WO2000037172A1

WO2000037172A1 - Materiaux destines a l'elimination de composants bacteriens

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Publication number: WO2000037172A1
Application number: PCT/JP1999/007146
Authority: WO
Inventors: Keishi Miwa; Mayumi Fukuyama; Rumiko Ishii
Original assignee: Toray Industries, Inc.
Priority date: 1998-12-22
Filing date: 1999-12-20
Publication date: 2000-06-29
Also published as: US6461517B1; EP1057529A1; AU1689900A; EP1057529A4

Description

明細書細菌由来成分の除去材料技術分野本発明は、原核生物である細菌、つまりはグラム陰性細菌及びグラム陽性細菌の産生する化合物に対して選択的に親和性を有する材料に関するものである。細菌の産生する化合物の中でも、リポタイコ酸（以下 L T Aと略する）やプロテイン A (以下 P r Aと略する）あるいは αへモリジン（ a H Lと略する）の毒素活性を失わせる（解毒）あるいは除去する材料に関するものである。特に血液中等の高濃度の蛋白質溶液中に存在するし T Aおよび/または P r Aおよび/または a H Lおよび/または蛋白質分解酵素と結合することによって L T Aおよび/あるいは P r Aおよび/または a H Lおよびあるいは蛋白質分解酵素の毒素活性を失わせる（解毒）薬剤として、 L T Aおよびあるいは P r Aおよび/または a H Lおよびノまたは蛋白質分解酵素を除去する浄化カラムあるいは被覆材料として好適に用いられる。背景技術近年 L T Aは、様々な研究から、グラム陽性菌敗血症の原因物質の一つとして考えられるようになつてきた。例えば、培養血管平滑筋細胞の一酸化窒素合成酵素を発現誘導すること（ J . C a r d i o v a s c . P h a r m a c o に , 2 0 , S I 4 5 - S 1 7 ( 1 9 9 2 ) ) 、ラッ卜への静脈内投与により血圧低下やノルァドレナリンによる昇圧反応の低下が起こること（B r . J . P h a e m a c o l . , 1 4 4 , 1 3 1 7 - 1 3 2 3 ( 1 9 9 5 ) ) 、動物に胸腔内投与することによって、胸腔内への好中球の浸潤が認められ胸膜炎病態が発症すること（特開平 9 一 1 6 3 8 9 6 ) 、また L T Aとべプチドグリカンをラッ卜に共投与すると、ショックや臓器障害が起こること（ J . E X p M e d . ， 1 8 8 ( 2 ) ， 3 0 5 — 3 1 5 ( 1 9 9 8 ) ) などが報告されている。これに対して、一酸化窒素の産生が抗マウス C D 1 4抗体（ B i o c h e m B i o p h y s R e s C o m m n n , 2 3 3 ( 2 ) ， 3 7 5 - 3 7 9 ( 1 9 9 7 ) ) あるいは、 N ( o m e g a ) - n i t r o - L — a r g i n i n e m e t h y l e s t e r ( I n f e c t I m m n n , 6 5 ( 6 ) ， 2 0 7 4 - 2 0 7 9 ( 1 9 9 7 ) ) で抑制されること、マウスへの L T A投与によるショック死を血小板活性化因子拮抗剤が抑制すること（特開平 9 — 2 0 8 4 9 3 ) が報告されており、アミノグァ二ジンゃデキサメタゾン（ B r J P h a r m a c o l . 1 1 9 ( 7 ) ， 1 4 1 1 - 1 4 2 1 ( 1 9 9 6 ) ) の効果も検討されている。しかし、これらは全て L T Aによって開始される炎症反応の後期産生物質をターゲッ卜としておリ、 L T A自身をターゲットとした医薬品の報告はない。一方、医療用材料としては、ポリミキシン一 B固定化繊維が、黄色ブドウ球菌培養上清（ 1 0 %ヒ卜血漿添加培地で希釈）による T N F— α産生を 2 0 %低下させるという報告（A S A I O J , 4 4 ( 1 ) ， 4 8— 5 3 ( 1 9 9 8 ) ) がある。

しかし、培養上清には種々の毒素が含まれており、 L T Aの除去は確認されておらず、また除去率も 2 0 %と低い。このように、血漿のような高蛋白質溶液において L T Aと高い親和性を有するような材料はこれまで知られていなかった。

また、 P r Aはヒ卜の免疫系の主要タンパク質であるィ厶ノグロブリン G (以下 I g Gと略くする。）に結合し凝集させることによりその活性を失活させることが知られている。 I g Gが失活させ免疫能を低下させることにより、細菌は生体内へ侵入し易くなり、敗血症が憎悪する。同様に、 a H Lは人の細胞（特に血球）の細胞膜へ孔を形成させることにより細胞を殺傷するタンパク質であり、細胞を破壊することにより感染しやすい状態を作り出し、敗血症を憎悪させている。これらの毒素、 P r Aおよび a H Lに関しては特異的な親和性を有する材料は知られていない。発明の目的本発明はこれら従来技術の欠点を解消し、さらに新規な機能を有する材料に関するものであり、血液などの高蛋白質濃度の溶液中においても L T Aおよびあるいは P r Aおよび/または a H Lおよびまたは蛋白質分解酵素毒素活性を迅速に失わせる（解毒）あるいは除去できる材料を提供することを目的とする。

すなわち、本発明材料は細菌由来成分と高い親和性を有し、血液、血漿などの体液や医薬品中に存在する L T Aおよび/あるいは P r Aおよび/または a H Lおよびまたは蛋白質分解酵素を結合することにより、これらの毒素の活性を解毒し、敗血症や感染症の治療や予防することが可能であり、また、この材料が水不溶性であるならば血液、血漿などの体液や医薬品中に存在する L T Aおよび/あるいは P r Aおよび/または a H Lおよびまたは蛋白質分解酵素を結合することにより、これらの毒素を吸着除去する材料及びそれを用いた敗血症あるいは感染症を治療あるいは予防する血液浄化カラムあるいは創傷被覆材料を提供することができる。発明の開示本発明は上記課題を解決するために下記の構成を有する。

Γ ( 1 ) 水素結合形成可能な官能基を少なくとも 1 つ有し、リポタイコ酸、プロテイン Α、 αへモリジン及び蛋白質分解酵素から選ばれる細菌由来成分の少なくとも 1 種を解毒または除去することを特徴とする細菌由来成分の解毒または除去材料。

( 2 ) 水素結合形成可能な官能基と疎水性基およびノまたはエーテル結合を有し、リポタイコ酸、プロテイン Α、 αへモリジン、蛋白質分解酵素及びェンドトキシンから選ばれる細菌由来成分の少なくとも 1 種を解毒または除去することを特徴とする細菌由来成分の解毒または除去材料。

( 3 ) 上記（ 1 ) および（ 2 ) 記載の材料を用いた敗血症治療用材料。

( 4 ) 上記（ 1 ) および（ 2 ) 記載の材料を用いた創傷被覆材料。

( 5 ) 上記（ 1 ) および（ 2 ) 記載の材料を用いた、液体中からのリポタイコ酸および/またはプロテイン Aおよびまたは aへモリジンおよびまたは蛋白質分解酵素の除去あるいは解毒方法。」発明の実施するための最良の形態本発明において、 L T Aとは、グラム陽性菌、例えばス卜レプトコッカス属、ミクロコッカス属、ラク卜バチルス属、スタフイロコッカス属、バチルス属、ェンテロコッカス属等の細胞膜および細胞壁を構成する物質である。 (医科細菌学吉川昌之介編南江堂）。また、？「ゃ & 1"1 しは黄色ブドゥ球菌の産生するタンパク質である。また、本発明においては蛋白質分解酵素とは細菌由来でありタンパク質の前駆体から部分配列を切断し活性なタンパク質を産生させる蛋白質分解酵素である。これらの細菌由来成分は、感染症、その中でも特に敗血症の重症化と関係している可能性が高い毒素である。その他に、ス卜レブ卜リシンゃコアグラーゼ、腸管出血性毒素、緑膿菌外毒素 A、コレラ毒素、ボツリヌス毒素、ベロ毒素、ロイコシジン、スーパー抗原、エンドトキシン等が感染症、特に敗血症、の重症化との関係が疑われている。中でも、スーパー抗原やエンド卜キシンは毒性も強く、 L T A、 P r A、 a Hしと同時に解毒あるいは除去されることが好ましい毒素である。本発明において、水素結合形成可能な官能基としては特に限定はなく、例えば、尿素結合、チォ尿素結合、ウレタン結合、アミド基、アミノ基、水酸基、カルボキシル基、アルデヒド基、メルカプ卜基、グァニジノ基などが挙げられるが、尿素結合、チォ尿素結合、アミド結合、アミノ基あるいは水酸基を少なくとも一つ有することが好ましい。水素結合形成可能な基に続く構造としては特に限定はなく、プロパン、へキサン、オクタン、ドデカンなどの脂肪族化合物ゃシク口へキサン、シク口ペンタンのような脂環族化合物を用いることができるが、親和性の高さを考慮するとベンゼン、ナフタレン、アン卜ラセン等の芳香族化合物がより好ましく用いられる。ブロモヘプタン、クロロシクロへキサン、メチルベンゼン、クロ口ベンゼン、二卜口ベンゼン、ジフエニルメタン、クロロナフタレン等の誘導体も好適に用いられる。また、水素結合形成可能な基を二つ以上有することがよリ好ましく、特に尿素結合、チォ尿素結合あるいはアミド結合に続く構造として例えば、アミノ基、水酸基、カルボキシル基等の水素結合形成可能な官能基をさらに有する構造が好ましく用いられる。例えばアミノ基を有する構造としては、ァミノへキサン、モノメチルァミノへキサン、ジメチルァミノへキサン、ァミノオクタン、ァミノドデカン、アミノジフエニルメタン、 1 — ( 3 —ァミノプロピル）イミダゾール、 3—アミノー 1 一プロペン、アミノビリジン、ァミノベンゼンスルホン酸、卜リス（ 2—アミノエチル）アミン等や、より好ましくは、ジァミノエタン、ジエチレン卜リアミン、卜リエチレンテ卜ラミン、テ卜ラエチレンペンミン、ジプロピレン卜リアミン、ポリエチレンィミン、 N ' —メチルー 2， 2 ' ジアミノジェチルァミン、 N—ァセチルエチレンジァミン、 1 ， 2—ビス（ 2—アミノエ卜キシェタン）等のようなアミノ基を複数個有する化合物（ポリアミンと言うことがある）が用いられる。また、水酸基を有する構造としては、ヒドロキシプロパン、 2 —エタノールァミン、 1 , 3ジアミノ - 2 -ヒドロキシプロパン、ヒドロキシブ夕ノン、ヒドロキシ酪酸、ヒドロキシピリジン等や、グルコース、ダルコサミン、ガラク卜サミン、マルトース、セルビオース、スクロース、ァガロース、セルロース、キチン、キ卜サン等の単糖、オリゴ糖、多糖等の糖質あるいはそれらの誘導体を用いることができる。さらに、カルボキシル基を有する構造としては例えば、 /3—ァラニン、 n—カブロン酸、イソ骆酸、ァ —アミノー —ヒドロキシ酪酸等を用いることができる。最も好ましくは、本発明材料は尿素、チ才尿素あるいはアミド基に続く構造として芳香族化合物と水素結合形成可能な化合物の両方を有することができる。水素結合形成可能な基以外の官能基としては、疎水性基あるいはエーテル結合を有していることが好ましい。疎水性基としては炭素数 4以上の炭化水素あるいは芳香族環が好ましく、直鎖 ·分岐 ·環状 ' 飽和 ' 不飽和の区別無く有効である。具体的には、 n —ブチル基、 s e c —ブチル基、 t e r t — ブチル基、 i s o —ブチル基、 n —へキシル基、 n—才クチル基、 n — ドデシル基、シクロへキシル基、ベンジル基、 3 ， 3ジフエ二ルプロピル基 n — プチルァミノ基、 n —へキシルァミノ基、 n — ドデシルァミノ基、 n —へキサデシルァミノ基等が挙げられる。

疎水性基としては、 I 0 _g P値（ P =才クタノール/水系における分配係数）が 0 . 7以上の化合物を側鎖に有することがより好ましい。いくつかの既知の化合物については報告されている値を参考にすることが出来る。（Albert L eo, Corwin Hansh, and David Elkins, Partition coefficients and their uses, Chemical Reviews, vol.71 , No.6 p525-61 6 (1 971 ))

エーテル結合を含む構造としてはエトキシェチル基、メ卜キシェチル基等の直鎖エーテルあるいはクラウンエーテル等の環状エーテルあるいはセル口ース、ァガロース等の糖質に含まれるエーテル結合等が挙げられる。

さらに、尿素結合、チォ尿素結合、アミド結合を分子構造内に複数個有するような、ポリ尿素、ポリチ才尿素、ポリアミドも本発明材料として用いることができる。この場合にも、尿素結合、チ才尿素結合、アミド結合に続く構造として上記構造のいずれをも用いることができるが、最も好ましくは、水酸基、アミノ基ゃカルボキシル基を有する化合物（糖質あるいはその誘導体を含む）のような水素結合形成可能な基と芳香族化合物の両方を用いることができる。

また、本発明材料としては、モノマ、才リゴマ、ポリマのいずれでも良いため、上記構造あるいはその一部が重合されているものも本発明材料に含まれる。すなわち、上記構造あるいはその一部として、ナイロン、ポリメチルメタクリレー卜、ポリスルホン、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリビニルアルコール、ポリテ卜ラフル才ロエチレンなどの合成高分子や、セルロース、コラーゲン、キチン、キ卜サンおよびそれらの誘導体を含む天然高分子などが好適に用いられる。つまり、単独重合、共重合あるいはブレンドされたこれら合成高分子や天然高分子などに、水素結合形成可能な基を導入することが好適に行われる。さらに、金属、セラミックス、ガラスなどの無機材料を適当な高分子で被覆したものも好適に用いられる。本発明における担体とは本発明材料を固定する支持体を指すので、例えば上記に挙げたような合成高分子や天然高分子などがある。

本発明材料は一般に公知の方法で合成することができる。例えば脂肪族化合物や芳香族化合物に尿素結合あるいはチ才尿素結合を導入する場合には、イソシァネー卜化合物あるいはィソチオシァネ一卜化合物とアミノ化合物とを反応させる方法を用いることができる。また、脂肪族化合物や芳香族化合物にアミド基を導入する場合には、例えば酸、酸塩化物あるいは酸無水物とアミノ化合物とを反応させる方法を用いることができる。アミノ化合物とィソシァネー卜化合物、イソチオシァネー卜化合物、酸、酸塩化物あるいは酸無水物の混合比は任意に選択でき、通常、イソシァネー卜化合物、イソチォシァネー卜化合物、酸、酸塩化物あるいは酸無水物 1 モルに対して 0 . 1 〜 1 0モルのァミノ化合物が好ましく用いられる。イソシァネー卜化合物あるいはイソチオシァネー卜化合物としては例えば、ェチルイソシァネート、ステアリルイソシァネ一卜、 n-プチルイソシァネー卜、 i s o —プチルイソシァネー卜、 n-プロピルイソシァネー卜、メチルイソチオシァネー卜、ェチルイソチ才シァネー卜、 n-プチルイソチオシァネー卜、ベンジルイソチ才シァネート、へキサメチレンジイソシァネー卜、シクロへキシルイソシァネー卜、シクロへキシルイソチオシァネート、シクロへキシルジイソシァネー卜等の脂肪族ィソシァネー卜化合物あるいはィソチオシァネー卜化合物のいずれをも用いることができるが、より好ましくはフエ二ルイソシァネー卜、クロ口フエ二ルイソシァネー卜、フル才ロフエ二ルイソシァネー卜、ブロモフエ二ルイソシァネー卜、ニトロフエ二ルイソシァネー卜、卜リルイソシァネート、メ卜キシフエ二ルイソシァネ一卜、 1 -ナフチルイソシァネー卜、 4, 4'ジフエ二ルメタンジイソシァネート、 3，3'，5，5'テ卜ラエチル 4, 4'ジィソシアナトジフエニルメタン、フエ二ルイソチ才シァネー卜、クロ口フエ二ルイソチ才シァネ一卜、フル才ロフエ二ルイソチ才シァネー卜、ニトロフエ二ルイソチ才シァネー卜、卜リルイソチ才シァネー卜、メ卜キシフエ二ルイソチ才シァネー卜、 1 -ナフチルイソチオシァネー卜、等の芳香族イソシァネー卜化合物あるいはイソチオシァネート化合物が用いられる。酸塩化物としては例えば、イソバレリルクロライド、ステア口イルク口ライド、シクロへキサンカルボニルク口ライド、 6—クロ口ニコチン酸クロライド等の脂肪族酸塩化物のいずれをも用いることができるが、より好ましくはべンゾイルク口ライド、 3 , 4—ジクロ口べンゾイルク口ライド、ニトロべンゾイルク口ライド、 4 一クロ口べンゾイルク口ライド、 4 一卜ル才イルク口ライド、ベンゾー [ b ] チォフエン— 2—カルボニルクロライド等の芳香族酸塩化物を用いることができる。また、酸無水物としては例えば、無水酢酸、無水コハク酸、無水フタル酸、無水安息香酸等を好ましく用いることができる。また、本発明に用いるアミノ化合物のアミノ基としては〗級ァミノ基、 2級ァミノ基、 3級ァミノ基のいずれでも良く、ァミノ化合物としては例えば、アンモニア、 s e c —才クチルアミン、 1 一（ 3 —ァミノプロピル）ィミダゾ一ル、 3 —アミノー 1 ― プロペン、アミノビリジン、ァミノベンゼンスルホン酸、卜リス（ 2—アミノエチル）アミン等を好ましく用いることができる。また、尿素結合、チ才尿素結合あるいはアミド結合に加えて水素結合形成可能な基を導入できるような、ポリアミノ化合物や水酸基あるいはカルボキシル基を有するアミノ化合物も好ましく用いることができる。ポリアミノ化合物としては例えば、ジアミノエタン、ジエチレン卜リアミン、卜リエチレンテ卜ラミン、テ卜ラエチレンペンタミン、ジプロピレン卜リアミン、 N ' —メチルー 2 , 2 'ジァミノジェチルァミン、ポリエチレンィミン、 N—ァセチルエチレンジァミン、 1 、 2—ビス（ 2—アミノエ卜キシ）ェタン等のいずれをも用いることができる。水酸基を有するァミノ化合物としては、 2-エタノールァミン、 3-プロパノールァミン、 6-へキサノールァミン、 1 ,3ジァミノ- 2-ヒドロキシプロパン、 2 — ( 2 一アミノエトキシ）エタノール、 2 — （ 2—アミノエチルァミノ）エタノール、ダルカミン、 N-メチル 1 ,3-ジァミノプロパノール等の脂肪族ァミン、あるいは、 4-ァミノフエノール、ジァミノフエノール、アミノヒドロキシピリミジン、ジアミノヒドロキシピリミジン、ジアミノヒドロキシピラゾール等の芳香族ァミン、あるいはセリン、チロシン等のアミノ酸類が用いられる。また、ェピクロロヒドリンおよびアミノ化合物、あるいは 1 , 3ジブロモ -2-ヒドロキシプロパンを反応させることによって水酸基のみを有する化合物あるいはアミノ基のみを有する化合物から水酸基を有するアミノ化合物を合成することも可能である。また、糖質に水素結合形成可能な基を導入する場合も上記と同様な方法を用いることができる。すなわち、キトサンやダルコサミンのようなアミノ基を有する糖質の場合には、上述したようなイソシァネ一卜化合物、イソチ才シァネー卜化合物、酸、酸塩化物あるいは酸無水物を反応させることができる。セルロースのようなアミノ基を有さない糖質の場合には、糖質の水酸基をェピクロルヒドリン、卜レシルク口ライドなどを用いて活性化させた後に、アンモニアゃジアミノエタンなどと反応させてアミノ基を導入し、このアミノ基を利用して、糖質に尿素結合、チ才尿素結合、アミド結合等の水素結合形成可能な基を導入することができる。カルボキシル基を有するアミノ化合物としては例えば、 0 —ァラニン、 4 一アミノー n —酪酸、ァ一アミノー iS —ヒドロキシー n —酪酸、 6—アミノー n—カブロン酸等を用いることができる。

さらに、本発明材料がオリゴマあるいはポリマの場合には、例えば、イソシァネー卜基、カルボキシル基あるいはスクシンイミド基等のカルボン酸の活性エステル基を有する才リゴマあるいはポリマに、水素結合形成可能な基を有する化合物のアミノ基を反応させる方法が好ましく用いられる。また、アミノ基を有する才リゴマ、ポリマ、あるいはアンモニア、ジアミノエタン、 1 ,3ジァミノプロパン、 1 ,3ジァミノ- 2-ヒドロキシプロパン、 1 、 2 —ビス（ 2 一アミノエ卜キシ）ェタン、卜リス（ 2 —アミノエチル）ァミン、 2 — （ 2 一アミノエチルァミノ）エタノールなどによりアミノ基を導入した才リゴマ、ポリマに上述したようなィソシァネー卜化合物、ィソチ才シァネー卜化合物、酸、酸塩化物あるいは酸無水物を反応させることも好ましい方法である。また、酸塩化物ゃィソシァネー卜化合物がアミノ基以外の水素結合形成可能な基に反応しないように、反応時間、反応温度あるいは混合比などを制御したり、保護基を用いることが好ましい。アミノ基、イソシァネー卜基、カルボキシル基あるいはスクシンイミド基等のカルボン酸の活性エステル基、酸塩化物基、酸無水物基などの官能基は、必要に応じて才リゴマ、ポリマに導入することができる。

さらに本発明材料がポリ尿素あるいはポリチ才尿素の場合には、例えばポリィソシァネー卜化合物あるいはポリィソチ才シァネー卜化合物とポリアミノ化合物とを反応させる方法を用いることができる。通常、試薬の量はポリイソシァネー卜化合物あるいはポリイソチ才シァネート化合物 1 モルに対して、 0 . 1 〜 1 0モルのポリアミンが好ましく用いられる。ポリイソシァネ一卜化合物あるいはポリイソチ才シァネー卜化合物としてはへキサメチレンジイソシァネー卜、シクロへキシルジイソシァネー卜、卜リレンジイソシァネー卜、 4, 4'ジフエニルメタンジイソシァネー卜、 3，3' ,5，5'テ卜ラェチル4,4'ジイソシアナ卜ジフエニルメタン、キシレンジイソシァネ一卜、メチレンビス ( 4 一フエ二ルイソチ才シァネー卜）等が好適に用いられる。また、ポリアミノ化合物としてはジアミノエタン、ジァミノプロパン、 1 ,3ジァミノ- 2-ヒドロキシプロパン、 N ' —メチル 1，3—ジァミノ- 2-プロパノール、ジァミノフエノール、 N , N ' —ジアミノビペラジン、ジエチレン卜リアミン、卜リエチレンテ卜ラミン、テ卜ラエチレンペン夕ミン、ポリエチレンィミン、ジプロピレン卜リアミン、 N ' —メチル一 2 、 2 ' ージアミノジェチルァミンなどを好ましく用いることができる。さらに、本発明材料がポリアミドの場合には、例えばポリカルボン酸とポリアミンを重縮合させる方法を用いることができる。また、ポリ尿素、ポリチ才尿素、ポリアミドのいずれにおいても、ポリイソシァネー卜、ポリイソチ才シァネー卜、ポリカルボン酸などを用いずに、各々の官能基を一つずつ順次導入することによって最終的にポリ尿素、ポリチ才尿素、ポリアミドを得る方法も好ましく行われる。

また、疎水性基を導入する方法公知の方法で行える。アミノ基を有する材料に対しては疎水性基である炭化水素化合物のハロゲン化物、例えば 1 ーブロモブタン、 1 一プロモへキサン等を反応させ、水酸基を有する化合物の水酸基をェピクロルヒドリン、トレシルク口ライドなどを用いて活性化させた後に、炭化水素化合物のァミノ化物、例えば 1 一アミノブタン、 1 ーァミノへキサン等を反応させることにより容易に作製できる。

また、エーテル結合はビス（ 2—ァミノ）ェ卜キシェタンやポリオキシェチレンビスアミンゃダルコサミン等のアミノ糖を材料の活性化エステル基やハロゲン化アルキル基と反応させることにより導入することが出来る。

上記すベての反応は標準的には、反応温度は 0〜 1 5 0 °C、反応時間は 0 . 1 〜 2 4時間で行われる。また、反応溶媒は必ずしも必要ではないが、一般的には溶媒の存在下に行われる。使用しうる溶媒としては、メタノール、ェタノ一ル、イソプロピルアルコール、 n -ブタノール、へキサン、アセトン、 N , Nジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド等の脂肪族炭化水素類、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素類、ジクロロメタン、クロロホルム、クロ口ベンゼン等のハロゲン化炭化水素類、ジェチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジ才キサン等のエーテル類等が挙げられる。反応終了後の反応液は、必要に応じ、ろ過、濃縮などの通常の後処理の後、カラ厶クロマ卜グラフィー、再結晶などの操作により、精製されることができる。また、水不溶性の材料の場合、ガラスフィルタ一等を用いて洗浄することも好ましい方法である。

本発明材料の中で水不溶性のものは、 L T Aおよびあるいは P r Aおよび/または a H Lおよびノまたは蛋白質分解酵素除去カラムあるいは被覆材料などとして好ましく用いられる。その形状としては特に限定はないが、カラ厶として用いる場合には、ビーズ、繊維、中空繊維、糸束、ヤーン、ネット、編み地、織物等が好ましく、被覆材料の場合は、織物あるいはフイルム等の形状が好ましい。また、本材料は単独での使用のみならず、適当な材料にさらに固定化したり、他材料と混合して一つのカラムあるいは被覆材料として用いることもできる。固定化あるいは混合などの操作は、前記形状に加工する前に行っても良いし、加工した後に行っても良い。本発明の材料を用いたカラムを体外循環用カラムとして用いる場合には、体外に導出した血液を直接カラムに通しても良いし、血漿分離膜などと組み合わせて使用しても良い。以下に実施例を用いて詳細に説明を加えるが、発明の内容が実施例に限定されるものではない。実施例実施例 1 修飾ポリスチレン繊維の作製

5 0重量比の海成分（ 4 6重量比のポリスチレンと 4重量比のポリプロピレンの混合物）と 5 0重量比の島成分（ポリプロピレン）とからなるァメリ力特許 4,661,260記載（実施例 1 ) の海島型複合繊維（厚さ： 2. 6デニール、島の数： 1 6 ) を 5 0 gの N—メチロール一 α—クロロアセ卜アミド、 4 0 O gのニトロベンゼン、 4 0 0 の 9 8 %硫酸、 0. 8 5 gのパラホル厶ァルデヒドの混合溶液と 2 0 °Cで 1 時間反応させた。そして、繊維をニトロべンゼンで洗浄し、水中に入れて反応を停止させた。その後、繊維を温水で再び洗浄することによって、クロロアセ卜アミドメチル化架橋ポリスチレン繊維（以下 A M P S t繊維と略す）を得た。

表 1 に示す試薬を N， N—ジメチルホルムアミド（以下 D M Fと略す） 5 0 m I に溶解した。この溶液に、 1 gの A M P S t繊維（クロ口含量 2 mm 0 I 相当）を攪拌しつつ加えた。反応は 3 0 °Cで 3時間行った。その後、 D M F 2 0 0 m I および蒸留水 2 0 0 m l を用いてガラスフィルター上で洗浄した。

これにより、アミド結合と有する担体繊維にアミノ基（ a ) ( b) 、アミノ基とエーテル基（ c ) ァミノ基と水酸基（d ) ァミノ基と疎水性基（ e ) ~ ( h) を導入した材料を作製した。さらに、蒸留水で洗浄する以前の（ a ) 〜（ h ) の材料を 4一クロルフエ二ルイソシァネー卜 0. 1 9 gを溶解した D M F 5 0 m I の溶液中に加え、 2 5 °Cで 1 時間、反応させた。その後、ガラスフィルタ一上で 2 0 0 m I の D M Fおよび 2 0 0 m I の蒸留水により洗浄し、アミノ基を尿素誘導体へ変換した。（ a 2 ) ~ ( h 2 ) 表 1 . A M P s t繊維との反応に用いた試薬

実施例 2 キトサンビーズへの尿素基、チ才尿素基およびアミド基の導入粒径 0. 1 m mのキトサンビーズ（富士紡（株）製、 " キトパール" A L - 0 1 ) 1 2 m l (沈殿時体積、乾燥重量は 1 . O g ) を 5 0 m l の D M F 中で攪拌し、ガラスフィルターによって、ビーズと溶液の分離を行った。この操作を 1 回 5分間、 2 0回繰り返し、含有水分を D M Fと完全に置換させた。

表 2の試薬を 1 0 0 m I の D M F中に溶解させたものにビーズを徐々に添加し、攪拌しながら室温で 1 時間反応させた。その後、ガラスフィルターを用いて、ビーズと溶液を分離し、ビーズを 5 0 m I の D M F中で 5分間攪拌することによって洗浄を行った。この洗浄操作を 2 0回繰り返し、未反応の試薬を完全に除去した。次いで、蒸留水による洗浄操作を同様に行い、 D M Fを蒸留水と置換することによって、尿素結合、チ才尿素結合、アミド結合を有するキ卜サンビーズを得た, 表 2

実施例 3 セルロースビーズへのアミノ基および疎水性基の導入

粒径 0. 1 mmのセルロースビーズ（チッツ（株）製、 " セル口ファイン G C L — 7 0 0 m" ) 2 0 0 m l に水を力 Qえ 4 0 0 m l としたのち、 5 N— 水酸化ナ卜リゥ厶水溶液 4 0 m l を加え、さらに、ェピクロロヒドリン 5 0 m I を加え、 4 0 °Cにおいて 6時間反応させた。反応後、ガラスフィルター上でビーズを 3 0 0 0 m I の蒸留水で洗浄し、エポキシ基を導入したセル口ースビーズ（ E P 0 ) を得た。

表 3の試薬を 1 0 0 m l の 5 0 % ( / v ) エタノール水溶液中に溶解させたものに E P Oビーズ 1 0 m l を徐々に添加し、攪拌しながら 5 0 °Cで 7 日間反応させた。その後、ガラスフィルターを用いて、ビーズと溶液を分離し、ビーズを 5 0 0 m I 5 0 % ( v X v ) エタノール水溶液、続いて蒸留水 5 0 0 m l 洗浄を行い、未反応の試薬を完全に除去した。これにより、セルロースビーズにアミノ基および疎水性基を下記の構造になるように導入した

C H - (C H2) n— X 2 — Y

X 1

X 1 = O H、 X 2 = N H 2

Y =(C H 2 ) 3 -C H 3 · · · ( I ) =(C H 2)5-C H 3 (m)

=(C H 2)7 -C H 3 ( n )

n = 1 表 3

実施例 4 修飾 A M P S t繊維と修飾キトサンビーズによる L T A、 P r A、 a H L、蛋白分解酵素、エンドトキシン、スーパー抗原の除去試験

実施例 1 で作製した修飾 A M P S t繊維と実施例 2で作製した修飾キ卜サンビーズおよび実施例 3で作製した修飾セルロースビーズによる L T A、 P r A、 a H し、蛋白分解酵素、エンドトキシン、スーパー抗原の吸着除去試験を行った。 L T Aは、黄色ブドウ球菌由来（シグマ社より購入）を、 P r Aはプロザィ厶社より購入し、エンド卜キシン（以下 E t と略する）は大腸菌 0 1 1 1 B 4株由来の標品（ D I F C 0社より購入）を蛋白質分解酵素としての S P E Bおよび a H Lおよび T S S T— 1 はトキシンテクノロジ一社より購入した。除去試験は、ゥサギ血隳を用いて行った。抗凝固剤を用いてゥサギより血液を採取し、 3 0 0 0 r p m、 1 5分間遠心分離することによつて血漿を得た。この血漿を 5 6 °Cで 2時間加温し熱非働化血漿を作製した。この血漿を 0. 4 5 m細径のメンブレンフィルターで濾過後、 L T A、 P r A、 a H L , S P E B , E t、丁 5 5丁ー 1 を各々 1 0 8 ^/ 11 1 となるように添加した。 L T A添加血漿 0. 5 m I に対して、表 1 の修飾 A M P S t繊維を 3 5 m g、または表 2の修飾キトサンビーズ 0. 1 m l (沈殿時体積）あるいは修飾セルロースビーズ 0. 1 m l (沈降時体積）を添加し、 3 7 °Cで 2時間振とうした。 2時間反応後の溶液中の細菌由来成分の濃度を酵素免疫学的測定法（ L T A , P r A , a H L , S P E B , T S S T— 1 ) あるいはリムルス試薬（和光純薬より購入）を用いて測定した。この結果を表 4に示す。この結果から、尿素結合、チ才尿素結合、アミド結合、アミノ基あるいは水酸基等の水素結合形成能を有する材料はポリスチレンのような水素結合形成可能な基を有していない材料と異なり、 L T A、 P r A， a Hし、 S P E B、 E tあるいは T S S T— 1 を同時に 1 ~ 5種類を除去することが示された。また、疎水性基やエーテル結合は除去能を促進する効果を示した。また、疎水性基の I 0 g P値が 0. 7以上であれば L T A、 P r A , a H し、 S P E B , E tあるいは T S S T— 1 に対する結合能が付加できることが示された。

なお、各毒素の除去試験前の濃度（C O ) と除去後の濃度（C) より式 1 により計算した除去率 A rを表 4中に示した。

A r = ( C O - C) /C O 式 1

表 4 . 修飾 A M P S t繊維と修飾キトサンビーズによる L T A、 P r A、 a H L、蛋白分解酵素、エンドトキシン、スーパー抗原の除去試験

L T A P r A a H L SPEB E t TSST-1

% % % % % % 未修飾本'リスチレン複合繊維 0 0 0 0 0 0

( a ) 8 5 2 5 3 2 4 7 7 0 4 8

( b ) 5 3 3 3 1 8 4 3 5 3 4 0

( c ) 4 8 2 3 1 8 3 9 4 2 3 7

( d ) 4 1 1 7 2 0 5 1 3 8 5 3

( e ) 1 2 2 0 1 8 3 8 2 0 4 2

( f ) 5 0 1 4 1 2 3 9 4 9 3 5

( g ) 8 2 1 0 9 3 2 6 0 2 8

( h ) 7 8 2 1 1 3 3 0 5 9 4 6

( a 2 ) 8 4 6 2 7 8 9 3 6 2 8 6

( b 2 ) 6 5 5 6 7 4 8 9 4 0 8 1

( c 2 ) 6 2 5 2 7 9 7 8 2 5 8 0

( d 2 ) 6 7 6 1 3 9 9 6 1 9 8 2 ( e 2 ) 1 3 2 4 2 1 7 5 1 4 7 6

( f 2 ) 2 5 3 8 2 4 7 8 1 7 6 3

( g 2 ) 4 2 4 6 3 8 6 7 3 2 4 9

( h 2 ) 5 8 5 1 4 1 5 8 3 0 5 8 未修飾キ卜サンビーズ 5 2 8 3 2 7 6

( i ) 9 5 5 3 7 2 9 6 5 4 8 9

( j ) 5 8 6 2 6 2 8 5 4 8 8 0

( k ) 5 2 4 5 5 2 7 1 4 2 6 9 未修飾木。リスチレンビ -ス' 0 0 0 0 0 0 未修飾セルスビ -ス' 6 2 0 6 0 4

( ！ ) 3 1 3 6 1 1 2 3 1 0 1 2

(m) 5 5 5 0 3 4 3 7 1 5 3 3

( n ) 8 0 4 2 7 7 9 0 2 1 8 4

実施例 5 修飾 A M P S t繊維による L T A除去試験一循環法

実施例 1 の修飾 A M P S t繊維（ a 2 ) を用いて、 L 丁 A、 P r A , a H L， S P E B , E t ， T S S T — 1 の循環方法による除去試験を行った。各繊維 1 gをカラムに充填し、これに実施例 3の方法で作製したゥサギ血漿 1 0 m I を 3 7 °Cにおいて 1 m I /m i nで 6 0分間循環させた時の L T A濃度を表 6 に示す。体外循環のような流動条件下においても、経時的に濃度が減少し、除去能があることが示された。

実施例 4 と同様に、各毒素の除去試験前の濃度（ C O ) と各時間における除去後の濃度（ C ) より式 1 により計算した除去率 A r を表中に示した。

表 5

し T A P r A a H L SPEB E t TSST-1

% %

% % % % 循環開始前の除去率 0 0 0 0 0 0

1 5分後の除去率 6 5 5 6 7 4 7 8 4 0 6 7

3 0分後の除去率 6 2 5 2 7 9 7 8 5 1 7 9

6 0分後の除去率 8 2 5 7 7 0 9 1 6 2 8 2 実施例 6 吸着体の作製とその吸着体を用いた細菌由来成分および抗生剤の除去率の測定（ 2 )

実施例 1 で作製した aクロロアセトアミドメチル化架橋ポリスチレン繊維 (以下 A M P S t繊維と略す。）に、テトラエチレンペンタミン 6 . 3 g、 n —プチルァミン 7. 2 gを D M F 5 0 0 m l に溶解した液に、 2 0 gの A M P s t繊維を撹拌しつつ加えた。反応は 3 0 °Cで 3時間行い、その後、反応した繊維をガラスフィルター上で D M F 5 0 0 m I を用いて洗浄し。さらにその繊維を、 2 . 3 gの 4 一クロ口フエ二ルイソシァネー卜を溶解した D M F 5 0 0 m I の溶液に添加し、反応を 2 5 °Cで 1 時間行った。その後ガラスフィルター上で D M F 1 0 0 O m l を用いて洗浄し、さらに蒸留水 1 0 0 0 m I を用いて洗浄し、尿素結合を導入した A M P s t繊維（以下 U A P 繊維と略す。）を得た。

ここで、作製した U A P繊維を用いて細菌由来成分および抗生剤の除去試験を行った。細菌由来成分として P r A、 a H L、蛋白分解酵素、ェンドトキシン、スーパー抗原の吸着除去試験を行った。抗生剤としてはアルべカシン（以下 A R Kと略す。明治製菓（株））を用い、昇圧剤としてはアドレナリン（第一製薬（株）製）を用いた。濃度は、 T S S T— 1 、 αへモリジン、プロテイン A、 S Ρ Ε Αに関しては酵素免疫学的に、 L P Sに関してはリムルス試薬（和光純薬）により、また、 A R Kに関しては蛍光偏光免疫測定法によりァドレナリンは液体クロマ卜グラフィ一法により測定した。

P r A、 a H し、 T S S T— 1 、 S P E Bを l n gノ m l 、 L P Sを 1 0 n g /m l 及び A R Kを 1 ノ m l 、アドレナリンを 1 O O n g Zm l となるように 0. 1 5 M塩化ナトリウム、 5 m g Zm l 牛血清アルブミン（フラクシヨン V ) (生化学工業社製）を含む 0. 1 Mリン酸ナトリウム緩衝液 ( P H 7. 4 ) 中に溶解させ被除去液とした。 U A M P O . 〗 gをこの被除去液 1 m I 中に添加し、 3 7でで 2時間旋回撹拌しつつ除去反応を行った。除去前後の濃度を測定し前述した式（ 1 ) を用いて除去率を算出した結果を表 6 . に示した, 表 6 . 細菌由来成分及び抗生剤の除去試験 <

発明の効果

本発明により、血漿などの高蛋白質濃度の溶液中においても L T Aおよび /あるいは P r Aおよび/または a H Lおよびまたは蛋白質分解酵素を迅速に解毒あるいは除去できる、水素結合形成可能な官能基を含む材料が提供された。本発明の材料を用いて、血液、血漿などの体液や医薬品中に存在する L T Aおよびあるいは P r Aおよび/あるいは a H Lおよび/"または蛋白質分解酵素の毒素活性を失わせる（解毒）ことができるので、敗血症ショック、感染症などの治療や予防が可能になる。また、この材料の中で水不溶性であるものを用いて、血液、血漿などの体液や医薬品中から L T Aおよび/あるいは P r Aおよび/または a H Lおよび Zまたは蛋白質分解酵素を効率的に除去できるので、これにより、 L T Aおよび/あるいは T A除去カラムや被覆材料を構成することで、敗血症ショック、感染症などの治療や予防が可能になる。

Claims

請求の範囲

1 . 水素結合形成可能な官能基を少なくとも 1 つ有し、リポタイコ酸、プロテイン A、 aへモリジン、蛋白質分解酵素及びエンドトキシンから選ばれる細菌由来成分の少なくとも 1 種を解毒または除去することを特徴とする細菌由来成分の解毒または除去材料。

2. 該細菌由来成分がリポタイコ酸である請求項 1 記載の細菌由来成分の解毒または除去材料。

3. 該細菌由来成分がプロティン Αである請求項 1 記載の細菌由来成分の解毒または除去材料。

4. 該細菌由来成分が αへモリジンである請求項 1 記載の細菌由来成分の解毒または除去材料。

5. 該細菌由来成分が蛋白質分解酵素である請求項 1 記載の細菌由来成分の解毒または除去材料。

6. 該細菌由来成分がエンドトキシンである請求項 1 記載の細菌由来成分の解毒または除去材料。

7. 該細菌由来成分がリポタイコ酸、プロテイン A、 αへモリジン、蛋白質分解酵素、エンド卜キシンおよびスーパー抗原から選ばれる少なくとも 2種である請求項 1 記載の解毒または除去材料。

8. 該水素結合形成可能な官能基の少なくとも一つが尿素結合、チ才尿素結合、アミド結合、アミノ基および水酸基から選ばれることを特徴とする請求項 1 記載の材料。

9. 該水素結合形成可能な官能基を二つ以上有することを特徴とする請求項 1 記載の材料。

1 0.化学構造の異なる該水素結合形成可能な官能基を有することを特徴とする請求項 9記載の材料。

1 1 .水素結合形成可能な基の少なくとも一つがアミノ基であることを特徴とする請求項 9記載の材料。

1 2.該ァミノ基が 2級あるいは 3級であることを特徴とする請求項 1 1 記載の材料。

1 3.該ァミノ基がポリアミンであることを特徴とする請求項 1 1 記載の材料。

1 4 ·水素結合形成可能な基の少なくとも一つが水酸基であることを特徴とする請求項 9記載の材料。

1 5.該水酸基が糖質由来であることを特徴とする請求項 1 4記載の材料。

1 6.該糖質がキトサン、セルロースおよびそれらの誘導体から選ばれることを特徴とする請求項 1 5記載の材料。

1 7.疎水性基を少なくとも一つ有することを特徴とする請求項 1 記載の材料。

1 8.疎水性基が炭素数 4以上の炭化水素鎖であることを特徴とする請求項 1 5 記載の材料。

19.疎水性基が芳香族環であることを特徴とする請求項 1 7記載の材料。

20.才クタノール/水系の分配係数を Pとしたとき、疎水性基の logPが 0. 5 以上であることを特徴とする請求項 1 7記載の材料。

21. 2種類以上の疎水基を有することを特徴とする請求項 1 7記載の材料。

22.水素結合形成可能な基から疎水性基までの距離が 5原子以内であることを特徴とする請求項 1 7記載の材料。

23.エーテル結合を有することを特徴とする請求項 1 記載の材料。

24.エーテル結合が糖質由来であることを特徴とする請求項 2 3記載の材料。

25.糖質がキトサン、セルロースおよびそれらの誘導体から選ばれることを特徴とする請求項 2 4記載の材料。

26. 下式で表される請求項 1 記載の材料。

- C H - (C H2) Π- Χ 2 - Υ

X 1

X ：水素結合形成可能な官能基

X 1 と X 2は同一でも異なっていても良い。

Y ：炭素数 4以上のアルキル基または芳香族環

n ： 0 - 5

27. Xがァミノ基および水酸基から選ばれる請求項 2 6記載の材料。

28.担体を含むことを特徴とする請求項 1 記載の材料。

29.該担体がポリスチレン、ポリスルホン、ポリメチルメタクリレー卜、セルロース、キ卜サンおよびそれらの誘導体から選ばれることを特徴とする請求項 2 8記載の材料。

30.該担体が繊維であることを特徴とする請求項 2 8記載の材料。

31 .該繊維が海島型の繊維であることを特徴とする請求項 3 0記載の材料。

32.水不溶性であることを特徴とする請求項 1 記載の材料。

33.敗血症治療用であることを特徴とする請求項 1 記載の材料。

34.請求項 1 記載の材料を用いた体液浄化カラム。

35.請求項 1 記載の材料を用いた被覆材料。

36.請求項〗記載の材料を充填したカラムにリポタイコ酸を含む液体を通過させることによってリポタイコ酸を液体から除去あるいは解毒する方法。

37.請求項 2記載の材料を充填したカラムにプロティン Aを含む液体を通過させることによってプロティン Aを液体から除去あるいは解毒する方法。

38.請求項 3記載の材料を充填したカラムに αへモリジンを含む液体を通過させることによってへモリジン αを液体から除去あるいは解毒する方法。

39.請求項 3記載の材料を充填したカラムに蛋白質分解酵素を含む液体を通過させることによって蛋白質分解酵素を液体から除去あるいは解毒する方法。

40.請求項 4記載の材料を充填したカラムにリポタイコ酸を含む液体を通過させることによってエンド卜キシンを液体から除去あるいは解毒する方法。

41 .請求項 5記載の材料を充填したカラムにリポタイコ酸、プロテイン A、 a へモリジン、蛋白質分解酵素、エンド卜キシンおよびスーパー抗原から選ばれる少なくとも二つ以上の成分を含む液体を通過させることによって、二つ以上の該成分を液体から除去あるいは解毒する方法。

42.液体が血液または血漿であることを特徴とする請求項 3 5から 4 1 記載の方法。