CN101151056B - 吸附材料和体外循环柱 - Google Patents
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Abstract
本发明的目的在于提供可以除去存在于血液中的细胞、粒细胞或单核细胞等活化的白细胞,以及以癌细胞为代表的细胞,同时可以除去促进残留细胞活化的细胞因子类,并且不会有压力损失、形状稳定性高的吸附材料。即,本发明提供ζ电位为-20mV以上、可吸附血液中的粒细胞、单核细胞的吸附材料;吸附免疫抑制性蛋白质的癌治疗用吸附材料;具有网和非织造布两层结构的吸附材料。本发明还提供填充了上述任意一种吸附材料而成的血液循环柱。
Description
技术领域
本发明涉及吸附材料和体外循环柱,更具体地说,涉及可有效地从血液中除去白细胞、炎症性、免疫抑制性细胞因子、体液因子,适合在白细胞除去疗法、免疫激活疗法、癌治疗等中使用的吸附材料,以及利用该吸附材料的体外循环柱等血液处理柱。
背景技术
血液中含有血细胞、细胞因子以及其它体液成分等各种成分,这些血液成分在体内免疫平衡调节中发挥重要作用。
以脂多糖为代表的内毒素是在血液中显示发热、血压降低、血管内凝血、哈格曼(hageman)因子活化等各种生物活性的因子。特别是在临床上,例如在外科手术后如果混入到患者血液中,则会引发严重的败血症。已知受到混入患者血液中的内毒素、特别是混入到重症患者的血液中的内毒素的刺激,白细胞释放出癌坏死因子、白细胞介素-1、白细胞介素-6、干扰素等各种细胞因子或酸过氧化物。还已知这些过量的细胞因子会产生生理性不良影响。
目前已经开发了除去血液中各种成分的柱。例如有以除去白细胞或粒细胞为目的的柱(专利文献1、2)、以吸附细胞因子为目的的柱(专利文献3、4)、以同时吸附白细胞和毒素为目的的柱(专利文献5、6),但是尚未有同时除去血细胞进行信息响应的体液因子的柱。还报道了以ζ电位为0mV以上的规定的过滤材料为主要部分的白细胞除去膜(专利文献7),但是只是公开了血细胞的除去。因此,这些以往的柱对于使残留的细胞的正常化来说仍不足。
另外,在血液成分中、特别是潜在型转化生长因子-β(以下称为TGF-β)、免疫抑制酸性蛋白、白细胞介素-10、肿瘤坏死因子(以下称为TNF)、前列腺素E2等各种物质、或B细胞、巨噬细胞等细胞在进行性癌(進行癌)患者中异常增殖,阻碍癌特异性杀伤细胞的诱导或功能表达等,抑制了上述免疫功能(非专利文献1:藤原大美著、肿瘤免疫学、89-112页、中外医学社、1998年)。因此,以癌患者为对象,
除去这些免疫抑制物质、提高患者免疫力,诱导肿瘤缩小或抑制增殖的方法的开发也得到了发展。
作为用于有效、安全地除去这些免疫抑制物质的技术,已经公开了以分别吸附TGF-β(专利文献8、9))、癌胎抗原(专利文献10)、免疫抑制酸性蛋白(专利文献11)为目的的技术。但是,将这些免疫抑制物质用一种吸附体有效地除去的技术尚未见开发。
另一方面,上述柱是在柱内部具有用于除去、吸附上述各目标物质的过滤材料或吸附材料(吸附载体),可以使用各种物质、形状。例如专利文献1中,为了消除血细胞的堵塞而使用了将含多种纤维直径的纤维混合得到的非织造布。但是,非织造布本身松密度高、对血细胞除去性的控制不足,依然有血液循环时导致压力损失升高的可能。
在含有直径2mm左右的乙酸纤维素珠的吸附载体(专利文献2)中,虽然没有压力损失的可能,但是无法增大吸附表面积,作为吸附载体,其效率较低。这是由于减小粒径会使压力损失增加,因此难以采用。
专利文献6中从防止堵塞和维持形态保持性的角度,开发了将吸附载体的松密度调节为0.05-0.15g/cm3,但是该吸附载体的实用性低,特别是形态稳定性不足。
非专利文献1:藤原大美著、肿疡免疫学、89-112页、中外医学社、1998年
专利文献1:日本特开昭60-193468号公报
专利文献2:日本特开平5-168706号公报
专利文献3:日本特开平10-225515号公报
专利文献4:日本特开2000-237585号公报
专利文献5:日本特开2002-113097号公报
专利文献6:日本特开2002-172163号公报
专利文献7:日本特开平6-142196号公报
专利文献8:日本特开2003-339854号公报
专利文献9:日本特开2004-248950号公报
专利文献10:日本特开2003-310751号公报
专利文献11:日本特开2003-111834号公报
发明内容
本发明的第一课题是除去粒细胞、单核细胞等细胞,并且使促进残留细胞活化的细胞因子类也不残留在残留的体液成分中。为此,通过使吸附体具有在除去细胞的同时也可以除去异常增加的细胞因子的功能,即可以解决这些问题。即,本发明的第一目的在于提供可适用于将细胞和细胞因子同时吸附、同时除去的材料,以及使用该材料的血液处理柱。
本发明人发现:吸附除去存在于体液中并成为细胞因子释放原因的内毒素、附着于粒细胞或单核细胞表面的内毒素等,或者预防内毒素导致的过量细胞因子的生成,对于改善含内毒素血液的状态是很重要的。基于该发现,本发明的课题包括(1)使体液中的内毒素直接吸附于吸附材料上并直接除去;以及(2)吸附粒细胞或单核细胞,从血液中间接除去对粒细胞或单核细胞等白细胞成分具有附着性的内毒素。本发明还包括(3)除去起因于该内毒素的细胞因子,预防血液中细胞因子浓度升高。
总而言之,上述本发明的第一目的包含:提供可适合用于将粒细胞或单核细胞等细胞以及细胞因子类、内毒素两者吸附和除去的高功能性材料,以及使用该高功能性材料的高功能血液处理柱。
本发明的第二课题在于除去与癌细胞增殖相关的免疫抑制物质。即,本发明的第二目的针对上述以往技术的问题点,提供可普及的、可以从体液中直接高效且选择性吸附TGF-β或免疫抑制酸性蛋白等免疫抑制物质,同时除去体液中的白细胞以使其接近正常白细胞平衡、且可以安全地进行体外循环的材料。该第二目的包括提供填充有吸附上述免疫抑制物质的材料的癌治疗用柱、以及使用该柱进行癌的治疗。
本发明的第三课题在于确保血液循环柱的稳定利用性。即,本发明的第三目的针对上述以往技术的问题点,提供可以除去存在于血液中的细胞、特别是粒细胞或单核细胞等活化白细胞、癌细胞等,进一步优选可除去过量存在的细胞因子的压力损失小的吸附载体,以及在不损害吸附特性的条件下使载体本身具有形状稳定性。
本发明中,为实现上述第一目的,具有下述构成。
(1)吸附材料,其特征在于:ζ电位(ゼ一タ電位)为-20mV以上,吸附血液中的粒细胞、单核细胞和细胞因子。
(2)上述(1)的吸附器,其特征在于:从上述血液分散液中吸附
粒细胞的吸附率为50%以上,且吸附单核细胞的吸附率为50%以上。
(3)上述(1)或(2)的吸附材料,其特征在于:淋巴细胞的吸附率为40%以下。
(4)上述(1)-(3)中任一项的吸附材料,其特征在于:上述细胞因子选自白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-8(IL-8)、白细胞介素-10(IL-10)、TNF-α、转化生长因子-β(TGF-β)、血管内皮生长因子(血管新生増殖因子,VEGF)、以及免疫抑制酸性蛋白(IAP)中的至少一种。
(5)上述(1)-(4)中任一项的吸附材料,其特征在于:凝血因子XIII的吸附率为30%以下。
(6)上述(1)的吸附材料,其特征在于:ζ电位为-15mV以上,在溶解了1vol%胎牛血清(FCS)的生理食盐水中具有90%以上的脂多糖(LPS)吸附能力。
(7)上述(1)-(6)中任一项的吸附材料,其是在水不溶性载体上结合季铵盐和/或直链状氨基而成的。
(8)上述(1)-(7)中任一项的吸附材料,其特征在于:其形状选自纤维、膜、中空丝和珠。
(9)上述(1)-(8)中任一项的吸附材料,其中,上述水不溶性载体的形状是纤维状或中空丝状,且该纤维直径超过3μm。
(10)上述(9)的吸附材料,其特征在于:该吸附材料含有纤维直径为4-8μm的纤维A和纤维直径为10-50μm的纤维B。
(11)上述(10)的吸附材料,其特征在于:上述纤维A含有纤维直径为4.5-8μm的纤维。
(12)上述(1)-(8)中任一项的吸附材料,其中,上述水不溶性载体的形状为珠状,且材料的表面具有直径超过3μm的突起部分。
(13)上述(1)-(12)中任一项的吸附材料,其特征在于:该吸附材料用于白细胞除去疗法。
(14)血液处理柱,该血液处理柱是将上述(1)-(13)中任一项的吸附材料填充到容器中而成。
(15)(14)的血液处理柱,其特征在于:使血液循环。
(16)(14)或(15)的血液处理柱,其特征在于:该血液处理柱用于白细胞除去疗法。
(17)上述(14)-(16)中任一项的血液处理柱,其中,与生物之间的体外循环结束150-180小时后,与体外循环之前相比,显示淋巴细胞数的增加和粒细胞数的减少。
本发明中,为实现上述第二目的,具有下述构成。
(1)癌治疗用吸附材料,该吸附材料含有结合了亲水性胺残基的水不溶性聚合物,其具有潜在性转化生长因子-β吸附能力和白细胞吸附能力。
(2)上述(1)的癌治疗用吸附材料,其特征在于:上述结合了亲水性胺残基的水不溶性聚合物是膜、纤维或粒状物。
(3)癌治疗用体外循环柱,该癌治疗用体外循环柱使用上述(1)或(2)的癌治疗用吸附材料。
本发明中,为实现上述第三目的,具有下述构成。
(1)吸附载体,其特征在于:该载体至少具有网和非织造布两层结构。
(2)(1)的吸附载体,其特征在于:上述网是在100mm2中具有10mm2以上空隙的网。
(3)(1)的吸附载体,其特征在于:该吸附载体吸附生理活性物质和/或细胞。
(4)(1)-(3)中任一项的吸附载体,其特征在于:上述网包含单纤维。
(5)(1)-(4)中任一项的吸附载体,其特征在于:松密度为0.02g/cm3以上。
(6)血液处理柱,其特征在于:将(1)-(5)中任一项的吸附载体装入到圆筒状容器中。
(7)(6)的血液处理柱,其特征在于:该血液处理柱是使血液循环而使用的。
本发明提供吸附材料和血液处理柱,该吸附材料和血液处理柱是通过同时除去过量增殖的粒细胞或单核细胞等人体不需要的白细胞或者对这些细胞进行信息传递的细胞因子,应用于溃疡性结肠炎、克罗恩病(クロ一ン病)、自身免疫疾病等的血液处理或治疗中。
本发明还提供吸附材料和血液处理柱,该吸附材料和血液处理柱是通过同时除去过量增殖的粒细胞或单核细胞等人体不需要的白细胞或
者对这些细胞进行信息传递的细胞因子,并且同时除去活化白细胞的LPS,应用于溃疡性结肠炎、克罗恩病、自身免疫疾病等的血液处理或治疗中。
本发明提供可以由体液中高效率、选择性直接吸附TGF-β或免疫抑制酸性蛋白等免疫抑制物质,同时除去体液中的白细胞的癌治疗用吸附材料以及使用该材料的癌治疗用体外循环柱。因此,本发明可治疗进行性癌或延长患者的寿命以及提高QOL。
本发明进一步提供血液循环时的压力损失小、形状稳定性优异、可适用于各种血液处理柱的吸附载体(吸附体)。特别是适合同时除去过量存在的人体不需要的白细胞或癌细胞等、以及细胞因子等生理活性物质,可用于自身免疫疾病、癌、变态反应等的血液处理或治疗。该材料可以是皿、瓶、膜、纤维、中空丝、粒状物或将它们组装而成的产品等成型品的形式,适合用作亲和色谱柱、治疗用血液柱,特别是适合用作体外循环柱。
具体实施方式
接着,对本发明进行进一步详细说明。
吸附材料的基本构成优选将官能团固定在水不溶性载体上,或者将固定有官能团的水不溶性载体涂布在基材上等。
本发明中使用的水不溶性载体只要是不溶解于水、可固定官能团即可,没有特别限定。从生物体适性的角度考虑,优选聚丙烯、聚乙烯等烯烃系树脂,还优选聚酰胺或以聚对苯二甲酸乙二醇酯为代表的聚酯。
本发明的吸附材料中,为了识别位于细胞表面的糖蛋白上的唾液酸或磷酸、识别与细胞因子等结合的糖链上的唾液酸或磷酸等,优选ζ电位高。通常的聚丙烯、聚乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯等高分子材料的ζ电位为负值,大约为-30mV左右。本发明人发现:通过在水不溶性载体上固定特定的官能团例如季铵盐和/或直链状氨基,使ζ电位为-20mV以上时,它们的吸附特性良好,从而实现了本发明。并且,如果ζ电位为-15mV以上,则对脂多糖(LPS)的吸附特性更为优异,因此优选;如果为-10mV以上则效果更高;进一步优选-2mV以上。
本发明中,优选对粒细胞、单核细胞和细胞因子具有吸附能力的同时,还具有LPS吸附能力。如后所述,LPS通常是革兰氏阴性菌所具有
的毒素。已知LPS与白细胞上的TLR-4等受体蛋白结合,活化该蛋白质。通过除去粒细胞、单核细胞和细胞因子,可以减轻它们所引起的异常状态,但是如果有由通过炎症性部位、溃疡部位等进入的菌产生的LPS存在,则患者的状态虽然好不容易转移至接近于正常状态,但有可能再次陷入异常状态。通过使本发明的吸附材料具有除去白细胞或细胞因子的吸附能力的同时还具有除去LPS的结构,可以在溃疡性结肠炎、克罗恩病、自身免疫疾病等时有效地用于血液处理或治疗。通过使用所述多功能性吸附材料,可以实现治疗用柱的小型化。
本发明中,ζ电位是指吸附材料表面的ζ电位。表面ζ电位可如下求出:通过流动电位测定装置测定流动电位和为了使液体流动而施加的压力、以及液体的比电导率,由此计算求出。本发明的吸附材料优选ζ电位为-20mV以上,更优选-15mV以上,特别优选-2mV以上。从防止红细胞溶血等角度考虑,优选为10mV以下。
本发明中,对水不溶性载体的形状没有特别限定,从加工性、作为血液处理柱时的压力损失等角度考虑,优选为纤维、膜、中空丝或珠的形状。当然也可以是它们的组合。
本发明的吸附材料具有吸附血液中的粒细胞、单核细胞和细胞因子的能力,特别优选对血液中粒细胞的吸附率为50%以上,且对单核细胞的吸附率为50%以上。这里,本发明的吸附率是指:例如以血细胞为例,将血液过一次填充了吸附材料的柱,通过血细胞分析装置测定过柱前后的血细胞量,由下式求出。柱的大小、形状、血液的通过速度等条件可按照实施例适当确定。
吸附率(%)=[(过柱前血液中的血细胞量)-(过柱后血液中的血细胞量)]/(过柱前血液中的血细胞量)×100
本发明的吸附材料具有吸附血细胞的作用,还可以具有过滤作用。此时,上述吸附率的计算对象不仅包含通过吸附从血液中除去的血细胞,还包含通过过滤除去的血细胞。
为了吸附并除去粒细胞、单核细胞等细胞,优选使用本发明的吸附材料作为水不溶性载体。其中,优选纤维、中空丝的纤维直径或珠颗粒表面突起直径(大小)等(以下称为纤维直径)超过3μm。特别是如果
直径比这小,则吸附、除去的淋巴细胞变多,会导致记忆细胞的除去,不优选。为了抑制淋巴细胞的吸附除去率,纤维直径的更优选范围是4μm以上,进一步优选的范围为4.5μm以上。从进一步抑制淋巴细胞的除去率且不会导致粒细胞或单核细胞的除去率降低的角度考虑,更优选纤维的直径为5μm以上。但是,纤维直径超过8μm时,粒细胞、单核细胞的除去率有降低倾向,纤维直径为10μm以上时,粒细胞、单核细胞的除去率降低,因而不优选。从实用角度考虑,优选纤维直径为20μm以下。
除了主要的除去血细胞的目的之外的目的,即为了使吸附材料的强度保持在一定以上,可以将更粗直径的纤维以纤维结构体等的形式(纤维B)与上述纤维(纤维A)混合。对所述纤维B的直径没有限定,纤维B的纤维直径优选10μm-50μm,低于10μm时,无法获得混合纤维B的主要目的—保持强度的效果。超过50μm时,难以与纤维A混合。
从不会导致记忆细胞降低的角度考虑,淋巴细胞的除去率(利用本发明的吸附材料的吸附率)优选为40%以下,进一步从安全性的角度考虑优选为30%以下。
作为本发明的吸附材料,优选在上述水不溶性载体上固定作为官能团的季铵盐和/或直链状氨基。用于将季铵盐和/或直链状氨基固定在水不溶性载体上的反应性官能团可以是卤代甲基、卤代乙酰基、卤代乙酰氨基甲基、卤代烷基等活性卤代基,环氧基、羧基、异氰酸基、硫代异氰酸基、酸酐基等,尤其是活性卤代基、其中卤代乙酰基制备容易、反应性高得恰当,在温和条件下即可进行季铵盐和/或直链状氨基的固定反应,同时此时产生的共价键化学稳定,因此优选。
被固定的官能团优选为季铵盐和/或直链状氨基,它们是指氨、伯~叔氨基与聚合物化学键合的状态。并且,作为伯~叔氨基,以碳原子数而言,相对于1个氮原子,碳原子数为18以下的基团反应率高,因而优选。进一步,从吸附细胞因子的角度考虑,在伯~叔氨基中,将键合了下述叔氨基形成的季铵基固定最为优异,其中所述叔氨基是每个氮原子具有碳原子数3~18、特别是4~14的烷基的叔氨基。上述叔氨基的具体例子有三甲胺、三乙胺、N,N-二甲基己胺、N,N-二甲基辛胺、N,N-二甲基月桂基胺、N-甲基-N-乙基-己基胺等。另外,具有直链状氨基的化合物的例子,可列举四亚乙基五胺等。
本发明中的季铵盐和/或直链状氨基的结合密度根据水不溶性载体的化学结构和用途不同而不同,过少则无法表达其功能,而过多则固定后的载体的物理强度变差,吸附材料的功能也有降低倾向,因此该密度优选为单位水不溶性载体的重复单元为0.01-2.0mol,更优选为0.1-1.0mol。另外,固定季铵盐和/或直链状氨基(季铵化)的方法经常采用以碘化钾作为催化剂的反应,但并不限于此,可以采用公知的方法。
本发明的吸附材料所吸附的细胞因子为选自白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-8(IL-8)、白细胞介素-10(IL-10)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、转化生长因子-β(TGF-β)、血管内皮生长因子(VEGF)以及免疫抑制酸性蛋白(IAP)中的至少一种细胞因子。它们均是白细胞除去疗法的适用对象,被认为是与溃疡性结肠炎、克罗恩病、慢性风湿性关节炎等免疫疾病的病态相关的细胞因子。
根据这些要吸附的细胞因子的种类,可以适当选择要固定的季铵盐和/或直链状氨基。例如,对于白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-6(IL-6)、转化生长因子-β(TGF-β)、血管内皮生长因子(VEGF)、免疫抑制酸性蛋白(IAP)等,如果固定N,N-二甲基己胺、N,N-二甲基辛胺、N,N-二甲基月桂基胺等则可以赋予吸附性。而对于白细胞介素-8(IL-8)、白细胞介素-10(IL-10)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等,则通过固定四亚乙基五胺作为胺成分可以赋予吸附性。还可以将多种官能团组合固定,例如可以使用季铵盐和直链状氨基两者。通过将多种官能团组合使用,可以使所吸附的细胞因子的种类有较宽的范围,因而优选,除此之外还有提高所需的细胞因子吸附特性等优点。
本发明中,对这些细胞因子的吸附除去性的评价是全部采用天然型蛋白质,用EIA法(酶免疫测定法)测定(条件是37℃下振荡2小时、分次吸附)。例如,对于IL-6,通过实施例所示的分次吸附法测定的吸附率优选为50%以上。为了降低对残留细胞的影响,进一步优选60%以上的吸附率。例如,对于IL-1,优选通过实施例所示的分次吸附法测定的吸附率为40%以上。为了降低对残留细胞的影响,进一步优选50%以上的吸附率。
如上所述,对吸附材料的形状没有特别限定,作为柱使用时,优选珠、纤维、中空丝、以及将纤维进行编织得到的针织物、机织物(織物)
或非织造布等纤维结构物。水不溶性载体如果其本身可以保持形态则可以单独使用,如果形态保持性低,则可以通过涂布在适当的基材上等的方法进行固定,或与其它吸附材料混合,制成一个柱子使用。固定或混合等操作可以在加工成上述形状之前进行。
本发明的吸附材料中,形状特别优选为非织造布。这种情况下,如果非织造布的松密度过大,则容易堵塞,而过小则形态保持性变差,因此优选0.02g/cm3以上,其中优选0.02g/cm3以上,更优选0.05g/cm3 以上。上限优选0.15g/cm3以下。
本发明中使用的非织造布可以是由单纤维制造,特别优选由海岛型复合纤维制造。即,使用复合纤维按照公知方法制成非织造布,然后为了使形态保持性良好以及为了调节松密度,通过将该非织造布进行针刺后,溶解海成分,则可以容易地制造。
采用非织造布的形态时,可以是如后所述的与网形成的两层结构,特别是可以形成用非织造布包入网的结构。通过采用上述结构,在卷成圆筒形等形成柱时可以提高形态保持性。
水不溶性载体的优选材料是疏水性纤维,即聚乙烯、聚丙烯等聚烯烃;聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚对苯二甲酸丁二醇酯等聚酯;以特氟龙(テフロン)为代表的氟代聚合物。除此之外还可以使用通过表面改性附加各种烷基的设置了疏水性部位的材料。可单独使用的、固定季铵盐和/或直链状氨基的聚合物的优选具体例子有:聚(对苯醚砜):-{(p-C6H4)-SO2-(p-C6H4)-O-}n-或ュ一デル·聚砜:-{(p-C6H4)-SO2-(p-C6H4)-O-(p-C6H4)-C(CH3)2-(p-C6H4)-O}n-,除此之外还有以-{(p-C6H4)-SO2-(p-C6H4)-O-(p-C6H4)-O}n-、-{(p-C6H4)-SO2-(p-C6H4)-SO2-(p-C6H4)-O}n-、-{(p-C6H4)-SO2-(p-C6H4)-O-(p-C6H4)-C(CF3)2-(p-C6H4)-O}n-等为代表的聚砜系聚合物、聚醚酰亚胺、聚酰亚胺、聚酰胺、聚醚、聚苯硫、聚苯乙烯、丙烯酸类聚合物等,且具有可通过共价键固定氨基的反应性官能团的聚合物。其中,聚砜系聚合物稳定性高,形状保持性良好,优选使用。
作为具体的例子,可以使用与上述反应性官能团结合的氯乙酰氨基甲基化聚苯乙烯、氯乙酰氨基甲基化ュ一デル·聚砜、氯乙酰氨基甲基化聚醚酰亚胺等。并且这些聚合物中的可溶于有机溶剂的,从容易成型的
角度考虑特别优选使用。
本发明的吸附材料可以是将所述具有季铵盐和/或直链状氨基的聚合物本身、即水不溶性载体本身成型为纤维、中空丝和珠状来制备,除此之外,可以在纤维、中空丝和珠以及从生产性角度考虑优选的非织造布等基材上涂布具有季铵盐和/或直链状氨基的聚合物来制备。此时,可以将该聚合物溶解于溶剂例如二氯甲烷、四氢呋喃、N,N-二甲基甲酰胺等中,将该非织造布浸渍在该溶液中后,通过使该溶剂蒸发而容易地制备。
将季铵盐和/或直链状氨基固定在水不溶性载体上时的反应溶剂优选使用水、甲醇、乙醇、异丙醇、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮等。
从安全方面考虑,优选本发明的吸附材料和血液处理柱在血液处理时凝血因子XIII(凝血第XIII因子)的活性不降低。特别是对于溃疡性结肠炎或克罗恩病患者,凝血因子XIII有降低的趋势,该因子缺乏会有出血的危险。凝血因子XIII的吸附率为30%以下则可以安全使用,进一步优选20%以下。所述吸附率是计算所使用的载体量与实际处理的血液量(本发明中,血液是指全血、血浆、血清、腹水、胸水)的比,可以使用由柠檬酸采血的健康志愿者血液制备的血浆,在37℃下振荡1小时,由振荡前后的凝血因子XIII活性求出。凝血因子XIII活性可通过合成底物法等测定,也可以委托专业人员测定。
本发明的吸附材料和血液处理柱可以是在溶解有1vol%胎牛血清(FCS)的生理食盐水中具有90%以上的脂多糖(LPS)吸附能力的材料。如上所述,通过具有脂多糖吸附能力,不仅可以预防在外科手术后混入到患者血液中,或者由炎症性部位、溃疡性部位等混入的内毒素导致的过量细胞因子的生成,还可以有效地吸附内毒素本身,可获得对由于内毒素生物活性产生的发热、休克、血管内凝血、淋巴细胞活化等的预防、治疗效果。因此成为可获得对由内毒素生物活性产生的发热、休克、血管内凝血、淋巴细胞活化等的预防、治疗效果、特别是在免疫活化治疗方法中有用的吸附剂。并且,不仅具有粒细胞、单核细胞、细胞因子吸附能力,还兼具脂多糖吸附能力,由此通过一种吸附剂即可同时处理,因此优选。
脂多糖是指含有脂质A结构的分子,可存在于血液中的代表性的
LPS是革兰氏阴性菌所具有的毒素。
已知内毒素如果在血液中过量存在,则引起由白细胞释放过量癌坏死因子、白细胞介素1、白细胞介素6、干扰素等各种细胞因子或酸过氧化物。本发明的吸附材料和血液处理柱通过进一步使本发明的吸附材料具有LPS吸附能力,可以获得推测是由于淋巴细胞、特别是Th1型淋巴细胞被活化导致的干扰素γ的生成提高的效果,在免疫激活疗法中有效。上述淋巴细胞的活化的详细机理尚不明确,可能是由于处理血液中的血细胞与被吸附的LPS接触。
LPS的吸附量可通过和光纯药制造的内毒素检测仪测定。将规定量的LPS混合在添加了1vol%FCS的生理食盐水中,在37℃的水浴中温育4小时,测定残留在上清中的LPS量,由与同样通过内毒素检测仪测定的添加液中的LPS的差和比求出除去量和除去率。除去量优选100pg/mg以上,进一步优选200pg/mg以上。本发明的同时吸附体液中的粒细胞和/或单核细胞以及细胞因子、并在溶解1%FCS的生理食盐水中具有LPS吸附能力的能力分别可通过将各种吸附材料组合实现。这种情况下,可以是将各种吸附材料汇总在一起填充在柱子中的形态,也可以是分别填充在不同的柱子中形成盒式(カセツトタイプ)的形态。采用盒式形态时,容易牺牲小型性,因此汇总在一起的方式较为便利。不必局限于此考虑,可以根据需要的形式适当选择。
本发明的血液处理柱可通过将本发明的吸附材料填充到柱容器中制备。可以使用公知的血液处理柱的容器作为柱容器。柱的构成优选以下形式:将吸附材料形成平板状,将其层叠并填充得到的柱;吸附材料卷成圆筒形状形成圆筒状滤器,将其装入两个端部具有血液入口和血液出口的圆筒容器中形成的柱;吸附材料卷成圆筒状形成中空圆筒状滤器,以其两个端部被封闭的状态装入具有血液入口和血液出口的圆筒容器中,容器的血液出口设在与上述中空圆筒状滤器的外周部连通的部位,容器的血液出口设在与上述中空圆筒状滤器的内周部连通的部位。其中,使用圆筒中空状滤器的柱中,血液中的炎症性白细胞的大部分被圆筒形状滤器外周部的大面积的非织造布迅速除去,留下的未除去的很少的炎症性白细胞到达圆筒形状滤器的内周部,即使被该小面积的非织造布也可将其充分除去,可以高效地除去炎症性白细胞,因此最优选。特别是本发明的吸附材料的形态为非织造布时,在制造癌治疗用体外循
环柱时,通过以后述的与网的两层结构、优选用非织造布包入网的结构的状态卷成圆筒状等,可以提高形态保持性。
本发明的血液处理柱可在白细胞除去疗法或免疫激活疗法中使用。另外,如后所述,如果使用本发明的血液处理柱与生物体进行体外循环,在体外循环结束经过150-180小时后,与体外循环前相比,血液中的白细胞、特别是粒细胞数减少,淋巴细胞数增加。这显示本发明的血液处理柱具有矫正免疫状态的功能。特别是对于进行性癌患者,已知可见颗粒细胞的增加和淋巴细胞的减少,免疫状态受到抑制,但通过使用本柱,可以将该状态向正常状态矫正。该效果并不是在体外循环后长时间延续,大概过一周左右再次出现粒细胞增加,淋巴细胞减少的趋势,因此希望每周进行一次左右的处置。
本发明的吸附材料可用于癌治疗,本发明也提供上述癌治疗用吸附材料。下面,对本发明的癌治疗用吸附材料进行详细说明。
本发明中所述免疫功能抑制蛋白是指抑制哺乳动物的免疫功能的、存在于血液中的蛋白质,例如有TGF-β、免疫抑制酸性蛋白、白细胞介素-10、TNF-α等。
使用本发明的吸附材料作为癌治疗用吸附材料时,只要可以吸附免疫抑制性蛋白(免疫功能抑制蛋白)即可,其吸附能力越大则排出到体外的血液量少即可以治疗,因而优选。癌治疗用吸附材料和后述的癌治疗用体外循环柱的吸附能力的判断基准大致是以血液中的TGF-β-潜在型转化生长因子β(以下称为潜在型TGF-β)作为基准物质。对于癌治疗用体外循环柱的吸附能力,以潜在型TGF-β计,优选荷癌哺乳动物每1kg体重100ng以上,并且在进行性癌中,血液浓度高,因此优选250ng以上。每1g吸附材料对潜在型TGF-β的平衡吸附量乘以柱填充量克数所得即为柱的吸附能力。
本发明中,潜在型TGF-β平衡吸附量是指向1mL荷癌大鼠的血清中加入30mg癌治疗用吸附材料,在37℃下振荡4小时,测定上清中的TGF-β浓度,将吸附前后的浓度差除以癌治疗用吸附材料重量(0.03g)求出的值。上清中的TGF-β浓度可以是将检样血清用酸进行前处理,将潜在型TGF-β变为游离型TGF-β,然后通过使用抗TGF-β抗体的酶免疫分析法求出。例如,为潜在型TGF-β时,在实施例中所述的分次吸附法的条件下,优选为40%以上。为了降低对免疫抑制效果的
影响,进一步优选为50%以上的吸附率。测定TGF-β浓度时,可以利用市售的分析试剂盒。已知TGF-β有TGF-β1、TGF-β2、TGF-β1.2、TGF-β4、TGF-β5等序列不同的超家族。特别是这些氨基酸序列的同源性高、吸附于吸附材料上时的性质相似。TGF-β的性质基本上是以TGF-β1的性质为代表,为对其定量,广泛采用TGF-β1的测定试剂盒。
本发明中,荷癌哺乳动物是指生出肿瘤的人、猿、牛、马、犬、猫、猪、羊等陆地哺乳动物。
上述本发明的癌治疗用吸附材料可用作癌治疗用体外循环柱。装入本发明的癌治疗用体外循环柱中的吸附免疫抑制性蛋白的癌治疗用吸附材料的量越少,则要排出体外的血液量少,因此优选。但过少则吸附能力下降,没有效果,过多则对机体的负担增大。通常,从安全上考虑,体外循环时在体外回路中的血液的适当的量可以是为了输血而采血时所允许的200mL以下。体重为60kg的人的血液总量约为4.6L,因此可以说排出体外的血液量如果占血液总量的4%以下则是可接受的。另一方面,将吸附材料填充到柱中时,为了使血液通过,必须使空隙率为15%以上。基于上述条件,填充到柱中的吸附免疫抑制性蛋白的材料的量优选为每1kg荷癌哺乳动物体重0.05g~3.5g。
本发明的癌治疗用吸附材料和癌治疗用体外循环柱可以同时进行血液中增加的粒细胞或单核细胞等白细胞的吸附除去。对于粒细胞和单核细胞,优选具有高的除去性能,在体外的除去评价中,优选具有35%以上、进一步优选具有50%以上的除去率。特别优选粒细胞和单核细胞的吸附率均在50%以上。为了吸附除去这些粒细胞或单核细胞,优选适当选择癌治疗用吸附材料的形态。具体来说,优选癌治疗用吸附材料的形态为纤维(也包含复合丝、细纱等。还可以是短纤维或长纤维)、膜、中空丝或珠。纤维可以适当制成纤维结构物(织物、针织物、非织造布、棉状等)使用。其中,采用非织造布的形态时,可以制成如后所述的与网的两层结构,特别可以采取用非织造布将网包入的结构。通过采用上述结构,卷成圆筒形等形成柱时,可提高形态保持性。
为了提高吸附除去粒细胞或单核细胞的能力,优选纤维、中空丝的纤维直径或珠粒表面的突起直径(大小)等(纤维直径等)超过3μm。如果比该直径小,则淋巴细胞的吸附除去增多,导致记忆细胞的除去,
不优选。为了抑制淋巴细胞的吸附除去率,纤维直径优选4μm以上,更进一步优选4.5μm以上。并且,从进一步抑制淋巴细胞的除去率、但并不会导致粒细胞或单核细胞除去率降低的角度考虑,更优选纤维直径为5μm以上。但是,纤维直径超过8μm时,粒细胞、单核细胞的除去率显示降低倾向,纤维直径为10μm以上,则粒细胞或单核细胞的除去率降低,不优选。为20μm以上则进一步降低,因此,实际应用上优选为20μm以下。
对因除去血细胞之外的目的而混合的纤维结构体等的直径没有特别限定。除了主要的除去血细胞的目的之外的目的,即,为了使吸附材料的强度保持在一定以上,可以将更粗直径的纤维以纤维结构体等的形式(纤维B)混合到上述纤维(纤维A)中。对所述纤维B的直径没有限定,纤维B的纤维直径优选10μm-50μm。如果低于10μm,无法获得混合纤维B的主要目的—保持强度的效果。超过50μm时,难以与纤维A混合。
从不会导致记忆细胞降低的角度考虑,淋巴细胞的除去率(利用本发明的吸附材料的吸附率)优选40%以下,进一步从安全性的角度考虑优选30%以下。特别是在进行性癌或晚期癌中,血液中的淋巴细胞数量减少,因此进一步优选为20%以下。
本发明的癌治疗用体外循环柱的制备通过将本发明的癌治疗用吸附材料填充到柱容器中实现。此时,本发明的癌治疗用吸附材料的形态如上所述,可采用非织造布、织物、针织物、棉状、中空丝、珠等形态。对容器的形状没有特别限定,可以采用以往的体外循环柱所使用的容器,通常为圆筒状。利用上述圆筒状容器时,特别是本发明的癌治疗用吸附材料的形态为非织造布时,如后所述,以与网的两层结构、优选用非织造布包入网的结构的状态卷成圆筒状,将其填充,则可以提高形态保持性。
本发明的癌治疗用吸附材料含有结合了亲水性胺残基的水不溶性聚合物。结合亲水性胺残基的水不溶性聚合物的制备可通过使水不溶性载体和亲水性胺在溶剂中反应实现。
所使用的水不溶性载体的具体例子有:以聚苯乙烯为代表的聚(芳族乙烯基化合物)、以聚(对苯醚砜)或-{(p-C6H4)-C(CH3)2 -(p-C6H4)-O-(p-C6H4)-SO2-(p-C6H4)-O-}n-(ュ一デル
聚砜)等为代表的聚砜系聚合物、聚醚酰亚胺、聚酰亚胺、聚酰胺、聚醚、聚苯硫等,且具有用于固定亲水性胺的反应性官能团的聚合物。用于固定亲水性胺的反应性官能团有:卤代甲基、卤代乙酰基、卤代乙酰氨基甲基、卤代烷基等活性卤素基团,环氧基、羧基、异氰酸基、硫代异氰酸基、酸酐基等。水不溶性聚合物的具体例子有氯乙酰氨基甲基聚苯乙烯、氯乙酰氨基甲基化ユ一デル·聚砜、氯乙酰氨基甲基化聚醚酰亚胺等。并且如果这些聚合物可溶解于有机溶剂,则有容易成型的优点。
本发明中所述亲水性胺残基是指单独溶解于水或者溶解水的亲水性胺与聚合物化学键合的状态。并且,形成亲水性胺残基的亲水性胺按照碳原子数来说,相对于1个氮原子碳原子数为18以下的是合适的。
亲水性胺中,结合了由下述叔胺得到的季铵基的是优异的,其中所述叔胺是每个氮原子具有碳原子数3~18,特别是4~14的烷基的叔胺。上述叔胺的具体例子有:三甲胺、三乙胺、N,N-二甲基己胺、N,N-二甲基辛胺、N,N-二甲基月桂基胺、N-甲基-N-乙基-己胺等。并且还可优选使用构成亲水性胺的烷基含有作为亲水性基团的羟基或醚基的亲水性胺,例如优选使用N,N-二甲基-6-羟基己胺、N,N-二甲基-4-甲氧基丁胺等作为亲水性胺。
本发明的亲水性胺残基的结合密度根据水不溶性聚合物的化学结构而不同,过小,则其功能无法体现,过大,则固定后水不溶性聚合物的物理强度变差,作为吸附材料的功能也可能下降,因此,该密度优选相对于水不溶性聚合物的重复单元1摩尔为0.01-2.0mol,更优选为0.1-1.0mol。
本发明的癌治疗用吸附材料的表面积优选每1g吸附材料为0.1m2 以上、更优选为0.3m2以上。但也不能无限大,因此实际上是有限度的,优选10m2以下。该表面积可通过水银孔隙率法求出。
本发明的癌治疗用吸附材料通过将结合有亲水性胺残基的水不溶性聚合物成型为膜、纤维、粒状物等形态,或者将结合有亲水性胺残基的水不溶性聚合物被覆在具有膜、纤维、粒状物等形态的基材上,或者使亲水性胺残基与水不溶性聚合物的膜、纤维、粒状物等成型品结合等获得。
结合有亲水性胺残基的水不溶性聚合物的成型品的制造有以下方法:使亲水性胺的溶液与水不溶性聚合物的成型品接触的不均匀体系反
应的方法;以及将水不溶性聚合物的溶液与亲水性胺的溶液混合,反应,然后进行成型的均匀体系反应方法。不均匀体系反应方法的一个例子是:将氯乙酰氨基甲基化聚砜的纤维或中空丝等成型品浸渍在二甲基己胺或聚亚烷基亚胺等的异丙醇溶液中,通过在0-100℃的温度下反应而容易地实现。均匀体系反应方法的一个例子是:向氯乙酰氨基甲基化聚砜的溶液中加入对应的多胺,通过在0-100℃温度下反应实现。对其量没有特别限定,为了获得可溶性的聚合物,优选相对于卤代乙酰氨基甲基,使用1倍摩尔以上。特别是采用多胺时,为了获得可溶性的聚合物,优选大大过量地使用亲水性胺。
反应溶剂可采用水、甲醇、乙醇、异丙醇、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)等极性高的溶剂,这样具有反应进行快的优点。在不均匀体系反应中,只要是亲水性胺可溶的溶剂即可,没有特别限定。在均匀体系中反应时,优选使用水不溶性载体和亲水性胺两者均可溶解的溶剂,具体来说优选使用四氢呋喃、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮等。还可以采用对成型品进行表面处理的方法,为此优选使用水、甲醇、乙醇等不溶解聚砜但溶解亲水性胺的溶剂。
将本发明中的结合有亲水性胺残基的水不溶性聚合物涂布在聚酯纤维、尼龙纤维、聚苯硫纤维等的成型品表面,则有可以简单且低成本地获得表面积大的高级成型品的优点。涂布通过将本发明的结合有亲水性胺残基的水不溶性聚合物溶解于二氯甲烷或四氢呋喃等低沸点溶剂中,在其中浸渍尼龙的针织物或机织物,然后使溶剂挥发,即可容易地实现。也可以利用将溶解于N,N-二甲基甲酰胺等溶剂中的结合有亲水性胺残基的水不溶性聚合物加入到聚合物的贫溶剂中的湿式涂布法。进行了涂布的成型品聚合物只要是聚酰胺、聚氨酯、聚酰亚胺、聚砜、聚氯乙烯、聚酯等与本发明的结合了亲水性胺残基的水不溶性聚合物粘合性良好的材料即可,对其种类没有特别限定,尼龙、聚醚酰亚胺等酰胺系的聚合物粘合性特别好,因此优选使用。
在对上述成型品或基材的被覆中,作为成型品、基材的形态所采用的纤维,优选使用中空丝。这样可以制作具备过滤功能的吸附材料,因此具有可作为人工透析器或血浆分离器使用的同时,还可除去免疫抑制物质和白细胞的优点。
本发明的癌治疗用体外循环柱能够以抑制荷癌患者癌的进行性、提高癌患者的生活品质(以下称为QOL)的目的应用于癌患者、特别是进行性癌患者的体外循环治疗。在将癌切除手术时出血的血液返回体内时,为了除去免疫抑制性蛋白,也可应用本发明的癌治疗用吸附材料。
本发明还提供将非织造布与网组合形成的吸附材料(吸附载体),这是上述吸附材料中作为优选方案的代表。即,本发明也提供至少具有网和非织造布两层结构的吸附材料(吸附载体),以下详细说明。
本发明中,对于上述课题,即,可同时高效率、选择性吸附除去过量存在于血液中的白细胞或癌细胞等的细胞、细胞因子等生理活性物质,且可安全地进行体外循环的吸附材料进行了深入的研究,着眼于以往的吸附材料的问题一过大的松密度,以及即使得到松密度小的非织造布,如果不同时具有形态保持性,结果也会产生堵塞等问题,最终完成了本发明。即,与以往的技术相比,成功地实现了松密度减小且具有形状稳定性。
生理活性物质除上述细胞因子之外,还包含趋化因子、抗体、补体、淋巴因子、其它体液因子等来自生物的蛋白质或脂肪、糖、激素类等,特别是指为了进行结构分析或图象分析等而要进行除去操作、作为治疗目标等的靶而选定的物质。除此之外,对机体产生不良影响的细菌、细菌毒素、病毒等也以生理活性物质对待。对于细胞,主要是血细胞、癌化细胞等,还以血液或淋巴液、腹水、胸水等渗出液中的物质作为对象。研究中的培养细胞、酵母、细菌类也是对象。
本发明的非织造布的材料可以使用聚酰胺、聚酯、聚丙烯腈系聚合物、聚乙烯、聚丙烯等公知的聚合物。这些聚合物可以是单独体系,也可以是芯鞘型、海岛型或并列型的复合丝。纤维的截面形状可以是圆形截面,也可以是除此之外的异形截面。非织造布的制造方法可以使用公知的非织造布制造方法,例如湿式法、梳理法、气流成网法、纺粘法、熔喷法等。
构成所述非织造布的纤维的直径是考虑目标吸附性能而定的。例如,为了除去粒细胞,优选超过3μm,其中优选4μm以上,更优选使用5μm-10μm的纤维。除此之外还可以制成同时混合有更粗的纤维的非织造布。另一方面,如果使用0.5-4μm的纤维,则适合用于除去淋巴细胞。如果使用低于0.5μm的纤维,则可以提高生理活性物质的除去
效率。
这里所示的直径不仅适用于圆柱状,例如也适用于椭圆或矩形、多角形。求出将最外层连接起来得到的图形的面积,求出与该面积相当的圆的直径。例如,以存在五个凸起部分的星形为例,将该五个顶点连接形成图形,计算其面积,将对应的圆的直径作为本发明所述的直径。
上述本发明的非织造布的优选方案可以是吸附上述粒细胞、单核细胞和细胞因子的吸附材料,以及癌治疗用吸附材料中的非织造布的形态。
本发明中,上述非织造布可以是与网组合,构成叠层结构。可以是非织造布与网的两层结构,但更优选在非织造布之间夹入网的形状、即,采取非织造布-网-非织造布的夹层结构(三层结构)。当然,考虑到后述的松密度,在对压力损失没有影响的范围可进一步形成多层结构。
本发明的网的材料可以使用聚酰胺、聚酯、聚丙烯腈系聚合物、聚乙烯、聚丙烯等公知的聚合物。如后所述,与非织造布形成一体后供于用于导入官能团的有机合成反应时,可根据所使用的溶剂的种类、反应温度适当选择材料。特别是从生物体适应性的角度考虑,特别优选聚丙烯。
多根纤维并丝的状态或用细纱形成网结构时,血液等被处理介质通过并丝的丝状之间等时可能出现压力损失升高,因此优选网以单丝(monofilament)的形式形成。如果是单丝,则也容易保持每根的机械强度。
网的构成没有特别限定,可以使用结节网、无结节网、拉舍尔网等。其中可特别优选形成网的构成材料、例如单丝在交叉部分相接合的网。使用这样的网,则单丝等构成材料之间没有移动,与未接合的网比较,可以获得形态保持性、操作性提高的吸附载体。对于网,构成单丝之间可以相接合。接合的方法可以是打结、热粘合等,如果采用热粘合的方法,则容易控制厚度且成本较低即可实施,因此优选。对于网的空隙(网眼)的形状没有特别限定,可以采用长方形等四边形、菱形、龟甲形等各种形式。其中四边形、特别是长方形可以使非织造布叠层时的强度或操作性提高,因此优选。并且,例如网的空隙形状是四边形时,通过使网的构成材料与非织造布的相对位置的关系是相对于非织造布的长轴
或短轴方向形成90度±10度角的方向,可以进一步提高叠层非织造布时的强度或操作性能。
构成网的单丝的直径优选50μm~1mm,同样,网的厚度为50μm~1.2mm。也可以是比这更大的范围,但这使得单位体积的吸附体本身的份量减少,不优选。
通过使用网,可以使非织造布具有形态保持性、即使松密度小也可以形成形态稳定的吸附载体。网本身对压力损失有影响,因此优选使网的开孔部尽量大。为此,优选100m2中具有10mm2以上的空隙,特别优选具有3mm见方左右的开孔部,这样可使形态保持性良好,优选使用。
对吸附材料的厚度没有特别限定,从应用方面考虑,优选0.1mm~10cm。例如组装到东丽制造的“トレミキシン”(注册商标)等径向流动型的模块中时,为了卷成中心管状,优选厚度为1cm以下。这根据使用方法而确定。
本发明的具有网和非织造布的两层结构的吸附材料的松密度优选0.02-0.15g/cm3,更优选0.05-0.15g/cm3。松密度增大,则过滤白细胞或细胞等大物质的能力提高,但是过大则血液循环时容易堵塞,因此优选上述范围。超过0.15g/cm3,则不用网和非织造布的叠层结构而只采用非织造布也可以保持形态稳定性,当然本发明中也可以采用超过0.15g/cm3的松密度。松密度的测定例如可如下进行。将吸附体切成3cm边长的正方形,然后放在1mm厚的聚丙烯制的板上,测定此时吸附体的厚度,共测定五次,以其平均值作为厚度。将该小片的重量除以体积,求出松密度,进行五个样品的测试,以平均值作为松密度。
如上所述,本发明中,使用非织造布时,主要是由非织造布部分通过吸附和过滤除去白细胞或癌细胞等。并且,通过适当选择非织造布部分的材料或纤维直径,可以将细胞因子等生理活性物质与白细胞或癌细胞等一起吸附除去。为了有效地将细胞因子等生理活性物质与白细胞或癌细胞等一起除去,优选向该吸附载体上导入并固定特定的官能团。通过适当选择吸附载体、特别是构成非织造布的材料,无需导入特定的官能团也可以使其具有吸附除去细胞因子等生理活性物质的能力,但通过导入这些官能团,可以更有效的吸附生理活性物质。
形成非织造布的纤维特别优选由芯为聚丙烯、鞘为聚苯乙烯等的多
芯海岛型复合纤维制造。材料的组合只要是使制丝性良好即可,可以是任意的组合,鞘如果使用聚苯乙烯则容易向鞘结构导入官能团,因此特别优选。此时,通过采用酰氨基甲基化法,可以简便地导入具有氨基的官能团。以往进行了环状肽(多粘菌素B、多粘菌素S)、聚亚乙基亚胺、季铵盐等的导入。作为其具体例子,可使用具有氨基的环状肽残基、聚亚烷基亚胺残基、苄基氨基、一级、二级、三级烷基氨基。其中,优选具有氨基的环状肽残基、聚亚烷基亚胺残基,进一步优选具有氨基的环状肽残基,其对生理活性物质的吸附性能高,较好。
更具体地说,具有氨基的环状肽是含有2个~50个,更优选4个~16个氨基酸的环状肽,只要其侧链上具有一个以上的氨基即可,没有特别限定。其具体例子可以使用多粘菌素B、多粘菌素E、粘菌素、短杆菌肽S或它们的烷基或酰基衍生物等。
本发明中所述聚亚烷基亚胺残基是将以聚亚乙基亚胺、聚亚己基亚胺和聚(亚乙基亚胺·亚癸基亚胺)共聚物为代表的聚亚烷基亚胺或其氮原子的一部分用以正己基溴、正癸基溴、正硬脂基溴等为代表的卤代烃单独或用它们的混合物进行烷基化所得,或者是用丁酸、戊酸(バレイン酸)、月桂酸、肉豆蔻酸、亚油酸(レルイン酸)、硬脂酸等脂肪酸进行酰化所得。
本发明的具有网和非织造布两层结构的吸附材料的制备方法可以是将预先分别制备的非织造布和网通过热粘合法、流延法、针刺法等公知的网粘合方法制成叠层结构的方法。为了制成叠层结构,另外一种方法可以是预先制成实施了预针刺(プレパンチング)的棉状物,将网夹在其间,针刺,制作具有非织造布-网-非织造布的夹层结构的吸附载体的方法,这种方法更为简便,因而优选。还可以将预针刺的棉状物单面与一片网结构叠合。
本发明的体外循环柱可通过将上述具有网和非织造布两层结构的吸附材料(吸附载体)填充到容器、特别优选圆筒状容器中制造。柱的构成优选以下构成:将吸附载体形成为平板状,将其多层重叠填充得到的柱;以吸附载体作为芯材,或者无需芯材,卷成圆筒形状,构成圆筒状滤器,装在两端具有血液入口和血液出口的圆筒状容器中得到的柱;吸附载体卷成圆筒状,形成中空圆筒状的滤器,将其以两端封闭的状态装入具有血液入口和血液出口的圆筒状容器中,容器的血液出口设于与
上述中空圆筒状滤器的外周部相通的部位,容器的血液出口设于与上述中空圆筒状滤器内周部相通的部位所得的柱等。其中,使用圆筒中空状滤器得到的柱可以通过圆筒形状滤器的外周部的大面积非织造布迅速除去血液中的炎症性白细胞,未除去的残留的很少的炎症性白细胞可到达圆筒形状滤器内周部,被该小面积的非织造布充分除去,因此可以有效除去炎症性白细胞,因而最为优选。例如制备圆筒形状中空滤器滤时,在夹层结构的非织造布中,通过使网单纤维的长度方向与非织造布各截面垂直,可以简单地使非织造布具有强的拉伸强度,即使将该非织造布卷成芯材,也可以提高其操作性。
以上说明的本发明的各种吸附材料可用作体外循环柱等血液处理柱。作为体外循环柱使用时,通常在与机体实施体外循环1小时-2小时后,由开始时刻至150-180小时后,与体外循环前相比,可实现淋巴细胞数的增加和粒细胞数的减少。当然这也根据填充到柱容器中的吸附材料的量、血液的循环速度等而不同。本发明的吸附材料和血液处理柱可用于白细胞除去疗法和免疫激活疗法。
实施例
以下通过实施例进一步具体说明本发明。
实施例1和比较例1(ζ电位的测定)
表面ζ电位是通过流动电位测定装置(ZP-10B(岛津制作所制造)),通过测定流动电位和为使液体流动而施加的压力、以及液体的比电导率,计算求出。流动液使用1mM KCl水溶液,在pH6±1、温度20±5℃下测定。
(细胞因子吸附评价)
向胎牛血清中添加人天然型IL-1、IL-6,分别制成500pg/mL。向该血清中添加吸附载体,在37℃下振荡2小时,采集上清,制成样品。按照载体∶血清量=30mg∶1mL的固液比统一,求出振荡前后的细胞因子量,测定除去率。
[制备例1]
(非织造布)
是36岛的海岛复合纤维,岛进一步形成芯鞘复合结构,使用下述成分,在纺丝速度800m/分钟、拉伸倍率3倍的制丝条件下获得。
岛的芯成分:聚丙烯
岛的鞘成分:90wt%聚苯乙烯、10wt%聚丙烯
海成分:共聚聚酯,该共聚聚酯含有对苯二甲酸乙二醇酯单元作为主要的重复单元,3wt%的5-磺基间苯二甲酸钠(5-ナトリウムスルホイソフタル酸)作为共聚成分
复合比例(重量比):芯∶鞘∶海=44∶44∶12
制备含有85wt%该纤维和15wt%直径20μm的聚丙烯的片状物后,通过针刺法得到非织造布。接着将该非织造布用90℃氢氧化钠水溶液处理,溶解共聚聚酯,制得芯鞘纤维的直径为5μm、松密度为0.05g/cm3(总目付250g/m2)的非织造布(非织造布1),其中所述共聚聚酯含有海成分的对苯二甲酸乙二醇酯单元为主要的重复单元、3wt%5-磺基间苯二甲酸钠作为共聚成分。
(中间体)
接着,在20℃在600mL硝基苯和390mL硫酸的混合液中溶解3g低聚甲醛,然后冷却至0℃,加入75.9g N-羟甲基-α-氯乙酰胺,在5℃以下溶解。将5g上述非制造布1浸渍在其中,在室温下静置两小时。然后取出纤维,放入到大大过量的冷甲醇中洗涤,将纤维用甲醇充分洗涤,然后水洗,干燥,得到7.0gα-氯乙酰氨基甲基化聚苯乙烯纤维(中间体A1)。ζ电位为-21mV。
(吸附体(吸附材料、吸附载体))
将50g N,N-二甲基辛基胺和8g碘化钾溶解于360mL DMF中,将5g中间体A1浸渍在该溶液中,在85℃的浴中加热3小时。将纤维用异丙醇洗涤后,浸渍在1mol/L浓度的盐水中,然后水洗、真空干燥,得到8.3g二甲基辛基铵化纤维(吸附体A1)。ζ电位为-1mV。
将50g N,N-二甲基己基胺和8g碘化钾溶解于360mL DMF中,将5g中间体A1浸渍在所得溶液中,在85℃的浴中加热3小时。将纤维用异丙醇洗涤后,浸渍在1mol/L浓度的盐水中,然后水洗、真空干燥,得到9.3g二甲基月桂基铵化纤维(吸附体A2)。ζ电位为1.2mV。
[实施例1]
由健康志愿者肝素采集50mL血液,向其中溶解人天然型IL-1、IL-6,使其浓度为500pg/mL,进行以下研究。
将吸附材料A1和吸附材料A2各150mg分别填充在内容积为2mL的柱中,在37℃下使25mL上述血液循环1小时,然后用自动血液分析仪分析血细胞的组成,通过EIA法对IL-1、IL-6进行定量。由循环前后的差计算吸附率。对于吸附体A1,淋巴细胞吸附率为19.5%,粒细胞吸附率为78%,单核细胞吸附率为85%,IL-1吸附率、IL-6吸附率分别为37%、32%。同样,使用健康志愿者的血液制备的柠檬酸血浆研究凝血因子XIII的活性降低(委托株式会社SRL进行合成底物法测定。以下的凝血因子XIII的测定也同样),结果为12%。对于吸附材料A2,淋巴细胞吸附率为21%,粒细胞吸附率为75%,单核细胞吸附率为83%,IL-1吸附率、IL-6吸附率分别为37%、40%。同样,使用健康志愿者的血液制备的柠檬酸血浆研究凝血因子XIII的活性降低,结果为16%。
另外进行细胞因子吸附评价,结果,对于吸附材料A1,对IL-1、IL-6的吸附率分别为56%、88%,对于吸附材料A2,对IL-1、IL-6的吸附率分别为74%、93%。
[比较例1]
使用中间体A1,进行与实施例1同样的试验(血液量25mL)。淋巴细胞吸附率19.5%,粒细胞吸附率78%,单核细胞吸附率78%,IL-1吸附率、IL-6吸附率分别为2%、3%。同样使用健康志愿者的血液制备的柠檬酸血浆研究凝血因子XIII的活性降低,结果为16%。另外进行细胞因子吸附评价,结果,对IL-1、IL-6的吸附率分别为12%、13%。
由以上实施例1和比较例1的结果可知,本发明的ζ电位为-20mV以上的吸附材料可以高效率地吸附血液中的粒细胞和单核细胞,同时还可以高效率地吸附细胞因子。
实施例2-7
为了获得粒细胞、单核细胞的吸附率与纤维直径的相关性,使用健康人血液(Ht=43%),按照以下顺序进行吸附试验。
(粒细胞、单核细胞吸附率的测定和纤维直径的相关性)
将纤维直径分别为2μm、3μm、4μm、6μm、10μm、17μm的由
聚对苯二甲酸乙二醇酯形成的纤维进行熔融纺丝,浸渍在健康人血液中,使固液比为20mg/mL(分次吸附试验),保持37℃,每分钟颠倒混合3次,进行5分钟。之后除去该纤维,用シスメツクス公司制造的血细胞计算机(XT1800iv)分别测定浸渍前全血中和浸渍后全血中的粒细胞(以嗜中性粒细胞的值代替)、单核细胞、淋巴细胞的数量,测定吸附率。各血细胞的吸附率(除去率)如表1所示。
[表1]
表1 5分钟除去率平均
纤维直径 (μm) | 嗜中性粒细胞 (Av) | 淋巴细胞 (Av) | 单核细胞 (Av) | |
实施例2 | 2 | 17.53 | 2.03 | 26.20 |
实施例3 | 3 | 25.87 | 2.34 | 28.60 |
实施例4 | 4 | 33.03 | 2.57 | 44.01 |
实施例5 | 6 | 25.13 | 1.55 | 38.39 |
实施例6 | 10 | 32.52 | 4.48 | 53.05 |
实施例7 | 17 | 6.05 | -0.45 | 12.76 |
(关于吸附率与纤维直径相关性的研究)
为了获得粒细胞、单核细胞吸附率与纤维直径的相关性,使用健康人血液(Ht=43%)进行上述分次吸附试验。该研究中,在柱的循环中得到了1/2左右的除去率。结果如表1所示,在进行研究的该范围的纤维直径中,保持淋巴细胞的吸附率为低比率并且几乎没有变动,以及将柱的粒细胞(嗜中性粒细胞)、单核细胞的除去率保持在50%以上的高比率的范围是纤维直径超过约3μm的区域。
实施例8-10和比较例2-4
在以下的实施例中,对ζ电位与脂多糖吸附能力的关系、以及促进干扰素γ生成的效果进行研究。
(ζ电位的测定)
表面ζ电位的测定按照与上述实施例1同样的条件进行。
(细胞因子吸附评价)
细胞因子吸附评价是向胎牛血清中添加人天然型IL-1、IL-6,分别制备成500pg/mL。向该血清中添加吸附载体,在37℃下振荡2小时,采集上清,制成样品。按照载体∶血清量=30mg∶1mL的固液比统一,求出振荡前后的细胞因子量,测定除去率。定量是使用EIA法,使用市售的试剂盒(IL-1:R&D System制备的人IL-1 β ELISA试剂盒、IL-6:镰仓テクノサイエンス制)进行。
(干扰素γ产生评价)
使用10mL志愿者血液,以血流速度2mL/分钟使其通过填充有0.3g吸附体、内容积为2mL的聚丙烯制圆筒形柱,得到吸附体刺激的血液。分别通过Ficoll密度梯度离心法对过了柱和未过柱的血液进行淋巴细胞组分分离。将接触吸附体前的血液和接触后8小时后的淋巴细胞浓缩液用1-10μg PHA(植物凝集素-L:和光纯药制备)刺激,测定刺激前后干扰素γ的浓度。定量是使用EIA法,使用市售的试剂盒(ENDOGEN制备的人干扰素γELISA试剂盒)进行。求出(刺激后干扰素γ浓度/刺激前干扰素γ浓度),以此作为干扰素γ产生活性。
(血细胞数量的测定)
对体液中血细胞数的定量、血细胞比容值的测定是使用シスメツクス社XT-1800iV进行的。
(LPS的测定)
LPS的吸附量通过和光纯药制造的内毒素测定仪测定。将和光纯药制的LPS(商品编号:120-04531)分散在添加了1vol%FCS的生理食盐水中,使其浓度为10ng/mL,与300mg吸附材料一起在37℃的条件下、在水浴中温育4小时。测定残留在上清中的LPS量,同样通过内毒素检测仪测定。由与添加液中LPS的差和比求出除去量和除去率。标准值是除去率为90%以上、吸附量为100pg/mg以上表示具有LPS吸附能力。
[制备例2]
(非织造布)
是36岛的海岛复合纤维,岛进一步形成芯鞘复合结构,使用下述成分,在纺丝速度800m/分钟、拉伸倍率3倍的制丝条件下获得。
岛的芯成分:聚丙烯
岛的鞘成分:90wt%聚苯乙烯、10wt%聚丙烯
海成分:共聚聚酯,该共聚聚酯含有对苯二甲酸乙二醇酯单元作为主要的重复单元,3wt%的5-磺基间苯二甲酸钠作为共聚成分
复合比例:芯∶鞘∶海=44∶44∶12(重量比)
制备含有75wt%该纤维和25wt%直径20μm的聚丙烯的片状物,然后通过针刺法得到非织造布。接着将该非织造布用90℃氢氧化钠水溶液处理,溶解共聚聚酯,制备芯鞘纤维的直径为4.5μm、松密度为0.03g/cm3(总目付200g/m2)的非织造布(非织造布2),其中所述共聚聚酯含有海成分的对苯二甲酸乙二醇酯单元为主要的重复单元、作为共聚成分的3wt%5-磺基间苯二甲酸钠。
(中间体)
接着,在20℃下在600mL硝基苯和390mL硫酸的混合液中溶解3g低聚甲醛,然后冷却至0℃,加入75.9g N-羟甲基-α-氯乙酰胺,在5℃以下溶解。将其升温至20℃后立即将5g上述非织造布2浸渍在其中,在室温下静置2小时,然后取出纤维,加入到大大过量的冷甲醇中洗涤,将纤维用甲醇充分洗涤,然后水洗,干燥,得到7.0gα-氯乙酰氨基甲基化聚苯乙烯纤维(中间体A2)。ζ电位为-23mV。
(吸附体)
将50g N,N-二甲基辛基胺和8g碘化钾溶解于360mL甲醇中,将5g中间体A2浸渍在该溶液中,在50℃的浴中加热3小时。将纤维用异丙醇洗涤后,浸渍在1mol/L浓度的盐水中,然后水洗、真空干燥,得到8.1g二甲基辛基铵化纤维(吸附体A3)。ζ电位为-0.3mV。
将50g N,N-二甲基己基胺和8g碘化钾溶解于360mL甲醇中,将5g中间体A3浸渍在所得溶液中,在50℃的浴中加热3小时。将纤维用异丙醇洗涤,然后浸渍在1mol/L浓度的盐水中,水洗、真空干燥,得到7.3g二甲基己基铵化纤维(吸附体A4)。ζ电位为2.2mV。
[实施例8]
由健康志愿者肝素采集50mL血液,向其中溶解人天然型IL-1、IL-6,使其浓度为500pg/mL,进行以下研究。
将吸附材料A3和吸附材料A4各150mg分别填充在内容积为2mL的柱中,在37℃下使25mL上述血液循环1小时,然后用自动血液分析
仪(シスメツクス制造XT-1800iV)分析血细胞的组成,通过EIA法对IL-1、IL-6进行定量。对于吸附体A3,淋巴细胞数减少14.5%,粒细胞减少72%,单核细胞减少82%,IL-1、IL-6分别减少33%、52%。对于吸附体A4,淋巴细胞数减少21%,粒细胞减少75%,单核细胞减少83%,IL-1、IL-6分别减少37%、40%。
关于LPS除去率,吸附体A3为98%,吸附体A4为97%。
另外进行细胞因子吸附评价,结果,吸附体A3对IL-1、IL-6的除去率分别为56%、88%,吸附体A4对IL-1、IL-6的除去率分别为74%、93%。
[实施例9]
(体外循环治疗)
将0.3g吸附体A3填充在内径为1cm、内容积为2mL的聚丙烯制圆筒形柱中,制备体外循环柱。向12周龄的WKAH:Hkm大鼠(雄性)背部皮下接种4-二甲基氨基偶氮苯诱发肝癌细胞KDH-8{矢野谕,北海道医志,68卷5号、654-664页(1993)}1×106个。癌细胞以100%的概率存活。(通常,接种一周后肿瘤变大,接种后在5.5周内死亡)。体外循环柱在体外循环前用含有1000单位肝素钠的生理食盐水预洗,再用500mL生理食盐水洗涤。
接种KDH细胞两周后,对大鼠进行体外循环治疗。由股动脉采血,通过自动血液分析仪确认体外循环前的粒细胞和淋巴细胞数量,粒细胞为9300个/μL、淋巴细胞为8100个/μL。通过体外循环柱后,制备向股动脉返血的回路,以2mL/分钟的血流体外循环1小时。体外循环中,以200U/小时的速度持续注入肝素钠注射液(味の素(株)制备)。体外循环柱在体外循环前用含有1000单位肝素钠的生理食盐水预洗,再用500mL生理食盐水洗涤。体外循环后,进行缝合等处置,在160小时后进行采血,通过自动血液分析仪测定粒细胞和淋巴细胞的数量,粒细胞为6700个/μL,淋巴细胞为11400个/μL,与处置前相比,淋巴细胞增多,粒细胞减少。将该大鼠再饲养三周,然后按照与接种KDH细胞两周后同样的方式进行体外循环。通过自动血液分析仪确认体外循环前的粒细胞和淋巴细胞的数量,粒细胞为28000个/μL、淋巴细胞为7400个/μL。体外循环结束160小时后进行采血,通过自动血液分析仪测定粒
细胞和淋巴细胞的数量,粒细胞为26700个/μL,淋巴细胞为8400个/μL,与处置前相比,淋巴细胞数目增加,粒细胞数目减少。
[比较例2]
使用中间体A2,进行与实施例8同样的试验(血液量为25mL)。结果,淋巴细胞数减少19.5%,粒细胞减少78%,单核细胞减少78%,IL-1、IL-6分别减少2%、3%。LPS除去率是78%。另外进行细胞因子吸附评价,结果,IL-1、IL-6的除去率分别为12%、13%。
[比较例3]
将0.3g中间体A2填充在内径为1cm、内容积为2mL的聚丙烯制圆筒形柱中,按照与实施例8同样的方法接种KDH细胞,两周后对接种的大鼠实施体外循环。由股动脉采血,通过自动血液分析仪确认体外循环前的粒细胞和淋巴细胞的数目,结果粒细胞为10300个/μL、淋巴细胞为8400个/μL。进行缝合等处置,160小时后采血,通过自动血液分析仪测定粒细胞和淋巴细胞的数目,结果粒细胞为15200个/μL,淋巴细胞为8100个/μL,与处置前相比,淋巴细胞减少,粒细胞增加。
[实施例10]
使用人末梢血、使用吸附体A4进行干扰素γ产生能力的评价。未用吸附体处理时,干扰素γ浓度比为20.4倍。与此相对,处理时为35.2倍,可知免疫活性提高。
[比较例4]
使用人末梢血、使用中间体A2进行干扰素γ产生能力的评价。未用吸附体处理时,干扰素γ浓度比为20.1倍。与此相对,处理时为21.2倍,可知免疫活性状态没有变化。
实施例11
[制备例3]
(非织造布)
是36岛的海岛复合纤维,岛进一步形成芯鞘复合结构,使用下述成分,在纺丝速度800m/分钟、拉伸倍率3倍的制丝条件下获得。
岛的芯成分:聚丙烯
岛的鞘成分:90wt%聚苯乙烯、10wt%聚丙烯
海成分:共聚聚酯,该共聚聚酯含有对苯二甲酸乙二醇酯单元作为主要的重复单元,3wt%的5-磺基间苯二甲酸钠作为共聚成分
复合比例:芯∶鞘∶海=44∶44∶12(重量比)
制备含有50wt%该纤维和50wt%直径20μm的聚丙烯的片状物,然后通过针刺法得到非织造布。接着将该非织造布用90℃氢氧化钠水溶液处理,溶解共聚聚酯,制备芯鞘纤维的直径为4.5μm、松密度为0.03g/cm3(总目付200g/m2)的非织造布(非织造布A3),其中所述共聚聚酯含有海成分的对苯二甲酸乙二醇酯单元为主要的重复单元、3wt%5-磺基间苯二甲酸钠作为共聚成分。
(中间体)
接着,在20℃下在600mL硝基苯和390mL硫酸的混合液中溶解3g低聚甲醛,然后冷却至0℃,加入75.9g N-羟甲基-α-氯乙酰胺,在5℃以下溶解。将其升温至20℃后立即将5g上述非织造布3浸渍在其中,在室温下静置2小时,然后取出纤维,加入到大大过量的冷甲醇中洗涤,将纤维用甲醇充分洗涤,然后水洗,干燥,得到6.3g α-氯乙酰氨基甲基化聚苯乙烯纤维(中间体A3)。ζ电位为-26mV。
(吸附体)
将50g N,N-二甲基辛基胺和8g碘化钾溶解于360mL甲醇中,将5g中间体A3浸渍在该溶液中,在50℃的浴中加热3小时。将纤维用异丙醇洗涤后,浸渍在1mol/L浓度的盐水中,然后水洗、真空干燥,得到6.8g二甲基辛基季铵化纤维(吸附体A5)。ζ电位为-12.3mV。
[实施例11]
由健康志愿者肝素采集50mL血液,向其中溶解人天然型IL-1、IL-6,使其浓度为500pg/mL,进行以下研究。
将上述制备例3中制备的吸附体A5各150mg分别填充在内容积为2mL的柱中,在37℃下使25mL上述血液循环1小时,然后用自动血液分析仪(シスメツクス制造XT-1800iV)分析血细胞的组成,通过EIA法对IL-1、IL-6进行定量。对于吸附体A5,淋巴细胞数减少10.5%,粒细胞减少61%,单核细胞减少67%,IL-1、IL-6分别减少24%、38%。
关于LPS除去率,吸附体A5为90%。
另外进行细胞因子吸附评价,结果,吸附体A5对IL-1、IL-6的除去率分别为44%、61%。
由以上实施例8-11和比较例2-14的结果可知,本发明的ζ电位为-20mV以上的吸附材料可以高效率吸附血液中的粒细胞和单核细胞,并且如果为-15mV以上,则可以同时高效率吸附LPS或细胞因子。在体外循环治疗后粒细胞或淋巴细胞数目的变动的机理尚未明确,但可知是变化为正常状态的比率。
实施例12-15和比较例5-8
各实施例中的评价方法和实施顺序和条件如下。
1.血液成分的分析
TGF-β浓度使用ゼンザイム·テクネ公司的人TGF-β1免疫分析试剂盒求出。免疫抑制酸性蛋白的浓度是使用三光纯药社制的大鼠IAP板求出。白蛋白浓度通过白蛋白分析试剂盒-白蛋白B-テストワコ一求出。
2.吸附材料对TGF-β的平衡吸附能力
收集5只荷癌大鼠的血清,制备30mL荷癌大鼠血清。向1mL该血清中加入50mg吸附材料,在37℃下振荡4小时。测定上清中的TGF-β浓度,将吸附前后的浓度差除以吸附材料重量(0.05g),将所得值作为TGF-β平衡吸附能力。
3.吸附材料的制备
(水不溶性聚合物)
是36岛的海岛复合纤维,岛进一步形成芯鞘复合结构,使用下述成分,在纺丝速度800m/分钟、拉伸倍率3倍的制丝条件下获得。
岛的芯成分:聚丙烯
岛的鞘成分:90wt%聚苯乙烯、10wt%聚丙烯
海成分:共聚聚酯,该共聚聚酯含有对苯二甲酸乙二醇酯单元作为主要的重复单元,3wt%的5-磺基间苯二甲酸钠作为共聚成分
复合比例(重量比):芯∶鞘∶海=45∶45∶10
制备含有85wt%该纤维和15%直径17μm的聚丙烯的片状物,然后通过针刺法得到非织造布。接着将该非织造布用95℃氢氧化钠水溶液处理2小时,溶解共聚聚酯,制备芯鞘纤维的直径为5μm、松密度为0.07g/cm3(总目付250g/m2)的非织造布,其中上述共聚聚酯含有海成分的对苯二甲酸乙二醇酯单元为主要的重复单元、3wt%5-磺基间苯二甲酸钠作为共聚成分。
(中间体)
接着,在20℃下在600mL硝基苯和390mL硫酸的混合液中溶解3g低聚甲醛,然后冷却至0℃,加入75.9g N-羟甲基-α-氯乙酰胺,在5℃以下溶解。将5g上述非织造布浸渍在其中,在室温下静置2小时,然后取出纤维,加入到大大过量的冷甲醇中洗涤,将纤维用甲醇充分洗涤,然后水洗,干燥,得到7.0g α-氯乙酰氨基甲基化聚苯乙烯纤维(中间体C1)。
(吸附体)
将50g N,N-二甲基辛基胺和8g碘化钾溶解于360mL DMF中,将5g中间体C1浸渍在该溶液中,在85℃的浴中加热3小时。将纤维用异丙醇洗涤后,浸渍在1mol/L浓度的食盐水中,然后水洗、真空干燥,得到8.3g二甲基辛基铵化纤维(吸附体C1)。
将50g N,N-二甲基己基胺和8g碘化钾溶解于360mL DMF中,将5g中间体C1浸渍在该溶液中,在85℃的浴中加热3小时。将纤维用异丙醇洗涤后,浸渍在1mol/L浓度的食盐水中,然后水洗、真空干燥,得到9.3g二甲基月桂基铵化纤维(吸附体C2)。
(磺化纤维:比较纤维)
将5g的非织造布1浸渍在50mL溶解了500mg低聚甲醛的硫酸中,在95℃下加热1小时,然后水洗,依次用1mol/L浓度的食盐水洗涤,水洗,干燥,得到7.3g磺化纤维(比较吸附体C1)。
(荷癌大鼠的制备)
向12周龄的WKAH:Hkm大鼠(雄性)背部皮下接种4-二甲基氨基偶氮苯诱发肝癌细胞KDH-8{矢野谕,北海道医志、68卷5号、654-664页(1993)}2×108个。癌细胞以100%的概率存活。(通常,接种一周后肿瘤变大,接种后在5.5周内死亡)。
(体外循环柱的制备)
向内径1cm、内容积2mL的聚丙烯制圆筒形柱中分别填充由吸附体C1、吸附体C2、比较吸附体C1或直径25μm的聚对苯二甲酸乙二醇酯纤维制成的非织造布,制备癌治疗用体外循环柱。将分别填充了0.38g吸附材料的柱分别作为实施例12(吸附体C1)、实施例13(吸附体C2)、比较例2(比较吸附体C1)、比较例3(直径25μm的聚对苯二甲酸乙二醇酯纤维)。同样地将分别填充了0.18g吸附材料的柱分别作为实施例14(吸附体C1)、实施例15(吸附体C2)、比较例4(比较吸附体C1)、比较例5(直径25μm的聚对苯二甲酸乙二醇酯纤维)。各实施例的吸附材料的ζ电位均为-20mV以上。
(荷癌大鼠的制备和体外循环)
癌治疗用体外循环柱在体外循环前用含有1000单位肝素钠的生理食盐水预洗,再用500mL生理食盐水洗涤。
接种KDH细胞两周后,以2mL/分钟的血流体外循环60分钟。由股动脉采血,通过吸附材料柱后,血液返回股动脉。体外循环中以100U/小时的速度持续注入肝素钠注射液(武田药品工业(株))。
在体外循环前和后采集大鼠血液,测定血清中TGF-β浓度,同时观察接种癌细胞后的存活天数,得到表2的结果。
(体外血细胞除去评价)
从健康志愿者采集25mL血液,立即加入10U/mL肝素,在3小时以内实施以下循环。将血液保持在37℃,以2mL/分钟的流量、用容量2mL的柱(将吸附材料冲成直径1cm,填充规定量)循环90分钟,柱处理后,通过血细胞计数装置将血液中的白细胞进行分组,计算淋巴细胞数、粒细胞数(嗜中性粒细胞)、单核细胞的除去率。基准除去率是60分钟时的值。
[表2]
癌治疗 用吸附 材料 填充量 (g) | 大鼠 体重 (kg) | 血清中 TGF-β 浓度 (ng/mL) | 粒细胞 除去率 (%) | 单核 细胞 除去率 (%) | 淋巴 细胞 除去率 (%) | 血液中 潜在型 TGF-β 除去率 (%) | 接种癌 细胞后 的寿命 (周) | |
实施例12 | 0.38 | 0.31 | 33 | 78 | 88 | 19 | 61 | 7.3 |
实施例13 | 0.38 | 0.32 | 36 | 68 | 84 | 17 | 72 | 8.6 |
实施例14 | 0.18 | 0.34 | 35 | 52 | 66 | 12 | 26 | 6.7 |
实施例15 | 0.18 | 0.31 | 33 | 52 | 68 | 13 | 39 | 7.3 |
比较例5 | 0.38 | 0.33 | 33 | 58 | 59 | 12 | 3 | 4.3 |
比较例6 | 0.38 | 0.31 | 34 | 21 | 16 | 11 | 6 | 4.7 |
比较例7 | 0.18 | 0.37 | 35 | 44 | 22 | 12 | 3 | 4.3 |
比较例8 | 0.18 | 0.32 | 36 | 18 | 14 | 10 | 3 | 4.3 |
实施例12-13中,TGF-β的血液浓度降低,与比较例相比,寿命延长。实施例12-15和比较例5-8中,体外循环后TGF-β的血液浓度与接种癌细胞后的寿命成反比。还可知,TGF-β血液浓度的降低与吸附材料的用量成比例发生。比较例中,TGF-β的血液浓度不下降,接种癌细胞后寿命短。未治疗时的寿命为5.5周,因此,由比较例5-8可知,用TGF-β吸附能力低的柱进行体外循环,寿命反而会缩短。
实施例16、17和比较例9、10
[实施例16]
(吸附载体)
是36岛的海岛复合纤维,岛进一步形成芯鞘复合结构,使用下述成分,在纺丝速度800m/分钟、拉伸倍率3倍的制丝条件下获得。
岛的芯成分:聚丙烯
岛的鞘成分:90wt%聚苯乙烯、10wt%聚丙烯
海成分:共聚聚酯,该共聚聚酯含有对苯二甲酸乙二醇酯单元作为主要的重复单元,3wt%的5-磺基间苯二甲酸钠作为共聚成分
复合比例(重量比):芯∶鞘∶海=42∶43∶15
制备含有85wt%该纤维和15wt%直径20μm的聚丙烯纤维的非织造布,然后将开孔部2mm见方的聚酯制网(厚度0.4mm、单丝直径0.3mm)夹在该两片非织造布之间,相对于非织造布的截面倾角为90°设置,通过针刺得到三层结构的吸附载体。接着将该非织造布用90℃氢氧化钠水溶液处理,溶解共聚聚酯,制备芯鞘纤维的直径为5μm、松密度为0.02g/cm3(总目付150g/m2)的吸附载体(吸附载体B 1),其中上述共聚聚酯含有海成分的对苯二甲酸乙二醇酯单元为主要的重复单元、3wt%5-磺基间苯二甲酸钠作为共聚成分。以一定的速度卷绕,得到可稳定卷绕的相同形状的圆筒状滤器。
(中间体)
接着,在20℃下在600mL硝基苯和390mL硫酸的混合液中溶解3g低聚甲醛,然后冷却至0℃,加入75.9g N-羟甲基-α-氯乙酰胺,在5℃以下溶解。将5g上述吸附载体B1浸渍在其中,在室温下静置2小时,然后取出纤维,加入到大大过量的冷甲醇中洗涤,将纤维用甲醇充分洗涤后,水洗,干燥,得到7.0gα-氯乙酰氨基甲基化聚苯乙烯纤维(中间体B1)。
(导入了官能团的吸附材料(吸附载体))
将50g N,N-二甲基辛胺和8g碘化钾溶解于360mL DMF中,将5g上述中间体B1浸渍在该溶液中,在85℃的浴中加热3小时。将纤维用异丙醇洗涤后,浸渍在1mol/L浓度的食盐水中,然后水洗,真空干燥,得到8.3g二甲基辛基铵化纤维(导入了官能团的吸附载体B1)。
另外将50g N,N-二甲基月桂基胺和8g碘化钾溶解于360mL DMF中,将5g上述中间体B1浸渍在该溶液中,在85℃的热水浴中加热3小时。将纤维用异丙醇洗涤,然后浸渍在1mol/L浓度的食盐水中,水洗,真空干燥,得到9.3g二甲基月桂基铵化纤维(导入了官能团的吸附载体B2)。
得到的导入了官能团的吸附载体B1和B2均含有网,因此不变形,保持了良好的形状。
[比较例9]
不使用网,对实施例16制备的海岛复合纤维进行针刺,除此之外同样地制备非织造布。接着,将该非织造布用90℃氢氧化钠水溶液处理,溶解共聚聚酯,制备芯鞘纤维的直径为5μm、松密度为0.02g/cm3 (总目付150g/m2)的非织造布(非织造布B1),其中所述共聚聚酯含有海成分的对苯二甲酸乙二醇酯单元作为主要的重复单元、3wt%5-磺基间苯二甲酸钠作为共聚成分。该非织造布在横向的强度小,在中间体和吸附体的合成中发生伸长,因此无法保持一定的松密度。
[实施例17]
由健康志愿者肝素采集50mL血液,向其中溶解人天然型白细胞介素6(以下称为IL-6),使其浓度为500pg/mL,进行以下研究。
将150mg吸附材料(导入了官能团的吸附载体B1)填充到内容积为2mL的柱中,在37℃下将上述25mL血液循环1小时,然后用自动血液分析仪分析血细胞的组成,通过EIA法对IL-6的量进行定量。可见淋巴细胞数减少12.5%,粒细胞数减少67%,IL-6也减少了35%。此时未见压力损失的升高。
[比较例10]
将比较例10中制备的非织造布与实施例17同样地同量填充到柱中,使用其余的25mL血液进行研究。
在45分钟时发生压力损失升高,超过200mmHg,因此中断。淋巴细胞数减少了31.5%,粒细胞减少了69%,IL-6也减少了35%。
[实施例18]
与实施例16同样地制备非织造布时,将开孔部2mm见方的聚酯制网(厚度0.4mm、单丝直径0.3mm)夹在中间,相对于非织造布的截面以110°的倾斜角设置。以一定速度卷绕,可见非织造布伸长,卷绕张力不稳定。非织造布的厚度也不确定,无法获得相同形状的圆筒状滤器。
将150mg该非织造布填充到内容积为2mL的柱中,在37℃下将上述25mL血液循环1小时,然后用自动血液分析仪分析血细胞的组成,通过EIA法对IL-6的量进行定量。结果,可见淋巴细胞数减少12.5%,粒细胞减少67%,IL-6也减少了35%。此时未见压力损失的升高。
产业实用性
本发明可提供有效吸附除去血液中的白细胞、炎症性、免疫抑制性细胞因子,且可以降低血液中有用成分除去率的吸附材料。所述本发明的吸附材料可用于白细胞除去疗法、免疫激活疗法、癌治疗等各种用途中。
该材料可以以皿、瓶、膜、纤维、中空丝、粒状物或使用它们的组装品等成型品的形式应用于亲和色谱柱、治疗用血液柱,特别是体外循环柱中。
Claims (27)
1.吸附材料,其特征在于:ζ电位为-20mV以上,吸附血液中的粒细胞、单核细胞和细胞因子,
淋巴细胞的吸附率为40%以下,
该吸附材料含有结合了官能团的水不溶性载体,
上述水不溶性载体的形状是选自纤维直径超过3μm的纤维或中空丝、以及表面突起直径超过3μm的珠中的形状。
2.权利要求1所述的吸附材料,其特征在于:上述细胞因子为选自白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-8(IL-8)、白细胞介素-10(IL-10)、TNF-α、转化生长因子-β(TGF-β)、血管内皮生长因子(VEGF)、以及免疫抑制酸性蛋白(IAP)中的至少一种。
3.权利要求1所述的吸附材料,其特征在于:凝血因子XIII的吸附率为30%以下。
4.权利要求1所述的吸附材料,其特征在于:ζ电位为-15mV以上,在溶解了1vol%胎牛血清(FCS)的生理食盐水中具有90%以上的脂多糖(LPS)吸附能力。
5.权利要求1所述的吸附材料,其特征在于:上述水不溶性载体的形状是选自纤维直径为4-8μm的纤维或中空丝、以及珠表面突起直径为4-8μm的珠中的形状。
6.权利要求1所述的吸附材料,其特征在于:上述水不溶性载体的形状是选自纤维直径为4.5-8μm的纤维或中空丝、以及珠粒子表面突起直径为4.5-8μm的珠中的形状。
7.权利要求5或6所述的吸附材料,其特征在于:上述水不溶性载体的形状进一步包含纤维直径为10-50μm的纤维或中空丝。
8.权利要求1所述的吸附材料,其是在水不溶性载体上结合季铵盐和/或直链状氨基而成的。
9.权利要求8所述的吸附材料,其特征在于:季铵盐为选自N,N-二甲基己胺、N,N-二甲基辛胺、N,N-二甲基月桂基胺、四亚乙基五胺中的至少一种。
10.权利要求1所述的吸附材料,其特征在于:其是癌治疗用吸附材料,该吸附材料含有结合了亲水性胺残基的水不溶性聚合物,具有潜在型转化生长因子β吸附能力。
11.权利要求10所述的吸附材料,其特征在于:粒细胞吸附率为35%以上,且单核细胞的吸附率为35%以上。
12.权利要求10所述的吸附材料,其特征在于:上述结合了亲水性胺残基的水不溶性聚合物是膜、纤维或粒状物。
13.权利要求10所述的吸附材料,其特征在于:粒细胞吸附率为50%以上,且单核细胞的吸附率为50%以上。
14.权利要求1所述的吸附材料,其特征在于:该吸附材料至少具有网和非织造布两层结构。
15.权利要求14所述的吸附材料,其特征在于:上述网是在100mm2中具有10mm2以上空隙的网。
16.权利要求14所述的吸附材料,其特征在于:上述网的空隙形状是四边形。
17.权利要求14所述的吸附材料,其特征在于:上述两层结构中,上述网的构成材料相对于上述非织造布的长轴或短轴方向成角度90度±10度的方向。
18.权利要求14所述的吸附材料,其特征在于:该吸附材料吸附生理活性物质和/或细胞。
19.权利要求14所述的吸附材料,其特征在于:上述网含有单纤维。
20.权利要求14所述的吸附材料,其特征在于:上述网是其构成材料相互交叉的部分接合而成的。
21.权利要求14所述的吸附材料,其特征在于:松密度为0.02g/cm3以上。
22.权利要求1、10、14中任一项所述的吸附材料,其特征在于:该吸附材料用于白细胞除去疗法或免疫激活疗法。
23.血液处理柱,该血液处理柱是将权利要求1或14所述的吸附材料填充到容器中而成的。
24.权利要求23所述的血液处理柱,其特征在于:所述容器是圆筒状容器。
25.权利要求23或24所述的血液处理柱,其特征在于:该血液处理柱使血液循环而使用。
26.权利要求23或24所述的血液处理柱,其中,从与生物体之间的体外循环结束时起经过150-180小时后,与体外循环前相比,显示淋巴细胞数增加和粒细胞数减少。
27.癌治疗用体外循环柱,该癌治疗用体外循环柱使用权利要求10-12中任一项所述的吸附材料。
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