる が、 自然界から分離することもできる。 なお、 これらの微生物に変異を生じさせ て本反応により有利な性質を有する菌株を得ることもできる。
これらの微生物の培養には、 通常これらの微生物が資化しうる栄養源を含む培 地であれば何でも使用できる。 例えば、 グルコース、 シュ一クロース、 マルトー ス等の糖類、 乳酸、 酢酸、 クェン酸、 プロピオン酸等の有機酸類、 エタノール、 グリセリン等のアルコール類、 パラフィン等の炭化水素類、 大豆油、 菜種油等の 油脂類、 またはこれらの混合物等の炭素源；硫酸アンモニゥム、 リン酸アンモニ ゥム、 尿素、 酵母エキス、 肉エキス、 ペプトン、 コーンスチープリカー等の窒素 源；更に、 その他の無機塩、 ビタミン類等の栄養源； を適宜混合 ·配合した通常 の培地を用いることが出来る。 これら培地は用いる微生物の種類によって適宜選 択すればよい。
微生物の培養は通常一般の条件により行なうことができ、 例えば、 pH4. 0 〜 9. 5、 温度範囲 20 °C〜 45 °Cの範囲で、 好気的に 10〜 96時間培養する のが好ましい。 ァセチルビリジン誘導体 [1] に微生物を反応させる場合におい ては、 通常、 上記微生物の菌体を含んだ培養液をそのまま反応に使用することも できるが、 培養液の濃縮物も用いることができる。 また、 培養液中の成分が反応 に悪影響を与える場合には、 培養液を遠心分離等により処理して得られる菌体ま たは菌体処理物を使用することも出来る。
上記微生物の菌体処理物としては特に限定されず、 例えば、 アセトンや五酸化 二リンによる脱水処理またはデシケーターや扇風機を利用した乾燥によって得ら れる乾燥菌体、 界面活性剤処理物、 溶菌酵素処理物、 固定化菌体または菌体を破 碎した無細胞抽出標品などをあげることができる。 更に、 培養物より、 不斉還元 反応を触媒する酵素を精製し、 これを使用してもよい。
本発明において還元反応を行う際には、 基質であるァセチルビリジン誘導体 [ 1] を反応の初期に一括して添加してもよく、 反応の進行にあわせて分割して添 加してもよい。 反応時の温度は通常 1 0〜60°C、 好ましくは 20〜4 であ り、 反応時の pHは 2. 5〜9、 好ましくは 5〜 9の範囲である。 反応液中の酵 素または酵素源の量はこれらの基質を還元する能力に応じ適宜決定すればよい。 また、 反応液中の基質濃度は 0. 0 1〜50% (w/v) が好ましく、 より好ま しくは、 0. l〜30°/o (w/v) である。 反応は通常、 振とうまたは通気攪拌 しながら行なう。 反応時間は基質濃度、 酵素または酵素源の量及びその他の反応 条件により適宜決定される。 通常、 2〜1 68時間で反応が終了するように各条 件を設定することが好ましい。
本発明において還元反応を促進させるために、 反応液にグルコース、 エタノー ル、 イソプロパノールなどのエネルギー源を 0. 5〜30 %の割合で加えると優 れた結果が得られるので好ましい。
一般に生物学的方法による還元反応に必要とされている NADH、 NADPH 等の補酵素を添加することにより、 反応を促進させることもできる。 この場合、 具体的には、 反応液に直接これらを添加する。
また、 還元反応を促進させるために、 NAD+及ぴ Z又は NAD P+をそれぞ れの還元型へ還元する酵素、 並びに、 該還元のための基質を存在させて反応を行 うと、 優れた結果が得られるのでより好ましい。 例えば、 還元型へ還元する酵素 としてグルコース脱水素酵素を、 還元のための基質としてグルコースを存在させ るか、 又は、 還元型へ還元する酵素としてギ酸脱水素酵素を、 還元のための基質 としてギ酸を存在させることができる。
更に、 トリ トン （ナカライテスク株式会社製） 、 スパン （関東化学株式会社製 ) 、 ツイーン （ナカライテスタ株式会社製） などの界面活性剤を反応液に添加す ることも効果的である。 ァセチルビリジン誘導体 [1] 及び Z又は光学活性なピ リジンエタノール誘導体 [2] による反応の阻害を回避する目的で、 酢酸ェチル、 酢酸ブチル、 イソプロピルエーテル、 トルエン、 へキサンなどの、 水に不溶な有 機溶媒を反応液に添加してもよい。 ァセチルビリジン誘導体 [1] の溶解度を高 める目的で、 メタノール、 エタノール、 アセトン、 テトラヒ ドロフラン、 ジメチ ルスルホキシドなどの、 水に可溶な有機溶媒を添加することもできる。 次に、 本発明の酵素、 該酵素をコードする DNA、 該 DNAを含有する組換え ベクター、 及び、 該組换えベクターを含む形質転換体について詳述する。
本発明の酵素は、 以下の （1) 〜 （3) の理化学的性質を有する ：
(1) 作用： NADHを補酵素として、 5—ァセチルフロ [2， 3— c] ピリジ ンを立体選択的に還元し、 5— ( 1 - (R) —ヒ ドロキシェチル） フロ [2， 3 一 c] ピリジンを生成する、
(2) 特異性：ケトン及びアルデヒ ドに対して還元活性を有しているが、 炭素環 ケトン及び α—ケト酸の α位ケトンに対する還元活性は非常に低い、
(3) 分子量：ゲル濾過分析において約 60000の分子量を示し、 SDSポリ ァクリルアミ ド電気泳動分析において約 29000の分子量を示す。
好ましくは、 上記 （1) 〜 （3) の理化学的性質に加えて、 以下の （4) 〜 （ 6) の理化学的性質を有する酵素である。
(4) 至適温度： 50 〜55°C、
( 5 ) 至適 p H： 5. 0〜 6. 0、
(6) 阻害剤：水銀イオンによって阻害される。
本発明において、 酵素の還元活性は、 l O OmMリン酸緩衝液 （pH6. 5) に、 基質 l mM、 補酵素 NADH 0. 25 mM、 ジメチルスルホキシド 0· 3 % (v o 1 /v o 1 ) 及び酵素溶液を含む 3. Om lの反応液中、 30°Cで 3分 間反応させ、 波長 340 nmの吸光度の減少を測定することにより実施する。 特異性において 「還元活性は非常に低い」 とは、 5—ァセチルフロ [2， 3— c] ピリジンに対する還元活性を 1 00%とした場合、 その基質に対する還元活 性が 1 0%以下であることを意味する。 また、 「炭素環ケトン」 とは、 シクロへ キサノン、 シクロペンタノンなどの脂環式化合物の環内の一 CH2—を一 C (= O) —に置き換えた時に生ずるケトンを意味している。
分子量は、 TSK— G 3000 SW (7. 8 mm I . D. X 30 c m) (東ソ 一株式会社製） カラムを用いたゲル濾過分析により、 標準タンパク質の相対溶出 時間から算出することにより決定する。 また、 サブユニットの分子量は、 20% SDS—ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動分析により、 標準タンパク質の相対移 動度から算出することにより決定する。
酵素の至適 pH、 至適温度は、 例えば、 還元活性測定系の反応 pH、 反応温度 を変えて還元活性を測定することによって決定する。
阻害剤は、 例えば、 還元活性測定系に種々の化合物を添加して還元活性を測定 することによって決定する。
本発明の酵素の起源として用いられる微生物は、 5—ァセチルフロ [2， 3— c] ピリジンを立体選択的に還元して 5— (1 - (R) ーヒ ドロキシェチル） フ 口 [2， 3 - c] ピリジンを生成する酵素を有する微生物であればいずれでも良 い。 また、 野生株または変異株のいずれでも良く、 更に、 細胞融合、 遺伝子操作 等の遺伝子学的手法により誘導される組換え微生物も用いることができる。 好ま しくはキャンディダ (C a n d i d a) 属に属する微生物が用いられる。 より好 ましくは、 キャンディダ 'マリス (Ca n d i d a ma r i s ) であり、 特に 好ましくはキャンディダ 'マリス (C a n d i d a ma r i s ) I FO 1 00 03株である。
以下に、 5—ァセチルフロ [2， 3— c] ピリジンを立体選択的に還元して 5 - (1— (R) —ヒ ドロキシェチル） フロ [2， 3— c] ピリジンを生成する酵 素を有する微生物より、 本発明の酵素を取得する方法の例を記載するが、 本発明 はこれに限定されない。 5—ァセチルフロ [2， 3— c] ピリジンを立体選択的 に還元して 5— ( 1— ( R ) ーヒ ドロキシェチル） フロ [ 2， 3— c ] ピリジン を生成する酵素を有する微生物を適切な培地で培養し、 培養液から菌体を遠心分 離した後、 菌体を適当な緩衝液中に懸濁し、 該菌体をグラスビーズ等の物理的手 法、 酵素などの生化学的手法などを用いて破碎または溶解し、 更に、 遠心分離に より該溶液中の固形物を除去することにより、 粗酵素液を得ることができる。 あ るいは、 培養液から、 上記と同様の精製法で粗酵素液を得ることができる。 さら に、 この粗酵素液を、 当業者が通常用いる手法、 例えば、 硫酸アンモニゥム沈殿、 透析、 クロマトグラフィーを単独でまたは組み合わせて用いて精製を行うことが できる。 クロマトグラフィーは、 疎水クロマトグラフィー、 イオン交換クロマト グラフィー、 ゲル濾過クロマトグラフィーを単独で、 または組み合わせて用いる こともできる。
本発明の酵素は、 上述のように微生物から取得する天然酵素であってもよいし、 組換え酵素であってもよい。 天然酵素としては、 配列表の配列番号 1で示される アミノ酸配列からなる酵素が挙げられる。
また本発明の酵素は、 配列表の配列番号 1で示されるアミノ酸配列において 1 若しくは数個のアミノ酸が欠失、 置換および Zまたは付加されたアミノ酸配列か らなり、 かつ 5—ァセチルフロ [ 2， 3— c ] ピリジンを立体選択的に還元して 5 - ( 1— ( R ) —ヒ ドロキシェチル） フロ [ 2， 3 - c ] ピリジンを生成する 活性を有するものであってもよい。 ここで、 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、 置換および Zまたは付加とは、 部位特異的突然変異誘発法等の周知の方法により 欠失、 置換おょぴ または付加できる程度の数のアミノ酸が欠失、 置換おょぴ Z または付加されることを意味する。 5 _ァセチルフロ [ 2， 3— c ] ピリジンを 立体選択的に還元して 5— ( 1— ( R ) —ヒドロキシェチル） フロ [ 2， 3 - c ] ピリジンを生成する活性を有するとは、 5—ァセチルフロ [ 2， 3— c ] ピリ ジンと反応させた場合、 配列表の配列番号 1で示されるアミノ酸配列からなる酵 素を用いた場合の 1 0 %以上、 好ましくは 4 0 %以上、 特に好ましくは 6 0 %以 上の収率で 5— （1一 ( R ) —ヒ ドロキシェチル） フロ [ 2， 3— c ] ピリジン を生成することをいう。 この収率を測定するには、 上述した高速液体クロマトグ ラフィーを用いる。 なお、 一旦精製した酵素が取得できれば、 当業者に公知の方法により、 該酵素 をコードする DNAを取得することができる。 この DNAを他の微生物に導入し て組換え微生物を取得し、 これを培養すれば、 本発明の製造方法で使用できる酵 素源を大量に製造できる。
以下に、 本発明の酵素をコードする DNAを取得する方法の例を記載するが、 本発明はこれに限定されない。 まず、 精製した酵素を適当なエンドべプチダーゼ により消化し、 逆相 HP LCにより切断された断片を精製後、 プロテインシーク ェンサ一により部分アミノ酸配列の一部を決定する。 そして、 得られた部分アミ ノ酸配列をもとにして、 PCR (P o l yme r a s e Ch a i n Re a c t i o n) プライマーを合成する。 次に、 該 DNAの起源となる微生物より、 通 常の DNA単離法、 例えば H e r e f o r d法 （C e 1 1， 1 8， 1 26 1 ( 1 979) ) により、 該微生物の染色体 DNAを調製する。 この染色体 DNAを铸 型として、 先述の PCRプライマーを用いて PCRを行い、 該酵素をコードする DNAの一部を増幅 （コア配列） し、 塩基配列決定を行う。 塩基配列決定はジデ ォキシ ·チェイン ·ターミネーシヨン法等により決定できる。 例えば、 AB I 373 A DNA S e q u e n c e r (Ap p l i e d B i o s y s t em s社製） 等を用いて実施可能である。 コア配列の周辺領域の塩基配列を明らかに するために、 該微生物の染色体 DNAを、 コア配列中にその認識配列が存在しな い制限酵素により消化し、 生成した DNA断片を T4リガーゼにより自己環化さ せることにより逆 PCR (Nu c l e i c Ac i d s Re s. 1 6， 8 1 8 6 (1 988) ) 用の铸型 DNAを調製する。 次に、 コア配列をもとに、 コア配 列の外側に向かう DNA合成の開始点となるプライマ一を合成し、 逆 PC Rによ りコア配列の周辺領域を増幅する。 こうして得られた DNAの塩基配列を明らか にすることにより、 目的酵素の全コード領域の DN A配列を明らかにできる。 D NA配列が明らかになれば、 PCRなどの方法により、 該微生物の染色体 DNA から本発明の酵素をコードする DN Aを取得することができる。
本発明の酵素をコードする DNAをベクターに組込み、 これを宿主内に導入し てなる形質転換体内で酵素遺伝子を発現させることができる。 このために用いら れるベクターとしては、 適切な宿主内で該酵素遺伝子を発現できるものであれば いずれもが使用できる。 このようなベクターとしては、 例えば、 プラスミ ドべク タ一、 ファージベクター、 コスミ ドベクターなどが挙げられる。 また、 他の宿主 との間での遺伝子交換が可能なシャトルベクターも使用できる。 このようなべク ターは、 作動可能に連結されたプロモーター （1 a cUV 5プロモーター、 t r ρプロモーター、 t r cプロモーター、 t a cプロモーター、 l p pプロモータ 一、 t u f Bプロモーター、 r e c Aプロモーター、 p Lプロモーター） 等の制 御因子を含み、 本発明の DN Aと作動可能に連結された発現単位を含む発現べク ターとして好適に使用できる。 例えば、 p UCNT (WO 94/036 1 3) 等 が好適に使用できる。
本明細書で用いる用語 「制御因子」 は、 機能的プロモーター及び、 任意の関連 する転写要素 （例えばェンハンサ一、 CCAATボックス、 TATAボックス、 S P I部位など） を有する塩基配列をいう。
本明細書で用いる用語 「作動可能に連結」 は、 遺伝子が発現するように、 DN Aと、 その発現を調節するプロモーター、 ェンハンサ一等の種々の調節エレメン トとが宿主細胞中で作動できる状態で連結されることをいう。 制御因子のタイプ 及び種類が、 宿主に応じて変わり得ることは、 当業者に周知の事項である。
本発明の DNAを含有する組換えベクターを導入する宿主としては、 細菌、 酵 母、 糸状菌、 植物細胞、 動物細胞などが挙げられるが、 大腸菌が特に好ましい。 本発明の DNAは定法により宿主細胞に導入できる。 宿主細胞として大腸菌を用 いる場合、 例えば塩化カルシウム法により、 本発明の DNAを導入できる。
本発明の酵素又は形質転換体を用いて、 ァセチルビリジン誘導体 [1] を立体 選択的に還元して絶対配置が R体であるピリジンエタノール誘導体を取得、 特に 好ましくは 5—ァセチルフロ [2， 3— c] ピリジンを立体選択的に還元して 5 - (1— (R) —ヒドロキシェチル） フロ [2， 3 - c] ピリジンを取得する場 合、 補酵素として NADHが必要となる。 反応系に NADHを必要な量だけ添加 しても実施できる。 しかし、 酸化された該補酵素 （NAD + ) を還元型 （NAD H) に変換する能力 （以後、 補酵素再生能力と呼ぶ） を有する酵素をその基質と 共に、 つまり補酵素再生系を本発明の酵素と組み合わせて反応を行うことにより、 高価な補酵素の使用量を大幅に削減することができる。 補酵素再生能力を有する 酵素としては、 ヒドロゲナーゼ、 ギ酸脱水素酵素、 アルコール脱水素酵素、 グル コース一 6—リン酸脱水素酵素及ぴグルコース脱水素酵素等を用いることができ る。 好適には、 グルコース脱水素酵素、 ギ酸脱水素酵素が用いられる。
このような反応は、 補酵素再生系を不斉還元反応系内に添加することによって も実施できるが、 本発明の酵素をコードする DNA及びグルコース脱水素酵素を コードする DNAの両者により形質転換された形質転換体を用いる場合は、 補酵 素再生能力を有する酵素を別に調製し反応系内に添加しなくても、 効率的に反応 を行うことができる。 このような形質転換体は、 本発明の酵素をコードする DN A及びグルコース脱水素酵素をコードする DN Aを、 同一のベクタ一に組込み、 これを宿主に導入することにより製造できるし、 また、 これら 2種類の DNAを 不和合性グループの異なる 2種のベクターにそれぞれ組込み、 それらを同一の宿 主に導入することによつても製造できる。 すなわち、 本発明の酵素をコードする DN Aとグルコース脱水素酵素をコードする DN Aとを含有する組換えべクタ一 を含む形質転換体や、 本発明の酵素をコードする D N Aを含有する第 1の組換え ベクターと、 グルコース脱水素酵素をコードする DN Aを含有する第 2の組換え ベクターとを含む形質転換体を使用できる。
本発明の酵素もしくは形質転換体が捕酵素再生能力を有している場合は、 その 再生のための基質を反応系に添加することにより N ADHの再生反応を同時に行 うことができ、 他の補酵素再生能力を有する酵素を反応系に追加添加しなくても、 高価な補酵素の使用量を大幅に削減できる。 例えば、 本発明の酵素もしくは形質 転換体がィソプロパノールの酸化活性を有している場合は、 還元反応系にィソプ ロパノールを添加することによって NADHを再生することが可能となる。
本発明の形質転換体を用いたァセチルビリジン誘導体 [1] からの光学活性ピ リジンエタノール誘導体 [2] の生産、 特に 5—ァセチルフロ [2， 3— c] ピ リジンからの 5— (1— (R) —ヒ ドロキシェチル） フロ [2， 3— c] ピリジ ンの生産は以下のように実施できる。 但し、 以下の方法に限定されるわけではな い。 まず最初に、 適当な溶媒中に基質 5—ァセチルフロ [2， 3 - c] ピリジン [1] 、 NAD+等の補酵素、 及び、 該形質転換体の培養物またはその処理物な どを添加し、 pH調整下、 攪拌して反応させる。 この反応は 10〜70 の温度 で行われ、 反応中反応液の P Hは 4〜 1 0に維持する。 反応はバッチ式または連 続方式で実施できる。 バッチ方式の場合は、 反応基質は 0 . 1 %〜7 0 % (w/ v ) の仕込み濃度で添加できる。 ここで形質転換体の処理物などとは、 例えば、 粗酵素液、 培養菌体、 凍結乾燥菌体、 アセ トン乾燥菌体、 あるいはそれらの磨砕 物、 これらの混合物などを意味する。 更にそれらは、 酵素自体または菌体のまま 公知の手段で固定化されて使用できる。 また、 本反応を行う際、 形質転換体とし て本発明の酵素とグルコース脱水素酵素の両者を生産するものを用いる場合、 反 応系に更にグルコースを添加することによって、 補酵素の使用量を大幅に減らす ことが可能となる。 次に、 上記酵素及び Z又は形質転換体をピリジンエタノール誘導体に作用させ、 R体のピリジンエタノール誘導体を優先的に酸化し、 残存する S体のピリジンェ タノ一ル誘導体を取得することによる、 絶対配置が S体のピリジンエタノール誘 導体の製造方法について、 詳述する。
本発明の製造方法において基質として用いられるピリジンエタノール誘導体は、 次の一般式 [ 5 ] で示される。
Figure imgf000027_0001
上記一般式 [ 5 ] において、 及び R2は上記一般式 [ 1 ] で言及したものと 同様である。 なかでも、 5員の単環性複素環が好ましく、 より好ましくは置換ま たは無置換のフラン環であり、 特に好ましいのはフラン環である。
また、 R 3及び R 4も上記一般式 [ 1 ] で言及したものと同様であり、 好まし くは水素原子または塩素原子であり、 より好ましくは水素原子である。
ピリジンエタノール誘導体 [ 5 ] は、 光学純粋が 1 0 0 %未満のものであれば 特に限定されない。 完全なラセミ体であってもよいし、 ある程度の光学純度を持 つているものでもよい。
ピリジンエタノール誘導体 [5] のうち、 特に好ましいものは、 次の一般式 [ 7] で示される。
Figure imgf000028_0001
上記一般式 [7] において、 Qは上記一般式 [3] で言及したものと同様であ る。 Qとしては酸素原子が好ましい。 また、 R3、 R4、 R5及び R6も上記一般 式 [3] で言及したものと同様である。
好適な態様によれば、 本発明の製造方法で使用される基質は、 Qが酸素原子で あり、 R 3が水素原子または塩素原子であり、 R4が水素原子であり、 R5が水素 原子であり、 R6が水素原子またはメチル基である一般式 [7] で表される化合 物である。
特に好適な態様によれば、 本発明の製造方法で使用される基質は、 Qが酸素原 子であり、 R3、 R4、 R5及び R6がいずれも水素原子である一般式 [7] で表 される化合物、 すなわち 5— (1—ヒ ドロキシェチル） フロ [2， 3— c] ピリ ジンである。
上記一般式 [5] で示されるピリジンエタノール誘導体は、 公知の製造方法で 容易に入手できる。 例えば、 5— (1—ヒ ドロキシェチル） フロ [2， 3 - c ] ピリジンは、 ョ一口ッパ特許 91 1 335号明細書 （EP 9 1 1 335) に記載 された方法により合成可能である。
ピリジンエタノール誘導体 [5] に、 本発明の酵素または形質転換体を作用さ せ、 R体のピリジンエタノール誘導体を優先的に酸化するためには、 補酵素とし て N A D +が必要となる。 反応系に N A D +を必要な量だけ添加しても実施でき る。 し力 し、 還元された該補酵素を酸化型に変換する能力を有する酵素をその基 質と共に、 本発明の酵素と組み合わせて反応を行うことにより、 高価な補酵素の 使用量を大幅に削滅することができる。 また、 還元された該補酵素を酸化型に変 換する能力を有する酵素を含有する微生物またはその処理物を使用しても良い。 還元された該補酵素を酸化型に変換する能力を有する酵素としては、 例えば NA DHォキシダ一ゼ、 NADH脱水素酵素等を用いることができる。
また、 本発明の酵素もしくは形質転換体が NAD +再生能力を有している場合 は、 その再生のための基質を反応系に添加することにより NAD +の再生反応を 同時に行うことができる。 この場合、 他の NAD+再生能力を有する酵素を別に 添加しなくても、 高価な補酵素の使用量を大幅に削減できる。 例えば、 本発明の 酵素もしくは形質転換体がアセトンの還元活性を有している場合は、 反応系にァ セトンを添加することによって N A D +を再生することが可能となる。
また、 本発明の形質転換体を用いた場合では、 菌体内に存在する NAD +によ り反応が進行し、 また N A D +が還元されて生じる NADHも菌体内で再酸化さ れるため、 補酵素や NAD+再生能力を有する酵素を別に添加しなくても実施で きる。
上記のいずれかの方法で得られる光学活性ピリジンエタノール誘導体の採取は、 特に限定されないが、 反応液から直接、 または、 菌体等を分離後、 酢酸ェチル、 トルエン、 t—ブチルメチルエーテル、 へキサン等の溶剤で抽出し、 脱水後、 蒸 留、 晶析あるいはシリカゲルカラムクロマトグラフィ一等により精製すれば高純 度の光学活性ピリジンェタノ一ル誘導体を容易に得ることができる。 図面の簡単な説明
図 1は、 実施例 21で決定した DNAの塩基配列及び推定ァミノ酸配列を示す。 図 2は、 実施例 22の組換えベクター p NT FP及び実施例 23の組換えべク ター p NTF PGの作製法、 並びに、 これらの構造を示す。 発明を実施するための最良の形態
以下、 実施例により本発明を更に詳しく説明するが、 本発明はこれらの実施例 により何ら限定されるものではない。 なお、 以下の記載において、 「％」 は特に 断らない限り 「重量％」 を意味する。
(実施例 1 ：種々の微生物を用いた 5—ァセチルフロ [2， 3— c] ピリジンの 不 3S兀)
グルコース 40 g、 酵母エキス 3 g、 リン酸水素二アンモニゥム 6. 5 g、 リ ン酸ニ水素カリウム l g、 硫酸マグネシウム 7水和物 0. 8 g、 硫酸亜鉛 7水和 物 60mg、 硫酸鉄 7水和物 90mg、 硫酸銅 5水和物 5 m g、 硫酸マンガン 4 水和物 1 Omg、 塩化ナトリウム l O Omg (いずれも 1 L当たり） の組成から なる液体培地 （PH7) 5m 1を大型試験管に分注し、 1 20でで 20分間蒸気 殺菌を行った。 これらの液体培地に表 1、 表 2に示す微生物を無菌的に一白金耳 接種して、 30°Cで 24〜72時間振とう培養した。 培養後、 各培養液 0. 5m 1を遠心分離にかけて菌体を集め、 各菌体をグルコース 8%を含んだ 10 OmM リン酸緩衝液 0. 5m l (pH6. 5) に懸濁した。 この菌体懸濁液を、 あら力 じめ 5—ァセチルフロ [2， 3— c] ピリジンを 5 m gいれた試験管に加えて、 3 で 26時間反応させた。 反応後、 各反応液に 5 m 1の酢酸ェチルを加えて 良く混合し、 有機相の一部を下記 HP LC条件で分析した。
[H PLC分析条件]
カラム：ダイセル化学工業株式会社製 Ch i r a 1 p a k AS、 溶離液：へ キサン Zエタノール ジェチルァミン = 92 8 0. 1、 流速： lm l Zm i n、 検出： 254 nm、 カラム温度：室温、 溶出時間： 5—ァセチルフ口 [2， 3— c] ピリジン 8. 8分、 5— (1— (R) —ヒ ドロキシェチル） フロ [2， 3— c] ピリジン 1 1. 7分、 5— (1— (S) —ヒ ドロキシェチル） フロ [2， 3— c] ピリジン 1 7. 5分
表 1、 表 2に生成物である 5— (1—ヒ ドロキシェチル） フロ [2， 3— c] ピリジンの反応液当たりの生成量、 光学純度及ぴ絶対配置をまとめた。 微生物 生成量 光学純度
(mg/ml) (%e.e.)
IFO 0560 0.17 95.6 S
Candida fennlca CBS 6087 0.43 69.7 S
Candida guilliermondii IFO 0454 0.86 95.3 S
Candida intermedia IFO 0761 2.81 99.2 S
Candida krusei IFO 0011 0.12 100.0 S
Candida magnoliae IFO 0705 2.41 59.4 S
Candida maltosa CBS 5612 7.43 99.9 S
Candida versatilis EFO 1908 0.11 94.5 s
Candida mogn IFO 0436 2.73 99.1 s
Candida norvegensis IFO 1020 0.18 100.0 s
Candida parapsilosis c c c c C E F ra B B B B BFO 0585 5.86 99.8 s
Candida pseudotropicalis I A O )M s s sS s 4840 0.32 95.6 s
Candida rugosa IFO 0750 0.12 91.9 s
Candida oleophila CBS 2219 0.72 79.8 s
Candida IFO 0701 0.11 100.0 s
Candida tropicalis IFO 0006 6.17 99.9 s
Candida hodinii IFO 10574 0.21 90.5 s
Candida saitnana IFO 0380 0.32 89.0 s
Candida albicans IFO 0759 4.12 98.1 s
Candida cariosilignicnla IFO 1910 1.44 100.0 s
Candida snlani IFO 0762 0.32 94.4 s
Candida tenuis IFO 0716 0.36 95.1 s
Cryptococcus albidus ^an albidus IFO 0378 2.37 99.3 s
Cryptococcus humicola CBS 1896 0.33 87.6 s
Cryptococcus IFO 0727 0.26 83.3 絶配 s
Clavispora lnsitaniae IFO 1019 0.60 98.4 s対置
Debaryomyces aasenii IFO 0082 0.48 94.2 s
Debaryomyces marama EFO 0668 0.12 64.8 s
Debaryomyces carsonii EFO 0946 0.40 83.8 s
Debaryomyces castellii IFO 1359 0.70 81.6 s
Dipodascus ovetensis 1201 6.81 97.2 s
Dipodascus tetrasperma 765.70 2.77 93.7 s
Galactomyces reessii 179.60 0.42 86.9 s
Geotrichum candidum 178.71 9.24 98.8 s
Geotrichum fragrans 164.32 3.03 98.8 s
Geotrichum candidum 187.67 0.26 64.2 s
Guilliermondell selenospora 1850 0.34 56.9 s
Hanseniaspora valbyensis IFO 0115 0.36 92.9 s
Hansen la polymorpha DL1 AKU 4752 0.38 95.2 s
Hyphopichia burton" IFO 0844 6.25 96.7 s
Issatchenkia orientalis IFO 1279 0.20 97.5 s
Kluyveromyces lactis IFO 1090 0.15 83.0 s
Kluyveromyces thermotolerans IFO 0662 0.98 94.3 s
Figure imgf000032_0001
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ひ O/OOdfA d 966S0/I0 OAV (実施例 2 ：種々の微生物を用いた 5—ァセチルフロ [2， 3 - c ] ピリジンの 不 遠元
肉エキス 1 0 g、 ぺプトン 10 g、 酵母エキス 5 g、 塩化ナトリウム 3 g (い ずれも 1 L当たり） の組成からなる液体培地 （pH7) 5m lを大型試験管に分 注し、 1 20 で 20分間蒸気殺菌を行った。 これらの液体培地に表 3に示す微 生物を無菌的に一白金耳接種して、 30 で 24〜 72時間振とう培養した。 培 養後、 各培養液 2m 1を遠心分離にかけて菌体を集め、 各菌体をグルコース 8% を含んだ 1 0 OmMリン酸緩衝液 0. 5m 1 (p H6. 5) に懸濁した。 この菌 体懸濁液を、 あらかじめ 5—ァセチルフロ [2， 3— c] ピリジンを 2. 5 mg いれた試験管に加えて、 3 で 26時間反応させた。 反応後、 実施例 1と同様 に分析を行った。 表 3に生成物である 5— (1—ヒ ドロキシェチル） フロ [2， 3-c] ピリジンの反応液当たりの生成量、 光学純度及び絶対配置をまとめた。 表 3
微生物 生成量 光学純度 絶対
(mg/ml) (%e.e.) 配置
Alcaligenes xvlosoxidans IFO 13495 0.05 93.1 S
Alcaligenes vylosnxidans s hsp IFO 12669 0.13 97.3 S dentrificans
Bacillus megaterium 0.13 94.6 s
Bacillus amvloliquefaciens EFO 3022 0.10 97.7 s
Brevibacterium incertum IFO 12145 0.20 98.4 s
Cellulomonas fimi IAM 12107 1.16 91.5 s
Corynebactenum sp. ATCC21245 0.26 57.3 s
Jensenia canicruria IFO 13914 4.91 98.6 s
Ochrobactram sp. IFO 12950 0.68 98.9 s
Pseudomonas siaizsd IFO 13596 3.99 99.9 s
Pseudomonas chlororaphis IFO 3904 0.21 95.9 s
Pseudomonas mendocina IFO 14162 0.65 99.2 s
Rhodococcus ervthropolis IFO 12320 0.13 68.5 s
Rhodococcus rhodochrous IFO 3338 0.10 85.8 s
Tsukamurella paurometabola IFO 12160 0.16 98.7 s
Brevibacterium iodinum IFO 3558 0.15 42.3 R
Corvnebacterium acectoacidophilum ATCC 21476 0.12 40.9 R
(比較例 1 ：種々の微生物を用いた 5—ァセチルフロ [2， 3 - c ] ピリジンの 不¾~還元) グルコース 40 g、 酵母エキス 3 g、 リン酸水素二アンモニゥム 6. 5 g、 リ ン酸ニ水素カリウム l g、 硫酸マグネシウム 7水和物 0. 8 g、 硫酸亜鉛 7水和 物 60mg、 硫酸鉄 7水和物 90mg、 硫酸銅 5水和物 5 m g、 硫酸マンガン 4 水和物 1 Omg、 塩化ナトリウム 1 0 Omg (いずれも 1 L当たり） の組成から なる液体培地 （p H 7) 5m 1を大型試験管に分注し、 1 20でで 20分間蒸気 殺菌を行つた。 これらの液体培地に表 4に示す微生物を無菌的に一白金耳接種し て、 3 で 24〜 7 2時間振とう培養した。 培養後、 各培養液 2 m lを遠心分 離にかけて菌体を集め、 各菌体をグルコース 8%を含んだ 1 0 OmMリン酸緩衝 液 0. 5m l (p H6. 5) に懸濁した。 この菌体懸濁液を、 あらかじめ 5—ァ セチルフロ [2， 3— c] ピリジンを 2. 5 mgいれた試験管に加えて、 3 0 で 26時間反応させた。 反応後、 実施例 1と同様に分析を行った。 表 4に生成物 である 5— (1—ヒ ドロキシェチル） フロ [2， 3— c] ピリジンの反応液当た りの生成量、 光学純度及び絶対配置をまとめた。 表 4
Figure imgf000034_0001
上記の結果から、 単環式のァセチルビリジンを光学活性なヒ ドロキシェチルピ リジンに変換することが知られているサッカロマイセス ·セルビシェ (S a c c h a r omv c e s c e r e v i s i a e) ίま、 複素環ァセチノレピリジン誘導 体である 5—ァセチルフロ [2， 3 - c] ピリジンには殆ど反応しないことが判 る。
(実施例 3 ： キャンディダ ·マリス （C a n d i d a ma r i s ) I FO 1 000 3による 5—ァセチルフロ [2， 3 - c] ピリジンからの 5— (1— (R ) —ヒ ドロキシェチル） フロ [2， 3 - c ] ピリジンの合成）
酵母エキス 3 g、 リン酸水素二アンモニゥム 6. 5 g、 リン酸二水素カリウム 1 g、 硫酸マグネシウム 7水和物 0. 8 g、 硫酸亜鉛 7水和物 6 Omg , 硫酸鉄 7水和物 90 m g、 硫酸銅 5水和物 5 m g、 硫酸マンガン 4水和物 10 m g、 塩 化ナトリウム l O Omg (いずれも 90 Om 1当たり） の組成からなる液体培地 45m l , アデ力ノール 1滴を 50 Om 1容坂ロフラスコに入れて殺菌し、 これ に殺菌済みの 40%グルコース水溶液 5m 1 と実施例 1記載の培養方法にて得ら れたキャンディダ 'マリス (C a n d i d a ma r i s ) I FO 1 0003 の培養液 1 m 1を無菌的に接種し、 30 で 24時間振とう培養し、 これを種母 とした。 5 L容のジャーフアーメンタ一に上記の組成からなる液体培地 2. 25 L、 アデ力ノール 5滴を入れて殺菌し、 これに殺菌済みの 40%グルコース水溶 液 25 Om 1及ぴ種母 5 Om lを無菌的に接種し、 培養温度 30°C、 攪拌数 3 5 O r pm、 通気量0. 75 LZ分の条件で 40時間培養を行った。 培養中、 pH が 5. 5を下回った場合には、 5規定の水酸化ナトリウム水溶液を添加して p H 5. 5に調整した。 培養後、 菌体を含む培養液 2 Lと、 5—ァセチルフロ [2， 3 - c ] ピリジン 1 0 g及びグルコース 60 gを 5 L容のジャーフアーメンター に入れ、 30 で攪拌下 22. 5時間還元反応を行った。 反応中、 反応液の pH は 5規定の水酸化ナトリウム水溶液で pH 6に保った。 また反応開始後 4. 5時 間目にグルコース 60 g、 7. 5時間目にグルコース 80 gを添加した。 反応終 了後、 反応液を酢酸ェチル 1 Lで抽出し、 水相を更に酢酸ェチル 1 Lで抽出した。 有機相をあわせて無水硫酸ナトリウムで脱水後、 減圧下溶媒を留去した。 残渣に 齚酸ェチル 30m l、 活性炭 50 Omgを加えて室温で 2時間攪拌した。 濾過に より活性炭を除去後、 減圧下溶媒を留去した。 残渣を酢酸ェチルとメチルシクロ へキサンの混合溶液から結晶化を行い、 5— （1一 (R) ーヒドロキシェチル） フロ [2， 3 - c] ピリジンの白色結晶 8. l gを得た。 収率 81%、 光学純度 98. 7 % e . e . 、 融点 59. 5〜60. 5°C、 比旋光度 [a] D 20 = + 37. 0° (CHC 1 3、 c = 0. 56) 。 一 NMR δ (CDC 1 3) : 1. 56 (3H， d, J = 6. 3 5 H z ) , 4. 1 2 (1 H， s ) 、 5. 00 ( 1 H, q , J = 6. 35Hz) 、 6. 80 ( 1 H, d , J = 1. 95Hz) 、 7. 54 (1 H, s) 、 7. 77 (1 H， d， J = 1. 95Hz) 、 8. 80 ( 1 H, s) 。
(実施例 4 ： キヤンディダ ' トロピカリス （Ca n d i d a t r o p i c a 1 1 s ) I FO 0006による 5—ァセチルフロ [2， 3 - c ] ピリジンからの 5— （1— (S) —ヒ ドロキシェチル） フロ [2， 3— c] ピリジンの合成） 酵母エキス 3 g、 リン酸水素二アンモニゥム 6. 5 g、 リン酸二水素カリウム 1 g、 硫酸マグネシウム 7水和物 0. 8 g、 硫酸亜鉛 7水和物 6 Omg、 硫酸鉄 7水和物 9 Omg、 硫酸銅 5水和物 5mg、 硫酸マンガン 4水和物 1 Omg、 塩 化ナトリウム l O Omg (いずれも 90 Om 1当たり） の組成からなる液体培地
225m l , アデ力ノール 2滴を 2 L容坂ロフラスコに入れて殺菌し、 これに殺 菌済みの 40%グルコース水溶液 25 m 1 と実施例 1記載の培養方法にて得られ たキャンディダ . トロピカリス (C a n d i d a t r o p i c a 1 i s ) I F O 0006の培養液 2. 5m lを無菌的に接種し、 30 °Cで 24時間振とう培 養した。 培養後、 培養液 300m lを遠心分離にかけて菌体を集め、 1 0 OmM リン酸緩衝液 （pH6. 5) 100m lに懸濁した。 上記菌体懸濁液と、 5—ァ セチルフロ [2， 3— c] ピリジン 1 g及びグルコース 3 gを 50 Om 1容三ロ フラスコに入れ、 30°Cで攪拌下 5時間反応を行った。 反応中、 反応液の pHは 5規定の水酸化ナトリウム水溶液で pH6. 5に保った。 反応終了後、 反応液を 齚酸ェチルで抽出し、 水相を更に酢酸ェチルで抽出した。 有機相をあわせて無水 硫酸ナトリウムで脱水後、 減圧下溶媒を留去した。 残渣をトルエンに室温で溶解 後、 氷水中で冷却することにより結晶化を行い、 5— (1— (S) —ヒ ドロキシ ェチル） フロ [2， 3 - c ] ピリジンの白色結晶 75 Omgを得た。 収率 75%、 光学純度 100 % e . e . 。
(実施例 5 ：キャンディダ ·インタ一メディア （Ca n d i d a i n t e r m e d i a) I FO 076 1からの無細胞抽出液の調製、 及びそれを用いた 5— ァセチルフロ [2， 3 - c ] ピリジンからの 5_ (1— (S) —ヒ ドロキシェチ ル） フロ [2， 3— c] ピリジンの合成）
5 Lジャーフアーメンターでの培養を、 攪拌数 700 r pm、 通気量 1. 5 L Z分、 培養時間を 16時間に変更した以外は、 実施例 3記載の培養方法と同じ方 法で、 キャンディダ .インタ一メディア (C a n d i d a i n t e r m e d i a) I FO 0761の培養を行った。 培養後、 得られた培養液 94 Om 1を、 遠心分離して菌体を集め、 1 0 O mMリン酸緩衝液 （p H 6. 5) 4 O O m lで 2回洗浄後、 湿菌体を 5 mMとなるように ]3—メルカプトエタノールを添加した 1 0 O mMリン酸緩衝液 （p H6. 5 ) 2 0 0 m 1 に懸濁し、 菌体をビートビー ター （バイオスペック ·プロダクツ社製） で破砕した。 遠心分離にて菌体残渣を 除き、 8 0 °/0飽和となるように硫酸アンモニゥムを添加後、 遠心分離により上清 を除去した。 得られた沈殿を、 5 mMとなるように —メルカプトエタノールを 添加した 1 0 O mMリン酸緩衝液 （ρ Η 6. 5) 1 5 m lに懸濁し、 I mMとな るように /3—メルカプトエタノールを添加した 1 0 O mMリン酸緩衝液 （p H 6. 5) に対してー晚透析し、 無細胞抽出液 6 4. 5 m lを取得した。 5—ァセチル フロ [ 2， 3— c ] ピリジン 1 5 m g、 NADH 1 0 4. 3 m gを入れた試験管 に無細胞抽出液 0. 7 5 m l を加えて、 3 で 4時間反応を行った。 反応終了 後、 実施例 1と同様の分析法で、 生成物への変換率と生成物の光学純度を測定し たところ、 変換率 6 0. 7%、 光学純度 （S) 9 9 , 5 % e . e . であった。
(実施例 6 ： キャンディダ 'インターメディア (C a n d i d a i n t e r m e d i a ) I F O 0 7 6 1の無細胞抽出液を用いた 5—ァセチルフロ [ 2， 3 - c ] ピリジンからの 5— ( 1— (S) —ヒ ドロキシェチル） フロ [2， 3 - c ] ピリジンの合成）
5—ァセチルフロ [ 2， 3 - c ] ピリジン 1 5 m g、 NAD PH 1 2 6. 4 m gを入れた試験管に実施例 5で得られたキャンディダ ·インターメディア (C a n d i d a i n t e r m e d i a ) I F O 0 7 6 1の無細胞抽出液 0. 7 5 m lを加えて、 3 0 で 4時間反応を行った。 反応終了後、 実施例 1と同様の分 析法で、 生成物への変換率と生成物の光学純度を測定したところ、 変換率 5 1。
1 %、 光学純度 （ S ) 9 9. 4 % e . e . であつた。
(実施例 7 ： キャンディダ ·マリス （C a n d i d a ma r i s ) I F O 1 0 0 0 3のアセトン乾燥菌体調製、 及びそれを用いた 5—ァセチルフロ [ 2， 3 — c ] ピリジンからの 5— ( 1 — (R) —ヒ ドロキシェチル） フロ [2， 3— c ] ピリジンの合成） 酵母エキス 3 g、 リン酸水素二アンモニゥム 6. 5 g、 リン酸二水素カリウム l g、 硫酸マグネシウム 7水和物 0. 8 g、 硫酸亜鉛 7水和物 6 Omg、 硫酸鉄 7水和物 9 Omg、 硫酸銅 5水和物 5mg、 硫酸マンガン 4水和物 1 Omg、 塩 化ナトリウム 1 0 Omg (いずれも 90 Om 1当たり） の組成からなる液体培地 45m 1及びアデ力ノール 1滴を 50 Om 1容坂ロフラスコに入れて殺菌し、 こ れに殺菌済みの 40%グルコース水溶液 5 m 1 と実施例 1記載の培養方法にて得 られたキャンディダ 'マリス (C a n d i d a ma r i s ) I FO 1000 3の培養液 1 m 1を無菌的に接種し、 30 で 48時間振とう培養した。 培養後、 得られた培養液 4 Om 1について、 遠心分離により菌体を集め、 イオン交換水で 2回洗浄し、 湿菌体をイオン交換水 4 Om 1に懸濁した。 氷冷下で攪拌しながら アセトン 1. 2 Lを加え、 氷中下で 30分間攪拌した。 濾過後、 濾紙上の菌体を 冷却したアセトンで洗浄し、 減圧下で乾燥させ、 アセ トン乾燥菌体 1. 3 gを取 得した。 アセトン乾燥菌体 1 Omg、 5—ァセチルフロ [2， 3— c] ピリジン 5mg、 NAD+O. 275mg、 NADP + O. 27 5mg、 グルコース 5. 5m g、 グルコース脱水素酵素 （商品名 ： GLUCDH" Am a n o" II、 天野 製薬株式会社製） 30U、 1 0 OmMリン酸緩衝液 （pH6. 5) 0. 5m lを 試験管に加えて、 30°Cで 24時間還元反応を行った。 反応終了後、 実施例 1と 同様の分析法で、 生成物への変換率と生成物の光学純度を測定したところ、 変換 率 90. 8%、 光学純度 （R) 99. 9 % e . e. であった。
(実施例 8 ：キャンディダ 'マリス (C a n d i d a ma r i s ) I F O 1 0003からの無細胞抽出液の調製、 及びそれを用いた 5—ァセチルフロ [2， 3 - c ] ピリジンからの 5— (1— (R) ーヒ ドロキシェチノレ） フロ [2， 3— c] ピリジンの合成）
5 Lジャーフアーメンタ一での培養を、 攪拌数 300 r p m、 通気量 0. 75 L /分、 培養時間 76時間に変更した以外は、 実施例 3記載の培養方法と同じ方 法で、 キャンディダ 'マリス (C a n d i d a ma r i s ) I FO 1000 3の培養を行った。 得られた培養液 21 5 Om 1について、 遠心分離により菌体 を集め、 1 0 OmMリン酸緩衝液 （pH6. 5) 500 m 1で洗浄し、 湿菌体を、 5 mMとなるように jS—メルカプトエタノールを添加した 1 0 O mMリン酸緩衝 液 （p H 6. 5) 4 3 O m lに懸濁し、 菌体をビートビ一ター （バイオスペック
•プロダクツ社製） で破砕した。 遠心分離にて菌体残渣を除き、 5 mMとなるよ うに —メルカプトエタノールを添加した 1 0 O mMリン酸緩衝液 （p H 6. 5 ) に対してー晚透析し、 無細胞抽出液 2 8 9 m 1を取得した。 5—ァセチルフロ
[ 2， 3 - c ] ピリジン 0. 2 5 g、 NAD+ 3 0 m g、 グルコース 2 · 5 g、 グルコース脱水素酵素 （商品名 ： G LUC DH" Am a n o " II、 天野製薬株式 会社製） 3 0 O Uを入れた三口フラスコに無細胞抽出液 24 m 1を加えて還元反 応を行った。 反応は 3 0 °Cで、 5規定の水酸化ナトリウム水溶液により反応液の p Hを 6. 5に調整しながら攪拌しつつ行なった。 反応液の一部を定期的に HP L Cにより分析し、 基質が枯渴している場合には更に基質 0. 2 5 gを追加して 反応を継続させた。 この操作を繰り返しつつ約 7 2時間反応を行なった。 反応終 了後の 5— ( 1 —ヒ ドロキシェチル） フロ [2， 3— c ] ピリジンの生成量は 2. 2 gであった。 収率 8 8 %、 光学純度 （R) 1 0 0 % e . e . 。
(実施例 9 ： キャンディダ 'マリス （C a n d i d a ma r i s ) I FO 1 0 0 0 3の無細胞抽出液を用いた 5—ァセチルフロ [ 2， 3— c ] ピリジンから の 5— ( 1 — (R) —ヒ ドロキシェチル） フロ [ 2， 3 - c ] ピリジンの合成） 実施例 8で得られた無細胞抽出液 2 0 m 1を入れた三口フラスコに、 5—ァセ チルフ口 [ 2， 3 - c ] ピリジン 0. 2 5 g、 NAD+ 40 m g、 ギ酸ナトリウ ム 0. 2 5 g、 ギ酸脱水素酵素 （フル力 （F 1 u k a) 社製） 1 2 0Uを加えて 還元反応を行った。 反応は 3 0 で、 5規定のギ酸により反応液の p Hを 6. 5 に調整しながら攪拌しつつ行なった。 反応液の一部を定期的に HP L Cにより分 析し、 基質が枯渴している場合には更に基質 0. 2 5 gを追加して反応を継続さ せた。 この操作を繰り返しつつ約 9 3時間反応を行なった。 反応終了後の 5 _ ( 1—ヒ ドロキシェチル） フロ [2， 3 - c ] ピリジンの生成量は 1. 8 gであつ た。 収率 7 2 %、 光学純度 （R) 1 0 0 % e . e . 。
(実施例 1 0 ：キャンディダ 'マリス （—C a n d i d a ma r i s ) I F O 1 0003のアセトン乾燥菌体を用いた 5—ァセチルフロ [2， 3 - c ] ピリジ ンからの 5— (1— (R) —ヒ ドロキシェチル） フロ [2， 3 - c ] ピリジンの 合成）
実施例 7で得られたキャンディダ 'マリス (C a n d i d a ma r i s ) I FO 1 0003のアセトン乾燥菌体 20 mg、 5—ァセチノレフ口 〔2， 3 - c ] ピリジン 25mg、 NAD+2. 2mg、 100 mMリン酸緩衝液 （pH6. 5) 0. 4mし イソプロパノール 0. 1 m lを試験管に加えて、 30 で 39. 5時間還元反応を行った。 反応終了後、 実施例 1と同様の分析法で、 生成物への 変換率と生成物の光学純度を測定したところ、 変換率 47. 2%、 光学純度 （R ) 100 % e . e . であった。
(実施例 1 1 ： キヤンディダ 'マリス (C a n d i d a ma r i s ) I F O 10003の無細胞抽出液を用いた 5—ァセチルフロ [2， 3— c] ピリジンか らの 5— (1— (R) ーヒ ドロキシェチル） フロ [2， 3 - c ] ピリジンの合成 )
実施例 8で得られたキャンディダ 'マリス (C a n d i d a ma r i s ) I FO 1 0003の無細胞抽出液 0. 4m l、 5—ァセチルフロ [2， 3 - c] ピリジン 25mg、 NAD+2. 2mg、 イソプロパノール 0. 1 m 1を試験管 に加えて、 30 で39. 5時間還元反応を行った。 反応終了後、 実施例 1と同 様の分析法で、 生成物への変換率と生成物の光学純度を測定したところ、 変換率 5 1. 8%、 光学純度 （R) 100 % e . e . であった。
(参考例 1 ： 7—クロ口一 5— (1—ヒ ドロキシェチル） フロ [ 2， 3— c ] ピ リジンからの 5—ァセチル一 7—クロロフ口 [2， 3— c] ピリジンの合成） J . O r g. Ch em. ， 63， 785 1 (1 998) に記載の方法により得 られた 7—クロロー 5— （1—ヒ ドロキシェチル） フロ [2， 3 - c ] ピリジン 1. 0 gを塩化メチレン 4. 0m lに溶解し、 これに飽和重曹水 3m l、 1 M臭 化ナトリウム水溶液 0. 62m l及び 2， 2， 6， 6—テトラメチルー 1—ピぺ リジニルォキシラジカルを 1Mになるように溶解した塩ィヒメチレン溶液 0. 62 m lを加えて、 氷中で激しく攪拌した。 これに予め重曹を飽和させた次亜塩素酸 ナトリウム水溶液 5. 74 m 1を少しづつ添加し、 氷中で 3 0分間攪拌した。 反 応終了後、 酢酸ェチルを加え、 攪拌しながら 1 0 %亜硫酸水素ナトリウム水溶液 1 0 m lを添加した。 分液により有機相を取得後、 飽和食塩水で洗浄、 無水硫酸 ナトリウムで乾燥した。 減圧下溶媒を留去し、 トルエンーメチルシクロへキサン より結晶化を行い、 5—ァセチル一 7—クロロフ口 [ 2， 3 - c ] ピリジン 0. 4 3 gを取得した。 — NMR δ (CD C 1 3) ： 2. 7 7 (3 H, s ) 、 7. 0 0 ( 1 H， d , J = 1. 9 5 H z ) 、 7. 8 9 ( 1 H， d , J = 1. 9 6 H z) 、 8. 3 2 ( 1 H， s ) 。
(実施例 1 2 ：種々の微生物を用いた 5—ァセチル一 7—クロロフ口 [ 2， 3 - c ] ピリジンの不斉還元）
グルコース 4 0 g、 酵母エキス 3 g、 リン酸水素二アンモニゥム 6. 5 g、 リ ン酸ニ水素カリウム l g、 硫酸マグネシウム 7水和物 0. 8 g、 硫酸亜鉛 7水和 物 6 0 m g、 硫酸鉄 7水和物 9 O m g、 硫酸銅 5水和物 5 m g、 硫酸マンガン 4 水和物 1 O m g、 塩化ナトリウム 1 0 O m g (いずれも 1 L当たり） の組成から なる液体培地 （p H 7) 5 m 1を大型試験管に分注し、 1 2 0°Cで 2 0分間蒸気 殺菌を行つた。 これらの液体培地に表 5に示す微生物を無菌的に一白金耳接種し て、 3 0°Cで 2 4〜7 2時間振とう培養した。 次に、 各培養液 0. 5 m lを遠心 分離にかけて菌体を集め、 各菌体をグルコース 8 %を含んだ 1 0 O mMリン酸緩 衝液 0. 5 m l (p H 6. 5 ) に懸濁した。 この菌体懸濁液を、 あらかじめ参考 例 1で得られた 5—ァセチル一 7—クロロフ口 [2， 3 - c ] ピリジンを 5 mg いれた試験管に加えて、 3 0°Cで 2 6時間反応させた。 反応後、 各反応液に 5 m 1の酢酸ェチルを加えて良く混合した。 この一部を下記 HP L C条件で分析した。
[H P L C分析条件]
カラム： ダイセル化学工業株式会社製 C h i r a 1 p a k AS、 溶離液：へキ サン Zエタノール/ジェチルアミン= 9 2/8/0. 1、 流速： 1 m l / i n、 検出： 2 5 4 nm、 カラム温度：室温、 溶出時間： 5—ァセチル一 7—クロロブ 口 [ 2， 3 - c ] ピリジン 7. 6分、 5— （1— (R) ーヒ ドロキシェチル） 一 7—クロロフ口 [2， 3 - c ] ピリジン 1 0. 3分、 5— （1— (S) —ヒ ドロ キシェチル） — 7—クロロフ口 [2， 3— c] ピリジン 1 5. 7分
表 5に生成物である 5— (1—ヒ ドロキシェチル） 一7—クロロブ口 [2， 3 -c] ピリジンの反応液当たりの生成量、 光学純度及び絶対配置をまとめた。 表 5
微生物 生成量 光学純度絶対
(mg/ml) (%e.e.) 配置
Candida maltosa CBS 5612 2.33 97.4 S
Candida parapsilosis IFO 0585 0.32 70.3 S
Crvptococcus alhidus SL albidiis IFO 0378 0.62 96.5 s
Dipodascus ovetensis IFO 1201 2.07 97.2 s
Geotrich謹 candidum CBS 178.71 3.35 98.2 s
H phopichia burtonii IFO 0844 1.61 81.4 s
Lodderomvces elongisporus IFO 1676 1.45 95.8 s
Rhodsporidium toruloides BFO 0559 1.90 98.7 s
Sporidiobolua jnhnsonii IFO 6903 4.24 98.3 s
Candida maris IFO 10003 5.10 90.5 R
Qgataea wickerhamii IFO 1706 5.85 18.0 R
Yamadazvma fannosa IFO 0534 0.46 78.8 R
(実施例 1 3 ：種々の微生物を用いた 5—ァセチルー 7—クロロフ口 [2， 3 - c] ピリジンの不斉還元）
肉エキス 1 0 g、 ペプトン 10 g、 酵母エキス 5 g、 塩化ナトリウム 3 g (い ずれも 1 L当たり） の組成からなる液体培地 （pH7) 5m lを大型試験管に分 注し、 1 20でで 20分間蒸気殺菌を行った。 これらの液体培地に表 6に示す微 生物を無菌的に一白金耳接種して、 3 で 24〜 72時間振とう培養した。 次 に、 各培養液 2m 1を遠心分離にかけて菌体を集め、 各菌体をグルコース 8%を 含んだ 1 0 OmMリン酸緩衝液 0. 5m l (p H 6. 5) に懸濁した。 この菌体 懸濁液を、 あらかじめ参考例 1で得られた 5—ァセチル一 7—クロロフ口 [2， 3— c] ピリジンを 2. 5 mgいれた試験管に加えて、 30 で 26時間反応さ せた。 反応後、 実施例 1 2と同様に分析を行った。 表 6に生成物である 5— (1 —ヒ ドロキシェチル） 一 7—クロロフ口 [2， 3 - c ] ピリジンの反応液当たり の生成量、 光学純度及び絶対配置をまとめた。 表 6
微生物 生成量 光学純度 絶対
(mg/ml) (%e.e.) 配置
Jensenia canicruria IFO 13914 4.37 99.0 S
Psendnmonas sMzsd IFO 13596 1.30 99.6 S r.orynehacterium acectoacidophilum ATCC 21476 0.24 64.0 R
(実施例 14 ：酵素の精製）
以後、 還元活性の測定は、 l O OmMリン酸緩衝液 （pH6. 5) に基質 5— ァセチルフロ [2， 3 - c ] ピリジン l mM、 NADH0. 25 mM、 ジメチル スルホキシド 0. 3 % ( V o 1 /v o 1 ) 及ぴ酵素溶液 0. 05m lを含む 3. Om lの反応液中、 30 、 3分間反応させ、 波長 340 nmの吸光度の減少を 測定することにより行った。 これを還元活性測定の標準反応条件とした。 この反 応条件において、 1分間に l //mo 1の NADHを NAD +に酸化する酵素活性 を 1 u n i tと定義した。
酵母エキス 3 g、 リン酸水素二アンモニゥム 6. 5 g、 リン酸二水素カリウム l g、 硫酸マグネシウム 7水和物 0. 8 g、 硫酸亜鉛 7水和物 6 Omg、 硫酸鉄 7水和物 90mg、 硫酸銅 5水和物 5mg、 硫酸マンガン 4水和物 10 m g、 塩 化ナトリウム l O Omg (いずれも 900 m 1当たり） の組成からなる液体培地 45m l、 アデ力ノール 1滴を 50 Om 1容坂ロフラスコに入れて殺菌し、 これ に殺菌済みの 40%グルコース水溶液 5m 1及びあらかじめ同一培地にて前培養 しておいたキャンディダ ·マリス (C a n d i d a ma r i s ) I FO 10 003の培養液 1 m 1を無菌的に接種し、 30 で 24時間振とう培養し、 これ を種母とした。
5 L容のジャーフアーメンターに上記の組成からなる液体培地 2. 25 L、 ァ デカノール 5滴を入れて殺菌し、 これに殺菌済みの 40%グルコース水溶液 25 Om 1及び種母 50m 1を無菌的に接種し、 培養温度 30°C、 攪拌数 300 r p m、 通気量 0. 3 L/分の条件で 1 40時間培養を行った。 培養中、 pHが 5. 5を下回る場合は、 5規定の水酸化ナトリウム水溶液で pH5. 5に調整した。 上記の培養方法で得られた培養液 1 0 Lについて、 遠心分離により菌体を集め、 生理食塩水 5 Lにて二回洗浄し、 湿菌体を 5 mMの /3—メルカプトエタノール及 ぴ 0. 1 mMの PMS Fを含む 1 00 mMトリス—塩酸緩衝液 （p H 7. 5) 1 2 O Om lに懸濁し、 菌体をダイノミル （Dy n o— Mi 1 1社製） で破砕した。 遠心分離にて菌体残渣を除去し、 無細胞抽出液 1 760m lを取得した。
この無細胞抽出液に硫酸プロタミン 3 gを加えて 4 °Cで一晩攪拌後、 生じた沈 殿を遠心分離により除去した。 上清に 3 5 %飽和となるように硫酸ァンモニゥム を添加し、 0でで一時間攪拌後、 生じた沈殿を遠心分離により除去した。 上清に 65%飽和となるように硫酸アンモニゥムを添加し、 0 Cで一時間攪拌後、 生じ た沈殿を遠心分離により取得し、 5 mMの) 3 _メルカプトエタノールを含む 20 mMトリス一塩酸緩衝液 （p H7. 5) 200 m 1に懸濁し、 同緩衝液 30 Lで 透析した。
これを 5mMの ]3—メルカプトエタノールを含む 2 OmMトリス一塩酸緩衝液 (p H 7. 5) であらかじめ平衡化した DEAE— TOYOP E ARL 650 M (東ソ一株式会社製） カラム （340m l ) に供し、 酵素を吸着させ、 塩化ナ トリウム濃度 （OmMから 5 OmMまで） のリニアグラジェントにより活性画分 を溶出させた。 この活性画分に終濃度 0. 5 Mとなるように硫酸アンモニゥムを 添加し、 5 mMの ]3—メルカプトエタノール及ぴ 0. 5 Mの硫酸アンモニゥムを 含む 2 OmMトリス—塩酸緩衝液 （pH8. 5) であらかじめ平衡化した P h e n y 1 -TOYOPEARL 650 M (東ソ一株式会社製） カラム （ 74 m 1 ) に供し、 酵素を吸着させ、 同一緩衝液でカラムを洗浄後、 硫酸アンモニゥム濃 度 （0. 5Mから 0Mまで） のリニアグラジェントにより活性画分を溶出させた。 活性面分を集め、 電気泳動的に単一な精製酵素標品を得た。 SDS— PAGEに おけるバンドの分子量は、 約 29000であった。 また、 溶離液として 0. 1M の硫酸ナトリウムを含む 0. 1Mリン酸緩衝液 （p H 7. 0) を用いた TSK— G 3000 SW (7. 8mm I . D. X 30 c m) (東ソ一株式会社製） カラム を用いたゲル濾過分析を行ったところ、 約 60000であった。 以後、 この酵素 を F PDHと呼ぶことにする。 (実施例 1 5 ： FPDHの作用至適愠度）
実施例 14記載の還元活性測定の標準反応条件において、 温度だけを 20〜8 0°Cに変化させて活性を測定を行った。 その結果、 至適温度は 50〜55°Cであ つた。
(実施例 1 6 ： ？011の作用至適 ^1)
実施例 1 4記載の還元活性測定の標準反応条件において、 緩衝液として酢酸緩 衝液、 リン酸緩衝液、 トリス—塩酸緩衝液を用いて pH3. 5〜9. 0の範囲で 変化させて活性測定を行った。 その結果、 至適 pHは 5. 0〜6. 0であった。
(実施例 1 7 ： F PDHの阻害剤に対する挙動）
実施例 1 4記載の還元活性測定の標準反応条件において、 阻害剤として各種の 化合物及ぴ金属塩を、 表 7に記載の濃度となるように添加し、 活性測定を行った。 表 7に、 阻害剤を添加しない時の活性を 1 00%とした時の相対活性で示した。 その結果、 酵素活性は水銀イオンにより阻害された。
表 7
Figure imgf000046_0001
(実施例 1 8 ： FPDHの特異性）
F PDHの種々の化合物に対する還元活性を調べた。 実施例 14記載の還元活 性測定の標準反応条件において、 5—ァセチルフロ [2， 3— c] ピリジンのか わりに、 表 8及び表 9に示す各種カルボニル化合物を基質として活性測定を行つ た。 表 8、 表 9に、 5—ァセチルフロ [2， 3— c] ピリジンを基質としたとき の還元活性を 1 00%とした時の相対活性で示した。 その結果、 ケトン、 アルデ ヒドに対して還元活性を有しているが、 炭素環ケトン及びカルボキシル基の α位 のケトンに対する還元活性は非常に低かつた。 表 8
基質 （ 1 mM) 相対活性 （％)
5—ァセチルフロ [ 2， 3 - c ] ピリジン 100
1—クロ口一 5 ァセチルフロ [ 2， 3 - c ] ピリジン 66
2 ァセチノレピリジン 111
3—ァセチノレピリジン 107
4—ァセチノレピリジン 130 ァセチノレピラジン 133
2—ァセチノレピロ一ノレ 100
2—ァセチルチオフェン 77
2—ァセチノレフラン 43
2 ァセチルチァゾール 86 ァセ トフエノン 88 m 二トロアセトフエノン 136 p—二トロアセトフエノン 116 o—クロロァセトフエノン 9 m—クロロアセトフェノン 120 ρ—クロロァセトフエノン 88 p—フノレ才ロアセトフエノン 88
2 ヒ ドロキシァセトフエノン 54
2， 3， 一ジクロロアセトフエノン 19 ベンジノレァセトン 96 ァセトン 40
2 ブタノン 94
2—ペンタノン 67
2一へキサノン 38
2—ォクタノン 38 メチルイソプロピルケトン 43 メチルイソブチルケトン 14 ァセ トイン 43 ジァセチノレ 107
—
,セチル 7セ 卜ン 123 ジェチルケトン 22 クロロァセトン 99
1—ァセチノレシク口ペンタノン 86
1—ァセチルシクロへキサノン 68 ピノレビン酸メチノレ 132 ピルビン酸ェチル 133 表 9
Figure imgf000048_0001
また、 FPDHの種々の化合物に対する酸化活性を調べた。 酸化活性の測定は， l O OmMリン酸緩衝液 （pH8. 0) に基質 1 mM NAD+0. 25 mM, ジメチルスルホキシド 0. 3 % ( V o 1 o 1 ) 及ぴ酵素溶液 0. 05m lを 含む 3. Om lの反応液中、 30°C 3分間反応させ、 波長 340 nmの吸光度 の増加を測定することにより行った。 これを酸化活性基質測定の標準反応条件と した。 この反応条件において、 1分間に 1 /zm o 1の NAD +を NADHに還元 する酵素活性を 1 u n i tと定義した。 表 10に、 5 （1— (R) ーヒ ドロキ シェチル） フロ [2 3 - c] ピリジンを基質としたときの酸化活性を 1 00% とした時の相対活性で示した。 その結果、 種々の化合物に対して酸化活性を有し ていた。 表 1 0
相対活性 基質 （ 1 mM)
(R) 一 5— (1—ヒ ドロキシェチル） フロ [2， 3 - c ] ピリジン 100 1一 （ 2—ピリジノレ） ェタノール 23 1一 （ 3—ピリジル） ェタノール 110 1— ( 4一ピリジル） ェタノール 24 ィソプロパノーノレ 226 1—ブテン一 3—オール 261 4—ペンテン一 2—才ーノレ 172 4—フエ二ノレ一 2—ブタノ一ノレ 219
(R) 一 1—フエ二 7レエタノ一/レ 225
(実施例 1 9 ： F PDHによる 5—ァセチルフロ [2， 3— c] ピリジンからの 5- (1— (R) ーヒ ドロキシェチル） フロ [2， 3— c] ピリジンの合成） 実施例 14で得られた F PDHO. 5 u n i t、 5—ァセチルフロ [2， 3— c] ピリジン 5mg、 グルコース 20 mg、 NAD+O. 5mg、 グルコース脱 水素酵素 （天野製薬製） 4 u n i tを含む 0. 1Mリン酸緩衝液 （pH6. 5) 0. 5m 1を 3 で 1 7時間攪拌した。 反応後、 実施例 1と同様に分析を行つ た。 その結果、 変換率 1 00%で光学純度 100°/。e. e . の 5— (1— （R) —ヒ ドロキシェチル） フロ [2， 3— c] ピリジンが生成していた。
(実施例 20 ： FPDHによる 5—ァセチルー 7—クロロフ口 [2， 3 - c ] ピ リジンからの 7—クロ口一 5— （1— (R) —ヒ ドロキシェチノレ） フロ [2， 3 -c] ピリジンの合成）
実施例 14で得られた F PDHO. 5 u n i t、 5—ァセチル一 7—クロロフ 口 [2, 3— c] ピリジン 5mg、 グノレコース 20m g、 NAD+O. 5 m g、 グルコース脱水素酵素 （天野製薬製） 4 u n i tを含む 0. 1Mリン酸緩衝液 （ pH6. 5) 0. 5m lを 30 °Cで 3時間攪拌した。 反応後、 実施例 1 2と同様 に分析を行った。 その結果、 変換率 66. 9。 で光学純度 99%e . e . 以上の 7—クロ口一 5— (1— (R) —ヒ ドロキシ工チル） フロ [2， 3 - c ] ピリジ ンが生成していた。 (実施例 21 ： F PDH遺伝子のクローニング）
(染色体 DNAの取得）
キャンディダ 'マリス I FO 10003の培養液から、 He r e f o r d ( C e l l , 1 8， 1 26 1 ( 1 979 ) ) に記載の方法に従って染色体 D N Aを 抽出した。
(F PDH遺伝子の PCR法によるクローユング）
実施例 1 4のようにして得られた精製 F P D Hを 8 M尿素存在下で変性させた 後、 ァクロモパクター由来のリシルエンドぺプチダーゼ （和光純薬工業株式会社 製） で消化し、 得られたペプチド断片の配列をエドマン法により決定した。 この アミノ酸配列から予想される DNA配列を考慮し、 PCRプライマー 2種 （ブラ イマ一 1 ： 5' — GGNGCNATHGTNAAYATGGG— 3 ' 、 プライマ —2 ： 5， 一 CCDATNGGRTGYTGNGTDAT— 3， ) を合成した。 プライマー 2種 （プライマー 1及びプライマー 2) 各 1 00 pmo 1、 染色体 DNA 660 n g、 dNTP各 20 nmo し E xT a q (宝酒造株式会社製） 2. 5Uを含む E X T a q用緩衝液 1 00 1を調製し、 熱変性 （95°C、 1分 ) 、 アニーリング （40 、 1分） 、 伸長反応 （6 5 、 2分） を 40サイクル 行い、 4 まで冷却後、 ァガロースゲル電気泳動により增幅 DNAを確認した。
(PCR法により増幅した DN A断片のサブクローニング）
増幅 DNAを p T 7 B 1 u e Ve c t o r (No v a g e n社製） にサブク ローニングし、 その塩基配列を決定した。 その結果、 増幅 DNAはプライマー配 列を含めて 230塩基からなっていた。 その配列は、 図 1に示した DNA配列に おいて、 二重下線を引いた DNA配列部分である。 以後この配列を 「コア配列」 と記す。
(逆 PC R法によるコア配列周辺配列のクローニング）
コア配列の 5 ' —側に近い部分の相補配列 GGAGCGGCC ACATACG AGTGAATGG (プライマー 3) 及び 3， 一側に近い部分の配列 A G A C A CCATTGCTTGATATTTGCCC (プライマ一 4) を基に、 これらと 同配列の PCRプライマ一 2種 （プライマー 3及びプライマ一 4) を合成した。 逆 P CRの铸型として、 まずキャンディダ ·マリス I FO 1 0003の染色体 DNAを制限酵素 P s t Iにより消化し、 消化物を T4DNAリガ一ゼを用いて 自己閉環した。 この自己閉環物 660 n g、 プライマー 2種 （プライマー 3及び プライマ一 4) 各 100 pmo l、 d NTP各 20 nmo l、 E x T a q (宝酒 造株式会社製） 2. 5Uを含む E xT a q用緩衝液 1 00 /Z 1を調製し、 熱変性 (94°C、 0. 5分） 、 アニーリング （5 5°C、 0. 5分） 、 伸長反応 （72°C、 1分） を 40サイクル行い、 4 °Cまで冷却後、 ァガロースゲル電気泳動により増 幅 DN Aを確認した。
増幅 DNAを p T 7 B 1 u e Ve c t o r (No v a g e n社製） にサブク ローニングし、 その塩基配列を決定した。 この結果とコア配列の結果より、 F P DHをコードする DN Aの全塩基配列を決定した。 全塩基配列及び該 DN Aがコ ードする推定アミノ酸配列を図 1にまとめた。 図 1中、 一重下線部は、 精製 F P DHをリシルェンドぺプチダーゼ消化して生じたぺプチド断片において、 ェドマ ン法により決定できたアミノ酸配列を表す。 キャンディダ 'マリス I FO 1 00 03由来の F PDHのアミノ酸配列を、 配列表の配列番号 1に示した。 また、 上 記 F P DHをコードする DNAの塩基配列を、 配列表の配列番号 2に示した。
(実施例 22 ： FPDH遺伝子を含む組換えベクターの作製）
大腸菌において F PDHを発現させるために、 形質転換に用いる組換えべクタ —を作製した。 まず、 F PDHの構造遺伝子の開始コ ドン部分に Nd e I部位を 付加し、 かつ終始コドンの直後に新たな終始コドンと E c o R I部位を付加した 二本鎖 DNAを以下の方法により取得した。 実施例 21で決定した塩基配列に基 づき、 F PDHの構造遺伝子の開始コドン部分に Nd e I部位を付加したプライ マー 5 ( 5 ' -CGCCATATGTCCTACAATTTTGCCAAC-3 ， ) と、 F PDHの構造遺伝子の終始コドンの直後に新たな終始コドンと E c o R I部位を付加したプライマ一 6 (5， -GCGGAATTCTTATTATC TTGCGGTATAACCACC— 3， ) とを合成した。
プライマー 2種 （プライマ一 5及びプライマー 6) 各 1 00 pmo l、 キャン ディダ .マリス I FO 1 0003の染色体 DNA 1 3 2 n g、 d NTP各 20 η mo l、 ExT a q (宝酒造株式会社製） 2. 5 Uを含む E x T a q用緩衝液 1 00 1を調製し、 熱変性 （94 、 0. 5分） 、 アニーリング （ 60 °C、 0. 5分） 、 伸長反応 （72Ϊ、 1分） を 30サイクル行い、 4 まで冷却後、 ァガ ロースゲル電気泳動により増幅 DNAを確認した。 この増幅断片を Nd e I及び E c o R Iで消化し、 プラスミ ド p UCNT (WO 94/036 1 3) の 1 a c プロモーターの下流の Nd e I、 E c o R I部位に挿入することにより、 組換え ベクター p NT F Pを得た。 p NT F Pの作製法及び構造を図 2に示す。
(実施例 23 ： F PDH遺伝子及びグルコース脱水素酵素遺伝子の両者を同時に 含む組換えベクターの作製）
ノくシラス ·メガテリウム （B a c i l l u s m e g_a t e r i u m) I AM 1030株由来のグルコース脱水素酵素 （以後 GDHと呼ぶことにする） の遺伝 子の開始コドンから 5塩基上流に大腸菌の S h i n e -Da l g a r n。配列 （ 9ヌクレオチド） を、 更にその直前に E c o R I切断点を、 また、 終始コドンの 直後に S a 1 I切断点を付加した二本鎖 DNAを、 以下の方法により取得した。
GDH遺伝子の塩基配列情報を基に、 GDHの構造遺伝子の開始コドンから 5塩 基上流に大腸菌の S h i n e— Da l g a r n o配列 （ 9ヌクレオチド） を、 更 にその直前に E c o R I切断点を付加したプライマー 7 (5， -GCCGAAT
—3 ' ) と、 GDHの構造遺伝子の終始コドンの直後に S a 1 I部位を付加した GG— 3， ) を常法に従って合成した。 これら 2つのプライマーを用いて、 プラ スミ ド pGDKl (E u r . J. B i o c h em. ， 1 86， 389 (1 989 ) ) を铸型として PCRによる二本鎖 DNAを合成した。 得られた DNA断片を E c o R I及び S a 1 Iで消化し、 実施例 22において構築した p NT F Pの E c o R I、 S a l I部位に挿入した組換えべクタ一 p NT F PGを得た。 pNT F P Gの作製法及び構造を図 2に示す。
(実施例 24 ：組換え大腸菌の作製）
実施例 22で得た組換えベクター p NTF P及ぴ実施例 23で得た組換えべク タ一 pNTF PGを用いて大腸菌 HB 1 0 1 (宝酒造株式会社製） を形質転換し、 各々から組換え大腸菌 HB 1 01 (p NTFP) 及び HB 101 (pNTFPG ) を得た。 こうして得られた形質転換体である大腸菌 HB 1 01 (pNTF P) 及ぴ HB 10 1 (pNTF PG) は、 それぞれ、 受託番号 FERM B P— 71 1 6 (寄託日 2000年 4月 1 1日） 及び FERM B P- 71 1 7 (寄託日 2 000年 4月 1 1日） として通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所 （あ て名 ： S本国茨城県つくば市東 1丁目 1番 3号） に寄託されている。
また、 プラスミ ド pGDA2 ( J . B i o l . C h e m. ， 264， 6381 (1 989) ) を E c o R I及ぴ P s t Iで二重消化して得られるバシラス ·メ ガテリゥム (B a c i 1 1 u s me g a t e r i um) 由来の GDH遺伝子を 含む約 0. 9 k bの DNA断片を、 プラスミド p STV28 (宝酒造株式会社製 ) の E c o R I— P s t I部位に挿入して、 組換えベクター p STVGを構築し た。 この p STVGで、 予め塩化カルシウム法でコンビテント化しておいた大腸 菌 HB 1 0 1 (p NTF P) を高い導入率で形質転換し、 大腸菌 HB 1 0 1 (p NTF P, p STVG) を容易に得た。
(実施例 25 ：組換え大腸菌における F PDHの発現）
実施例 24で得た組換え大腸菌 HB 10 1 (p NTFP) を 1 20 μ g/m 1 のアンピシリンを含む 2 XYT培地 （バク ト ' トリプトン 1. 6% (w/v) 、 ノ ク ト ·ィ―ス トエキス 1. 0% (w/v) 、 Na C 1 0. 5% (w/ v) 、 p H7. 0) で培養し、 集菌後、 1 00 mMトリス塩酸緩衝液 （pH7) に懸濁し、 超音波破砕により無細胞抽出液を得た。 この無細胞抽出液の F P D H活性を実施 例 14に記載の方法で測定した。 その結果を、 比活性として表 1 1に表した。 菌 ¾ ^名 F PDH比活性 （U/mg)
HB 101 (p UCNT) < 0. 1
HB 10 1 (p NT F P) 1 2. 7 大腸菌 HB 1 0 (p NTF P) では、 ベクタープラスミ ドのみの形質転換体 である大腸菌 HB 0 1 (p UCNT) と比較して明らかな F PDH活性の増加 力 Sみられた。
(実施例 26 ：組換え大腸菌における F PDH及ぴ GDHの同時発現） 実施例 24で得た組換え大腸菌 HB 1 0 1 (pNTFPG) 及ぴ組換え大腸菌 HB 1 0 1 (p NTF P, p SVTG) を、 実施例 25と同様に処理して得られ た無細胞抽出液について、 F PDH活性及び GDH活性を測定した。 GDH活性 の測定は、 1Mトリス塩酸緩衝液 （ρΗ8· 0) に、 基質グルコース 0. 1Μ 補酵素 NAD Ρ+ 2 mM及び酵素を添加し、 25°Cで波長 340 mMの吸光度の 増加を測定することにより行った。 この反応条件において、 1分間に Ι μπιο ΐ の NADP+を NADPHに還元する酵素活性を 1 u n i tと定義した。 また、 F PDH活性についても実施例 1 4と同様に測定した。 このようにして測定した 無細胞抽出液の FPDH活性及び GDH活性を、 比活性として表 1 2に表した。 表 1 2
Figure imgf000054_0001
大腸菌 HB 1 01 (p NTF PG) 及び大腸菌 HB 101 (p NTF P, p S VTG) では、 ベクタープラスミ ドのみの形質転換体である大腸菌 HB 101 ( pUCNT) と比較して明らかな F PDH及び GDH活性の増加がみられた。 (実施例 27 ：反応系にイソプロパノールを添加した条件下での、 FPDH遺伝 子を導入した組換え大腸菌による 5—ァセチルフロ [2， 3— c] ピリジンから の 5— （1— (R) —ヒ ドロキシェチル） フロ [2， 3— c] ピリジンの合成） 実施例 24で得た組換え大腸菌 HB 1 0 1 (pNTFP) を、 500 m 1容坂 口フラスコ中で滅菌した 5 Om 1の 2 XYT培地に接種し、 37 で1 8時間振 とう培養した。 得られた培養液 1 m 1を p H7. 0に調整し、 これに 5—ァセチ ルフロ [2， 3— c] ピリジン 5 Omg、 イソプロパノール 1 50 1及び NA D+0. 22m gを添加して、 30°Cで 7. 5時間攪拌した。 反応終了後、 実施 例 1と同様の分析法で、 生成物である 5— （1—ヒ ドロキシェチル） フロ [2， 3- c] ピリジンへの変換率と光学純度を測定したところ、 変換率 95. 7%、 光学純度 （R) 100 % e . e. であった。
(実施例 28 ：反応系に GDHを別添加した場合の、 FPDH遺伝子を導入した 組換え大腸菌による 5—ァセチルフロ [2， 3-c] ピリジンからの 5— (1 -
(R) —ヒ ドロキシェチル） フロ [2， 3 - c ] ピリジンの合成）
実施例 24で得た組換え大腸菌 HB 1 0 1 (p NTFP) を、 500 m 1容坂 口フラスコ中で滅菌した 50 m 1の 2 X Y T培地に接種し、 3 7 で 1 8時間振 とう培養した。 得られた培養液 2 Om 1にグルコース脱水素酵素 （天野製薬株式 会社製） 540 u n i t、 5—ァセチルフロ [2， 3-c] ピリジン 1. 0 g、 NAD+3mg、 グルコース 3 gを添加し、 2. 5 Mの水酸化ナトリウム水溶液 を滴下することにより PH6. 5に調整しながら、 30 で 29時間攪拌した。 反応終了後、 実施例 1と同様の分析法で、 生成物である 5 _ (1—ヒドロキシェ チル） フロ [2， 3-c] ピリジンの変換率と光学純度を測定したところ、 変換 率 9 7. 1%、 光学純度 （R) 1 00 % e . e . であった。
(実施例 29： F PDH及ぴ GDHを同時発現させた組換え大腸菌による 5—ァ セチルフロ [2， 3 - c ] ピリジンからの 5— (1— (R) —ヒ ドロキシェチル ) フロ [2， 3 -c] ピリジンの合成）
実施例 24で得た組換え大腸菌 HB 1 0 1 (p NTFPG) を、 500 m 1容 坂口フラスコ中で滅菌した 5 Om 1の 2 XYT培地に接種し、 3 7°Cで 1 8時間 振とう培養した。 得られた培養液 2 Om 1に 5—ァセチルフロ [2， 3 - c ] ピ リジン 1. O g、 NAD+3mg、 グルコース 3 gを添加し、 2. 5Mの水酸化 ナトリウム水溶液を滴下することにより P H6. 5に調整しながら、 30°Cで攪 拌した。 反応途中 6時間目に 5—ァセチルフロ [2， 3— c] ピリジン 1. O g、 グルコース 3. O gを追加添加した。 29時間攪拌後、 実施例 1と同様の分析法 で、 生成物である 5— (1—ヒ ドロキシェチル） フロ [2， 3 - c ] ピリジンの 生成量と光学純度を測定したところ、 生成量 2. 66 g、 光学純度 （R) 1 00 % e . e. であった。
(実施例 30 ：反応系に酢酸ブチルを添加した条件下での、 F PDH及び GDH を同時発現させた組換え大腸菌による 5—ァセチルフロ [2， 3— c] ピリジン 力 らの 5— ( 1 - (R) —ヒ ドロキシェチル） フロ [2， 3 - c ] ピリジンの合 成）
実施例 24で得た組換え大腸菌 HB 1 0 1 (p NTFPG) を、 500m l容 坂口フラスコ中で滅菌した 5 Om 1の 2 X YT培地に接種し、 3 7°Cで 1 8時間 振とう培養した。 得られた培養液 2 Om 1に 5—ァセチルフロ [2， 3 - c] ピ リジン 4. O g、 NAD+3mg、 グルコース 6 g、 酢酸ブチル 2 Om lを添加 し、 5 Mの水酸化ナトリウム水溶液を滴下することにより pH6. 5に調整しな がら、 30 で攪拌した。 反応途中 9時間目に 5—ァセチルフロ [2， 3— c] ピリジン 1. O g、 グルコース 1. 5 gを追加添加した。 適時 NAD +を追加添 加して 78時間攪拌後、 実施例 1と同様の分析法で、 生成物である 5— (1—ヒ ドロキシェチル） フロ [2， 3-c] ピリジンの生成量と光学純度を測定したと ころ、 生成量 4. 98 g、 光学純度 （R) 100 % e . e. であった。
(実施例 3 1 ： FPDH遺伝子を導入した組換え大腸菌による 5— (1—ヒ ドロ キシェチル） フロ [2， 3 - c ] ピリジンかちの 5— (1— (S) —ヒ ドロキシ ェチル） フロ [2， 3 - c ] ピリジンの合成）
実施例 24で得た組換え大腸菌 HB 1 0 1 (pNTFP) を、 500 m 1容坂 口フラスコ中で滅菌した 5 Om 1の 2 XYT培地に接種し、 37 で1 8時間振 とう培養した。 得られた培養液 1 m 1を p H6. 5に調整し、 これに 5— (1— ヒ ドロキシェチル） フロ [2， 3— c] ピリジン 1 0 mg (光学純度は 0%e. e. ) , ァセトン 50 / 1及び NAD+O . 1 mgを添加して、 3 で 7時間 攪拌した。 反応終了後、 実施例 1と同様の分析法で、 5—ァセチルフロ [2， 3 — c] ピリジンの生成量と、 5— (1—ヒ ドロキシェチル） フロ [2， 3— c] ピリジンの残存量及ぴ光学純度を測定した。 その結果、 5—ァセチルフロ [2， 3 - c ] ピリジンが 4. 71 mg生成し、 5— (1—ヒ ドロキシェチル） フロ [ 2， 3 - c ] ピリジンの残存量は 5. 29mg、 光学純度 （S) 89. 2 % e . e. であった。
(実施例 32 ： FPDH遺伝子を導入した組換え大腸菌による 5— (1—ヒドロ キシェチル） フロ [2， 3— c] ピリジンからの 5— (1— (S) —ヒ ドロキシ ェチル） フロ [2， 3— c] ピリジンの合成）
実施例 24で得た組換え大腸菌 HB 1 0 1 (p NTF P) を、 500 m 1容坂 口フラスコ中で滅菌した 5 Om 1の 2 XYT培地に接種し、 37"¾：で 18時間振 とう培養した。 得られた培養液 1 m 1を p H6. 5に調整し、 これに 5— (1— ヒ ドロキシェチル） フロ [2， 3 - c ] ピリジン 1 0 m g (光学純度は 0 % e . e. ) を添加して、 30 で 7時間攪拌した。 反応終了後、 実施例 1と同様の分 析法で、 5—ァセチルフロ [2， 3— c] ピリジンの生成量と、 5— （1—ヒ ド 口キシェチル） フロ [2， 3-c] ピリジンの残存量及び光学純度を測定した。 その結果、 5—ァセチルフロ [2， 3 - c ] ピリジンが 4. 98mg生成し、 5 - (1—ヒドロキシェチル） フロ [2， 3 -c] ピリジンの残存量は 5. 02m g、 光学純度 （S) 99. 2 % e . e. であった。 産業上の利用可能性
本発明は、 不斉還元活性を有する酵素または酵素源を作用させて、 ァセチルビ リジン誘導体を立体選択的に還元することにより光学活性ピリジンエタノール誘 導体を高収率で製造することができる。 また、 新規酵素、 該酵素をコードする D NA、 該 DNAを含有する組換えべクタ一、 及び、 該組換えベクターを含む形質 転換体を提供する。 また、 該酵素及ぴ該形質転換体を用いることにより、 光学活 性ピリジンエタノール誘導体の効率的な製造が可能となる。

Claims

一般式 [ 1 ]
請
Figure imgf000059_0001
求
5
(式中、 と R 2は両者が互いに結合して範、 酸素原子、 硫黄原子および窒素原 子からなる群より選ばれる少なくとも 1つのへテロ原子を含み、 かつ置換基を有 していてもよい 5〜 8員の単環性複素環、 又は、 この単環性複素環に他の環が縮 合してなり、 かつ置換基を有していてもよい多環性複素環を形成する。 R 3及び R 4は、 同一又は異なって、 水素原子、 ハロゲン原子、 水酸基、 置換基を有して いてもよい炭素数 1〜1 2のアルキル基、 又は、 置換基を有していてもよい炭素 数 1〜 1 2のアルコキシ基を示す） で示されるァセチルビリジン誘導体を、 不斉 還元活性を有する酵素または酵素源を作用させて、 立体選択的に還元することを 特徴とする、 一般式 [ 2 ] ：
Figure imgf000059_0002
(式中、 R 2、 R 3及び R 4は、 前記と同じであり、 *は不斉炭素を表す） で示される光学活性ピリジンエタノ一ノレ誘導体の製造方法。
2 -般式 [3]
Figure imgf000060_0001
(式中、 Qは、 酸素原子、 硫黄原子、 又は、 一般式— N (D) - (ここで、 Nは 窒素原子であり、 Dは水素原子または 1価の保護基を表す） を示す。 R3、 R4、 R5及び R6は、 同一又は異なって、 水素原子、 ハロゲン原子、 水酸基、 置換基 を有していてもよい炭素数 1〜1 2のアルキル基、 又は、 置換基を有していても よい炭素数 1〜1 2のアルコキシ基を示す） で示されるァセチルビリジン誘導体 を、 不斉還元活性を有する酵素または酵素源を作用させて、 立体選択的に還元す ることを特徴とする、 一般式 [4] ：
Figure imgf000060_0002
(式中、 Q、 R3、 R4、 R5及び R6は、 前記と同じであり、 *は不斉炭素を表 す） で示される光学活性ピリジンエタノール誘導体の製造方法。
3. Qが酸素原子である請求項 2記載の製造方法。
4. Qが酸素原子であり、 R3が水素原子または塩素原子であり、 R4が水素 原子であり、 R5が水素原子であり、 Rfiが水素原子またはメチル基である請求 項 2記載の製造方法。
5 . Qが酸素原子であり、 R 3、 R 4、 R 5及び R 6がいずれも水素原子である 請求項 2記載の製造方法。
6 . 酸化型ニコチンアミ ド ·アデニンジヌクレオチド及び Z又は酸化型ニコチ ンアミ ド ·アデニンジヌクレオチドりん酸をそれぞれの還元型へ還元する酵素、 並びに、 該還元のための基質を存在させて反応を行う請求項 1〜 5のいずれか 1 項に記載の製造方法。
7 . 還元型へ還元する前記酵素がグルコース脱水素酵素であり、 還元のための 前記基質がグルコースである請求項 6記載の製造方法。
8 . 還元型へ還元する前記酵素がギ酸脱水素酵素であり、 還元のための前記基 質がギ酸である請求項 6記載の製造方法。
9 . 前記酵素または酵素源が、 ァシュベィ属、 キャンディダ属、 タリプトコッ カス属、 クラビスボラ属、 デバリオマイセス属、 ディボダスカス属、 ガラク トマ イセス属、 ゲオトリカム属、 ギラモンデラ属、 ハンセニァスポラ属、 ハンセヌラ 属、 ハイホピキア属、 ィサツチエンキァ属、 クルイべロマイセス属、 クライシァ 属、 ロダロマイセス属、 メシュニコヮ属、 ォガタエァ属、 パキソレン属、 ピキア 属、 ロ ドスポリディウム属、 ロドトルーラ属、 サッカロマイコプシス属、 シュヮ ニォマイセス属、 スポリディオボラス属、 スポロボロマイセス属、 シゾブラスト スポリオン属、 ステファノァスカス属、 トルラスボラ属、 トリゴノプシス属、 ト リコスポロン属、 ウイロプシス属、 ヤマダジ一マ属、 チゴサッカロマイセス属、 アルカリゲネス属、 バシラス属、 ブレビパクテリゥム属、 セル口モナス属、 コリ ネバクテリウム属、 ジェンセニァ属、 オタロバク トラム属、 シユードモナス属、 口ドコッカス属、 及びッカムレラ属からなる群より選ばれた微生物由来のもので ある請求項 1〜 8のいずれか 1項に記載の製造方法。
1 0 . 生成物である光学活性ピリジンエタノールの絶対配置が s体であり、 前 記酵素または酵素源が、 ァシュベィ属、 キャンディダ属、 クリプトコッカス属、 クラビスボラ属、 デバリオマイセス属、 ディボダスカス属、 ガラク トマイセス属、 ゲオトリカム属、 ギラモンデラ属、 ハンセニァスポラ属、 ハンセヌラ属、 ハイホ ピキア属、 ィサツチエンキァ属、 クルイべロマイセス属、 クライシァ属、 ロダロ マイセス属、 メシュニコヮ属、 ォガタエァ属、 パキソレン属、 ピキア属、 ロドス ポリディウム属、 ロドトルーラ属、 サッカロマイコプシス属、 シュヮニォマイセ ス属、 スポリディオボラス属、 スポロボロマイセス属、 シゾブラストスポリオン 属、 ステファノァスカス属、 トルラスボラ属、 トリゴノプシス属、 トリコスポロ ン属、 ウイロプシス属、 ヤマダジーマ属、 チゴサッカロマイセス属、 アルカリゲ ネス属、 バシラス属、 ブレビバクテリウム属、 セル口モナス属、 コリネバクテリ ゥム属、 ジェンセニァ属、 オタロバク トラム属、 シユードモナス属、 ロドコッカ ス属、 及びッカムレラ属からなる群より選ばれた微生物由来のものである請求項
9記載の製造方法。
1 1 . 生成物である光学活性ピリジンエタノールの絶対配置が R体であり、 前 記酵素または酵素源が、 キャンディダ属、 ォガタエァ属、 ピキア属、 ヤマダジー マ属、 ブレビバクテリウム属、 及びコリネバクテリゥム属からなる群より選ばれ た微生物由来のものである請求項 9記載の製造方法。
1 2 . 以下の （1 ) から （3 ) の理化学的性質を有することを特徴とする酵素
( 1 ) 作用：還元型ニコチンアミ ド ·アデニンジヌクレオチドを補酵素として、 5—ァセチルフロ [ 2， 3— c ] ピリジンを立体選択的に還元し、 5— ( 1— (
R) —ヒ ドロキシェチル） フロ [ 2， 3— c ] ピリジンを生成する、
( 2 ) 特異性：ケトン及びアルデヒ ドに対して還元活性を有しているが、 炭素環 ケトン及び α—ケト酸の α位ケトンに対する還元活性は非常に低い、
( 3 ) 分子量：ゲル濾過分析において約 6 0 0 0 0の分子量を示し、 S D Sポリ ァクリルアミ ド電気泳動分析において約 29000の分子量を示す。
1 3. 更に、 以下の （4) から （6) の理化学的性質を有する請求項 1 2記載 の酵素：
( 4 ) 至適温度： 50 〜 55 °C、
( 5 ) 至適 p H： 5. 0〜 6. 0、
(6) 阻害剤：水銀イオンによって阻害される。
14. 以下の （a) 又は （b) の酵素：
(a) 配列表の配列番号 1で示されるアミノ酸配列からなる酵素；
( b ) 配列表の配列番号 1で示されるァミノ酸配列において 1若しくは数個のァ ミノ酸が欠失、 置換および/または付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ 5— ァセチルフロ [2， 3— c] ピリジンを立体選択的に還元して 5— (1— （R) ーヒドロキシェチル） フロ [2， 3-c] ピリジンを生成する活性を有する酵素。
1 5. キャンディダ (C a n d i d a) 属に属する微生物に由来する請求項 1 2〜 14のいずれか 1項に記載の酵素。
1 6. キャンディダ 'マリス (C a n d i d a ma r i s ) に由来する請求 項 1 2〜 14のいずれか 1項に記載の酵素。
1 7. キャンディダ 'マリス (C a n d i d a ma r i s ) I FO 1000 3株に由来する請求項 1 2〜14のいずれか 1項に記載の酵素。
1 8. 前記酵素が請求項 1 2〜 1 7のいずれか 1項に記載の酵素であり、 生成 物である光学活性ピリジンエタノール誘導体の絶対配置が R体である請求項 1〜 8のいずれか 1項に記載の製造方法。
1 9. 請求項 14〜1 7のいずれか 1項に記載の酵素をコードする DNA。
20. 配列表の配列番号 2で示される塩基配列からなる DNA。
21. 請求項 1 9又は 20に記載の DN Aを含有する組換えベクター。
22. p NT F Pである請求項 21記載の組換えベクター。
23. グルコース脱水素酵素をコードする DNAを更に含有する請求項 21記 載の組換えベクター。
24. 前記グルコース脱水素酵素がバシラス ·メガテリゥム （B a c i 1 l u me g a t e r i um) 由来のものである請求項 23記載の組換えベクター。
25. p NT F PGである請求項 24記載の組換えベクター。
26. 請求項 21〜25のいずれか 1項に記載の組換えベクターを含む形質転 換体。
27. 宿主が大腸菌である請求項 26記載の形質転換体。
28. E. c o 1 i HB 10 1 ( p N T F P ) である請求項 27記載の形質 転換体。
29. E. c o 1 i HB 10 1 ( p N T F P G) である請求項 27記載の形 質転換体。
30. 請求項 1 9又は 20に記載の DN Aを含有する第 1の組換えべクタ一、 及び、 グルコース脱水素酵素をコードする DNAを含有する第 2の組換えべクタ 一を含む形質転換体。
3 1. 前記第 1の組換えベクターが p NT FPであり、 前記グルコース脱水素 酵素がバシラス .メガテリゥム (B a c i 1 1 u s m e g a t e r i urn) 由 来のものである請求項 30記載の形質転換体。
32. 宿主が大腸菌である請求項 30又は 3 1に記載の形質転換体。
33. 前記酵素が請求項 26〜 3 2のいずれか 1項に記載の形質転換体であり， 生成する光学活性ピリジンエタノール誘導体の絶対配置が R体である請求項 1〜 5記載の製造方法。
34. -般式 [5]
Figure imgf000065_0001
(式中、 と R2は両者が互いに結合して、 酸素原子、 硫黄原子おょぴ窒素原 子からなる群より選ばれる少なくとも 1つのへテロ原子を含み、 かつ置換基を有 していてもよい 5〜8員の単環性複素環、 又は、 この単環性複素環に他の環が縮 合してなり、 かつ置換基を有していてもよい多環性複素環を形成する。 R3及ぴ R4は、 同一又は異なって、 水素原子、 ハロゲン原子、 水酸基、 置換基を有して いてもよい炭素数 1〜1 2のアルキル基、 又は、 置換基を有していてもよい炭素 数 1〜1 2のアルコキシ基を示す） で示されるピリジンエタノール誘導体に、 請 求項 1 2〜 1 7のいずれか 1項に記載の酵素及び/又は請求項 26〜 32のいず れか 1項に記載の形質転換体を作用させ、 R体のピリジンエタノール誘導体を優 先的に酸化し、 残存する S体のピリジンェタノール誘導体を取得することを特徴 とする、 一般式 [6] ：
Figure imgf000066_0001
(式中、 R2、 R3及び R4は、 前記と同じであり、 *は不斉炭素を表す） で示される絶対配置が S体の光学活性ピリジンエタノール誘導体の製造方法。
35. —般式 [ 7 ] ：
Figure imgf000066_0002
(式中、 Qは、 酸素原子、 硫黄原子、 又は、 一般式一 N (D) - (ここで、 Nは 窒素原子であり、 Dは水素原子または 1価の保護基を表す） を示す。 R3、 R4、 R5及び R6は、 同一又は異なって、 水素原子、 ハロゲン原子、 水酸基、 置換基 を有していてもよい炭素数 1〜1 2のアルキル基、 又は、 置換基を有していても よい炭素数 1〜1 2のアルコキシ基を示す） で示されるピリジンエタノール誘導 体に、 請求項 1 2〜1 7のいずれか 1項に記載の酵素及び Z又は請求項 26〜3 2のいずれか 1項に記載の形質転換体を作用させ、 R体のピリジンエタノール誘 導体を優先的に酸化し、 残存する S体のピリジンエタノール誘導体を取得するこ とを特徴とする、 一般式 [8] ：
Figure imgf000067_0001
(式中、 Q、 R3、 R4、 R5及ぴ1^6は、 前記と同じであり、 *は不斉炭素を表 す） で示される絶対配置が S体の光学活性ピリジンエタノール誘導体の製造方法。
36. Qが酸素原子である請求項 35記載の製造方法。
37. Qが酸素原子であり、 R3が水素原子または塩素原子であり、 R4が水 素原子であり、 R5が水素原子であり、 R6が水素原子である請求項 3 5記載の 製造方法。
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