CN102361658B - 用于移除与蛋白结合物质的吸着剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种吸着剂，该吸着剂具有经改进的一些选择属性用于从生物流体移除与蛋白结合的物质，而该生物流体特别是患有严重肝功能障碍或肝衰竭或肾功能不全的病人的血液或血浆，该吸着剂包含：(a)多孔、中性、疏水性聚合物以及(b)吸附在该聚合物的多肽层，该中性、疏水性聚合物的平均孔隙大小最少为15nm。本发明进一步涉及到配合有关这样的吸着剂的方法和用途。本发明特别适用于体外的肝脏支持。

Description

用于移除与蛋白结合物质的吸着剂

技术领域

本发明涉及一种吸着剂，用于从生物流体移除与蛋白结合(protein-bound)的物质，该吸着剂带有：(a)多孔、中性、疏水性聚合物以及(b)吸附在该聚合物的多肽层。

背景技术

肝脏，作为主要的代谢器官，不论是在葡萄糖、蛋白、和脂肪的代谢、碳水化合物和维生素的储存、解毒、以及免疫防御中，均有重要的任务。在血液中汇集的有毒物质和代谢产物是由正常运作的肝脏从血液中移除的。对于患有因长期疾病而引致肝功能减弱或急性肝衰竭或肝衰竭的病人，必须将他们血液中所含有的大量有毒物质清除。肾功能不全者亦须清除其血液中的大量肝毒素。肝衰竭会因累积大量有毒物质而在短时间内导致多器官并发症甚至如肾脏和肺部等多个器官衰竭，故须立即送院治疗。解毒治疗将辅以人工肝脏支持系统（“人工肝”、肝脏透析）施行，使用该系统可有效移除血液中的有毒物质。因此，患有致命肝衰竭的病人的病情可以稳定下来并保存性命，直至进行器官移植时。由于肝脏有高的自我再生能力，故减轻肝脏负担的治疗甚至可使病人的肝脏功能恢复。肝脏支持系统的成效对治疗能否成功是决定性的。

患有肝脏疾病的病人的血液中的有毒物质可分为水溶性和非水溶性物质。使用肝脏支持系统从血液中移除的有毒物质的例子有非结合胆红素、胆汁酸、主要芳香族氨基酸、酚类化合物、和氨。为了在血液中进行运输，非水溶性肝毒素均为与蛋白结合形式――通常与血蛋白白蛋白结合。血红蛋白和其他血红素蛋白（肌红蛋白、细胞色素）降解时会形成胆红素。由于其并非水溶性，故其无法经肾脏排出体外。为了在血液中进行运输，胆红素会与白蛋白结合（非结合或间接胆红素）。在肝脏中，胆红素会与葡萄糖醛酸连结（已结合或直接胆红素）。已结合胆红素为水溶性，可与胆汁一同在肠道或在肾脏排出。倘若发生肝功能衰竭，则无法再形成已结合胆红素，而血液会累积大量非结合胆红素。倘若血清胆红素的水平上升，则会出现黄疸病，巩膜、皮肤发黄，而倘若胆红素上升到很高水平，则组织和器官亦会发黄。因此，胆红素代表肝功能障碍或衰竭的一个重要指标。

体外肝脏支持系统为已知的现有技术。为了移除与蛋白结合的物质，体外肝脏支持系统通常有位于体外血液回路或血浆回路的吸着装置（吸附体），而使用该装置会移除血液或血浆中的与蛋白结合的物质。该吸着装置含有吸着剂（吸附剂）。该吸着装置的效率或该吸着剂的吸着作用（特别是吸附作用）的速度是治疗成功或对病人（特别是患有肝衰竭的病人）桥接稳定的基础。

血液或血浆与外来表面接触，会致使接触活化作用，并在此后引致凝结作用、释出激肽、和活化补体系统。因为血浆或血液在体外血液净化方法中会与膜和吸附体接触，故该些方法亦会触发这些过程。因此，对大部分需要体外血液净化的病人来说，抑制血液凝结是必要的。这通常是使用肝素输注进行的。若病人为忌服用肝素者，则可使用柠檬酸盐施行局部抗凝。

以阴离子交换剂为基础的吸附体经常被用于体外肝脏支持系统的临床应用中。本文将提述的肝脏透析装置MARS（分子吸附再循环系统）（Molecularadsorbentrecircuitsystem）和普罗米修斯系统（Prometheussystem），为临床应用上使用阴离子交换剂的已知装置。使用阴离子交换剂，可非常有效率地从如血浆的生物流体中移除如胆红素的与蛋白结合的有毒物质。特别是普罗米修斯系统，其特点在于可高度清除与蛋白结合和水溶性的肝毒素，因此可大幅提高肝病患者的生存率。然而，阴离子交换剂一个很大的缺点是，不但该些想要的与蛋白结合的物质会被大幅消除，对血液凝结系统而言生理上重要的蛋白或因子（抗凝剂和促凝剂）亦会被大幅消除。其中特别是本文将提述的病患者体内的凝血抑制剂，如蛋白C和蛋白S。作为凝血抑制因子，蛋白C可谓尤其重要。体内的蛋白C浓度下降会致使严重的凝血并发症，如深静脉血栓和肺栓塞。抗凝肝素，其透过输注额外供给到该体外血液回路中，亦会遭该阴离子交换剂消除掉，导致该体内凝血系统失调或者体外或体内血液回路中有不希望发生的抗凝作用。这特别是对于高风险患者而言，如患有肝衰竭和败血症的病人，可以是很大的问题。近期有一报告是关於，由于凝血系统中的蛋白在阴离子交换剂进行不希望发生的结合，导致经净化的血液返回体外血液净化系统或病人体内后形成闭塞性血栓的巨大风险[Meijersetal.2007.MajorCoagulationDisturbancesDuringFractionatedPlasmaSeparationandAdsorption.AmJTransplant7(9):2195-2199]。

因为阴离子交换剂有上述缺点，所以有人便提出了使用中性、疏水性聚合物。该聚合物具有孔隙，可吸附有关物质于其内。该聚合物的选定孔隙大小为决定性的因素。已显示在体外仅大于5-6nm的孔隙可触及如胆红素的与蛋白高度结合的物质。已确立当平均孔隙大小为>7.5nm时胆红素吸附作用是良好的[Weberetal.2008.Neutralstyrenedivinylbenzenecopolymersforadsorptionoftoxinsinliverfailure.Biomacromolecules9(4):1322-1328]。在孔隙大小较大的情况下，因孔隙可及性较好，故与蛋白结合物质会吸附得较好。然而由于随着孔隙大小增大，该聚合物的内表面面积会减少，因此若选择过大的孔隙大小，则该吸附体的能力和因此其吸附效能反会下降。

除此以外，与上述阴离子交换剂不同，就中性、疏水性聚合物而言已确定仅少数肝素会被结合。此外，凝血酶-抗凝血酶络合物的形成亦大大减少。然而，由于中性、疏水性聚合物的平均孔隙大小为>7.5nm而出现显著的蛋白C吸附作用，实属不利。可以假设，其他分子重量相似的重要蛋白，如蛋白S，亦会被吸附。孔隙大小较小（<5-6nm）者，不会吸附蛋白C，而其对与蛋白高度结合物质而言是不可及的。

透过弃用阴离子交换剂而使用中性、疏水性聚合物，由于可大幅减少或预防肝素的吸附，因此可提供最少为部分选择性的吸着剂。然而，中性、疏水性聚合物对蛋白C的吸附依然显著，使其可致使上述凝结问题。若病人为忌服用肝素者，则特别有危险。使用较小孔隙大小的聚合物虽不会吸附蛋白C，但因其移除与蛋白结合的物质的效率太低而并不推荐使用。在肝衰竭的情况中，正如前文所强调，对与蛋白结合的物质的吸附效率为决定性的生存因素。

从EP0776223B1和US5855782可知，在移除与蛋白结合的物质的方面，基于微粒体的解毒系统（MDS）为特别高性能的系统。最近有报告是有关从中性、疏水性聚合物（苯乙烯/二乙烯苯共聚物，平均孔隙直径：>100nm）生产的微粒体吸附粒子（平均粒度5μm）[FalkenhagenD.,VienkenJ.,ThePrometheus-System.TechnicalBackgroundandClinicalExperience.ASAIO54thAnnualConference,19-21June2008]。

另外，WO2005/082504A2公开了用于移除与蛋白结合的物质的中性树脂。WO2005/082504A2描述了解毒装置，其带有活性碳和最少一个非离子树脂，而这非离子树脂的平均孔隙大小为30nm（聚苯乙烯二乙烯苯树脂――AmberchromGC300C）或45nm（基于脂肪族酯的树脂――AmberliteXAD-7HP）。上述中性、疏水性聚合物的问题亦适用到这些中性树脂吸附体上。

早于1970年代末，已公开了一种吸着剂和一种生产本文起首时所述的吸着剂种类的方法[Tonetal.1979.AdsorptionofHumanSerumAlbumintoAmberliteXAD-7Resin.JBiomedMaterRes13:407-422]、[Hughesetal.1978.Theuseofaninvitrohaemoperfusioncircuittoevaluatethebloodcompatibilityofalbumin-coatedAmberliteXAD-7resin.IntJArtifOrgans1(3):129-34]、[TonH.Y.etal.1979.Albumin-coatedAmberliteXAD-7resinforhemoperfusioninacuteliverfailure.PartI:adsorptionstudies.ArtifOrgans3(1):20-22]、[HughesR.etal.1979.Albumin-coatedAmberliteXAD-7resinforhemoperfusioninacuteliverfailure.PartII:invivoevaluation.ArtifOrgans.3(1):23-26]、[Falkenhagenetal.1981.Optimizationofalbumincoatingforresins.ArtifOrgans5(Suppl):195-199]。使用多肽层（白蛋白）作为如AmberliteXAD-7（平均孔隙大小：9nm）或Y56（平均孔隙大小：8nm）等中性、疏水性树脂的吸附性涂层，目的为减少在血液灌流时血小板与该吸附体结合和因与吸附体连接而失去的血小板。

在另一更近期的出版物中，描述了本文起首时所述的吸着剂种类，报告指胆红素在没有涂层的中性树脂（聚苯乙烯二乙烯苯，孔隙大小5-10nm）上较在以白蛋白层涂层的中性树脂上被吸附得较好[Annesinietal.,2005.Bilirubinremovalfromalbumin-containingsolutionbyadsorptiononpolymerresin.TheInternationalJournalofArtificialOrgans.Vol28,Nr.7:686-693]。因此，吸附在该中性树脂上的白蛋白层会对胆红素的吸附并因而对吸附效率有不良影响。

发明内容

本发明的一目的是提供经改良的吸着剂。提供在选择属性方面相比起现有技术的已知吸着剂有明显改进的用于从生物流体移除与蛋白结合的物质的吸着剂。该经改良的吸着剂可高效率地消除肝病患者血液中的与蛋白结合的物质，而参与凝血作用的蛋白，尤其是如蛋白C或蛋白S的重要生理凝血抑制因子，则会留在该生物流体内。

本目的可透过本文起首时所述的吸着剂种类达成，该中性、疏水性聚合物的平均孔隙大小最少为15nm。

全赖本发明提供了选择属性有明显改进的吸着剂，使用该吸着剂一方面可确保高效率移除与蛋白结合的物质，而另一方面可避免与中性、疏水性聚合物有关的凝结问题。如本发明所述的吸着剂首次提供了一方面可有效率地移除患有严重肝功能障碍或肝衰竭的病人血液中的与蛋白结合的物质，而另一方面可减少严重的凝血并发症发生的可能，从而改善病人的安全。

本案发明人确立了一出人意表的情况，即若该中性、疏水性聚合物的平均孔隙大小在涂上该多肽层前最少为15nm，则相比起没有涂层的中性疏水性聚合物，如本发明所述的吸着剂明显较少与蛋白C结合。

蛋白C是在血浆中依赖维生素K的蛋白，在凝血程序起了重要的调控作用并有抗凝效果。从现有技术已知蛋白C与没有涂层的中性疏水性聚合物会有不希望发生的结合，可因此致使凝血并发症（深静脉血栓、肺栓塞）。由于蛋白S（62,000Da）与蛋白C（69,000Da）的相对分子重量相似，因此可假设，如本发明所述的吸着剂有很大机会亦会大幅减少与蛋白S的结合。同样的考量亦可应用到有类似分子重量的凝血因子（例如因子VII、因子IX、和因子X）上。

此外，相比起没有涂层的聚合物，已确立如本发明所述的吸着剂对该些将被移除的与蛋白结合的物质（例如胆红素）的吸着效能仅削弱甚微或毫无影响。因此，如本发明所述的吸着剂在这点上亦优于现有技术已知的上述吸着剂[见Annesinietal.,2005.Bilirubinremovalfromalbumin-containingsolutionbyadsorptiononpolymerresin.TheInternationalJournalofArtificialOrgans.Vol28,Nr.7:686-693]。

本文使用的一些术语将在此后作更详细的解释，以便可更好地理解：

在本公开的内容中，术语“吸着剂”为进行吸着作用(sorption)（优选为吸附作用(adsorption)）的作用剂，即该吸着剂的表面力会将位于生物流体中的分子固定。在说明书中，除了术语“吸着剂”，也会使用术语“吸附作用剂”或“吸附剂”或“吸附体”。

本发明范围内使用的措辞“生物流体”可涉及无细胞的液体（尤其是血浆）或含有细胞的液体（尤其是血液）。由于在使用人工肝脏支持的过程中需将其他液体，例如含有凝血抑制剂的溶液（肝素溶液、柠檬酸盐溶液）或替代溶液（电解液、补充液体损失的液体），导入体外血液回路或血浆回路，因此生物流体亦可理解为已稀释的血液或已稀释的血浆。本发明主要计划用于人类医学领域，因此主要涉及人类的生物流体。然而，这并不排除本发明亦适用于兽医学领域。

措辞“多孔中性、疏水性聚合物”指一种有特定平均孔隙大小的多孔、非水溶性固体。其可为均聚物亦可为杂聚物。该聚合物的内外表面均为中性和疏水性。术语“中性”指非离子型。术语“疏水性”应理解为指该些聚合物为防水材质的结构。尽管本领域技术人员明白术语“聚合物的平均孔隙大小”应如何理解以及可如何特意设置孔隙度或平均孔隙大小，但为求清晰，在此仍会为本术语作简单界定。平均孔隙大小涉及孔隙的平均直径。从孔隙直径的高斯粒度分布方面而言，平均孔隙直径即是对应分布曲线最大值的孔隙直径。举例来说，平均孔隙直径可使用氮吸附[如Weberetal.2008.Neutralstyrenedivinylbenzenecopolymersforadsorptionoftoxinsinliverfailure.Biomacromolecules9(4):1322-1328中所述]或使用压汞法来确定。孔隙大小是以所涉单体、溶剂、或调节剂的浓度变化而设定。该聚合物的所选孔隙越小，该聚合物可供吸着（尤其是吸附）的内表面面积就越大。孔隙越大，孔隙对较大分子的可及性就越好。如Weber等人已描述过一种产生可用于本发明的一种有特定孔隙大小的聚合物的方法[Weberetal.2008.Neutralstyrenedivinylbenzenecopolymersforadsorptionoftoxinsinliverfailure.Biomacromolecules9(4):1322-1328]。本发明主要取向于颗粒聚合物。该吸着剂如要以滤膜的方式也是可以想像到的。

多孔、中性、疏水性聚合物的内外表面均使用多肽层涂层，该多肽层是由多肽分子吸附到该聚合物表面上而形成的。本文的术语“多肽”涉及疏水性并具有亲水性侧键(sidechains)或结构域(domains)的多肽或蛋白。术语多肽特别涉及由多于10个氨基酸合成的多肽，合成该多肽分子的该些氨基酸的数量向上是开放的。术语多肽尤其涉及蛋白。在使用多肽溶液在该中性疏水性聚合物涂层成为吸附性涂层时，由于疏水性相互作用，该多肽（或蛋白）的疏水性侧键或结构域会与该聚合物的中性、疏水性表面相互影响。该疏水性相互作用有重大的生化意义，并以疏水性分子倾向在极性环境(polarenvironment)中联合的现象为基础。因此，该疏水性相互作用并非本身的作用力，而是受极性环境所迫使的。该多肽的亲水性侧键朝外，远离该聚合物的疏水性表面。该聚合物透过以多肽层衬砌其内外表面而变得亲水化。通常会形成多肽单层。若该多肽层在功能上具惰性就会特别有利，而术语“功能上具惰性”应理解为指该多肽层与存在于该生物流体中的分子（例如血浆蛋白等等）之间并无发生特别的相互作用。另外，若该多肽层亦不会与存在于该生物流体中的分子发生非特别的相互作用，也会有利。用于本发明的多肽可透过本领域技术人员以常规实验确立其适用性。

已展示如本发明所述的平均孔隙大小为15-20nm的吸着剂在一段特定时间后，即当生物流体已与该吸着剂接触了一段足够长的时间（超过15分钟）后，会将蛋白C从该生物流体移除。但与如本发明所述的吸着剂相比，没有涂层的中性疏水性聚合物会立即将蛋白C消除。尽管如此，平均孔隙大小为15-20nm的聚合物对于对与蛋白高度结合的物质有高吸附速度的肝脏支持系统而言，例如基于微粒体的解毒系统（MDS），是非常合适的。在MDS中，可将生物流体与该吸着剂接触的时间保持在足够短的时间（少于5分钟）内，使蛋白C在该生物流体中仍留有生理上的相关数量。在孔隙大小为15-20nm时，优点是内表面面积较大，其对伴随的与蛋白结合的物质的吸着效能亦较好。

对于该生物流体与如本发明所述的吸着剂接触较长时间（超过15分钟）的方法，则推荐使用平均孔隙大小大于15-20nm的聚合物。当平均孔隙大小增大时，可见蛋白C会进一步减少与该聚合物结合。在孔隙大小较大（≥30nm）时，亦可能使到该生物流体与如本发明所述的吸着剂接触一段非常长的时间，而蛋白C的浓度又不会跌至生理临界值。在平均孔隙大小为极高的80-100nm时，蛋白C则几乎不会被吸附。按照此观察结果，该将被涂层的中性疏水性聚合物的平均孔隙大小应选为不少于15nm，而较大者（≥30nm）则为优选。如胆红素的与蛋白结合的物质在孔隙大小为15nm或以上时会被吸附得很好。

使用平均孔隙大小为小的8或9nm的以白蛋白为涂层的聚合物（见上述现有技术），在血液灌流时减少血小板与吸附体结合这方面，的确可提高生物相容性，但在减少与蛋白C产生不希望发生的结合另一方面，卻无法提供一个满意的解决方案。该些已知的以白蛋白为涂层的聚合物至今仍未被就与蛋白C的凝结有关的问题拉上关系。此外，正如现有技术所指出，已确立平均孔隙大小为5-10nm的以白蛋白为涂层的聚合物，相比起没有涂层的聚合物，对胆红素的吸附会较为不利地减少。

孔隙大小增大时吸着剂对蛋白C的结合作用就减少的一个可能的解释如下：平均孔隙大小为小(15-20nm)并使用多肽层在聚合物涂层成吸附性涂层，尤其是在聚合物的内表面上，可能会因所用的多肽（例如白蛋白）的大小而不完整。因此相对较小的蛋白C可穿过该些孔隙，并吸附到剩余的疏水性表面上。当平均孔隙大小较大（>30nm）时，对多肽的可及性也较高，因而亦会提供较好的聚合物表面的亲水性衬里。因此，疏水性表面将不可为蛋白C所用。此外，蛋白C会遭该多肽层的亲水性侧键或结构域排斥。由于与蛋白结合的物质的吸着效能并不会因该多肽涂层而受到负面影响，可假设在孔隙大小较大（>30nm）的已涂层的聚合物上，用于跟与蛋白结合的物质结合的内表面仍然有足够的疏水性表面，惟这些疏水性表面对蛋白C而言则为不可及的。可推定该蛋白层会形成单分子层(monolayer)，而该单分子层的个别多肽分子之间有极小的孔隙（微微孔），可让如胆红素的与蛋白结合的物质穿过，因此就算有多肽涂层仍可被吸附。

虽然选定的平均孔隙大小较大的没有涂层的聚合物，可将蛋白C的结合减至最低，但若平均孔隙大小不大于80nm，则对临床应用为适宜，否则该聚合物的内表面面积会太小。结果，与蛋白高度结合的物质的吸着效率（吸附效率）会下降。对患有肝衰竭的高风险病人来说，推荐选用不大于40nm的平均孔隙大小。

在一个特别优选的变体的情况下，没有涂层的中性、疏水性聚合物的平均孔隙大小为30至40nm。已展示在此变体中，尽管该生物流体与该吸着剂接触一段长时间，但仅很少蛋白C会被吸附。此外，在此孔隙大小下该聚合物的内表面面积仍然大得足以确保可高效吸附与蛋白结合的物质。

在临床实践中已确立的中性、疏水性聚合物已被有利地使用，更尤其优选的是使用苯乙烯/二乙烯苯共聚物。苯乙烯/二乙烯苯共聚物在肝和肾衰竭中对毒素的吸附作用已获证实，而良好的生物相容性、无毒性、以及良好稳定性和可经消毒的能力是显著的。此外，孔隙大小可轻易和重生地设定。另外，也可设定非常小的粒度。然而，也可以使用结构与苯乙烯/二乙烯苯共聚物类似的中性、疏水性聚合物；该些聚合物应会表现出与苯乙烯/二乙烯苯共聚物类似的行为。本领域技术人员在几次的常规实验中，可确定某一中性、疏水性聚合物是否适合用来进行本发明。

就以多肽层涂层中性、疏水性聚合物方面，相对分子重量为40,000至80,000Da和/或尺寸维度达约10nmx10nmx10nm的多肽为优选。

该多肽层可包含最少一种多肽，而该最少一种多肽选自白蛋白，尤其是人血白蛋白、和似白蛋白多肽。似白蛋白多肽在其结构方面与白蛋白类似和/或具有类似白蛋白的特性。似白蛋白多肽为选取自（其中包括）白蛋白的亚型，如前白蛋白。似白蛋白多肽可源自天然来源，或能够以合成方式产生。该多肽层可包含单一种多肽或混合两种或以上多肽。该多肽可源自天然来源，亦能够以重组方式产生。本领域技术人员可以常规实验确定以一个多肽或两种或以上多肽的混合物用于本发明的适用性如何。

在此再次指出，该多肽层是基于所用多肽或蛋白的疏水性侧键与该聚合物的疏水性表面之间的疏水性相互作用而在该中性、疏水性聚合物的内外表面上形成的。

鉴于人血白蛋白（人血清白蛋白，HSA）的卓越生物相容性和高纯度的可及性，使用人血白蛋白对聚合物涂层为特别有利。

本发明进一步涉及产生如本发明所述般吸着剂的方法，其中最多10%多肽溶液为用来以多肽层在该中性、疏水性聚合物涂层成为吸附性涂层。

在一个特别优选的变体中，该多肽溶液为人血白蛋白溶液。正如上文已详述过，进一步有利的多肽可选自白蛋白，尤其是人血白蛋白、和似白蛋白多肽。此外，多肽溶液亦可含有多于一种多肽。

已显示的是1%多肽溶液已足以提供具备如本发明所述属性的吸着剂。使用更高浓度的多肽溶液（5-10%）并不会致使在与蛋白C结合的方面有显著差异或改进。出于经济原因，高纯度多肽溶液是昂贵的，因此在本发明的首个有利实施例中，会将1%多肽溶液用作涂层该中性疏水性聚合物。

在该方法的另一有利实施例中，使用了10%多肽溶液。使用更高浓度的多肽溶液（10%）在该聚合物涂层成为吸附性涂层，优点为不仅可大幅减少蛋白C与该吸着剂之间不希望发生的结合，更可大幅减少纤维蛋白原的结合。

该多肽溶液的pH值优选为设定到7.40。其好处为在以多肽在该载体（聚合物）涂层成为吸附性涂层时已经使用对应血液生理pH值的pH值。这不但对病人安全（避免酸中毒或碱中毒）有好处，亦因不再需要繁琐的洗涤程序以设定生理pH值（通常以悬浮液形式提供该吸着剂），故对生产也有好处。

也可证明，若选定的pH值为接近该多肽的等电点，则属有利。已知聚合物上的多肽占有密度(occupationdensity)可通过改变pH值而改变[Tonetal.1979.AdsorptionofHumanSerumAlbumintoAmberliteXAD-7Resin.JBiomedMaterRes13:407-422]。通过优化pH值，可将多肽溶液的浓度保持在非常低的水平，而据此可节省生产成本。pH值的优化可于常规实验中进行。

除聚合物表面的理化特性和平均孔隙大小外，聚合物的粒度亦在吸附步骤中起着作用。粒度会影响吸附作用的动力学。吸附作用在本质上是扩散时间（因此也是扩散速度）的函数，而其与距离的平方成正比。在选定小粒度时，扩散路径很短，因此消除速度与粒度成反比。此外，在粒度小时，会有一个大的表面积/体积比。为了使与蛋白高度结合的物质的吸着速度和吸着能力尽可能提高，若该吸着剂含有微粒，而该些微粒的粒度为20μm或以下，则为有利。

正如上文所述，在现有技术中，基于微粒体的解毒系统（MDS）尤其会使用微粒。微粒在净化回路（血浆回路）中以悬浮物的方式于滤膜的滤液的一侧环流。然而，若该滤膜变得有渗漏，则存有微粒将到达体外血液回路以及其后病人身体并引发肺栓塞的危险。出于这个原因，因小粒度可避免发生肺栓塞的风险，故某一个特别有利的变体将提供粒度为8μm或以下的微粒，而5μm或以下则为理想。

另外，如本发明所述的吸着剂为适合用于吸着装置（如吸附塔）的填充材料。

另外，本发明涉及从生物流体移除与蛋白结合的物质的方法，而含有与蛋白结合的物质的生物流体会与如本发明所述的吸着剂接触。这首先可于体外肝脏支持的范畴进行，其中使用吸着剂可净化血液或血浆中的与蛋白结合的物质。患有肝衰竭或肝功能减弱的病人和患有肾功能不全的病人会使用体外肝脏支持。正如上文所述，该生物流体可通过含有吸着剂的吸着装置。然而，就如在MDS中所使用般，该吸着剂亦可于生物流体中悬浮。

另外，本发明涉及如本发明所述的吸着剂作为用于从生物流体移除与蛋白结合的物质的选择性吸着剂的用途，该些与蛋白结合物质尤其可为胆红素、芳香族氨基酸、胆汁酸、苯酚、和硫醇。术语“与蛋白结合的物质”主要涉及与蛋白结合的有毒物质（所谓肝毒素），在患有肝功能障碍或肝衰竭的病人血液中含有大量这些有毒物质。如本发明所述的吸着剂的经改良的选择性属性是以蛋白C与如本发明所述的吸着剂之间的结合大幅减少这方面为基础的，而相比起没有涂层的聚合物，对与蛋白结合的物质的吸着效能并未受损。

本发明另外涉及如本发明所述的吸着剂作为用于从无细胞生物流体移除与蛋白结合的物质的选择性吸着剂的用途，尤其是血浆。

另外，本发明涉及如本发明所述的吸着剂作为用于从含有细胞的生物流体移除与蛋白结合的物质的选择性吸着剂的用途，尤其是血液。

具体实施方式

在此后，将以非限制性的例子为基础，更详细说明本发明。

例1：生产涂上白蛋白的苯乙烯二乙烯苯共聚物

表1已列出用于涂层带有不同平均孔隙大小的苯乙烯-二乙烯苯共聚物，粒度为5μm+/-3-4μm：

表1：苯乙烯/二乙烯苯共聚物

苯乙烯-二乙烯苯共聚物标号	平均孔隙大小（nm）
		#1822	15-20
#1824	30-40
		#1825	80-100

首先，在生理氯化钠(NaCl)溶液中生产出具有特定平均孔隙大小的苯乙烯/二乙烯苯共聚物的50%悬浮液。将其两倍的批量通过移液器移入至15mL的Greiner试管中并进行离心。上层清液被抽出。剩余的苯乙烯/二乙烯苯共聚物与该批次的容积对应。

其后，透过在该苯乙烯/二乙烯共聚物的内外表面上从人血白蛋白溶液吸附人血白蛋白，使用人血白蛋白层为该共聚物涂层。将一枝带有1mL共聚物和5mL人血白蛋白溶液（人血清白蛋白，HSA）（人血白蛋白Octapharma20%溶液，第B17B6331号）的试管置入各个双倍批次中。人血白蛋白溶液的浓度可为1-10%。将该些试管放到摇动器中用25:50的频率以10°C培育21个小时。将带有共聚物和0.9%氯化钠(NaCl)溶液的试管作为对照。将仅带有加样血浆(spikedplasma)（见第2.2.1节）而无共聚物的试管作为阴性对照。在摇动器中的培育时间完结后（21个小时），对该些试管进行离心并弃置该上层清液。

例2：在与蛋白结合的物质的吸附和蛋白C的吸附方面，与没有涂层的苯乙烯/二乙烯苯共聚物相比，试验经人血白蛋白涂层的带有不同孔隙大小的苯乙烯/二乙烯苯共聚物。

2.1.吸附体

首先，提供不同孔隙大小的苯乙烯/二乙烯苯共聚物。该些苯乙烯/二乙烯苯共聚物的粒度为5μm+/-3-4μm。其后，使用根据例1的生产方案的10%人血白蛋白溶液（HSA）涂层该些苯乙烯/二乙烯苯共聚物。表2已列出该些吸附体：

表2：带有和不带有HSA涂层的吸附体(苯乙烯/二乙烯苯共聚物)的不同孔隙大小

吸附体标号	平均孔隙大小（nm）
		#1822有HSA	15-20

#1822无HSA	15-20
		#1824有HSA	30-40
#1824无HSA	30-40
		#1825有HSA	80-100
#1825无HSA	80-100

“有HSA”的标号标明吸附体有使用白蛋白涂层，“无HSA”标明该些相应的吸附体没有被涂层=无HSA涂层的苯乙烯/乙烯苯共聚物）。

2.2.分批试验

在分批试验中，就上列吸附体从人类血浆吸附与蛋白结合的物质和吸附蛋白C研究了其特性。在这些实验中，使用加样血浆该些吸附体被涂层（见第2.2.1.节）。

2.2.1.生产血浆加样：

来自健康捐赠者的血浆使用了特定浓度的肝毒素来加样，以生产血浆加样。100mL的加样血浆含有以下浓度的肝毒素：300μM胆红素、100μM胆酸、100μM色氨酸、2mM苯酚。

该些肝毒素乃以下列方式处理：

就该胆红素批次，先称量出0.0175g胆红素，然后溶解在2ml的0.3NNaOH中。

就该混合毒素批次，先称量出0.02043g胆酸、0.0102g色氨酸、和0.0940g苯酚,然后共同搅拌到合共5ml的0.3NNaOH中。

就100ml的加样血浆，将2mL的该胆红素批次和1mL的该混合毒素批次加入96mL的血浆中，然后缓慢而避光地搅拌60分钟。在60分钟后，加入3mL的0.3NHCl。

使用加样血浆在试管中涂层表2列出的吸附体，再将1mL吸附体与9mL加样血掺合。这与10%吸附体批次对应。将带有加样血浆而无吸附体的试管作为阴性对照。将该些试管放到Enviro摇动器上用25:50的频率以37°C培育一个小时。

2.2.2.取样：

在5、15、30、和60分钟后，从每个试管取出1mL，然后立即以11,000g的离心力离心10分钟。立即将上层清液移转到Eppendorf反应器中。在第0分钟的时间，使用无吸附体的阴性对照（标明为“对照血浆”）作计量。将该些样品存于-20°C下避光，直到分析时用。

2.2.3.分析：

已对所添加的肝毒素（胆红素、胆酸、色氨酸、苯酚）以及存于血浆中的蛋白白蛋白和蛋白C的吸附均进行分析：

胆红素，试验剂编号：14652700（Roche）

胆酸，编号：R284067（Roche）

色氨酸试验剂编号：685125-01（Roche）

苯酚：高效液相色谱法

白蛋白试验剂编号：688271-01（Roche）

蛋白CELISA试验剂编号：12021228（Technoclone）

分析是在日立902（VT）中进行的。

2.3.实验结果：

该些实验的结果以图表的方式在各个附图中显示。在该些附图中：

图1A显示了在时间曲线[分钟]中，与分別没有涂层的吸附体#1822无HSA和#1824无HSA比较，已涂层的HSA的吸附体#1822有HSA和#1824有HSA对胆红素（以mg/dL表示胆红素在上层清液中的浓度）的吸附，

图1B显示了在时间曲线[分钟]中，与没有涂层的吸附体#1825无HSA比较，已涂层的HSA的吸附体#1825有HSA对胆红素（以mg/dL表示胆红素在上层清液中的浓度）的吸附，

图2A显示了在时间曲线[分钟]中，与分別没有涂层的吸附体#1822无HSA和#1824无HSA比较，已涂层的HSA的吸附体#1822有HSA和#1824有HSA对胆酸（以μmol/L表示胆酸在上层清液中的浓度）的吸附，

图2B显示了在时间曲线[分钟]中，与没有涂层的吸附体#1825无HSA比较，已涂层的HSA的吸附体#1825有HSA对胆酸（以μmol/L表示胆酸在上层清液中的浓度）的吸附，

图3A显示了在时间曲线[分钟]中，与分別没有涂层的吸附体#1822无HSA和#1824无HSA比较，已涂层的HSA的吸附体#1822有HSA和#1824有HSA对色氨酸（以μmol/L表示色氨酸在上层清液中的浓度）的吸附，

图3B显示了在时间曲线[分钟]中，与没有涂层的吸附体#1825无HSA比较，已涂层的HSA的吸附体#1825有HSA对色氨酸（以μmol/L表示色氨酸在上层清液中的浓度）的吸附，

图4A显示了在时间曲线[分钟]中，与相应的没有涂层的吸附体#1822无HSA和#1824无HSA比较，已涂层的HSA的吸附体#1822有HSA和#1824有HSA对苯酚（以mmol/L表示苯酚在上层清液中的浓度）的吸附，

图4B显示了在时间曲线[分钟]中，与没有涂层的吸附体#1825无HSA比较，已涂层的HSA的吸附体#1825有HSA对苯酚（以mmol/L表示苯酚在上层清液中的浓度）的吸附，

图5A显示了在时间曲线[分钟]中，与相应的没有涂层的吸附体#1822无HSA和#1824无HSA比较，已涂层的HSA的吸附体#1822有SA和#1824有HSA对血浆蛋白白蛋白（以g/dL表示白蛋白在上层清液中的浓度）的吸附，

图5B显示了在时间曲线[分钟]中，与没有涂层的吸附体#1825无HSA比较，已涂层的HSA的吸附体#1825有HSA对血浆蛋白白蛋白（以g/dL表示白蛋白在上层清液中的浓度）的吸附，以及

图6显示了在培育0、5、15和60分钟后，与分別没有涂层的吸附体#1822无HSA、#1824无HSA、和#1825无HSA比较，如本发明所述已涂层的HSA的吸附体#1822有HSA、#1824有HSA和#1825有HSA对凝血蛋白蛋白C（以%表示）的吸附。

2.4.从分批试验得到的结果概要：

分批测试的结果显示，吸附体的白蛋白涂层可大幅提高生物相容性，特别是可避免或大大减少对天然抗凝剂蛋白C的吸附。因此可以推定，这也可应用到蛋白S上。由于患有败血症或肝衰竭的病人血液的凝结能力已受到干扰，且不应再受到额外损害，故这对该类病人来说具有重大意义。此外，吸附体在吸附肝和肾衰竭的重要毒素这方面（见图1A、图1B、图2A、图2B、图3A、图3B、图4A、和图4B）的特性并不会受到HSA-蛋白涂层的影响，因此其吸附能力以及吸附动力均可很大程度地保持。

白蛋白的轻微解吸作用（见图5A和图5B）可透过因在涂层的过程中有多于所需的白蛋白与聚合物结合而形成双层或多层来解释。在特殊情况下，过多的白蛋白会再次解吸。而负责所述白蛋白层有利功能的，是在任何情况均会保留的白蛋白单分子层。

从图6可清楚看到，使用人血白蛋白层作为苯乙烯/乙烯苯共聚物的吸附性涂层可达到大幅减少对蛋白C的吸附。当使用小平均孔隙大小（15-20nm和30-40nm）的没有涂层的聚合物时，蛋白C会从血浆中被完全除去，而当使用与大平均孔隙大小（#1825无HSA，孔隙大小80-100nm）者时，则有一部分的蛋白C会留于血浆中。孔隙大小大于80nm的吸附体因内表面面积减小，故在临床应用上仅得有限的适用性，例如，用于患有非危及生命的肝功能障碍的病人上。与没有涂层的吸附体相比，使用已涂层的HSA的吸附体在孔隙大小为15-20nm时已可达到大幅减少对蛋白C的吸附。已涂层的HSA的吸附体对蛋白C的吸附会随着孔隙大小增大而进一步减少。由于一方面此孔隙大小只会消除小量的蛋白C，另一方面该吸附体的内表面面积仍大得足以可高效移除与蛋白结合的物质，因此若已涂层的HSA的吸附体的孔隙大小为30-40nm，则更是特别有利。在大孔隙大小（80-100nm）时，蛋白C则几乎不会被吸附，然而，正如已指出的，对与蛋白结合的物质的吸附效能亦显然较低。

例3：测试以人血白蛋白溶液浓度作为函数、与蛋白结合的物质和蛋白C的吸附。

用作涂层中性、疏水性苯乙烯/乙烯苯共聚物（见例1中的方案）的人血白蛋白溶液，就其浓度对吸附与蛋白结合的物质和蛋白C的影响已作出测试。本实验目的为测试人血白蛋白溶液用于涂层共聚物时的最佳浓度。

根据例1中的方案使用人血白蛋白为例1中的没有涂层的吸附体#1824（平均孔隙大小30-40nm）涂层，并使用了三种浓度的人血白蛋白溶液（1%HSA、5%HSA、和10%HSA）涂层。在根据第2.2.节的方案进行的分批试验中，使用加样血浆为已涂上HSA的吸附体涂层。将带有没有涂层的吸附体的试管作比较之用。此外，将仅带有加样血浆而无吸附体的试管作阴性对照。亦已根据第2.2.节的方案进行分析。

表3已列出用于分批试验的不同批次。

表3：测试人血白蛋白溶液浓度的批次

阴性对照血浆
	#1824无HSA
# 1824 1% HSA
	# 1824 5% HSA
# 1824 10% HSA

从分批试验得到的结果概要：

HSA溶液的浓度对吸附胆红素、胆酸、白蛋白、和苯酚并无影响。些曲线在本质上是一致的。

相比起HSA浓度为1%或5%，HSA浓度为10%时可达到稍微较好的色氨酸吸附。

在图7中，以时间（培育0、5、15、30、和60分钟）为函数表示了使用不同人血白蛋白溶液（1%、5%、和10%）涂层的吸附体对凝血蛋白蛋白C（以%表示）的吸附。

用于涂层的人血白蛋白溶液的浓度仅对吸附蛋白C有轻微影响。可确立提高人血白蛋白溶液的浓度仅对蛋白C的吸附有轻微的减少。在基于这结果，用于在聚合物涂层的1%人血白蛋白溶液已完全足以大幅减少蛋白C的吸附。

虽然出于经济原因，1%人血白蛋白溶液为优选，但在涂层方面使用10%人血白蛋白溶液对纤维蛋白原的吸附而言为有利的。当纤维蛋白原与1%HSA和5%HSA接触几分钟后会从血浆中完全除去，而采用使用10%HSA涂层的吸附体可大幅减少吸附作用。

Claims (20)

1.一种用于从生物流体移除与蛋白结合的物质的吸着剂，该吸着剂带有：(a)多孔、中性、疏水性聚合物以及(b)吸附在该聚合物的多肽层，其特征在于该中性、疏水性聚合物的平均孔隙大小为30至40nm，其中该吸着剂包含微粒，该些微粒的粒度为20μm或以下，其中以10％多肽的溶液用于使该多肽层在该中性、疏水性聚合物涂层成为吸附性涂层。

2.如权利要求1所述的吸着剂，其特征在于该中性、疏水性聚合物为苯乙烯/二乙烯苯共聚物。

3.如权利要求1或2所述的吸着剂，其特征在于该多肽层包含最少一种多肽，该最少一种多肽选自白蛋白和似白蛋白多肽。

4.如权利要求1或2所述的吸着剂，其特征在于该多肽层包含最少一种多肽，该最少一种多肽选自人血白蛋白。

5.如权利要求1所述的吸着剂，其特征在于该些微粒的粒度为8μm或以下。

6.如权利要求5所述的吸着剂，其特征在于该些微粒的粒度为5μm或以下。

7.一种吸着装置，含有如权利要求1至6中任一权利要求所述的吸着剂。

8.一种血浆回路，含有如权利要求1至6中任一权利要求所述吸着剂的悬浮液。

9.一种产生如权利要求1至6中任一权利要求所述吸着剂的方法，其特征在于通过以下的步骤：

提供多孔、中性、疏水性聚合物，该聚合物的平均孔隙大小为30至40nm并具有粒度为20μm或以下的微粒；

以多肽层涂布该中性、疏水性聚合物，其中以10％多肽的溶液用于使该多肽层在该中性、疏水性聚合物涂层成为吸附性涂层。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于该多肽溶液含有最少一种多肽，该多肽选自白蛋白和似白蛋白多肽。

11.如权利要求9所述的方法，其特征在于该多肽溶液含有最少一种多肽，该多肽选自人血白蛋白。

12.如权利要求1所述的吸着剂，其特征在于将含有与蛋白结合的物质的生物流体与其接触。

13.如权利要求12所述的吸着剂，其特征在于该生物流体为血液或血浆。

14.如权利要求1所述的吸着剂，其用作从生物流体移除与蛋白结合的物质的选择性吸着剂。

15.如权利要求14所述的吸着剂，其中该些与蛋白结合的物质为胆红素、芳香族氨基酸、胆汁酸、苯酚、和硫醇。

16.如权利要求1所述的吸着剂，其用作从无细胞生物流体移除与蛋白结合的物质的选择性吸着剂。

17.如权利要求16所述的吸着剂，其中该无细胞生物流体是血浆。

18.如权利要求1所述的吸着剂，其用作从含有细胞的生物流体移除与蛋白结合的物质的选择性吸着剂。

19.如权利要求18所述的吸着剂，其中该含有细胞的生物流体是血液。

20.一种基于微粒体的解毒系统(MDS)，其包括如权利要求1至6中任一权利要求所述的吸着剂。