CN102361658A - 用于移除与蛋白结合物质的吸着剂 - Google Patents

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Abstract

本发明系有关于一种吸着剂，该吸着剂对用于丛生物流体移除与蛋白结合物质的选择属性有所改进，而该生物流体特别是患有严重肝功能障碍或肝功能衰竭或肾功能不全的病人的血液或血浆，该吸着剂包含：(a)多孔中性疏水性聚合物以及(b)吸附在该聚合物上的多肽层，该中性疏水性聚合物的平均孔隙大小最少为15nm。本发明进一步涉及到配合有关吸着剂的方法和用途。本发明特别适用于体外肝支持。

Description

用于移除与蛋白结合物质的吸着剂
技术领域
本发明涉及用于丛生物流体移除与蛋白结合(protein-bound)物质的吸着剂，该吸着剂带有：(a)多孔中性疏水性聚合物以及(b)吸附在该聚合物上的多肽层。
背景技术
肝脏，作为主要的代谢器官，不论是在葡萄糖、蛋白质、和脂肪的代谢、储存碳水化合物和维生素、解毒、以及免疫防御中，均有重要的任务。收集在血液的有毒物质和代谢产物是由正常运作的肝脏从血液中移除。对于患有因长期疾病所引起的肝功能降低或急性肝衰竭或肝衰竭的病人，必须将他们血液中所含有的大量有毒物质清除。肾功能不全者亦须清除其血液中的大量肝毒素。肝衰竭会因充满大量有毒物质而在短时间内导致多器官并发症甚至如肾脏和肺部等多个器官衰竭，故须立即送院治疗。所施行的解毒治疗将辅以人工肝支持系统(“人工肝”，肝脏透析)，使用该系统可有效移除血液中的有毒物质。因此，患有致命肝衰竭的病人可以直到进行器官移植时间都稳定下来并保存性命。由于肝脏有高的自我再生能力，故减轻肝脏负担的治疗甚至可使病人的肝脏功能恢复。肝支持系统的成效对治疗能否成功是决定性的。
患有肝脏疾病的病人的血液中的有毒物质可分为水溶性和非水溶性物质。使用肝支持系统从血液中移除的有毒物质的例子有未结合胆红素、胆汁酸、主要芳香族氨基酸、苯酚化合物、和氨。为了在血液中进行运输，非水溶性肝毒素均为与蛋白结合形式——通常与血蛋白白蛋白结合。血红蛋白和其他血红素蛋白(肌紅蛋白、细胞色素)降解时会形成胆红素。由于其并非水溶性，故其无法经肾脏排出体外。为了在血液中进行运输，胆红素会与白蛋白结合(未结合或间接胆红素)。在肝脏中，胆红素会与葡萄糖醛酸连结(已结合或直接胆红素)。已结合胆红素为水溶性，可在肠道与胆汁一同或在肾脏排出。倘若发生肝功能衰竭，则无法再形成已结合胆红素，而血液会累积大量未结合胆红素。倘若血清胆红素的水平上升，则会出现黄疸，巩膜、皮肤发黄，而倘若胆红素上升到很高水平，则组织和器官亦会发黄。因此，胆红素代表肝功能障碍或衰竭的一个重要指标。
体外肝支持系统为已知的现有技术。为了移除与蛋白结合物质，体外肝支持系统通常有位于体外血液循环管道或血浆循环管道的吸着装置(吸附体)，而使用该装置移除血液或血浆中的与蛋白结合物质。该吸着装置含有吸着剂(吸附剂)。该吸着装置的效率或该吸着剂的吸着作用(特别是吸附作用)的速度是治疗成功或对病人(特别是患有肝衰竭的病人)桥接稳定的基础。
血液或血浆与外来表面接触，会致使接触活化作用，并在此后引致凝结作用、释出激肽、和活化补体系统。因为血浆或血液在体外血液净化方法中会与膜和吸附体接触，故该等方法亦会触发这些过程。因此，对需要体外血液净化的大部分病人来说，抑制血液凝结是必要的。这通常是使用肝素注射进行的。若病人为忌用肝素给药者，则可使用柠檬酸盐施行局部抗凝。
以阴离子交换剂为基础的吸附体经常被用于体外肝支持系统的临床应用中。本文将提述肝脏透析装置MARS(分子吸附再循环系统)(Molecular adsorbent recircuitsystem)和普罗米修斯系统(Prometheus system)，为临床应用上使用阴离子交换剂的已知装置。使用阴离子交换剂，可非常有效地从如血浆的生物流体中移除如胆红素的与蛋白结合有毒物质。特别是普罗米修斯系统，其特点在于可高效清除与蛋白结合和水溶性肝毒素，因此可大幅提高肝病患者的生存率。然而，阴离子交换剂一个很大的缺点是，不但该预想的与蛋白结合物质，对血液凝结系统而言生理上重要的蛋白或因子(抗凝剂和促凝剂)亦会被大幅消除。其中特别是本文将提述的病患固有的凝血抑制剂，如蛋白C和蛋白S等。作为凝血抑制因子，蛋白C可谓尤其重要。体内的蛋白C浓度下降会致使严重的凝血并发症，如深静脉血栓和肺栓塞等。抗凝肝素，其透过输液额外供给到该体外血液循环管道中，亦会遭该阴离子交换剂消除掉，造成该体内凝血系统失调或体外或体内血液循环管道中的非预想的抗凝作用。这特别是对于高风险患者而言，如患有肝衰竭和败血症的病人，可以是很大问题。近期有一报告，内容为因阴离子交换剂上凝血系统中的非预想的结合蛋白而引致经净化的血液返回后，在该体外血液净化系统回路中或在病人中闭塞性血栓形成的巨大风险[Meijers et al.2007.Major Coagulation Disturbances During Fractionated Plasma Separation and Adsorption.Am J Transplant 7(9)：2195-2199]。
因为阴离子交换剂有上述缺点，所以有人便提出了使用中性疏水性聚合物。该聚合物具有孔隙，可吸附有关物质于其内。该聚合物的选定孔隙大小为一个决定性的因素。已显示仅大于5-6nm的孔隙可触及在体外如胆红素的与蛋白高度结合的物质。已确立当平均孔隙大小为＞7.5nm时胆红素吸附作用是良好的[Weber et al.2008.Neutralstyrene divinylbenzene copolymers for adsorption of toxins in liver failure.Biomacromolecules 9(4)：1322-1328]。在孔隙大小较大的情况下，因孔隙可及性较好，故与蛋白结合物质吸附得较好。然而由于随着孔隙大小增大，该聚合物的内表面积会减少，因此若选择过大的孔隙大小，则该吸附体的能力和吸附效能反会下降。
除此以外，与上述阴离子交换剂不同，就中性疏水性聚合物而言已确定仅少数肝素会被结合。此外，凝血酶-抗凝血酶络合物的形成亦大大减少。然而，由于中性疏水性聚合物的平均孔隙大小为＞7.5nm，故亦会出现显著的蛋白C吸附作用，实属不利。可以假设，其他分子量相似的重要蛋白，如蛋白S，亦会被吸附。孔隙大小较小(＜5-6nm)者，其对与蛋白高度结合物质而言是不可及的，不会吸附蛋白C。
透过弃用阴离子交换剂而使用中性疏水性聚合物，由于可大幅减少或预防肝素的吸附，因此可提供最少为部分选择性的吸着剂。然而，中性疏水性聚合物对蛋白C的吸附依然显著，使其可致使上述凝结问题。若病人为忌用肝素给药者，则特别有危险。使用较小孔隙大小的聚合物虽不会吸附蛋白C，但因其移除与蛋白结合物质的效率太低而并不推荐使用。在肝衰竭的情况中，正如前文所强调，对与蛋白结合物质的吸附效率为决定性的生存因素。
从EP 0776223B1和US 5855782可知，在移除与蛋白结合物质的方面，微球解毒系统(MDS)为特别高性能的系统。最近有报告是有关从中性疏水性聚合物(苯乙烯/二乙烯苯共聚物，平均孔隙直径：＞100nm)生产的微球吸附粒子(平均粒度5μm)[Falkenhagen D.，Vienken J.，The Prometheus-System.Technical Background and ClinicalExperience.ASAIO 54th Annual Conference，19-21June 2008]。
另外，WO 2005/082504A2公开了用于移除与蛋白结合物质的中性树脂。WO2005/082504A2描述了解毒装置，其带有活性碳，且最少一个非离子树脂的平均孔隙大小为30nm(聚苯乙烯二乙烯苯树脂——Amberchrom GC 300C)或45nm(基于脂肪族酯的树脂——Amberlite XAD-7HP)。中性疏水性聚合物的上述问题亦可应用到这些中性树脂吸附体上。
早于1970年代末，已公开了一种吸着剂和一种生产本文起首时所述吸着剂种类的方法[Ton et al.1979.Adsorption of Human Serum Albumin to Amberlite XAD-7Resin.JBiomed Mater Res 13：407-422]、[Hughes et al.1978.The use of an in vitro haemoperfusioncircuit to evaluate the blood compatibility of albumin-coated Amberlite XAD-7resin.Int JArtif Organs 1(3)：129-34]、[Ton H.Y.et al.1979.Albumin-coated Amberlite XAD-7resinfor hemoperfusion in acute liver failure.Part I：adsorption studies.Artif Organs3(1)：20-22]、[Hughes R.et al.1979.Albumin-coated Amberlite XAD-7resin forhemoperfusion in acute liver failure.Part II：in vivo evaluation.Artif Organs.3(1)：23-26]、[Falkenhagen et al.1981.Optimization of albumin coating for resins.Artif Organs 5(Suppl)：195-199]。如Amberlite XAD-7(平均孔隙大小：9nm)或Y56(平均孔隙大小：8nm)等以多肽层(白蛋白)吸附涂上的中性疏水性树脂，目的为减少血小板与该吸附体结合，和在血液灌流时因与吸附体连接而失去的血小板。
在另一更近期的出版物中，描述了本文起首时所述的吸着剂种类，报告指胆红素在未涂上的中性树脂(聚苯乙烯二乙烯苯，孔隙大小5-10nm)上较在以白蛋白层涂上的中性树脂上的吸附作用较好[Annesini et al.，2005.Bilirubin removal fromalbumin-containing solution by adsorption on polymer resin.The International Journal ofArtificial Organs.Vol 28，Nr.7：686-693]。因此，吸附在该中性树脂上的该白蛋白层会对胆红素的吸附并因而对吸附效率有不良影响。
发明内容
本发明的一目的是提供经改良的吸着剂。将提供在用于从生物流体移除与蛋白结合物质的选择属性方面，相比起现有技术的已知吸着剂，有明显改进的吸着剂。该经改良的吸着剂可高效地消除肝病患者血液中的与蛋白结合物质，而涉及凝血作用的蛋白，尤其是如蛋白C或蛋白S的重要生理凝血抑制因子，则会留在该生物流体内。
本目的可透过本文起首时所述的吸着剂种类达成，该中性疏水性聚合物的平均孔隙大小最少为15nm。
全赖本发明提供了选择属性有明显改进的吸着剂，使用该吸着剂一方面可确保高效移除与蛋白结合物质，而另一方面可避免与中性疏水性聚合物有关的凝结问题。本发明所述的吸着剂首次提供了一方面可有效移除患有严重肝功能障碍或肝衰竭的病人血液中的与蛋白结合物质，而另一方面可减少严重的凝血并发症，从而改善病人的安全。
发明人确立了一出人意表的情况，即若该中性疏水性聚合物的平均孔隙大小在涂上该多肽层前最少为15nm，则相比起未涂上的中性疏水性聚合物，本发明所述的吸着剂明显较少与蛋白C结合。
蛋白C是在血浆中依赖维生素K的蛋白质，在凝血程序起了重要的调控作用并有抗凝效果。从现有技术已知蛋白C与未涂上的中性疏水性聚合物会有非预想的结合，会因此致使凝血并发症(深静脉血栓、肺栓塞)。由于蛋白S(62,000Da)与蛋白C(69,000Da)的相对分子量相似，因此可假设，本发明所述的吸着剂有很大机会亦会大幅减少与蛋白S的结合。同样的考量亦可应用到有类似分子量的凝血因子(例如因子VII、因子IX、和因子X)上。
此外，相比起未涂上的聚合物，已确立本发明所述的吸着剂对该等将被移除的与蛋白结合物质(例如胆红素)的吸着效能仅削弱甚微或毫无影响。因此，本发明所述的吸着剂在这点上亦优于现有技术已知的上述吸着剂[见Annesini et al.，2005.Bilirubinremoval from albumin-containing solution by adsorption on polymer resin.TheInternational Journal of Artificial Organs.Vol 28，Nr.7：686-693]。
本文使用的一些术语将在此后作更详细的解释，以便可更好地理解：
在本公开的内容中，术语“吸着剂”为进行吸着作用(最好是吸附作用)的作用剂，即该吸着剂的表面力会将位于生物流体内的分子固定。在说明书中，亦均使用术语“吸附剂体”或“吸附剂”或“吸附体”而非术语“吸着剂”。
本发明范围内使用的措辞“生物流体”可涉及无细胞的液体(尤其是血浆)或含有细胞的液体(尤其是血液)。由于在使用人工肝支持的过程中将其他液体，例如含有凝血抑制物的溶液(肝素溶液、柠檬酸盐溶液)或替代溶体(电解液、补充液体损失的液体)，导入体外血液循环管道或血浆循环管道是需要的，因此生物流体亦可理解为已稀释的血液或已稀释的血浆。本发明主要计划用于人类医学领域，因此主要指人类的生物流体。然而，这并不排出本发明亦可适用于兽医药领域。
措辞“多孔中性疏水性聚合物”指一个指定平均孔隙大小的多孔、水溶性固体。其可为均聚物亦可为杂聚物。该聚合物的内外表面均为中性和疏水性。术语“中性”指非离子型。术语“疏水性”应理解为指该等聚合物为防水材质的结构。尽管本领域技术人员应明白术语“聚合物的平均孔隙大小”应如何理解以及可如何故意设置孔隙度或平均孔隙大小，但为求清晰，在此仍会为本术语作简单界定。平均孔隙大小涉及该等孔隙的平均直径。从孔隙直径的高斯粒度分布方面而言，平均孔隙直径即是对应分布曲线最大值的孔隙直径。举例来说，平均孔隙直径可使用氮吸附[如Weber et al.2008.Neutral styrene divinylbenzene copolymers for adsorption of toxins in liver failure.Biomacromolecules 9(4)：1322-1328中所述]或使用压汞法来厘定。孔隙大小是以所涉单体、溶剂、或调节剂的浓度变化而设定。该聚合物的所选孔隙越小，该聚合物可供吸着(尤其是吸附)的内表面积就越大。孔隙越大，孔隙对较大分子的可及性就越好。如Weber等人已描述过一种产生可用于本发明的一个选定孔隙大小的聚合物的方法，[Weber et al.2008.Neutral styrene divinylbenzene copolymers for adsorption of toxins inliver failure.Biomacromolecules 9(4)：1322-1328]。本发明的主要方向为颗粒聚合物。该吸着剂如要以滤膜的方式也是可以想像到的。
多孔中性疏水性聚合物的内外表面均涂上多肽层，该多肽层是由多肽分子吸附到该聚合物表面上而形成的。本文的术语“多肽”涉及疏水性并具有亲水性侧键或结构域的多肽或蛋白质。术语多肽特别涉及由多于10个氨基酸合成的多肽，合成该多肽分子的该等氨基酸在顶端是开放的。术语多肽特别涉及蛋白质。在以多肽溶液吸附涂上该中性疏水性聚合物时，由于疏水性相互作用，故该多肽(或蛋白质)的亲水性侧键或结构域会与该聚合物的中性疏水性表面相互影响。该疏水性相互作用有重大的生化意义，并以疏水性分子倾向在极化环境中结合的现象为基础。因此，该疏水性相互作用并非本身的作用力，而是受极化环境所迫使的。该多肽的该等亲水性侧键朝外，远离该聚合物的疏水性表面。该聚合物透过以多肽层衬砌其内外表面而变得亲水化，并通常会形成多肽单层。若该多肽层在功能上具惰性就会特别方便，而术语“功能上具惰性”应理解为指该多肽层与存于该生物流体中的该等分子(例如血浆蛋白、等等)之间并无发生特别的相互作用。另外，若该多肽层亦不会存于该生物流体中的该等分子发生非特别的相互作用，也会比较方便。用于本发明的多肽可透过本领域技术人员以常规实验确立其适用性。
可见本发明所述的平均孔隙大小为15-20nm的吸着剂在一段特定时间后，即当生物流体已与该吸着剂接触了一段足够长的时间(超过15分钟)后，可将蛋白C从该生物流体移除。但与本发明所述的吸着剂相比，未涂上的中性疏水性聚合物会立即将蛋白C消除。然而，平均孔隙大小为15-20nm的聚合物对于对与蛋白高度结合物质有高吸附速度的肝支持系统而言，例如微球解毒系统(MDS)等，是非常合适的。在MDS中，可将生物流体与该吸着剂接触的时间保持在足够短的时间(小于5分钟)内，使蛋白C在该生物流体仍留有生理上的相关数量。在孔隙大小为15-20nm时，优点是内表面积越大，其对伴随的与蛋白结合物质的吸附效能就越好。
对于该生物流体与本发明所述的吸着剂接触较长时间(超过15分钟)的方法，则推荐使用平均孔隙大小大于15-20nm的聚合物。当平均孔隙大小增大时，可见该聚合物与蛋白C的结合会进一步减少。在孔隙大小较大(≥30nm)时，该生物流体与本发明所述的吸着剂接触一段非常长的时间后，蛋白C的浓度亦有可能不会跌至生理临界值。在平均孔隙大小为极高的80-100nm时，蛋白C则几乎不会被吸附。按照此观察结果，该将被涂上的中性疏水性聚合物的平均孔隙大小应选为不少于15nm，而较大者(≥30nm)则较为适宜。如胆红素等的与蛋白结合物质在孔隙大小为15nm或以上时会有很好的吸附。
使用小平均孔隙大小的8或9nm的涂上白蛋白的聚合物(见上述现有技术)，在血小板于血液灌流时与吸附体的结合减少的方面，的确可提高生物相容性，但在非预想的蛋白C结合减少的方面，就无法提供一个满意的解决方案。迄今，该等已知的涂上白蛋白的聚合物并未与有关蛋白C的凝结问题有关联。此外，正如现有技术所指出，已确立若涂上白蛋白的聚合物的平均孔隙大小为5-10nm，则相比起未涂上的聚合物，对胆红素的吸附会较为不利地减少。
孔隙大小增大时吸着剂对蛋白C的结合作用就减少的一个有可能的解释如下：一个小平均孔隙大小15-20nm)并以一个多肽层吸附涂上的聚合物，尤其是在聚合物的内表面上，可能会因所用的多肽(例如白蛋白)大小而不完整。因此相对较小的蛋白C可穿过该等孔隙，并吸附到剩余的疏水性表面上。当平均孔隙大小(≥30nm)较大时，对多肽的可及性也较高，因而亦会为聚合物表面提供较好的亲水性衬里。因此，疏水性表面对蛋白C将不再可及。此外，蛋白C会遭该多肽层的该等亲水性侧键或结构域排斥。由于与蛋白结合物质的吸着效能并不会因该多肽涂层而受到负面影响，可假设在孔隙大小较大(≥30nm)的已涂上的聚合物上，用于与与蛋白结合物质结合的内表面上仍然有足够的疏水性表面可及，惟对蛋白C而言则为不可及。可推定该蛋白层会形成单层，而该单层的个别多肽分子之间有极微小的孔隙(微微孔)，可让如胆红素等的与蛋白结合物质穿过，因此就算有多肽涂层仍可被吸附。
虽然选定较大的未涂上的聚合物的平均孔隙大小，可将蛋白C的绑定减至最低，但若平均孔隙大小不大于80nm，则对临床应用较为适宜，否则该聚合物的内表面积会太小。结果，与蛋白高度结合物质的吸着效率(吸附效率)会下降。对患有肝衰竭的高风险病人来说，对平均孔隙大小推荐所选定的不大于40nm。
在一个特别优选的变体的情况下，未涂上的中性疏水性聚合物的平均孔隙大小为30至40nm。在本体中，已知尽管该生物流体与该吸着剂接触一段长时间，亦仅很少蛋白C会被吸附。此外，在此孔隙大小下该聚合物的内表面积仍然够大以确保可高效吸附与蛋白结合物质。
在临床实践中，已确立并已有利地使用中性疏水性聚合物，其中更尤其偏好使用苯乙烯/二乙烯苯共聚物。苯乙烯/二乙烯苯共聚物在肝和肾衰竭中对毒素的吸附作用已获验证，而其特色为良好的生物相容性、无毒性、以及可经消毒的良好稳定性和能力。此外，孔隙大小可轻易和重复地设定。另外，也可设定非常小的粒度。然而，也可以使用结构与苯乙烯/二乙烯苯共聚物类似的中性疏水性聚合物；该等聚合物应会表现出与苯乙烯/二乙烯苯共聚物类似的行为。本领域技术人员在几次的常规实验中，可确定一个中性疏水性聚合物是否适合用来进行本发明。
就以多肽层涂上中性疏水性聚合物方面，相对分子量为40,000至80,000Da及/或尺寸维度达约10nmx10nmx10nm的多肽为优选。
该多肽层可包含最少一种多肽，而该最少一种多肽为选自白蛋白，尤其是人血白蛋白、和似白蛋白多肽。似白蛋白多肽在其结构方面与白蛋白类似及/或具有似白蛋白的特性。似白蛋白多肽为选取自(其中包括)白蛋白的亚型，如前白蛋白等。似白蛋白多肽可源自天然来源，亦可以合成方式产生。该多肽层可包含单一种多肽或混合两种或以上多肽。该多肽可源自天然来源，亦能够以重组方式产生。本领域技术人员可以常规实验确定一个多肽或两种或以上多肽的混合物是否适合进行本发明。
在此将须再次指出，该多肽层是基于所用多肽或蛋白质的疏水性侧键与该聚合物的疏水性表面之间的疏水性相互作用而在该中性疏水性聚合物的内及外表面上形成的。
鉴于人血白蛋白(人血清白蛋白，HSA)的卓越生物相容性和高纯度时的可及性，使用人血白蛋白涂上聚合物为特别有利。
本发明进一步涉及根据本发明产生吸着剂的方法，其中高达10％多肽的溶液为用作以多肽层吸附涂上该中性疏水性聚合物。
在一个特别优选的变体中，该多肽溶液为人血白蛋白溶液。正如上文已详述过，进一步有利的多肽可选自白蛋白，尤其是人血白蛋白、和似白蛋白多肽。此外，多肽溶液亦可含有多于一种多肽。
已显示的是1％多肽溶液已足以提供具备本发明所述属性的吸着剂。使用更高浓度的多肽溶液(5-10％)并不会致使在与蛋白C结合的方面有显著差异或改进。出于经济原因，高纯度多肽溶液较昂贵，因此在本发明的首个有利实施例中，会将1％多肽溶液用作涂上该中性疏水性聚合物。
在该方法的进一步有利实施例中，使用了10％多肽溶液。使用更高浓度的多肽溶液(10％)以吸附涂上该聚合物，优点为不仅可大幅减少蛋白C与该吸着剂的非预想结合，更可大幅减少与纤维蛋白原的结合。
该多肽溶液的pH值最好设置到7.40。对应血液生理pH值的pH值，其优势为其在以多肽吸附涂上该载体(聚合物)时已使用过。这不但对病人安全(避免酸中毒或碱中毒)有好处，亦因设定生理pH值(通常以悬浮液形式提供该吸着剂)不再需要繁琐的洗涤程序，故对生产也有好处。
也可证明，若选定的pH值为接近该多肽的等电点，则属有利。已知聚合物上的多肽占有密度可通过改变pH值而改变[Ton et al.1979.Adsorption of Human SerumAlbumin to Amberlite XAD-7Resin.J Biomed Mater Res 13：407-422]。通过优化pH值，可将多肽溶液的浓度保持在非常低的水平，而据此可节省生产成本。pH值的优化可于常规实验中进行。
除聚合物表面和平均孔隙大小的理化特性外，聚合物的粒度亦在吸附步骤中起着作用。粒度会影响吸附作用的动力学。吸附作用实质上是扩散时间(因此也是扩散速度)的函数，而其则与距离的平方成正比。在选定小粒度时，扩散路径是很短的，因此消除速度与粒度成反比。此外，在粒度小时，会有一个大表面积/体积。为了使与蛋白高度结合物质的吸着速度和吸着能力尽可能提高，若该吸着剂含有微粒，而该等微粒的粒度为20μm或以下，则为比较有利。
正如上文所述，在现有技术中，微球解毒系统(MDS)尤其会使用微粒。微粒在净化循环管道(血浆循环管道)中以悬浮物的方式于滤膜的滤液层上环流。然而，若该滤膜变得有渗漏，则存有微粒将到达体外血液循环管道以及其后病人身体的危险，并将在其中引发肺栓塞。出于这个原因，因小粒度可避免发生肺栓塞的风险，故一个特别有利的变体将提供粒度为8μm或以下的微粒，而5μm或以下则最为理想。
另外，本发明所述的吸着剂为一个适合用于吸着装置(如吸附塔等)的填充材料。
另外，本发明涉及从生物流体移除与蛋白结合物质的方法，而含有与蛋白结合物质的生物流体会与本发明所述的吸着剂接触。这首先可于体外肝支持进行，其中吸着剂可净化血液或血浆中的与蛋白结合物质。患有肝衰竭或肝功能降低的病人和患有肾功能不全的病人会使用体外肝支持。正如上文所述，该生物流体可通过含有吸着剂的吸着装置。然而，就如在MDS中所使用般，该吸着剂亦可于生物流体中悬浮。
另外，本发明涉及根据本发明的吸着剂作为用于从生物流体移除与蛋白结合物质的选择性吸着剂的用途，该等与蛋白结合物质尤其可为胆红素、芳香族氨基酸、胆汁酸、苯酚、和琉醇。术语“与蛋白结合物质”主要涉及与蛋白结合有毒物质(所谓肝毒素)，在患有肝功能障碍或肝衰竭的病人血液中大量含有。根据本发明的吸着剂的经改良选择性属性是以蛋白C与本发明所述的吸着剂的结合大幅减少这方面为基础的，而相比起未涂上的聚合物，对与蛋白结合物质的吸着效能并未受损。
本发明另外涉及根据本发明的吸着剂作为用于从无细胞生物流体移除与蛋白结合物质的选择性吸着剂的用途，尤其是血浆。
另外，本发明涉及根据本发明的吸着剂作为用于从含有细胞的生物流体移除与蛋白结合物质的选择性吸着剂的用途，尤其是血液。
具体实施方式
在此后，将以非限制性的例子为基础，更详细说明本发明。
例1：生产涂上白蛋白的苯乙烯-二乙烯苯共聚物
表1已列出用于涂覆的苯乙烯-二乙烯苯共聚物的不同平均孔隙大小，粒度为5μm+/-3-4μm：
表1：苯乙烯-二乙烯苯共聚物
  苯乙烯-二乙烯苯共聚物标号   平均孔隙大小(nm)
  #1822   15-20
  #1824   30-40
  #1825   80-100
首先，从生理氧化钠溶液生产特定平均孔隙大小的苯乙烯/二乙烯苯共聚物的50％悬浮液。将其两倍的批量通过移液器移入至15mL的Greiner试管中并进行离心。上层清液被回收。剩余的苯乙烯/二乙烯苯共聚物与该批量对应。
其后，透过在该苯乙烯/二乙烯共聚物的内外表面上丛人血白蛋白溶液吸附人血白蛋白，以人血白蛋白层涂上该共聚物。将带有1mL共聚物和5mL人血白蛋白溶液(人血清白蛋白，HSA)(人血白蛋白Octapharma 20％溶液，第B17B6331项)的试管置入各个双倍批次中。人血白蛋白溶液的浓度可为1-10％。将该等试管放到摇动器(Enviro
Figure BDA0000093528450000111
中用25∶50的频率以10℃培育21个小时。带有共聚物和0.9％氧化钠溶液的试管将连同作对照。仅带有加样血浆(见第2.2.1节)而无共聚物的试管将连同作阴性对照。在摇动器中的培育时间完结后(21个小时)，将该等试管离心并弃置该上层清液。
例2：在蛋白结合物质的吸附和蛋白C的吸附方面，与未涂上的苯乙烯/二乙烯苯共聚物相比，试验涂上人血白蛋白的苯乙烯/二乙烯苯共聚物的不同孔隙大小。
2.1.吸附体
首先，提供不同孔隙大小的苯乙烯/二乙烯苯共聚物。该等苯乙烯/二乙烯苯共聚物的粒度为5μm+/-3-4μm。其后，根据例1的生产方案，以10％人血白蛋白溶液(HSA)涂上该等苯乙烯/二乙烯苯共聚物。该等吸附体已于表2中列出：
表2：带有和不带有HSA涂层的吸附体(苯乙烯/二乙烯苯共聚物)的不同孔隙大小
  吸附体标号   平均孔隙大小(nm)
  #1822有HSA   15-20
  #1822无HSA   15-20
  #1824有HSA   30-40
  #1824无HSA   30-40
  #1825有HSA   80-100
  #1825无HSA   80-100
“有HSA”的标号标明吸附体有使用白蛋白涂上，“无HSA”标明该等相应的吸附体未被涂上(＝无HSA涂层的苯乙烯/二乙烯苯共聚物)。
2.2.分批试验
在一项分批试验中，就上述吸附体从人类血浆吸附与蛋白结合物质和吸附蛋白C研究了其特性。在该等实验，该等吸附体用加样血浆被涂上(见第2.2.1.节)。
2.2.1.生产血浆加样：
来自健康捐赠者的血浆使用了特定浓度的肝毒素来加样，以生产血浆加样。100mL的加样血浆含有以下浓度的肝毒素：300μM胆红素、100μM胆酸、100μM色氨酸、2mM苯酚。
该等肝毒素乃以下列方式处理：
就该胆红素批次，先称量出0.0175g胆红素，然后溶解在2ml的0.3N NaOH中。
就该混合毒素批次，先称量出0.02043g胆酸、0.0102g色氨酸、和0.0940g苯酚，然后共同搅拌到合共5ml的0.3N NaOH中。
就100ml的加样血浆，将2mL的该胆红素批次和1mL的该混合毒素批次加入96mL的血浆中，然后缓慢而避光地搅拌60分钟。在60分钟后，加入3mL的0.3N HCl。
表2列出的吸附体以加样血浆被涂上在试管中，再将1mL吸附体与9mL加样血浆混合。这与一个10％吸附体批次对应。带有加样血浆而无吸附体的试管将连同作阴性对照。将该等试管放到Enviro
Figure BDA0000093528450000121
摇动器中用25∶50的频率以37℃培育一个小时。
2.2.2.取样：
在5、15、30、和60分钟后，从每个试管取出1mL，然后立即以11,000g的离心力离心10分钟。立即将上层清液移转到一个Eppendorf的反应器中。在第0分钟的时间，将无吸附体的阴性对照(标明为“对照血浆”)用作计量。将该等样品存于-20℃下避光，直到分析时用。
2.2.3.分析：
已对所添加的肝毒素(胆红素、胆酸、色氨酸、苯酚)以及存于血浆中的蛋白白蛋白和蛋白C的吸附均进行分析：
胆红素，试验剂编号：14652700(Roche)
胆酸，编号：R284067(Roche)
色氨酸试验剂编号：685125-01(Roche)
苯酚：高效液相色谱
白蛋白试验剂编号：688271-01(Roche)
蛋白C ELISA试验剂编号：12021228(Technoclone)
分析是在一个日立902(VT)分析仪进行的。
2.3.实验结果：
该等实验的结果以图表的方式在各个图中显示。在该等图中：
图1A显示了在时间曲线[分钟]中，与相应的未涂上的吸附体#1822无HSA和#1824无HSA比较，涂上HSA的吸附体#1822有HSA和#1824有HSA对胆红素(以mg/dL表示胆红素在上层清液中的浓度)的吸附，
图1B显示了在时间曲线[分钟]中，与未涂上的吸附体#1825无HSA比较，涂上HSA的吸附体#1825有HSA对胆红素(以mg/dL表示胆红素在上层清液中的浓度)的吸附，
图2A显示了在时间曲线[分钟]中，与相应的未涂上的吸附体#1822无HSA和#1824无HSA比较，涂上HSA的吸附体#1822有HSA和#1824有HSA对胆酸(以μmol/L表示胆酸在上层清液中的浓度)的吸附，
图2B显示了在时间曲线[分钟]中，与未涂上的吸附体#1825无HSA比较，涂上HSA的吸附体#1825有HSA对胆酸(以μmol/L表示胆酸在上层清液中的浓度)的吸附，
图3A显示了在时间曲线[分钟]中，与相应的未涂上的吸附体#1822无HSA和#1824无HSA比较，涂上HSA的吸附体#1822有HSA和#1824有HSA对色氨酸(以μmol/L表示色氨酸在上层清液中的浓度)的吸附，
图3B显示了在时间曲线[分钟]中，与未涂上的吸附体#1825无HSA比较，涂上HSA的吸附体#1825有HSA对色氨酸(以μmol/L表示色氨酸在上层清液中的浓度)的吸附，
图4A显示了在时间曲线[分钟]中，与相应的未涂上的吸附体#1822无HSA和#1824无HSA比较，涂上HSA的吸附体#1822有HSA和#1824有HSA对苯酚(以mmol/L表示苯酚在上层清液中的浓度)的吸附，
图4B显示了在时间曲线[分钟]中，与未涂上的吸附体#1825无HSA比较，涂上HSA的吸附体#1825有HSA对苯酚(以mmol/L表示苯酚在上层清液中的浓度)的吸附，
图5A显示了在时间曲线[分钟]中，与相应的未涂上的吸附体#1822无HSA和#1824无HSA比较，涂上HSA的吸附体#1822有HSA和#1824有HSA对血浆蛋白白蛋白(以g/dL表示白蛋白在上层清液中的浓度)的吸附，
图5B显示了在时间曲线[分钟]中，与相应的未涂上的吸附体#1825无HSA比较，涂上HSA的吸附体#1825有HSA对血浆蛋白白蛋白(以g/dL表示白蛋白在上层清液中的浓度)的吸附，以及
图6显示了在培育0、5、15和60分钟后，与相应的未涂上的吸附体#1822无HSA、#1824无HSA、和#1825无HSA比较，根据本发明涂上HSA的吸附体#1822有HSA、#1824有HSA和#1825有HSA对凝血蛋白蛋白C(以％表示)的吸附。
2.4.从分批试验得到的结果概要：
分批测试的结果显示，吸附体的白蛋白涂层可大幅提高生物相容性，特别是可避免或大大减少对天然抗凝剂蛋白C的吸附。因此可以推定，这也可应用到蛋白S上。由于患有败血症或肝衰竭的病人血液的凝结能力已受到干扰，且不应再受到额外损害，故此这对该类病人来说具有重大意义。此外，吸附体有关吸附肝和肾衰竭的重要毒素(见图1A、图1B、图2A、图2B、图3A、图3B、图4A、和图4B)的特性，并不会受到HSA-蛋白涂层的影响，因此其吸附能力以及其吸附动力均可很大程度地保持。
白蛋白的轻微解吸作用(见图5A和图5B)可透过因在涂上的过程中有多于所需的白蛋白与聚合物结合而形成一个双重或多重层来解释。在特殊情况下，过多的白蛋白会再次解吸。而负责所述白蛋白层有利功能的，是在任何情况均会保持的白蛋白单层。
从图6可清楚看到，使用人血白蛋白层吸附涂上苯乙烯/二乙烯苯共聚物，可达到大幅减少蛋白C的吸附。在与小平均孔隙大小(15-20nm和30-40nm)的未涂上的聚合物一起时，蛋白C会从血浆中被完全消除，而与大平均孔隙大小(#1825无HSA，孔隙大小80-100nm)者一起时，则有一部分的蛋白C会留于血浆中。孔隙大小大于80nm的吸附体因内表面积减小，故在临床应用上仅得有限的适用性，例如，用于患有非危及生命的肝功能障碍的病人上。与未涂上的吸附体相比，使用涂上HSA的吸附体在孔隙大小为15-20nm时已可达到大幅减少蛋白C的吸附。涂上HSA的吸附体对蛋白C的吸附会随着孔隙大小增大而进一步降低。由于一方面此孔隙大小只会消除小量的蛋白C，另一方面该吸附体的内表面积仍够大可高效移除与蛋白结合物质，因此若涂上HSA的吸附体的孔隙大小为30-40nm，则更是特别有利。在大孔隙大小(80-100nm)时，蛋白C则几乎不会被吸附，然而，正如已指出的，对与蛋白结合物质的吸附效能亦会大幅降低。
例3：测试作为人血白蛋白溶液浓度的函数的与蛋白结合物质和蛋白C的吸附。
用作涂上中性疏水性苯乙烯/二乙烯苯共聚物(见例1中的方案)的人血白蛋白溶液，就其浓度对吸附与蛋白结合物质和蛋白C的影响已作出测试。本实验目的为测试人血白蛋白溶液用于涂上共聚物时的最佳浓度。
例1中的未涂上的吸附体#1824(平均孔隙大小30-40nm)是根据例1中的方案使用人血白蛋白涂上的，并使用了三种浓度的人血白蛋白溶液(1％HSA、5％HSA、和10％HSA)涂上。在根据第2.2.节的方案的分批试验中，使用加样血浆涂上了涂上HSA的吸附体。带有未涂上的吸附体的试管已连同作比较之用。此外，仅带有加样血浆而无吸附体的试管已连同作阴性对照。亦已根据第2.2.节的方案进行分析。
表3已列出用于分批试验的不同批次。
表3：测试人血白蛋白溶液浓度的批次
  阴性对照血浆
  #1824无HSA
  #18241％HSA
  #18245％HSA
  #182410％HSA
从分批试验得到的结果概要：
HSA溶液的浓度对吸附胆红素、胆酸、色氨酸、和苯酚并无影响。该等曲线在本质上是一致的。
相比起HSA浓度为1％或5％，HSA浓度为10％时可达到轻微较好的色氨酸吸附。
在图7中，以时间(培育0、5、15、30、和60分钟)的函数表示了使用不同人血白蛋白溶液(1％、5％、和10％)涂上的吸附体对凝血蛋白蛋白C(以％表示)的吸附。
用于涂覆的人血白蛋白溶液的浓度仅对吸附蛋白C有轻微影响。提高人血白蛋白溶液的浓度，仅可对蛋白C的吸附确立轻微的减少。在这结果的基础上，用于涂上聚合物的1％人血白蛋白溶液已完全足以大幅减少蛋白C的吸附。
虽然出于经济原因，1％人血白蛋白溶液为优选，但在涂覆上使用10％人血白蛋白溶液对纤维蛋白原的吸附而言有利。当纤维蛋白原与1％HSA和5％HSA接触几分钟并从血浆中完全消除后，采用使用10％HSA涂上的吸附体可大幅减少吸附作用。

Claims (18)

1.一种用于丛生物流体移除与蛋白结合物质的吸着剂，该吸着剂带有：(a)一个多孔中性疏水性聚合物以及(b)一个吸附在该聚合物上的多肽层，其特征在于该中性疏水性聚合物的平均孔隙大小最少为15nm。
2.如权利要求1所述的吸着剂，其特征在于该中性疏水性聚合物的平均孔隙大小不大于80nm，而不大于40nm为优选。
3.如权利要求1或2所述的吸着剂，其特征在于该中性疏水性聚合物的平均孔隙大小为30至40nm。
4.如权利要求1至3所述的吸着剂，其特征在于该中性疏水性聚合物为一个苯乙烯/二乙烯苯共聚物。
5.如权利要求1至4所述的吸着剂，其特征在于该多肽层包含最少一种多肽，该最少一种多肽选自血清白蛋白，尤其是人血白蛋白、和似白蛋白多肽。
6.如权利要求1至5所述的吸着剂，其特征在于该吸着剂包含微粒，该等微粒的粒度为20μm或以下，而粒度8μm或以下为优选，5μm或以下为理想。
7.一种吸附装置，含有一个权利要求1至6所述的吸着剂。
8.一种电浆电路含有一个权利要求1至6所述吸着剂的悬浮液。
9.一种产生权利要求1至6所述吸着剂的方法，其特征在于使用一个高达10％多肽的溶液用于以该多肽层吸附涂上到该中性疏水性聚合物。
10.权利要求9所述的方法，其特征在于使用一个1％多肽的溶液用于吸附涂上该中性疏水性聚合物。
11.权利要求9所述的方法，其特征在于使用一个10％多肽的溶液用于吸附涂上该中性疏水性聚合物。
12.权利要求9至11所述的方法，其特征在于该多肽溶液含有最少一种多肽，该多肽选自血清白蛋白，尤其是人血白蛋白、和似白蛋白多肽。
13.一种用于丛一个生物流体移除与蛋白结合物质的方法，其特征在于将含有与蛋白结合物质的生物流体与权利要求1至6所述吸着剂接触。
14.权利要求13所述的方法，其特征在于该生物流体为血液或血浆。
15.一种权利要求1至6所述吸着剂的用途，该用途将该吸着剂用作一个用于丛生物流体移除与蛋白结合物质的选择性吸着剂，该等与蛋白结合物质尤其为胆红素、芳香族氨基酸、胆汁酸、苯酚、和琉醇。
16.一种权利要求1至6所述吸着剂的用途，该用途将该吸着剂用作一个用于丛一个无细胞生物流体(特别是血浆)移除与蛋白结合物质的选择性吸着剂。
17.一种权利要求1至6所述吸着剂的用途，该用途将该吸着剂用作一个用于丛一个含有细胞的生物流体(尤其是血液)移除与蛋白结合物质的选择性吸着剂。
18.一种权利要求1至6所述吸着剂的用途，该用途将该吸着剂用作一个MDS(微球解毒系统)中的选择性吸着剂。
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